JP6639906B2 - 生物試料検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物試料中において生きた標的細胞を検出する方法に関する。より具体的には、本発明の検出方法は、以下の工程:
生物試料から生細胞を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程と、
前記濃縮工程で得られた濃縮液を基板上に展開する展開工程と、
前記基板上に展開された生きた標的細胞を光学的に検出する光学検出工程と、
を含む。
濃縮工程は、生物試料から生きた細胞を濃縮し、濃縮液を得る工程である。一般に、生細胞と死細胞とでは比重が異なっていることから、生物試料の比重差を利用することで生細胞を死細胞から分離して濃縮することができる。このような濃縮工程としては、具体的に密度勾配溶液を用いることで、生細胞を分離し濃縮することができる。このような濃縮工程では、生細胞を完全に分離することを意図するものではなく、生細胞の割合が増加しさえすれば濃縮工程としては十分である。生物試料中の死細胞の混入率によっても変化しうるが、濃縮工程後の死細胞の割合が、20%未満、好ましくは15%未満、さらに好ましくは10%未満、さらにより好ましくは5%未満になることが好ましい。
展開工程は、濃縮工程を経て得られた濃縮液を基板上に展開することにより行われる。濃縮液を展開することで、濃縮液に含まれる細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができる。非凝集状態で展開させることが好ましく、展開前に濃縮液を十分に懸濁しておくことが好ましい。展開工程は、細胞を検出に適した間隔で基板上に分布させることができれば任意の手法を用いることができ、単に濃縮液を基板上に適用するのみであってもよいが、必要に応じてさらなる処理を行ってもよい。一例として、濃縮液を基板上に適用後に、振動や誘導泳動力をあたえることにより、細胞を展開することもできる。細胞を均一に展開するために、基板上に保持孔があけられていることが好ましく、各保持孔につき、概ね一個の細胞を配置することで、その後の検出工程にて標的細胞の検出が容易になる。所望される細胞の展開密度に応じて、濃縮液中の細胞数を計数し、適切な細胞数が展開されるように希釈されてもよく、また展開に供する濃縮液を計量して展開することもできる。
検出工程は、基板上に展開された標的細胞を検出する工程である。本発明の生物試料検出方法は、前記分離濃縮構造体で濃縮された生細胞を含む濃縮液に含まれる細胞のうち、標的細胞を検出することができればよい。検出は、光学的に検出することが好ましく、顕微鏡下又は蛍光顕微鏡下で撮像し、明視野で撮影された画像、及び/又は標識物質を用いて撮影された画像を分析することで、標的細胞を検出することができる。例えば、明視野で撮影された画像から、細胞形態に関する情報を取得し、分析することで標的細胞を検出することができる。このような情報として、例えば、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、細胞の周囲長、真円度などが例示できる。標識物質を用いた場合、標的細胞を直接標識してもよいし、標的細胞以外の細胞を標識することもできる。標的細胞以外の細胞を標識する場合、撮影された画像を、他の画像、例えば明視野撮影画像と比較することで、標的細胞を検出することができる。
本発明の生体試料中の標的細胞の検出方法は、標的細胞として、CTCを検出することにより、癌の診断方法、又は癌転移の診断方法、並びに癌の予後予測方法に用いることができる。健康診断などの被験者の生体試料中にCTCが検出できた場合、その被験者が癌を患っていると診断することができる。このように癌を患っていると診断された場合、被験者は、癌の部位を特定するために更なる診断を受けることができるし、抗癌剤の投与、放射線治療、手術などにより治療されてもよい。被験者が既に癌を患っているか、癌の治療後である場合、本発明の検出方法でCTCを検出できた場合、転移癌を発症する恐れがあると診断することができる。その場合、診断後にさらに転移癌を治療するため、抗癌剤の投与を継続することができる。
実施例1と同様の分離濃縮構造体を利用して、あらかじめ蛍光染色試薬(株式会社同仁化学研究所製、商品名CalceinAM)で標識した約30個の生きたヒト乳癌細胞(SKBR3)を健常者血液に混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心は2000×g、10分間、回収における遠心は300×g、10分間室温にて実施した。実施例2では、分離濃縮構造体の下側の筒状部材3に、表2に示す密度勾配溶液を2mL注入した。
図4に示した装置を使用して、実施例1と同様に、回収された癌細胞数を測定した。表2に密度勾配溶液の密度と癌細胞回収率の結果を示した。密度勾配溶液の密度の上昇に伴い、癌細胞回収率は向上したが、密度が1.091g/mL、浸透圧300mOsm/kgでは赤血球が十分に沈降せず上部構造体に混入し、分離不良となった。一方、密度1.091g/mL、浸透圧380〜400mOsm/kgの範囲においては、赤血球(一部の白血球)と癌細胞を良好に分離することができ、回収率は88.2〜95.3%であった。
実施例2と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳癌細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は2000×g、5〜20分間、室温にて実施した。実施例3では、分離濃縮構造体の下側の筒状部材3に、密度が1.091g/mL、浸透圧380mOsm/kgを2mL注入した。
実施例2と同様にして、健常者血液に約30個のヒト乳癌細胞(SKBR3)を混合させた試料、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を行うことで濃縮工程を実施し、濃縮液を得た。なお、密度差分離における遠心条件は2000×g、10分間、室温にて実施した。実施例4では、分離濃縮構造体の下側の筒状部材3に、密度が1.091g/mL、浸透圧380mOsm/kgを2mL注入した。遠心分離後、実施例1と同様にして、細胞の回収、洗浄を行い、生きた癌細胞が濃縮された濃縮液を得た。
図2に示した構造体の収容部に細胞懸濁液を導入し、基板間に交流電圧(電圧20Vpp、周波数10kHz〜10MHz、矩形波)を印加し、誘電泳動力により細胞を保持孔に捕捉した。
蛍光標識試薬(株式会社同仁化学研究所製、商品名CFSE)で標識したヒト乳癌細胞(SKBR3)を4%ホルムアルデヒド水溶液より固定処理した後、PI標識した細胞懸濁液を図2に示した構造体の収容部に導入し、基板間に交流電圧(電圧20Vpp、周波数100kHz〜10MHz、矩形波)を印加することで誘電泳動力によるPI非標識細胞(生細胞モデル)とPI標識細胞(死細胞モデル)の捕捉率を比較した。その結果、PI非標識細胞(生細胞モデル)は周波数100kHz〜10MHzにおいて保持孔への捕捉率98%以上を維持した。一方、PI標識細胞(死細胞モデル)は、100kHzで99%の捕捉率であったが、1MHzで92%、3MHzで59%、10MHzで6%と周波数の上昇に伴い、捕捉率が低下したことから周波数3MHz〜10MHzにおいてより生きた癌細胞を選択的に捕捉することができる。
実施例1と同様にして、ステージIVの乳癌患者血液、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施し、生きた癌細胞を濃縮した。なお、密度差分離における遠心条件は2000×g、10分間、室温にて実施した。実施例5では、分離濃縮構造体の下側の筒状部材3に、密度が1.091g/mL、浸透圧380mOsm/kgを2mL注入した。遠心分離後、実施例1と同様にして、細胞の回収、洗浄を行い、癌細胞が濃縮された細胞懸濁液を得た。
実施例1と同様にして、ステージIVの乳癌患者血液、生理食塩水、結合剤の混合液を密度勾配溶液の上へ重層し、遠心分離、回収操作を実施した。なお、密度差分離における遠心条件は2000×g、10分間、室温にて実施した。実施例6では、分離濃縮構造体の下側の筒状部材3に、密度が1.091g/mL、浸透圧380mOsm/kgを2mL注入した。遠心分離後、実施例1と同様にして、細胞の回収、洗浄を行い、癌細胞が濃縮された細胞懸濁液を得た。
図2に示した構造体の収容部細胞懸濁液を導入し、基板間に交流電圧(電圧20Vpp、周波数1MHz、矩形波)を印加し、誘電泳動力により細胞を保持孔に捕捉した。
次に収容部へ800μLの細胞染色液(FITC標識抗CK抗体、PE標識抗CD45抗体、DAPI(0.5μg/mL)を混合した細胞染色液)を送液し、細胞標識を行った後(25℃、30分)、マンニトール水溶液にて洗浄し、CTCを検出した。CTCおよび正常な白血球細胞はともに核を有しているためDAPIで染色され、赤血球や死細胞片などの核を有していないものは検出ソフトで排除した。また、CTCはCD45を発現していないが、CKを発現しているCTC(CK陽性CTC)、発現していないCTC(CK陰性CTC)が存在するため、DAPI陽性、CD45陰性、CK陽性および陰性の細胞を画像処理により抽出した。正常な白血球細胞はCD45を発現しているが、CKを発現していないため、DAPI陽性、CK陰性、CD45陽性細胞を検出することでCTCと識別した。
以上、白血球でない異常細胞を含む、CTCの一連の検出フローを図9に示した。
2 筒状部材(上側)
3 筒状部材(下側)
4 キャップ
5 底部
6 連通開口端(分離部)
7 保持孔(貫通孔)
8 構造体
9 基板
10 上蓋基板
11 絶縁膜
12 遮光膜
13 収容部
14 導入口
15 排出口
16 電極(+)
17 電極(−)
18 櫛状電極
19 交流電源
20 光
21 検出部
22 導電線
23 細胞
24 誘電泳動力
25 密度勾配溶液
26 混合液
27 界面
Claims (6)
- 血液中の生きた腫瘍細胞の検出方法であって、
血液試料から生きた腫瘍細胞を、
比重が、1.091 〜1.093g/mL、かつ浸透圧が、380 〜 400mOsm/kgの範囲である密度勾配溶液、または
比重が、1.077〜1.084g/mL、浸透圧が、300mOsm/kg の範囲である密度勾配溶液
を用いて濃縮液を得る第1工程と、
前記第1工程で得られた濃縮液を基板上に展開する第2工程と、
前記基板上に展開された標的細胞を検出する第3工程と、
を備えることを特徴とする血液中の腫瘍細胞の検出方法。 - 前記密度勾配溶液の比重が、1.091 /mL、かつ浸透圧が、380 〜 400mOsm/kgの範囲である、請求項1に記載の生物試料検出方法。
- 第1工程が、生物試料中の生細胞と死細胞との間の比重差を用いて濃縮する工程である、請求項1又は2に記載の生物試料検出方法。
- 第1工程が、一端は閉塞して底部を形成し、他端は開口した筒状の構造体と、開口を密閉するキャップからなり、前記構造体は2以上の筒状部材より構成され、分離部にて分離可能である構造体を用いて生物試料から生細胞を濃縮する、請求項3に記載の生物試料検出方法。
- 前記基板上に複数の保持孔が設けられており、
前記濃縮液に含まれる生物試料細胞を誘電泳動力により基板上に展開する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の生物試料検出方法。 - 前記標的細胞が、循環腫瘍癌細胞(CTC)である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の生物試料検出方法。
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