KR20150132654A - 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20150132654A
KR20150132654A KR1020140058301A KR20140058301A KR20150132654A KR 20150132654 A KR20150132654 A KR 20150132654A KR 1020140058301 A KR1020140058301 A KR 1020140058301A KR 20140058301 A KR20140058301 A KR 20140058301A KR 20150132654 A KR20150132654 A KR 20150132654A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fraction
extract
disease
water
butanol
Prior art date
Application number
KR1020140058301A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101710091B1 (ko
Inventor
안경섭
오세량
백두하
신소림
권옥경
류형원
신인식
이수의
Original Assignee
한국생명공학연구원
(주)화평디엔에프
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원, (주)화평디엔에프 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020140058301A priority Critical patent/KR101710091B1/ko
Publication of KR20150132654A publication Critical patent/KR20150132654A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101710091B1 publication Critical patent/KR101710091B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/42—Cucurbitaceae (Cucumber family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings

Abstract

본 발명은 나한과(Siraitia grosvenori) 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, 염증관련 인자인 IL-6, IL-1β 및/또는 COX-2 유전자의 발현을 억제할 뿐만 아니라, MUC5AC 생성 억제, 기도과민성 경감, 기관지 내 염증세포 침윤 억제, 혈청과 기관지 폐포 세척액 내의 IgE 생성 억제, 및 폐에서의 Th2 사이토카인(IL-5 및 IL-13)의 발현 억제 효과가 우수하므로, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment inflammatory diseases comprising Siraitia grosvenori extract or fractions thereof, or compounds isolated from therefrom}
본 발명은 나한과(Siraitia grosvenori) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 대하여 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포 (migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개인자에 의하여 촉발된다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 이 중에 세균의 침입에 의해 형성되는 농양의 병리적 상태를 염증성 질환이라고 한다.
염증성 질환 중에서도 천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만 명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다(Lemanske RF Jr, 등 JAMA 1997;278:1855-1873; Global Initiative for Asthma. NIH Publication No. 02-3659, 2002). 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다(Global Initiative for Asthma. NIH Publication No. 02-3659, 2002, p50-66). 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨 (interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며, 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다. 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다. 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.
현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항생제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항생제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다. 이러한 부작용들을 극복하고 독성이 적으며, 치료효과가 탁월한 천연물 혹은 새로운 화합물의 개발이 끊임없이 진행되고 있다.
한편, 나한과(Siraitia grosvenori)는 중국 광동, 광서성의 고랭지에서 재배되는 박과의 다년생 식물로서, 종래에 청량음료의 원료나 조미료로 사용되어져 왔으며, 위나 장에 문제가 있을 경우 민간에서 사용되어 왔으나, 이의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물의 항천식 또는 항염증 활성에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 인체에 부작용을 유발하지 않으면서 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용한 천연물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물이 독성을 나타내지 않으면서 천식을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002

본 발명의 다른 목적은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 나한과(Siraitia grosvenori) 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
[화학식 2]
Figure pat00004

구체적으로, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "나한과(Siraitia grosvenori)"는 중국 광동, 광서성의 고랭지에서 재배되는 박과의 다년생 식물이다. 매년 6월에서 8월 사이에 담황색 꽃을 피우고, 8월에서 10월 사이에 원형의 호과를 맺는다. 과일의 외피에 용모가 나있고 처음 열매를 맺을 때 열매의 색깔은 홍색이나 성숙하면 청색으로 변한다. 수확한 후 과병은 잘라내고 얕은 불에 5일 내지 6일 동안 말려서 약용한다. 중국계림지방에서는 청량음료의 원료나 조미료로 사용되어져 왔으며, 위나 장에 문제가 있을 경우 민간에서 사용되었다.
본 발명에서 용어, "나한과 추출물"은 나한과를 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 나한과 추출물은 나한과 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 나한과 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다. 상기 나한과 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 열매 또는 식물 조직 배양물 등으로부터 추출 가능하며, 특히 나한과의 열매로부터 추출될 수 있다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 나한과 분획물은 나한과 추출물을 현탁한 후, 물, 메탄올, 에탄올 등의 극성 용매 또는 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 구체적으로, 나한과 조추출물을 증류수 등에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매와 같은 극성 또는 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 극성 또는 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 얻어진 나한과 에탄올 조추출물(89.5 g)에 증류수를 가하여 현탁한 후 동량의 클로로포름을 가하여 클로로포름 층과 물 층으로 분리하였고, 이를 여과, 감압농축하여 클로로포름 분획물(17.0 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 물 층에 부탄올을 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물(22.7 g)을 수득하였고, 남은 물층을 농축하여 물 분획물(49.0 g)을 수득하였다.
또한 본 발명의 분획물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 수득한 것일 수도 있다(Harborne J.B. Plant Pathology, 1998, 3rd Ed. p6-7). 예컨대, 본 발명에 따른 나한과 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성분획물도 본 발명의 나한과 분획물에 포함된다.
상기 활성분획물은 분획물로부터 보다 높은 생리활성 등을 가지는 분획을 분리한 것으로, 활성분획 또는 유효분획물이라고도 한다. 계통분획과 같은 통상의 분획과정을 통해 수득한 여러 성분이 혼합되어 있는 분획물 가운데 농도구배 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 활성성분의 성질에 따라 분리해냄으로써 보다 강한 활성을 갖는 특정 활성분획물을 제조할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, LH-20, ODS 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획물을 분리 및 정제할 수 있고, 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 크로마토그래피를 사용함에 있어 용출용매, 용출 속도 및 용출시간은 당업계에서 일반적으로 사용하는 용매, 속도 또는 시간을 적용할 수 있으나, 구체적으로 물 및/또는 메탄올을 용출용매로 사용하여, 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 30분 내지 200분 간 용출시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 계통분획을 통해 수득한 분획물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(Sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 ㎛)을 장착한 후 각각의 메탄올 추출물을 5 g의 양으로 반복 로딩하였다. 용출용매로는 물/메탄올[10:90→100:0 (v/v)]를 사용하였으며, 용리 속도는 40 ㎖/분으로 하여 190분간 용출(분석)시킨 후 UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출한 결과, 5개의 클로로포름 활성분획물(MGS_C1 내지 C5), 6개의 부탄올 활성분획물(MGS_B1 내지 B6), 및 3개의 물 활성분획물(MGS_D1 내지 D3)을 수득하였고, 이 중 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3), 5번(MGS_B5), 6번(MGS_B6) 및 물 활성분획물 2번(MGS_D2)의 활성이 우수함을 확인하였다.
상기 나한과 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물은 트라이터펜계 화합물로서, 대표적인 예로 모그로사이드 Ⅳ(mogroside Ⅳ), 모그로사이드Ⅴ(mogroside Ⅴ), 시아메노사이드 Ⅰ(siamenoside Ⅰ), 11-옥소-모그로사이드 Ⅴ(11-oxo-mogroside Ⅴ) 등을 들 수 있다. 본 발명의 나한과로부터 상기 트라이터펜계 화합물들을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리가능하다. 보다 구체적으로는, 상기에서 수득되는 분획물 중 부탄올 활성분획물(MGS_B5)과 물 활성분획물(MGS_D2)으로부터 11-옥소-모그로시드 Ⅴ(11-oxo-mogroside Ⅴ, 화합물 1이라 명명함)와 모그로시드 Ⅴ(mogroside Ⅴ, 화합물 2이라 명명함)를 각각 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화합물들은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물들을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 화합물들은 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염의 형태로 만들어 사용할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 염증관련 인자로 알려진 IL-6, IL-1β 및/또는 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로써 염증성 질환의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다(실험예 2-1 및 2-2, 표 10 내지 12, 도 4).
본 발명에서 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 구체적으로 천식, 만성폐쇄성 폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 염증성 질환의 대표적인 질환으로서 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 및 천식의 예방 또는 치료효과를 확인하였다.
본 발명에서 용어, "천식"은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 바람직하게는 기관지성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "만성폐쇄성 폐질환(COPD)"은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환을 말한다. 만성폐쇄성 폐질환의 주된 증상은 만성적인 기침 또는 만성적인 가래(객담)을 비롯하여 호흡곤란 등이 있으며, 베타항진제, 항콜린제, 메틸잔틴계 등의 기관지 확장제 또는 부신피질 호르몬 흡입제 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 만성폐쇄성 폐질환은 바람직하게는 만성 기관지염(chronic bronchitis) 또는 폐기종(emphysema)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
뮤신 유전자 중에서 MUC5AC는 천식 및 COPD 환자에게서 발현이 현저히 증가되어 있어, 이들 질환의 중요한 표적인자로 여겨지고 있다. 이에 MUC5AC의 발현과 생성은 천식 및 만성폐쇄성 폐질환의 메커니즘을 규명하는데 중요한 요인으로서, 이를 억제하는 약물의 탐색 등을 통해 상기 질환을 예방 또는 치료하고자 하는 연구가 활발하다. 본 발명에서는 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물이 MUC5AC의 발현을 억제함을 확인하였다(실험예 2-3, 표 15 내지 17). 이는 본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 시사한다.
한편, Th2(helper T cell Type 2) 세포가 생산하는 사이토카인(cytokine)인 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5) 및 인터류킨-13(IL-13)은 기관지 천식의 중요한 매개 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Coyle AJ. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13(1): 54-9; Nakajima H. et al. 1992. Am. Rev. Respir. Dis. 146(2): 374-7; Wills-Karp, M. et al. 1998. Sci. 282(5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008).
구체적으로, 기관지 천식을 일으키는 항원은 1차적으로 대식세포에 의해 제거되고, 이 과정에서 활성화된 폐포의 대식세포가 B 세포를 자극하여 IgE를 생산하면, IgE는 비만세포를 활성화시키는 방법으로 초기 천식 반응을 담당한다. 이와 함께, 천식을 유발하는 항원에 노출된 B 세포는 CD4 T 세포를 자극하여 Th2 세포로 분화되고, 이 분화된 Th2 세포가 폐조직 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 내에서 IL-5 및 IL-13과 같은 사이토카인의 분비를 촉진하고, 이들 촉진된 사이토카인에 의하여 기관지 과민성과 기도 폐쇄가 유발되어 천식 반응이 일어난다고 알려져 있다.
따라서, 상기 IL-5 및 IL-13 등의 사이토카인의 분비를 억제시키거나 IgE의 분비를 억제시킴으로써 천식 반응을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 실험예에서는 ⅰ) 기관지 폐포 세척액으로부터 IL-5 및 IL-13의 생성량을 측정한 결과, IL-5 및 IL-13 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물의 투여군에서는 이들 인자들이 유의성있게 감소하였음을 확인하였고(실험예 3-4, 표 18), ⅱ) 혈청 내 및 난백알부민 특이 IgE의 분비량을 측정한 결과, 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물의 투여군에서는 유의성있게 감소하였음을 확인하였다(실험예 3-5, 표 19). 이는 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
또한, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물은, 기관지상피의 배상세포의 점액분비를 감소시킬 수 있음이 본 발명에 의해 확인되었다.
본 발명의 일 실험예로서, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 폐조직 내 염증을 관찰하고, PAS(periodic acid Schiff) 염색을 통해 기관지 내 점액분비량을 관찰한 결과, ⅰ) 천식유발군의 기관지 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물 투여군 모두에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨을 확인하였고(실험예 3-6, 도 7), ⅱ) 천식유발군에서는 기관지 상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물 투여군 모두에서 기관지 상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(실험예 3-6, 도 8). 이러한 결과 또한 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
결과적으로, 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 만성폐쇄성 폐질환, 천식 등을 포함한 염증성 질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 염증성 질환의 의심 개체는 상기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 약학적 조성물 및 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
[화학식 2]
Figure pat00006

상기 나한과, 이의 추출물, 분획물, 화학식 1 및 2의 화합물 및 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 염증성 질환과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 나한과 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 나한과 추출물 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, 염증관련 인자인 IL-6, IL-1β 및/또는 COX-2 유전자의 발현을 억제할 뿐만 아니라, MUC5AC 생성 억제, 기도과민성 경감, 기관지 내 염증세포 침윤 억제, 혈청과 기관지 폐포 세척액 내의 IgE 생성 억제, 및 폐에서의 Th2 사이토카인(IL-5 및 IL-13)의 발현 억제 효과가 우수하므로, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 나한과 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 MPLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 나한과 에탄올 추출물의 물 분획물을 MPLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC(Ultraperformance Liquid Chromatography)를 사용하여 MS(Mass Spectrometry)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC를 사용하여 PDA(Photodiode-Array detection)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC를 사용하여 CAD(Charged Aerosol Detectors)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 나한과의 추출, 분획, 활성분획물 및 화합물의 분리 전체적인 과정을 나타내낸 도이다.
도 3b는 나한과 부탄올 활성분획물 5번(MGS_B5) 및 물 활성분획물 2번(MGS_W2)으로부터 perp-HPLC(preaparative High-performance Liquid Chromatography)를 사용하여 DAD(Diode-Array detection)로 분리/정제한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 나한과 추출물의 RAW264.7 세포에서의 LPS로 유도된 염증관련 유전자의 억제효과를 나타낸 도이다. 가장 왼쪽 컬럼이 0.1% DMSO만 투여한 음성대조군; 그 오른쪽 컬럼이 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 양성대조군; 나머지 컬럼은 나한과 추출물을 농도별로 처리한 후, LPS로 염증을 유도한 실험군이다.
도 5는 기도 감작한 후 호흡률에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
NC: 기도 감작하지 않은 정상 대조군(음성대조군);
OVA; 난백 알부민으로 기도 감작한 천식 유도군(양성대조군);
Mon; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군; 및
나한과 에탄올 추출물(Total): 나한과 추출물을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B5): 나한과 부탄올 활성분획물 5번을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B6): 나한과 부탄올 활성분획물 6번을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 화합물 1(MGS_W02-01): 나한과로부터 분리한 화합물 11-O-모그로사이드 V(화학식 1)를 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 화합물 2(MGS_W02-02): 나한과로부터 분리한 화합물 모그로사이드 V(화학식 2)를 30 mg/kg 투여한 실험군
#: 정상 대조군 (NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
*: 천식 유도군 (OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
도 6은 기도 감작한 후, 기관지 폐포 세척액의 총 세포 수와 호산구 수에 대한 나한과 추출물, 부탄올 분획물 및 이로부터 분리한 화합물이 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7는 기도 감작한 후 기도점막 내 염증세포의 침윤정도를 H&E 염색으로 확인한 도이다.
도 8는 기도 감작한 후 마우스의 기관지 상피세포에서 배윤세포가 차지하는 정도를 PAS 염색으로 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 나한과 추출물, 분획물 및 활성분획물의 제조
본 발명자들은 광서성 계림시 영복현에서 채집하여 건조시킨 나한과를 화평 디엔에프를 통해 확보하였다. 나한과(2 kg)를 건조기(50-55℃)를 자연건조(음건) 사용하여 수분을 제거한 후 약 1 cm의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 에탄올 10 ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 나한과 에탄올 추출물 89.5 g을 수득하였다. 이후의 실험에서는 상기 수득된 나한과 에탄올 추출물을 총(total) 추출물로 명명하였다.
상기 얻어진 나한과 에탄올 조추출물(89.5 g)에 증류수를 가하여 현탁한 후 동량의 클로로포름을 가하여 클로로포름 층과 물 층으로 분리하였고, 이를 여과, 감압농축하여 클로로포름 분획물(17.0 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 물 층에 부탄올을 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물(22.7 g)을 수득하였고, 남은 물층을 농축하여 물 분획물(49.0 g)을 수득하였다.
이후, 상기 분획물로부터 활성분획물을 분리·제조하기 위해 MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(Sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 ㎛)을 장착한 후 각각의 메탄올 추출물을 5 g의 양으로 반복 로딩하였다. 이때, 용매로는 물/메탄올[10:90→100:0 (v/v)]를 사용하고, 용리 속도는 40 ㎖/분이었으며, UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출하였다. 분석 시간은 190분으로 하여 각각, 5개의 클로로포름 활성분획물(MGS_C1-C5), 6개의 부탄올 활성분획물(MGS_B1-B6), 및 3개의 물 활성분획물을 수득하였다.(표 1 내지 3, 및 도 1a 내지 도 1c).
나한과 클로로포름층 분석시간 (min) 무게 (g) 조건
MGS_C1 0-115 2.79 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH
MGS_C2 115-135 2.68
MGS_C3 135-160 2.79
MGS_C4 160-175 2.52
MGS_C5 175-190 1.91
나한과 부탄올층 분석시간 (min) 무게 (g) 조건
MGS_B1 0-25 2.03 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH
MGS_B2 25-35 0.25
MGS_B3 35-45 0.54
MGS_B4 45-70 0.86
MGS_B5 70-115 2.29
MGS_B6 115-190 0.44
나한과 물층 분석시간 (min) 무게 (g) 조건
MGS_W1 0-105 12.52 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH
MGS_W2 105-140 1.23
MGS_W3 140-190 0.30
실시예 1: 나한과 추출물, 분획물의 분석
상기 제조예 1에서 수득한 나한과 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 활성분획을 조사하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 UPLC(ultra performance liquid chromatography)로 분석하였다.
먼저, UPLC 분석을 위해 상기 제조예 1에서 수득한 나한과 에탄올 추출물 89.5 g 및 분획물을 UPLC용 0.25 mm 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. UPLC 기기(Waters UPLC-QTOF-MS)에 칼럼(Waters BEH C18 column, 2.1 × 100 mm, 1.7 ㎛m)을 장착한 후 여과된 각각의 분획물을 5 ㎕ 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산/물 + 0.1% 포름산 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 0.4 ㎖/분이었으며, UV 254 nm의 파장과 CAD(Charged Aerosol Detectors), MS(Mass Spectrometry)에서 검출하였다(도 2a 내지 도 2c).
제조예 2: 나한과 활성분획물로부터 화합물의 분리
상기 제조예 1에서 수득한 나한과 분획물로부터 활성 단일화합물을 분리하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 prep-HPLC(preparative High-performance Liquid Chromatography)로 분리 및 정제하였다.
먼저, prep-HPLC 분리하기 위해 제조예에서 수득한 나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B5) 및 물 활성분획물(MGS_W2)을 HPLC용 0.45 mm 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. prep-HPLC 기기(Gilson HPLC)에 칼럼(Shiseido column, 2.0 × 250 mm, 5 ㎛)을 장착한 후 여과된 각각의 활성분획물을 400 ㎕ 양(약 1 g/10 mL)으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 메탄올/물 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 14 ㎖/분이었으며, DAD(Diode-Array detection)에서 검출하여 각각의 활성분획물로부터 화합물 1(MGS_W2-01, 11-O-mogroside V), 화합물 2(MGS_W2-02, mogroside V)를 분리 및 정제하였다(도 3a 및 3b).
실험예 1: 나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 세포독성 평가
실험예 1-1: Raw264 .7 세포에서의 세포독성 평가
생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 5% 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)에 1×105 cells/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰-플레이트에 접종하여 4시간 동안 부착하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 농도별로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 5 mg/㎖의 MTT 용액을 웰당 10 ㎕씩 첨가한 후 4시간 추가로 배양하였고, 상등액을 제거하고 DMSO를 100 ㎕씩 첨가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였고 그 결과를 하기 표 4 내지 6에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure pat00007
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.00 ± 3.31
에탄올
추출물
(total)		 5 92.87 ± 7.11
10 95.06 ± 4.70
20 91.44 ± 0.34
40 90.17 ± 4.90
80 79.68 ± 2.14
클로로폼
(CHCl3)
분획물
 5 85.65 ± 1.03
10 95.82 ± 12.58
20 89.17 ± 1.87
40 95.79 ± 3.37
80 97.39 ± 3.56
부탄올
(BuOH)
분획물		 5 89.03 ± 3.52
10 85.30 ± 1.61
20 90.98 ± 4.97
40 95.50 ± 11.44
80 92.12 ± 11.78
물
(H2O)
분획물		 5 87.09 ± 1.61
10 84.54 ± 6.35
20 86.57 ± 4.17
40 97.55 ± 11.44
80 96.50 ± 0.92
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.00 ± 4.13
부탄올 추출물 20 96.13 ± 0.05
40 96.32 ± 2.04
부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)		 20 93.36 ± 2.47
40 96.70 ± 4.18
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 20 99.96 ± 1.93
40 96.51 ± 4.88
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 20 94.69 ± 0.91
40 96.28 ± 0.80
물
활성분획물 2번
(MGS_W2)		 20 95.37 ± 2.09
40 97.72 ± 1.34
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.00 ± 4.38
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 10 99.12 ± 0.30
20 94.79 ± 0.95
40 92.11 ± 4.35
80 99.06 ± 0.62
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 10 98.14 ± 2.72
20 97.96 ± 0.66
40 97.95 ± 0.87
80 96.99 ± 1.12
표 4 내지 표 6에 나타난 바와 같이, 나한과 추출물 및 분획물의 농도에 따른 대식세포의 세포생존율을 조사해본 결과, IC50의 값이 모두 80 ㎍/㎖ 이상임을 확인하였고, 나한과 추출물 또는 분획물로부터 분리한 화합물 또한 대식세포의 세포생존율에 대한 독성이 없음을 확인하였다.
실험예 1-2: H92 세포에서의 세포독성 평가
인간의 폐암점막세포인 H292 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI 배지(Gibco)에 5×104 cells/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰-플레이트에 접종하여 12시간 동안 부착하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 농도별로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 세포 수를 셀 수 있는 CCK-8(Dojindo) 키트에서 설명한 대로, 배지 90 ㎕에 CCK-8 용액을 10 ㎕ 혼합하여 웰당 100 ㎕씩 첨가하였고, 최소 30분에서 최대 4시간까지 반응시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 상기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 7 내지 표 9에 나타낸 바와 같다.
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.00 ± 7.83
에탄올
추출물
(total)		 5 95.08 ± 2.15
10 97.89 ± 2.47
20 98.13 ± 3.54
40 109.14 ± 1.92
클로로폼
(CHCl3)
분획물		 5 94.20 ± 1.03
10 100.24 ± 5.09
20 101.93 ± 4.43
40 107.49 ± 8.65
부탄올
(BuOH)
분획물		 5 90.16 ± 1.90
10 91.93 ± 2.24
20 96.26 ± 2.71
40 110.24 ± 5.94
물
(H2O)
분획물		 5 93.42 ± 2.87
10 95.18 ± 2.66
20 94.08 ± 1.74
40 96.93 ± 6.62
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.09 ± 4.87
부탄올 추출물 20 110.83 ± 7.74
40 111.44 ± 3.44
물 추출물 20 107.91 ± 3.27
40 105.60 ± 5.85
부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)		 20 116.27 ± 0.05
40 118.13 ± 11.27
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 20 114.48 ± 8.77
40 113.38 ± 1.03
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 20 119.59 ± 8.09
40 114.60 ± 1.72
물
활성분획물 2번
(MGS_W2)		 20 113.38 ± 1.03
40 115.09 ± 3.10
시료 농도
(㎍/ml)		 세포생존율
(%, 평균±편차)
음성대조군 0 100.09 ± 4.87
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 10 101.95 ± 4.82
20 98.91 ± 4.30
40 97.81 ± 0.34
80 97.32 ± 3.44
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 10 98.18 ± 0.86
20 98.78 ± 3.44
40 98.05 ± 2.41
80 93.07 ± 4.99
표 7 내지 표 9에 나타난 바와 같이, 나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 농도에 따른 H292 세포의 세포생존율을 조사해본 결과, 세포독성이 없음을 확인하였다.
실험예 2: 나한과 추출물 및 분획물의 항염증 효과 분석
실험예 2-1: IL -6 생성 억제활성
나한과 추출물 등의 항염효과를 분석하기 위하여, LPS를 처리한 Raw264.7 세포에서의 나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증관련 인자 생성 저해효과를 확인하였다.
구체적으로 LPS로 유도된 IL-6의 생성량을 효소면역학적 분석키트(mouse IL-6 Duoset ELISA development system, R&D systems, USA)를 이용하여 측정하였다. 웰-플레이트에 Raw264.7 세포를 1×105 cells/ml의 농도로 분주하여 4시간 내지 16시간 동안 부착시킨 후, 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 각 농도별로 1시간 동안 처리하였다. LPS를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 6시간 또는 20시간 동안 배양시킨 후 상등액을 회수하였다. IL-6 항체가 코팅된 면역플레이트(Immuno-plate)에 분주하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 세척을 하고 제2차 항체를 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 재세척한 후 Streptavidin-HRP를 20분간 반응시킨 다음, 세척 후, 기질을 넣고 20분간 반응시킨 후, 황산용액으로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 측정기로 450 nm에서 발색 정도를 측정하였다.
시료 농도
(㎍/ml)		 LPS IL-6
(pg/ml, 평균±편차)		 저해율(%)
음성대조군 0 - -2.88 ± 2.42 -
LPS처리군 0 + 241.33 ± 14.38 -
에탄올
추출물
(total)		 5 + 224.13 ± 0.41 7.13
10 + 222.29 ± 2.89 7.89
20 + 234.96 ± 1.00 2.64
40 + 248.96 ± 22.21 -3.16
80 + 175.54 ± 2.18 27.26
클로로폼
(CHCl3)
분획물		 5 + 213.96 ± 6.31 11.34
10 + 226.08 ± 13.32 6.32
20 + 193.42 ± 3.18 19.85
40 + 186.58 ± 13.79 22.69
80 + 145.00 ± 9.19 39.92
부탄올
(BuOH)
분획물		 5 + 206.46 ± 9.96 14.45
10 + 179.33 ± 13.08 25.69
20 + 147.29 ± 8.78 38.97
40 + 121.58 ± 18.03 49.62
80 + 69.67 ± 8.49 71.13
물
(H2O)
분획물		 5 + 225.58 ± 4.36 6.53
10 + 200.08 ± 7.07 17.09
20 + 202.63 ± 28.11 16.04
40 + 196.42 ± 5.30 18.61
80 + 177.38 ± 11.25 26.50
시료 농도
(㎍/ml)		 LPS IL-6
(pg/ml, 평균±편차)		 저해율(%)
음성대조군 0 - -40.56 ± 2.51 -
LPS처리군 0 + 277.06 ± 5.58 -
부탄올 분획물 20 + 193.72 ± 17.83 30.08
40 + 88.00 ± 5.81 68.24
부탄올
활성분획물 1번
(MGS_B1)		 20 + 315.33 ± 9.27 -13.82
40 + 261.28 ± 9.35 5.69
부탄올
활성분획물 2번
(MGS_B2)		 20 + 137.11 ± 1.26 50.51
40 + 269.67 ± 3.30 2.67
부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)		 20 + 52.67 ± 5.66 80.99
40 + 55.11 ± 0.16 80.11
부탄올
활성분획물 4번
(MGS_B4)		 20 + 193.44 ± 16.18 30.18
40 + 251.06 ± 3.38 9.38
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 20 + 240.33 ± 10.21 13.25
40 + 295.44 ± 17.44 -6.64
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 20 + -39.67 ± 2.67 114.32
40 + -40.06 ± 0.24 114.46
물
활성분획물 2번
(MGS_W2)		 20 + 50.89 ± 2.36 81.63
40 + 42.06 ± 4.48 84.82
시료 농도
(㎍/ml)		 LPS IL-6 (pg/ml,
평균±편차)		 저해율(%)
음성대조군 0 - -36.61 ± 2.75 -
LPS처리군 0 + 187.33 ± 6.76 -
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 20 + 172.17 ± 8.25 8.15±4.40
40 + 162.50 ± 0.71 13.31±0.38
80 + 93.83 ± 10.14 49.94±5.41
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 20 + 189.50 ± 7.15 -1.10±3.81
40 + 185.78 ± 10.21 0.89±5.45
80 + 65.78 ± 7.07 64.91±3.77
그 결과 상기 표 10 내지 표 12에서 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 군에서 IL-6의 발현양이 증가하였으나, 나한과 추출물, 분획물, 및 화합물의 농도에 따라 점차 감소하였음을 확인하였다. 특히 80 ㎍/㎖의 부탄올 분획물을 처리한 군에서 71.13%의 상당한 IL-6의 생성저해율을 나타내었음을 확인하였다. 또한, 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)에서 약 80%, 부탄올 활성분획물 6번(MGS_B6)에서 약 114%의 상당한 IL-6의 생성저해율을 나타내었음을 확인하였고, 분리한 화합물(MSG_W2-01, MSG_W2-02) 또한 80 ㎍/㎖의 농도에서 각각 49.9%, 64.9%의 IL-6 생성저해율을 보였다.
실험예 2-2: IL -6, IL -1β 및 COX -2의 유전자 발현 억제활성
트리졸(TrizolTMreagent , Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 처리된 세포로부터 리보핵산(RNA)을 추출하였다. 정량 후, Omniscript RT kit(Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 상보적 핵산(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형과 하기 표 13에 나타낸 IL-6, IL-1β, COX-2 및 β-actin 프라이머를 각각 혼합하고, PCR mix(DreamTaqTM PCR Master Mix, Fermentas, USA)를 사용하여 94℃에서 5분간 변성(Denaturation)을 하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30 사이클(cycle)을 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다. 대조군(내부 표준)으로는 β-actin(bioneer, 한국)을 사용하였다.
유전자 프라이머
IL-6 sense 5`-AAC GAT GAT GCA CTT GCA GA-3` 서열번호 1
antisense 5`-GAG CAT TGG AAA TTG GGG TA-3` 서열번호 2
IL-1β sense 5`-GTG TCT TTC CCG TGG ACC TT-3` 서열번호 3
antisense 5`-TCG TTG CTT GGT TCT CCT TG-3` 서열번호 4
COX-2 sense 5’-GAA GTC TTT GGT CTG GTG CCT G -3’ 서열번호 5
antisense 5’-GTC TGC TGG TTT GGA ATA GTT GC-3’ 서열번호 6
β-actin sense 5`-TGT TTG AGA CCT TCA ACA CC-3` 서열번호 7
antisense 5`-CGC TCA TTG CCG ATA GTG AT-3` 서열번호 8
그 결과, LPS 처리에 따라 상기 유전자들의 발현이 증가하였으나, 나한과 추출물, 분획물 및 화합물의 농도에 따라 점차 감소하였음을 확인하였다. 특히, 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)에서 IL-6, IL-1β 및 COX-2의 발현이 급격히 감소함을 확인하였다(도 4).
실험예 2-3: MUC5AC 생성 억제활성 - 만성폐쇄성 폐질환
나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 만성폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료효과를 분석하기 위하여, 나한과 추출물, 분획물 및 화합물의 MUC5AC 생성 저해 효과를 확인하였다.
구체적으로, TNF-α로 유도된 MUC5AC의 생성량 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR, quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)과 MUC5AC 면역분석(immunoassay)을 이용하여 측정하였다. 세포준비는 48 웰-플레이트에 H292세포를 2×104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후, 0.1 % FBS를 포함한 배지로 교체하여 24 시간을 배양하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 각 농도별로 2시간 동안 처리하였고, TNF-α를 20 ng/㎖ 의 농도로 처리하고, 12시간 배양하였다.
Total RNA를 추출하기 위해서 TrizolB(invitrogen)을 사용하여 리보핵산(RNA)을 추출하였고, 정량 후, Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 상보적 핵산(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형과 하기 표 5에 나타낸 MUC5AC 및 GAPDH 프라이머를 각각 혼합하고, PCR mix(PCR Master Mix, Bioneer, Korea)를 사용하여 94℃에서 5분간 변성(Denaturation)을 하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 50초, 72℃에서 45초로 30 사이클(cycle)을 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다(표 14).
유전자 프라이머
MUC5AC sense 5`-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3` 서열번호 9
antisense 5`-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3` 서열번호 10
GAPDH sense 5`-CGG AGT CAA CGG ATTT GGT CGT AT -3` 서열번호 11
antisense 5`-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3` 서열번호 12
생성된 MUC5AC의 면역분석(immunoassay)을 위해서 회수한 상등액 50 uL를 96 웰-플레이트에 분주하고 50℃로 설정된 항온기에서 건조시켰다. PBS로 세척한 다음, MUC5AC 항체(abcam사)와 상온에서 반응하고, 2차 항체를 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 재세척한 후 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine peroxide solution를 20분간 반응시킨 다음, 황산용액으로 반응을 정지시킨후, 마이크로플레이트 측정기로 450 nm에서 발색 정도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 15 내지 17에 나타내었다.
시료 농도
(㎍/ml)		 TNF-α MUC5AC mRNA
발현양
(TNF-α처리군에 대한 상대적인 %)		 저해율(%)
음성대조군 0 - 18.58 ± 1.18 81.80
TNF-a처리군 0 + 100.38 ± 23.40 0.00
에탄올
추출물
(total)		 5 + 85.42 ± 0.41 14.96
10 + 55.12 ± 6.47 45.26
20 + 49.25 ± 4.10 51.13
40 + 24.01 ± 8.85 76.37
클로로폼
(CHCl3)
분획물		 5 + 250.82 ± 6.15 -150.44
10 + 519.36 ± 15.27 -418.98
20 + 542.60 ± 53.10 -442.22
40 + 87.73 ± 28.71 12.65
부탄올
(BuOH)
분획물		 5 + 96.10 ± 16.87 4.28
10 + 67.90 ± 1.33 32.48
20 + 61.19 ± 1.12 39.19
40 + 67.72 ± 8.94 32.66
물
(H2O)
분획물		 5 + 66.73 ± 4.25 33.65
10 + 49.83 ± 0.49 50.55
20 + 32.22 ± 10.69 68.16
40 + 20.81 ± 0.71 79.57
시료 농도
(㎍/ml)		 TNF-α MUC5AC 분비
(TNF-a처리군에 대한
상대적인 %)		 저해율(%)
　음성대조군 0 - 43.70 ± 6.01 56.3
TNF-α 처리군　 0 + 100.00 ± 9.66 0
에탄올 추출물 20 + 73.60 ± 1.07 26.4
40 + 64.95 ± 1.72 35.05
부탄올 분획물 20 + 83.46 ± 5.58 16.54
40 + 71.93 ± 7.73 28.07
물 분획물 20 + 85.58 ± 0.43 14.42
40 + 67.22 ± 0.24 32.78
부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)		 20 + 103.79 ± 12.88 -3.79
40 + 64.95 ± 2.15 35.05
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 20 + 82.40 ± 1.93 17.6
40 + 79.36 ± 0.64 20.64
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 20 + 122.76 ± 0.64 -22.79
40 + 147.04 ± 2.79 -47.04
물
활성분획물 2번
(MGS_W2)		 20 + 77.54 ± 1.50 22.46
40 + 74.51 ± 0.64 25.49
시료 농도
(㎍/ml)		 TNF-α MUC5AC
(TNF-a처리군에 대한 상대적인 %)		 저해율(%)
　음성대조군 0 - 43.70 ± 6.01 56.3
TNF-α처리군 0 + 100.00 ± 9.66 0
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 5 + 93.02 ± 0.21 6.98
10 + 82.25 ± 6.01 17.75
20 + 81.03 ± 2.15 18.97
40 + 79.06 ± 1.93 20.94
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 5 + 101.97 ± 4.72 -1.97
10 + 94.39 ± 1.29 5.61
20 + 83.92 ± 7.08 16.08
40 + 88.77 ± 1.93 11.23
그 결과 상기 표 15 내지 17에서 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 군에서 MUC5AC의 양이 증가하였고, 모든 시료물질(나한과 추출물, 분획물, 및 이로부터 분리한 화합물 1, 2)의 농도에 따라 발현양이 감소하였음을 확인하였다.
특히, (i) 표 15에서 물 분획물을 40㎍/㎖을 처리한 군에서 약 79.57%의 TNF-a의 생성저해율을 나타내었고, (ii) 표 16의 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)을 40㎍/㎖ 처리한 군에서 약 35.05%, 물 활성분획물 2번(MGS_W2)을 40㎍/㎖ 처리한 군에서 약 25.49%의 TNF-a의 생성저해율을 나타내었다.
실험예 3: 나한과 추출물 및 분획물의 항천식 효과 분석
실험예 3-1: 실험동물 및 난백 알부민으로 기관지 천식 유도
본 발명에서는 평균 체중 20 g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였다. 1주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하였다. 순화기간을 거친 생쥐에게 2주 간격으로 2 mg수산화알루미늄(A8222, Sigma, St. Louis, MO)과 난백알부민 20 μg(A5503, Sigma, St. Louis, MO)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 ㎕를 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 21일부터 23일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기를 이용하여 30분간 흡입시켰다. 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고, 48시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈(엔토발, 한림제약주식회사)을 투여한 뒤, 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 ㎖의 생리식염수로 기관지폐포세척을 실시하여 검체를 수거하였다.
실험군은 정상대조군(NC, 난백알부민 투여 및 흡입하지 않은 군), 천식유발군(OVA, 난백알부민 투여 및 흡입한 군), 양성대조군비교군(Mon, 난백알부민 흡입 1시간 전에 montelukast 30mg/kg, 을 경구투여한 군, 실험군으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 나한과 에탄올추출물(Total), 부탄올 활성분획물(MGS_B5, MGS_B6), 나한과에서 분리한 11-O-mogroside V(MGS_W02-01) 또는 mogroside V(MGS_W02-02)를 30 mg/kg의 용량으로 경구투여한 군으로 실험을 진행하였으며, 각 군당 7두의 흰쥐를 사용하였다.
약물 및 시료는 첫 번째 난백알부민 투여 후 21일부터 23일까지 경구투여 하였으며. 각 군당 7 두의 생쥐를 사용하였다. 실험 종료 후 각 군 생쥐의 혈액, 폐세척액 및 폐조직을 분리하였다.
실험예 3-2: 기도과민성 ( Airway hyperresponsiveness ) 측정
천식 발생에 의한 기도과민성을 측정하기 위해 일실체적변동기록기(one chamber plethysmography, All Medicus, Korea)를 이용하였다. 기도 저항의 정도는 수학적으로 계산된 기도의 폐색을 반영하는 수치인 enhaced pause(Pehn)을 측정하여 평가하였다. Pehn의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후, PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린(A2251, Sigma-Aldrich)을 12, 25, 50 mg/㎖의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh 값을 측정하였다. 수치는 하기 수학식 2에 나타난 바와 같이 계산하였고, 기저 Penh값(PBS chanllenge)을 100%로 하여, 각 농도의 메타콜린 흡입 후 Penh의 증가율을 백분율로 표현하였다.
[수학식 2]
Figure pat00008

Te : expiratory time(sec)(흡기에서 다음 흡기까지 걸리는 시간)
RT : relaxation time(호기동안 호기양이 일회호흡양의 30%가 남을 때까지 걸리는 시간)
PEF : Peak expiration flow
PIF : Peak inspiration flow
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 난백알부민을 처리한 천식 동물모델에서 천식유도군(OVA)은 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 정상대조군에 비하여 기도과민성이 크게 증가하였다. 반면, 양성대조군인 montelukast 투여군은 천식유도군에 비해 기도과민성이 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 감소하였다. 또한 상기 모든 실험군(시료물질 투여군)에서 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 천식유발군에 비해 현저한 기도과민성의 감소가 관찰되었으며, 이러한 효과는 특히 나한과 추출물, 부탄올 활성분획물(MGS_B5), mogroside V (MGS_W02-02) 투여군에서 크게 관찰되었다.
실험예 3-3: 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 분석
호산구의 증가는 천식에 있어 주요한 특징 중에 하나인 바, 이를 측정하기 위하여, 하기와 같이 실시하였다. 상기 실험예 3-1에서 수득한 각 개체의 기관지 폐포 세척액은 회수된 즉시 트리판블루(Trypan Blue)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 계산한 다음 사이토스핀(Cytospin, Hanil, Korea)을 이용하여 세포를 슬라이드에 부착시킨 후, Diff-Quik 염색 (Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경을 통해 검경한 후, 각 샘플별 염증세포 수를 세었다.
그 결과, 천식유도군에서는 정상대조군에 비해 호산구를 비롯한 염증세포의 수가 크게 증가하였다. 반면, 나한과 추출물 등의 모든 시료물질 투여군에서 염증세포 및 호산구의 현저한 감소가 관찰되었다(도 6).
실험예 3-4: 기관지 폐포세척액 ( BALF ) 내 사이토카인 분석
상기 실시예 2의 각 개체에서 분리한 기관지 폐포세척액에서 Th2 타입-사이토카인인 인터루킨(IL-5, IL-13)의 생성량을 시판용 효소면역분석(Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) 키트(R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 사이토카인의 분석은 제조사의 실험방법에 따라 실시하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, USA)기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 18과 같다.
Group IL-5 IL-13
생성량 (pg/mL) 억제율 (%) 생성량 (pg/mL) 억제율 (%)
정상대조군(NC) 26.4±4.40 - 21.1±1.35 -
천식유도군(OVA) 43.2±5.99# - 43.7±7.31# -
양성대조군(Mon) 35.6±9.60 17.5 37.8±5.15 13.5
나한과 추출물
(Total)		 29.6±8.30* 31.5 28.0±2.15* 36.0
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 31.3±7.45* 27.5 33.0±5.18* 24.5
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 32.7±6.00* 24.3 36.3±6.35 17.1
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 23.6±2.62* 45.5 34.0±5.86* 22.2
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 32.7±3.54* 24.4 34.0±3.75* 22.2
#정상 대조군 (NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
*천식 유도군 (OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
그 결과, 표 18에서 나타낸 바와 같이, Th2 타입의 사이토카인인 IL-5 및 IL-13은 천식유발군에서 정상군에 비해 현저하게 증가하였다. 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군과 모든 시료물질 투여군은 Th2 사이토카인이 천식유발군에 비해 크게 억제되었다.
실험예 3-5: 혈청내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 측정
난백알부민 특이 IgE의 측정을 위하여 ELISA법을 이용하였다. 난백알부민 특이 IgE는 96-well flat bottom ELISA plate에 난백알부민을 20 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M NaHCO3 완충액(pH 8.3)에 녹여 4℃에서 overnight 코팅시켰다. 그 후 1% bovine serum albumin(BSA)이 함유된 PBS로 비특이 반응을 억제시켰다. 혈청 검체는 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척하였다. 잘 세척한 후 항-마우스 IgE 단일클론성 항체(anti-mouse IgE monoclonal antibody)를 300배 희석하여 2시간 반응시켰다. 그 후, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 항-래트 IgG 다중클론성 항체(HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal Antibody)를 4000 배 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 발색은 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrate로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 19과 같다.
Group 난백알부민 특이 IgE
생성량 (pg/mL) 억제율 (%)
정상대조군(NC) - -
천식유도군(OVA) 188.7±47.24 -
양성대조군(Mon) 143.5±49.25 24.0
나한과 추출물(Total) 130.4±30.14 30.9
부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)		 123.1±51.95 34.8
부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)		 117.0±39.22 38.0
화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)		 147.2±57.27 22.0
화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)		 124.9±40.49 33.8
그 결과, 표 19에서 나타낸 바와 같이, 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)는 천식유발군에서 정상군에 비해 크게 증가하였으며, 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군은 천식유발군에 비해 현저하게 감소되었다. 한편 나한과 추출물 등의 모든 시료물질 투여군에서 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)가 현저히 감소하였다.
실험예 3-6: 조직병리학적 검사
폐조직의 염증정도를 평가하기 위하여, 적출된 폐조직은 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4μm 두께로 영구조직 절편을 제작하였다.
이후, (1) 폐조직내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, (2) 기관지내 점액분비는 천식이 유발된 경우 현저하게 증가되므로, 이를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc., USA) 염색을 수행하였다. 광학현미경을 이용하여 폐조직의 병리학적 변화를 검경하였다.
(1) 폐조직 내 염증반응을 관찰한 결과, 천식유발군의 폐조직의 기도 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 기도 감작되지 않은 정상대조군보다 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서 상피세포가 손상되어 있었으며, 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었다. 반면, montelukast 투여군에서는 이러한 염증세포의 침윤의 감소가 인정되었으며, 또한 나한과 추출물(Total)을 비롯한 모든 시료물질 투여군에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨이 확인되었다. 이러한 감소는 montelukast 투여군과 비교하여 볼 때, 유사하게 관찰되었다(도 7).
(2) 기관지내 점액분비 결과를 관찰한 결과, 천식유발군에서는 기관지상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 점액분비가 감소되었고, 또한 나한과 추출물(Total)을 비롯한 모든 시료물질 투여군에서, 기관지상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 8).
이상의 결과를 통해 본 발명에 따른 나한과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물이 천식의 억제 활성을 보유함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Hwapyung D&F Co., Ltd <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment inflammatory diseases comprising Siraitia grosvenori extract or fractions thereof, or compounds isolated from therefrom <130> KPA140044-KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 sense primer <400> 1 aacgatgatg cacttgcaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 antisense primer <400> 2 gagcattgga aattggggta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b sense primer <400> 3 gtgtctttcc cgtggacctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b antisense primer <400> 4 tcgttgcttg gttctccttg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 sense primer <400> 5 gaagtctttg gtctggtgcc tg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 antisense primer <400> 6 gtctgctggt ttggaatagt tgc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin sense primer <400> 7 tgtttgagac cttcaacacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin antisense primer <400> 8 cgctcattgc cgatagtgat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC sense primer <400> 9 tgatcatcca gcagcagggc t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC antisense primer <400> 10 ccgagctcag aggacatatg gg 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 11 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 12 agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims (20)

  1. 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00009

    [화학식 2]
    Figure pat00010

  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올로 추출한 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 추가적으로 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매를 용출용매로 사용하여 분리한 활성분획물인 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 활성분획물은 물과 메탄올의 혼합용매의 농도구배를 90:10 → 0:100 으로 하여 수득한 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 활성분획물은 상기 용출용매를 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 35분 내지 190분간 용출시켜 수득한 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 IL-6, IL-1β, COX-2 및 MUC5AC의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.및 MUC5AC의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00011

    [화학식 2]
    Figure pat00012

  13. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올로 추출한 것인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 추가적으로 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매를 용출용매로 사용하여 분리한 활성분획물인 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 활성분획물은 물과 메탄올의 혼합용매의 농도구배를 90:10 → 0:100 으로 하여 수득한 것인 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 활성분획물은 상기 용출용매를 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 35분 내지 190분간 용출시켜 수득한 것인 조성물.
  20. 제12항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성 폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.
KR1020140058301A 2014-05-15 2014-05-15 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR101710091B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140058301A KR101710091B1 (ko) 2014-05-15 2014-05-15 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140058301A KR101710091B1 (ko) 2014-05-15 2014-05-15 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150132654A true KR20150132654A (ko) 2015-11-26
KR101710091B1 KR101710091B1 (ko) 2017-02-28

Family

ID=54847249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140058301A KR101710091B1 (ko) 2014-05-15 2014-05-15 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101710091B1 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018186705A1 (ko) * 2017-04-05 2018-10-11 한국 한의학 연구원 나한과 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101959205B1 (ko) * 2017-09-13 2019-03-19 한국 한의학 연구원 나한과 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
CN109602757A (zh) * 2019-01-11 2019-04-12 桂林医学院附属医院 罗汉果苷iie在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用
WO2020027574A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 한국 한의학 연구원 나한과 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102173528B1 (ko) * 2020-02-28 2020-11-03 주식회사 바른 섭취가 가능한 타블렛 또는 분말형 구강청결제 조성물
CN114404315A (zh) * 2022-01-17 2022-04-29 上海澄穆生物科技有限公司 11-o-罗汉果皂苷v及其药学上可接受的盐作为cb2受体激动剂在化妆品中的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108653672A (zh) * 2018-07-06 2018-10-16 涂世红 一种治疗慢性***的中药灌肠剂及其临床应用方法
CN108671186A (zh) * 2018-07-06 2018-10-19 涂世红 一种治疗慢性***的中药灌肠剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100773856B1 (ko) * 2006-06-02 2007-11-06 주식회사 바이오랜드 나한과 추출물 또는 이로부터 분리된 트라이터펜계화합물을 함유하는 주름개선용 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5187935B2 (ja) * 2007-08-31 2013-04-24 学校法人星薬科大学 羅漢果エキスを含有する創傷治癒促進組成物と適用方法
GB0718446D0 (en) * 2007-09-21 2007-10-31 Prendergast Patrick T Compositions and methods for the treatment of infection
US20120141386A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Oraceuticals, Inc. Application of Antimicrobial and Glycemic Control Activities of Lo Han Kuo Fruit (Siraitia grosvenorii)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100773856B1 (ko) * 2006-06-02 2007-11-06 주식회사 바이오랜드 나한과 추출물 또는 이로부터 분리된 트라이터펜계화합물을 함유하는 주름개선용 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chinese journal of natural medicines, 2014, 12(2), 89-102* *
Journal of agricultural and food chemistry, 2011, 59(13), 7474-7481* *
Journal of functional foods, 2009, 1(2), 145-152* *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018186705A1 (ko) * 2017-04-05 2018-10-11 한국 한의학 연구원 나한과 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101959205B1 (ko) * 2017-09-13 2019-03-19 한국 한의학 연구원 나한과 잔사 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2020027574A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 한국 한의학 연구원 나한과 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
CN112367859A (zh) * 2018-07-31 2021-02-12 韩国韩医学研究院 包含罗汉果提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸***疾病的组合物
JP2021528107A (ja) * 2018-07-31 2021-10-21 コリア・インスティトゥート・オブ・オリエンタル・メディスン 羅漢果抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物
CN109602757A (zh) * 2019-01-11 2019-04-12 桂林医学院附属医院 罗汉果苷iie在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用
KR102173528B1 (ko) * 2020-02-28 2020-11-03 주식회사 바른 섭취가 가능한 타블렛 또는 분말형 구강청결제 조성물
WO2021172692A1 (ko) * 2020-02-28 2021-09-02 주식회사 바른 섭취가 가능한 타블렛 또는 분말형 구강청결제 조성물
KR20210110163A (ko) * 2020-02-28 2021-09-07 주식회사 바른 섭취가 가능한 타블렛 또는 분말형 구강청결제 조성물
US11464715B2 (en) 2020-02-28 2022-10-11 Bareun Co., Ltd. Ingestible tablet or powder type oral cleaning composition
CN114404315A (zh) * 2022-01-17 2022-04-29 上海澄穆生物科技有限公司 11-o-罗汉果皂苷v及其药学上可接受的盐作为cb2受体激动剂在化妆品中的应用
CN114404315B (zh) * 2022-01-17 2023-12-08 上海澄穆生物科技有限公司 11-o-罗汉果皂苷v及其药学上可接受的盐作为cb2受体激动剂在化妆品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR101710091B1 (ko) 2017-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101710091B1 (ko) 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP6132942B2 (ja) 多量の有効成分を含有するシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された精製抽出物、その調製、ならびに有効成分としてそれを含む炎症、アレルギーおよび喘息の予防または治療用組成物
JP6623253B2 (ja) ピスタキア ウェインマニフォリア抽出物、その分画物またはこれらから分離された化合物を含む慢性閉塞性肺疾患（ｃｏｐｄ）の予防または治療用薬学的組成物
KR102006738B1 (ko) 쥐꼬리망초 추출물을 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101160488B1 (ko) 참나리 추출물을 함유하는 염증성 질환 및 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물
US8980846B2 (en) Composition containing styraxlignolide A or the aglycone thereof as an active ingredient for preventing or treating asthma
KR102410678B1 (ko) 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 생약 조성물
KR101761285B1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물
AU2014309569B2 (en) Composition containing monoacetyldiacylglycerol compound as active ingredient for preventing or treating chronic obstructive pulmonary diseases
KR20190043996A (ko) 국화 추출물 및 황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101604347B1 (ko) 피스타시아 웨인마니폴리아 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20200027454A (ko) 산수국 추출물을 이용한 호흡기 질환 개선용 조성물
KR20200021738A (ko) 장수만리화 추출물을 포함하는 호흡기 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101515067B1 (ko) 스컬캅플라본ⅱ 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20150083327A (ko) 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물
KR20160008459A (ko) 오풍칠 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101715154B1 (ko) 회양목 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물
KR20140026091A (ko) 가는잎산들깨 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20120053395A (ko) 페닐부틸산（４－ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 천식 치료용 약학적 조성물
KR20200014246A (ko) 나한과 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101638795B1 (ko) 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20220047193A (ko) 더위지기 추출물을 포함하는 진해 또는 거담용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant