KR20160033798A - 체세포의 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (ｉｒｎｓｃｓ) 로의 전환 - Google Patents

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클라우스 크리스텐센
마르틴 그라프
로베르토 이아코네
라비 자가시아
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 출원은 체세포를 신경 줄기 세포 (NSC) 로 전환하는 방법에 관한 것이다. 더욱이 본 출원은 유전자 형질도입 및 화학적으로 규명된 배지 유도의 연결된 단계에 기초하여 인간 섬유모세포, 각질세포 또는 지방세포를 신경 줄기 세포로 전환하는 방법에 관한 것이다.

Description

체세포의 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (ＩＲＮＳＣＳ) 로의 전환 {CONVERSION OF SOMATIC CELLS TO INDUCED REPROGRAMMED NEURAL STEM CELLS (IRNSCS)}
본 출원은 체세포를 신경 줄기 세포 (신경 줄기 세포: NSC) 로 전환하는 방법에 관한 것이다. 더욱이 본 출원은 유전자 형질도입 및 화학적으로 규명된 배지 유도의 연결된 단계에 기초하여 인간 섬유모세포, 각질세포 또는 지방세포를 신경 줄기 세포로 전환하는 방법에 관한 것이다.
완전히 분화된 체세포가 절대 불가역 특성을 갖는다는 정설이 오랫 동안 일반적으로 받아들여졌다. 이는 일련의 선도적 실험들이 상이한 쌍의 세포 유형의 융합에 의해 침묵 유전자 발현 프로파일이 완전히 재활성화될 수 있음을 밝혔을 때 변하기 시작했다 (Blau, H. M. How fixed is the differentiated state? Lessons from heterokaryons. Trends Genet. 5, 268-272 (1989)). 더욱 최근에는 체세포 유형으로부터의 핵을 제핵 난 세포 내로 전달함으로써 체세포의 유전자 발현 프로파일의 완전 복귀 및 새로운 전체 동물을 생성할 수 있는 다능성 세포의 형성이 초래될 수 있음이 밝혀졌다 (예를 들어 Gurdon, J. B. & Melton, D. A. Nuclear reprogramming in cells. Science 322, 1811-1815 (2008) 를 참조). Yamanaka 및 동료들 (Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006)) 은 4 가지 규명된 인자 (Sox2, Oct4, Klf4, c-Myc) 를 형질도입함으로써 체세포가 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 로 재프로그래밍될 수 있음을 입증했다. 섬유모세포, 각질세포 및 지방세포를 포함하는 상이한 유형의 체세포가 iPSC 다능성 상태로 재프로그래밍된 바 있다. 지난 몇 년 동안 특정 체세포 유형이 신경세포와 같이 완전히 상이한 체세포 유형으로 전환분화될 수 있는지 여부에 대한 의문이 생겼다. Wernig 및 동료들은 이러한 의문을 다뤄서 3 가지 결정적 유전자: Mash1, Brn2 및 Myt1l 의 형질도입에 의한 마우스 섬유모세포의 기능적 신경세포로의 직접 전환을 보였다 (Wernig at al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 25;463(7284):1035-41 (2010)). 그러나 수득된 신경세포는 감수분열후 세포로서 정의상 증식할 수 없고 동결 및 해동 절차를 용인하지 않는다. US2010/0021437 은 섬유모세포로부터 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하고 그러한 세포를 신경 표현형으로 분화를 유도하는 방법을 공개한다.
그러나, 분화된 체세포의 신경 줄기 세포로의 직접 전환은 이전에 기술된 바 없다. 신경 줄기 세포는 다능성 줄기 세포이고 특정 조건 하에 증식하는 것으로 보고된다. 신경 줄기 세포는 화학적으로 규명된 배지, 예를 들어 FGF (섬유모세포 성장 인자 2) 및 EGF (표피 성장 인자) 로 보충된 N2B27 배지 (N2B27 은 N2 및 B27 (둘다 Gibco 사제) 로 보충된 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK) 의 1:1 혼합물임) 를 요구한다. 신경 줄기 세포는, 예를 들어 폴리-오르니틴/라민 코팅된 플레이트 상에서, 단층 부착 배양으로서 또는 비-부착 세포 배양 플레이트 내에서 부유 신경구로서 성장할 수 있다. 2 가지 유형의 신경 줄기 세포 배양 (신경구, 부착 배양) 이 완벽히 호환가능한 것으로 보고되었다. 신경 줄기 세포는 무한정 성장하면서도 여전히 완전히 다능성으로 유지될 수 있다. 특정 조건 하에 신경 줄기 세포는, 신경세포, 별아교세포 및 희소돌기아교세포를 포함하는, 성체 뇌를 구성하는 세포 유형으로 분화된다. 신경 줄기 세포는 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 및 척수 외상이 있는 환자를 치료할 수 있는 치료제로 여겨진다.
신경 줄기 세포는 시험관 내에서 배아 줄기 세포 (ESC) 로부터 생성되거나 (Chambers et al. Nature 27;3 (2009)), 뇌 샘플로부터 직접 단리될 수 있는 것으로 알려져 있다 (Reynolds BA, Rietze RL (2005) Nat Methods 2:333-336). 그러나 지금까지 알려진 이러한 방법들은 다수의 매우 민감한 윤리적 문제를 제기하고/거나 재현성으로 심각한 어려움을 겪는 복잡하고 힘든 기술을 필요로 하는 등 많은 중대한 결점을 갖는다. 지금까지 신경 줄기 세포가 분화된 체세포로부터 직접 유도될 수 있는 방법은 기술된 바 없다. 원칙적으로, 신경 줄기 세포는 분화된 세포로부터 유도된 iPSC 로부터 수득될 수 있었다. 그러나, 이는 iPSC 의 배양을 의미할 것이다. iPSC 는 무한 증식하는 것으로 보고된 바 있으나 배양 조건이 복잡하고 엄청난 노력을 요구한다. 또한 다능성 줄기 세포로부터 신경 줄기 세포의 유도는 확률적 메카니즘으로 인해 변동하는 것으로 보고된 바 있다. iPSC 및 ESC 의 흔한 장애물은 심지어 소수의 미분화 세포라도 기형종 (여러 세포 유형을 포함하는 생식 세포 종양) 의 형성을 초래할 수 있다는 점이며, 이는 무시될 수 없는 심각한 오염을 야기한다. 체세포성 줄기 세포, 예컨대 신경 줄기 세포는 기형종을 형성하지 않는다. 따라서 신경 줄기 세포를 생성하는 쉽게 접근가능하고 재현가능한 기술이 여전히 필요하다. 본 발명은 체세포를 직접 신경 줄기 세포로 전환하는 방법을 제공한다. 이러한 신규한 방법은 iPS 세포를 수득할 필요를 덜고, 따라서 기형종 형성의 위험을 제거한다. 그러한 기형종 형성 능력이 없는 세포는 재생 의약 적용에 유용하고 안전하다. 바람직하게는 상기 체세포는 포유류 체세포, 가장 바람직하게는 인간 체세포이다. 상기 인간 체세포는 건강한 개체 또는 환자로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포, 가장 바람직하게는 섬유모세포이다. 상기 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포는 환자 또는 건강한 개체로부터, 예를 들어 피부 생검과 같은 비침습적 방법에 의해 또는 뽑힌 머리카락으로부터 용이하고 안전하게 유도될 수 있다. 본 발명의 방법은 체세포 예컨대 건강한 또는 병든 개체로부터의 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포를 신경 줄기 세포로 직접 전환할 수 있다. 이러한 건강한 개체 또는 환자 특이적 신경 줄기 세포는 무한 증식될 수 있다. 배양은 용이하고 잘 특징화되어 있다. 건강한 개체 및 환자 특이적 신경 줄기 세포 부분표본을 재현성 있게 동결 및 해동하는 것이 가능하다. 특히, 환자 유래 신경 줄기 세포는 CNS 질환의 병리생리학을 연구하기 위한 질환 관련 시험관내 모델을 대표한다. 환자 특이적 체세포의 신경 줄기 세포로의 직접 전환은 환자 특이적 신경 줄기 세포의 바이오뱅크를 생성하는 쉽게 접근가능하고 재현가능한 기술을 대표한다. 그러한 바이오뱅크는 CNS 관련 질환에 매우 적절하며, CNS 관련 질환은 신경 줄기 세포로부터 생성된 하기 3 가지 세포 유형 중 하나 이상에서 명백한 병리가 기재된 바 있다: 신경세포, 희소돌기아교세포 및 별아교세포. 그러므로 본원에 기재된 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 유효하고 안전한 약물을 스크리닝하는 귀중한 질환 모델이다.
여러가지 신경변성 질환은 신경세포 상실을 특징으로 한다. 성체 뇌의 재생 능력은 뇌 손상 및 신경변성 질환에 반응하여 약간 제한된다. 게다가, 감수성 신경세포 집단이 점진적으로 상실되므로 약물 개입의 효과가 종종 점점 더 작아진다. 본원에 기재된 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 신경변성 질환 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS/루게릭병) 또는 척수 외상을 치료하는 재생 의약에도 사용될 수 있다. 본원에 기재된 혁신적 방법으로 이제 세포 이식 치료에서 사용하기에 충분한 양의 신경원성 전구체 세포를 제공하는 것이 가능하다. 신경 줄기 세포는 건강한 개체 또는 환자로부터 단리된 체세포로부터 수득될 수도 있다. 본원에 기재된 방법으로 수득되는 환자 특이적 신경 줄기 세포는 자가 세포 이식 치료를 위한 매력적인 새로운 공여자 공급원이며, 이를 이용하면 환자와 공여자 사이의 면역 부적합성으로 인한 임의의 면역 거부가 일어나지 않는다. 이러한 전략은 세포 이식 치료에 있어서 면역 억제제의 필요성을 제거할 것이다. 더욱이, 다양한 HLA 동형접합 대립유전자를 갖는 건강한 개체에서 유래하는 신경 줄기 세포의 바이오뱅크를 생성하여 필요한 개체를 치료하기 위한 공여자 뱅크로서 사용할 수 있다. 적합성 HLA 유형을 갖는 신경 줄기 세포의 이종 이식은 이식된 세포의 거부를 초래할 수 있는 원치 않는 면역 반응의 위험을 감소시킨다.
(1) 하기 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포 (NCS) 의 제조 방법:
a) 체세포를 제공하는 단계,
b) Bmi1, Sox2, Mash 1, Sox11, Emx2, Foxg1 및 Pax6 의 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 유전자를 도입함으로써 상기 체세포를 NSC 로 재프로그래밍하는 단계; 및
c) 성장 인자 및 소분자로 재프로그래밍을 유도하는 단계.
(2) (1) 에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
d) 단계 b) 및 c) 의 산물을 NSC 의 증식에 적합한 조건 하에 인큐베이팅하는 단계.
(3) (1) 또는 (2) 에 있어서, 단계 a) 의 체세포가 인간 세포인 방법.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 단계 a) 의 체세포가 섬유모세포, 각질세포 및 지방세포의 군으로부터 선택되는 방법.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 단계 c) 의 성장 인자 및 소분자가 화학적으로 규명된 배지의 보충물인 방법.
(6) (5) 에 있어서, 화학적으로 규명된 배지가 인슐린, 트랜스페린 및 프로게스테론을 보충한 무혈청 배지인 방법.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 단계 b) 의 2 가지 이상의 유전자가 Bmi1 및 Sox2 를 포함하는 방법.
(8) (7) 에 있어서, 단계 b) 의 2 가지 이상의 유전자가 Mash1, Sox11, Emx2, Foxg1 및 Pax6 의 군으로부터 선택되는 1 가지 이상의 유전자를 부가적으로 포함하는 방법.
(9) (7) 또는 (8) 에 있어서, 단계 b) 의 2 가지 이상의 유전자가 Bmi1, Sox2 및 Mash1 을 포함하는 방법.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 단계 c) 의 성장 인자가 FGF2, EGF 및 BDNF 의 군으로부터 선택되는 방법.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 단계 c) 의 소분자가 ROCK 저해제를 포함하는 방법.
(12) (11) 에 있어서, ROCK 저해제가 1-(5-이소퀴놀린술포닐) 호모피페라진, N-벤질-2-(피리미딘-4-일아미노)티아졸-4-카르복사미드, (+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜) 시클로-헥산카르복사미드 디히드로클로리드) 및 N-{(3R,4R)-4-[4-(2-플루오로-6-히드록시-3-메톡시-벤조일)-벤조일아미노]-아제판-3-일}-4-히드록시-3,5-디메틸-벤즈아미드의 군으로부터 선택되는 방법.
(13) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 체세포가 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 저해제로 전처리되는 방법.
(14) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 체세포의 재프로그래밍이 2 가지 이상의 유전자의 조합을 렌티바이러스로 전달함으로써 달성되는 방법.
(15) (1) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는 신경 줄기 세포.
(16) (15) 의 신경 줄기 세포의, CNS 질환에 대한 시험관내 모델로서의 용도.
(17) (15) 의 신경 줄기 세포를 포함하는 치료 조성물.
(18) (17) 에 있어서, 신경 줄기 세포가 신경세포 또는 신경아교세포로 분화되는 치료 조성물.
(19) (1) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는 NSC 의 바이오뱅크.
(20) 본원에 본질적으로 기재된 방법 및 용도.
도 1: 인간 섬유모세포를 irNSC 로 전환하는 방법의 도식적 표현. 제 0 일: 인간 섬유모세포를 트립신처리하고, 유도 배지 (FGF, EGF 30 ng/㎖; BDNF 20 ng/㎖; 파수딜 10 μM, 폴리브렌 4 ㎍/㎖ 함유 N2B27) 를 사용하여 유전자와 네스틴 GFP 리포터의 조합으로 작은 부피로 트랜스펙션시켰다. 섬유모세포를 정상 조직 배양 플레이트에 10000 - 30000 세포/㎠ 의 농도로 플레이팅했다. 제 1 일: 새로운 유도 배지로 배지 교환. GFP / 네스틴 양성 (GFP+) irNSC 가 매우 낮은 빈도 (100000 개 중 ~50 개 irNSC GFP+) 로 나타나기 시작했다. 제 2 일: GFP+ irNSC 가 수가 점점 증가했고 함께 이동하여 세포 무리를 형성하기 시작했다. 제 3 일: 세포 무리가 투명한 회전타원체 구조로 조직되고 위로 떠올라 GFP+ 신경구로서 부유하기 시작했다. 추가의 증식을 위해 20 ㎛ 보다 큰 신경구를 계수하고 수확했다.
도 2: 인간 네스틴 GFP 리포터 렌티바이러스의 도식적 표현. 형광 단백질 copGFP 및 제오신 선택 마커를 최소 CMV 프로모터에 연결된 인간 네스틴 인트론 2 로부터의 1.8 kb 인핸서 조각의 발현 제어 하에 클로닝했다.
도 3: 재프로그래밍 유도 방법 제 1 일의 irNSC. 상부 패널: 인간 미형질전환 태아 폐 섬유모세포 IMR90 (위상 대조). 하부 패널: irNSC GFP+ 세포의 생성 (위상 대조 및 GFP 채널).
도 4: 재프로그래밍 유도 방법 제 2 일의 irNSC. 세포가 함께 가까이 이동하는 경향이 있고 중심에 irNSC GFP+ 가 있는 회전타원체 구조를 형성하기 시작한다 (위상 대조 및 GFP 채널).
도 5: 재프로그래밍 유도 방법 제 3 일의 irNSC. 제 2 일에 형성된 회전타원체 구조가 이제 완전히 성숙하여 배지에서 부유하는 신경구로서 보인다. 신경구는 직경이 20 - 100 ㎛ 이고, 세포 밀도가 높다. irNSC 는 네스틴 GFP 발현에 의해 라벨링되고 거의 모든 신경구에서 동정될 수 있지만, 모든 신경구가 동일한 비율의 irNSC GFP+ 를 갖는 것은 아니다 (위상 대조 및 GFP 채널).
도 6: 유전자의 상이한 조합으로 생성된 신경구의 수.
도 7: Sox2 - Bmi1 로 형질도입 후 부착된 신경구. 부착된 신경구는 신장된 이극 세포의 특징적 형태를 보인다. 하부 패널: 더 높은 배율의 irNSC GFP+ 신경구.
도 8: EGF 및 FGF 철수 1 주 후 분화된 세포. 증식 성장 인자의 철수시 irNSC 는 신경세포 마커 tuj1 에 대해 양성으로 염색된 매우 얇은 돌출부가 있는 세포를 초래한다.
도 9: 증식을 위한 irNSC 신경구의 뱃치의 생성 및 특성분석. 인간 섬유모세포 IMR90 3백6십만 개를 트립신처리하고, 파수딜 10 μM 및 폴리브렌 4 ㎍/㎖ 를 보충한 유도 배지 (FGF, EGF 30 ng/㎖ BDNF 20 ng/㎖ 함유 N2B27) 를 사용하여 Sox2, Bmi1, 네스틴 GFP 리포터로 작은 부피로 감염시켰다. 제 4 일 ~ 제 8 일: 50 ㎛ 보다 큰 GFP+ 신경구를 수확하고 나아가 증식을 위해 사용했다. 신경구의 절반은 파수딜 함유, 나머지 절반은 파수딜 미함유 증식 배지 (FGF, EGF 30 ng/㎖ BDNF 20 ng/㎖ 함유 N2B27) 를 사용하여 증식시켰다. 제 15 일: 파수딜 함유 증식 배지에서 성장한 신경구는 형태가 더 양호하고 경계가 선명하다 (잘 형성된 신경구의 특징, 패널 B); 파수딜 미함유 증식 배지에서 성장한 신경구는 경계가 흐릿하다 (패널 A).
도 10: NSC 마커 Sox2 및 네스틴의 발현에 대한 irNSC 신경구의 면역세포화학 특성분석. 제 15 일: 파수딜로 증식된 irNSC 신경구를 PO/Lam 코팅된 플레이트에 플레이팅하고, 48h 후 Sox2 및 네스틴 발현에 대해 염색했다. irNSC 신경구가 부착되었고, 구로부터 irNSC 가 확산되었다. irNSC 는 전형적인 NSC 형태를 갖고, Sox2 및 네스틴 양성이었다. 패널 A: 병합 및 단일 채널 DAPI, Sox2, 네스틴; 20x 배율; 패널 B: 병합 채널 DAPI, Sox2, 네스틴; 10x 배율.
도 11: irNSC 신경구 생성에 대한 파수딜과 발라놀-유사-324 화합물의 자극의 비교. 인간 섬유모세포 IMR90 을 트립신처리하고, 파수딜 10 μM (사선 그래프) 또는 발라놀-유사-324 화합물 2 μM (검은색 그래프) 를 보충한 유도 배지 [FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖; 폴리브렌 4 ㎍/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies)] 를 사용하여 Sox2, Bmi1, 네스틴 GFP 리포터로 작은 부피로 감염시켰다. 섬유모세포를 정상 조직 배양 플레이트에 10000 - 30000 세포/㎠ 의 농도로 플레이팅했다. 제 1 일: 새로운 유도 배지로 배지 교환. 제 4 일: 50 ㎛ 보다 큰 GFP+ 신경구를 계수했다. 발라놀-유사-324 소화합물은 신경구 생성의 효율을 약 2 배 (1.9) 증가시켰고, 재현성이 더 양호하다 (STDEV, n=3).
도 12: 발프로산 (VPA) 에 의한 인간 섬유모세포의 전처리는 GFP+ irNSC 신경구의 수율을 개선한다. 인간 섬유모세포 IMR90 을 Sox2, Bmi1, 네스틴 GFP 리포터로 감염하기 전에 HDAC 저해제 발프로산 (2-프로필-펜탄산, 일나트륨 염) (1mM) 으로 또는 그것 없이 48 시간 동안 전처리했다. 유도 배지: FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖; 발라놀-유사-324 2μM 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies). 제 7 일: 50 ㎛ 보다 큰 신경구를 계수했고 (패널 A), 신경구 1 개 당 GFP+ irNSC 의 평균 수가 보고되어 있다 (패널 B). VPA 전처리하여 생성된 irNSC 신경구에 대한 대표적 사진 (패널 C). VPA 전처리는 제 7 일의 신경구 수에 크게 영향을 미치지 않았지만; VPA 처리는 GFP+ irNSC 의 수를 증가시켰다 (2.1 배) (STDEV, n=3).
도 13: irNSC 신경구의 효율적 유도를 위한 Sox2 및 Bmi1 과 조합된 유전자의 최소 풀의 규정. Sox2, Bmi1, 네스틴 GFP 리포터 + 상이한 후보 유전자로 감염시켜 상승작용을 다루기 전에, 인간 섬유모세포 IMR90 을 48 시간 동안 VPA (1mM) 로 전처리했다. 유도 배지: FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖ 및 발라놀-유사-324 화합물 2μM 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies). 제 7 일의 50 ㎛ 보다 큰 irNSC 신경구의 정량화. irNSC 의 생성에 있어서 Mash1, Emx2, Foxg1, Pax6 및 Sox11 은 Bmi1 및 Sox2 와 상승작용한다.
도 14: 성체 인간 진피 섬유모세포 (HDFa) 로부터의 irNSC 신경구의 생성. 성체 인간 진피 섬유모세포는 GIBCO (카탈로그 번호: C-013-5C) 에 의해 제공된다. 성체 인간 진피 섬유모세포를 트립신처리하고, 파수딜 10μM 을 보충한 유도 배지 [FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies)] 를 사용하여 Sox2, Bmi1, 네스틴 GFP 리포터로 작은 부피로 감염시켰다. 제 8 일: irNSC 신경구가 탐지된다 (대표적 사진 2.5 및 10X 배율).
도 15: 아스코르브산, 소닉 헤지호그 (Shh), Jagged1, DLL4 및 FGF8 의 조합을 사용한 irNSC 신경구의 증식으로 irNSC GFP+ 의 단층 배양물을 수득함. 인간 섬유모세포 IMR90 을 유도 배지 [FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖; 발라놀-유사-324 2μM 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies)] 를 사용하여 Sox2, Bmi1, Mash1 및 네스틴 GFP 리포터로 감염시켰다. 제 7 일: 50 ㎛ 보다 큰 신경구를 수확하고, 나아가 증식 배지 [FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖; 발라놀-유사-324 2μM; 아스코르브산 0.2mM, SHH (재조합 인간 소닉 헤지호그, 카탈로그 번호: 1845SH) 500 ng/㎖, FGF8 (재조합 인간 FGF8a 동형, 카탈로그 번호: 4745F8) 100 ng/㎖, DLL4 (재조합 인간 DLL4, 카탈로그 번호: 1506D4) 500 ng/㎖, Jagged1 (재조합 인간 톱니모양 1 Fc 키메라, 카탈로그 번호: 1277JG) 500 ng/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies)] 로 증식시키고, FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies) 에서 2 일 동안 배양한 hESC-유래 NSC 로부터 1/10 로 배지를 조정했다. 위에 보고된 증식 배지로 증식시킨 제 14 일의 irNSC 신경구에 대한 대표적 사진 (패널 A). 신경구는 경계가 명확하고, 신경구로부터 가시의 돌출을 관찰할 수 있다 (패널 B, 줌 인). 제 21 일에 증식된 irNSC 신경구를 해리시키고 PO/Lam 코팅된 플레이트에 플레이팅하여 irNSC GFP+ 의 균일 단층 배양물을 수득했다 (패널 C, 단층에서 배양 4 일 후 irNSC 단층의 위상 대조 및 GFP 채널).
도 16: NSC 마커 네스틴 및 조기 신경세포 마커 Tuj1 의 발현에 대한 irNSC 신경구의 면역세포화학 특성분석. 제 21 일: 도 15 에 기재한 바와 같이 생성한 irNSC 신경구를 해리시키고 NSC 자가-재생 상태 [FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies)] 에서 플레이팅하여 네스틴 마커의 발현을 시험하거나 (패널 A 48h 후, 모든 세포가 네스틴+ 및 Tuj1- 이다), 분화 조건 (BDNF 20 ng/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 분화 키트 (Human, StemCells Technologies)) 에서 플레이팅하고 제 7 일에 Tuj1 및 네스틴에 대해 염색했다 (패널 B, 모든 세포가 Tuj1+ 이고, 적은 세포가 네스틴+ 이다).
본원에 기재된 진보적 발전을 달성하기 위해, 재프로그래밍의 현존 제한 중 일부를 우회할 뿐만 아니라, 유전자 형질도입과 특이적 배지에 의한 유도 단계의 이용을 조합할 필요가 있었다.
본원에서 제공되는 것은 하기 단계를 포함하는, 체세포를 신경 줄기 세포 (NSC) 로 전환하는 방법이다:
a) 체세포를 제공하는 단계;
b) 2 가지 이상의 유전자를 도입함으로써 상기 체세포를 신경 줄기 세포로 재프로그래밍하는 단계;
c) 성장 인자 및 소분자로 재프로그래밍을 유도하는 단계.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 부가적으로 포함한다:
d) 단계 b) 및 c) 의 산물을 신경 줄기 세포의 증식에 적합한 조건 하에 인큐베이팅하는 단계. 전형적으로 단계 b) 및 c) 의 산물은 세포 배양물 중에서 신경구로서 용이하게 동정될 수 있다. 바람직하게는 신경 줄기 세포의 증식에 적합한 상기 조건은 상기 신경구를 수확하고 이를 화학적으로 규명된 배지에서 증식시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배지는 증식 배지이고, 신경구는 비-부착 배양 조건에서 배양된다. 증식 배지의 비제한적 예는 아래 추가로 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "체세포" 는 생식계열 세포 (예를 들어 정자 및 난자, 그들의 생성 기원인 세포 (생식모세포)) 및 미분화 줄기 세포가 아닌 유기체의 몸을 형성하는 임의의 세포를 언급한다. 내장, 피부, 뼈, 혈액 및 결합 조직은 모두 체세포로 이루어진다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 바람직한 체세포는 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포이고, 바람직하게는 피부 생검으로부터 수득된다.
바람직하게는, 신경 줄기 세포로의 전환에 사용되는 체세포의 기원은 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다. 상기 인간 체세포는 건강한 개체 또는 환자로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포의 군으로부터 선택된다. 이들 공여자 세포는 임의의 적합한 공급원으로부터 용이하게 수득될 수 있다. 본원에서 바람직한 것은 인간 신체에 침습적 절차를 수행하지 않고 공여자 세포를 단리할 수 있게 하는 공급원이다. 섬유모세포의 단리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 섬유모세포는 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 다양한 기관 조직 또는 피부 조직으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 섬유모세포는 폐 섬유모세포, 포피 섬유모세포, 및 성체 진피 섬유모세포이다. 본 발명의 특별한 구현예에서, 상기 인간 섬유모세포는 환자로부터, 예를 들어 피부 생검에 의해 수득된다 (예를 들어, Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. George Q. Daley et al. Nature 2008; A method for the isolation and serial propagation of keratinocytes, endothelial cells, and fibroblasts from a single punch biopsy of human skin, Normand et al. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 1995). 지방세포 및 각질세포도 피부 생검에 의해 또는 뽑힌 머리카락으로부터 용이하게 유도될 수 있고 (Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells, Belmonte et al. Nature Protocols 2010), 또한 본 발명의 방법에 바람직한 공여자 세포이다.
본 발명의 하나의 바람직한 양상은 환자 특이적 신경 줄기 세포의 생성 방법이다. 본 발명의 또다른 양상은 건강한 개체로부터 수득되는 체세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 방법이다.
본원에서 사용되는 "신경 줄기 세포" 는, 예를 들어 네스틴를 포함하는, 일부 신경 마커를 발현하는 다능성 세포의 아집단을 언급한다. 본원에 기재된 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 ("irNSC": induced reprogrammed neural stem cell) 로도 언급된다. 신경 줄기 세포는 무한 증식될 수 있고, 신경세포 또는 아교세포 (예를 들어 별아교세포 및 희소돌기아교세포) 로 분화될 수 있다. 용어 "환자 특이적 신경 줄기 세포" 는 환자의 체세포로부터 수득되는 신경 줄기 세포를 언급하고, 자가 신경 줄기 세포로도 언급된다. 본원에서 사용되는 "건강한 개체로부터 수득되는 신경 줄기 세포" 는 임의의 장애 또는 질환을 앓는 것으로 의심되지 않는 개체의 체세포로부터 수득되는 신경 줄기 세포를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍" 은 체세포를 덜-분화된 세포로 전환하기 위해, 예를 들어 섬유모세포, 지방세포 또는 각질세포를 신경 줄기 세포로 전환하기 위해, 필요한 하나 이상의 단계를 언급한다. 체세포의 신경 줄기 세포로의 재프로그래밍은 신경 줄기 세포 특성을 유지하는데 관여하는 2 가지 이상의 유전자를 도입함으로써 달성된다. 체세포의 신경 줄기 세포로의 재프로그래밍에 적합한 유전자는 Sox2 (Seq ID No. 1), Brn2 (Seq ID No. 2), Bmi1 (Seq ID No. 3), Mash1 (Seq ID No. 4), Sox11 (Seq ID No. 5), NCam (Seq ID No. 6), Kpna1 (Seq ID No.7), Foxg1 (Seq ID No. 8), Emx2 (Seq ID No.9) 및 Pax6 (Seq ID No. 10) 을 포함하나, 이에 재한되지는 않는다. 바람직한 구현예에서 2 가지 이상의 유전자가 도입되고, 또다른 바람직한 구현예에서 3 가지 유전자가 도입된다. 체세포에 도입되는 유전자의 바람직한 조합은 Bmi1 및 Sox2 를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서 2 가지 이상의 유전자의 이러한 조합은 Mash1 을 부가적으로 포함한다. 또다른 구현예에서 2 가지 이상의 유전자의 이러한 조합은 Mash1, Emx2, Foxg1, Pax6 및 Sox11 의 군으로부터 선택되는 1 가지 유전자를 부가적으로 포함한다. 추가의 구현예에서 2 가지 이상의 유전자의 조합은 Bmi1 및 Sox2 및 Mash1 을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자의 도입" 은 체세포에서 상기 유전자의 안정적 발현을 초래하는 임의의 방법을 언급한다. 상기 유전자는, 재프로그래밍 벡터를 통한 세포 내로의 전달에 의해 또는 소분자를 통한 상기 유전자의 활성화에 의해, 당업계에 공지된 방법에 의해 체세포 내로 도입된다. 재프로그래밍 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 플라스미드 및 트랜스포존이다. 상기 유전자의 전달에 렌티바이러스를 사용하는 것이 본원에서 바람직하다. 상기 유전자의 강한 활성화에 적합한 소분자의 예는 DNA 메틸화 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 에르골린 (예를 들어 리세르그산 에틸아미드), 플라본 (예를 들어 7' 히드록시플라본), 파울론 (예를 들어 켄파울론) (Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4 PNAS 2009 106 (22) 8912-8917), L-유형 채널 아고니스트 (예를 들어 BIX01294), BayK8644 및 5' 아자시티딘 (Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds Yan Shi et al. Cell Stem Cell - 6 November 2008 (Vol. 3, Issue 5, pp. 568-574)) 이다. 재프로그래밍을 성공적으로 유도하기 위해 체세포는 성장 인자 및 소분자로 보충된 적합한 배지에서 성장된다. 본원에서 사용되는 용어 "성장 인자" 는 세포 증식을 야기하는 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미하고, 성장 인자 및 그의 유사체 둘다를 포함한다. 이들은 표피 성장 인자, 전환 성장 인자, 신경 성장 인자, 산성 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 및 혈관생성 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자 예를 들어 소마토메딘, 점액종 및 우두 바이러스-유래 성장 인자를 제한 없이 포함한다. 본원에서 사용되는 바람직한 성장 인자는 BDNF (뇌-유래 신경영양 인자), FGF2 (섬유모세포 성장 인자 2) 및 EGF (표피 성장 인자) 이다. 성장 인자는 단독으로 또는 쌍 조합으로 사용될 수 있거나, 가장 바람직하게는 모든 3 가지 인자가 함께 사용된다. 또한 섬유모세포는 1 가지 이상의 소분자의 존재 하에 배양된다. 본원에서 사용되는 용어 "소분자", 또는 "소화합물" 은 합성되거나 자연에서 발견되는 유기 또는 무기 분자를 언급하며, 일반적으로 분자량이 10,000 grams/mole 미만, 임의로 5,000 grams/mole 미만, 임의로 2,000 grams/mole 미만이다. 하나의 바람직한 구현예에서 상기 소분자는 단백질 키나제의 Rho-연합 코일형-코일 형성 (Rho-associated coiled-coil forming) 단백질 세린/트레오닌 키나제 (ROCK) 패밀리의 저해제를 포함한다. ROCK 저해제의 비제한적 예는 파수딜 (1-(5-이소퀴놀린술포닐)호모피페라진), 티아조비빈 (N-벤질-2-(피리미딘-4-일아미노)티아졸-4-카르복사미드), Y27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜) 시클로-헥산카르복사미드 디히드로클로리드) 및 발라놀-유사-324 화합물 (N-{(3R,4R)-4-[4-(2-플루오로-6-히드록시-3-메톡시-벤조일)-벤조일아미노]-아제판-3-일}-4-히드록시-3,5-디메틸-벤즈아미드) 를 포함한다. 또다른 구현예에서 상기 소분자는 키나제 AMPK (AMP-활성화 단백질 키나제, 베타 1 비-촉매적 서브유닛; 공식 기호: PRKAB1), CHK2(CHK2 체크포인트 동족체 (S. pombe), 공식 기호: CHEK2), MSK1 (리보솜 단백질 S6 키나제, 90kDa, 폴리펩티드 5; 공식 기호: RPS6KA5), PKA(단백질 키나제, cAMP-의존성, 촉매적, 알파; 공식 기호: PRKACA), PKGa (단백질 키나제, cGMP-의존성, 유형 I; 공식 기호: PRKG1) 및 SGK1(혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제 1, 공식 기호: SGK1) 중 하나 이상의 저해제로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 "재프로그래밍의 유도에 적합한 배지" 는 "유도 배지" 로도 언급되며, 체세포의 재프로그래밍의 유도에 유용한 임의의 화학적으로 규명된 배지를 언급한다. 본원에서 바람직한 것은 인슐린, 트랜스페린 및 프로게스테론으로 보충된 무혈청 배지이다. 본원에서 사용되는 바람직한 배지는 10-50 ㎍/㎖ 인슐린, 10-100 ㎍/㎖ 트랜스페린 및 10-50 nM 프로게스테론을 함유한다. 재프로그래밍의 유도에 적합한 무혈청 배지의 예는 N2B27 배지 (N2B27 은 N2 및 B27 (둘다 Gibco 사제) 로 보충된 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK) 의 1:1 혼합물임), N3 배지 (DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK), 25 ㎍/㎖ 인슐린, 50 ㎍/㎖ 트랜스페린, 30 nM 나트륨 셀레나이트, 20 nM 프로게스테론 (Sigma), 100 nM 푸트레신 (Sigma) 으로 구성됨), 또는 NeuroCult® NS-A 증식 배지 (Stemcell Technologies) 이다. 본원에서 가장 바람직한 것은 FGF2, EGF, BDNF 및 ROCK 저해제로 부가적으로 보충된 위에 기재된 무혈청 배지이다. 바람직하게는, 상기 ROCK 저해제는 파수딜 또는 발라놀-유사-324 화합물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 배지는 10-50 ng/㎖ FGF2, 10-50 ng/㎖ EGF, 1-20 ng/㎖ BDNF 및 1-50 μM 파수딜 또는 1-10 μM 발라놀-유사-324 화합물로 보충된다. 2 가지 이상의 유전자를 도입한 후, 재프로그래밍될 체세포는 바람직하게는 상기 유도 배지에서 1 일 이상 동안, 바람직하게는 1 ~ 7 일 동안, 가장 바람직하게는 2 ~ 3 일 동안 성장된다.
하나의 구현예에서 단계 a) 의 체세포는 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 저해제로 전처리된다. 본원에서 사용되는 "전처리하다" 또는 "전처리" 는 상기 HDAC 저해제로 보충된 적합성 배지에서 4 ~ 60 시간, 바람직하게는 48 시간 동안 체세포를 인큐베이팅하는 것을 의미한다. 본원에서 유용한 HDAC 저해제는 나트륨 부티레이트 (부탄산, 나트륨 염) 트리코스타틴 A (TSA, 7-[4-(디메틸아미노)페닐]-N-히드록시-4,6-디메틸-7-옥소헵타-2,4-디엔아미드) 및 발프로산 (2-프로필-펜탄산) 을 포함하는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 단계 a) 의 체세포는 발프로산으로 전처리된다. 또다른 구현예에서 단계 a) 의 체세포는 발프로산으로 48 시간 동안 전처리된다.
신경구 배양물로서의 신경 줄기 세포의 증식을 확대하기 위해, 유도된 신경 줄기 세포는 위에 기재된 인슐린, 트랜스페린 및 프로게스테론 및 성장 인자로 보충된 무혈청 배지를 포함하는 증식 배지에서 성장된다. 바람직하게는 상기 성장 인자는 FGF2, BDNF 및 EGF 를 포함한다. 또다른 구현예에서 상기 증식 배지는 헤파린, 아스코르브산, SHH (재조합 인간 소닉 헤지호그), FGF8 (재조합 인간 FGF8a 동형), DLL4 (재조합 인간 DLL4), Jagged1 (재조합 인간 톱니모양 1 Fc 키메라), 파수딜 및 발라놀-유사-324 화합물의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 보충물을 부가적으로 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 다음 단계에서 재프로그래밍 배지의 성장 인자 중 하나 이상의 생략에 의해 분화가 자극된다. 바람직하게는 빼낼 상기 성장 인자는 EGF 및 FGF 를 포함한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 성공적으로 재프로그래밍된 신경 줄기 세포의 스크리닝 및 정량화를 용이하게 하기 위해 마커 유전자가 이용된다. 예를 들어, 형광 마커 단백질을 인코딩하는 유전자가 렌티바이러스 형질도입에 의해 표적 체세포 내로 도입된다. 형광 마커 단백질의 예는 GFP, YFP, EGFP 또는 DsRed 이다. 바람직하게는 상기 마커 유전자는 네스틴 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 네스틴은 신경 줄기 세포에서 특이적으로 발현되므로, 네스틴 프로모터의 제어 하에 있는 마커 유전자는 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포의 신속한 스크리닝 및 동정을 가능하게 한다. 그 후, 상기 세포는 원하는 표현형을 나타내는 세포, 즉 신경구를 동정하기 위해 스크리닝된다. 20 ㎛ 초과, 바람직하게는 50 ㎛ 초과인 신경구가 추가의 증식을 위해 선별되고 수확된다.
본 발명의 또다른 양상에서, 임의의 상기 방법으로 생성되는 신경 줄기 세포의 집단이 제공된다. 바람직하게는, 신경 줄기 세포의 집단은 환자 특이적, 즉 병든 개체로부터 수득되는 체세포에서 유도된다. 또다른 구현예에서 줄기 세포의 상기 집단은 건강한 개체로부터 수득된다. 신경 줄기 세포는 무한 증식될 수 있다. 배양은 용이하고 잘 특징화되어 있다. 신경 줄기 세포 부분표본을 재현성 있게 동결 및 해동하는 것이 가능하다. 환자 유래 신경 줄기 세포는 CNS 질환의 병리생리학을 연구하기 위한 질환 관련 시험관내 모델을 대표한다. 환자 특이적 체세포의 신경 줄기 세포로의 직접 전환은 환자 특이적 신경 줄기 세포의 바이오뱅크를 생성하는 쉽게 접근가능하고 재현가능한 기술을 대표한다. 그러므로 본 발명의 추가의 바람직한 양상에서 환자 특이적 신경 줄기 세포를 포함하는 바이오뱅크가 구상된다. 또다른 구현예에서, 건강한 개체로부터 수득된 신경 줄기 세포의 상이한 집단을 포함하는 바이오뱅크가 생성된다. 본원에서 사용되는 용어 "바이오뱅크" 는 상이한 개체 또는 종에서 취해진 생물학적 샘플의 라이브러리를 의미한다. 보관된 표본 집단 및 연합된 데이타는 신경 질환 예를 들어 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS/루게릭병) 발작, 및 척수 외상을 다루려는 연구 목적을 위해 또는 상기 신경 질환의 치료를 위해 의도된다.
본 발명의 또다른 양상은 이러한 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포의 용도이다. 바람직한 구현예에서 이러한 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 CNS 질환의 병리생리학을 연구하기 위한 시험관내 모델로서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 수득되는 신경 줄기 세포는 신경 질환을 역전, 저해 또는 방지하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 또한 약제, 예를 들어 당뇨병 약제의 신경계 부작용을 역전, 저해 또는 방지하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 본 발명의 방법으로 수득되는 상기 신경 줄기 세포는 병든 대상으로부터 유도된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 상기 방법으로 생성된 세포를 함유하거나 임의의 상기 세포 집단을 함유하는 치료 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 치료 조성물은, 예를 들어 인공 뇌척수액 또는 인산 완충 식염수를 포함하는, 생리적으로 적합한 용액을 추가로 포함한다. 상기 치료 조성물은 신경 질환 예컨대 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 ALS, 리소솜 축적 질환, 다발성 경화증, 또는 척수 외상을 치료, 예방, 또는 안정화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 섬유모세포, 각질세포 또는 지방세포가 치료가 필요한 개체로부터 또는 건강한 개체로부터 피부 생검에 의해 수득되고 본 발명의 방법에 의해 신경 줄기 세포로 재프로그래밍될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서 신경 줄기 세포가 수확되고 상태를 치료하기 위해 개체 내로 도입된다. 또다른 구현예에서 상기 신경 줄기 세포는 개체 내로 도입하기 전에 신경세포, 희소돌기아교세포 또는 별아교세포로의 분화에 적합한 조건 하에 배양되고, 병든 또는 손상된 조직의 정상적 기능을 대체 또는 보조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 큰 이점은 환자 특이적 인간 신경 세포 또는 이식에 적합한 동일한 HLA 유형을 갖는 건강한 개체로부터의 적합성 신경 줄기 세포를 본질적으로 무한하게 공급할 수 있다는 점이다. 세포 요법에서는 면역 거부를 겪을 것으로 예상되는 비-자가 세포를 사용하는 것보다 자가 및/또는 적합성 세포를 사용하는 것이 크게 유리하다. 대조적으로, 자가 세포는 유의한 면역 반응을 유발하지 않을 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 신경 질환을 치료하기 위한 신경 줄기 세포의 바이오뱅크의 용도이다. 바이오뱅크는 바람직하게는 환자 또는 여러 HLA 유형을 갖는 건강한 개체로부터 수득된 신경 줄기 세포를 포함한다. 적합성 HLA 유형을 갖는 건강한 공여자로부터 수득된 세포를 치료가 필요한 개체에게 이식하는 경우, 이종 세포 이식과 보통 연관되는 거부 반응이라는 중대한 문제가 없다. 관습적으로, 면역억제제 또는 항-거부 약물 예컨대 시클로스포린을 투여함으로써 거부가 방지 또는 감소된다. 그러나, 그러한 약물은 중대한 유해 부작용, 예를 들어 면역억제, 발암 특성, 신장 독성이 있을 뿐만 아니라 매우 값비싸다. 본 발명은 항-거부 약물, 예컨대 시클로스포린, 이뮬란, FK-506, 글루코코르티코이드, 및 라파마이신, 및 그의 유도체에 대한 필요를 없애거나, 적어도 크게 감소시킬 것이다.
본 발명의 치료 방법에 관하여, 포유류에의 신경 줄기 세포의 투여는 특정 투여 방식, 투여량, 또는 투여 빈도에 제한되지 않으며; 본 발명은 근육내, 정맥내, 관절내, 병변내, 피하, 또는 질환 예방 또는 치료에 적당한 투여량을 제공하기에 충분한 임의의 기타 경로를 포함하는, 모든 방식의 투여를 고려한다. 신경 줄기 세포는 포유류에 단일 투여물 또는 다중 투여물로 투여될 수 있다. 다중 투여물이 투여되는 경우 투여물은 서로 별도로, 예를 들어, 1 주, 1 달, 1 년, 또는 10 년까지 투여될 수 있다. 세포를 특별한 세포 유형으로 추가로 편향시키기 위해 세포의 투여 전, 동안, 또는 후에 1 가지 이상의 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 사이토카인, 소분자 또는 기타 세포가 또한 투여될 수 있다.
실시예
인간 섬유모세포를 신경 줄기 세포 (NSC) 로 전환시키기 위해 사용되는 본 발명에 따른 방법을 묘사하는 본 명세서의 도 1 을 참조하여 본 발명의 방법을 설명할 수 있다. 이러한 방법에서 인간 섬유모세포를 제 0 일에 트립신처리하고, 계수하고, 생활력을 확인했다. 그 후 트립신처리한 섬유모세포 1.0 x 105 ~ 3.0 x 105 개를 유도 배지에 재현탁시키고, 유전자의 조합을 렌티바이러스로 전달했다. 유도 배지에 폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드) 을 첨가하여 렌티바이러스 형질도입의 효율을 증가시켰다. 에펜도르프 튜브에서 15 분 동안 감염을 실시했다. 유전자와 조합하여, 인간 네스틴 GFP 리포터를 사용했다. 네스틴은 NSC 에서 특이적으로 발현되는 잘 알려진 마커이다. 네스틴 리포터에서 형광 단백질 GFP 는 인간 네스틴 프로모터의 발현 하에 있으므로 (도 2), 그것은 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (irNSC) GFP+ 에 대한 용이한 스크린을 가능하게 한다.
감염된 세포를 조직 배양 플레이트에 적당한 부피의 유도 배지에 10000 - 30000 세포/㎠ 의 농도로 플레이팅했다. 제 1 일에 유도 배지를 전부 교체했다. 인간 섬유모세포와 비교되는 형태의 명백한 변화로 일부 irNSC GFP+ (도 3) 를 동정할 수 있었다. irNSC GFP+ 는 NSC 에 전형적인, 세포질이 더 농축된 이극성 신장된 형태를 획득했다. 더욱이, irNSC 는 압축된 (packed) 단층 배양물로 성장하는데, 이는 노치 경로의 전-증식 신호 (pro-proliferative signal) 를 활성화시키기 위한 전통적 NSC 배양에서 획득되는 전형적인 세포-대-세포 상호작용과 비슷하다. 제 2 일에 irNSC GFP+ 는 더 성숙한 상태였고 매우 압축된 세포 무리를 형성하기 시작했다. 이러한 irNSC 무리는 밀도 높은 중심에 irNSC GFP+ 가 함유되어 있는 회전타원체 구조를 형성하기 시작했다 (도 4). 제 3 일에 회전타원체 구조가 완전히 형성되었고, 조직 배양 플레이트로부터 위로 떠올라 배지 중에서 신경구로서 부유하기 시작했다. 신경구는 크기가 약 20 ~ 100 ㎛ 였고, 경계가 명확했고, 중심의 세포 밀도가 높았고, 중심에서 irNSC GFP+ 를 동정할 수 있었다 (도 5).
진보적 발전을 달성하기 위해, 유전자의 특정 조합을 사용하는 것이 필수적이었다. 생체 내에서 및 시험관 내에서 NSC 특성의 유지에 관여하는 유전자의 하기 목록을 문헌 지식으로부터 찾았다: Sox2 (Sox 전사 인자 및 NSC 에 대한 중요한 마커), Brn2 (Sox 단백질에 결합하는 것으로 알려진 POU 도메인 단백질. 네스틴 프로모터에 대한 Sox2 및 Brn2 의 결합이 보고됨. Brn2 KO 마우스는 CNS 발달 장애를 가짐), Bmi1 (세포 주기의 조절에 관여하는 단백질, 사이클린E/cdk2 복합체의 p21 및 p27 저해제의 발현을 증가시키는 것으로 보고됨. 사이클린E/cdk2 저해는 NSC 의 자가-재생 상태 동안 빠른 세포 주기를 초래하는 세포 주기에 대한 망막모세포종 단백질 제어의 상실을 확인함), Mash1 (생체 내에서 신경 전구체 증식의 중요한 조절인자인 것으로 기술됨), Sox11 (Sox 단백질, 생체 내에서 SGZ 에서 발현되는 것으로 보고됨), NCam (유동세포 분석법에서의 NSC 마커, CNS 의 상이한 영역에서 발현됨), Kpna1 (임포르틴 알파5 로 더 잘 알려짐, 외배엽 유래 조직에서 임포르틴 베타와 함께 단백질 핵 이동을 책임짐).
모든 유전자를 cDNA 로서 렌티바이러스 플라스미드 내로 클로닝한 후, 렌티바이러스 내로 포장했다. Sox2, Bmi1, Mash1, Sox11, NCam, Kpna1, 네스틴 GFP 리포터에 대한 렌티바이러스 포장된 입자로 인간 섬유모세포를 직접 형질도입시켰다. 위에 기재된 방법에서 상이한 조합의 유전자를 시험했다. 제 3 일에, 생성된 신경구를 계수함으로써 irNSC 생성의 성공을 평가할 수 있었다. 50 ㎛ 보다 큰 신경구만 계수했다.
도 6 에 나타낸 바와 같이 유도 배지에 파수딜을 첨가하지 않고 네스틴 리포터 렌티바이러스로 형질도입한 경우 인간 섬유모세포가 irNSC 로 재프로그래밍되지 않았다. 유도 배지에 파수딜을 첨가한 경우 신경구 (약 50㎛) 및 조금 더 작은 것 (약 20 ㎛, 계수하지 않음) 의 생성이 보고되었다.
유전자 조합: Sox2 - Bmi1 을 사용하여 본 발명의 방법으로 생성한 신경구를 제 3 일에 수확하고 추가로 14 일 동안 증식시켰다. irNSC 신경구의 증식은 중요한 단계였다. 특수한 초저 비 부착성 플레이트 (Corning) 에서 FGF, EGF, BDNF 를 보충한 N2B27 배지를 사용하여 신경구를 배양했다. irNSC GFP+ 신경구의 균일한 집단을 획득하기 위해 2 ~ 3 일 마다 세척 절차를 실시했다. 14 일의 증식 동안 irNSC GFP+ 가 저밀도인 일부 신경구는 제대로 증식할 수 없었는데, 이는 아마도 전환되지 않은 섬유모세포로 오염되었기 때문일 것이다. 그러한 종류의 오염된 신경구는 제거될 필요가 있는 단일 세포로 허물어졌다. 제 14 일에, 신경구를 폴리-오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트 상에의 부착 및 신경세포-유사 세포의 생성에 대해 시험했다. 부착에 대해, 폴리-오르니틴/라미닌 코팅된 플레이트 상에 세포 부착 및 확산을 개선하기 위해 파수딜 10 μM 으로 단지 첫 날 동안 보충된 증식 배지에 20 ~ 40 개 신경구/㎠ 를 플레이팅했다. 배양 제 1 일에 신경구의 부착 및 확산을 볼 수 있었다 (도 7). 확산하는 신경구의 중심에서 본 발명자들은 전형적인 NSC 형태를 갖는 irNSC GFP+ 를 동정했다. 신경구를 부가적 3 일 동안 성장시킨 후, N2B27 에 BDNF 만 첨가했다 (신경세포 분화 조건). EGF 및 FGF 철수시 irNSC 의 형태가 변화했다. irNSC 는 더욱 신장되었고 신경돌기-유사 세포 돌출부를 형성하기 시작했다. 분화 조건의 제 7 일에 세포를 고정하고 신경세포 마커 tuj1 에 대해 염색했다 (도 8).
파수딜로 증식된 신경구는 형태가 더 양호하고 경계가 분명하고 선명하다 (잘 형성된 신경구의 특징, 도 9, 패널 B); 파수딜 없이 증식된 신경구는 경계가 흐릿하다 (도 9, 패널 A). irNSC 는 전형적인 NSC 형태를 갖고, Sox2 및 네스틴 양성이었다 (도 10).
도 11 은 Rock 키나제 저해제 발라놀-유사-324 화합물이 GFP+ 신경구의 수율을 증가시킴을 보여준다.
이들 증거는 본 발명의 방법이 유전자 형질도입 (최선의 조합: Sox2-Bmi1, Sox2-Bmi1-Mash1, Sox2-Bmi1-Sox11, Sox2-Bmi1-Emx2, Sox2-Bmi1-Foxg1 및 Sox2-Bmi1-Pax6 , 또한 도 13 을 참조) 및 화학적으로 규명된 배지 유도의 연결된 단계에 기초하여 인간 섬유모세포를 irNSC 로 전환할 수 있음을 보여준다.
irNSC 의 수율을 증가시키기 위해, 인간 섬유모세포를 HDAC 저해제 발프로산 (VPA, 2-프로필-펜탄산, 일나트륨 염) 으로 또는 그것 없이 전처리했다. 이러한 목적을 위해, 인간 섬유모세포를 감염 전에 1mM VPA 를 보충한 L-글루타민 및 FBS 10% 를 보충한 DMEM/F12 에서 인큐베이팅했다 (도 12).
도 14 는 성체 인간 진피 섬유모세포 (HDFa) 로부터의 irNSC 신경구의 생성을 보여준다.
도 15 는 아스코르브산, 소닉 헤지호그 (Shh), Jagged1, DLL4 및 FGF8 의 조합을 사용하는 irNSC 신경구의 증식을 보여준다. 도 16 은 NSC 마커 네스틴 및 조기 신경세포 마커 Tuj1 의 발현에 대한 irNSC 신경구의 면역세포화학 특성분석을 보여준다.
물질 및 방법
세포 배양:
유도 배지: N2B27 (N2B27 은 인간 EGF (Peprotech) 30 ng/㎖, 인간 FGF2 30ng/㎖ (Peprotech), 인간 BDNF (Roche) 20 ng/㎖ 및 파수딜 (Calbiochem) 10 μM 또는 발라놀-유사-324 화합물 (N-{(3R,4R)-4-[4-(2-플루오로-6-히드록시-3-메톡시-벤조일)-벤조일아미노]-아제판-3-일}-4-히드록시-3,5-디메틸-벤즈아미드) 2 μM 로 보충된 N2 및 B27 (둘다 Gibco 사제) 로 보충된 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK) 의 1:1 혼합물임).
증식 배지: 인간 EGF (Peprotech) 30 ng/㎖, 인간 FGF2 30 ng/㎖ (Peprotech), 인간 BDNF (Roche) 20 ng/㎖ 로 보충된 N2B27, 또는
FGF, EGF, BDNF 20 ng/㎖; 헤파린 2 ㎍/㎖; 발라놀-유사-324 2μM; 아스코르브산 0.2mM, SHH (재조합 인간 소닉 헤지호그, 카탈로그 번호: 1845SH) 500ng/㎖, FGF8 (재조합 인간 FGF8a 동형, 카탈로그 번호: 4745F8) 100ng/㎖, DLL4 (재조합 인간 DLL4, 카탈로그 번호: 1506D4) 500ng/㎖, Jagged1 (재조합 인간 Jagged 1 Fc Chimera, 카탈로그 번호: 1277JG) 500ng/㎖ 함유 NeuroCult® NS-A 증식 키트 (Human, StemCells Technologies).
분화 배지: 인간 BDNF (Roche) 20 ng/㎖, 라미닌 2 ㎍/㎖ (Invitrogen) 로 보충된 N2B27.
인간 섬유모세포: IMR90 태아 폐 섬유모세포 (ATCC Lot. Num. 580229699) 또는 성체 인간 진피 섬유모세포 (GIBCO, 카탈로그 번호: C-013-5C).
렌티바이러스: 미리포장된, 즉시 사용가능한 렌티바이러스 입자를 Sigma (Stemgent 재프로그래밍 렌티바이러스 인간 Sox2, 카탈로그 번호 ST070012), Genecopeia (인간 Bmi1 Lentifect 렌티바이러스 입자, 카탈로그 번호 LP-B0015-Lv105; Sox11 Lentifect 렌티바이러스 입자, 카탈로그 번호 LP-MO425-LV105; Mash1 Lentifect 렌티바이러스 입자, 카탈로그 번호 LP-Z0740-LV105; 인간 Kpna1Lentifect 렌티바이러스 입자, 카탈로그 번호 LP- U1286-Lv105; NCam1 Lentifect 렌티바이러스 입자, 카탈로그 번호 LP-Z2645-Lv105) 및 SBI Systems Biosciences (네스틴 GFP 리포터: pGreenZeoTM-h네스틴 전사 리포터 바이러스, SR10035VA-1) 로부터 수득했다.
역가 네스틴GFP 1.45*105/㎕, BMI1 4.3*105/㎕, Sox2 1.07*104/㎕, Sox11 3.2*106/㎕, Mash1 4.7*106/㎕, NCam 3.3*104/㎕, Kpna1 1.8*105/㎕.
프로토콜:
1. irNSC 의 생성:
- 에펜도르프 내의 폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드, Sigma) 4 ㎍/㎖ 함유 300 ㎕ 유도 배지에서 상이한 유전자 조합에 대한 렌티바이러스 (각각의 단일 렌티바이러스에 사용된 감염의 다중도 (M.O.I.) 30) 및 리포터 네스틴 GFP 렌티바이러스 (사용된 M.O.I. 10) 로 200.000 개의 IMR90 인간 섬유모세포를 감염시킨다.
- 실온에서 15 분 동안 인큐베이팅한다.
- 조직 처리된 6-웰-플레이트의 하나의 웰 내의 1.7 ㎖ 유도 배지에 300 ㎕ 를 플레이팅한다
- 제 1 일, 2 ㎖ 의 유도 배지/각각의 웰 를 새로 교체한다
- 제 3 일, 부유하는 구를 함유하는 2 ㎖ 를 조심스럽게 수집하여 신경구를 수확한다
- 신경구를 증식시킨다
2. 신경구의 증식:
- 6-웰-플레이트의 3 개의 웰로부터 부유하는 신경구를 함유하는 배지를 15 ㎖ 튜브에 수집한다
- 구가 뿌리내도록 10 분 동안 놔둔다
- 상청액을 매우 조심스럽게 제거한다 (단일 세포는 뿌리내리지 않으므로 상청액과 함께 흡입될 것이다)
- 구를 4 ㎖ 최종 부피 증식 배지에 재현탁시킨다
- B6 플레이트 초저 부착성 플레이트 (Corning) 에 플레이팅한다
- 2 ~ 3 일 인큐베이팅한다
- irNSC 의 생성으로부터 제 14 일까지 2 ~ 3 일마다 증식 절차를 반복한다
3. 신경구의 분화:
- irNSC 의 생성 제 14 일 및 증식 절차 후 입체 현미경으로 경계가 명확하고 irNSC GFP+ 가 풍부한 둥근 신경구를 선별한다
- 파수딜 10μM 또는 발라놀-유사-324 화합물 2μM 을 첨가한 증식 배지를 사용하여 폴리-오르니틴/라미닌으로 사전 코팅된 24-웰-플레이트의 하나의 웰에 구 40 개를 플레이팅한다.
- 그 다음 날 증식 배지를 파수딜 / 발라놀-유사-324 화합물 2μM 없는 배지로 새로 교체한다.
- 3 일 동안 인큐베이팅한다
- 증식 배지를 제거하고 분화 배지를 첨가한다
- 3 ~ 4 일 후 분화 배지를 새로 교체한다
- 3 ~ 4 일 동안 인큐베이팅한다
- 세포를 PFA 4% 로 고정하고 면역염색을 수행한다
irNSC 신경구 염색 프로토콜: 특성분석을 위해 제 15 일에 신경구를 하기 항체로 염색했다: 마우스 네스틴 및 토끼 Sox2 O/N 및 그 후 이차 항-마우스 488 및 항-토끼 555 로 1 시간 동안.
일차 항체:
네스틴 마우스, 모노클로날, 1/500 희석 (MAB5326 Millipore)
Sox2 토끼, 폴리클로날, 1/500 희석 (AB5603MI Millipore)
이차 항체:
Alexa fluor 488, IgG, 1/1 000 희석, 염소 항 마우스 (A11029 Invitrogen)
Alexa fluor 555, IgG 1/1 000 희석, 염소 항 토끼 (A21429 Invitrogen)
<110> F. Hoffmann - La Roche AG <120> Conversion of somatic cells to induced reprogrammed Neural Stem Cells (irNSCs) <130> 26845 WO <150> EP10173455.6 <151> 2010-08-19 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60 ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120 gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180 caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240 cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300 cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360 aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420 agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480 gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540 ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600 gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc 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aataaagatt 2880 tatcaatatg ccctcaaaaa aaaaaaaa 2908 <210> 10 <211> 2191 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcgacgaaag agaggatgcc tcttaaaggc agaagacttt aactaggggc gggcgagcag 60 atgtgtgaga tcttctattc aaagagtgga catatagccc agttttcaga gccacgtatt 120 cgagccccgt gggatccgga ggctgccaac cagctccagc atgcagaaca gtcacagcgg 180 agtgaatcag cttggtggtg tctttgtcaa cgggcggcca ctgccggact ccacccggca 240 gaagatcgta gagctagctc acagcggggc ccggccgtgc gacatttccc gaattctgca 300 ggtgtccaac ggatgtgtga gtaaaattct gggcaggtat tacgagactg gctccatcag 360 acccagggca atcggaggca gtaagccaag agtggcgact ccagaagttg taagcaaaat 420 agcccagtat aaacgggagt gcccgtccat ctttgcttgg gaaatccgag acagattact 480 ctccgagggg gtctgtacca acgacaatat acccagtgtg tcatcaataa acagagttct 540 tcgcaacctg gctagcgaaa agcaacagat gggcgcagac ggcatgtatg ataaactaag 600 gatgctgaac ggacagaccg gaagctgggg cacccgccct ggttggtatc ccgggacgtc 660 agtaccaggg caacccacgc aagacggctg ccagcaacag gaaggacagg gagaaaacac 720 caactccatc agctccaatg gagaagactc ggatgaggct caaatgcggc tgcagctgaa 780 gcggaagctg cagagaaata gaacatcttt tacccaggag cagattgagg ctctggagaa 840 agagtttgag aggacccatt atccagatgt gtttgcccgg gaaagactag cagccaaaat 900 agatctacct gaagcaagga tacaggtgtg gttttctaac cgaagggcca agtggagaag 960 agaagaaaaa ctgaggaacc agagaagaca ggccagcaac accccgagtc acatccctat 1020 cagcagcagt ttcagtacca gtgtctacca gccaattcca cagcccacca cacctgtctc 1080 ctcctttaca tcgggttcca tgttgggccg cacagacacc gccctcacca acacgtacag 1140 tgctttgccg ccgatgccca gcttcaccat ggcaaataac ctgcctatgc aacccccagt 1200 ccccagtcag acctcctcgt actcctgcat gctgcccacc agcccttcag tgaatgggcg 1260 gagttatgat acctacaccc ctccgcacat gcaaacacac atgaacagtc agcccatggg 1320 cacctcggga accacttcaa caggactcat ttcacctgga gtgtcagttc ccgtccaagt 1380 tcccggaagt gaacctgaca tgtctcagta ctggcctcga ttacagtaaa gagagagaaa 1440 gagagagaat gtgatcgaga gggggattgt gttcactcag ccaatgacta tgtggacaca 1500 gcggttgggt attcaggaaa gaaagagaaa tggctgttag aagcacttca ctttacaact 1560 gtgtcctata ctggagcccg ggaatggact agaaaccagg acctttgcgt 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Claims (1)

  1. 본 명세서에 따른 신경 줄기 세포 (NSC) 의 시험관내 제조 방법.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101788903B1 (ko) 2010-08-19 2017-10-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 체세포의 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (ｉｒｎｓｃｓ) 로의 전환
CN102604894B (zh) 2012-02-29 2014-07-30 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
PL223189B1 (pl) * 2012-11-15 2016-10-31 Celther Polska Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Komórka iNS oraz sposób reprogramowania komórek somatycznych za pomocą czynnika Sox2 oraz Sox2 i c-Myc do komórki iNS
EP2922828B1 (en) * 2012-11-21 2020-07-08 PTC Therapeutics, Inc. 4,6-diamino-pyrimidine derivatives as bmi-1 inhibitors for treating cancer
KR20140121317A (ko) * 2013-04-06 2014-10-15 서울대학교산학협력단 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포
MX2016000557A (es) * 2013-07-23 2016-04-20 Hoffmann La Roche Conversion basada en moleculas pequeñas de celulas somaticas en celulas de cresta neural.
CN104342401B (zh) * 2013-07-25 2017-04-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞
EP3060237B1 (en) * 2013-10-25 2021-08-18 Wayne State University Modified reprogramming protein for use in treating a cancer
EP3088415B1 (en) 2013-12-25 2019-11-06 Toagosei Co., Ltd. Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into endodermal cells
CN104894060B (zh) * 2014-03-03 2018-11-06 中国科学院上海生命科学研究院 诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用
CN104195108B (zh) 2014-07-29 2018-02-06 深圳市三启生物技术有限公司 蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途
BR112017018704A2 (pt) * 2015-03-04 2018-04-17 Univ North Carolina Chapel Hill métodos para produção de células troncos neurais e usos das mesmas
AU2016243612A1 (en) * 2015-03-31 2017-10-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Delivery vehicles for stem cells and uses thereof
JP6691756B2 (ja) 2015-09-29 2020-05-13 東亞合成株式会社 合成ペプチドを用いた神経幹細胞の生産方法
LT3374509T (lt) * 2015-11-12 2021-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonukleotidai, skirti sukelti iš tėvo paveldėto ube3a raišką
CN108884444A (zh) * 2016-03-31 2018-11-23 味之素株式会社 使神经分化能力增强的神经干细胞用培养基
KR102311121B1 (ko) 2016-04-20 2021-10-13 교토후고리츠다이가쿠호진 배양 상피 시트의 제조 방법
US20210246422A1 (en) * 2018-06-14 2021-08-12 Academia Sinica Method to generate induced oligodendrocyte-lineage cells and treatment using such cells
EP3841197A1 (en) 2018-08-21 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for assessing transendothelial barrier integrity
CN116157511A (zh) * 2020-06-09 2023-05-23 蔚山科学技术院 一种用于诱导体细胞直接转分化为运动神经元的组合物以及其使用方法
WO2022072325A1 (en) * 2020-09-29 2022-04-07 NeuExcell Therapeutics Inc. Neurod1 combination vector

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968829A (en) * 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
KR20090115984A (ko) * 2001-11-09 2009-11-10 아르테셀 사이언스, 인크. 지방 조직에서 유래된 기질세포의 내분비 췌장 분화 및 이의 용도
WO2004007700A1 (ja) * 2002-06-24 2004-01-22 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 神経系細胞の製造方法
US7682828B2 (en) 2003-11-26 2010-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for reprogramming somatic cells
NZ550542A (en) * 2004-03-30 2009-03-31 Nsgene As Therapeutic use of a growth factor, NsG33
GB0410011D0 (en) * 2004-05-05 2004-06-09 Novartis Forschungsstiftung Neural cell differentiation method
US8278104B2 (en) * 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US20100021437A1 (en) * 2008-04-07 2010-01-28 The McLean Hospital Corporation Whitehead Institute for Biomedical Research Neural stem cells derived from induced pluripotent stem cells
KR101102483B1 (ko) 2008-08-12 2012-01-05 연세대학교 산학협력단 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 중추 또는 말초 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물
GB0902034D0 (en) * 2009-02-06 2009-03-11 Reneuron Ltd Method
KR101788903B1 (ko) 2010-08-19 2017-10-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 체세포의 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (ｉｒｎｓｃｓ) 로의 전환

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