MX2013001587A - Convesion de celulas somaticas a celulas madre, neurales reprogramadas, inducidas (irnscs). - Google Patents

Convesion de celulas somaticas a celulas madre, neurales reprogramadas, inducidas (irnscs).

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Abstract

Esta solicitud se refiere a un método para convertir células somáticas a Células Madre Neurales (NSC, por sus siglas en inglés). Por otra parte, esta solicitud se refiere a un método para convertir fibroblastos, queratinocitos o adipocitos humanos a células madre neurales con base en pasos vinculados de transducción de genes e inducción de un medio químicamente definido.

Description

CONVERSION DE CELULAS SOMATICAS A CELULAS MADRE, NEURALES , REPROGRAMADAS , INDUCIDAS (IRNSCS) Descripción de la Invención Esta solicitud se refiere a un método para convertir células somáticas a Células Madre Neurales (NSC, por sus siglas en inglés) . Por otra parte, esta solicitud se refiere a un método para convertir fibroblastos humanos, queratinocitos o adipocitos a células madre neurales con base en pasos vinculados de transducción de genes e inducción de medio químicamente definido.
El dogma que postula que las células somáticas completamente diferenciadas tienen propiedades absolutamente irreversibles fue aceptado generalmente durante un largo tiempo. Esto comenzó a cambiar cuando una serie de experimentos de vanguardia mostraron que los perfiles de expresión de genes silenciosos pueden ser reactivados completamente mediante la fusión de diferentes pares de tipos de células (Blau, H.M. How fixed is the differentiated state? Lessons from heterokaryons . Trends Genet . 5, 268-272 (1989)). Más recientemente, se mostró que la transferencia de núcleos de un tipo de célula somática en una célula huevo enucleada podría conducir a la reversión completa del perfil de expresión de genes de las células somáticas y a la formación de una célula pluripotente estable capaz de generar nuevos Ref: 238623 animales completos (véase por ejemplo Gurdon, J. B. & Melton, D. A. Nuclear reprogramming in cells. Science 322, 1811-1815 (2008)). Yamanaka y colegas (Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006) ) demostraron que las células somáticas pueden ser reprogramadas a células madre, pluripotentes , inducidas (iPSCs) mediante la transducción de cuatro factores definidos (Sox2, Oct4, Klf4, c-Myc) . Diferentes tipos de células somáticas que incluyen fibroblastos, queratinocitos y adipocitos han sido reprogramados a un estado pluripotente iPSC. Durante los años pasados, surgió la interrogante si los tipos específicos de células somáticas podrían ser transdiferenciados a un tipo de célula somática completamente diferente tal como una neurona. ernig y colegas abordaron este cuestionamiento mostrando la conversión directa de fibroblastos de ratón a neuronas funcionales mediante la transducción de tres genes cruciales: Mashl, Brn2 y ytll (Wernig y colaboradores, Direct conversión of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 25 ;463 (7284) : 1035-41 (2010) . Sin embargo, las neuronas obtenidas son células posmitóticas las cuales por definición no son capaces de proliferar y las cuales no toleran procedimientos de congelamiento y descongelamiento. El documento US2010/0021437 da a conocer un método para generar células madre, pluripotentes , inducidas a partir de fibroblastos e inducir esas células para diferenciarse en fenotipos neurales.
Sin embargo, la conversión directa de células somáticas diferenciadas a células madre neurales no ha sido descrita hasta ahora. Las células madre neurales son células madre multipotentes y se reporta que se propagan bajo condiciones específicas. Estas requieren un medio químicamente definido, por ejemplo el medio N2B27 (N2B27 es una mezcla 1:1 de DMEM/F12 (Gibco, Paisley, Reino Unido) complementada con N2 y B27 (ambos de Gibco) ) complementado con FGF (factor de crecimiento de fibroblastos 2) y EGF (factor de crecimiento epidérmico) . Estas pueden crecer como un cultivo adherente monocapa, por ejemplo una placa revestida con Poli-ornitina/Lamina o como neuroesferas flotantes en placas de cultivo de células no adherentes. Se ha reportado que los dos tipos de cultivos de células madre neurales (neuroesferas, cultivos adherentes) son completamente inter-convertibles . Las células madre neurales se pueden desarrollar indefinidamente y aún pueden permanecer realmente multipotentes. En condiciones especiales, se diferencian en tipos de células que componen el cerebro adulto, que incluyen neuronas, astrocitos y oligodendrocitos . Las células madre neurales se consideran posibles agentes terapéuticos para tratar a pacientes con enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, apoplejía y lesión de la médula espinal .
Se sabe que las células madre neurales se pueden generar ya sea in vitro a partir de Células Madre Embriónicas (ESC, por sus siglas en inglés) (Chambers y colaboradores Nature 27;3 (2009)) o se pueden aislar directamente de muestras de cerebro (Reynolds BA, Rietze RL (2005) Nat Methods 2:333-336). Sin embargo, estos métodos conocidos hasta ahora tienen muchas desventajas mayores puesto que ya sea origina una variedad de consideraciones éticas sumamente sensibles y/o necesitan tecnologías complicadas y laboriosas las cuales experimentan problemas serios con la capacidad de reproducción. Hasta ahora no se ha descrito un método en donde las células madre neurales puedan ser derivadas directamente de células somáticas diferenciadas. En un principio, las células madre neurales se pudieron obtener de iPSCs que habían sido derivadas de células diferenciadas. Sin embargo, esto implicaría el cultivo de iPSC. Se ha reportado que las iPSCs se expanden indefinidamente pero las condiciones de cultivo son complicadas y requieren enormes esfuerzos. Además, se ha reportado que la derivación de células madre neurales a partir de células madre pluripotentes fluctúa debido a mecanismos estocásticos . Un obstáculo común de las iPSC y las ESC es que incluso un número pequeño de células no diferenciadas puede dar por resultado la formación de teratomas (tumores de células germinales que comprenden varios tipos de células) , los cuales poseen contaminaciones serias que no pueden ser ignoradas. Las células madre somáticas, tales como las células madre neurales no forman teratomas. Por lo tanto, permanece la necesidad de una tecnología fácil, accesible y reproducible para la generación de células madre neurales. La presente invención proporciona un método para convertir directamente células somáticas a células madre neurales. El nuevo método disminuye la necesidad de obtener células iPS y por lo tanto elimina el riesgo de formación de teratomas. Estas células sin la capacidad de formar teratomas son útiles y seguras para aplicaciones de medicina regenerativa . Preferiblemente, las células somáticas son células somáticas de mamífero, más preferiblemente células somáticas humanas. Las células somáticas humanas se pueden obtener de un individuo saludable o de un paciente. Preferiblemente, las células somáticas son células fibroblásticas , adipocitos o queratinocitos , más preferiblemente células fibroblásticas . Las células fibroblásticas, adipocitos o queratinocitos se pueden derivar fácilmente y de manera segura de un paciente o un individuo saludable, por ejemplo por medio de métodos no invasivos tal como una biopsia de piel o de cabello arrancado. El método de esta invención permite convertir células somáticas tales como células fibroblásticas , adipocitos o queratinocitos de individuos saludables o enfermos directamente a células madre neurales. Estas células madre neurales específicas de individuos saludables o pacientes se pueden expander indefinidamente. El cultivo es fácil y bien caracterizado. Es posible congelar y descongelar de manera reproducible alícuotas de células madre neurales específicas de individuos saludables y pacientes. En particular, las células madre neurales derivadas de pacientes representan un modelo in vi tro relevante para la enfermedad para estudiar la patofisiología de enfermedades del CNS. La conversión de células somáticas específicas de pacientes directamente a células madre neurales representa una tecnología fácil, accesible y reproducible para generar BioBancos de células madre neurales específicas de pacientes. Estos BioBancos tienen gran relevancia para enfermedades relacionadas con el CNS, ya que se ha descrito una patología clara en por lo menos uno de los tres tipos de células generadas a partir de las células madre neurales: neuronas, oligodentrocitos y astrocitos . Por lo tanto las células madre neurales obtenidas con el método descrito en este documento son modelos de enfermedad valiosos para seleccionar fármacos efectivos y seguros.
Una variedad de enfermedades neurodegenerativas se caracteriza por pérdida de células neurales. La capacidad regenerativa del cerebro adulto es bastante limitada en respuesta a una lesión cerebral y una enfermedad neurodegenerativa. Además, las intervenciones farmacológicas se vuelven frecuentemente cada vez menos efectivas ya que las poblaciones neuronales susceptibles se pierden progresivamente. Las células madre neurales obtenidas con el método descrito en este documento también se pueden utilizar en la medicina regenerativa para tratar enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, Esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés/Enfermedad de Lou Gehrig) o lesión de la médula espinal. Con el método innovador descrito en este documento ahora es posible proporcionar suficientes cantidades de células precursoras, neuronales para el uso en terapias de trasplante de células. Las células madre neurales se pueden obtener ya sea de células somáticas aisladas de un individuo saludable o de un paciente. Las células madre neurales específicas de pacientes obtenidas por medio del método descrito en este documento son una nueva fuente donadora atractiva para las terapias de trasplante de células autólogas, lo que anula de ese modo cualquier rechazo inmune debido a una incompatibilidad inmunológica entre el paciente y el donador. Esta estrategia eliminaría el requerimiento de inmunosupresores en la terapia de trasplante de células. Por otra parte, la creación de Biobancos de células madre neurales derivadas de individuos saludables con varios alelos homocigotos HLA se puede utilizar como bancos donadores para el tratamiento de individuos necesitados. El trasplante heterólogo de células madre neurales con un tipo HLA compatible reduce el riesgo de respuestas inmunes indeseables lo cual podría conducir al rechazo de las células trasplantadas .
Para lograr el avance inventivo descrito en este documento, fue necesario pasar por alto algunas de las limitaciones existentes de reprogramación, así como también combinar la transducción de genes con el empleo de un paso que consiste en la inducción con un medio específico.
En este documento se proporciona un método para convertir células somáticas a Células Madre Neurales (NSC, por sus siglas en inglés) , el método comprende los pasos que consisten en: a) proporcionar células somáticas b) reprogramar las células somáticas a células madre neurales mediante la introducción de por lo menos dos genes y c) inducir la reprogramación con factores de crecimiento y una molécula pequeña; En una modalidad adicional, el método comprende adicionalmente d) incubar el producto de los pasos b) y e) bajo condiciones adecuadas para la proliferación de las células madre neurales . Típicamente, el producto de los pasos b) y e) se puede identificar fácilmente en un cultivo de células como neuroesferas . Preferiblemente, las condiciones adecuadas para la proliferación de células madre neurales comprenden la recolección de las neuroesferas y la expansión de las mismas en un medio químicamente definido. Preferiblemente, el medio es un medio de expansión y las neuroesferas se cultivan en condiciones de cultivo no adherentes . Los ejemplos no limitantes de medios de expansión se describen adicionalmente más adelante.
El término "célula somática" , utilizado en este documento se refiere a cualquier célula que forma el cuerpo de un organismo que no es una célula de línea germinal (por ejemplo esperma y óvulo, las células de las cuales están hechos (gametocitos) ) y células madre no diferenciadas. Los órganos internos, piel, huesos, sangre y tejido conectivo todos están constituidos de células somáticas. Las células somáticas preferidas que se utilizan en el método descrito en este documento son células fibroblásticas , adipocitos o queratinocitos y se obtienen preferiblemente de una biopsia de piel.
Preferiblemente, las células somáticas utilizadas para la conversión en células madre neurales son de origen mamífero, más preferiblemente de origen humano. Las células somáticas humanas se pueden obtener de un individuo saludable o de un paciente. Preferiblemente las células somáticas se seleccionan del grupo de células fibroblásticas , adipocitos o queratinocitos . Estas células donadoras se pueden obtener fácilmente de cualquier fuente adecuada. En este documento se prefieren fuentes que permiten el aislamiento de células donadoras sin procedimientos invasivos en el cuerpo humano. Los métodos para aislar células fibroblásticas son bien conocidos en el campo. Las células fibroblásticas se pueden obtener de cualquier fuente adecuada, por ejemplo de varios tejidos de órganos o tejido de piel. Los fibroblastos preferidos son fibroblastos de pulmón, fibroblastos de prepucio y fibroblastos dérmicos de adulto. En una modalidad especial de esta invención, los fibroblastos humanos se obtienen de un paciente, por ejemplo por medio de una biopsia de piel (por ejemplo Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. George Q. Daley y colaboradores Nature 2008; A method for the isolation and serial propagation of keratinocytes , endothelial cells, and fibroblasts from a single punch biopsy of human skin, Normand y colaboradores In vitro Cellular & Developmental Biology -Animal, 1995) . Los adipocitos y los queratinocitos también se puede derivar fácilmente por medio de una biopsia de piel o cabello arrancado (Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells, Belmonte y colaboradores Nature Protocols 2010) y también son células donadoras preferidas para el método de esta invención.
Un aspecto preferido de la presente invención es un método para generar células madre neurales específicas de pacientes. Otro aspecto de la presente invención es un método para generar células madre neurales a partir de células somáticas obtenidas de individuo saludable.
Como se utiliza en este documento, las "células madre neurales" se refieren a un subconjunto de células pluripotentes las cuales expresan algunos marcadores neurales que incluyen, por ejemplo, nestina. Las células madre neurales obtenidas por medio del método descrito en este documento también son referidas como "irNSCs" : células madre, neurales, reprogramadas , inducidas. Las células madre neurales se pueden expandir indefinidamente y se pueden diferenciar en neuronas o células gliales (por ejemplo astrocitos y oligodendrocitos) . El término "células madre neurales específicas de pacientes" se refiere a células madre neurales obtenidas de células somáticas de un paciente y también son referidas como células madre, neurales, autólogas. Las "células madre neurales obtenidas de un individuo saludable" como se utiliza en este documento se refieren a células madre neurales obtenidas de células somáticas de un individuo que no se sospecha que sufra de algún trastorno o enfermedad.
Como se utiliza en este documento, el término "reprogramar" se refiere a uno o más pasos necesarios para convertir una célula somática a una célula menos diferenciada, por ejemplo para convertir células fibroblásticas , adipocitos o queratinocitos en células madre neurales . La reprogramación de una célula somática a una célula madre neural se logra al introducir por lo menos dos genes involucrados en el mantenimiento de las propiedades de células madre neurales. Los genes adecuados para la reprogramación de células somáticas a células madre neurales incluyen, pero no están limitados a Sox2 (Sec ID No. 1) , Brn2 (Sec ID No. 2), Bmil (Sec ID No. 3), Mashl (Sec ID No. 4), Soxll (Sec ID No. 5), NCam (Sec ID No. 6), Kpnal (Sec ID No.7), Foxgl (Sec ID No. 8), Emx2 (Sec ID No.9) y Pax6 (Sec ID No. 10) . En una modalidad preferida se introducen por lo menos dos genes, en otra modalidad preferida se introducen tres genes. Una combinación preferida de genes para ser introducida en las células somáticas comprende Bmil y Sox2. En una modalidad adicionalmente preferida, esta combinación de por lo menos dos genes comprende adicionalmente Mashl. En otra modalidad, esta combinación de por lo menos dos genes comprende adicionalmente un gen seleccionado del grupo de Mashl, Emx2, Foxgl, Pax6 y Soxll. En una modalidad adicional, la combinación de por lo menos dos genes comprende Bmil y Sox2 y Mashl.
El término "introducción de genes", utilizado en este documento, se refiere a cualquier método que conduzca a la expresión estable del gen en una célula somática. Los genes se introducen en células somáticas por medio de métodos conocidos en el campo, ya sea mediante el suministro en la célula por vía de vectores de reprogramación o mediante la activación de los genes por vía de moléculas pequeñas . Los ejemplos de vectores de reprogramación son retrovirus, lentivirus, adenovirus, plásmidos y transposones. En este documento se prefiere el uso de un lentivirus para el suministro de los genes. Los ejemplos de moléculas pequeñas adecuadas para la activación consistente de los genes son inhibidores de la metilación de ADN, inhibidores de histona desacitelasa, ergolinas (por ejemplo etilaminda de ácido lisérgico) , flavonas (por ejemplo 7 ' -hidroxiflavona) , paullonas (por ejemplo Kenpaullona) (Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4 PNAS 2009 106 (22) 8912-8917) , agonistas del canal tipo L (por ejemplo BIX01294), BayK8644 y 5' azacitidina (Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds Yan Shi y colaboradores. Cell Stem Cell -6 de Noviembre de 2008 (Volumen 3, Fascículo 5, páginas 568-574)} . Para una inducción exitosa de la reprogramación, las células somáticas se desarrollan en un medio adecuado complementado con factores de crecimiento y una molécula pequeña. Como se utiliza en este documento, el término "factor de crecimiento" significa un polipéptido biológicamente activo el cual causa la proliferación de células e incluye tanto factores de crecimiento como sus análogos. Estos incluyen, sin limitación, el factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento transformantes, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos y factor de angiogénesis ácidos y básicos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento insulínicos y similares a la insulina que incluyen somatomedinas , factores de crecimiento derivados de virus de mixoma y vaccinia. Los factores de crecimiento preferidos que se utilizan en este documento son BDNF (siglas en inglés para factor neutrotrófico derivado del cerebro) , FGF2 (siglas en inglés para factor de crecimiento de fibroblastos 2) y EGF (factor de crecimiento epidérmico) . Los factores de crecimiento se pueden utilizar solos o en una combinación por pares o más preferiblemente los tres factores se utilizan juntos. Además, los fibroblastos se cultivan en presencia de por lo menos una molécula pequeña. El término "molécula pequeña" o "compuesto pequeño" , utilizado en este documento, se refiere a moléculas orgánicas o inorgánicas ya sea sintetizadas o encontradas en la naturaleza, que tienen generalmente un peso molecular menor que 10,000 gramos por mol, opcionalmente menos de 5,000 gramos por mol y opcionalmente menos de 2,000 gramos por mol. En una modalidad preferida, la molécula pequeña comprende un inhibidor de la familia de proteína serina/treonina cinasas que forma una doble hélice asociada con Rho (ROCK) de proteína cinasas. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de ROCK comprenden Fasudilo (1- (5-Isoquinolinsulfonil) homopiperazina) , Tiazovivina (N-Benoil-2- (pirimidin-4-ilamino) tiazol-4-carboxamida) , Y27632 (diclorhidrato de (+) - {R) - trans-4- (1-aminoetil) -N- (4-piridil) ciclohexanocarboxamida) y compuesto 324 similar a Balanol (N-{ (3R,4R) -4- [4- (2- Fluoro- 6 -hidroxi - 3 -metoxi-benzoil) -benzoilamino] -azepan-3 -il } -4-hidroxi-3 , 5-dimetil-benzamida) . En otra modalidad, la molécula pequeña se selecciona de un inhibidor de una o más de las cinasas AMPK (proteína cinasa activada con AMP, subunidad no catalítica beta 1; símbolo oficial: PRKAB1) , CHK2 (homólogo de punto de control CHK2 (S. pombe) , símbolo oficial: CHEK2 ) , MSK1 (proteína ribosómica S6 cinasa, 90kDa, polipéptido 5; símbolo oficial: RPS6KA5) , PKA (proteína cinasa, dependiente de cAMP, catalítica, alfa; símbolo oficial: PRKACA) , PKGa (proteína cinasa, dependiente de cGMP, tipo I; símbolo oficial: PRKG1) y SGK1 (cinasa 1 regulada con suero/glucocorticoides , símbolo oficial: SGKl) .
Un "medio adecuado para la inducción de la reprogramación" , también descrito como "medio de inducción" , utilizado en este documento, se refiere a cualquier medio químicamente definido que sea útil para la inducción de la reprogramación de las células somáticas. En este documento se prefiere un medio sin suero complementado con insulina, transferrina y progesterona . Los medios preferidos que se utilizan en este documento contienen 10-50 µg/ml de insulina, 10-100 µg/ml de transferrina y progesterona 10-50 nM. Los ejemplos de medios sin suero que son adecuados para la inducción de la reprogramación son el medio N2B27 (el N2B27 es una mezcla 1:1 de DME /F12 (Gibco, Paisley, Reino Unido) complementado con N2 y B27 (ambos de Gibco) ) , el medio N3 (compuesto de DMEM/F12 (Gibco, Paisley, Reino Unido) , 25 µg/ml de insulina, 50 µg/ml de transferrina, selenita sódica 30 nM, progesterona 20 nM (Sigma) , putrescina 100 nM (Sigma) ) o un medio de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Stemcell Technologies) . En este documento es más preferido un medio sin suero como se describiera anteriormente el cual es complementado adicionalmente con FGF2 , EGF, BDNF y un inhibidor de ROCK. Preferiblemente, el inhibidor de ROCK comprende Fasudil o el compuesto 324 similar a Balanol. En una modalidad preferida, el medio es complementado con 10-50 ng/ml de FGF2 , 10-50 ng/ml de EGF, 1-20 ng/ml de BDNF y Fasudil 1-50 µ? o el compuesto 324 similar a Balanol 1-10 µ?. Después de la introducción de por lo menos dos genes, las células somáticas a ser reprogramadas se desarrollan preferiblemente en el medio de inducción durante por lo menos 1 día, preferiblemente durante 1 a 7 días, más preferiblemente durante 2 a 3 días .
En una modalidad, las células somáticas del paso a) se tratan previamente con un inhibidor de Histona Desacetilasa (HDAC) . "Tratar previamente" o "tratamiento previo" como se utiliza en este documento significa la incubación de células somáticas en un medio adecuado complementado con el inhibidor de HDAC durante 4 a 60 horas, preferiblemente 48 horas. Los inhibidores de HDAC útiles en este documento se seleccionan del grupo que comprende butirato de sodio (sal sódica de ácido butanóico) , Trichostatina A (TSA, 7- [4- (dimetilamino) fenil] -N-hidroxi-4, 6-dimetil-7-oxohepta-2,4-dienamida) y Acido Valproico (ácido 2 -propil-pentanóico) . En una modalidad, las células somáticas del paso a) se tratan previamente con Acido Valproico. En otra modalidad, las células somáticas del paso a) se tratan previamente con Acido Valproico durante 48 horas .
Para propagar la proliferación de células madre neurales como cultivos de neuroesferas , las células madre neurales, inducidas se desarrollan en un medio de expansión que comprende un medio sin suero complementado con insulina, transferrina y progesterona y factores de crecimiento como se describiera anteriormente. Preferiblemente, los factores de crecimiento comprenden FGF2 , BDNF y EGF. En otra modalidad, el medio de expansión comprende adicionalmente uno o más complementos seleccionados del grupo de Heparina, Acido Ascórbico, SHH (Sonic Hedgehog Humano Recombinante) , FGF8 (Isoforma FGF8a Humana Recombinante) , DLL4 (DLL4 Humana Recombinante) , Jaggedl (Quimera Jagged 1 Fe Humana Recombinante), Fasudil y el compuesto 324 similar a Balanol .
En otra modalidad de la invención, las células madre neurales que se obtienen por medio del método descrito en este documento son estimuladas en un siguiente paso para la diferenciación mediante la omisión de por lo menos uno de los factores de crecimiento del medio de reprogramación. Preferiblemente, los factores de crecimiento a ser retirados comprenden EGF y FGF .
En otra modalidad preferida de la invención, se emplea un gen marcador para facilitar la selección y cuantificación de células madre, neurales, reprogramadas exitosamente. Por ejemplo, un gen que codifica una proteína marcadora fluorescente se introduce en las células somáticas objetivo por medio de la transducción de lentivirus. Los ejemplos de proteínas marcadoras fluorescentes son GFP, YFP, EGFP o DsRed. Preferiblemente, el gen marcador se une de manera operable a un promotor de nestina. La nestina es expresada específicamente en células madre neurales, por lo tanto el gen marcador bajo control de un promotor de nestina permite la selección e identificación rápida de las células madre, neurales, reprogramadas , inducidas. Después, esas células se seleccionan para identificar una célula que exhibe el fenotipo deseado, es decir neuroesferas . Las neuroesferas más grandes que 20 µt?, preferiblemente más grandes que 50 µp?, se seleccionan y se recolectan para la expansión adicional.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una población de células madre neurales producidas por medio de cualquiera de los métodos anteriores. Preferiblemente, la población de células madre neurales es específica de paciente, es decir se deriva de células somáticas obtenidas de individuos enfermos. En otra modalidad, la población de células madre se obtiene de un individuo saludable. Las células madre neurales se pueden expandir indefinidamente. El cultivo es fácil y bien caracterizado. Es posible congelar y descongelar de manera reproducible alícuotas de células madre neurales . Las células madre neurales derivadas de pacientes representan un modelo in vi tro relevante para la enfermedad para estudiar la patofisiología de enfermedades del CNS. La conversión de células somáticas específicas de pacientes directamente a células madre neurales representa una tecnología fácil, accesible y reproducible para generar BioBancos de células madre neurales específicas de pacientes. Por lo tanto, en un aspecto preferido adicionalmente de la invención, se contempla un BioBanco que comprende células madre neurales específicas de pacientes. En otra modalidad, se genera un BioBanco que comprende diferentes poblaciones de células madre neurales obtenidas de individuos saludables. El término "BioBanco" utilizado en este documento significa una colección de muestras biológicas tomadas de diferentes individuos o especies. La colección lograda de especímenes y datos asociados se propone para propósitos de investigación con el objetivo de tratar enfermedades neurales como enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, Esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés/Enfermedad de Lou Gehrig) , apoplejía y lesión de la médula espinal o para la terapia de las enfermedades neurológicas .
Otro aspecto de la invención es el uso de células madre neurales obtenidas por medio de este método. En una modalidad preferida, las células madre neurales obtenidas por medio de este método se utilizan como un modelo in vitro para estudiar la patofisiología de enfermedades del CNS . Por ejemplo, las células madre neurales obtenidas por medio del método de la invención se pueden utilizar para seleccionar compuestos que invierten, inhiben o previenen enfermedades neurológicas. Además, se pueden utilizar para seleccionar compuestos que invierten, inhiben o previenen efectos colaterales neurales de medicamentos, por ejemplo medicamentos para la diabetes. Preferiblemente, las células madre neurales obtenidas por medio del método de la invención descrito en este documento se derivan de sujetos enfermos.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición terapéutica que contiene células producidas por medio de cualquiera de los métodos anteriores o que contiene cualquiera de las poblaciones de células anteriores. Preferiblemente, las composiciones terapéuticas comprenden además una solución fisiológicamente compatible que incluye, por ejemplo, fluido cerebroespinal artificial o solución salina amortiguada con fosfato. La composición terapéutica se puede utilizar para tratar, prevenir o estabilizar una enfermedad neurológica tal como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington o ALS, enfermedades relacionadas con el almacenamiento lisosómico, esclerosis múltiple o lesión de la médula espinal. Por ejemplo, las células fibroblásticas , queratinocitos o adipocitos se pueden obtener por medio de una biopsia de piel del individuo necesitado de tratamiento o de un individuo saludable y se pueden reprogramar a células madre neurales por medio del método de la invención. En una modalidad de la invención, las células madre neurales se recolectan y se introducen en el individuo para tratar la condición. En otra modalidad, las células madre neurales se cultivan bajo condiciones adecuadas para la diferenciación en neuronas, oligodendrocitos o astrocitos antes de la introducción en el individuo y se pueden utilizar para reemplazar o ayudar a la función normal de tejido enfermo o dañado. La gran ventaja de la presente invención es que proporciona un suministro esencialmente ilimitado de células neurales, humanas específicas de pacientes o células madre, neurales, compatibles de individuos saludables con el mismo tipo de HLA adecuadas para el trasplante. El uso de células autólogas y/o compatibles en una terapia de células ofrece una mayor ventaja sobre el uso de células no autólogas, las cuales es probable que sean sometidas a un rechazo inmunológico . En contraste, es improbable que las células autólogas produzcan respuestas inmunológicas significativas.
Otra modalidad de la invención es el uso de biobancos de células madre neurales para la terapia de enfermedades neurológicas . Los biobancos comprenden preferiblemente células madre neurales obtenidas de pacientes o individuos saludables con varios tipos de HLA. El trasplante de células obtenidas de un donador saludable a un individuo necesitado de tratamiento con un tipo compatible de HLA elimina el problema significativo de reacciones de rechazo asociadas normalmente con trasplantes de células heterólogas . Convencionalmente, el rechazo se impide o se reduce mediante la administración de inmunosupresores o fármacos anti-rechazo tal como ciclosporina . Sin embargo, estos fármacos tienen efectos colaterales, adversos, significativos, por ejemplo inmunosupresión, propiedades carcinogénicas , toxicidad renal así como también son muy costosos. La presente invención debe eliminar, o por lo menos reducir en gran medida, la necesidad de fármacos anti-rechazo, tal como ciclosporina, imulan, FK-506, glucocorticoides y rapamicina, y derivados de los mismos.
Con respecto a los métodos terapéuticos de la invención, no se pretende que la administración de células madre neurales a un mamífero sea limitada a un modo particular de administración, dosificación o frecuencia de dosis; la presente invención contempla todos los modos de administración, que incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarticular, intralesional , subcutánea o cualquier otra ruta suficiente para proporcionar una dosis adecuada para prevenir o tratar una enfermedad. Las células madre neurales se pueden administrar al mamífero en una dosis individual o múltiples dosis. Cuando se administran múltiples dosis, las dosis pueden ser separadas unas de otras por, por ejemplo, una semana, un mes, un año o diez años. Uno o más factores de crecimiento, hormonas, interleucinas , citocinas, moléculas pequeñas u otras células también se pueden administrar antes, durante o después de la administración de las células para predisponerlas adicionalmente hacia un tipo particular de células.
Figura 1: Representación esquemática del método para convertir fibroblastos humanos a irNSCs. Día 0: los fibroblastos humanos se trataron con tripsina y se transíectaron en un volumen pequeño con una combinación de genes y el gen reportero GFP específico para nestina utilizando el medio de inducción (N2B27 con FGF, 30 ng/ml de EGF; 20 ng/ml de BDNF Fasudil 10 µ?, 4 µg/ml de Polibreno) . Los fibroblastos se colocaron en una placa de cultivo de tejido normal en una concentración de 10000 - 30000 células/cm2. Día 1: cambio de medios por medio de inducción nuevo. Las irNSCs GFP/nestina positivas (GFP+) comenzaron a aparecer con una frecuencia muy baja (~50 irNSC GFP+ de 100,000). Día 2: las irNSCs GFP+ se incrementaron en número y comenzaron a moverse juntas formando agrupaciones de células. Día 3: las agrupaciones de células se organizan en una estructura esferoide, clara que se levanta y comienza a flotar como neuroesferas GFP+ . Las neuroesferas más grandes que 20 µp? se contaron y se recolectaron para la expansión adicional .
Figura 2: Representación esquemática del lentivirus que contenía el gen reportero GFP específico para nestina humana. La proteína fluorescente copGFP y el marcador seleccionable zeocina se clonaron bajo el control de expresión de un fragmento potenciador de 1.8 kb del intrón 2 de nestina humana unido a promotor mínimo de CMV.
Figura 3 : irNSCs en el día 1 del método de inducción de reprogramación. Panel superior: fibroblastos de pulmón fetal no transformados, humanos IMR90 (contraste de fase) . Panel inferior: generación de células irNSC GFP+ (contraste de fase y canal de GFP) .
Figura 4: irNSCs en el día 2 del método de inducción de reprogramación. Las células tienden a emigrar estrechamente juntas y comienzan a formar una estructura esferoide con un núcleo de irNSCs GFP+ (contraste de fase y canal de GFP) .
Figura 5: irNSCs en el día 3 del método de inducción de reprogramación. Las estructuras esferoides formadas en el día 2 ahora completamente maduras aparecen como neuroesferas que flotan en el medio. Las neuroesferas tienen una dimensión que varía de 20 - 100 µp? de diámetro con una alta densidad de células. Las irNSCs son etiquetadas por la expresión de GFP específico para nestina y se pueden identificar en casi todas las neuroesferas, aunque no todas las neuroesferas tienen la misma proporción de irNSC GFP+ (contraste de fase y canal de GFP) .
Figura 6: Número de neuroesferas generadas con diferentes combinaciones de genes (cuyo título es "Generación de irNSCs" ) .
Figura 7: Neuroesferas unidas después de la transducción con Sox2 - Bmil. Las neuroesferas unidas muestran una morfología característica de las células bipolares alargadas. Panel inferior: magnificación más alta de neuroesferas de irNSC GFP+.
Figura 8: Células diferenciadas después de 1 semana de retiro de EGF y FGF. Las irNSCs con el retiro de los factores de crecimiento proliferativos dan origen a células con protuberancias muy delgadas teñidas positivas para el marcador neuronal tuj 1.
Figuras 9A-9B: Generación de un lote de neuroesferas de irNSC para la expansión y caracterización. 3.6 millones de fibroblastos humanos IMR90 se trataron con tripsina y se infectaron en un volumen pequeño con: Sox2 , Bmil, gen reportero GFP específico para nestina utilizando el medio de inducción (N2B27 con FGF, 30 ng/ml de EGF, 20 ng/ml de BDNF) complementado con Fasudil 10 µ? y 4 g/ml de Polibreno. Desde el Día 4 hasta el Día 8: las neuroesferas GFP+ más grandes que 50 µ?? se recolectaron y se utilizaron además para la expansión. La mitad de las neuroesferas había sido expandida utilizando el medio de expansión (N2B27 con FGF, 30 ng/ml de EGF, 20 ng/ml de BDNF) con Fasudil y la otra mitad sin Fasudil. Día 15: las neuroesferas desarrolladas en el medio de expansión con Fasudil tienen una mejor morfología y bordes claros y definidos (una característica distintiva de neuroesferas bien formadas, Figura 9B) ,- sin Fasudil las neuroesferas tienen bordes poco claros (Figura 9A) .
Figuras 10A-10B: Caracterización por inmunocitoquímica de neuroesferas de irNSC para la expresión de los marcadores de NSCs Sox2 y Nestina. Las neuroesferas de irNSC del Día 15 expandidas con Fasudil han sido colocadas en placas revestidas con PO/Lam y después de 48 horas se han teñido para la expresión de Sox2 y Nestina. Las neuroesferas de irNSC se unieron y las irNSCs se dispersaron de las esferas. Las irNSCs tienen una morfología típica de NSC y fueron positivas para Sox2 y Nestina. Figura 10A: Agrupación y canales individuales DAPI, Sox2 , Nestina; magnificación de 20x; Figura 10B: Canales de agrupación DAPI, Sox2, Nestina; magnificación de lOx.
Figura 11: Comparación de estimulación con Fasudil contra el compuesto 324 similar a Balanol para generar neuroesferas de irNSC. Los fibroblastos humanos IMR90 se trataron con tripsina y se infectaron en un volumen pequeño con: Sox2, Bmil, gen reportero GFP específico para nestina utilizando el medio de inducción (Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina; 4 µg/ml de Polibreno) complementado con Fasudil 10 µ? (gráfica rayada) o el compuesto 324 similar a Balanol 2 µ? (gráfica negra) . Los fibroblastos se colocaron en una placa de cultivo de tejido normal en una concentración de 10000 - 30000 células/cm2. Día 1: Cambio de medios por un medio de inducción nuevo. Día 4: Las neuroesferas GFP+ más grandes que 50 µp? se contaron. El compuesto pequeño 324 similar a Balanol incrementó la eficiencia de la generación de neuroesferas aproximadamente al doble (1.9) y tiene una mejor capacidad de reproducción (STDEV, n=3) .
Figuras 12A-12C: El tratamiento previo de fibroblastos humanos con Acido Valpróico (VPA, por sus siglas en inglés) mejora el rendimiento de neuroesferas de irNSC GFP+. Los fibroblastos humanos IMR90 se trataron previamente durante 48 horas con o sin el inhibidor de HDAC Acido Valpróico (sal monosódica de ácido 2 -propil-pentanóico) (1 mM) antes de la infección con: Sox2 , Bmil, gen reportero GFP específico para nestina. El medio de inducción (Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina; compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?) . Día 7: Las neuroesferas más grandes que 50 µp? se contaron (Figura 12A) y el número promedio de irNSC GFP+ por neuroesfera se reporta (Figura 12B) . Imágenes representativas para las neuroesferas de irNSCs generadas con el tratamiento previo con VPA (Figura 12C) . El tratamiento previo con VPA no afectó significativamente el número de neuroesferas en el día 7; aunque el tratamiento con VPA incrementó (2.1 veces) el número de irNSCs GFP+ (STDEV, n=3) .
Figura 13: Definición de una reserva mínima de genes en combinación con Sox2 y Bmil para la inducción eficiente de neuroesferas de irNSCs. Los fibroblastos humanos IMR90 se trataron previamente durante 48 horas con VPA (1 mM) antes de la infección con: Sox2, Bmil, gen reportero GFP específico para nestina más diferentes genes candidatos para tratar su sinergismo. Medio de inducción: Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 g/ml de Heparina y compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?. Cuantificación en el Día 7 de neuroesferas de irNSCs más grandes que 50 µp?. Los genes Mashl, Emx2, Foxgl, Pax6 y Soxll actúan en sinergia con Bmil y Sox2 para generar neuroesferas de irNSC.
Figura 14: Generación de neuroesferas de irNSC a partir de fibroblastos dérmicos de humano adulto (HDFa, por sus siglas en inglés) . Los fibroblastos dérmicos de humano adulto son proporcionados por GIBCO (Número de Catálogo: C-013-5C). Los fibroblastos dérmicos de humano adulto se trataron con tripsina y se infectaron en un pequeño volumen con: Sox2, Bmil, gen reportero de GFP específico para nestina utilizando el medio de inducción (Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina) complementado con Fasudil 10 µ?. Día 8: las neuroesferas de irNSCs se detectan (imágenes representativas magnificación de 2.5 y 10X) .
Figuras 15A-15C: Expansión de neuroesferas de irNSC utilizando una combinación de Acido Ascórbico, Sonic Hedgehog (Shh) , Jaggedl, DLL4 y FGF8 para obtener un cultivo monocapa de irNSCs GFP+. Los fibroblastos humanos IMR90 se infectaron con: Sox2, Bmil, Mashl y gen reportero GFP específico para nestina utilizando el medio de inducción (Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina; compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?. Día 7: las neuroesferas más grandes que 50 µt? se recolectaron y se expandieron adicionalmente con el medio de expansión (Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina; compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?; Acido Ascórbico 0.2 m , 500 ng/ml de SHH (Sonic Hedgehog Humano Recombinante , Número de Catálogo: 1845SH) , 100 ng/ml de FGF8 (Isoforma FGF8a Humana Recombinante, Número de Catálogo: 4745F8), 500 ng/ml de DLL4 (DLL4 Humano Recombinante, Número de catálogo: 1506D4), 500 ng/ml de Jaggedl (Quimera de Jagged 1 Fe Humana Recombinante, Número de Catálogo: 1277JG) , medios acondicionados 1/10 de NSCs derivadas de hESC cultivadas durante dos días en el Kit de Proliferación NeuroCult NS-AM (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina. Imágenes representativas para las neuroesferas de irNSCs en el día 14 expandidas con el medio de expansión reportado anteriormente (Figura 15A) . Las neuroesferas tienen bordes definidos y es posible observar las protuberancias de espinas de las neuroesferas (Figura 15B, acercamiento) . En el día 21, las neuroesferas de irNSC expandidas se disociaron y se colocaron en placas revestidas con PO/Lam para obtener un cultivo monocapa, homogéneo de irNSCs GFP+ (Figura 15C, contraste de fase y canal de GFP de la monocapa de irNSCs después de 4 días de cultivo en la monocapa) .
Figuras 16A-16B: Caracterización por inmunocitoquímica de neuroesferas de irNSC para la expresión de los marcadores de NSC Nestina y el marcador neuronal prematuro Tujl. Día 21, las neuroesferas de irNSC generadas como se describiera en la Figura 15 se disociaron y se colocaron en condiciones autorrenovables de NSC ( it de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 µg/ml de Heparina) para someter a prueba la expresión del marcador Nestina (Figura 16A después de 48 horas, todas las células fueron Nestina+ y Tujl-) y se colocaron en condiciones de diferenciación (Kit de diferenciación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de BDNF) y se tiñeron para Tujl y Nestina en el día 7 (Figura 16B, todas las células son Tujl+ y algunas células son Nestina+) .
Ejemplos El método se puede ilustrar por referencia a la Figura 1 en este documento, la cual ilustra un método de acuerdo con la invención que se utiliza para convertir fibroblastos humanos en células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) . En este método, los fibroblastos humanos se trataron con tripsina en el día 0, se contaron y su viabilidad se determinó. Entre 1.0 x 105 - 3.0 x 105 fibroblastos tratados con tripsina luego se resuspendieron en el medio de inducción y la combinación de genes se suministró como lentivirus . Al medio de inducción se agregó polibreno (bromuro de hexadimetrina) para incrementar la eficiencia de la transducción de lentivirus. La infección se realizó durante 15 minutos en un tubo eppendorf . En combinación con los genes, se utilizó un gen reportero GFP específico para Nestina humana. La Nestina es un marcador bien conocido expresado específicamente en NSCs. En el gen reportero específico para nestina, la proteína fluorescente GFP está bajo expresión del promotor de nestina humana (Figura 2) , por lo tanto permite una selección fácil para células madre, neurales, reprogramadas , inducidas (irNSCs, por sus siglas en inglés) GFP+ .
Las células infectadas se colocaron en placas de cultivo de tejido utilizando una concentración de 10000 -30000 células/cm2 en el volumen apropiado de medio de inducción. En el día 1, el medio de inducción total se renovó. Fue posible identificar algunas irNSC GFP+ (Figura 3) con un claro cambio en la morfología en comparación con los fibroblastos humanos. Las irNSCs GFP+ adquirieron una morfología bipolar y alargada con un citoplasma más condensado, típico de las NSCs . Por otra parte, las irNSCs se desarrollan en un cultivo monocapa, empacado que se asemeja a la interacción típica de célula a célula adquirida en los cultivos de NSC tradicionales para activar la señal pro-proliferativa de la vía de Notch. En el día 2 las irNSCs GFP+ estuvieron en un estado más maduro y comenzaron a formar agrupaciones muy empacadas de células. Estas agrupaciones de irNSCs comenzaron a formar una estructura esferoide con un núcleo denso que contenía irNSCs GFP+ (Figura 4) . En el día 3, las estructuras esferoides se formaron completamente y comenzaron a levantarse de la placa de cultivo de tejido flotando como neuroesferas en el medio. Las neuroesferas tienen una dimensión de aproximadamente 20-100 µ?? con bordes claros y un núcleo con una alta densidad de células, donde es posible identificar las irNSCs GFP+ (Figura 5) .
Para lograr el avance inventivo, fue necesario utilizar una combinación específica de genes. La siguiente lista de genes involucrados en el mantenimiento de la propiedad de NSC in vivo e in vitro se recuperó del conocimiento bibliográfico: Sox2 (factor de transcripción Sox y marcador importante para NSC) , Brn2 (proteína de dominio POU conocida que se enlaza a proteínas Sox. Enlace reportado de Sox2 y Brn2 en el promotor de nestina. Los ratones genéticamente deficientes de Brn2 tienen un mejoramiento del desarrollo del CNS) , Bmil (Proteína involucrada en la regulación del ciclo celular, reportada que incrementa la expresión de los inhibidores p21 y p27 del complejo de ciclinaE/cdk2. La inhibición de ciclinaE/cdk2 determina la pérdida del control de proteína de retinoblastoma en el ciclo celular que da por resultado un ciclo celular rápido durante el estado auto-renovable de NSCs) , Mashl (descrito que es un regulador importante para la proliferación de precursores neurales in vivo) , Soxll (proteína Sox reportada que es expresa en SGZ in vivo) , NCam (marcador de NSC en la Citometría de Flujo y expresado en diferentes regiones del SNC) , Kpnal (mejor conocido como importina alfa5 responsable junto con la importina beta de la importación nuclear de proteínas en tejidos derivados de ectodermo) .
Todos los genes se clonaron como ADNcs en plásmidos de lentivirus y se empacaron subsecuentemente en lentivirus. Las partículas empacadas en lentivirus para Sox2 , Bmil, Mashl, Soxll, NCam, Kpnal, gen reportero GFP específico para nestina se transdujeron directamente en fibroblastos humanos. Diferentes combinaciones de genes se sometieron a prueba en el método descrito anteriormente. En el día 3, fue posible evaluar el éxito de la producción de las irNSCs al contar las neuroesferas generadas. Solo las neuroesferas más grandes que 50 µt? se tomaron en cuenta.
Como se representa en la Figura 6, la transducción de lentivirus con gen reportero para nestina sin la adición de Fasudil al medio de inducción no reprogramó los fibroblastos humanos a irNSCs. Con la adición de Fasudil al medio de inducción, se reportó la generación de neuroesferas (aproximadamente 50 µt?) y algunas más pequeñas (alrededor de 20 µ??, las cuales no se contaron) .
Las neuroesferas generadas en el método innovador utilizando la combinación de genes: Sox2 - Bmil se recolectaron en el día 3 y se expandieron durante 14 días adicionales. La expansión de las neuroesferas de irNSCs fue un paso crítico. Las neuroesferas se cultivaron utilizando el medio N2B27 complementado con FGF, EGF, BDNF en placas no adherentes, ultrabajas, especiales (Corning). Con el propósito de lograr una población homogénea de neuroesferas de irNSCs GFP+ se aplicó un procedimiento de limpieza cada 2-3 días. Durante 14 días de expansión, algunas neuroesferas con baja densidad de irNSCs GFP+ no fueron capaces de proliferar apropiadamente, más probablemente debido a una contaminación por fibroblastos no convertidos. Esta clase de neuroesferas contaminadas se deterioraron en células individuales que necesitaron ser retiradas. En el día 14, las neuroesferas se sometieron a prueba por: la unión en placas revestidas con poli-ornitina/laminina y la generación de células similares a neuronas. Para la unión, 20-40 neuroesferas/cm2 se colocaron en placas revestidas con poli-ornitina/laminina en el medio de expansión complementado solo para el primer día con Fasudil 10 µ?, con el propósito de mejorar la unión y dispersión de células. En el día 1 del cultivo fue posible mostrar la unión y dispersión de las neuroesferas (Figura 7) . Al centro de las neuroesferas dispersantes se identificaron irNSCs GFP+ con una morfología típica de NSC. Las neuroesferas se desarrollaron durante tres días adicionales y luego solo se agregó BDNF al N2B27 (condiciones de diferenciación neuronal) . Con el retiro del EGF y el FGF, las irNSCs cambiaron la morfología. Se volvieron más alargadas y comenzaron a formar protuberancias celulares similares a neuritas. En el día 7 de las condiciones de diferenciación, las células se fijaron y se tiñeron por el marcador neuronal tujl (Figura 8) .
Las neuroesferas expandidas con Fasudil tienen una mejor morfología y bordes claros y definidos (una característica distintiva de las neuroesferas bien formadas, Figura 9B) ; sin Fasudil las neuroesferas tienen bordes poco claros (Figura 9A) . Las irNSCs tienen una morfología típica de NSC y fueron Sox2 y Nestina positivas (Figuras 10A-10B) .
La Figura 11 muestra que el inhibidor de cinasa Rock compuesto 324 similar a Balanol incrementa el rendimiento de neuroesferas GFP+ .
Las evidencias muestran que el método fue capaz de convertir fibroblastos humanos a irNSCs con base en los pasos vinculados de transducción de genes (mejores combinaciones: Sox2-Bmil, Sox2-Bmil-Mashl, Sox2-Bmil-Soxll, Sox2 -Bmil-Emx2 , Sox2-Bmil-Foxgl y Sox2-Bmil-Pax6 , véase también la Figura 13) y la inducción de medios definida químicamente.
Para incrementar el rendimiento de irNSCs, los fibroblastos humanos se trataron previamente con o sin el inhibidor de HDAC Acido Valpróico (VPA, sal monosódica de ácido 2-propil-pentanóico) . Con este propósito, los fibroblastos humanos se incubaron en DMEM/F12 complementado con FBS al 10% y L-glutamina complementada con VPA 1 mM antes de la infección (Figuras 12A-12C) .
La Figura 14 muestra la generación de Neuroesferas de irNSC a partir de fibroblastos dérmicos de humano adulto (HDFa) .
Las Figuras 15A-15C muestran la expansión de Neuroesferas de irNSC utilizando una combinación de Acido Ascórbico, Sonic Hedgehog (Shh) , Jaggedl, DLL4 y FGF8. Las Figuras 16A-16B muestran la caracterización por Inmunocitoquimica de neuroesferas de irNSC para la expresión de los marcadores de NSCs Nestina y el marcador neuronal prematuro Tuj 1.
Materiales y Métodos Cultivo de Células: Medio de Inducción: N2B27 (el N2B27 es una mezcla 1:1 de D EM/F12 (Gibco, Paisley, Reino Unido) complementado con N2 y B27 (ambos de Gibco) complementado con 30 ng/ml de EGF humano (Peprotech) , 30 ng/ml de FGF2 humano (Peprotech) , 20 ng/ml de BDNF humano (Roche) y Fasudil 10 µ? (Calbiochem) o el compuesto 324 similar a Balanol 2 µ? (N- { (3R, 4R) -4- [4 -(2-fluoro-6-hidroxi-3 -metoxi-benzoil) -benzoilamino] -azepan-3-il} -4-hidroxi-3 , 5-dimetil-benzamida) .
Medio de Expansión: N2B27 complementado con 30 ng/ml de EGF humano (Peprotech) , 30 ng/ml de FGF2 humano (Peprotech) , 20 ng/ml de BDNF humano (Roche) o Kit de Proliferación NeuroCult NS-AMR (Human, StemCells Technologies) con 20 ng/ml de FGF, EGF, BDNF; 2 g/ml de Heparina; compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?; Acido ascórbico 0.2 mM, 500 ng/ml de SHH (Sonic Hedgehog Humano Recombinante, Número de Catálogo: 1845SH) , 100 ng/ml de FGF8 (Isoforma de FGF8a Humano Recombinante, Número de Catálogo: 4745F8) , 500 ng/ml de DLL4 (DLL4 Humano Recombinante, Número de Catálogo: 1506D4), 500 ng/ml de Jagged 1 (Quimera de Jagged 1 Fe Humano Recombinante, Número de Catálogo: 1277JG) .
Medio de Diferenciación: N2B27 complementado con 20 ng/ml de BDNF humano (Roche) , 2 µg/ml de Laminina (Invitrogen) .
Fibroblastos humanos: fibroblastos de pulmón fetal IMR90 (Lote de ATCC Número 580229699) o fibroblastos dérmicos de humano adulto (GIBCO, Número de Catálogo: C-013-5C) .
Lentivirus: Las partículas de lentivirus listas para el uso, preempacadas se obtuvieron de Sigma (Lentivirus de Reprogramación. StemgentMR Sox2 humano, Número de Catálogo ST070012) , Genecopeia (Partículas Lentivirales LentifectMR Bmil humano, Número de Catálogo LP-B0015-Lvl05 ; Partículas Lentivirales LentifectMR Soxll, Número de Catálogo LP-M0425-LV105; Partículas Lentivirales LentifectMR Mashl Número de Catálogo LP-Z0740-LV105 ; Partículas Lentivirales LentifectMR Kpnal humano, Número de Catálogo LP-U1286-Lvl05 Partículas Lentivirales LentifectMR NCaml, Número de Catálogo LP-Z2645-Lvl05) y SBI Systems Biosciences (Gen Reportero GFP Específico para Nestina: Virus Reportero Transcripcional-hNestina pGreenZeoMR, SR10035VA-1) .
Títulos GFP para Nestina 1.45*105/µ1, BMI1 4.3*105/µ1, Sox2 1.07*104/µ1, Soxll 3.2*106/µ1, Mashl 4.7*106/µ1, NCam 3.3*104/µ1, Kpnal 1.8*10e/µ1· Protocolos : 1. Generación de las irNSCs : - 200,000 fibroblastos humanos IMR90 infectados con los lentivirus para diferentes combinaciones de genes (multiplicidad de infección (M.O.I., por sus siglas en inglés) utilizada para cada lentivirus individual 30) y el lentivirus reportero de GFP específica para nestina (M.O.I. utilizada 10) en un tubo eppendorf con 300 µ? de medio de inducción con polibreno (bromuro de hexadimetrina, Sigma) 4 µg/ml .
Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos .
Colocar los 300 µ? en 1.7 mi de medio de inducción en un pocilio de una placa de 6 pocilios de tejido tratada Día 1, renovar los 2 mi de medio de inducción/cada pocilio Día 3, recolección de las neuroesferas recogiendo cuidadosamente los 2 mi con las esferas flotantes Expandir las neuroesferas 2. Expansión de las neuroesferas: Recolectar el medio con las neuroesferas flotantes en tubos de 15 mi de 3 pocilios de una placa de 6 pocilios Permitir que las esferas sean sembradas durante 10 minutos Retirar muy cuidadosamente el sobrenadante (las células individuales no se sembrarán y serán aspiradas con el sobrenadante) Resuspender las esferas en un volumen final de 4 mi de medio de expansión Colocar en una placa B6, placa de adherencia ultrabaja (Corning) Incubar 2-3 días Repetir el procedimiento de expansión cada 2-3 días hasta el día 14 desde la generación de irNSCs 3. Diferenciación de neuroesferas : Generación durante 14 días de las irNSCs y después del procedimiento de expansión seleccionar bajo un microscopio estereoscópico las neuroesferas redondas con bordes claros y ricas en irNSCs GFP+ Colocar 40 esferas en una placa de 24 pocilios 2 µ9/t?1 revestida previamente con poli-ornitina/laminina utilizando el medio de expansión con la adicción de Fasudil 10 µ? o el compuesto 324 similar a Balanol 2 µ?.
- El día posterior, renovar el medio de expansión sin Fasudil / compuesto 324 similar a Balanol 2 µ? .
Incubar durante tres días Retirar el medio de expansión y agregar medio de diferenciación - Renovar el medio de diferenciación después de 3 - 4 días Incubar durante 3 - 4 días Fijar las células con PFA al 4% y realizar inmunotinciones Protocolo de tinción de neuroesferas de irNSCs: las neuroesferas en el día 15 se tiñeron para la caracterización con los siguientes anticuerpos: Nestina de Ratón y Sox2 de Conejo O/N y luego el anticuerpo 488 anti-ratón secundario y el anticuerpo 555 anti-conejo durante una hora.
Anticuerpos primarios: Nestina de Ratón, monoclonal, dilución 1/500 (MAB5326 Millipore) Sox2 de Conejo, policlonal, dilución 1/500 (AB5603MI Millipore) Anticuerpos secundarios: Alexa flúor 488, IgG, dilución 1/1000 de Cabra anti-ratón (A11029 Invitrogen) Alexa flúor 555, IgG, dilución 1/1000, de Cabra anti-conejo (A21429 Invitrogen) .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para producir células madre neurales (NCS, por sus siglas en inglés), caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: a) proporcionar células somáticas, b) reprogramar las células somáticas a NSCs mediante la introducción de por lo menos dos genes seleccionados del grupo de Bmil, Sox2 , Mash 1, Soxll, Emx2 , Foxgl y Pa 6 y c) inducir la reprogramación con factores de crecimiento y una molécula pequeña.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además d) incubar el producto de los pasos b) y e) bajo condiciones adecuadas para la proliferación de las NSCs.
3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque las células somáticas del paso a) son células humanas.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células somáticas del paso a) se seleccionan del grupo de fibroblastos, queratinocitos y adipocitos.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque los factores de crecimiento y la molécula pequeña del paso c) son complementos de un medio químicamente definido.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el medio químicamente definido es un medio sin suero complementado con insulina, transferrina y progesterona .
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque por lo menos dos genes del paso b) comprenden Bmil y Sox2.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque por lo menos dos genes del paso b) comprenden adicionalmente por lo menos un gen seleccionado del grupo de Mashl, Soxll, Emx2, Foxgl y Pax6.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque por lo menos dos genes del paso b) comprenden Bmi, Sox2 y Mashl.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el factor de crecimiento del paso c) se selecciona del grupo de FGF2 , EGF y BDNF .
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la molécula pequeña del paso c) comprende un inhibidor de ROCK.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor de ROCK se selecciona del grupo de 1- ( 5 - isoquinolinsulfonilo) homopiperazina, N-bencil-2- (pirimidin-4-ilamino) tiazol-4 -carboxamida, clorhidrato de (+) - (R) - trans-4- (1-aminoetil) -N- (4-piridil) ciclo-hexancarboxamida) y N-{ (3R,4R) -4- [4- (2-fluoro-6-hidroxi-3-metoxi-benzoil) -benzoilamino] -azepan-3-il} -4-hidroxi-3 , 5-dimetil-benzamida.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque las células somáticas son tratadas previamente con un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC) .
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la reprogramación de las células somáticas se logra a través del suministro de una combinación de por lo menos dos genes por un lentivirus .
15. Las células madre neurales, caracterizadas porque se obtienen por medio de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. El uso de las células madre neurales de conformidad con la reivindicación 15, como un modelo in vitro para las enfermedades del CNS .
17. Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende las células madre neurales de conformidad con la reivindicación 15.
18. La composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque las células madre neurales se diferencian en neuronas o células gliales.
19. Un biobanco de NSCs, caracterizado porque se obtiene por medio de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 .
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