JP2018021895A - 未分化細胞を検出および回収する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で検出し、かつ当該検出した未分化細胞を回収可能な方法を提供する。【解決手段】細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、未分化細胞を含む試料に当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させる工程の後、前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程、を少なくとも経ることで試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法、ならびに前記検出した未分化細胞を、別途備えたノズルによる吸引吐出により当該目的とする細胞を回収する回収手段により回収することで試料中に含まれる未分化細胞を回収する方法。【選択図】図６

Description

本発明は、試料中に含まれる未分化細胞を検出し回収する方法に関する。

再生医療分野において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞から分化させることで組織を得ようとする場合、未分化の幹細胞はガン化のおそれがあるため、組織の基となる分化細胞を当該未分化の幹細胞を極力含まない状態で得る必要がある。

未分化細胞と分化細胞とを区別する方法として、従来より、蛍光顕微鏡を用いた方法（特許文献１）やフローサイトメーターを用いた方法（特許文献２）が知られている。しかしながら、蛍光顕微鏡を用いた方法は凝集した細胞に対する検出感度が悪いという問題があり、フローサイトメーターを用いた方法は細胞形状に関する情報が乏しいという問題があった。

国際公開２０１０／１０１２２５号 国際公開２００６／１２６５７４号

本発明の課題は、試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で検出し、かつ当該検出した未分化細胞を回収可能な方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法である。
（１）未分化細胞を含む試料に、当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体を含む試料を基板に導入する工程
（２）前記複合体を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
また本発明の第二の態様は、以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法である。
（１）未分化細胞を含む試料を基板に導入する工程
（２）前記未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を基板に導入し、当該標識タンパク質と保持部に保持された未分化細胞との複合体を形成させる工程
（４）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
さらに本発明の第三の態様は、以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする細胞を回収する回収手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を回収する方法である。
（１）未分化細胞を含む試料に、当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体を含む試料を基板に導入する工程
（２）前記複合体を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
（４）細胞を検出する手段で検出した未分化細胞を、回収手段で回収する工程
また本発明の第四の態様は、以下の（１）から（５）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする細胞を回収する回収手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を回収する方法である。
（１）未分化細胞を含む試料を基板に導入する工程
（２）前記未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を基板に導入し、当該標識タンパク質と保持部に保持された未分化細胞との複合体を形成させる工程
（４）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
（５）細胞を検出する手段で検出した未分化細胞を、回収手段で回収する工程
また本発明の第五の態様は、未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質が未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体である、前記第一から第四の態様のいずれかの態様に記載の方法である。

また本発明の第六の態様は、未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体が抗Ｎａｎｏｇ標識抗体である、前記第五の態様に記載の方法である。

また本発明の第七の態様は、未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質が未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識レクチンである、前記第一から第四の態様のいずれかの態様に記載の方法である。

また本発明の第八の態様は、前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、前記第一から第七の態様のいずれかの態様に記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において未分化細胞とは、分化細胞の一段階前の細胞のことをいい、一例として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞があげられる。また血小板の一段階前の細胞である巨核球も、本発明における未分化細胞に含まれる。ｉＰＳ細胞などの幹細胞のサイズは約１０から２０μｍであり、巨核球のサイズは約２０から１００μｍである。

本発明において未分化細胞が有するタンパク質は、未分化細胞の表面もしくは細胞内で発現し、かつ分化細胞では発現しないタンパク質または糖タンパク質のことをいい、対象となる未分化細胞／分化細胞に応じ適宜選択すればよい。例として、未分化細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞である場合の、未分化細胞が有するタンパク質の好ましい一態様として、Ｎａｎｏｇがあげられる。

本発明の方法で用いる、未分化細胞が有するタンパク質を認識するタンパク質は未分化細胞が有するタンパク質を認識する機能を有している限り、その態様に限定はなく、一例として未分化細胞が有するタンパク質に対する抗体や未分化細胞が有するタンパク質を認識するレクチンがあげられる。具体的には、未分化細胞が有するタンパク質に対する抗体である、抗Ｎａｎｏｇ抗体、抗Ｏｃｔ４抗体、抗ＴＲＡ−１ ６０抗体、抗ＴＲＡ−１ ８０抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体や、未分化細胞が有するタンパク質を認識するレクチンである、ＢＣ２ＬＣＮなどがあげられる。

本発明の一態様は、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて未分化細胞を検出する方法である。具体的には、前記未分化細胞を前記基板に設けた保持部に保持させた後、細胞を検出する手段により前記保持部に保持された未分化細胞を検出する。保持部に保持された未分化細胞の特異的検出は、前述した未分化細胞が有するタンパク質の有無に基づき行なう。

未分化細胞が有するタンパク質の有無に基づく未分化細胞の検出方法としては、当該タンパク質を特異的に標識可能な色素（化学発光色素や蛍光色素など）を添加する方法も考えられるが、汎用性の点から当該タンパク質を認識する標識タンパク質（例えば、未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体や未分化細胞が有するタンパク質を認識可能な標識レクチン）を用いる方法が一般的である。前記標識タンパク質中の標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質があげられる。前記標識タンパク質におけるタンパク質と標識物質との結合態様に限定はなく、前記タンパク質が標識物質と化学結合などにより直接結合された態様であってもよく、前記タンパク質が標識物質が結合された前記タンパク質に対する抗体（前記タンパク質が抗体の場合は標識二次抗体に相当）によって間接的に結合された態様であってもよい。なお前記標識タンパク質を添加するタイミングも特に限定はなく、未分化細胞を含む試料を基板に導入する前に添加してもよいし、未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させた後に添加してもよい。

本発明で用いる、基板に設けた保持部の形状に特に限定はなく、界面張力などで細胞を含む液体を維持できれば平面の保持部であってもよいが、側壁を設けた保持部とすると細胞を含む液体を基板内に安定に保持できる点で好ましい。

本発明において、保持部の開口部のサイズは１０μｍから２０μｍが好ましく、更に好ましくは１０μｍから１５μｍであり、保持部の深さは１０μｍから４０μｍが好ましい。
また未分化細胞を含む液体を基板に導入し、当該細胞を保持部に保持させる方法にも特に限定はなく、単に保持部に細胞を含む液体を導入するだけでもよいし、未分化細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に当該細胞を導入させてもよい。中でも未分化細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、未分化細胞を保持部へ効率的に保持できる点で好ましい。

前述した未分化細胞を検出するための装置にノズルによる吸引吐出により当該未分化細胞を回収する回収手段をさらに備えることで、試料中に含まれる未分化細胞を回収することができる。具体的には前記装置で検出した未分化細胞を前記回収手段で回収すればよい。

本発明は、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、（１ａ）未分化細胞を含む試料に当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させる工程、（２ａ）前記複合体を含む試料を基板に導入する工程、（３ａ）前記複合体を基板に設けた保持部に保持させる工程、または（１ｂ）未分化細胞を含む試料を基板に導入する工程、（２ｂ）前記未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させる工程、（３ｂ）前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を基板に導入し当該標識タンパク質と保持部に保持された未分化細胞との複合体を形成させる工程の後、（４）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程、を少なくとも経ることで試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法であり、試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で検出することができる。

また本発明は、ノズルによる吸引吐出により保持部に保持された細胞を回収する回収手段をさらに備えることで、前記検出した未分化細胞を回収することができる。これにより単一状態かつ形状情報を含めた形で検出した未分化細胞を選択的に回収することができる。

本発明の方法を実施可能な装置を構成する基板の一例を示した図（分解図）である。 図１に示す基板の正面図である。 図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の一例を示した図である。 図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の別の例を示した図である。 未分化細胞の（Ａ）ＤＡＰＩ染色像および（Ｂ）抗Ｎａｎｏｇ抗体染色像である。 実施例１の結果を示した図である。図中（ａ）は未分化細胞培養液の、（ｂ）は未分化細胞培養液と分化細胞培養液との１：１混合液の、（ｃ）は未分化細胞培養液と分化細胞培養液との３：７混合液の、（ｄ）は未分化細胞培養液と分化細胞培養液との１：９混合液の、（ｅ）は未分化細胞培養液と分化細胞培養液との１：９９混合液の、（ｆ）は分化細胞培養液のみの、それぞれ結果であり、棒の上の数字は各培養液における未分化細胞混入率の計算値［％］である。 未分化細胞および分化細胞の（Ａ）ＤＡＰＩ染色像および（Ｂ）ＢＣ２ＬＣＮ染色像である。 実施例２の結果を示した図である。

以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の方法を実施可能な装置を構成する基板の一例を図１に示す。また図１に示した基板の正面図を図２に示す。

図１に示す基板１００は、
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極２１・２２と、
電極２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞２００が導入される。電極２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞２００を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部５０に保持した細胞２００の回収を容易にするため、電極２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。

次に、図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の一例を図３を用いて説明する。

（１−１）未分化細胞を標識する工程（図示せず）
未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を含む溶液を試料に添加することで、試料中に含まれる未分化細胞と前記標識タンパク質との複合体を形成させる。標識タンパク質は、前記未分化細胞が有するタンパク質を認識するタンパク質に標識物質を結合させたものである。一例として、未分化細胞が有するタンパク質としてＮａｎｏｇを用いる場合は、抗Ｎａｎｏｇ抗体に標識物質を直接または前述した標識二次抗体を用いて間接的に結合させたものを標識タンパク質として用いればよい。また未分化細胞が有するタンパク質を認識するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮに、標識物質を直接または前述した標識抗体を用いて間接的に結合させたものを標識タンパク質として用いてもよい。前記標識物質は後述の検出部および計測部で検出可能な蛍光や発光を生成可能な物質であれば特に限定はない。

（１−２）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから、分化細胞２２０（試料中に含まれている場合）および標識タンパク質３００と結合した未分化細胞２１０を含む試料を導入し、誘電泳動力６００を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。具体的には、信号発生器４０から電極２１・２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６０を発生させ、保持部５０へ未分化細胞２１０および分化細胞２２０を導入する。図１に示す基板１００に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。

信号発生器４０から電極２１・２２へ印加する交流電圧は、保持部５０に保持された細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

（１−３）未分化細胞２１０を検出する工程
導入口１３ａから洗浄液を導入して残存試料を排出した後、基板を移動させる手段（図示せず）で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部４００および計測部により、未分化細胞２１０に結合した標識タンパク質由来の蛍光または発光および位置情報を取得し、未分化細胞２１０の位置を検出する。

（１−４）目的細胞２１０を回収する工程
検出部４００および計測部により検出した未分化細胞２１０を回収するために、電極２２をスペーサ１３から取り外した後、ノズル５００で吸引することで、基板１００から未分化細胞２１０を回収する。電極２２を取り外す際は、スペーサ１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１３が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、未分化細胞２１０が破壊されるからである。

未分化細胞２１０の吸引は、基板を移動させる手段およびノズルを移動させる手段（ともに図示せず）を用いて前記（１−３）の工程で検出した未分化細胞２１０が保持されている保持部へノズル５００の中心を移動させ、ノズル５００により液を吸引することで目的細胞２１０を回収する。なおノズル５００による未分化細胞２１０の吸引位置を、未分化細胞２１０を保持した保持部５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、未分化細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には未分化細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部５０の高さから垂直方向に保持部５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。

図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の別の例を図４を用いて説明する。

（２−１）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから未分化細胞２１０および分化細胞２２０（試料中に含まれている場合）を含む試料を導入し、誘電泳動力６０を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。導入方法および条件は前記（１−２）と同様な方法および条件で行なえばよい。

（２−２）標識タンパク質３００を導入する工程
導入口１３ａから洗浄液を導入して残存試料を排出した後、導入口１３ａから標識タンパク質３００を含む試薬を導入して、未分化細胞２１０と標識タンパク質３００との複合体を形成させる。標識タンパク質は前記（１−１）と同様のタンパク質を用いればよい。

（２−３）未分化細胞２１０を検出する工程
導入口１３ａから洗浄液を導入して残存標識抗体を排出した後、前記（１−３）と同様な方法で、検出部４００および計測部により、未分化細胞２１０の位置を検出する。

（２−４）目的細胞２１０を回収する工程
前記（１−４）と同様な方法で、検出部４００および計測部により検出した未分化細胞２１０を、ノズル５００で吸引することにより、回収する。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本例に限定されるものではない。

実施例１
以下に示す方法により、未分化細胞の検出を試みた。
（１）マウスＥＳ細胞（理研バイオリソースセンターから購入）を未分化維持培地（表１に記載の成分を添加したＧｌａｓｇｏｗ’ｓ ＭＥＭ培地）で２日培養することで未分化細胞培養液を調製し、前記ＥＳ細胞を分化培地（表２に記載の成分を添加したαＭＥＭ培地）で３．５日間培養することで分化細胞培養液を調製した。

（２）（１）で調製した培養液を以下のいずれかに記載の条件で混合した。
（ａ）未分化細胞培養液のみ
（ｂ）未分化細胞培養液と分化細胞培養液とを１：１で混合
（ｃ）未分化細胞培養液と分化細胞培養液とを３：７で混合
（ｄ）未分化細胞培養液と分化細胞培養液とを１：９で混合
（ｅ）未分化細胞培養液と分化細胞培養液とを１：９９で混合
（ｆ）分化細胞培養液のみ
（３）（２）で調製した混合液を遠心分離して細胞を回収後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で３０分間浸することで、前記細胞を固定した。
（４）５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）と０．７５％（ｗ／ｖ）サポニンとを含むＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）（Ｂｕｆｆｅｒ Ａ）で２回洗浄後、ウサギ由来抗マウスＮａｎｏｇ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を含むＢｕｆｆｅｒ Ａに室温で６０分間浸すことで、未分化細胞と当該未分化細胞が有するタンパク質（Ｎａｎｏｇ）に対する抗体との複合体を形成させた。
（５）Ｂｕｆｆｅｒ Ａで２回洗浄後、標識二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社製）と核染色試薬であるＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）とを含むＢｕｆｆｅｒＡに室温で９０分間浸した。
（６）３００ｍＭマンニトール溶液で２回洗浄後、３００ｍＭマンニトール溶液に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
（７）ピペットを用いて（６）で調製した細胞懸濁液８００μＬを図１に示す基板１００に導入し、信号発生器４０で電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの交流電圧を電極２１・２２に１０分間印加することで基板１００が有する保持部５０に細胞を保持させた。
（８）保持部５０に保持された細胞に結合した標識抗体由来の蛍光を、蛍光顕微鏡（Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ／ＩＸ７１、オリンパス製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影することで観察し、ＤＡＰＩ陽性かつ抗Ｎａｎｏｇ抗体陽性細胞を未分化細胞と判断し、ＤＡＰＩ陽性かつ抗Ｎａｎｏｇ抗体陰性細胞を分化細胞と判断した。

未分化細胞のＤＡＰＩ（Ａ）および抗Ｎａｎｏｇ抗体（Ｂ）染色像を図５に示す。また前記基準で未分化細胞または分化細胞と判断した細胞数から、下記式で算出した未分化細胞混入率［％］を、前記（ａ）から（ｆ）の条件で調製した培養液に対して算出した結果を図６に示す。

未分化細胞混入率［％］＝１００×未分化細胞数÷（未分化細胞数＋分化細胞数）
培養液中に含まれる未分化細胞の割合が多いほど、前記式で算出した未分化細胞混入率［％］が上昇していることから、本発明の方法により、試料中に含まれる未分化細胞の割合を把握することができる。

実施例２
以下に示す方法により、未分化ｉＰＳ細胞の検出を試みた。
（１）以下に示す方法により、未分化ｉＰＳ細胞を調製した。
（１−１）ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパンより購入）をｉＭａｔｒｉｘ（タカラバイオ社製）でコートしたシャーレに播種し、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。
（１−２）７日間培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）との混合液で前記細胞を剥離した。
（１−３）剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。固定後、Ｂｕｆｆｅｒ Ａに置換した。
（２）分化細胞として、未分化マーカーを発現していない細胞である巨核球芽細胞株Ｋ５６２細胞を使用し、以下に示す方法により調製した。
（２−１）Ｋ５６２細胞（医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を、ＧＩＴ培地（日本製薬製）を用いて５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。
（２−２）培養した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。固定後、Ｂｕｆｆｅｒ Ａに置換した。
（３）（１）および（２）で調製した細胞培養液を以下のいずれかに記載の条件で混合した。
（ｉ）ｉＰＳ細胞数とＫ５６２細胞数とを１５：８５で混合した細胞懸濁液（未分化ｉＰＳ細胞の混入率１５％［理論値］）
（ｉｉ）Ｋ５６２細胞の培養懸濁液（未分化ｉＰＳ細胞の混入率０％［理論値］）
（ｉｉｉ）（ｉ）の懸濁液と（ｉｉ）の懸濁液とを１：９の割合で混合し、総細胞数を５０万細胞に調製した細胞懸濁液（未分化ｉＰＳ細胞の混入率１．５％［理論値］）
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の懸濁液と（ｉｉ）の懸濁液とを１：９で混合し、総細胞数を５０万細胞に調製した細胞懸濁液（未分化ｉＰＳ細胞の混入率０．１５％［理論値］）
（ｖ）（ｉｖ）の懸濁液と（ｉｉ）の懸濁液とを１：９で混合し、総細胞数を５０万細胞に調製した細胞懸濁液（未分化ｉＰＳ細胞の混入率０．０１５％［理論値］）
（４）（３）で調製した懸濁液のうち、（ｉｉ）から（ｖ）の懸濁液を遠心した後、上清を除去し細胞ペレットを調製した。
（５）６５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ａに１３μＬのＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣ（和光純薬工業社製）と１．３μＬのＤＡＰＩとを混合し、染色液Ａを作製した。
（６）（４）で調製した各細胞ペレットを１００μＬの染色液Ａで懸濁し、室温で６０分間反応させた。
（７）各反応後の液に、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを１ｍＬ入れ、遠心し上清を除去することで洗浄後、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを５ｍＬずつ入れることで、約５０万細胞／５ｍＬの懸濁液を作製した。
（８）ピペットを用いて（７）で調製した細胞懸濁液８００μＬを図１に示す基板１００に導入し、５分間静置することで基板１００が有する保持部５０に細胞を保持させた。
（９）保持部５０に保持された細胞に結合したＢＣ２ＬＣＮ−ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩ由来の蛍光を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影することで観察し、ＤＡＰＩ陽性かつＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞を未分化細胞と判断し、ＤＡＰＩ陽性かつＢＣ２ＬＣＮ陰性細胞を分化細胞と判断した。

未分化細胞のＤＡＰＩ（Ａ）およびＢＣ２ＬＣＮ（Ｂ）染色像を図７に示す。また前記基準で未分化細胞または分化細胞と判断した細胞数から、下記式で算出した未分化細胞混入率［％］を、前記（ｉｉ）から（ｖ）の懸濁液に対して算出した結果と理論値の比較結果を表３および図８に示す。

未分化細胞混入率［％］＝１００×未分化細胞数÷（未分化細胞数＋分化細胞数）

実測値が理論値と相関していることから、本発明の方法により、試料中に含まれる未分化細胞の割合を把握することができる。

１００：基板
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：誘電泳動力
２００：細胞
２１０：未分化細胞
２２０：分化細胞
３００：標識タンパク質
４００：検出部
５００：ノズル

Claims (8)

1. 以下の（１）から（３）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法。
   （１）未分化細胞を含む試料に、当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体を含む試料を基板に導入する工程
   （２）前記複合体を基板に設けた保持部に保持させる工程
   （３）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
2. 以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を検出する方法。
   （１）未分化細胞を含む試料を基板に導入する工程
   （２）前記未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させる工程
   （３）前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を基板に導入し、当該標識タンパク質と保持部に保持された未分化細胞との複合体を形成させる工程
   （４）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
3. 以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする細胞を回収する回収手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を回収する方法。
   （１）未分化細胞を含む試料に、当該未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を添加することで当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体を含む試料を基板に導入する工程
   （２）前記複合体を基板に設けた保持部に保持させる工程
   （３）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
   （４）細胞を検出する手段で検出した未分化細胞を、回収手段で回収する工程
4. 以下の（１）から（５）に示す工程を含む、細胞を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする細胞を回収する回収手段とを備えた装置を用いて、試料中に含まれる未分化細胞を回収する方法。
   （１）未分化細胞を含む試料を基板に導入する工程
   （２）前記未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させる工程
   （３）前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を基板に導入し、当該標識タンパク質と保持部に保持された未分化細胞との複合体を形成させる工程
   （４）前記複合体中の標識に基づき、細胞を検出する手段で未分化細胞を検出する工程
   （５）細胞を検出する手段で検出した未分化細胞を、回収手段で回収する工程
5. 未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質が未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体が抗Ｎａｎｏｇ標識抗体である、請求項５に記載の方法。
7. 未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質が未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識レクチンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

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