CN108884444A - 使神经分化能力增强的神经干细胞用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基本不含选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的一种以上氨基酸的神经干细胞和/或神经祖细胞培养基、以及使用该培养基的神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法等。
Description
技术领域
本发明涉及神经干细胞和/或神经祖细胞的培养基和培养方法。更详细而言,本发明涉及增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的培养基、和使用该培养基增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的方法等。
背景技术
作为治疗肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病等难治疗性神经疾病、神经损伤的方法之一,近年来,对于开发将神经细胞、神经干细胞向活体移植的方法寄予厚望。神经干细胞是具有自我复制能力、具有多潜能性(multipotency)的未分化的细胞,是具有产生神经***的多种细胞(神经细胞和神经祖细胞(neural progenitor)、以及胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)和胶质前体细胞等)能力的细胞。神经干细胞和神经祖细胞除了对其本身进行移植以外,还能够供应神经细胞等通常在成体中难以增殖的细胞,因此作为再生医疗中的活体材料提供源受到瞩目。
神经干细胞具有增殖能力和多潜能性,因此认为如果移植至活体,则能够在活体内产生功能性的神经系细胞,但另一方面,存在因移植具有增殖能力的神经干细胞而肿瘤化的担忧。因此,正在研究将预先在体外由神经干细胞分化的神经祖细胞用于再生医疗,但这种情况下也存在制作的神经祖细胞中混入、残留有具有增殖能力的细胞的风险。为了避免增殖性的细胞混入到移植后的神经系细胞中而形成肿瘤,重要的是尽量不含增殖性的细胞。进行利用非增殖性的神经细胞的治疗的情况下,能够由神经干细胞高效分化为神经细胞是重要的。因此,由神经干细胞高效产生神经系细胞的方法的开发、减少获得的分化后的神经系细胞中所含的增殖性的细胞的神经系细胞的制备方法的开发成了重要的课题。
而关于不含谷氨酰胺的培养基,迄今为止已有一些报告。
非专利文献1中记载了,将作为血细胞系细胞的人红白血病细胞株K562细胞用不含谷氨酰胺的培养基培养时,向红细胞的分化得到促进。
此外,非专利文献2中记载了,如果将作为大鼠的胶质瘤细胞的C6胶质瘤细胞用不含谷氨酰胺的培养基培养,则向少突胶质细胞样细胞的分化得到促进。
然而,关于不含包括谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬酰胺酸的1种以上氨基酸的培养基对神经干细胞和/或神经祖细胞的分化能力、神经细胞产生能力产生什么样的影响是完全不清楚的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Canh Hiep N等,“Depletion of glutamine enhances sodiumbutyrate-induced erythroid differentiation of K562 cells.”The Journal ofBiochemistry.2012年12月;152(6):509-519.
非专利文献2:Martin M等,“Energetic and morphological plasticity ofC6glioma cells grown on 3-D support;effect of transient glutaminedeprivation.”Journal of Bioenergetics and Biomembranes.1998年12月;30(6):565-78.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于,提供能够增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的培养基、和使用该培养基增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了实现上述目的反复进行深入研究,结果发现,如果在将选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的1种以上氨基酸除去的培养基中培养神经干细胞,则该细胞的增殖能力受到抑制、且该细胞的神经分化能力增强。如果使用将选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的1种以上氨基酸除去的培养基,则能够维持经过增强的神经分化能力而使神经干细胞继代。如果由神经分化能力经过增强的神经干细胞向神经细胞分化,则获得增殖性低且分化的细胞的比例高的神经细胞群。基于这些见解,进一步反复研究,从而完成了本发明。
即,本发明如下。
(1)一种神经干细胞和/或神经祖细胞培养用培养基,基本不含L-谷氨酰胺。
(2)根据(1)所述的培养基,L-谷氨酰胺浓度为100μM以下。
(3)根据(1)或(2)所述的培养基,不含L-谷氨酰胺。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的培养基,含有饱和铁转铁蛋白。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的培养基,含有L-色氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-组氨酸。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的培养基,其为用于增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的培养基。
(7)根据(1)~(6)中任一项所述的培养基,其为无血清培养基。
(8)一种神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法,包括在(1)~(7)中任一项所述的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞。
(9)根据(8)所述的方法,其为用于制造神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞的方法。
(10)根据(8)或(9)所述的方法,培养时间为4天以上。
(11)一种神经细胞的制作方法,包括以下工序:
(I)在(1)~(7)中任一项所述的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞,获得神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞;
(II)将在工序(I)中获得的神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞在诱导神经细胞分化的条件下培养,获得神经细胞群。
(12)一种神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞,其通过(9)的方法获得。
(13)一种培养制备物,含有神经干细胞和/或神经祖细胞、以及(1)~(7)中任一项所述的培养基。
发明的效果
本发明的培养基具有增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的效果。如果通过本发明的培养方法培养神经干细胞和/或神经祖细胞,则能够获得增殖能力受到抑制但神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞。神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞通过分化诱导培养而产生大量神经细胞,因此能够有效地制作神经细胞。此外,以这种方式制作的神经细胞群中增殖性的细胞少,因此能够降低将神经细胞移植至活体时肿瘤化的风险,对开发更安全的治疗方法做出贡献。
附图说明
图1为显示除去L-谷氨酰胺的培养基带来的神经分化促进效果的图。用含有L-谷氨酰胺的培养基(Full)或不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln)将神经干细胞培养4天(Day4)(图1A和B)。用不含L-谷氨酰胺的培养基培养的神经干细胞中,神经干细胞的增殖性降低(图1B)。用上述培养基培养4天后,替换为神经分化诱导培养基,培养21天(Day25),对神经细胞进行免疫染色。与含有L-谷氨酰胺的培养基(Full)相比,用不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln)培养的神经干细胞产生了较多的神经细胞(图1C)。图1D显示了NeuroD1、Synapsin1的表达强度。图1D中,各项目左边的条表示Full,右边的条表示ΔGln。用不含L-谷氨酰胺的培养基培养20天的神经干细胞的增殖曲线显示直线性(图1E)。
图2为显示细胞内氨基酸含量的分析结果的图。横轴:经定量的氨基酸,纵轴:单位细胞数的氨基酸含量(nmol/1x106细胞)。各项目左边的条表示Full,右边的条表示ΔGln。
图3为显示单位细胞数中TCA循环中的有机酸含量的图。各项目左边的条表示Full,右边的条表示ΔGln。
图4为显示神经干细胞中的凋亡的图。
具体实施方式
本发明提供神经干细胞和/或神经祖细胞培养用培养基(以下也将其统称为本发明的培养基)、使用了该培养基的神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法(以下也将其统称为本发明的培养方法)、以及通过该方法得到的神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞等。
(1)神经干细胞和/或神经祖细胞
本说明书中,神经干细胞的意思是,维持向神经系细胞(神经细胞和胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)、以及它们的前体细胞)的多潜能性(multipotency)、具有自我复制能力的未分化的细胞。具体地,神经干细胞是,具有最终产生神经细胞和胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)的能力,且只要不进行初始化等特别操作,就基本不产生表皮系细胞、血细胞系细胞、肌肉细胞等神经系以外细胞的细胞。基本不产生是指神经干细胞产生的细胞中90%以上为神经细胞和胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞等)、以及它们的前体细胞中的任一种的状态。
本说明书中,神经祖细胞(neural progenitor)是指,作为具有***能力的未分化的细胞的、具有最终分化为1种以上神经细胞的能力的细胞。神经祖细胞是指以最终产生神经细胞的方式决定命运、且基本不产生神经细胞及其前体细胞以外细胞的细胞。胶质前体细胞(glial progenitor)是指,作为来源于神经干细胞、具有***能力的未分化细胞的、具有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、施万细胞中的任一种或它们的前体细胞的能力,且基本不分化为神经细胞的细胞。
神经干细胞和神经祖细胞难以严格区别,因此,本说明书中,有时作为“神经干细胞和/或神经祖细胞”,无区别地进行使用。
本发明中通常使用哺乳动物来源的神经干细胞和/或神经祖细胞。作为哺乳动物,可列举例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔等兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目、狗、猫等猫目、人、猴子、恒河猴、狨、猩猩、黑猩猩等灵长类等,但不限于此。本发明中使用的神经干细胞和/或神经祖细胞优选为小鼠等啮齿类或人等灵长类的神经干细胞和/或神经祖细胞,更优选为人神经干细胞和/或神经祖细胞。
本发明中使用的神经干细胞和/或神经祖细胞可列举来源于多潜能性干细胞的细胞、由活体组织分离的细胞、由成纤维细胞等不经过多潜能性干细胞直接分化诱导而得的细胞(Matsui T等,Stem Cells.2012年6月,30(6):1109-19)等,只要是维持上文所述的未分化性、维持多潜能性的细胞、维持产生神经细胞的能力就没有特别限制。本发明中使用的神经干细胞和/或神经祖细胞优选为来源于多潜能性干细胞的细胞,更优选为来源于诱导性多能干细胞(iPS细胞)的细胞。
作为由多能干细胞制作神经干细胞和/或神经祖细胞的方法,可以使用本身公知的方法。作为来源于多能干细胞的神经干细胞和/或神经祖细胞的制作方法的例子,可列举进行多能干细胞的悬浮培养、经过胚叶体形成而形成神经干细胞和/或神经祖细胞的方法(Bain G等,Dev Biol.1995年4月,168(2):342-57等)、使用基质细胞等作为饲养细胞的方法、在含有bFGF的无血清培养基中进行多能干细胞的悬浮培养的方法(Watanabe K等,NatNeurosci.2005年3月,8(3):288-96等)、在SMAD信号抑制剂Noggin和SB431542的存在下对多能干细胞(ES细胞等)进行黏附培养的方法(Chambers SM等,Nat Biotechnol.2009年3月,27(3):275-80)、将经单层培养的多能干细胞(ES细胞等)在糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3)(GSK3)抑制剂、转化生长因子β(transforming growthfactorβ)(TGF-β)抑制剂、Notch信号抑制剂存在下进行培养的方法(Li W等,Proc NatlAcad Sci USA.2011年5月17日,108(20):8299-304)等,但不限于此。
本说明书中,多能干细胞的意思是,作为具有自我复制能力和分化/增殖能力的未成熟细胞的、具有能够向构成除了胎盘以外的活体的全部组织、细胞分化的能力的细胞。作为多能干细胞的例子,可列举胚性干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)(TakahashiK等,Cell.2007年11月30日,131(5):861-72)、***干细胞(mGS细胞)(Kanatsu-Shinohara M等,Biol Reprod.2007年1月,76(1):55-62)、胚性生殖细胞(Matsui Y等,Cell.1992年9月4日,70(5):841-7)等。
细胞为神经干细胞例如可以通过下述指标来确认:将细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养基中悬浮培养,对经培养的细胞团进行分散处理后,在后述实施例记载的分化诱导培养基中进行黏附培养,产生神经细胞和胶质细胞。
此外,神经干细胞也可以通过已知在神经干细胞中表达的基因、其转录产物、蛋白质等(神经干细胞标志物)来确认。
作为神经干细胞标志物的例子,已知作为细胞骨架蛋白质的巢蛋白(Nestin;Science,276,66(1997))、SOX1(SRY(sex determining region Y)-box1)、SOX2(SRY(sexdetermining region Y)-box2)、Pax6(paired box 6)、Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、脂肪酸结合蛋白质7(Fabp7,也称为BLBP)等,本领域技术人员可以将这些标志物适当组合而确认为期望的神经干细胞。
细胞为神经祖细胞例如可以通过下述指标来确认:将细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养基中悬浮培养,对经培养的细胞团进行分散处理后,在后述实施例所述的分化诱导培养基中进行黏附培养,此时产生神经细胞,不产生胶质细胞。
此外,神经祖细胞也可以通过已知在神经祖细胞中表达的基因、其转录产物、蛋白质等(神经祖细胞标志物)来确认。作为在神经祖细胞中表达的基因,可列举Tbr2、MASH1、巢蛋白、NeuroD1等,但不限于此。本领域技术人员可以将这些标志物适当组合而确认细胞为神经祖细胞。
作为神经祖细胞的例子,可列举SOX2为阴性且巢蛋白为阳性的细胞,但不限于此。
本说明书中,神经细胞(neuron)的意思是作为神经***功能单位的细胞。通常,神经细胞由细胞体和神经突起(例如轴索、树突)构成,但也存在产生期的未成熟神经元、视网膜的无长突细胞、嗅球的颗粒细胞等没有神经突起的神经细胞(非极性神经细胞)。神经细胞按形态分类的情况下,分为非极性神经细胞、单极性神经细胞、假单极性神经细胞、双极性神经细胞、多极性神经细胞,本说明书中,它们全包括在神经细胞中。
神经细胞包括中枢神经系神经细胞和末梢神经系神经细胞。神经细胞可以为运动神经细胞,可以为感觉神经细胞,也可以为中间神经细胞。作为神经细胞的例子,可列举多巴胺能神经细胞、去甲肾上腺素能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、血清素能神经细胞、胆碱能神经细胞、γ氨基丁酸能神经细胞、谷氨酰胺酸能神经细胞等,但不限于此。
细胞是神经细胞可以通过已知在神经细胞中表达的基因、其转录产物、蛋白质等(神经细胞标志物)来确认。
作为分化的神经细胞的标志物的例子,可列举MAP2(microtubule associatedprotein 2)、神经元纤维、突触蛋白1、βIII微管蛋白、NeuN(neuronal specific nuclearprotein)、FOX3(Forkhead box protein)、钙结合蛋白、PSA-NCAM(polysialylatedneural cell adhesion molecule)、Doublecortin、Peripherin等。
神经干细胞和/或神经祖细胞产生的细胞是否为神经细胞例如可以通过上述标志物来确认。
(2)神经干细胞和/或神经祖细胞培养用培养基
本发明的培养基的特征在于,基本不含选自由L-谷氨酰胺(2-氨基-4-氨基甲酰基丁酸)、L-天冬酰胺(2-氨基-3-氨基甲酰基丙酸)和L-天冬酰胺酸(2-氨基丁二酸)组成的组的1种以上氨基酸(本说明书中,也称为“神经分化相关氨基酸”)。
所选择的“神经分化相关氨基酸”可以为1种(L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺或L-天冬酰胺酸)(这种情况下,本发明的培养基可以含有其他2种神经分化相关氨基酸),可以为2种(L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺的组合、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺酸的组合、或L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸的组合)(这种情况下,培养基可以含有另1种神经分化相关氨基酸),也可以为全部3种(L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸)。
作为一个方式,本发明提供一种培养基,其特征在于,基本不含选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的任1种氨基酸。该方式中,本发明的培养基可以含有未被选择的其他2种神经分化相关氨基酸中的一方或两方。
本发明的培养基可以是用于增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的培养基。通过在本发明的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞,能够增强该细胞的神经分化能力。进而,如果使在本发明的培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞向神经细胞分化,则获得的神经细胞群中增殖性细胞的数量减少。因此,能够提供对神经细胞移植治疗有用的神经细胞,能够提供适合于制作神经细胞移植治疗用神经细胞的神经干细胞和/或神经祖细胞。
本说明书中,“培养基基本不含选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的1种以上氨基酸”的意思是,在该培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞时,与除了含有相当于标准培养基氨基酸浓度(L-谷氨酰胺0.3-3.0mM(例如2.5mM),L-天冬酰胺0.05-1.0mM(例如0.05mM),L-天冬酰胺酸0.05-1.0mM(例如0.05mM))的该所选择的神经分化相关氨基酸以外组成相同的对照培养基中培养时相比,培养基中所选择的神经分化相关氨基酸的浓度降低至足以增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的程度。
例如“培养基基本不含L-谷氨酰胺”的意思是,在该培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞时,与除了含有与标准培养基L-谷氨酰胺浓度(0.3-3.0mM(例如2.5mM))相当的L-谷氨酰胺以外组成相同的对照培养基中培养时相比,培养基中的L-谷氨酰胺浓度降低至足以增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的程度。关于其他神经分化相关氨基酸也是同样的。
本说明书中,“基本不含选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的1种以上氨基酸”的意思是,不仅不包含所选择的神经分化相关氨基酸,也不含所选择的神经分化相关氨基酸的替代用二肽(含有所选择的神经分化相关氨基酸残基的二肽,在培养基中由于肽酶等分解从而供应该所选择的神经分化相关氨基酸)等在培养基中提供所选择的神经分化相关氨基酸的物质。
本说明书中,“基本不含L-谷氨酰胺”的意思是,培养基中不仅基本不含L-谷氨酰胺,也基本不含L-丙氨酰L-谷氨酰胺等L-谷氨酰胺与氨基酸的二肽(L-谷氨酰胺代替用二肽)。
本说明书中,“基本不含L-天冬酰胺”的意思是,培养基中不仅基本不含L-天冬酰胺,也基本不含L-天冬酰胺的替代用二肽(例如L-丙氨酰L-天冬酰胺)。
本说明书中,“基本不含L-天冬酰胺酸”的意思是,培养基中不仅基本不含L-天冬酰胺酸,也基本不含L-天冬酰胺酸的替代用二肽(例如L-丙氨酰L-天冬酰胺酸)。
“基本不含L-谷氨酰胺的培养基”是指,该培养基中的L-谷氨酰胺浓度(L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺代替用二肽的合计浓度)通常为100μM以下,优选为10μM以下,进一步优选为100nM以下,最优选为0nM的培养基。
“基本不含L-天冬酰胺的培养基”是指,该培养基中的L-天冬酰胺浓度(L-天冬酰胺和L-天冬酰胺代替用二肽的合计浓度)通常为10μM以下,优选为100nM以下,进一步优选为1nM以下,最优选为0nM的培养基。
“基本不含L-天冬酰胺酸的培养基”是指,该培养基中的L-天冬酰胺酸浓度(L-天冬酰胺酸和L-天冬酰胺酸代替用二肽的合计浓度)通常为10μM以下,优选为100nM以下,进一步优选为1nM以下,最优选为0nM的培养基。
本说明书中,不含所选择的神经分化相关氨基酸是指该神经分化相关氨基酸的浓度为0nM。
本说明书中,“神经分化能力”的意思是,神经干细胞和/或神经祖细胞向神经细胞分化的能力。
本发明的培养基具有增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的效果。
“增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力”的意思是,将在本发明的培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞与在除了所选择的神经分化相关氨基酸的浓度相当于标准培养基氨基酸浓度(L-谷氨酰胺0.3-3.0mM,天冬酰胺0.05-1.0mM,天冬酰胺酸0.05-1.0mM)以外具有与本发明的培养基相同组成的比较对照培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞(本说明书中,也简称为比较对照细胞)在神经细胞分化条件下(例如存在N2和B27的条件下)培养而制作神经细胞时,由一定细胞数量的神经干细胞和/或神经祖细胞产生的神经细胞数比比较对照多,或者从培养开始后至达到一定时间之间产生的神经细胞数比比较对照多。
例如所选择的神经分化相关氨基酸为L-谷氨酰胺的情况下,“增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力”的意思是,将在本发明的培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞与除了L-谷氨酰胺的浓度相当于标准培养基L-谷氨酰胺浓度(0.3-3.0mM(例如2.5mM))以外具有与本发明的培养基相同组成的比较对照培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞在神经细胞分化条件下(例如存在N2和B27的条件下)培养而制作神经细胞时,由1个神经干细胞和/或神经祖细胞产生的神经细胞数比比较对照多,或者从培养开始后至达到一定时间之间产生的神经细胞数比比较对照多。
只要能够实现神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的增强,本发明的培养基对于所选择的神经分化相关氨基酸以外的成分就没有特别限定,可以适当采用通常的神经干细胞和/或神经祖细胞的维持培养中使用的组成。
本发明的培养基可以以从哺乳动物细胞的培养中通常使用的培养基的组成将所选择的神经分化相关氨基酸除去而得的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基,只要能够实现期望的效果就没有特别限定,可以列举例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、或它们的混合培养基等动物细胞的培养中能够使用的培养基。此外,也可以以从作为多能干细胞培养用而通常使用的培养基的组成将所选择的神经分化相关氨基酸除去而得的培养基为基础培养基来制备。
还可以以从作为市售的多能干细胞培养用基础培养基的StemFit(注册商标)AK培养基(味之素)、Essential 8培养基(Life Technologies)、mTeSR1培养基(STEMCELLTechnologies)、TeSR2培养基(STEMCELL Technologies)、RHB培养基(StemCells,Inc.)、TeSR TM-E6(STEMCELL Technologies)、hESF-GRO培养基(尼普洛株式会社)、HESF-DIF培养基(尼普洛株式会社)、CSTI-7(株式会社细胞科学研究所)、Essential 6培养基(LifeTechnologies)等的组成将所选择的神经分化相关氨基酸除去而得的培养基为基础培养基来制备。
从避免混入化学上未确定的成分的观点出发,本发明的培养基优选为所含成分在化学上已确定的培养基(Chemically defined medium,CDM)。从避免混入化学上未确定的成分的观点出发,本发明的培养基优选为无血清培养基。本发明中的“无血清培养基”的意思是,不含无调整或未纯化的血清的培养基。本发明中,只要不含无调整或未纯化的血清,含有经纯化的血液来源成分、动物组织来源成分(例如bFGF等增殖因子)的培养基也包括在无血清培养基中。
无血清培养基可以含有血清替代物。作为血清替代物,可以列举例如适当含有血清白蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油、或者它们的等价物等的物质。该血清替代物例如可以通过WO98/30679中记载的方法来制备。作为血清替代物,可以利用市售品。作为该市售的血清替代物,可列举例如KnockoutTM SerumReplacement(Life Technologies公司制,以下有时记为KSR。)、Chemically-definedLipid concentrated(Life Technologies公司制)、B27(Life Technologies公司)、N2(Life Technologies公司),但不限于此。
通常,本发明的培养基含有全部必需氨基酸(L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸)。
只要能够实现神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的增强就没有特别限定,本发明的培养基所含的必需氨基酸的浓度分别例示如下:
L-亮氨酸0.005-100mM,优选0.5-20mM;
L-赖氨酸0.005-100mM,优选1-20mM;
L-苯丙氨酸0.005-100mM,优选0.5-10mM;
L-异亮氨酸0.005-100mM,优选0.5-20mM;
L-苏氨酸0.005-100mM,优选0.5-10mM;
L-组氨酸0.005-100mM,优选0.5-10mM;
L-甲硫氨酸0.005-100mM,优选0.5-5mM;
L-色氨酸0.005-100mM,优选0.05-1mM;
L-缬氨酸0.005-100mM,优选0.5-10mM。
作为各必需氨基酸的浓度的组合,例示了L-亮氨酸0.005-100mM、L-赖氨酸0.005-100mM、L-苯丙氨酸0.005-100mM、L-异亮氨酸0.005-100mM、L-苏氨酸0.005-100mM、L-组氨酸0.005-100mM、L-甲硫氨酸0.005-100mM、L-色氨酸0.005-100mM和L-缬氨酸0.005-100mM,但不限于此。
更优选本发明的培养基含有全部必需氨基酸(L‐亮氨酸0.5-20mM、L-赖氨酸1-20mM、L-苯丙氨酸0.5-10mM、L-异亮氨酸0.5-20mM、L-苏氨酸0.5-10mM、L-组氨酸0.5-10mM、L-甲硫氨酸0.5-5mM、L-色氨酸0.05-1mM和L-缬氨酸0.5-10mM)。
本发明的培养基优选含有L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸以外的全部非必需氨基酸(L-丙氨酸0.2-2mM、L-精氨酸1-10mM、甘氨酸1-10mM、L-谷氨酰胺酸0.5-10mM、L-半胱氨酸0.5-10mM、L-丝氨酸0.5-10mM、L-酪氨酸0.5-10mM、L-脯氨酸0.5-5mM)。
本发明的培养基基本不含L-天冬酰胺和/或L-天冬酰胺酸、含有L-谷氨酰胺的情况下,L-谷氨酰胺在培养基中的浓度优选为0.3-3.0mM。
本发明的培养基基本不含L-谷氨酰胺和/或L-天冬酰胺酸、含有L-天冬酰胺的情况下,L-天冬酰胺在培养基中的浓度优选为0.05-1.0mM。
本发明的培养基基本不含L-谷氨酰胺和/或L-天冬酰胺、含有L-天冬酰胺酸的情况下,L-天冬酰胺酸在培养基中的浓度优选为0.05-1.0mM。
除了上述氨基酸以外,本发明的培养基还可以含有L‐胱氨酸等天然氨基酸。
本发明的培养基可以进一步含有培养基添加物。作为培养基添加物,可列举维生素类、细胞因子和生长因子等蛋白质、L-抗坏血酸、磷酸L-抗坏血酸镁、丙酮酸钠、2-氨基乙醇(乙醇胺)、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、***、硒酸钠、腐胺等,但不限于此。添加物优选在本身公知的浓度范围内含有。本发明的培养基可以含有L-抗坏血酸,也可以不含有。
本发明的培养基可以进一步含有饱和铁转铁蛋白。与铁结合的转铁蛋白被称为饱和铁转铁蛋白,未与铁结合的转铁蛋白被称为脱辅基转铁蛋白。本说明书中,饱和铁转铁蛋白包括1分子脱辅基转铁蛋白与1个铁离子结合的分子和1分子脱辅基转铁蛋白与2个铁离子结合的分子。
本发明的培养基含有饱和铁转铁蛋白的情况下,培养基所含的饱和铁转铁蛋白的浓度只要能够实现神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的增强等期望的效果就没有特别限制,为0.01~100μg/ml,优选为0.1~6.5μg/ml,进一步优选为0.1~5μg/ml。
作为编码人转铁蛋白的核酸序列,可列举NM_001063(NCBI Accession No.),作为人转铁蛋白的氨基酸序列可列举NP_001054,但不限于此。
饱和铁转铁蛋白也可以使用市售的试剂(Sigma Aldrich)。
本发明的培养基可以含有神经干细胞和/或神经祖细胞的继代培养中使用的增殖因子(例如EGF:10~100ng/mL,bFGF:10~100ng/ml等)。
本发明的培养基可以含有脂肪酸。作为本发明的培养基所含的脂肪酸,可列举油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、丁酸、乙酸、棕榈油酸、戊酸(缬草酸)、己酸、庚酸(Heptylic acid)、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五碳酸、十七碳酸、客烯酸(クセン酸)、桐酸、花生酸、8,11-二十碳二烯酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二十二烷酸、二十四烷酸、神经酸、蜡酸、褐煤酸、蜂花酸等,但不限于此。本发明的培养基所含的脂肪酸可以为饱和脂肪酸,也可以为不饱和脂肪酸。
例如本发明的培养基可以通过在不含所选择的神经分化相关氨基酸(例如L-谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬酰胺酸)的基础培养基中添加碳酸氢钠、硒、转铁蛋白、胰岛素、bFGF和2-氨基乙醇而制备,但不限于此。
本发明的培养基的pH优选为约5.0~约8.5,更优选调节至约6.0~约8.0。培养基优选进行使用膜过滤器等的过滤灭菌等灭菌处理。
只要获得本发明的期望的效果,本发明的培养基的形态就没有特别限定,例如可以作为液体培养基、半流动培养基和固态培养基的形态制备。此外,也可以将本发明的培养基作为粉末状的形态制备。通过制备成粉末状的形态,可以使输送、保存极为容易。该粉末状的培养基可以通过在即将使用之前添加灭菌水等、根据需要用膜过滤器等灭菌,容易地制成液体培养基。本发明的培养基也可以用于黏附培养、悬浮培养、包埋培养、组织培养等任一培养方法。
(3)神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法
本发明提供包括在上述本发明的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞的、神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法(本说明书中也称为本发明的培养方法)。
通过使用本发明的培养基培养神经干细胞和/或神经祖细胞,能够获得神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞。尤其是如果使使用本发明的培养基培养的神经干细胞和/或神经祖细胞向神经细胞分化,则能够获得增殖受到抑制的神经细胞群,因此本发明的培养方法对神经细胞移植用神经细胞的制作是有用的。因此,本发明的培养方法是优选用于制造神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞的方法。此外,通过在神经干细胞和/或神经祖细胞的维持培养中,将培养基中选自由L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸组成的组的1种以上氨基酸的浓度降低至“基本不含”该氨基酸的浓度并继续培养,能够增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力。本发明也可被视为这样的神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的增强方法。所选择的神经分化相关氨基酸的浓度降低可以通过将培养所用的培养基由以规定浓度含有所选择的神经分化相关氨基酸的培养基更换为本发明的培养基来实施。通过将使细胞悬浮于含有神经分化相关氨基酸的培养基中而得的溶液悬浮于约10倍量的ΔGln培养基,更换前的培养基稀释至10倍左右。据估计,如果通过通常的操作进行培养基更换,则更换前的培养基的残留最多为1/100容量左右,因此,通过例如在培养基刚更换之后~数小时后将更换后的培养基用本发明的培养基置换,估计含有神经分化相关氨基酸的培养基至少稀释至1,000倍左右。如上述那样,一般的多能干细胞、神经干细胞的维持用培养基中含有L-谷氨酰胺0.3~3.0mM左右、L-天冬酰胺0.05~1.0mM左右、L-天冬酰胺酸0.05~1.0mM左右。因此,例如通过在以0.3~3.0mM的浓度含有L-谷氨酰胺的培养基中维持培养神经干细胞和/或神经祖细胞,将该培养基更换为基本不含L-谷氨酰胺的本发明的培养基并持续继续维持培养,使L-谷氨酰胺浓度由0.3~3.0mM降低至例如100μM以下、优选为10μM以下、进一步优选为100nM以下、进一步更优选为1nM以下、最优选为0nM,使神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力增强。此外,例如通过在以0.1~1.0mM的浓度含有L-天冬酰胺的培养基中维持培养神经干细胞和/或神经祖细胞,将该培养基更换为基本不含L-天冬酰胺的本发明的培养基并持续继续维持培养,使L-天冬酰胺浓度由0.1~1.0mM降低至例如10μM以下、优选为100nM以下、进一步优选为1nM以下、最优选为0nM,使神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力增强。此外,通过在以0.1~1.0mM的浓度含有L-天冬酰胺酸的培养基中维持培养神经干细胞和/或神经祖细胞,将该培养基更换为基本不含L-天冬酰胺酸的本发明的培养基并持续继续维持培养,使L-天冬酰胺酸浓度由0.1~1.0mM降低至例如10μM以下、优选为100nM以下、进一步优选为1nM以下、最优选为0nM,使神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力增强。
本发明的培养方法中使用的神经干细胞和/或神经祖细胞优选是经过分离的。“分离”的意思是,进行了将目的成分、细胞以外的因子除去的操作、脱离了天然存在的状态。“分离的神经干细胞和/或神经祖细胞”的纯度(神经干细胞和/或神经祖细胞的数量占总细胞数的百分率)通常为70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为99%以上、最优选为100%。
本发明的培养方法中,培养基中的神经干细胞和/或神经祖细胞的浓度只要具有期望的效果就没有特别限制,通常为5×103~105个/cm3、优选为104~3×104个/cm3。
本发明的培养方法中的培养条件除了使用本发明的培养基以外,只要能够实现期望的效果就没有特别限定,可以根据培养目的适当采用通常的神经干细胞和/或神经祖细胞的培养中使用的培养条件。
本发明的培养方法中,细胞的培养中使用的培养器只要能够实现期望的效果就没有特别限定,可列举培养瓶、组织培养用培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、组织培养用培养皿、多孔培养皿、微板(microplate)、微孔板、多板(Multiplate)、多孔板、载玻片、培养玻片、浅底盘、管、托盘、培养袋和滚瓶等。
细胞的培养中使用的培养器可以为细胞黏附性,也可以为细胞非黏附性,根据目的适当选择。
出于提高培养器表面与细胞的黏附性的目的,细胞黏附性的培养器可以是用细胞外基质(ECM)等任选的细胞支撑用基质或模仿它们的功能的人工物质包被的培养器。
其他培养条件可以适当设定。例如培养温度只要能够实现期望的效果就没有特别限制,约为30~40℃,优选约为37℃。CO2浓度约为1~10%,优选约为2~5%。氧浓度通常为1~40%,根据培养条件等适当选择。
本发明的培养方法中,神经干细胞和/或神经祖细胞可以通过黏附培养、悬浮培养、组织培养等本身公知的方法来培养。
只要能够实现神经分化能力的增强等期望的效果就没有特别限制,本发明的培养方法中培养神经干细胞和/或神经祖细胞的时间通常为2天以上,优选为4天以上,更优选为8天以上。通过回收在本发明的培养基中培养的神经干细胞和/或神经祖细胞,使其一部分或全部在新鲜的本发明的培养基中继代并继续持续培养,能够维持经过增强的神经分化能力而对神经干细胞和/或神经祖细胞进行继代培养。
使神经干细胞和/或神经祖细胞继代的情况下,可以通过本身公知的方法对神经干细胞和/或神经祖细胞进行分散处理。作为对细胞进行分散处理的方法的例子,可列举利用螯合剂(例如EDTA)、酶(例如胰蛋白酶、胶原酶)等进行的处理、机械分散(例如吹打)等操作。
(4)由神经干细胞和/或神经祖细胞制作神经细胞的方法
本发明提供一种神经细胞制作方法(本说明书中,也称为本发明的神经细胞制作方法),其特征在于,在上述本发明的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞,接着进行向神经细胞的分化诱导培养,获得神经细胞群。
本说明书中,神经细胞群的意思是包括神经细胞的细胞的群。神经细胞群可以包含神经细胞以外的细胞。神经细胞群只要包含神经细胞就没有特别限制,通常,细胞群内细胞的1%以上、优选5%以上、更优选20%以上、进一步优选40%以上为神经细胞。
通过使用本发明的神经细胞制作方法,能够在短时间内高效制作大量神经细胞。此外,通过本发明的神经细胞制作方法获得的神经细胞群中,神经细胞群所含的增殖性细胞的比例低,因此用于细胞移植治疗的情况下肿瘤化的风险低。因此,通过本发明的神经细胞制作方法制作的神经细胞可以合适地用于移植治疗。
本发明的神经细胞制作方法包括以下工序:
(I)在本发明的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞,获得神经细胞分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞;
(II)将在工序(I)中获得的神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞在诱导神经细胞分化的条件下培养,获得神经细胞群。
工序(I)可以通过将神经干细胞和/或神经祖细胞在本发明的培养基中培养足以增强神经分化能力的时间(例如2天以上,优选4天以上,更优选8天以上)来实现。其他培养条件比照本发明的培养方法的记载。
工序(II)中的神经细胞分化诱导条件只要能够实现神经干细胞和/或神经祖细胞向神经细胞的分化就没有特别限定,可以适当采用向期望的神经细胞的分化诱导中使用的培养条件。作为神经干细胞和/或神经祖细胞的黏附培养方法的例子,可列举Flanagan LA等,J Neurosci Res.2006年4月,83(5):845-56、Conti L等,PLoS Biology.,2005年9月,3(9):e283等记载的方法。神经干细胞和/或神经祖细胞的悬浮培养是指在培养基中,在对培养器或饲养细胞(使用的情况下)非黏附性的条件下,对神经干细胞和/或神经祖细胞进行培养。作为神经干细胞和/或神经祖细胞的悬浮培养方法的例子,可列举神经球法(Reynolds BA and Weiss S.,Science,USA,1992年3月27日,255(5052):1707-10.)、无血清凝集悬浮培养法(SFEB法、SFEBq法,Watanabe等,Nature Neuroscience 8,288-296(2005))等。神经干细胞和/或神经祖细胞的组织培养是将包含神经干细胞和/或神经祖细胞的组织以切片等组织片或整个组织的方式进行培养的方法。作为神经干细胞和/或神经祖细胞的组织培养,可列举O’Rourke NA等,Science.1992年10月9日,258(5080):299-302.、Komuro H等,Science.1992年8月7日,257(5071):806-9.记载的切片培养法等。神经细胞分化诱导条件对于本领域技术人员而言是公知的,本领域技术人员可以适当采用期望的神经细胞分化诱导条件。
工序(II)中,培养基中神经干细胞和/或神经祖细胞的浓度只要具有期望的效果就没有特别限制,通常为5×103~105个/cm3,优选为104~3×104个/cm3。
工序(II)的分化诱导培养中的培养条件只要能够实现减少增殖性细胞所占的比例等期望的效果就没有特别限定,可以根据培养目的适当采用公知的培养方法。
工序(II)的分化诱导培养中,细胞的培养中使用的培养器只要能够实现期望的效果就没有特别限定,可列举培养瓶、组织培养用培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、组织培养用培养皿、多孔培养皿、微板(microplate)、微孔板、多板(Multiplate)、多孔板、载玻片、培养玻片、浅底盘、管、托盘、培养袋和滚瓶等。
细胞的培养中使用的培养器可以为细胞黏附性,也可以为细胞非黏附性,根据目的适当选择。
出于提高培养器表面与细胞的黏附性的目的,细胞黏附性的培养器可以是用细胞外基质(ECM)等任选的细胞支撑用基质或模仿它们的功能的人工物质包被的培养器。
其他培养条件可以适当设定。例如培养温度只要能够实现期望的效果就没有特别限制,约为30~40℃,优选约为37℃。CO2浓度约为1~10%,优选约为2~5%。氧浓度通常为1~40%,根据培养条件等适当选择。
工序(II)的分化诱导培养中,神经干细胞和/或神经祖细胞可以通过黏附培养、悬浮培养、组织培养等本身公知的方法进行培养。
工序(II)的分化诱导培养中,培养神经干细胞和/或神经祖细胞的时间只要能够实现增殖性降低的神经细胞的产生等期望的效果就没有特别限制,至少持续培养至神经细胞出现。神经细胞的出现可以通过评价上述神经细胞标志物的表达来确认。
一个实施方式中,分化诱导培养是在分化诱导培养基中培养神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞。
只要能够实现增殖性降低的神经细胞的产生等期望的效果就没有特别限制,工序(II)的分化诱导培养中使用分化诱导培养基的情况下,培养神经干细胞和/或神经祖细胞的时间通常为10天以上,优选为21天以上,更优选为60天以上。在分化诱导培养基中进行培养的情况下,通常3天1次、优选2天1次以上更换为新鲜的培养基。
使用分化诱导培养基的情况下,优选在工序(II)中对神经干细胞和/或神经祖细胞进行分散处理,将经分散处理的细胞交与分化诱导培养。使用分化诱导培养基的情况下,工序(II)优选使用细胞黏附性的容器。
工序(II)中使用的分化诱导培养基的组成只要能够实现神经干细胞和/或神经祖细胞向神经细胞的分化就没有特别限制,可以使用公知的神经细胞分化诱导用培养基。
分化诱导培养基优选不含EGF和bFGF等维持神经干细胞的未分化性的物质。
工序(II)中使用的分化诱导培养基可以以哺乳动物细胞的培养中通常使用的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基,只要能够实现期望的效果就没有特别限定,可以列举例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEMZinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、或它们的混合培养基等动物细胞的培养中能够使用的培养基。
从避免混入化学上未确定的成分的观点出发,工序(II)中使用的分化诱导培养基优选为所含成分在化学上已确定的培养基(Chemically defined medium,CDM)。从避免混入化学上未确定的成分的观点出发,分化诱导培养基优选为无血清培养基。本发明中的“无血清培养基”的意思是,不含无调整或未纯化的血清的培养基。本发明中,只要不含无调整或未纯化的血清,含有经纯化的血液来源成分、动物组织来源成分的培养基也包括在无血清培养基中。
无血清培养基可以含有血清替代物。作为血清替代物,可以列举例如适当含有血清白蛋白、脂肪酸、非必需氨基酸、转铁蛋白、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油、或者它们的等价物等的物质。该血清替代物例如可以通过WO98/30679记载的方法来制备。作为血清替代物,可以利用市售品。作为该市售的血清替代物,可列举例如KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies公司制,以下有时记为KSR。)、GlutamaxTM(Life Technologies公司制)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies公司制)、B27(Life Technologies公司)、N2(Life Technologies公司),但不限于此。
工序(II)中使用的分化诱导培养基可以进一步含有培养基添加物。作为培养基添加物,可列举维生素类、细胞因子和生长因子等蛋白质、L-抗坏血酸、磷酸L-抗坏血酸镁、丙酮酸钠、2-氨基乙醇、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、***、硒酸钠、腐胺等,但不限于此。添加物优选在本身公知的浓度范围内含有。
工序(II)中使用的分化诱导培养基可以含有L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-天冬酰胺酸。
工序(II)中使用的分化诱导培养基可以含有脂肪酸。作为分化诱导培养基所含的脂肪酸,可列举油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、丁酸、乙酸、棕榈油酸、戊酸(缬草酸)、己酸、庚酸(Heptylicacid)、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五碳酸、十七碳酸、客烯酸(クセン酸)、桐酸、花生酸、8,11-二十碳二烯酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二十二烷酸、二十四烷酸、神经酸、蜡酸、褐煤酸、蜂花酸等,但不限于此。分化诱导培养基所含的脂肪酸可以为饱和脂肪酸,也可以为不饱和脂肪酸。
分化诱导培养基的pH优选为约5.0~约8.5,更优选调节至约6.0~约8.0。培养基优选进行使用膜过滤器等的过滤灭菌等灭菌处理。
作为本发明的一个实施方式,分化诱导培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基,含有转铁蛋白、Glutamax、B27补充剂、N2补充剂、葡萄糖、碳酸氢钠、HEPES、胰岛素、***、***钠和腐胺。
使用上述培养基的情况下,工序(II)中培养细胞的时间只要能够实现向神经细胞的分化诱导就没有特别限定,通常为10天以上,优选为21天以上,更优选为60天以上。
工序(II)也可以是分化为特定种类的神经细胞。
本发明的神经细胞制作方法可以在工序(I)、(II)之后进一步包括从工序(III)神经细胞群将神经细胞分离的工序。
神经细胞从神经细胞群的分离可以通过本身公知的方法来进行。
作为从神经细胞群将神经细胞分离的方法的例子,可列举:使用针对期望的神经细胞特异性存在的细胞外抗原的抗体、利用流式细胞仪进行分离的方法,利用结合有针对期望的神经细胞特异性存在的细胞外抗原的抗体的微珠进行分离的方法等,但不限于此。
神经细胞群的分离也可以通过将预测会混入的神经祖细胞和神经干细胞除去来实现。
(5)神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞
本发明提供通过上述本发明的培养方法获得的神经干细胞和/或神经祖细胞(本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞)。
如上所述,本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力增强。
本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞可以通过将神经干细胞和/或神经祖细胞在本发明的培养基中通常培养2天以上、优选培养4天以上、更优选培养8天以上来获得。其他培养条件比照本发明的培养方法的记载。
本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞优选是经分离的。“分离”的意思是,进行将目的成分、细胞以外的因子除去的操作、脱离天然存在的状态。“分离的神经干细胞和/或神经祖细胞”的纯度(神经干细胞和/或神经祖细胞的数量占总细胞数的百分率)通常为70%以上,优选为80%以上,更优选为90%以上,进一步优选为99%以上,最优选为100%。
作为一个实施方式,本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞可以以冷冻保存的状态提供。本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞能够冷冻保存,可以根据需要解冻、复苏而使用。冷冻保存可以使用本身公知的细胞冷冻保存方法。作为冷冻保存的例子,在本发明的组成物中加入二甲基亚砜,在-80至-200℃、优选-196℃(液氮中)的条件下保存本发明的神经干细胞和/或神经祖细胞。
(6)神经干细胞和/或神经祖细胞培养制备物
本发明提供包括上述本发明的培养基和神经干细胞和/或神经祖细胞的神经干细胞和/或神经祖细胞培养制备物(本发明的培养制备物)。
本发明的培养制备物中的神经干细胞和/或神经祖细胞是存活、增殖的细胞。
本发明的培养制备物中的神经干细胞和/或神经祖细胞优选是经分离的。“分离”的意思是,进行将目的成分、细胞以外的因子除去的操作、脱离天然存在的状态。“分离的神经干细胞和/或神经祖细胞”的纯度(神经干细胞和/或神经祖细胞的数量占总细胞数的百分率)通常为70%以上,优选为80%以上,更优选为90%以上,进一步优选为99%以上,最优选为100%。
本发明的培养制备物中,神经干细胞和/或神经祖细胞存在于本发明的培养基中。一个方式中,本发明的培养制备物是神经干细胞和/或神经祖细胞在本发明的培养基中的悬浮液。本发明的培养制备物可以封入适当的容器中。
本发明的培养制备物对上述本发明的培养方法的实施是有用的。
作为一个实施方式,本发明的培养制备物可以以冷冻保存的状态提供。本发明的培养制备物能够冷冻保存,可以根据需要解冻、复苏而使用。冷冻保存可以使用本身公知的细胞冷冻保存方法。作为冷冻保存的例子,在本发明的培养制备物中加入二甲基亚砜,在-80至-200℃、优选在-196℃(液氮中)的条件下保存本发明的培养制备物。
以下给出实施例,更详细地对本发明进行说明,但这些实施例并非对本发明的范围的限定。
实施例
实施例1:基本不含谷氨酰胺的培养基中神经干细胞的培养法
(1)Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells(长期自我更新的神经上皮样干细胞)(以下LtNES细胞)诱导法
由iPS细胞形成EB(embryoid body;拟胚体),在对相当于从E6培养基(LifeTechnologies或STEMCELL Technologies)中将抗坏血酸和转铁蛋白除去的组成的培养基中添加转铁蛋白(终浓度0.5~10μg/mL)、乙醇胺(终浓度5~50μM)、人血清白蛋白(终浓度0.1~5mg/mL)而得的培养基中,培养4天。将EB接种于用多聚L鸟氨酸(PO)包被的培养皿(dish),在上述培养基中培养10天左右,确认形成了玫瑰花环(Rosette)样的结构。将Rosette部分挖出,作为神经球在上述培养基中进行7天左右悬浮培养。利用胰蛋白酶/EDTA使神经球分散,在用PO/层粘连蛋白包被的培养皿(dish)上,在RHB-A培养基中培养,制成LtNES细胞。
(2)LtNES细胞的培养法
在相当于从E6培养基(Life Technologies或STEMCELL Technologies)将抗坏血酸、转铁蛋白和L-谷氨酰胺除去的组成的培养基中添加转铁蛋白(终浓度0.5~10μg/mL)、乙醇胺(终浓度5~50μM)、人血清白蛋白(终浓度0.1~5mg/mL)、20ng/mL bFGF,制作不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)。此外,制作除了含有L-谷氨酰胺(0.3-3.0mM)以外组成与ΔGln培养基相同的对照培养基(Full培养基)。
将由人多能干细胞诱导的LtNES细胞悬浮于Full培养基,制作细胞悬浮液。对于Full培养基或ΔGln培养基,加入1/10量的该细胞悬浮液,在37℃、5%CO2环境下进行培养。为了减少更换前的培养基的残留,在培养开始2小时后实施培养基更换,进一步继续培养。因此,估计更换前的培养基至少稀释至1,000倍左右。LtNES细胞的继代中,在TrypLESelect内,37℃进行1分钟孵育,用培养基稀释,然后进行吹打,制成单个细胞。按1.5×105cells/well(6well plate;6孔板)接种上述分散在培养基中的细胞,在37℃、5%CO2环境下进行培养。细胞数测定是在利用台盼蓝(Life Technologies)进行死细胞染色的基础上,利用血细胞计数板进行的。
将培养4天后的神经干细胞的显微镜图像示于图1A。在ΔGln培养基中培养4天的神经干细胞显示与在Full培养基中培养的神经干细胞同样的形态。
实施例2:神经系细胞诱导的促进效果的验证
为了验证用不含L-谷氨酰胺的培养基培养的细胞的分化能力,进行分化诱导实验。
与实施例1同样,由iPS细胞诱导神经干细胞,在不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)或对照培养基(Full培养基)中进行4天培养。
培养后,代替培养基,添加TrypLE Select,37℃孵育1分钟,进行细胞分散处理。将TrypLE Select用培养基稀释后,进行吹打,在用多聚L鸟氨酸/纤连蛋白包被的48孔板上按1.5×105cells/well接种。在含有L-谷氨酰胺的DMEM/F-12(Life Technologies)中添加1×N2补充剂(Life Technologies)、1×B27补充剂(Life Technologies),在由此得到的分化诱导培养基中,第4天~第25天培养21天。细胞的培养在37℃、5%CO2气氛下的培养箱内进行。2天进行一次培养基更换。
从分化诱导培养后的细胞提取RNA,转录为cDNA后进行qPCR,测定Neuro D1(Neurogenic differentiation 1)、synapsin 1的表达强度。此外,将分化诱导培养后的细胞固定,通过使用针对作为神经细胞标志物的βIII微管蛋白的抗体的荧光抗体法进行免疫染色。
将免疫染色的结果示于图1C。显示分化诱导后的细胞中包含βIII微管蛋白为阳性的分化了的神经细胞。与在Full培养基中培养的神经干细胞相比,用ΔGln培养基培养的神经干细胞产生了更多分化了的神经细胞。因此,表明ΔGln培养基具有促进神经干细胞分化的作用。
将qPCR的结果示于图1D。由用不含L-谷氨酰胺的ΔGln培养基培养的神经干细胞诱导的神经细胞中,作为神经细胞标志物的Synapsin1和作为神经祖细胞标志物的NeuroD1的表达得到了增强。
实施例3:神经细胞的增殖性的抑制效果的验证
根据实施例1记载的神经干细胞培养方法,在对照培养基(Full培养基)或不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)中将神经干细胞培养4天。用4%-多聚甲醛磷酸缓冲液在室温下将培养的细胞固定20分钟。经固定的细胞用PBS(Phosphate buffered saline)洗涤后,在乙醇中室温孵育5分钟,风干。然后,将细胞用0.4%结晶紫甲醇溶液(和光纯药:038-04862)染色20分钟,用纯水进行洗涤。加入350μL 1%SDS水溶液,振荡20分钟,从而将结晶紫溶出,利用酶标仪SH―9000(科罗纳电气公司)测定溶出液的570nm吸光度,从而进行细胞数的定量。
将结果示于图1B。在ΔGln培养基中培养4天时神经干细胞的数量比在Full培养基中培养的情况下少。因此,ΔGln培养基显示出对神经干细胞的增殖的抑制。
实施例4:神经干细胞的增殖效果的验证
根据实施例1记载的神经干细胞培养方法,在对照培养基(Full培养基)或不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)中将神经干细胞培养4天。然后,培养至20天(总共继代5次),在培养第4天、第8天、第12天、第16天、第20天进行细胞数量的测量。
将结果示于图1E。在ΔGln培养基中培养的神经干细胞的数量显示出直线性增殖(图1E)。
实施例5:培养基中的氨基酸的分析
根据实施例1记载的神经干细胞培养方法,在对照培养基(Full培养基)或不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)中将神经干细胞培养4天以上。经培养的细胞在将培养基除去后用冰冷甲醇溶解,回收。分析细胞内的氨基酸量、TCA循环相关的酮酸和有机酸量。以下给出氨基酸、酮酸、有机酸的分析步骤。
〈氨基酸的分析步骤〉
试样溶液的衍生物化反应
取10μL待测物,加入10μL内标溶液,加入60μL Amino Tag Wako APDSTag Wako用硼酸缓冲液(和光纯药制),振荡,进一步加入20μL Amino Tag Wako氨基酸分析试剂(LC/MS用)(和光纯药制),剧烈振荡。
然后,使用块式加热器55℃加热10分钟。冷却后,在反应溶液中加入400μL稀释液,振荡,作为分析试样。
衍生物化反应溶液的分析
作为移动相,A液使用Amino Tag Wako APDSTag Wako用洗脱液(和光纯药制)、B液使用将600μL乙腈和400μL水混合而得的溶液,固定相使用C8柱,试样导入LC-MS/MS***,检测各氨基酸的质量数。
此外,作为内标,使用的是:取650μl Amino Tag Wako APDSTag Wako用氨基酸内标混合液(和光纯药制)No.1,添加50μL No.2,与50μM Put-d8和水按1:1:8的比例混合而得的物质。
分析装置
分析装置使用API4000LC/MS/MS***(AB SCIEX制)。
将结果示于图2。在ΔGln培养基中培养的细胞的细胞内,氨基酸含量发生了变化,关于甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺,观察到显著上升。此外关于谷氨酰胺、谷氨酰胺酸、天冬酰胺酸,观察到显著减少。
〈酮酸的分析步骤〉
衍生物化试剂溶液的制备
将10mg O‐(2,3,4,5,6-五氟苄基)-羟胺溶解于1mL的、0.1%氢氧化钠水溶液与乙腈各等量混合而得的溶液,作为衍生物化试剂溶液。
试样溶液的衍生物化反应
将20μL试样溶液放入反应瓶,加入20μL衍生物化试剂溶液,均匀搅拌后,在冰水中静置30分钟,进行衍生物化反应。然后,加入10μL的、丙酮与乙腈各等量混合而得的溶液,使衍生物化反应停止。然后,加入50μL的、0.1%氢氧化钠水溶液与乙腈各等量混合而得的溶液,将稀释的溶液作为分析试样。
衍生物化反应溶液的分析
作为移动相,A液使用25mM甲酸水溶液、B液使用乙腈,固定相使用Ph柱,将分析试样导入LC/MS/MS***,以对应于各酮酸的质量数的形式进行检测。
分析装置
分析装置使用API4000LC/MS/MS***(AB SCIEX制)。
〈有机酸的定量步骤〉
衍生物化试剂溶液的制备
将10mg 3-氨甲基吡啶以成为200mM的方式溶解在含有5%的三乙胺的DMSO溶液中,作为衍生物化试剂溶液。
缩合剂溶液的制备
将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐以成为50mM的方式溶解于DMSO,作为缩合剂溶液。
内标溶液的制备
以各有机酸的稳定同位素标记化合物的浓度成为100μM的方式溶解于蒸馏水,作为内标原液。分取等量各内标原液,以终浓度为10μM的方式加入蒸馏水,作为内标溶液。
试样溶液的衍生物化反应
将100μL试样溶液放入反应瓶,加入10μL内标溶液,均匀搅拌后,用旋转蒸发器减压干燥固化。在减压干燥固化的试样中加入10μL 50%乙腈溶液、15μL衍生物化试剂溶液和30μL缩合剂溶液,溶解后,80℃加热60分钟,进行衍生物化。在瓶中分取30μL反应溶液,加入120μL 50mM甲酸铵水溶液,将稀释的溶液作为分析试样。
衍生物化反应溶液的分析
作为移动相,A液使用调节至pH6的25mM甲酸铵水溶液、B液使用乙腈、固定相使用C8柱,将分析试样导入LC/MS/MS***,以对应于各有机酸的质量数的形式进行检测。
分析装置
分析装置使用API4000LC/MS/MS***(AB SCIEX制)。
将结果示于图3。在ΔGln培养基中培养的细胞的细胞内,TCA循环相关有机酸含量发生了变化,关于丙酮酸,观察到显著上升。此外,关于α酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸、富马酸、苹果酸,观察到显著减少。
实施例6:除去L-谷氨酰胺的培养基培养细胞有无细胞死亡的验证
根据实施例1记载的神经干细胞培养方法,在对照培养基(Full培养基)或不含L-谷氨酰胺的培养基(ΔGln培养基)中将神经干细胞培养4天。利用4%多聚甲醛磷酸缓冲液将培养的细胞在室温下固定20分钟。固定的细胞用PBS洗涤后,使用针对作为apoptosis标志物的cleaved caspase-3的抗体和作为核染色剂的Hoechst33342进行免疫染色。将结果示于图4。
在不含L-谷氨酰胺的培养基中培养的神经干细胞(ΔGln)和在含有L-谷氨酰胺的培养基中培养的神经干细胞(Control)中均几乎未观察到凋亡。不管培养基中是否有L-谷氨酰胺,都几乎不发生凋亡。因此,表明不含L-谷氨酰胺的培养基中并未发生感受性高的一部分细胞的细胞死亡。
实施例7:各除去非必需氨基酸的培养基带来的神经分化促进效果的验证
制作从实施例1记载的Full培养基将各必需氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬酰胺酸、谷氨酰胺酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸)除去的组成的培养基。与实施例1同样地,由iPS细胞诱导神经干细胞,在各除去非必需氨基酸的培养基或Full培养基中进行8-12天培养。
培养后,代替培养基,添加TrypLE Select,37℃孵育1分钟,进行细胞分散处理。将TrypLE Select用培养基稀释后,进行吹打,在用多聚L鸟氨酸/纤连蛋白包被的48孔板上按1.5×105cells/well接种。在DMEM/F-12(Life Technologies)中添加有1×N2补充剂(Life Technologies)、1×B27补充剂(Life Technologies)的培养基中培养20天。细胞的培养在37℃、5%CO2气氛下的培养箱内进行。2天进行一次培养基更换。
将培养后的细胞固定,利用荧光抗体法进行免疫染色,所述荧光抗体法使用针对作为神经细胞标志物的βIII微管蛋白的抗体。通过图像解析对βIII微管蛋白阳性细胞的神经突起长度进行定量,结果示于表1。表1中的记号是,将以对照(Full)作为1时的相对平均神经突起长度以++:>1.5、+:1.5~0.3、-:0.3>的形式表示。不含谷氨酰胺的培养基、不含天冬酰胺酸的培养基和不含天冬酰胺的培养基显示出使神经干细胞的神经分化能力增强的作用。
[表1]
产业可利用性
根据本发明,能够使神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力增强,能够减少神经干细胞和/或神经祖细胞培养花费的人力成本和资金成本。
本申请以在日本申请的特愿2016-071967(申请日:2016年3月31日)为基础,其内容全部包括在本说明书中。
Claims (13)
1.一种神经干细胞和/或神经祖细胞培养用培养基,基本不含L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的培养基,L-谷氨酰胺浓度为100μM以下。
3.根据权利要求1或2所述的培养基,不含L-谷氨酰胺。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的培养基,含有饱和铁转铁蛋白。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的培养基,含有L-色氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-组氨酸。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的培养基,其为用于增强神经干细胞和/或神经祖细胞的神经分化能力的培养基。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的培养基,其为无血清培养基。
8.一种神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法,包括在权利要求1~7中任一项所述的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞。
9.根据权利要求8所述的方法,其为用于制造神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞的方法。
10.根据权利要求8或9所述的方法,培养时间为4天以上。
11.一种神经细胞的制作方法,包括以下工序:
(I)在权利要求1~7中任一项所述的培养基中培养神经干细胞和/或神经祖细胞,获得神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞;
(II)将在工序(I)中获得的神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞在诱导神经细胞分化的条件下培养,获得神经细胞群。
12.一种神经分化能力经过增强的神经干细胞和/或神经祖细胞,其通过权利要求9的方法获得。
13.一种培养制备物,其含有神经干细胞和/或神经祖细胞、以及权利要求1~7中任一项所述的培养基。
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