CN105492597A - 利用hmga2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备由分化细胞重编程的诱导神经干细胞的方法。根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够仅利用两种诱导因子SOX2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比使用四种或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比仅施用单一SOX2基因时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的的效能。

Description

利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法

发明背景

1.发明领域

本发明涉及利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导干细胞的方法。

2.相关领域描述

干细胞大体上被分成全能干细胞和多能干细胞。全能干细胞具有生成所有细胞的分化潜力。全能干细胞生成体内所有不同种类的细胞，例如，受精***。多能干细胞生成体内衍生自三个主要胚层或胚胎本身的任意细胞类型。

多能干细胞，如胚胎干细胞(ESC)，增殖迅速，同时保持分化成各种细胞类型的能力，即，多能性。胚胎干细胞是细胞移植治疗的有希望的供应源。

直到最近，多能干细胞主要通过核移植和细胞融合(ShinyaYamanaka,PluripotencyandNuclearReprogramming,PhilosTransRSocLondBBiolSci.363(1500):2079-2087(2008年6月27日))来生产。然而，两种方法均使用了胚胎干细胞，因此存在伦理困境。

然而，由于最近发现了诱导多能干细胞(iPSC)，克服与使用胚胎干细胞相关的问题变得可能。“诱导多能干细胞(iPSC)”是呈现与胚胎干细胞(ESC)相似的性质的细胞。诱导多能干细胞首次在2006年通过在小鼠成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成(Takahashi,Y.andS.Yamanaka,InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdultFibroblastCulturesbyDefinedFactors,Cell126:663-676(2006))和在2007年通过在人成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成(YuJunyingetal.,InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticcells,Science318:1917-1920(2007)、Takahashi,K.etal.,InductionofPluripotentStemCellFromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors,Cell131:861-872(2007))。

关于引起成熟体细胞重编程形成iPSC的这些研究包括Oct-3/4、Sox2、Klf4和c-Myc(Takahashi,Cell126:663-676；Takahashi,Cell131:861-872)和使用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28(Junying,Cell318:1917-1920)。然而，iPSC具有限制：其无法在体内转化成期望的细胞，因为其可导致胚胎干细胞中出现畸胎瘤，并且同时无法在体内移植时充分控制分化。

因此，为克服这些限制，通过定向转化/重编程分化形成具体谱系细胞的技术在最近被重视起来。这是可在不经过多能状态的情况下通过将具体谱系特异性基因引入还未完全分化的细胞(即，成纤维细胞)定向诱导具体细胞的技术，并且可排除多能细胞造成的畸胎瘤形成的风险。具体地，关于一旦损坏就可能永久维持损坏的神经元细胞，已积极进行各种研究线路来尝试定向诱导。结果是，美国教授MariusWernig带领的研究组成功定向诱导神经元细胞[VierbuchenT,OstermeierA,PangZP,KokubuY,SudhofTC,WernigM(2010)Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature463(7284):1035-1041.doi:10.1038/nature08797]。然而，难以体外培养无自我更新能力的诱导神经元超过特定时间，因此难以保证细胞足量，因此在实践中不可能获得细胞治疗所需的足量细胞，包括定向重编程涉及的分子细胞学机制。

之后，两个德国研究组成功通过将基因引入小鼠成纤维细胞制备诱导神经干细胞(iNSC)(ThierM.WorsdorferP,LakesYB,GorrisR,HermsS,OpitzT,SeiferlingD,QuandelT,HoffmannP,NothenMM,BrustleO,EdenhoferF(2012)Directconversionoffibroblastsintostablyexpandableneuralstemcells.CellStemCell10(4):473-479.doi:10.1016/j.stem.2012.03.003)。关于人，有报告称成功实施了通过将单个SOX2基因引入成纤维细胞而诱导iNSC(ThierM,WorsdorferP,LakesYB,GorrisR,HermsS,OpitzT,SeiferlingD,QuandelT,HoffmannP,NothenMM,BrustleO,EdenhoferF(2012)Directconversionoffibroblastsintostablyexpandableneuralstemcells.CellStemCell10(4):473-479.doi:10.1016/j.stem.2012.03.003)。

然而，利用这些因子制备诱导神经元细胞的常规方法具有限制：其具有低诱导效力，并且不能增殖神经元细胞，因此不可用于治疗目的。

发明概述

为解决常规方法显示出的问题，本发明的目的在于提供由分化细胞生成诱导神经干细胞或神经元细胞的新方法、和通过该方法生成的诱导神经干细胞或神经元细胞。

本发明的一个目的是提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂盒，包括(a)SRY(性别决定区Y)框2(SOX2)蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和(b)高移动性型AT钩2(highmobilitygroupat-hook2，HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。

本发明的另一目的是提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或由其分化的神经元细胞的方法，包括(a)递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达；和(b)培养步骤(a)中的细胞。

本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞；或由该诱导神经干细胞分化的神经元细胞。

本发明的再一目的是提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括诱导神经干细胞；或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。

本发明的再一目的是提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包括SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为活性成分。

本发明的再一目的是提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑制剂的方法，包括：1)制备分离的非神经元细胞；2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞；3)任选地，使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和4)通过在步骤1或步骤2后用候选物质处理，根据候选物质的处理的存在来确认诱导神经干细胞或神经元细胞的生成。

本发明的再一目的是提供筛选个人定制的神经元细胞治疗产品的方法，包括：1)制备分离的非神经元细胞；2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞；3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和4)通过用候选物质处理步骤3)形成的非神经元细胞，确认非神经元细胞获取对象的定制神经元细胞治疗产品。

本发明的再一目的是提供促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

本发明的再一目的是提供用于细胞增殖的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

本发明的再一目的是提供抑制细胞衰老的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

发明有益效果

根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够在仅利用两种诱导因子SOX2和HMGA2时由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比利用四或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比单独使用SOX2时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。

在本发明中，Oct4不被用于重编程形成神经干细胞的过程中的重编程因子组合，因此分化的细胞被定向重编程形成神经干细胞，而不经过去分化过程。由此制备的诱导神经干细胞不仅可在移植于小鼠脑组织时保留自我更新能力和增殖能力，而且可充分分化形成神经相关细胞，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，因此被预期用于治疗目的。

附图简述

图1A显示在明场显微镜下观察的人类新生儿真皮(dermal)成纤维细胞(hDF)的形态。

图1B显示在明场显微镜下观察的由SOX2转导的hDF诱导而来的iNSC。

图1C显示在明场显微镜下观察的通过SOX2转导形成的早期神经球样集落的图像。

图1D显示利用抗PAX6和巢蛋白抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免疫细胞化学分析的结果。

图1E显示利用抗波形蛋白和SOX2抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免疫细胞化学分析的结果。

图1F显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(SOX2)中的全局miRNA表达谱的热图。

图1G显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(SOX2)中的神经***特异性miRNA的热图。

图1H显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(SOX2)的miR-124-3p的定量实时PCR的结果。

图1I显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(SOX2)的miR-9-5p/-3p的定量实时PCR的结果。

图1J显示通过定量实时PCR测量的hDF、H9-NSC、hDF-iNSC(SOX2)和hESC中的胚胎干细胞特异性miR-302/367家族的相对表达水平。

图1K显示通过定量实时PCR测量的hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(SOX2)中let-7/miR-98家族的相对表达水平。

图1L显示miR-124-3p、miR-9-5p、miR-9-3p、抗let-7b和let-7b在其转染到SOX2转导的hDF中之后测量的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。

图2A显示在hDF对照组、SOX2-、SOX2/CMYC-、SOX2/LIN28-、和SOX2/HMGA2转导的hDF组中进行的MTT细胞增殖测定的结果。

图2B显示在SOX2-、SOX2/CMYC-、SOX2/LIN28-、和SOX2/HMGA2转导的hDF组中测量的集落形成时间。

图2C显示在SOX2-、SOX2/CMYC-、SOX2/LIN28-、和SOX2/HMGA2转导的hDF组中测量的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。

图2D显示hDF对照组、SOX2-、SOX2/CMYC-、SOX2/LIN28-、和SOX2/HMGA2转导的hDF组的流式细胞术分析结果，该流式细胞术分析利用其NSC细胞表面标记物(CD44)和阳性标记物(CD184)在病毒转导后7天进行。

图2E显示在明场显微镜下观察的hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)的形态和PAX6、巢蛋白、Ki67和HMGA2表达的免疫细胞化学分析结果。

图2F显示与hDF表达水平相比，H9-NSC、hDF-iNSC(SOX2)和hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)中的NSC特异性miRNA表达的定量实时PCR结果。

图2G显示通过二硫化物处理源自hDF、H9-NSC、hDF-iNSC(SOX2)和hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)的DNA而进行的SOX2基因启动子的甲基化模式的分析结果。

图3A显示hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)在其分化形成三种主要细胞类型——即神经元(α-互联蛋白、TH、DCX、ChAT、NF、MAP2、和TUJ1)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(OLIG2和O4)——后的免疫细胞化学分析。

图3B显示通过电压钳测量记录的源自人诱导神经干细胞(hiNSC)的神经元的钠电流和动作电位。

图3C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因(lidocaine)限制后hiNSC源神经元的钠电流和动作电位。

图3D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后hiNSC源神经元的钠电流和动作电位。

图3E显示在CM-DiI标记的hiNSC被移植到4周龄小鼠的海马回区域后，hiNSC分化形成神经元(TUJ1)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(MBP)，并且与CM-DiI共定位。

图4A显示利用SOX2/HMGA2由源自人脐带血的间充质干细胞生成iNCS的程序。图4A确认神经球样集落在病毒转导后7天形成，以及hUCB-MSC源hiNSC被PAX6(红色)、巢蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色。

图4B显示被SOX2、SOX2/CMYC、SOX2/LIN28和SOX2/HMGA2(经过21天)转导的衰老hUCB-MSC的形态。通过β-半乳糖苷酶活性评价衰老的hUCB-MSC，和最初的iNSC簇仅通过SOX2/HMGA2转导而生成。

图4C显示对照组、被SOX2、SOX2/CMYC、SOX2/LIN28和SOX2/HMGA2转导的衰老hUCB-MSC的PAX6-和巢蛋白(NESTIN)-阳性集落的定量结果。

图4D显示实验示意图，示例由hUCB源CD34⁺细胞重编程hiNSC的策略。

图4E经由点图显示通过流式细胞术分析的CD34⁺细胞纯度。显示由单核细胞分离的CD34⁺细胞具有84.15％的纯度。

图4F显示通过免疫化学测定示例hUCB-CD34⁺iNSC的特征的图像，其中细胞用NSC特异性标记物(PAX6，巢蛋白，和SOX2)、神经元标记物(NF)和星形胶质细胞标记物(GFAP)染色。

图5显示在显微镜下观察的用PAX6、巢蛋白、SOX2、Ki67和HMGA2免疫染色的H9-NSC的图像。

图6A显示被miR-CTL或者50nM或100nMlet-7b转染的hDF-iNSC(SOX2)，其在用BrdU处理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色。

图6B显示被miR-CTL或者50nM或100nMlet-7b转染的hDF-iNSC(SOX2)中BrdU阳性细胞的定量结果。

图6C显示被miR-CTL或者50nM或100nMlet-7b转染的细胞的神经球直径。

图6D显示被miR-CTL或者50nM或100nMlet-7b转染的细胞的绝对数量。

图6E显示被miR-CTL或者50nM或100nMlet-7b转染的细胞的初级神经球比率。

图7A显示hDF-iNSC(SOX2)、hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)和H9-NSC中的阴性细胞表面标记物(CD44)和阳性细胞表面标记物(CD184)的流式细胞术分析结果。

图7B显示hDF、H9-NSC、hDF-iNSC(SOX2)和hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)的全局基因组的热图。

图7C显示在hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)和hDF之间；和hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)和H9-NSC之间进行比较的点图。

图8A显示被siCTL或50nMsiHMGA2转染的hDF-iNSC(SOX2)的结果，其在用BrdU处理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色。

图8B显示被siCTL或50nMsiHMGA2转染的hDF-iNSC(SOX2)中BrdU阳性细胞的定量结果。

图8C显示被siCTL或50nMsiHMGA2转染的细胞的神经球直径。

图8D显示被siCTL或50nMsiHMGA2转染的细胞的绝对数量。

图8E显示被siCTL或50nMsiHMGA2转染的细胞的初级神经球比率。

图9A显示H9-NSC在其分化形成三种主要细胞类型——即，神经元(ChAT、NF、和MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(O4)——后的免疫细胞化学分析。

图9B显示通过电压钳测量记录的源自hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。

图9C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因(0.1％)阻止后的源自hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。

图9D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后的源自hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。

图9E显示移植的CM-DiI标记的hiNSC的免疫组织化学结果。

图10A显示hMSC和hMSC源iNSC中的hMSC表面标记物(阴性标记物：CD34、CD45、和HLA-DR；阳性标记物：CD73和CD105)和阳性细胞表面标记物(CD184)的流式细胞术分析结果。

图10B分别显示关于HMGA2和hUCB-MSC的三种不同系的表达水平的蛋白质印迹分析结果。

图10C显示在SOX2或SOX2/HMGA2在hUCB-MSC中转导后测量的PAX6-和巢蛋白-阳性集落形成率。

图10D显示通过累积群体倍增水平(CPDL)分析确定的H9-NSC、hDF-iNSC和hMSC-iNSC的增殖速率。

图10E显示在SOX2或SOX2/HMGA2转导的hUCB-CD34⁺细胞中测量的PAX6-和巢蛋白-阳性集落形成率。

图11显示确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的分化能力的结果。

图12显示hUCBSC的HMGA2转导效力的测量结果。

图13显示通过免疫细胞化学分析测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期阶段的HMGA2表达水平的结果。

图14显示通过微阵列测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期阶段的HMGA2表达水平的结果。

图15显示通过PCR测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的HMGA2表达水平结果。

图16显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞形态的测量结果。

图17显示通过β-gal染色测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的表达水平结果。

图18显示通过MTT测定测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞增殖结果。

图19显示通过Ingenuity途径分析(IPA)软件测量的、HMGA2转导的hUCBSC中与HMGA2过表达相关信号途径有关的基因和与分子细胞功能有关的基因的表达水平结果。

图20显示用于评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2过表达对PI3K/AKT途径和mTOR/p70s6K的影响的蛋白质印迹分析结果。

图21显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞形态结果，和通过β-gal染色测量的、基于世代进程的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达水平结果——用于评价HMGA2抑制型hUCBSC的衰老水平。

图22显示通过MTT测定测量的、HMGA2抑制型hUCBSC中的细胞增殖结果。

图23显示蛋白质印迹分析结果，以评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2抑制对PI3K/AKT途径和mTOR/p70s6K的影响。

图24显示HMGA2抑制型hUCBSC分化形成脂肪组织的能力的测量结果。

图25显示HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的基因表达之间的比较结果。

图26显示对通过比较HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的基因表达而选择的8个基因进行的PCR的结果。

图27显示对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时增加并且在HMGA2抑制时减少的选定基因和对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时减少并且在HMGA2抑制时增加的那些基因进行的PCR的结果。

图28显示从脐带血源单核细胞分离的CD34⁺细胞的流式细胞术分析结果。

图29显示CD34⁺细胞数量基于在CD34⁺特异性培养基中的培养天数的波动。

图30显示从CD34⁺细胞到诱导神经干细胞的形态变化进程。

图31显示用DAPI、巢蛋白、HMGA2和SOX2免疫染色的CD34⁺iNSC的表达特征。

优选实施方式详述

一方面，本发明提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂盒，其包括(a)SRY(性别决定区Y)框2(SOX2)蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和(b)高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。

本发明涉及通过在靶细胞如非神经元细胞等内增加两种因子SOX2和HMGA2(常规公知的神经元分化转录因子)的表达，从靶细胞生成诱导神经干细胞。本发明的生成诱导神经干细胞的方法可通过仅利用两种诱导因子SOX2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干细胞，因此可比利用四或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法可显著减少重编程所需的时间，并且比仅利用单一SOX2基因时提供明显更高的重编程诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。

SOX2蛋白是通过性别决定区Y-box2(Sox2)基因表达的蛋白质，已知在产前阶段基于中枢神经***表达并且涉及神经干细胞自我复制，但也已知常常在恶性神经胶质瘤中表达。

高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白已知通过结合于DNA充当修饰染色质结构的因子，因此可诱导基因转录变化。

在本发明中，SOX2蛋白和HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可包括源自动物(包括人、小鼠等)的所有SOX2和HMGA2，优选地源自人的SOX2和HMGA2。另外，本发明的SOX2和HMGA2蛋白不仅可包括具有这些蛋白质的野生型氨基酸序列的那些蛋白质，而且可包括其变体。在此，SOX2和HMGA2蛋白的变体包括由于至少一个氨基酸残基的敲除、***、保守型或非保守型置换或其组合具有不同于SOX2和HMGA2的天然氨基酸序列的序列的蛋白质。变体可以是功能等同形式，其呈现与天然蛋白质相同的生物活性，或出于对理化环境提高结构稳定性或生理活性的必要蛋白质理化性质被修饰的那些蛋白质。

如本文所用，术语“编码SOX2或HMGA2蛋白的核酸分子”指代编码野生型SOX2或HMGA2蛋白、或上述变体型SOX2或HMGA2蛋白——其中可通过置换、敲除、***、或其组合修饰至少一个核苷酸——的核苷酸序列，并且可通过从天然来源分离或通过化学合成来制备。

编码SOX2蛋白的核酸分子或编码HMGA2蛋白的核酸分子可处于如下形态中：各核酸分子被独立地包含在表达载体中。

具体地，SOX2蛋白或HMGA2蛋白可以是利用包括编码这些蛋白质的核酸分子的表达载体由细胞系体外表达的形式的蛋白质。关于表达载体，可使用杆状病毒表达载体、哺乳动物表达载体或细菌表达载体，而关于细胞系，可使用昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、或细菌细胞系，但本发明所用的表达载体和细胞系不限于此。

如本文所用，术语“表达载体”可指代包括必需调控元件、与***基因可操作地连接以表达***基因、能够表达靶蛋白的基因构建体。本发明的表达载体可用于递送重编程诱导因子至非神经元细胞的目的。本发明的表达载体不仅可包括表达调控元件，如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，而且可选择性地包括用于膜靶向或分泌的信号序列、或前导序列，并且可根据目的用途被不同地制备。载体的启动子可以是组成型或诱导型的。另外，表达载体包括选择性标记物，用于选择包括载体的宿主细胞，并且在表达载体是可复制的表达载体时，其包括复制起点。表达载体可自我复制或可整合到宿主DNA中。载体可包括质粒载体、粘粒载体、游离基因载体、病毒载体等，优选病毒载体。病毒载体可包括源自下列的载体：逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒(MLV)、禽肉瘤/造血白细胞组织增生(ASLV)、脾坏死病毒(SNV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒等，但不限于此。

编码SOX2或HMGA2蛋白的核酸分子可以是信使RNA(mRNA)。

如本文所用，术语“重编程”指代使以具有不同特征的状态存在的分化的细胞(例如，无分化能力的细胞或有部分分化能力的细胞等)恢复或转化成具有新型分化能力的细胞的过程。细胞的重编程机制指代在敲除核内的表观遗传标记(与导致功能遗传性变化而不导致给定核苷酸序列变化相关的DNA状态)后，建立不同的表观遗传标记组，并且不同的细胞和组织在多细胞生物体分化和成长过程中获得不同的基因表达程序。这些不同的基因表达谱呈现通过表观遗传修饰(例如，DNA甲基化、组蛋白修饰、和其他染色质结合蛋白)被基本上控制。因此，多细胞生物体中的细胞类型被固定，并且在细胞分化或脱离细胞周期后不变，但在正常发育过程中或具体疾病的进展过程中的具体时期，可进行主要表观遗传重编程。本发明提供通过用具体蛋白质处理已经分化的目标细胞来制备具有未分化细胞的潜能的细胞的方法。

如本文所用，术语“重编程诱导因子”指代这样的物质：可诱导最终分化的细胞或部分分化的细胞被重编程形成具有分化形成新细胞类型的潜力的诱导神经干细胞，并且可包括SOX2蛋白、HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子。重编程诱导因子可无限制地包括任何能够诱导分化细胞重编程的物质。

如本文所用，HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可以是染色质调控因子。具体地，染色质是核小体，具有DNA与组蛋白之间复合物的基础结构。染色质调控进行使得相应基因的表达特征随DNA包围组蛋白的方式变化(例如，组蛋白乙酰化、DNA甲基化等)而变化。因此，染色质可通过DNA甲基化/去甲基化被调控，并且HMGA2可通过促进SOX2基因的启动子区域的低甲基化来充当染色质调控因子(实施例4-5)。

如本文所用，“非神经元细胞”指代除神经元细胞外充当本发明的靶细胞的所有分化或未分化的细胞。非神经元细胞可以是源自不同动物(包括人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、鼠、兔等)的细胞，优选源自人的细胞，但通过诱导神经干细胞重编程的细胞不限于此。

非神经元细胞可以是体细胞、成熟干细胞、或多能干细胞。

如本文所用，术语“体细胞”指代构成成年者(adult)的细胞，具有有限的分化能力和自我更新能力，具体地，体细胞构成人的皮肤、毛发、脂肪、血液等，优选是人成纤维细胞或人脐带血细胞，但不限于此。

如本文所用，“成熟干细胞”指代存在于骨、脂肪、骨髓基质、肌肉、神经等的干细胞，优选间充质干细胞，但不限于此。

如本文所用，“诱导神经干细胞”指代通过对分化细胞应用重编程技术来构建具有与神经干细胞相似或相同的多能性的未分化干细胞而制备的细胞。诱导神经干细胞具有与神经干细胞相同或相似的特征，具体地具有相似的细胞形态、相似的基因和蛋白质表达谱，并且可具有体内和体外多能性。因此，本发明的诱导神经干细胞可以是可分化形成神经细胞(神经元)、星形胶质细胞、少突胶质细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞等的神经干细胞。

本发明的试剂盒可不被具体限制，而可使用可在本领域常规使用的任何试剂盒类型。

本发明的试剂盒可以如下形式包装：包括SOX2蛋白和编码SOX2蛋白的核酸分子的第一组合物和包括HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子的第二组合物分别被包含在单独的容器中，或包含在唯一的容器中，该唯一的容器被划分成超过一个部分。

在本发明的示例性实施方式中，为确认SOX2和HMGA2蛋白在人成纤维细胞至诱导神经干细胞的重编程诱导过程中的效果，使这些蛋白质过表达，并通过PAX6/巢蛋白阳性集落分析连续检查其形态变化和重编程诱导效力。结果是，确认在SOX2和HMGA2的表达同时增加时，与仅SOX2表达增加时相比，自我更新能力、增殖能力和神经元细胞分化能力以及重编程诱导效力增加。具体地，在仅以HMGA2诱导重编程时，诱导神经干细胞的集落早约10天形成。

另外，确认SOX2和HMGA2可有助于脐带血源间充质干细胞(hUCB-MSCs)和脐带血源血细胞有效重编程形成诱导神经干细胞，并且具体地，确认HMGA2可有助于重编程效力提高并减少重编程所需时间。

作为本发明使用的非神经元细胞，脐带血源间充质干细胞是成熟干细胞的一个代表性实例，脐带血源血细胞是体细胞的一个代表性实例，并且这些结果表明在SOX2和HMGA2作为重编程诱导因子的辅助下，不仅体细胞，而且成熟干细胞也可被诱导神经干细胞有效重编程。

另一方面，本发明提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞的方法。具体地，本发明的方法可包括(a)递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子，和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达；和(b)培养步骤(a)的细胞。

优选地，本发明的方法可进一步包括步骤(c)：从步骤(b)获得的细胞培养物分离神经干细胞样集落。

在根据本发明生成诱导神经干细胞的方法中，可通过将SOX2和/或HMGA2的表达调控元件引入靶细胞来增加SOX2和HMGA2在靶细胞中的表达。

具体地，递送重编程诱导因子——如SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子——至细胞的方法可无限制地通过提供本领域使用的核酸分子或蛋白质的常规方法进行，优选如下方法：添加重编程诱导因子至非神经元细胞培养基、或直接将重编程诱导因子注入非神经元细胞，其中在此使用的重编程诱导因子可以以下列形式使用：病毒，其由病毒载体转染的包装细胞获得，其中相应基因，即编码SOX2蛋白的核酸分子和编码HMGA2蛋白的核酸分子，被分别***；mRNAs，其通过体外转录生成；或蛋白质，其在各种细胞系中生成。

将重编程诱导因子直接注入分化细胞的方法可通过本领域已知的任何方法进行，但不限于此，并且可通过适当选择方法进行，该方法选自微注射、电穿孔、粒子轰击、直接注射入肌肉、和利用绝缘子和转座子的方法。

所用病毒载体可以是源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒等的载体，但不限于此，并且优选地，可使用逆转录病毒载体。另外，关于包装细胞，可在根据所用病毒载体选择后，使用本领域已知的各种细胞。

另外，SOX2和HMGA2在靶细胞中的表达可通过引入SOX2和/或HMGA2的表达调节因子来增加。

具体地，HMGA2的表达调节因子可以是let-7miRNA簇抑制剂或PDE4D抑制剂。let-7miRNA簇已知是靶向HMGA2从而减少其表达的miRNA。在本发明中，可以通过引入let-7miRNA簇抑制剂来增加靶细胞中的HMGA2表达量。

另外，SOX2的表达调节因子可以是PDE4D抑制剂。cAMP活化的主要细胞机制已知是通过被称为环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的同工酶系列的cAMP分解。PDE酶包括12种已知的酶。IV型PDE抑制(PDE4抑制)被公认在炎症介导释放的抑制和气道平滑肌的松弛中尤其有效。表明cAMP活化为在SCI后诱导神经元细胞以克服抑制剂信号的有希望的策略。通过洛利普兰(rolipram)——PDE4抑制剂——抑制cAMP水解已知防止在脊髓挫伤后cAMP水平下降。因此，当PDE4抑制剂结合于许旺细胞移植物时，其促进相当大的脊髓和本体感受轴突保留和髓鞘形成。可以使用SelCID^TM作为PDEIV活性抑制剂。

因此，PDE4D抑制剂——SOX2和HMGA2的常用表达调节因子——的应用可增加SOX2和HMGA2的表达量，从而显著增加重编程诱导效力等。

除本发明的重编程诱导因子SOX2和HMGA2外，重编程诱导因子还可包括选自下列的至少一种蛋白质：OCT4、KlF4、CMYC、LIN28、和Nanog、或编码这些蛋白质的至少一种核酸分子。这些蛋白质是已知的重编程诱导因子，并且其中CMYC和LIN28属于let-7miRNA簇。因此，可通过另外表达这些诱导因子来增加重编程诱导效力。

另外，在本发明中，可利用其他纳米颗粒或化合物来引入SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子、和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。

本发明的步骤(b)的细胞培养可在本领域已知的适当的培养基和培养条件下进行。这些培养过程可容易根据所选细胞被本领域技术人员调节。

步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基中培养，并且神经元细胞可自诱导神经干细胞形成。

另一方面，本发明提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞。

诱导神经干细胞同上述。

实施例中确认，诱导神经干细胞可分化形成神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞，并且还可获得自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。

另一方面，本发明提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，其包括诱导神经干细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。

本发明的诱导神经干细胞是可分化形成神经元相关细胞的那些细胞，因此可用于神经元细胞再生。因此，其可用作细胞治疗产品。

本发明的细胞治疗产品可包括1.0×10⁵个细胞至1.0×10⁹个细胞/1mL，优选1.0×10⁶个细胞至1.0×10⁸个细胞/1mL，更优选1.0×10⁷个细胞/1mL，但不限于此。

本发明的细胞治疗产品可不经冷冻干燥使用或被冷冻干燥以后续使用。在需要冷冻干燥时，可在冷冻干燥前将标准冷冻保存液(例如，DMSO、甘油、和Epilife^TM细胞冻干介质(CascadeBiologics))加入细胞群。

另外，细胞治疗产品可在根据医药领域常规方法配制成适于给予患者身体的单位给予形式后被给予，并且该制剂可包括在单次或几次给予后有效的给予剂量。适于此目的、作为胃肠外给予制剂的制剂实例可优选为注射剂如注射安瓿瓶、输注剂如输注袋、和喷雾剂如气溶胶制剂等。注射安瓿瓶可通过在使用前夕混合注射剂制备。关于注射液，可使用生理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格溶液等。另外，关于输注袋，可使用聚氯乙烯或聚乙烯材料，输注袋可由Baxter、BectonDickinson、Medcep、NationalHospitalProducts、和Terumo制造。

细胞治疗产品可进一步包括至少一种药学上可接受的载体，例如，保存剂、镇痛剂、增溶剂、稳定剂等，用于注射制剂；和基质、赋形剂、润滑剂、保存剂等，用于局部制剂。

由此制备的本发明的细胞治疗产品可通过本领域使用的常规给予方法连同用于移植和其他用途的其他干细胞一起或以与这些干细胞混合的形式给予，并且可优选被直接灌输(移入，engrafted)或移植至疾病区域、或直接移植或输注至需要治疗的患者的腹腔，但不限于此。另外，该给予可通过利用导管的非外科给予方法或通过截断后注入疾病区域或移植至疾病区域的外科给予方法来给予，但更优选通过利用导管的非外科给予方法给予。另外，根据常规方法的胃肠外给予，例如，直接给予到损伤中，和通过输注到血管中的移植——造血干细胞移植的普通方法，是可以的。

上述细胞的日剂量可被给予一次或每日以几个分剂量给予，该分剂量为1.0×10⁴个细胞/kg至1.0×10¹⁰个细胞/kg体重，优选1.0×10⁵个细胞/kg至1.0×10⁹个细胞/kg体重。然而，应理解，活性成分的实际剂量考虑多种相关因素来确定，如待治疗疾病、疾病严重程度、给予途径、患者体重、年龄和性别等，因此剂量不应被以任何方式解释为限制本发明的范围。

另一方面，本发明提供抑制或恢复对象的神经元细胞损伤的方法，包括给予重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞。具体地，对象的神经元细胞损伤可通过给予重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞被抑制或恢复，该重编程通过如下进行：递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞；和培养该细胞。

如本文所用，术语“对象”指代牛、狗、猪、鸡、羊、马、和包括人的哺乳动物，但不限于此。优选地，重编程的诱导神经干细胞或其培养产物的给予可被腹膜内或血管内给予、直接给予到损伤中或给予到关节滑膜腔中等。

神经元细胞损伤的抑制或恢复可包括预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。

另一方面，本发明提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，其包括SRY(性别决定区Y)框2(SOX2)蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子、和高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为活性成分。

如上所述，包括SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子的组合物可被引入非神经元细胞，以诱导其重编程形成神经干细胞，从而用于预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。

另外，SOX2和/或HMGA2基因可被以如下形式提供：本领域已知的胞内基因递送***或基因转运体，例如，脂质复合体(lipoplex)，多聚体(polyplex)，细胞渗透肽(CPP)，蛋白转导域(PTD)等，但不限于此。

PTD可无限制地被使用，只要其可提高SOX2和/或HMGA2的胞内引入效力。

另外，SOX2和/或HMGA2可以是融合蛋白形式，该融合蛋白被SOX2和/或HMGA2质粒和转运子之间的缀合物编码，从而将质粒递送到细胞中。例如，其可以是SOX2和/或HMGA2和CPP或PTD之间、或SOX2和/或HMGA2和低分子量鱼精蛋白缀合物之间的融合蛋白形式。

如本文所用，术语“神经元细胞损伤相关疾病”指代可由于神经元细胞改变、丧失等发生的疾病、包括帕金森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、缺血性脑病如中风、脱髓鞘疾病、多发性硬化症、癫痫、退行性神经元疾病、脊髓损伤等，但不限于此。

如本文所用，术语“预防”指代与通过给予上述组合物抑制或延迟神经元细胞损伤相关疾病有关的各种行为，术语“治疗”指代与通过给予上述组合物导致神经元细胞损伤相关疾病症状改善或有利变化有关的各种行为。

另一方面，本发明提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生启动子或再生抑制剂的方法，包括1)制备分离的非神经元细胞；2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞；3)任选地，使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和4)在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选物质的处理，确定诱导神经干细胞或神经元细胞是否生成或其生成水平。

在本发明中，通过非神经元细胞重编程是否生成神经干细胞或神经元细胞或生成水平可通过观察诸如下列的变化来评价：候选物质处理之前和之后的非神经元细胞形态变化、神经元细胞特异性标记物是否表达、自我更新能力、增殖能力、神经元细胞分化能力等。

另外，本发明可进一步包括如下步骤：如果诱导神经干细胞或神经元细胞的生成水平在步骤4中增加，则确定该候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再生启动子。

优选地，筛选方法可利用从患者分离的非神经元细胞筛选患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生启动子或患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生抑制剂。

具体地，可通过如下提供治疗方法：基于个别检查确定适于个别患者的构成或环境的神经元细胞再生启动子或再生抑制剂。因此，可通过如下选择定制治疗剂：根据筛选方法选择候选药物作为神经元细胞再生启动子或再生抑制剂，用该药物治疗神经元细胞损伤相关疾病患者，和确认治疗效果，然后进行测绘(mapping)和将其储存。即，通过结合体外筛选方法和体内确认方法，可更有效地选择和确认神经元细胞损伤相关患者的定制治疗剂。

在本发明的示例性实施方式中，通过上述筛选方法确认，当HMGA2基因被另外引入时，与SOX2基因或类似物被引入时相比，诱导形成诱导神经干细胞的效力增加约两倍或更高，因此确认HMGA2蛋白可用作神经元细胞的再生启动子。

另一方面，本发明提供筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括：1)制备分离的非神经元细胞；2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加SOX2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞；3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和4)用候选物质处理步骤3形成的非神经元细胞，和确定候选物质是否是针对非神经元细胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。

具体地，为根据个别患者的构成或环境来选择个人定制神经元细胞治疗产品，可通过确认神经元再生相关机制和其相关蛋白质表达的变化、通过用候选物质处理步骤2诱导的神经干细胞或步骤3形成的神经元细胞来确认和验证用于生成诱导神经干细胞的非神经元细胞是否可用作非神经元细胞获取对象的定制神经元细胞治疗产品。

另一方面，本发明提供促进非神经元细胞重编程形成诱导神经干细胞(iNSC)的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

在本发明的示例性技术特征中，确认当HMGA2蛋白的表达和SOX2因子(传统公知是神经元分化转录因子)一起增加时，从非神经元细胞至诱导神经干细胞的诱导效力和增殖能力显著高于利用常规SOX2的重编程。因此，HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子可用于促进重编程非神经元细胞形成神经干细胞。

另一方面，本发明提供用于细胞增殖的组合物或用于抑制细胞衰老的组合物，其包含HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

如本文所用，术语“细胞增殖”包括细胞数量增加，因此细胞增殖伴随DNA复制、细胞***、和各种细胞组分增加，并且体内细胞增殖速率可被控制。

另外，术语“细胞衰老”指代包括下列的过程：细胞特征和功能退化，直到细胞死亡或细胞增殖终止之时。已知的衰老原因包括代谢被代谢产物抑制、细胞表面变化、细胞骨架分子如胶原蛋白之间交联增加、退化分子通过自由基在细胞中积累、遗传信息转录和翻译错误积累、被致死基因遗传编程的细胞的预期寿命、胞内DNA损伤和修复活性恶化等。如本文所用，术语“衰老”不仅包括细胞衰老，而且包括组织和活生物体衰老。具体地，干细胞衰老可伴随，随着次代培养数增加，干细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶的表达增加、干细胞尺寸增加、干细胞增殖速率降低、增殖期缩短、端粒酶活性减少、或干细胞分化能力下降。

在本发明实施例11至20中，确认HMGA2转导的人脐带血源细胞(hUCBSC)不仅显示形态变化减少，而且显示SA-β-gal表达减少和细胞增殖保持。相比之下，当HMGA2被抑制时，形态变化增加，而且随同SA-β-gal表达增加，细胞增殖显著减少。因此，确认HMGA2蛋白过表达可促进基质细胞增殖，同时抑制细胞衰老。另外，根据本发明控制基质细胞的增殖、保持和衰老可通过下列进行：控制基质细胞的增殖——通过经由基质细胞转染诱导HMGA2蛋白的表达，和保持分化能力和干细胞能力，从而防止基质细胞衰老。因此，随着在培养过程中次代培养数增加，基质细胞的衰老更快进行，因此细胞***快速减少的问题可被解决。这种方法也可用于干细胞。

下文将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅以示例为目的，而非意图本发明受限于这些实施例。

制备实施例1：细胞培养

(1)在足月分娩后立即从20至30岁母体获得人脐带血源间充质干细胞(hUCB-MSC)，仅使用自分娩24小时内收集的血液样本。将脐带血样本与HetaSep溶液(StemCellTechnology，加拿大温哥华)以5：1(v/v)的比例混合，然后在室温下进行培育，直到血红细胞耗尽。在培育后，收集上清液，并通过在2,500rpm下Ficoll(GEhealthcarelifesciences，匹兹堡，PA)密度梯度离心20分钟收集单核细胞。细胞用PBS洗涤两次，并接种于具有生长培养基的培养皿上，该生长培养基为包含10％胎牛血清(FBS；GibcoBRL)的内皮细胞生长培养基-2(GibcoBRL，GrandIsland，NY)。在Boramae医院机构审查委员会(InstitutionalReviewBoard，IRB)和首尔国立大学(SeoulNationalUniversity)IRB(1109/001-006)的批准下进行分离和研究方案。

(2)同时，人真皮成纤维细胞(hDF，C-013-5C)购自LifeTechnologies，并被培养于包含10％FBS的成纤维细胞生长培养基-2(GibcoBRL)中。

(3)H9源人神经干细胞(H9-hNSC，NA800-100)购自Gibco，并被培养于包含StemPro神经补充物、碱性FGF、和EGF重组蛋白的KnockOutDMEM/F12基础培养基中。

(4)分离人脐带血源基质细胞，并将其如下述培养。具体地，为从脐带血(首尔国立大学医院)去除血红细胞，将脐带血与HetaSep溶液(StemCellTechnology，加拿大温哥华)以5：1(v/v)的比例混合，然后在室温下培育30分钟。小心收集上清液，通过添加Ficoll溶液收集单核细胞并在2,500rpm下离心20分钟。仅收获分离的细胞，用PBS洗涤两次，并以2×10⁵个细胞/cm²的浓度培养在包含肝素、抗坏血酸、重组人表皮生长因子(rhEGF)、氢化可的松、血管内皮生长因子(VEGF)、重组人成纤维细胞生长因子(rhFGF-B)、重组长R***-1(R3-IGF-1)、硫酸庆大霉素、两性霉素-B(GA-1000))和10％FBS(Gibco)的EMEM(Gibco)培养基中。培育后4天，去除未附于底部的那些细胞，并在80％细胞汇合时进行次代培养。

制备实施例2：通过转导由人真皮成纤维细胞制备人诱导神经干细胞(hiNSC)

通过VSV-G和gag/pol质粒和Fugene6转染剂(Roche，Indianapolis，IN)，将SOX2、HMGA2、CMYC和LIN28质粒转染到293T细胞中。在转染后48小时和72小时后收集病毒，并加载5μg/mL聚凝胺(Sigma，Ronkonkoma，NY)，以转导单独或与至少两种基因组合的基因至hDF、hUCB-MSC和hUCB-CD34⁺MNC。转导后，将细胞用PBS洗涤两次以去除病毒，并在生长培养基中培养以增殖。

为进行神经干细胞诱导，将培养基替换成ReNcellNSC维持培养基(Millipore，Billerica，MA)——神经干细胞诱导培养基，包含bFGF(Sigma)和EGF(Sigma)。通过Accutase(GibcoBRL)对hiNSC进行次代培养。

实施例1：分离iNSC和确认其特征

利用逆转录病毒SOX2，通过STO饲养细胞，在涂有聚-L-鸟氨酸(PLO)和纤连蛋白(FN)的玻璃盖玻片上将hDF转染成hiNSC。在转染2周至3周内从SOX2转导的hDF生成SOX2样和NSC样集落。

分离诱导神经干细胞集落，并通过反复的次代培养和神经球培养使其稳定。为附着诱导神经干细胞，将玻璃盖玻片涂覆PLO/FN，并将5×10⁴个诱导神经干细胞散布于其上。在24小时内，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟，然后用0.3％TritonX-100PBS透化10分钟。将细胞用5％正常山羊血清(NGS)阻断1小时，并用初级抗体以1：100的浓度处理过夜。第二天，将细胞用次级抗体以1：1000的浓度培育1小时。其核用DAPI染色，并在固定后干燥。

结果是，SOX2转导的iNSC具有与H9源NSC(H9-NSC)相似的形态，并且显示NSC特异性标记物如PAX6、巢蛋白、波形蛋白(VIMENTIN)和SOX2的表达(图1A至1D和S1A)。

实施例2：分析SOX2转导的hiNSC中的miRNA表达谱

实施例2-1：微RNA微阵列分析

利用Trizol试剂从细胞提取全RNA，为了生成荧光标记的miRNAs，利用AgilentmiRNA完全标记和杂交试剂盒将100ng全RNA样本标记并杂交。通过Agilent微阵列扫描仪扫描带标记miRNA的信号。利用软件(Agilent特征提取软件(v11.0.1.1))提取原始数据，并利用R统计学语言v.2.15.0对其进行分析和可视化。

实施例2-2：miRNA表达谱的分析结果

通过如同实施例2-1的微阵列分析，确定hDF、H9-NSC和SOX2转导的hiNSC的miRNA谱。

结果是，确认，SOX2转导的hiNSC的miRNA表达谱，与hDF相比，更相似于H9-NSC(图1E)。

具体地，确认在成纤维细胞向功能神经元的转化中具有主要作用的神经谱系(neurallineage)特异性miRNA如miR-9-5p、miR-9-3p、和miR-124的表达水平在H9-NSC和SOX2转导的hiNSC中比在hDF中更加上调。

另外，关于已知在NSC维持和自我更新的控制中发挥作用的let-7，确认整个let-7/miR-98家族的表达水平在H9-NSC和SOX2转导的hiNSC中比在hDF中更加下调(图1F和1J)。

然而，未检测到在hDF、H9-NSC和SOX2转导的hiNSC之间胚胎干细胞特异性miRNA——miR-302/367家族——的表达有显著改变，但在人胚胎干细胞(hESC)中检测到显著表达。

实施例3：Let-7b导致iNSC重编程效力、增殖、和自我更新的分析

实施例3-1：miRNA活性导致iNSC重编程效力的分析

为确认miRNA活性是否促进hDF重编程形成iNSC，在重编程过程中用SOX2转染miR-9-5p、miR-9-3p、miR-124、抗let-7b、let-7b、miR-CTL和抗miR-CTL。

具体地，利用市售hsa-let-7b(Invitrogen，PM11050)、miR-124-3p(Invitrogen，PM10691)、miR-9-5p(Invitrogen，PM10022)、miR-9-3p(Invitrogen，PM13072)和抗let-7b(Invitrogen，AM11050)使miRNA过表达，并使用适当的pre-miRNA前体-阴性对照(Invitrogen，AM17110)和抗miRNA抑制剂-阴性对照(Invitrogen，AM17010)。

关于集落形成率测定，将2×10⁴个细胞的SOX-2转导的hDF接种于24孔板，然后转染。转染利用50nMhsa-let-7b、miR-124-3p、miR-9-5p、miR-9-3p和抗let-7b进行(第0天)，并在3天后(第3天)再次转染。

结果是，确认SOX2转导的hDF转化成神经元样细胞，而非NSC样集落。在miR-124、miR-9-5p或miR-9-3p转染的细胞中，与miR-CTL转染的细胞相比，形成PAX6/巢蛋白阳性集落的效力下降很少或根本无变化。

然而，与抗miR-CTL相比，let-7b的过表达使重编程效力下降，而let-7b抑制使重编程效力增加至少3.5倍(图11)。

实施例3-2：let-7b导致hiNSC增殖的能力

为确认miRNAlet-7b是否控制hiNSC的增殖，用SOX2转导的hiNSC转染let-7b，并通过***细胞的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记来测量细胞增殖。

具体地，为测量细胞的增殖速率，如下述将iNSC用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU；Sigma)染色。简而言之，将10μMBrdU加入细胞培养基，并在37℃下培育5小时。然后，用PBS洗涤细胞，并用4％PFA将其在室温下固定10分钟。关于透化，在85℃下应用柠檬酸钠缓冲剂15分钟，并用阻断液(5％NGS)培育细胞。然后将细胞用在阻断液(Abcam，Cambridge，MA)中稀释的BrdU初级抗体在4℃下培育过夜。用次级Alexa-488抗体处理细胞1小时。关于核染色，将DAPI在PBS中稀释至1：1000，并与细胞一起培育10分钟。用共聚焦显微镜(EclipseTE200，Nikon，日本东京)拍摄图像。

结果是，确认BrdU阳性细胞的百分比减少，具体地，let-7b的转染使hiNSC的增殖以剂量依赖性方式减少(图6A和6B)。

实施例3-3：let-7b导致hiNSC的自我更新能力

为确认let-7b是否调节SOX2转导的hiNSC的自我更新，进行神经球形成测定。

具体地，在miRNA处理后，将2,000个细胞在非粘性培养皿中培养，形成初级神经球。利用Accutase使初级神经球细胞解离成单个细胞，然后在非粘性培养中以克隆密度重新铺平板，形成次级神经球。培养7天后计数和测量次级神经球的数量和尺寸。

结果是，确认let-7b-转染的hiNSC的尺寸小于miR-CTL转染的hiNSC的尺寸，而且let-7b在亚克隆过程中的增加导致几乎不形成次级神经球(图6C至7E)。

实施例4：同时转导SOX/HMGA2导致hiNSC重编程激活

由于实施例3确认了let-7b过表达使hiNSC重编程效力下降，因此考察MYC和LIN28(已知抑制let-7b的表达)和HMGA2(其表达已知被let-7b抑制)的过表达是否可提高hiNSC重编程效力。

实施例4-1：HMGA2导致细胞增殖的确认

为考察CMYC、LIN28和HMGA2与SOX2组合过表达与单独SOX2过表达相比是否增加细胞增殖，进行MTT测定。具体地，将1×10⁴个细胞接种于24孔板。培育48小时后，将50μLMTT原液(5mg/mL)加入培养基。在37℃下培育4小时后，移除包含MTT溶液的培养基。添加DMSO以溶解甲晶体，然后将溶液转移至96孔板。通过EL800微板读取器(BIO-TEKInstruments，Winooski，VT)测量540nm波长下的吸光度。

结果是，确认其中HMGA2具有最低增殖能力，并且其比CMYC低32％，比LIN28低17％(图2A)。

实施例4-2：HMGA2导致iNCS重编程效力提高的确认

为确认CMYC、LIN28和HMGA2与SOX2组合过表达与单独SOX2过表达相比是否促进hiNSC重编程，分别测量各情况的形成PAX6/巢蛋白阳性集落的效力。

结果是，确认HMGA2与SOX2的过表达显著增加hiNSC的重编程效力(图2C)，并且SOX2/HMGA2的同时过表达使形成PAX6/巢蛋白阳性集落所需的时间从17天减少至7.4天(图2B)。

实施例4-3：HMGA2导致免疫表型变化的确认

为确认在重编程早期阶段是否诱导了免疫表型变化，确定荧光激活细胞分选术(FACS)。

结果是，观察到仅SOX2/HMGA2过表达细胞显示细胞总量约10％的细胞群在转染后7天从CD44-阳性变成CD44-阴性，同时，细胞群约7％显示从CD184-阴性变成CD184-阳性(图2D)。

hiNSC和H9-NSC大部分显示CD44-阴性和CD184阳性细胞群(图7A)，SOX2/HMGA2转导的hiNSC还显示与SOX2转导的hiNSC和H9-NSC相似的形态特征，和NSC特异性标记物，如PAX6、巢蛋白、SOX2、Ki67、和HMGA2的表达(图2E)。

实施例4-4：HMGA2导致的转录组重编程水平的评价

为评价HMGA2导致的转录组重编程水平，通过微阵列分析来分析比较性全局基因表达数据，并进行定量实时PCR(qRT-PCR)以评价微阵列数据。

结果是，确认全局基因组热图和成对的散布图显示，hiNSC非常类似于H9-NSC，但不同于亲本hDF(图7B和7C)。SOX2-和SOX2/HMGA2转导的iNSC中均诱导了SOX2、HMGA2、PAX6、巢蛋白、OLIG2、MSI1和GLAST，并且其表达水平与H9-NSC相当(图2F)。

实施例4-5：SOX2启动子的甲基化状态分析

为分析hDF、H9-NSC和SOX2-和SOX2/HMGA2转导的hiNSC中的SOX2DNA的甲基化状态，利用EZDNA甲基化-金试剂盒(ZymoResearch，Irvine，CA)使未甲基化的胸腺嘧啶转化成胞嘧啶。

具体地，通过整合热变性和利用CT转化试剂的硫酸氢钠处理，使CpG岛中的未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。随着在进行酸性亚硫酸DNA转化后回收DNA，将转化的DNA去磺化，随后清洁和洗脱。然后，立即通过PCR扩增酸性亚硫酸根修饰的DNA，并将其储存在-20℃以下。关于酸性亚硫酸根转化的DNA的扩增，在MethPrimer(http：//www.urogene.org/ methprimer)设计引物，并进行PCR。引物序列显示如下：

Sox2正义5'-GGGATATGATTAGTATGTATTTTTT-3'(SEQIDNO：1)，

Sox2反义5'-AATTTTCTCCATACTATTTCTTACTCTCCT-3'(SEQIDNO：2)

将生成的PCR产物与pGEMT-Easy载体***I(Promega，Madison，WI)连接。然后，将质粒DNA克隆到细菌(DH5α)。利用ABI3730XL毛细管DNA测序仪(AppliedBiosystems)，通过M13反向引物(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)测序，来分析从细菌克隆提取的质粒DNA。随后，甲基化的CpGs通过黑圆圈表示，而未甲基化的CpG通过白圆圈表示。

结果是，确认hiNSC中的SOX2启动子是低甲基化的，类似于H9-NSC，表明SOX2在转录上是活化的(图2G)。因此，确认HMGA2发挥染色质调控因子的作用，促进SOX2启动子低甲基化。

总之，本实施例表明HMGA2，作为let-7b靶，显著增加SOX2诱导的重编程形成hiNSC的效力和时间，并且SOX2/HMGA2转导的hiNSC在细胞表面标记物特征、转录水平、甲基化模式等方面显示与H9-NSC相似的特征。

实施例5：HMGA2下调导致hiNSC增殖和自我更新抑制的确认

为确认HMGA2是否控制hiNSC的增殖，用HMGA2靶向性siRNA(siHMGA2)转染hiNSC，并通过BrdU标记***细胞来测量细胞增殖——具体地，利用市售siRNA(Dharmacon，ONTargetplusSMARTpool，Cat#L-013495-00-0005，Lafayette，CO)作为HMGA2抑制剂，和非靶向性siRNA(Dharmacon，ONTargetplusSMARTpool，Cat#D-001810-01)作为对照。将细胞以1×10⁴的浓度接种于24孔板，并用加入无抗生素的培养基的Dharmafect转染剂(Dharmacon)转染50nMsiRNA。

结果是，HMGA2的下调使BrdU阳性细胞的百分比急剧减少(图8A和8B)。另外，确认siHMGA2转染的hiNSC显著减少神经球尺寸，而且减少自我更新，如通过可在初级神经球中产生次级神经球的细胞的数量和百分比确认(图S4C至S4E)。总之，表明利用针对HMGA2的siRNA下调HMGA2，抑制hiNSC的增殖和自我更新。

实施例6：hiNSC多能性的确认

关于神经分化，将hiNSC以1,000的密度接种于包含iNSC维持培养基(ReNcellNSC维持培养基(Millipore))的24孔板中的各聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的盖玻片上。24小时后，将培养基更换成Neurocult(StemCellTechnology)，进行随机分化。1周Neurocult后，将培养基更换为三种具体谱系(神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞)的诱导培养基。

同时，在诱导分化后，通过免疫细胞化学利用谱系相关标记物确认iNSC。

实施例6-1：神经元分化能力的确认

作为神经元诱导培养基，使用DMEM/F12(GibcoBRL)和Neurobasal(GibcoBRL)之间的1：1混合物，其包含B27(GibcoBRL)、Gmax(GibcoBRL)、维甲酸(Sigma)、抗坏血酸(Sigma)、BDNF(Peprotech，RockyHill，NJ)、GDNF(Peprotech)、和Forskolin(Sigma)。

分化结果是，在对SOX2/HMGA2转导的hiNSC进行神经元诱导后10天至15天，确认未成熟神经元标记物、神经元特异性III类β-微管蛋白(TUJ1)、双皮质素(doublecortin，DCX)、和神经元中间丝、α-互联蛋白、和神经丝(NF)的表达(图3A)。

另外，用于hiNSC自我更新能力评价的克隆分析的结果是，确认神经元分化被诱导，并且多传代的克隆的NF和α-互联蛋白被染色。神经元诱导10天至25天后，MAP2(成熟神经元标记物)、酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺能和去甲肾上腺素能神经元标记物)、和胆碱乙酰转移酶(ChAT)，与H9-NSC相比，以相似的水平表达(图3A和9A)。

实施例6-2：星形胶质细胞分化能力的确认

作为星形胶质细胞诱导培养基，使用包含N2(GibcoBRL)、Gmax、和1％FBS的DMEM(高葡萄糖)培养基。

结果是，确认SOX2/HMGA2转导的hiNSC生成胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞，从而确认hiNSC分化形成星形胶质细胞(图3A)。

实施例6-3：少突胶质细胞分化能力的确认

有两种不同类型的少突胶质细胞诱导培养基。第一，将细胞在补充有N2、MEM非必需氨基酸溶液(MEMNEAA；GibcoBRL)、肝素(Sigma)、RA、SHH(Peprotech)、和B27的DMEM/F12培养基中培养2周，然后将培养基更换成补充有N2、B27、MEMNEAA、T3、cAMP(Sigma)、PDGF(Peprotech)、IGF(R&D)和NT3(Sigma)的DMEM/F12培养基2周。

结果是，确认在朝少突胶质细胞方向诱导20天至35天后检测到O4和OLIG2(少突胶质细胞标记物)双重阳性细胞(图3A)。

实施例7：hiNSC电生理学特征分析

为评价SOX2/HMGA2转导的hiNSC的功能，通过膜片钳读取(patch-clampreading)来测试电生理学性质。具体地，利用EPC10USB扩增仪(HEKAElectronik，Lamprecht，Germany)在室温下(22±1℃)记录源自iNSC的神经元的全细胞膜片钳记录。记录室装有持续流动的Tyrode溶液(流速，10mL/min)，并且贴片电极通过PC-10牵拉器(NarishigeCompany)由硼硅酸玻璃毛细管制成。电极在其装有移液管溶液时电阻为4MΩ至7MΩ。获取数据，并利用脉冲程序版本8.67(HEKAElectronik)和Origin6.1软件(MircoCal)进行分析。将电流在3kHz下利用四极Bessels过滤器过滤，并在10kHz下数字化。Tyrode溶液包含143mMNaCl、5.4mMKCl、0.5mMMgCl₂、1.8mMCaCl₂、0.5mMNaHPO₄、10mM葡萄糖和5mM4-(2羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；并且pH用NaOH调整至7.5。移液器溶液包含150mMKCl、1.0mMMgCl₂、10mMHEPES、5mMEGTA、2mMMg-ATP，并且pH用NaOH调整至7.2。利多卡因(0.1％)用于阻断Na电流。

结果是，确认SOX2/HMGA2转导的hiNSC可在产生表达钠电流的神经元时生成不同动作电位。钠电流(或内部电流)和动作电位被钠通道阻断剂利多卡因抑制，并且在洗出后恢复正常状态(图3B至3D和9B至9D)。这些数据表明，自hiNSC分化的神经元具有正常神经元的功能膜性质和活性。

实施例8：在动物模型中测试hiNSC分化和存活性

实施例8-1：移植CMDil标记的hiNSC

利用Accutase分离SOX2/HMGA2转导的hiNSC，并将其悬浮于PBS中。用CM-DiI(分子探针)标记hiNSC，以在注射后进行追踪。用CM-DiI在37℃水浴中培育hiNSC15分钟，然后在4℃下培育10分钟。将CM-DiI标记的hiNSC以1×10⁵个细胞/μL的密度悬浮于PBS中。利用立体定位仪和超微泵(WorldPrecisionInstruments，Sarasota，FL)将CM-DiI标记的hiNSC移植到室下区(SVZ)。移植后，通过缝合闭合头皮，并使动物从麻醉恢复，从而制备4周龄小鼠模型。

实施例8-2：IHC冷冻切片

移植后三周，从小鼠模型分离脑，并浸入4％PFA过夜，然后转移至30％蔗糖48小时。然后，使分离的脑与浸润混合物(OCT化合物；SakuraFinetek，日本东京)一起成型，保持在-70℃过夜，并在低温恒温器(CM3050，Leica，德国韦茨拉尔)上进行冷冻切片。具体地，用0.05％TritonX-100培育组织20分钟。用5％NGS培育组织，以阻断非特异性抗体结合。然后，在4℃下用初级抗体以5％NGS的稀释比培育组织过夜。在室温下用Alexa488或Alexa594标记的二级抗体(1：1000)培育组织1小时。用DAPI将核染色10分钟。用共聚焦显微镜(Nikon)拍摄图像。

结果是，通过免疫染色检测到移植细胞，并且检测到的细胞被三种不同谱系的标记物共同染色。免疫染色显示，发现移植的hiNSC是TUJ1(神经元)、GFAP(星形胶质细胞)和MBP(少突胶质细胞)阳性的，其被CMDiI1荧光共同定位(图3E和9E)。总之，表明SOX2/HMGA2转导的hiNSC能够在体内存活并分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

实施例9：各种体细胞通过HMGA2有效重编程形成hiNSC

实施例9-1：通过HMGA2进行hUCB-MSC的iNSC重编程

由于人脐带血(hUCB)细胞的优点是其可无侵入获得并且保留最少基因突变，因此评价hUCB是否可用作iNSC重编程的来源。

按照制备实施例1的描述，从hUCB分离间充质干细胞(MSC)群。在SOX2/HMGA2转导到hUCB-MSC中后，hUCB-MSC源hiNSC集落在转染后第7天至第12天出现，并且其被免疫细胞化学证明是PAX6和巢蛋白阳性染色的iNSC(图4A)。已有报道称MSC是CD73和CD105阳性的，但是造血标记物CD34、CD45和HLA-DR阴性的。hUCB-MSC源hiNSC是CD73和CD105阴性的，表明细胞表面标记物特征已被改变(图10A)。

另外，确认与hDF相比，hUCB-MSC中HMGA2的表达明显较高(图10B)。SOX2/HMGA2转导的hUCB-MSC产生比SOX2转导的hUCB-MSC高3至4倍的PAX6/巢蛋白阳性集落(图10C)。

实施例9-2：H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异

为确认来自不同细胞来源和转基因组合的H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异，通过累积群体倍增水平分析(CPDL)测量H9-NSC和hiNSC的增殖速率。具体地，利用方程式CPDL＝ln(N_f/N_i)ln2通过整个累积群体倍增水平确定增殖速率，其中N_i是初始接种细胞数，N_f是最终收获细胞数，ln是自然对数。

在6孔板上接种三份5×10⁴个细胞，并将其每4天进行次代培养。为只检测活细胞，利用台盼蓝计数最终细胞数，并再次接种5×10⁴个细胞。关于累积群体倍增水平的计算，计算各传代的群体倍增数，并加和至前一传代的群体倍增数。

结果是，确认H9-NSC和hiNSC细胞系之间增殖能力无显著差异，这表明H9-NSC和hiNSC细胞系具有相似的增殖能力(图10D)。

实施例9-3：诱导衰老hUCB-MSC形成神经干细胞的能力的确认

为研究let-7b/HMGA2在重编程效力中的作用，通过转导单独SOX2或SOX2与let-7靶向因子组合，考察衰老hUCU-MSC是否可被诱导形成神经干细胞。为此，用SOX2、SOX2/CMYC、SOX2/LIN28、和SOX2/HMGA2转导衰老hUCB-MSC——其衰老经由衰老相关(SA)-β-半乳糖苷酶测定确认(图4B)。

关于半乳糖苷酶测定，将hUCB-MSC接种于6孔板，并培育直到群体达到40％至50％，用PBS洗涤两次，并在室温下用0.5％戊二醛在PBS中固定5分钟。用包含1mMMgCl₂的PBS(pH7.2)洗涤细胞，并将其用X-gal溶液(1mg/mLX-gal、0.12mMK₃Fe[CN]₆(铁***)、0.12mMK₄Fe[CN]₆(亚铁***)和1mMMgCl₂，在PBS中，pH6.0)在37℃下培育过夜。第二天，在显微镜(IX70，Olympus，日本)下拍摄图像。

SOX2/CMYC和SOX2/LIN28之间的组合导致形态变化，但不生成hiNSC集落，而仅SOX2/HMGA2过表达被明显显示促进hiNSC集落形成(图4B)。SOX2/HMGA2过表达导致在转化后三周由1×10⁵个衰老hUCB-MSC形成2至4个集落(转化效力为0.004％至0.008％)(图4C)。

实施例10：脐带血CD34 ⁺ 细胞的hiNSC重编程

实施例10-1：脐带血CD34⁺细胞的分离和纯化

通过CD34微珠分选***(MACS)进行CD34⁺细胞分离。具体地，将50μLCD34微珠(#130-046-703，MiltenyiBiotech)与在2℃至8℃下利用30分钟Lymphoprep(ProteoGenix，Portland，OR)密度梯度离心从脐带血获得的单核细胞(约1×10⁸)一起培育，从而磁性标记CD34⁺细胞。使单核细胞的悬浮液经过连接MACS柱后的有磁场的MACS分选机，使得仅磁性标记的CD34⁺细胞可被限制在柱内。将柱从MACS分选机移除后，通过施压将缓冲液推开，从而分离被限制的CD34⁺细胞。在包含10％FBS、50ng/mLSCF、20ng/mLIL-6、50ng/mLTPO和100ng/mLFlt3的Iscove改良型Dulbecco培养基(IMDM)培养CD34⁺细胞。

利用抗CD34-FITC抗体(MiltenyiBiotech)通过流式细胞术测量CD34⁺细胞的纯化效力，结果是，确认84.15％纯度的CD34⁺细胞被分离和纯化(图4E和27)。

实施例10-2：脐带血CD34⁺细胞的hiNSC重编程的确认

关于刺激胞质***，将hUCB-CD34⁺细胞用细胞因子(SCF、Flt3L、TPO和IL-6)培养3天，并通过逆转录病毒用SOX2/HMGA2转导(图4D)。然后将细胞铺平在饲养器上，直到转导后10天至14天，并在NSC条件下观察iNSC集落。免疫细胞化学染色的结果显示，hUCB-CD34⁺iNSC具有PAX6、SOX2和巢蛋白的阳性表达。另外，这些hUCB-CD34⁺iNSC能够发育成神经元或星形胶质细胞(图4F)。单独SOX2足以生成hUCB-CD34⁺iNSC，但显示极低效力。共表达SOX2和HMGA2的hUCB-CD34⁺细胞显示形成PAX6/巢蛋白阳性集落的频率增加10至20倍(图10E)。

总之，通过SOX2和HMGA2之间的协同相互作用进行的有效定向重编程实现，不仅干细胞，而且各种体细胞如血细胞，重编程形成hiNSC。

实施例11：转染hUCBSC细胞的HMGA2蛋白表达增加的确认

实施例11-1：转染进行HMGA2过表达

为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞(hUCBSC)分化和衰老中的作用，用HMGA2转染8或更少代的早期阶段的hUCBSC。

首先，将HMGA2序列克隆到pMX逆转录病毒载体中。将HMGA2质粒连同VSV-G和gag/pol质粒转染到293T细胞中。转染后48小时和72小时收集病毒悬浮液，并利用其在5μg/mL聚凝胺的存在下转染hUCBSC。测量转导效力，显示为80％或更高，如图12所示。

实施例11-2：免疫细胞化学分析

在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过免疫细胞化学分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图13中。

实施例11-3：微阵列

在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过微阵列分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图14中。

实施例11-4：根据次代培养传代进程的HMGA2表达水平的测量

在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过PCR确认根据次代培养进程的HMGA2表达水平。

根据制造商推荐的方案，利用Trizol试剂^TM(Invitrogen，USA)提取全RNA，然后向其加入寡dT引物和AccupowerRT预混物(Bioneer，Korea)，以合成cDNA。利用cDNA作为模板按照制造商推荐的方案进行PCR，结果显示在图15中。根据PCR实验结果，确认HMGA2表达水平随次代培养从第6传代进行至第20传代而减少。

实施例12：根据次代培养传代进程的形态变化的确认

在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对比图像测量根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图16中。

根据图16，确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)随着传代进程变得更扁平和更长，而人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的形态变化减少。

实施例13：SA-b-gal(衰老相关β-半乳糖苷酶)染色

为确认实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水平，通过β-gal染色法测量根据次代培养传代进程的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达水平，结果显示在图17中。

根据图17，确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达水平减少。

实施例14：根据次代培养传代的细胞增殖

在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定测量根据次代培养传代进程的细胞增殖水平，结果显示在图18中。

根据图18，确认与对照相比，人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使根据次代培养传代进程的细胞增殖水平较少减少。

实施例15：HMGA2对PI3K/AKT途径的影响的评价

实施例15-1：相关基因的确认

在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过Ingenuity途径分析(IPA)软件说明HMGA2过表达相关的信号传导途径的相关基因和分子细胞功能的相关基因，结果显示在图19中。

根据图19，确认与转录控制相关的elF4和p70S6K信号被大量表达，并且与elF4和p70S6K相关的mTOR和PI3K/AKT信号途径被大量表达。

实施例15-2：蛋白质印迹

在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，进行蛋白质印迹，评价HMGA2过表达对PI3K/AKT途径和mTOR/p70s6K的影响。

对下列进行蛋白质印迹分析：(i)HMGA2过表达的hUCBSC，(ii)LY294002处理的HMGA2过表达的hUCBSC，和(iii)作为比较例的GFP。

具体地，将细胞在包含1mM苯甲基磺酰氟、1mM抑肽酶、1mM亮肽素、1mM抗痛素和0.1mM原钒酸钠的50mMTris-HCl缓冲剂中粉碎。通过DC测定试剂盒(Bio-Rad，USA)确认蛋白质含量，通过在10％至15％聚丙烯酰胺凝胶上加载特定量蛋白质进行SDS-PAGE，并将蛋白质转移至50V和350mA的硝化纤维素膜5小时。所有抗体按照制造商的说明来使用，并且通过增强型化学发光检测试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech，Buckinghamshire，UK)确认蛋白质带，结果显示在图20中。

根据图20，确认HMGA2诱导了AKT、mTOR和p70S6K磷酸化，并且在用LY294002处理时蛋白质表达总量无变化，但AKT、mTOR和p70S6K磷酸化被抑制。

虽然HMGA2抑制了p16^INK4A和p21^CIP1/WAF1的表达水平，但表达水平通过LY294002处理被恢复，因此PI3K/AKT/mTOR/p70S6K途径适于降低p16^INK4A和p21^CIP1/WAF1的表达水平。

另外，确认HMGA2过表达激活PI3K/AKT/mTOR/p70S6K途径并且抑制p16^INK4A和p21^CIP1/WAF1的表达。

实施例16：HMGA2抑制导致根据次代培养传代进程的形态变化的确认

为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞(hUCBSC)分化和衰老中的作用，利用siRNA抑制8或更少代的早期阶段的hUCBSC中的HMGA2表达。

在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对比图像测量根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图21中。即，确认HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)变得更扁平和更长。

实施例17：HMGA2抑制导致的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达水平的测量

为确认HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水平，通过β-gal染色测量衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的表达水平，结果显示在图21中。

确认HMGA2转导的hUCBSC增加衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的表达水平。

实施例18：次代培养传代对细胞增殖的影响的确认

在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定测量根据次代培养传代进程的细胞增殖，结果显示在图22中。根据图22，确认HMGA2被抑制的hUCBSC显著减少根据次代培养传代进程的细胞增殖。

实施例19：蛋白质印迹

在人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，为评价HMGA2抑制对PI3K/AKT途径和mTOR/p70s6K的影响，进行蛋白质印迹，结果显示在图23中。

根据图23，确认AKT、mTOR和p70S6K磷酸化急剧减少，而p16^INK4A和p21^CIP1/WAF1的表达水平增加。根据这些结果，确认HMGA2的抑制抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K途径，而增加p16^INK4A和p21^CIP1/WAF1的表达。

基于实施例15-2和上述实施例的结果，HMGA2蛋白表达导致的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的信号传导途径显示在图24中。

实施例20：脂肪组织分化能力的测量

测量HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)分化能力。

为了解基于细胞中存在的累积脂肪的分化水平，将培养的细胞用油红O染色，并用100％异丙醇再次提取渗入细胞的油红O，并通过ELISA平板阅读器(EL800，Bio-TekInstruments，USA)将其在OD500下定量。结果显示在图25中。

根据图25，确认HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中油红O染色的百分比低于对照组，并且脂肪细胞分化相关的基因如PPARr、aP2和C/EBP-b的表达率迅速减少。

实施例21：HMGA2控制相关基因的筛选和PCR

比较实施例11-1制备的HMGA2过表达人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达和实施例7制备的HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达，如图26所示。

基于图26的结果，选择在HMGA2过表达时表达水平增加而在HMGA2被抑制时表达水平减少的三种基因，CyclinF、CyclinE1和CDC25A，而且选择在HMGA2过表达时表达水平减少而在HMGA2被抑制时表达水平增加的五种基因，C14orf153、EID2B、ZNF394、CDKN2AIPNL和C9orf80。由此选择的八种基因进行PCR，结果显示在图27中。

Claims (28)

1.用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂盒，包括：

(a)SRY(性别决定区Y)框2(SOX2)蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和

(b)高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码SOX2蛋白的核酸分子和所述编码HMGA2蛋白的核酸分子分别独立地被包括在表达载体内。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码HMGA2蛋白的核酸分子是染色质调控因子。

4.制备自非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞的方法，包括：

(a)递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加所述SOX2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达；和

(b)培养步骤(a)中的细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括：

(c)从步骤(b)获得的培养物分离神经干细胞样集落。

6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基上进行培养，并且其特征在于由所述非神经元细胞形成所述诱导神经干细胞，并且由所述诱导神经干细胞形成所述神经元细胞。

7.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)通过下列进行：

将SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子加入所述非神经元细胞的培养基；

将SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子直接加入所述非神经元细胞；或

用病毒感染所述非神经元细胞，所述病毒由其中***了编码SOX2蛋白的核酸分子和编码HMGA2蛋白的核酸分子的病毒载体转染的包装细胞获得。

8.根据权利要求4所述的方法，其中增加所述SOX2蛋白或所述HMGA2蛋白在所述非神经元细胞中的表达的特征在于分别将SOX2或HMGA2的表达调节因子引入所述非神经元细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中HMGA2的表达调节因子是let-7miRNA簇抑制剂或PDE4D抑制剂。

10.根据权利要求8所述的方法，其中SOX2的表达调节因子是PDE4D抑制剂。

11.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞源自人。

12.根据权利要求4所述的方法，其中所述非神经元细胞是体细胞或成熟干细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述体细胞是血细胞。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述成熟干细胞是间充质干细胞。

15.通过权利要求4至14任一项所述的方法制备的诱导神经干细胞；或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。

16.用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括权利要求15所述的诱导神经干细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。

17.预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包括：

SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和

HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，

作为活性成分。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述神经元细胞损伤相关疾病选自帕金森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、缺血性脑病、脱髓鞘疾病、多发性硬化症、癫痫、退行性神经***疾病、和脊髓损伤。

19.筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑制剂的方法，包括：

1)制备分离的非神经元细胞；

2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加所述SOX2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞；

3)任选地，使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和

4)在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选物质的处理，确定所述诱导神经干细胞或所述神经元细胞是否生成、或其生成水平。

20.根据权利要求19所述的方法，进一步包括下列步骤：如果步骤4中所述诱导神经干细胞或所述神经元细胞的生成水平增加，则确定候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再生启动子。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中利用从患者分离的非神经元细胞，筛选患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生促进剂或患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生抑制剂。

22.筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括：

1)制备分离的非神经元细胞；

2)通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加所述SOX2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞；

3)使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞；和

4)用候选物质处理步骤3形成的所述非神经元细胞，和确定所述候选物质是否是针对非神经元细胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。

23.促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

24.用于细胞增殖的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

25.抑制细胞衰老的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。

26.根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中所述细胞是脐带血源基质细胞。

27.预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予权利要求15所述的诱导神经干细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。

28.预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。