KR20150132654A - Pharmaceutical composition for prevention or treatment inflammatory diseases comprising Siraitia grosvenori extract or fractions thereof, or compounds isolated from therefrom - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition and a food composition for preventing or treating inflammatory diseases, containing a Siraitia grosvenori extract, a fraction thereof, or a compound isolated therefrom as an active ingredient. The Siraitia grosvenori extract, the fraction thereof, or the compound isolated therefrom of the present invention is derived from a natural product, which has been used as a natural medicinal herb for a long time, thereby having no side effects, and suppressing expression of inflammation-related factors IL-6 and IL-1β and/or a COX-2 gene. In addition, the Siraitia grosvenori extract, the fraction thereof, or the compound isolated therefrom has excellent effects of: suppressing MUC5AC production; alleviating tracheal hypersensitivity; inhibiting inflammatory cell infiltration in bronchi; suppressing IgE production in serum and bronchoalveolar lavage fluid; and suppressing expression of Th2 cytokines (IL-5 and IL-13), thereby being effectively used in preventing or treating asthma or inflammatory diseases including chronic obstructive pulmonary disease.

Description

나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment inflammatory diseases comprising Siraitia grosvenori extract or fractions thereof, or compounds isolated from therefrom}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, which comprises an extract, a fraction thereof or a compound isolated therefrom,

본 발명은 나한과(Siraitia grosvenori) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a process for the preparation of The present invention relates to a pharmaceutical composition and a food composition for preventing or treating an inflammatory disease which comprises as an active ingredient a grosvenori extract, a fraction thereof or a compound isolated therefrom.

염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 대하여 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포 (migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개인자에 의하여 촉발된다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 이 중에 세균의 침입에 의해 형성되는 농양의 병리적 상태를 염증성 질환이라고 한다. Inflammation is a normal and protective in vivo defense manifestation that is localized to physical trauma, harmful chemicals, microbial infections, or tissue damage caused by stimuli in vivo metabolites. This inflammation is triggered by various inflammatory mediators produced from damaged tissues and migrating cells. In normal cases, the organism neutralizes or eliminates the cause of inflammation through the inflammation reaction, regenerates the upper tissue and regenerates the normal structure and function, but if not, the disease state such as chronic inflammation also proceeds. The pathological state of the abscess formed by the invasion of bacteria is called an inflammatory disease.

염증성 질환 중에서도 천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만 명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다(Lemanske RF Jr, 등 JAMA 1997;278:1855-1873; Global Initiative for Asthma. NIH Publication No. 02-3659, 2002). 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다(Global Initiative for Asthma. NIH Publication No. 02-3659, 2002, p50-66). 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨 (interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며, 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다. 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다. 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.Among inflammatory diseases, asthma is a lung disease characterized by chronic airway inflammation and airway hyperresponsiveness, and is caused by air pollutants, dust, allergen, and the like. In particular, asthma is an inflammatory respiratory disease that causes dyspnea, and about 3 million people in Korea have asthma. Asthma is a disease characterized by colorless asthma, dyspnea, sneezing, severe cyanosis due to lack of oxygen, and chest pain. Recently, it has been rapidly increasing due to exposure to air pollution and various chemical substances and westernization of diet. Especially, (Lemanske RF Jr., et al., JAMA 1997; 278: 1855-1873; Global Initiative for Asthma, NIH Publication No. 02-3659, 2002). However, in asthmatic patients, the cause and pathogenesis of the disease is not clear (Global Initiative for Asthma, NIH Publication No. 02-3659, 2002, p50-66). In this pathogenesis, the Th2 (T helper type 2) type of immune response is exaggerated and the secretion of interluenin (-4, 5, 13) is increased. In addition, many inflammatory cells including eosinophils And migrate and invade into the lung tissue. In addition, inflammatory cells release a variety of proinflammatory and chemotactic factors, further exacerbating the inflammatory response, increasing mucus secretion in the airway goblet cells, and causing airway hyperresponsiveness. Because of this series of reactions, patients with asthma exhibit clinical symptoms such as dyspnea, cyanosis, and chest pain.

현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항생제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항생제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다. 이러한 부작용들을 극복하고 독성이 적으며, 치료효과가 탁월한 천연물 혹은 새로운 화합물의 개발이 끊임없이 진행되고 있다.
Currently, steroids, bronchodilators, and antibiotics are mainly used as medicines used for the treatment of asthma. Steroids and antibiotics are used in the treatment of asthma through immune responses and inhibition of inflammatory responses, and bronchodilators are used to counteract clinical manifestations such as dyspnea. The most widely used inhaled corticosteroids have excellent therapeutic effect, but when used for a long period of time, adrenal suppression, bone density reduction, growth disorder, eye and skin complications, collagen synthesis And the like. In addition, persistent beta-2 agonists, such as salmeterol and formeterol, have been shown to be protective against asthma attacks, . And long-term use has been found to have side effects, limited use as a treatment for asthma. The development of natural products or new compounds that overcome these side effects, are less toxic, and have excellent therapeutic effects are constantly under way.

한편, 나한과(Siraitia grosvenori)는 중국 광동, 광서성의 고랭지에서 재배되는 박과의 다년생 식물로서, 종래에 청량음료의 원료나 조미료로 사용되어져 왔으며, 위나 장에 문제가 있을 경우 민간에서 사용되어 왔으나, 이의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물의 항천식 또는 항염증 활성에 대해서는 알려진 바가 없다.
On the other hand, to me and (Siraitia grosvenori ) is a perennial plant which is cultivated in the highland of Guangdong province, Guangxi province, China, and has been conventionally used as a raw material or seasoning for soft drinks. When there is a problem in the stomach or intestines, it has been used in the private sector. Or anti-asthmatic or anti-inflammatory activity of compounds isolated therefrom is not known.

이에 본 발명자들은 인체에 부작용을 유발하지 않으면서 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용한 천연물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물이 독성을 나타내지 않으면서 천식을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to find a natural substance useful for the prevention and treatment of inflammatory diseases without causing adverse effects on the human body. As a result, it has been found that Nahan and its extract, its fractions or compounds isolated therefrom do not exhibit toxicity, And thus the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, which comprises the extract of Aspergillus oryzae, a fraction thereof, a compound represented by the following formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient .

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

[화학식 2](2)

Figure pat00002

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본 발명의 다른 목적은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or ameliorating an inflammatory disease, which comprises as an active ingredient an extract of Nagoya crassa, an extract thereof, a fraction thereof, or a compound represented by the above formula (1) or (2)

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 나한과(Siraitia grosvenori) 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, there is provided an extract of Siraitia grosvenori , a fraction thereof, a compound represented by the following general formula (1) or (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the prophylaxis or treatment of inflammatory diseases.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00003
Figure pat00003

[화학식 2](2)

Figure pat00004

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구체적으로, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
Specifically, the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases of the present invention may include a nhanhua extract, a fraction thereof, a compound represented by the following general formula (1) or (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof .

본 발명에서 용어, "나한과(Siraitia grosvenori)"는 중국 광동, 광서성의 고랭지에서 재배되는 박과의 다년생 식물이다. 매년 6월에서 8월 사이에 담황색 꽃을 피우고, 8월에서 10월 사이에 원형의 호과를 맺는다. 과일의 외피에 용모가 나있고 처음 열매를 맺을 때 열매의 색깔은 홍색이나 성숙하면 청색으로 변한다. 수확한 후 과병은 잘라내고 얕은 불에 5일 내지 6일 동안 말려서 약용한다. 중국계림지방에서는 청량음료의 원료나 조미료로 사용되어져 왔으며, 위나 장에 문제가 있을 경우 민간에서 사용되었다. In the present invention, the term " Siraitia " grosvenori "is a perennial plant that is cultivated in the highlands of Guangdong province, Guangxi province, China. It blooms between June and August every year and blooms between August and October. In the Guilin province of China, the raw materials and seasonings of soft drinks are divided into three parts: the raw material of the beverage and the seasoning And has been used in the private sector if there is a problem in the stomach or intestines.

본 발명에서 용어, "나한과 추출물"은 나한과를 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 나한과 추출물은 나한과 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 나한과 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다. 상기 나한과 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 열매 또는 식물 조직 배양물 등으로부터 추출 가능하며, 특히 나한과의 열매로부터 추출될 수 있다.In the present invention, the term "bark extract" means an extract obtained by extracting bark extract. The bark extracts are prepared by dissolving the bark and ground product in a solvent having a volume of about 2 to 20 times, preferably about 3 to 5 times the dry weight, of 1 to 4 carbon atoms (C 1 to 4) such as methanol, ethanol, 4 ) or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10 of them is used as an elution solvent, and the extraction temperature is 20 to 100 ° C, preferably room temperature, and the extraction period is about Extraction can be carried out using an extraction method such as hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction for 12 hours to 4 days, preferably 3 days, but a method of extracting a substance having an activity for preventing or treating inflammatory diseases And can be used without limitation. Preferably, the extract is continuously extracted one to five times by cold extraction, filtered under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure at 20 to 100 ° C, preferably at room temperature, in a vacuum rotary condenser to be dissolved in water, a lower alcohol or a mixed solvent thereof However, the present invention is not limited thereto, and it is possible to use a dried product obtained by drying an extract, a diluted solution, a concentrate, or an extract of an extract, as long as it can exhibit the activity of preventing or treating the inflammatory disease of the present invention , Or both of these controlled products or tablets. The above extracts can be extracted from various organs of natural, hybrid, and variant plants and extracted from, for example, roots, shoots, stems, leaves, fruits or plant tissue cultures, Can be extracted.

본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 나한과 분획물은 나한과 추출물을 현탁한 후, 물, 메탄올, 에탄올 등의 극성 용매 또는 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 구체적으로, 나한과 조추출물을 증류수 등에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매와 같은 극성 또는 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 극성 또는 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. The term "fraction" in the present invention means a product obtained by a fractionation method for separating a specific component or a specific group from a mixture containing various constituents. In the present invention, the crude extract and the fractions can be separated into a polar solvent fraction and a non-polar solvent fraction, respectively, by suspending the extract in a polar solvent such as water, methanol, ethanol, or a non-polar solvent such as hexane or ethyl acetate have. Specifically, after the suspension or the like distilled water to me, and the crude extract, from about 1 to 100 times of the suspension, preferably from about 1 to a volume of five times with water, alcohol or chloroform with a carbon number of 1 (C 1) to 4 (C 4) , A polar or nonpolar solvent such as ethyl acetate, hexane, butanol, or a mixed solvent thereof is added, and the polar or non-polar solvent soluble layer is extracted and separated from 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times have.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 얻어진 나한과 에탄올 조추출물(89.5 g)에 증류수를 가하여 현탁한 후 동량의 클로로포름을 가하여 클로로포름 층과 물 층으로 분리하였고, 이를 여과, 감압농축하여 클로로포름 분획물(17.0 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 물 층에 부탄올을 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물(22.7 g)을 수득하였고, 남은 물층을 농축하여 물 분획물(49.0 g)을 수득하였다.
In one embodiment of the present invention, distilled water was added to the obtained crude extract and ethanolic crude extract (89.5 g) to suspend, and the same amount of chloroform was added thereto to separate the chloroform layer and the water layer. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain chloroform fraction ). Then, the chloroform fraction was removed and an equal amount of butanol was added to the remaining water layer to obtain a butanol fraction (22.7 g) in the same manner as above. The remaining water layer was concentrated to obtain a water fraction (49.0 g).

또한 본 발명의 분획물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 수득한 것일 수도 있다(Harborne J.B. Plant Pathology, 1998, 3rd Ed. p6-7). 예컨대, 본 발명에 따른 나한과 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성분획물도 본 발명의 나한과 분획물에 포함된다.The fraction of the present invention may also be obtained by further performing a conventional fractionation process (Harborne J. B. Plant Pathology, 1998, 3rd Ed. P6-7). For example, fractions obtained by passing the crude extract according to the present invention through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatographies (prepared for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity) Are also encompassed by the present invention in fractions and fractions thereof.

상기 활성분획물은 분획물로부터 보다 높은 생리활성 등을 가지는 분획을 분리한 것으로, 활성분획 또는 유효분획물이라고도 한다. 계통분획과 같은 통상의 분획과정을 통해 수득한 여러 성분이 혼합되어 있는 분획물 가운데 농도구배 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 활성성분의 성질에 따라 분리해냄으로써 보다 강한 활성을 갖는 특정 활성분획물을 제조할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, LH-20, ODS 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획물을 분리 및 정제할 수 있고, 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The active fractions are obtained by separating fractions having higher physiological activities or the like from the fractions, and they are also referred to as active fractions or effective fractions. The active fractions having stronger activity can be prepared by separating the fractions containing various components obtained through ordinary fractionation processes such as the system fraction according to the properties of the active ingredient through concentration gradient column chromatography or the like . The column chromatography was carried out by column chromatography using a filler selected from the group consisting of silica gel, Sephadex, LH-20, ODS gel, RP-18, polyamide, Toyopearl and XAD resin to isolate active fractions And the column chromatography can be carried out several times by selecting an appropriate filler as necessary, but the present invention is not limited thereto.

상기 크로마토그래피를 사용함에 있어 용출용매, 용출 속도 및 용출시간은 당업계에서 일반적으로 사용하는 용매, 속도 또는 시간을 적용할 수 있으나, 구체적으로 물 및/또는 메탄올을 용출용매로 사용하여, 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 30분 내지 200분 간 용출시키는 것일 수 있다.In using the above chromatography, the elution solvent, the elution rate and the elution time may be any solvent, rate or time generally used in the art, but specifically, water and / or methanol may be used as the elution solvent, And eluted at a rate of 50 ml / min for 30 minutes to 200 minutes.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 계통분획을 통해 수득한 분획물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(Sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 ㎛)을 장착한 후 각각의 메탄올 추출물을 5 g의 양으로 반복 로딩하였다. 용출용매로는 물/메탄올[10:90→100:0 (v/v)]를 사용하였으며, 용리 속도는 40 ㎖/분으로 하여 190분간 용출(분석)시킨 후 UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출한 결과, 5개의 클로로포름 활성분획물(MGS_C1 내지 C5), 6개의 부탄올 활성분획물(MGS_B1 내지 B6), 및 3개의 물 활성분획물(MGS_D1 내지 D3)을 수득하였고, 이 중 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3), 5번(MGS_B5), 6번(MGS_B6) 및 물 활성분획물 2번(MGS_D2)의 활성이 우수함을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, a fraction (20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 μm) was loaded on a MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) apparatus (Sepbox 2D 5000) Each methanol extract was repeatedly loaded in an amount of 5 g. The elution solvent was water / methanol [10: 90 → 100: 0 (v / v)] and the elution rate was 40 ml / min. After elution for 190 minutes, As a result, five chloroform active fractions (MGS_C1 to C5), six butanol active fractions (MGS_B1 to B6) and three water active fractions (MGS_D1 to D3) ), 5 (MGS_B5), 6 (MGS_B6) and water active fraction 2 (MGS_D2).

상기 나한과 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물은 트라이터펜계 화합물로서, 대표적인 예로 모그로사이드 Ⅳ(mogroside Ⅳ), 모그로사이드Ⅴ(mogroside Ⅴ), 시아메노사이드 Ⅰ(siamenoside Ⅰ), 11-옥소-모그로사이드 Ⅴ(11-oxo-mogroside Ⅴ) 등을 들 수 있다. 본 발명의 나한과로부터 상기 트라이터펜계 화합물들을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 의해 분리가능하다. 보다 구체적으로는, 상기에서 수득되는 분획물 중 부탄올 활성분획물(MGS_B5)과 물 활성분획물(MGS_D2)으로부터 11-옥소-모그로시드 Ⅴ(11-oxo-mogroside Ⅴ, 화합물 1이라 명명함)와 모그로시드 Ⅴ(mogroside Ⅴ, 화합물 2이라 명명함)를 각각 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Examples of the compound isolated from the crude extract and the fractions thereof include triporpenoid compounds, and representative examples thereof include mogroside IV, mogroside V, siamenoside I, 11-oxo -11-oxo-mogroside V, and the like. Methods for separating the triphenylamine compounds from the compounds of the present invention can be carried out by methods known in the art. More specifically, 11-oxo-mogroside Ⅴ (referred to as compound 1) and mogro (water-soluble fraction) were obtained from the butanol active fraction (MGS_B5) and water active fraction (MGS_D2) (Mogroside V, compound 2), but not limited thereto.

본 발명의 상기 화합물들은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다.The compounds of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt. As the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Acid addition salts include those derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, and aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxyalkanoates, Dioleate, aromatic acid, aliphatic and aromatic sulfonic acids. Such pharmaceutically innocuous salts include, but are not limited to, sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogenphosphate, dihydrogenphosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, Butyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, succinate, maleic anhydride, maleic anhydride, , Sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, chlorobenzene sulfide Propyl sulphonate, naphthalene-1-yne, xylenesulfonate, phenylsulfate, phenylbutyrate, citrate, lactate,? -Hydroxybutyrate, glycolate, maleate, Sulfonate, naphthalene-2-sulfonate or mandelate.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물들을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.The acid addition salts according to the invention may be prepared by conventional methods, for example by dissolving the compounds in an excess of an aqueous acid solution and precipitating the salts using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile .

또한, 본 발명의 상기 화합물들은 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염의 형태로 만들어 사용할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
In addition, the compounds of the present invention can be prepared in the form of a pharmaceutically acceptable metal salt using a base. The alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is preferable for the metal salt to produce sodium, potassium or calcium salt. In addition, the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).

본 발명에 따른 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 염증관련 인자로 알려진 IL-6, IL-1β 및/또는 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로써 염증성 질환의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다(실험예 2-1 및 2-2, 표 10 내지 12, 도 4).
The fractions of the extract according to the present invention, fractions thereof, the compound represented by the formula (1) or (2) isolated therefrom or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as an agent for inhibiting IL-6, IL-1β and / or COX-2 (Examples 2-1 and 2-2, Tables 10 to 12, Fig. 4).

본 발명에서 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 구체적으로 천식, 만성폐쇄성 폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The term "inflammatory disease" in the present invention means a general disease of inflammation as a main lesion, and includes, but is not limited to, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, allergy, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, Diabetic retinopathy, retinitis, macular degeneration, uveitis, conjunctivitis, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, osteoarthritis, osteoporosis, diabetes, diabetic nephropathy, nephritis, nephritis, Sjogren's syndrome Wherein the disease is selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, autoimmune pancreatitis, periodontal disease, graft versus host disease, chronic pelvic inflammatory disease, endometritis, rhinitis, tonsillitis, otitis media, sore throat, cystitis and chronic prostatitis. But is not limited thereto.

특히, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 염증성 질환의 대표적인 질환으로서 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 및 천식의 예방 또는 치료효과를 확인하였다.In particular, in one embodiment of the present invention, prophylactic or therapeutic effects of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma have been confirmed as representative diseases of the inflammatory diseases.

본 발명에서 용어, "천식"은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 바람직하게는 기관지성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "asthma" in the present invention is a comprehensive disease name collectively referred to as various diseases characterized by inflammation of the airways leading to organs, bronchi, bronchioles, and alveoli, , Clin Exp Allergy 2005; 35: 1254-62). In particular, asthma is a condition in which the bronchus in the lung is very sensitive. Sometimes the bronchus narrows and the breathing, choking, and breathing sounds can be heard, causing severe coughing. Allergy caused by bronchial allergy inflammation Disease. The most common symptoms of asthma include dyspnea, cough, wheezing (wheezy breathing), a symptom reliever (bronchodilator) that alleviates the narrowed bronchus in a short time, or a disease modifier that prevents asthma attacks by inhibiting bronchial allergic inflammation Anti-inflammatory agents, and leukotriene modulators). In the present invention, the asthma may be bronchial asthma, allergic asthma, atopic asthma, nonatopian asthma, exercise induced asthma, aspirin asthma, cardiogenic asthma or alveolar asthma, But is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "만성폐쇄성 폐질환(COPD)"은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환을 말한다. 만성폐쇄성 폐질환의 주된 증상은 만성적인 기침 또는 만성적인 가래(객담)을 비롯하여 호흡곤란 등이 있으며, 베타항진제, 항콜린제, 메틸잔틴계 등의 기관지 확장제 또는 부신피질 호르몬 흡입제 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 만성폐쇄성 폐질환은 바람직하게는 만성 기관지염(chronic bronchitis) 또는 폐기종(emphysema)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The term "chronic obstructive pulmonary disease (COPD)" as used herein refers to a condition in which an abnormal inflammatory reaction occurs in the lungs due to the ingestion of harmful particles or gas, whereby the airflow limitation progresses gradually to lower the lung function and cause dyspnea Respiratory disease. The main symptoms of chronic obstructive pulmonary disease are chronic cough or chronic sputum (sputum) as well as dyspnea, and bronchodilator such as beta agonist, anticholinergic agent, methylzantine system, or corticosteroid inhalant do. In the present invention, the chronic obstructive pulmonary disease may be, but is not limited to, chronic bronchitis or emphysema.

뮤신 유전자 중에서 MUC5AC는 천식 및 COPD 환자에게서 발현이 현저히 증가되어 있어, 이들 질환의 중요한 표적인자로 여겨지고 있다. 이에 MUC5AC의 발현과 생성은 천식 및 만성폐쇄성 폐질환의 메커니즘을 규명하는데 중요한 요인으로서, 이를 억제하는 약물의 탐색 등을 통해 상기 질환을 예방 또는 치료하고자 하는 연구가 활발하다. 본 발명에서는 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물이 MUC5AC의 발현을 억제함을 확인하였다(실험예 2-3, 표 15 내지 17). 이는 본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 시사한다.
Of the mucin genes, MUC5AC is significantly expressed in asthma and COPD patients and is considered to be an important target of these diseases. Thus, the expression and production of MUC5AC are important factors for identifying mechanisms of asthma and chronic obstructive pulmonary disease, and researches to prevent or treat the above diseases are actively conducted through searching for drugs that inhibit them. In the present invention, it was confirmed that the extracts of Nagoya crassifolia, its fractions or the compounds isolated therefrom suppressed the expression of MUC5AC (Experimental Example 2-3, Tables 15 to 17). This suggests that the extract of the present invention, its fractions, the compound isolated therefrom, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease.

한편, Th2(helper T cell Type 2) 세포가 생산하는 사이토카인(cytokine)인 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5) 및 인터류킨-13(IL-13)은 기관지 천식의 중요한 매개 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Coyle AJ. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13(1): 54-9; Nakajima H. et al. 1992. Am. Rev. Respir. Dis. 146(2): 374-7; Wills-Karp, M. et al. 1998. Sci. 282(5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008).Interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5) and interleukin-13 (IL-13), which are cytokines produced by Th2 helper T cell type 2 cells, (Coyle AJ. Et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol 13 (1): 54-9; Nakajima H. et al 1992. Am Rev. Respir Dis. 146 (2): 374-7; Wills-Karp, M. et al., 1998. Sci 282 (5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008).

구체적으로, 기관지 천식을 일으키는 항원은 1차적으로 대식세포에 의해 제거되고, 이 과정에서 활성화된 폐포의 대식세포가 B 세포를 자극하여 IgE를 생산하면, IgE는 비만세포를 활성화시키는 방법으로 초기 천식 반응을 담당한다. 이와 함께, 천식을 유발하는 항원에 노출된 B 세포는 CD4 T 세포를 자극하여 Th2 세포로 분화되고, 이 분화된 Th2 세포가 폐조직 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 내에서 IL-5 및 IL-13과 같은 사이토카인의 분비를 촉진하고, 이들 촉진된 사이토카인에 의하여 기관지 과민성과 기도 폐쇄가 유발되어 천식 반응이 일어난다고 알려져 있다.Specifically, when the antigen causing bronchial asthma is firstly removed by macrophages and the macrophages of the alveoli activated in this process stimulate B cells to produce IgE, IgE is a method of activating mast cells, Responsible for the reaction. In addition, B cells exposed to asthma-inducing antigens are differentiated into Th2 cells by stimulating CD4 T cells, and the differentiated Th2 cells secrete IL-5 and IL-13 in lung tissue and bronchoalveolar lavage (BALF) And promotes the secretion of cytokines, such as the promoted cytokine caused by bronchial hyperresponsiveness and airway obstruction is known to cause asthma reaction.

따라서, 상기 IL-5 및 IL-13 등의 사이토카인의 분비를 억제시키거나 IgE의 분비를 억제시킴으로써 천식 반응을 억제시킬 수 있다.Therefore, the suppression of the secretion of cytokines such as IL-5 and IL-13 or the suppression of the secretion of IgE can suppress the asthmatic reaction.

본 발명의 실험예에서는 ⅰ) 기관지 폐포 세척액으로부터 IL-5 및 IL-13의 생성량을 측정한 결과, IL-5 및 IL-13 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물의 투여군에서는 이들 인자들이 유의성있게 감소하였음을 확인하였고(실험예 3-4, 표 18), ⅱ) 혈청 내 및 난백알부민 특이 IgE의 분비량을 측정한 결과, 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 모두 천식유발군에서 정상대조군에 비하여 크게 증가된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물의 투여군에서는 유의성있게 감소하였음을 확인하였다(실험예 3-5, 표 19). 이는 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
In the experimental examples of the present invention, IL-5 and IL-13 were significantly increased in the asthma-induced group compared to the control group, , The fractions thereof or the compound of the formula (1) or (2) isolated therefrom significantly decreased (Factor 3-4, Table 18), ii) the secretion amount of serum and albumin-specific IgE As a result, serum IgE and albumin-specific IgE were significantly increased in the asthma-induced group compared to the normal control group, but in the group administered with the compound of formula (1) or (2) (Experimental Example 3-5, Table 19). This shows that the above extracts, fractions thereof, compounds isolated therefrom, or pharmaceutically acceptable salts thereof are effective for the treatment of asthma.

또한, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물은, 기관지상피의 배상세포의 점액분비를 감소시킬 수 있음이 본 발명에 의해 확인되었다.In addition, it has been confirmed by the present invention that the above extract, its fraction, or the compound of formula (1) or (2) isolated therefrom can reduce the mucus secretion of the goblet cells of the bronchial epithelium.

본 발명의 일 실험예로서, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 폐조직 내 염증을 관찰하고, PAS(periodic acid Schiff) 염색을 통해 기관지 내 점액분비량을 관찰한 결과, ⅰ) 천식유발군의 기관지 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물 투여군 모두에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨을 확인하였고(실험예 3-6, 도 7), ⅱ) 천식유발군에서는 기관지 상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰된 반면, 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화학식 1 또는 2의 화합물 투여군 모두에서 기관지 상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(실험예 3-6, 도 8). 이러한 결과 또한 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 천식의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다.
As an experimental example of the present invention, inflammation in the lung tissue was observed through H & E (Hematoxylin & Eosin) staining, and mucous secretion amount was examined through PAS (periodic acid Schiff) staining. As a result, And infiltration of inflammatory cells around the blood vessels was observed, whereas infiltration of inflammatory cells around the bronchi and blood vessels was found to be reduced in both of the fractions of Nahan and its extracts, fractions thereof or the compound administered with the compound of formula (1) or (2) In Experimental Example 3-6, Fig. 7), in the asthmatic induction group, mucin secretion was observed to increase in the goblet cells of the bronchial epithelium. On the other hand, The mucous secretion of the goblet cells of the bronchial epithelium was significantly reduced (Experimental Example 3-6, Fig. 8). These results also show that the above extracts, their fractions, the compounds isolated therefrom, or their pharmaceutically acceptable salts are effective for the treatment of asthma.

결과적으로, 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 만성폐쇄성 폐질환, 천식 등을 포함한 염증성 질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 확인하였다.
As a result, it has been confirmed that the extracts of horseradish peroxidase, its fractions, the compounds isolated therefrom, or the pharmaceutically acceptable salts thereof are effective for the prevention or treatment of inflammatory diseases including chronic obstructive pulmonary disease and asthma.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term "prevention" means any action that inhibits or delays the onset of an inflammatory disease upon administration of the composition, and "treatment" .

본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the extract according to the present invention, a fraction thereof, a compound isolated therefrom or a pharmaceutically acceptable salt thereof may further comprise an appropriate carrier, adduct or diluent conventionally used in the production of a pharmaceutical composition . In this case, the content of the extract of the present invention, the fraction thereof, the compound isolated therefrom or the pharmaceutically acceptable salt thereof is not particularly limited, but is preferably 0.001% by weight to 99% by weight, By weight may comprise from 0.01% to 50% by weight.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition may be any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, nonaqueous solvents, suspensions, emulsions, And may be oral or parenteral formulations of various forms. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a method of preventing or treating an inflammatory disease, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a suspected individual of an inflammatory disease.

본 발명에서 상기 염증성 질환의 의심 개체는 상기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 약학적 조성물 및 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the suspected individual of the above-mentioned inflammatory disease means all the animals including humans who have developed or can develop the disease. By administering the pharmaceutical composition of the present invention to suspected individuals having an inflammatory disease, have. The pharmaceutical composition and inflammatory diseases are as described above.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.The term "administering" as used herein means introducing the pharmaceutical composition of the present invention into a suspected individual of an inflammatory disease by any suitable method, and the administration route includes various routes of oral or parenteral administration ≪ / RTI >

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The term "pharmaceutically effective amount" as used herein means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will vary depending on the species and severity, age, sex, The type of drug, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an object for an inflammatory disease, and any of them can be applied. For example, any non-human animal such as a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a guinea pig, a rat, a mouse, a cattle, a sheep, a pig or a goat can be used. Subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal, and may be administered by a suitable method, including localized administration, if necessary, for localized treatment. The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and body weight of the individual, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine dural or intracerebral injection.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
Suitable total daily doses may be determined by the treatment within the scope of sound medical judgment and are generally in the range of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg can be administered once or several times a day.

또 다른 양태로서, 본 발명은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating an inflammatory disease, which comprises, as an active ingredient, Nahan and its extract, its fractions, or a compound represented by the following formula (1) or (2) isolated therefrom.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00005
Figure pat00005

[화학식 2](2)

Figure pat00006

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상기 나한과, 이의 추출물, 분획물, 화학식 1 및 2의 화합물 및 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.The extracts, fractions thereof, the compounds of formulas (1) and (2) and inflammatory diseases are as described above.

본 발명에서의 용어, "개선"은 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 염증성 질환과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.The term "improvement" in the present invention refers to a disease such as inflammatory disease that is prevented or treated by using a composition comprising an effective amount of the extract of the present invention, a fraction thereof, or a compound represented by the following formula And all actions that improve or alleviate symptoms of an onset entity.

구체적으로, 본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.Specifically, the extract of the present invention, a fraction thereof, or a compound represented by the following formula (1) or (2) isolated therefrom can be added to a food composition for the purpose of preventing or improving an inflammatory disease.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 나한과 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.The food composition of the present invention may be in the form of pills, powders, granules, infusions, tablets, capsules or liquid preparations. There is no particular limitation on the kinds of foods in which the extracts of the present invention or fractions thereof can be added, , For example, various drinks, gum, tea, vitamin complex, and health supplement foods.

상기 식품 조성물에는 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. In the food composition, other components may be added in addition to the components of the extract, the fractions thereof, or the compounds isolated therefrom, and the kind thereof is not particularly limited. For example, it may contain various herbal medicine extracts, food-acceptable food-aid additives or natural carbohydrates such as ordinary food, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다. The term "food supplementary additive " in the present invention means a component which can be added to foods in a supplementary manner, and is appropriately selected and used by those skilled in the art as added to produce health functional foods of each formulation. Examples of food-aid additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, , a pH adjusting agent, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, a carbonating agent used in a carbonated drink, and the like. However, the types of the food auxiliary additives of the present invention are not limited by these examples.

상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. In addition to the above, natural flavorings (such as tau mart), stevia extracts (rebaudioside A, Etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.The food composition of the present invention may include a health functional food. The term " health functional food " as used in the present invention refers to foods prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and circles by using raw materials and components having useful functions in the human body. Here, the term "functionality" means that the structure and function of the human body are controlled to obtain nutritional effects or effects useful for health use such as physiological actions. The health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art and can be prepared by adding raw materials and ingredients which are conventionally added in the art. Also, unlike general medicine, there is an advantage that there is no side effect that can occur when a medicine is used for a long time by using food as a raw material, and it is excellent in portability.

유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 나한과 추출물 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, in the production of foods, the extract of the present invention and its fractions may be added in an amount of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 10% by weight, based on the weight of the raw material composition, but the present invention is not limited thereto. However, in the case of long-term ingestion intended for health and hygiene purposes or for the purpose of controlling health, the amount can also be used in the above-mentioned range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health functional foods in a conventional sense.

본 발명의 나한과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, 염증관련 인자인 IL-6, IL-1β 및/또는 COX-2 유전자의 발현을 억제할 뿐만 아니라, MUC5AC 생성 억제, 기도과민성 경감, 기관지 내 염증세포 침윤 억제, 혈청과 기관지 폐포 세척액 내의 IgE 생성 억제, 및 폐에서의 Th2 사이토카인(IL-5 및 IL-13)의 발현 억제 효과가 우수하므로, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 비롯한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
The extract of the present invention, its fractions, or the compounds isolated therefrom are derived from natural products that have been used as natural medicines for a long time and have no adverse effects, and can be used for the treatment of inflammation-related factors IL-6, IL-1β and / (IL-5 and IL-13) expression in the lungs, as well as suppression of MUC5AC production, alleviation of airway hyperresponsiveness, inhibition of inflammatory cell infiltration in bronchi, inhibition of IgE production in serum and bronchoalveolar lavage fluids, and expression of Th2 cytokines It is useful for prevention or treatment of inflammatory diseases including asthma or chronic obstructive pulmonary disease.

도 1a는 나한과 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 MPLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 나한과 에탄올 추출물의 물 분획물을 MPLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC(Ultraperformance Liquid Chromatography)를 사용하여 MS(Mass Spectrometry)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC를 사용하여 PDA(Photodiode-Array detection)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 나한과 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC를 사용하여 CAD(Charged Aerosol Detectors)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 나한과의 추출, 분획, 활성분획물 및 화합물의 분리 전체적인 과정을 나타내낸 도이다.
도 3b는 나한과 부탄올 활성분획물 5번(MGS_B5) 및 물 활성분획물 2번(MGS_W2)으로부터 perp-HPLC(preaparative High-performance Liquid Chromatography)를 사용하여 DAD(Diode-Array detection)로 분리/정제한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 나한과 추출물의 RAW264.7 세포에서의 LPS로 유도된 염증관련 유전자의 억제효과를 나타낸 도이다. 가장 왼쪽 컬럼이 0.1% DMSO만 투여한 음성대조군; 그 오른쪽 컬럼이 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증을 유도한 양성대조군; 나머지 컬럼은 나한과 추출물을 농도별로 처리한 후, LPS로 염증을 유도한 실험군이다.
도 5는 기도 감작한 후 호흡률에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
NC: 기도 감작하지 않은 정상 대조군(음성대조군);
OVA; 난백 알부민으로 기도 감작한 천식 유도군(양성대조군);
Mon; 몬테루카스트를 30 mg/kg 투여한 비교대조군; 및
나한과 에탄올 추출물(Total): 나한과 추출물을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B5): 나한과 부탄올 활성분획물 5번을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B6): 나한과 부탄올 활성분획물 6번을 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 화합물 1(MGS_W02-01): 나한과로부터 분리한 화합물 11-O-모그로사이드 V(화학식 1)를 30 mg/kg 투여한 실험군
나한과 화합물 2(MGS_W02-02): 나한과로부터 분리한 화합물 모그로사이드 V(화학식 2)를 30 mg/kg 투여한 실험군
#: 정상 대조군 (NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
*: 천식 유도군 (OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
도 6은 기도 감작한 후, 기관지 폐포 세척액의 총 세포 수와 호산구 수에 대한 나한과 추출물, 부탄올 분획물 및 이로부터 분리한 화합물이 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7는 기도 감작한 후 기도점막 내 염증세포의 침윤정도를 H&E 염색으로 확인한 도이다.
도 8는 기도 감작한 후 마우스의 기관지 상피세포에서 배윤세포가 차지하는 정도를 PAS 염색으로 확인한 도이다.FIG. 1A is a diagram showing the results of analysis of the chloroform fraction of the crude extract and ethanol extract by MPLC (medium pressure liquid chromatography). FIG.
FIG. 1B is a graph showing the results of MPLC analysis of the butanol fraction of the Hana and ethanol extracts.
FIG. 1 (c) is a graph showing the results of MPLC analysis of water fractions of the lanolophilic and ethanol extracts.
FIG. 2 (a) is a graph showing the results of MS (Mass Spectrometry) analysis of the harsh and ethanol extracts and fractions using UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography).
FIG. 2B is a graph showing the results of PDA (Photodiode-Array detection) analysis using the UPLC of the ethanol extract and the fraction of the ethanol extract.
FIG. 2C is a graph showing the results of analytical analysis of nude and ethanol extracts and fractions by CAD (Charged Aerosol Detectors) using UPLC.
FIG. 3A shows the overall process of extraction, fractionation, active fractions and separation of the compounds. FIG.
3B shows the result of separation / purification by DAD (Diode-Array detection) using perp-HPLC (preaparative High-performance Liquid Chromatography) from the active fractions No. 5 (MGS_B5) and the water active fraction No. 2 (MGS_W2) Fig.
Fig. 4 is a graph showing the inhibitory effect of LPS-induced inflammation-related genes in RAW264.7 cells of the extracts of Nahan and Hana. Negative control with only the leftmost column in 0.1% DMSO alone; A positive control whose right column induced inflammation by treatment with 0.5 μg / ml of LPS; The remaining column is the experimental group in which the naphtha and the extract are treated by concentration and the inflammation is induced by LPS.
FIG. 5 is a graph showing the effect on respiration rate after airway sensitization.
NC: non-airway sensitized normal control (negative control);
OVA; Asthma induction group (positive control) that airways sensitized with albumin albumin;
Mon; Comparative control with 30 mg / kg montelukast; And
Nahan and ethanol extracts (Total): Experiments with 30 mg / kg of Nahan and extract
Nahan and butanol active fractions (MGS_B5): Experimental group treated with 30 mg / kg of Nahan and butanol active fractions 5
Nahan and butanol active fractions (MGS_B6): Experimental group treated with 30 mg / kg of Nahan and butanol active fraction No. 6
Compound 1 (MGS_W02-01) obtained from nakahan: Compound 11-O-mogroside V (Formula 1) isolated from naan
Compound 2 (MGS_W02-02): Compound obtained by the method in which 30 mg / kg of compound Mogroside V (Formula 2)
# : Statistically significant (p <0.05) compared with normal control (NC)
* : Statistically significant (p <0.05) as compared with asthma induction group (OVA)
FIG. 6 is a graph showing the effect of the extracts, butanol fractions and compounds isolated therefrom on total cell number and eosinophil count of bronchoalveolar lavage fluid after airway sensitization.
FIG. 7 shows the degree of infiltration of inflammatory cells in the airway mucosa after airway sensitization by H & E staining.
FIG. 8 is a graph showing PAS staining of the degree of macrophages in the bronchial epithelial cells of the mice after airway sensitization.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

제조예Manufacturing example 1: 나한과 추출물,  1: Extract of Barker, 분획물Fraction 및  And 활성분획물의Active fraction 제조 Produce

본 발명자들은 광서성 계림시 영복현에서 채집하여 건조시킨 나한과를 화평 디엔에프를 통해 확보하였다. 나한과(2 kg)를 건조기(50-55℃)를 자연건조(음건) 사용하여 수분을 제거한 후 약 1 cm의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 에탄올 10 ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 나한과 에탄올 추출물 89.5 g을 수득하였다. 이후의 실험에서는 상기 수득된 나한과 에탄올 추출물을 총(total) 추출물로 명명하였다.The present inventors obtained the dried and dried seaweed collected from Yeongbok, Guilin, Guangxi province through Huafing Dienf. Nahan (2 kg) was dried in a dryer (50-55 ° C) using natural drying (shade) to remove water and crushed to a size of about 1 cm. Based on the dry weight of the pulverized powder sample, 10 L of ethanol was added and the mixture was extracted at room temperature. Then, after filtration and concentration under reduced pressure, 89.5 g of a lower and an ethanol extract were obtained. In the subsequent experiments, the obtained extracts and ethanol extracts were designated as total extracts.

상기 얻어진 나한과 에탄올 조추출물(89.5 g)에 증류수를 가하여 현탁한 후 동량의 클로로포름을 가하여 클로로포름 층과 물 층으로 분리하였고, 이를 여과, 감압농축하여 클로로포름 분획물(17.0 g)을 수득하였다. 그런 다음, 상기 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 물 층에 부탄올을 동량 가하여 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물(22.7 g)을 수득하였고, 남은 물층을 농축하여 물 분획물(49.0 g)을 수득하였다. The resulting crude extract and ethanolic crude extract (89.5 g) were suspended in distilled water and suspended in chloroform. The chloroform layer and the water layer were separated by filtration and concentrated under reduced pressure to obtain a chloroform fraction (17.0 g). Then, the chloroform fraction was removed and an equal amount of butanol was added to the remaining water layer to obtain a butanol fraction (22.7 g) in the same manner as above. The remaining water layer was concentrated to obtain a water fraction (49.0 g).

이후, 상기 분획물로부터 활성분획물을 분리·제조하기 위해 MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(Sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 ㎛)을 장착한 후 각각의 메탄올 추출물을 5 g의 양으로 반복 로딩하였다. 이때, 용매로는 물/메탄올[10:90→100:0 (v/v)]를 사용하고, 용리 속도는 40 ㎖/분이었으며, UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출하였다. 분석 시간은 190분으로 하여 각각, 5개의 클로로포름 활성분획물(MGS_C1-C5), 6개의 부탄올 활성분획물(MGS_B1-B6), 및 3개의 물 활성분획물을 수득하였다.(표 1 내지 3, 및 도 1a 내지 도 1c).Thereafter, a column (20 mm x 250 mm; Resin: Grace C18, 10 탆) was attached to an MPLC (Medium pressure liquid chromatography) apparatus (Sepbox 2D 5000) to separate and prepare active fractions from the fractions. The extract was repeatedly loaded in an amount of 5 g. At this time, water / methanol [10: 90 -> 100: 0 (v / v)] was used as a solvent and the elution rate was 40 ml / min and detected at a wavelength of UV 200-400 nm. The analytical time was 190 minutes, and five chloroform active fractions (MGS_C1-C5), six butanol active fractions (MGS_B1-B6) and three water active fractions were obtained, respectively (Tables 1 to 3 1C).

나한과 클로로포름층Nahan and chloroform layer 분석시간 (min)Analysis time (min) 무게 (g)Weight (g) 조건Condition MGS_C1MGS_C1 0-1150-115 2.792.79 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH MGS_C2MGS_C2 115-135115-135 2.682.68 MGS_C3MGS_C3 135-160135-160 2.792.79 MGS_C4MGS_C4 160-175160-175 2.522.52 MGS_C5MGS_C5 175-190175-190 1.911.91

나한과 부탄올층Nahan and butanol layers 분석시간 (min)Analysis time (min) 무게 (g)Weight (g) 조건Condition MGS_B1MGS_B1 0-250-25 2.032.03 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH MGS_B2MGS_B2 25-3525-35 0.250.25 MGS_B3MGS_B3 35-4535-45 0.540.54 MGS_B4MGS_B4 45-7045-70 0.860.86 MGS_B5MGS_B5 70-11570-115 2.292.29 MGS_B6MGS_B6 115-190115-190 0.440.44

나한과 물층Nahan and water layer 분석시간 (min)Analysis time (min) 무게 (g)Weight (g) 조건Condition MGS_W1MGS_W1 0-1050-105 12.5212.52 0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH0 - 5 min 10% MeOH
5 - 20 min 10% MeOH
20 - 110 min 50% MeOH
110 - 170 min 100% MeOH
170 - 190 min 100% MeOH MGS_W2MGS_W2 105-140105-140 1.231.23 MGS_W3MGS_W3 140-190140-190 0.300.30

실시예Example 1: 나한과 추출물,  1: Extract of Barker, 분획물의Fraction 분석 analysis

상기 제조예 1에서 수득한 나한과 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 활성분획을 조사하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 UPLC(ultra performance liquid chromatography)로 분석하였다. In order to examine the active fractions of the crude extract and ethanol fraction obtained in Preparation Example 1 and the fractions thereof, they were analyzed by UPLC (ultra performance liquid chromatography).

먼저, UPLC 분석을 위해 상기 제조예 1에서 수득한 나한과 에탄올 추출물 89.5 g 및 분획물을 UPLC용 0.25 mm 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. UPLC 기기(Waters UPLC-QTOF-MS)에 칼럼(Waters BEH C18 column, 2.1 × 100 mm, 1.7 ㎛m)을 장착한 후 여과된 각각의 분획물을 5 ㎕ 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산/물 + 0.1% 포름산 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 0.4 ㎖/분이었으며, UV 254 nm의 파장과 CAD(Charged Aerosol Detectors), MS(Mass Spectrometry)에서 검출하였다(도 2a 내지 도 2c).
First, for the UPLC analysis, 89.5 g of the crude extract and ethanol extract obtained in Preparation Example 1 and the fractions were once filtered with a 0.25 mm membrane filter for UPLC. A column (Waters BEH C18 column, 2.1 x 100 mm, 1.7 탆 m) was mounted on a UPLC instrument (Waters UPLC-QTOF-MS) and each fraction filtered was loaded in a quantity of 5 쨉 l. At this time, acetonitrile + 0.1% formic acid / water + 0.1% formic acid [10: 90 → 100: 0 (v / v)] was used as a solvent and elution rate was 0.4 ml / min. CAD (Charged Aerosol Detectors), and MS (Mass Spectrometry) (Figs. 2A to 2C).

제조예Manufacturing example 2: 나한과  2: Nahan 활성분획물로부터From the active fraction 화합물의 분리 Separation of compounds

상기 제조예 1에서 수득한 나한과 분획물로부터 활성 단일화합물을 분리하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 prep-HPLC(preparative High-performance Liquid Chromatography)로 분리 및 정제하였다. In order to separate the active single compounds from the lower fractions obtained in Preparation Example 1, they were separated and purified by prep-HPLC (preparative High-performance Liquid Chromatography) which is liquid chromatography.

먼저, prep-HPLC 분리하기 위해 제조예에서 수득한 나한과 부탄올 활성분획물(MGS_B5) 및 물 활성분획물(MGS_W2)을 HPLC용 0.45 mm 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. prep-HPLC 기기(Gilson HPLC)에 칼럼(Shiseido column, 2.0 × 250 mm, 5 ㎛)을 장착한 후 여과된 각각의 활성분획물을 400 ㎕ 양(약 1 g/10 mL)으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 메탄올/물 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 14 ㎖/분이었으며, DAD(Diode-Array detection)에서 검출하여 각각의 활성분획물로부터 화합물 1(MGS_W2-01, 11-O-mogroside V), 화합물 2(MGS_W2-02, mogroside V)를 분리 및 정제하였다(도 3a 및 3b).
First, the crude and butanol active fractions (MGS_B5) and water active fractions (MGS_W2) obtained in the preparation examples for the prep-HPLC separation were once filtered with a 0.45 mm membrane filter for HPLC. After loading a column (Shiseido column, 2.0 x 250 mm, 5 쨉 m) on a prep-HPLC apparatus (Gilson HPLC), each of the filtered active fractions was loaded with a quantity of 400 쨉 l (about 1 g / 10 ml). At this time, methanol / water [10: 90 → 100: 0 (v / v)] was used as the solvent and the elution rate was 14 ml / min and detected from DAD (Diode-Array detection) Compound 1 (MGS_W2-01, 11-O-mogroside V) and Compound 2 (MGS_W2-02, mogroside V) were isolated and purified (FIGS.

실험예Experimental Example 1: 나한과 추출물,  1: Extract of Barker, 분획물Fraction 및 이로부터 분리된 화합물의 세포독성 평가 And cytotoxicity evaluation of compounds isolated therefrom

실험예Experimental Example 1-1:  1-1: Raw264Raw264 .7 세포에서의 세포독성 평가.7 Evaluation of cytotoxicity in cells

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 5% 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)에 1×105 cells/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰-플레이트에 접종하여 4시간 동안 부착하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 농도별로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 5 mg/㎖의 MTT 용액을 웰당 10 ㎕씩 첨가한 후 4시간 추가로 배양하였고, 상등액을 제거하고 DMSO를 100 ㎕씩 첨가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였고 그 결과를 하기 표 4 내지 6에 나타내었다.The mouse macrophage Raw264.7 cells were suspended in DMEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) at a concentration of 1 × 10 5 cells / Well plate and allowed to attach for 4 hours. The crude extracts, fractions and compounds prepared or isolated in Preparation Examples 1 and 2 were treated for each concentration and then cultured for 24 hours. 5 mg / ml of MTT solution was added at a rate of 10 μl per well, followed by further incubation for 4 hours. The supernatant was removed, 100 μl of DMSO was added, and the absorbance was measured at 570 nm. Cell viability was calculated according to the following formula 1 with a negative control group treated with 0.2% DMSO as 100%, and the results are shown in Tables 4 to 6 below.

[수학식 1][Equation 1]

Figure pat00007
Figure pat00007

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.00 ± 3.31100.00 3.31 에탄올
추출물
(total)ethanol
extract
(total) 55 92.87 ± 7.1192.87 ± 7.11 1010 95.06 ± 4.7095.06 + - 4.70 2020 91.44 ± 0.3491.44 + 0.34 4040 90.17 ± 4.9090.17 + - 4.90 8080 79.68 ± 2.1479.68 ± 2.14 클로로폼
(CHCl3)
분획물
Chloroform
(CHCl 3)
Fraction
55 85.65 ± 1.0385.65 ± 1.03 1010 95.82 ± 12.5895.82 + - 12.58 2020 89.17 ± 1.8789.17 ± 1.87 4040 95.79 ± 3.3795.79 ± 3.37 8080 97.39 ± 3.5697.39 + - 3.56 부탄올
(BuOH)
분획물Butanol
(BuOH)
Fraction 55 89.03 ± 3.5289.03 + - 3.52 1010 85.30 ± 1.6185.30 ± 1.61 2020 90.98 ± 4.9790.98 + - 4.97 4040 95.50 ± 11.4495.50 + - 11.44 8080 92.12 ± 11.7892.12 ± 11.78 물
(H2O)
분획물water
(H 2 O)
Fraction 55 87.09 ± 1.6187.09 ± 1.61 1010 84.54 ± 6.3584.54 ± 6.35 2020 86.57 ± 4.1786.57 + - 4.17 4040 97.55 ± 11.4497.55 + - 11.44 8080 96.50 ± 0.9296.50 ± 0.92

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.00 ± 4.13100.00 + - 4.13 부탄올 추출물Butanol extract 2020 96.13 ± 0.0596.13 + - 0.05 4040 96.32 ± 2.0496.32 + 2.04 부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)Butanol
Active fraction 3
(MGS_B3) 2020 93.36 ± 2.4793.36 + - 2.47 4040 96.70 ± 4.1896.70 + - 4.18 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 2020 99.96 ± 1.9399.96 + 1.93 4040 96.51 ± 4.8896.51 + - 4.88 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 2020 94.69 ± 0.9194.69 ± 0.91 4040 96.28 ± 0.8096.28 0.80 물
활성분획물 2번
(MGS_W2)water
Active fraction 2
(MGS_W2) 2020 95.37 ± 2.0995.37 ± 2.09 4040 97.72 ± 1.3497.72 ± 1.34

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.00 ± 4.38100.00 + - 4.38 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 1010 99.12 ± 0.3099.12 + - 0.30 2020 94.79 ± 0.9594.79 ± 0.95 4040 92.11 ± 4.3592.11 + - 4.35 8080 99.06 ± 0.6299.06 + - 0.62 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 1010 98.14 ± 2.7298.14 + - 2.72 2020 97.96 ± 0.6697.96 + 0.66 4040 97.95 ± 0.8797.95 ± 0.87 8080 96.99 ± 1.1296.99 ± 1.12

표 4 내지 표 6에 나타난 바와 같이, 나한과 추출물 및 분획물의 농도에 따른 대식세포의 세포생존율을 조사해본 결과, IC50의 값이 모두 80 ㎍/㎖ 이상임을 확인하였고, 나한과 추출물 또는 분획물로부터 분리한 화합물 또한 대식세포의 세포생존율에 대한 독성이 없음을 확인하였다.
As shown in Table 4 to Table 6, it was confirmed that to me and the extract and the examination, the cell viability of macrophages according to the concentration of the fraction, the value of the IC 50 are both 80 ㎍ / ㎖ above, from to me and extracts or fractions The isolated compounds also showed no toxicity to the cell viability of macrophages.

실험예Experimental Example 1-2:  1-2: H92H92 세포에서의 세포독성 평가 Evaluation of cytotoxicity in cells

인간의 폐암점막세포인 H292 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI 배지(Gibco)에 5×104 cells/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰-플레이트에 접종하여 12시간 동안 부착하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 농도별로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 세포 수를 셀 수 있는 CCK-8(Dojindo) 키트에서 설명한 대로, 배지 90 ㎕에 CCK-8 용액을 10 ㎕ 혼합하여 웰당 100 ㎕씩 첨가하였고, 최소 30분에서 최대 4시간까지 반응시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 상기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 7 내지 표 9에 나타낸 바와 같다.Human lung cancer mucosal H292 cells were suspended in RPMI medium (Gibco) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum at a concentration of 5 × 10 4 cells / ml and 100 μl were inoculated into 96-well plates For 12 hours. The crude extracts, fractions and compounds prepared or isolated in Preparation Examples 1 and 2 were treated for each concentration and then cultured for 24 hours. 10 μl of CCK-8 solution was added to 90 μl of the medium as described in the CCK-8 (Dojindo) kit capable of counting the number of cells, 100 μl / well of the mixture was added, and the reaction was continued for at least 30 minutes to a maximum of 4 hours. nm absorbance was measured. Cell viability was calculated according to Equation (1) using a negative control group treated with 0.2% DMSO as 100%, and the results are shown in Tables 7 to 9 below.

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.00 ± 7.83100.00 7.83 에탄올
추출물
(total)ethanol
extract
(total) 55 95.08 ± 2.1595.08 ± 2.15 1010 97.89 ± 2.4797.89 + - 2.47 2020 98.13 ± 3.5498.13 + - 3.54 4040 109.14 ± 1.92109.14 ± 1.92 클로로폼
(CHCl3)
분획물Chloroform
(CHCl 3)
Fraction 55 94.20 ± 1.0394.20 ± 1.03 1010 100.24 ± 5.09100.24 + 5.09 2020 101.93 ± 4.43101.93 + - 4.43 4040 107.49 ± 8.65107.49 + 8.65 부탄올
(BuOH)
분획물Butanol
(BuOH)
Fraction 55 90.16 ± 1.9090.16 ± 1.90 1010 91.93 ± 2.2491.93 + - 2.24 2020 96.26 ± 2.7196.26 + 2.71 4040 110.24 ± 5.94110.24 + - 5.94 물
(H2O)
분획물water
(H 2 O)
Fraction 55 93.42 ± 2.8793.42 ± 2.87 1010 95.18 ± 2.6695.18 + - 2.66 2020 94.08 ± 1.7494.08 ± 1.74 4040 96.93 ± 6.6296.93 + - 6.62

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.09 ± 4.87100.09 + - 4.87 부탄올 추출물Butanol extract 2020 110.83 ± 7.74110.83 + - 7.74 4040 111.44 ± 3.44111.44 + - 3.44 물 추출물Water extract 2020 107.91 ± 3.27107.91 + - 3.27 4040 105.60 ± 5.85105.60 ± 5.85 부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)Butanol
Active fraction 3
(MGS_B3) 2020 116.27 ± 0.05116.27 ± 0.05 4040 118.13 ± 11.27118.13 + - 11.27 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 2020 114.48 ± 8.77114.48 + - 8.77 4040 113.38 ± 1.03113.38 ± 1.03 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 2020 119.59 ± 8.09119.59 8.09 4040 114.60 ± 1.72114.60 ± 1.72 물
활성분획물 2번
(MGS_W2)water
Active fraction 2
(MGS_W2) 2020 113.38 ± 1.03113.38 ± 1.03 4040 115.09 ± 3.10115.09 + - 3.10

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) 세포생존율
(%, 평균±편차)Cell survival rate
(%, Mean ± deviation) 음성대조군Negative control group 00 100.09 ± 4.87100.09 + - 4.87 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 1010 101.95 ± 4.82101.95 + - 4.82 2020 98.91 ± 4.3098.91 + - 4.30 4040 97.81 ± 0.3497.81 + - 0.34 8080 97.32 ± 3.4497.32 ± 3.44 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 1010 98.18 ± 0.8698.18 ± 0.86 2020 98.78 ± 3.4498.78 + - 3.44 4040 98.05 ± 2.4198.05 + - 2.41 8080 93.07 ± 4.9993.07 ± 4.99

표 7 내지 표 9에 나타난 바와 같이, 나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 농도에 따른 H292 세포의 세포생존율을 조사해본 결과, 세포독성이 없음을 확인하였다.
As shown in Tables 7 to 9, the cell survival rate of H292 cells according to the concentrations of the extracts of Nagoya crassifolia, fractions and the compounds isolated therefrom was examined, and it was confirmed that there was no cytotoxicity.

실험예Experimental Example 2: 나한과 추출물 및  2: Nahan and extracts and 분획물의Fraction 항염증 효과 분석 Analysis of anti-inflammatory effect

실험예Experimental Example 2-1:  2-1: ILIL -6 생성 억제활성-6 production inhibitory activity

나한과 추출물 등의 항염효과를 분석하기 위하여, LPS를 처리한 Raw264.7 세포에서의 나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증관련 인자 생성 저해효과를 확인하였다.In order to analyze the anti - inflammatory effects of Nahan and extracts, the inhibitory effect of the extracts, fractions and compounds isolated therefrom on Raw264.7 cells treated with LPS was confirmed.

구체적으로 LPS로 유도된 IL-6의 생성량을 효소면역학적 분석키트(mouse IL-6 Duoset ELISA development system, R&D systems, USA)를 이용하여 측정하였다. 웰-플레이트에 Raw264.7 세포를 1×105 cells/ml의 농도로 분주하여 4시간 내지 16시간 동안 부착시킨 후, 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 각 농도별로 1시간 동안 처리하였다. LPS를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 6시간 또는 20시간 동안 배양시킨 후 상등액을 회수하였다. IL-6 항체가 코팅된 면역플레이트(Immuno-plate)에 분주하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 세척을 하고 제2차 항체를 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 재세척한 후 Streptavidin-HRP를 20분간 반응시킨 다음, 세척 후, 기질을 넣고 20분간 반응시킨 후, 황산용액으로 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 측정기로 450 nm에서 발색 정도를 측정하였다. Specifically, the amount of IL-6 production induced by LPS was measured using an enzyme immunoassay kit (mouse IL-6 Duoset ELISA development system, R & D systems, USA). Raw 264.7 cells were added to the well plate at a concentration of 1 x 10 5 cells / ml and allowed to attach for 4 hours to 16 hours. Then, the crude extracts, fractions and compounds prepared or isolated in Preparation Examples 1 and 2 Each concentration was treated for 1 hour. LPS was treated at a concentration of 0.5 / / ml and cultured for 6 hours or 20 hours, and the supernatant was recovered. The cells were dispensed into an Immuno-plate coated with IL-6 antibody and allowed to react for 2 hours. After the reaction, washing was performed, and the secondary antibody was dispensed and reacted for 1 hour. After washing, streptavidin-HRP was reacted for 20 minutes. After washing, substrate was added and reacted for 20 minutes. After stopping the reaction with sulfuric acid solution, the degree of color development was measured with a microplate meter at 450 nm.

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) LPSLPS IL-6
(pg/ml, 평균±편차)IL-6
(pg / ml, mean ± deviation) 저해율(%)Inhibition rate (%) 음성대조군Negative control group 00 -- -2.88 ± 2.42-2.88 + - 2.42 -- LPS처리군LPS treated group 00 ++ 241.33 ± 14.38241.33 + - 14.38 -- 에탄올
추출물
(total)ethanol
extract
(total) 55 ++ 224.13 ± 0.41224.13 + - 0.41 7.13 7.13 1010 ++ 222.29 ± 2.89222.29 ± 2.89 7.89 7.89 2020 ++ 234.96 ± 1.00234.96 ± 1.00 2.64 2.64 4040 ++ 248.96 ± 22.21248.96 ± 22.21 -3.16 -3.16 8080 ++ 175.54 ± 2.18175.54 ± 2.18 27.26 27.26 클로로폼
(CHCl3)
분획물Chloroform
(CHCl 3)
Fraction 55 ++ 213.96 ± 6.31213.96 ± 6.31 11.34 11.34 1010 ++ 226.08 ± 13.32226.08 ± 13.32 6.32 6.32 2020 ++ 193.42 ± 3.18193.42 ± 3.18 19.85 19.85 4040 ++ 186.58 ± 13.79186.58 ± 13.79 22.69 22.69 8080 ++ 145.00 ± 9.19145.00 ± 9.19 39.92 39.92 부탄올
(BuOH)
분획물Butanol
(BuOH)
Fraction 55 ++ 206.46 ± 9.96206.46 ± 9.96 14.45 14.45 1010 ++ 179.33 ± 13.08179.33 + - 13.08 25.69 25.69 2020 ++ 147.29 ± 8.78147.29 + - 8.78 38.97 38.97 4040 ++ 121.58 ± 18.03121.58 ± 18.03 49.62 49.62 8080 ++ 69.67 ± 8.4969.67 8.49 71.13 71.13 물
(H2O)
분획물water
(H 2 O)
Fraction 55 ++ 225.58 ± 4.36225.58 + - 4.36 6.53 6.53 1010 ++ 200.08 ± 7.07200.08 + - 7.07 17.09 17.09 2020 ++ 202.63 ± 28.11202.63 ± 28.11 16.04 16.04 4040 ++ 196.42 ± 5.30196.42 + - 5.30 18.61 18.61 8080 ++ 177.38 ± 11.25177.38 ± 11.25 26.50 26.50

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) LPSLPS IL-6
(pg/ml, 평균±편차)IL-6
(pg / ml, mean ± deviation) 저해율(%)Inhibition rate (%) 음성대조군Negative control group 00 -- -40.56 ± 2.51-40.56 + 2.51 -- LPS처리군LPS treated group 00 ++ 277.06 ± 5.58277.06 + - 5.58 -- 부탄올 분획물Butanol fraction 2020 ++ 193.72 ± 17.83193.72 ± 17.83 30.08 30.08 4040 ++ 88.00 ± 5.8188.00 ± 5.81 68.24 68.24 부탄올
활성분획물 1번
(MGS_B1)Butanol
Active fraction 1
(MGS_B1) 2020 ++ 315.33 ± 9.27315.33 + 9.27 -13.82 -13.82 4040 ++ 261.28 ± 9.35261.28 + - 9.35 5.69 5.69 부탄올
활성분획물 2번
(MGS_B2)Butanol
Active fraction 2
(MGS_B2) 2020 ++ 137.11 ± 1.26137.11 ± 1.26 50.51 50.51 4040 ++ 269.67 ± 3.30269.67 + - 3.30 2.67 2.67 부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)Butanol
Active fraction 3
(MGS_B3) 2020 ++ 52.67 ± 5.6652.67 ± 5.66 80.99 80.99 4040 ++ 55.11 ± 0.1655.11 + - 0.16 80.11 80.11 부탄올
활성분획물 4번
(MGS_B4)Butanol
Active fraction 4
(MGS_B4) 2020 ++ 193.44 ± 16.18193.44 + 16.18 30.18 30.18 4040 ++ 251.06 ± 3.38251.06 ± 3.38 9.38 9.38 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 2020 ++ 240.33 ± 10.21240.33 + - 10.21 13.25 13.25 4040 ++ 295.44 ± 17.44295.44 ± 17.44 -6.64 -6.64 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 2020 ++ -39.67 ± 2.67-39.67 + - 2.67 114.32114.32 4040 ++ -40.06 ± 0.24-40.06 + -0.24 114.46 114.46 물
활성분획물 2번
(MGS_W2)water
Active fraction 2
(MGS_W2) 2020 ++ 50.89 ± 2.3650.89 + - 2.36 81.63 81.63 4040 ++ 42.06 ± 4.4842.06 + - 4.48 84.82 84.82

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) LPSLPS IL-6 (pg/ml,
평균±편차)IL-6 (pg / ml,
Mean ± deviation) 저해율(%)Inhibition rate (%) 음성대조군Negative control group 00 -- -36.61 ± 2.75-36.61 + - 2.75 -- LPS처리군LPS treated group 00 ++ 187.33 ± 6.76187.33 + - 6.76 -- 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 2020 ++ 172.17 ± 8.25172.17 + - 8.25 8.15±4.408.15 + 4.40 4040 ++ 162.50 ± 0.71162.50 ± 0.71 13.31±0.3813.31 + - 0.38 8080 ++ 93.83 ± 10.1493.83 + - 10.14 49.94±5.4149.94 + - 5.41 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 2020 ++ 189.50 ± 7.15189.50 + - 7.15 -1.10±3.81-1.10 ± 3.81 4040 ++ 185.78 ± 10.21185.78 ± 10.21 0.89±5.450.89 ± 5.45 8080 ++ 65.78 ± 7.0765.78 + - 7.07 64.91±3.7764.91 + - 3.77

그 결과 상기 표 10 내지 표 12에서 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 군에서 IL-6의 발현양이 증가하였으나, 나한과 추출물, 분획물, 및 화합물의 농도에 따라 점차 감소하였음을 확인하였다. 특히 80 ㎍/㎖의 부탄올 분획물을 처리한 군에서 71.13%의 상당한 IL-6의 생성저해율을 나타내었음을 확인하였다. 또한, 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)에서 약 80%, 부탄올 활성분획물 6번(MGS_B6)에서 약 114%의 상당한 IL-6의 생성저해율을 나타내었음을 확인하였고, 분리한 화합물(MSG_W2-01, MSG_W2-02) 또한 80 ㎍/㎖의 농도에서 각각 49.9%, 64.9%의 IL-6 생성저해율을 보였다.
As a result, as shown in Tables 10 to 12, the expression level of IL-6 was increased in the LPS-treated group, but it was found to be gradually decreased according to the concentrations of the extracts, fractions and compounds. In particular, it was confirmed that the inhibition rate of IL-6 production was 71.13% in the group treated with 80 μg / ml butanol fraction. In addition, it was confirmed that IL-6 production inhibition rate was about 114% in the butanol active fraction No. 3 (MGS_B3) and about 80% in the butanol active fraction No. 6 (MGS_B6). The isolated compounds (MSG_W2-01, MSG_W2-02) also showed 49.9% and 64.9% inhibition of IL-6 production at the concentration of 80 ㎍ / ㎖, respectively.

실험예Experimental Example 2-2:  2-2: ILIL -6, -6, ILIL -1β 및 -1β and COXCOX -2의 유전자 발현 억제활성-2 gene expression inhibitory activity

트리졸(TrizolTMreagent , Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 처리된 세포로부터 리보핵산(RNA)을 추출하였다. 정량 후, Omniscript RT kit(Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 상보적 핵산(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형과 하기 표 13에 나타낸 IL-6, IL-1β, COX-2 및 β-actin 프라이머를 각각 혼합하고, PCR mix(DreamTaqTM PCR Master Mix, Fermentas, USA)를 사용하여 94℃에서 5분간 변성(Denaturation)을 하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30 사이클(cycle)을 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다. 대조군(내부 표준)으로는 β-actin(bioneer, 한국)을 사용하였다.RNA from the sols tree (TM reagent Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA) The cells were treated in the same manner as in Experimental Example 2-1 by using (RNA) was extracted. After quantitation, complementary nucleic acid (cDNA) was synthesized using Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany). The synthesized cDNA was mixed with a template and the IL-6, IL-1β, COX-2 and β-actin primers shown in Table 13 below and PCR was performed using a PCR mix (DreamTaq ™ PCR Master Mix, Fermentas, USA) Denaturation for 5 minutes and 30 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 45 seconds, followed by PCR at 72 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme . As a control (internal standard), β-actin (bioneer, Korea) was used.

유전자gene 프라이머primer IL-6IL-6 sensesense 5`-AAC GAT GAT GCA CTT GCA GA-3`5`-AAC GAT GAT GCA CTT GCA GA-3` 서열번호 1SEQ ID NO: 1 antisenseantisense 5`-GAG CAT TGG AAA TTG GGG TA-3`5`-GAG CAT TGG AAA TTG GGG TA-3` 서열번호 2SEQ ID NO: 2 IL-1βIL-1? sensesense 5`-GTG TCT TTC CCG TGG ACC TT-3`5`-GTG TCT TTC CCG TGG ACC TT-3` 서열번호 3SEQ ID NO: 3 antisenseantisense 5`-TCG TTG CTT GGT TCT CCT TG-3`5`-TCG TTG CTT GGT TCT CCT TG-3` 서열번호 4SEQ ID NO: 4 COX-2COX-2 sensesense 5’-GAA GTC TTT GGT CTG GTG CCT G -3’5'-GAA GTC TTT GGT CTG GTG CCT G -3 ' 서열번호 5SEQ ID NO: 5 antisenseantisense 5’-GTC TGC TGG TTT GGA ATA GTT GC-3’5'-GTC TGC TGG TTT GGA ATA GTT GC-3 ' 서열번호 6SEQ ID NO: 6 β-actinβ-actin sensesense 5`-TGT TTG AGA CCT TCA ACA CC-3`5`-TGT TTG AGA CCT TCA ACA CC-3` 서열번호 7SEQ ID NO: 7 antisenseantisense 5`-CGC TCA TTG CCG ATA GTG AT-3`5`-CGC TCA TTG CCG ATA GTG AT-3` 서열번호 8SEQ ID NO: 8

그 결과, LPS 처리에 따라 상기 유전자들의 발현이 증가하였으나, 나한과 추출물, 분획물 및 화합물의 농도에 따라 점차 감소하였음을 확인하였다. 특히, 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)에서 IL-6, IL-1β 및 COX-2의 발현이 급격히 감소함을 확인하였다(도 4).
As a result, the expression of the genes was increased according to the LPS treatment, but it was found to be gradually decreased according to the concentrations of the extracts, fractions and compounds. In particular, it was confirmed that the expression of IL-6, IL-1 beta and COX-2 abruptly decreased in butanol active fraction 3 (MGS_B3) (FIG.

실험예Experimental Example 2-3:  2-3: MUC5ACMUC5AC 생성 억제활성 - 만성폐쇄성 폐질환  Production inhibitory activity - chronic obstructive pulmonary disease

나한과 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 만성폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료효과를 분석하기 위하여, 나한과 추출물, 분획물 및 화합물의 MUC5AC 생성 저해 효과를 확인하였다.In order to analyze the preventive or therapeutic effect of the extracts, fractions and the compounds isolated therefrom from inflammatory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), the inhibitory effect on the MUC5AC formation of the extracts, fractions and compounds of the present invention was confirmed.

구체적으로, TNF-α로 유도된 MUC5AC의 생성량 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR, quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)과 MUC5AC 면역분석(immunoassay)을 이용하여 측정하였다. 세포준비는 48 웰-플레이트에 H292세포를 2×104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후, 0.1 % FBS를 포함한 배지로 교체하여 24 시간을 배양하였다. 상기 제조예 1 및 2에서 제조 또는 분리한 나한과 추출물, 분획물 및 화합물을 각 농도별로 2시간 동안 처리하였고, TNF-α를 20 ng/㎖ 의 농도로 처리하고, 12시간 배양하였다. Specifically, the amount of MUC5AC induced by TNF-α was measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) and MUC5AC immunoassay Respectively. For cell preparation, H292 cells were seeded in 48 well-plates at a concentration of 2 x 10 4 cells / well, adhered for 24 hours, and then cultured for 24 hours in a medium containing 0.1% FBS. The crude extracts, fractions and compounds prepared or isolated in Preparation Examples 1 and 2 were treated for 2 hours at each concentration, treated with TNF-α at a concentration of 20 ng / ml, and cultured for 12 hours.

Total RNA를 추출하기 위해서 TrizolB(invitrogen)을 사용하여 리보핵산(RNA)을 추출하였고, 정량 후, Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 상보적 핵산(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형과 하기 표 5에 나타낸 MUC5AC 및 GAPDH 프라이머를 각각 혼합하고, PCR mix(PCR Master Mix, Bioneer, Korea)를 사용하여 94℃에서 5분간 변성(Denaturation)을 하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 50초, 72℃에서 45초로 30 사이클(cycle)을 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다(표 14).To extract total RNA, ribonucleic acid (RNA) was extracted using TrizolB (Invitrogen). After quantification, complementary nucleic acid (cDNA) was synthesized using Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany). The synthesized cDNA was mixed with the template and the MUC5AC and GAPDH primers shown in Table 5 below. Denaturation was carried out at 94 ° C for 5 minutes using a PCR mix (PCR Master Mix, Bioneer, Korea) The reaction was carried out at 60 ° C for 50 seconds and at 72 ° C for 45 seconds for 30 cycles, followed by PCR at 72 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme (Table 14).

유전자gene 프라이머primer MUC5ACMUC5AC sensesense 5`-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3`5`-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3` 서열번호 9SEQ ID NO: 9 antisenseantisense 5`-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3`5`-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3` 서열번호 10SEQ ID NO: 10 GAPDHGAPDH sensesense 5`-CGG AGT CAA CGG ATTT GGT CGT AT -3`5`-CGG AGT CAA CGG ATTT GGT CGT AT -3` 서열번호 11SEQ ID NO: 11 antisenseantisense 5`-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3`5`-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3` 서열번호 12SEQ ID NO: 12

생성된 MUC5AC의 면역분석(immunoassay)을 위해서 회수한 상등액 50 uL를 96 웰-플레이트에 분주하고 50℃로 설정된 항온기에서 건조시켰다. PBS로 세척한 다음, MUC5AC 항체(abcam사)와 상온에서 반응하고, 2차 항체를 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 재세척한 후 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine peroxide solution를 20분간 반응시킨 다음, 황산용액으로 반응을 정지시킨후, 마이크로플레이트 측정기로 450 nm에서 발색 정도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 15 내지 17에 나타내었다.For immunoassay of the resulting MUC5AC, 50 uL of the supernatant recovered was dispensed into 96-well plates and dried in a thermostat set at 50 &lt; 0 &gt; C. After washing with PBS, the cells were reacted with MUC5AC antibody (abcam) at room temperature, and the secondary antibody was reacted for 1 hour. After re-washing, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine peroxide solution was reacted for 20 minutes. After the reaction was stopped with sulfuric acid solution, the degree of color development was measured at 450 nm with a microplate meter. Are shown in Tables 15 to 17.

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) TNF-αTNF-a MUC5AC mRNA
발현양
(TNF-α처리군에 대한 상대적인 %)MUC5AC mRNA
Expression level
(% Relative to TNF-a treated group) 저해율(%)Inhibition rate (%) 음성대조군Negative control group 00 -- 18.58 ± 1.1818.58 ± 1.18 81.8081.80 TNF-a처리군TNF-a treated group 00 ++ 100.38 ± 23.40100.38 + - 23.40 0.000.00 에탄올
추출물
(total)ethanol
extract
(total) 55 ++ 85.42 ± 0.4185.42 + - 0.41 14.9614.96 1010 ++ 55.12 ± 6.4755.12 + - 6.47 45.2645.26 2020 ++ 49.25 ± 4.1049.25 ± 4.10 51.1351.13 4040 ++ 24.01 ± 8.8524.01 + - 8.85 76.3776.37 클로로폼
(CHCl3)
분획물Chloroform
(CHCl 3)
Fraction 55 ++ 250.82 ± 6.15250.82 ± 6.15 -150.44-150.44 1010 ++ 519.36 ± 15.27519.36 ± 15.27 -418.98-418.98 2020 ++ 542.60 ± 53.10542.60 ± 53.10 -442.22-442.22 4040 ++ 87.73 ± 28.7187.73 ± 28.71 12.6512.65 부탄올
(BuOH)
분획물Butanol
(BuOH)
Fraction 55 ++ 96.10 ± 16.8796.10 ± 16.87 4.284.28 1010 ++ 67.90 ± 1.3367.90 ± 1.33 32.4832.48 2020 ++ 61.19 ± 1.1261.19 + - 1.12 39.1939.19 4040 ++ 67.72 ± 8.9467.72 + - 8.94 32.6632.66 물
(H2O)
분획물water
(H 2 O)
Fraction 55 ++ 66.73 ± 4.2566.73 + - 4.25 33.6533.65 1010 ++ 49.83 ± 0.4949.83 + 0.49 50.5550.55 2020 ++ 32.22 ± 10.6932.22 + - 10.69 68.1668.16 4040 ++ 20.81 ± 0.7120.81 ± 0.71 79.5779.57

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) TNF-αTNF-a MUC5AC 분비
(TNF-a처리군에 대한
상대적인 %)MUC5AC secretion
(For TNF-a treated group
Relative%) 저해율(%)Inhibition rate (%) 　음성대조군Negative control group 00 -- 43.70 ± 6.0143.70 ± 6.01 56.356.3 TNF-α 처리군　  TNF-α treated group 00 ++ 100.00 ± 9.66100.00 + - 9.66 00 에탄올 추출물Ethanol extract 2020 ++ 73.60 ± 1.0773.60 ± 1.07 26.426.4 4040 ++ 64.95 ± 1.7264.95 ± 1.72 35.0535.05 부탄올 분획물Butanol fraction 2020 ++ 83.46 ± 5.5883.46 + - 5.58 16.5416.54 4040 ++ 71.93 ± 7.7371.93 + - 7.73 28.0728.07 물 분획물Water fraction 2020 ++ 85.58 ± 0.4385.58 + - 0.43 14.4214.42 4040 ++ 67.22 ± 0.2467.22 + 0.24 32.7832.78 부탄올
활성분획물 3번
(MGS_B3)Butanol
Active fraction 3
(MGS_B3) 2020 ++ 103.79 ± 12.88103.79 ± 12.88 -3.79-3.79 4040 ++ 64.95 ± 2.1564.95 ± 2.15 35.0535.05 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 2020 ++ 82.40 ± 1.9382.40 ± 1.93 17.617.6 4040 ++ 79.36 ± 0.6479.36 ± 0.64 20.6420.64 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 2020 ++ 122.76 ± 0.64122.76 ± 0.64 -22.79-22.79 4040 ++ 147.04 ± 2.79147.04 + - 2.79 -47.04-47.04 물
활성분획물 2번
(MGS_W2)water
Active fraction 2
(MGS_W2) 2020 ++ 77.54 ± 1.5077.54 1.50 22.4622.46 4040 ++ 74.51 ± 0.6474.51 + - 0.64 25.4925.49

시료sample 농도
(㎍/ml)density
(占 퐂 / ml) TNF-αTNF-a MUC5AC
(TNF-a처리군에 대한 상대적인 %)MUC5AC
(% Relative to TNF-a treated group) 저해율(%)Inhibition rate (%) 　음성대조군Negative control group 00 -- 43.70 ± 6.0143.70 ± 6.01 56.356.3 TNF-α처리군TNF-α treated group 00 ++ 100.00 ± 9.66100.00 + - 9.66 00 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 55 ++ 93.02 ± 0.2193.02 + - 0.21 6.986.98 1010 ++ 82.25 ± 6.0182.25 ± 6.01 17.7517.75 2020 ++ 81.03 ± 2.1581.03 + - 2.15 18.9718.97 4040 ++ 79.06 ± 1.9379.06 ± 1.93 20.9420.94 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 55 ++ 101.97 ± 4.72101.97 + - 4.72 -1.97-1.97 1010 ++ 94.39 ± 1.2994.39 ± 1.29 5.615.61 2020 ++ 83.92 ± 7.0883.92 + - 7.08 16.0816.08 4040 ++ 88.77 ± 1.9388.77 ± 1.93 11.2311.23

그 결과 상기 표 15 내지 17에서 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 군에서 MUC5AC의 양이 증가하였고, 모든 시료물질(나한과 추출물, 분획물, 및 이로부터 분리한 화합물 1, 2)의 농도에 따라 발현양이 감소하였음을 확인하였다.As a result, as shown in Tables 15 to 17, the amount of MUC5AC in the group treated with TNF-a was increased, and the concentration of all the sample materials (NaCl and extracts, fractions and the compounds 1 and 2 isolated therefrom) And the amount of expression was decreased.

특히, (i) 표 15에서 물 분획물을 40㎍/㎖을 처리한 군에서 약 79.57%의 TNF-a의 생성저해율을 나타내었고, (ii) 표 16의 부탄올 활성분획물 3번(MGS_B3)을 40㎍/㎖ 처리한 군에서 약 35.05%, 물 활성분획물 2번(MGS_W2)을 40㎍/㎖ 처리한 군에서 약 25.49%의 TNF-a의 생성저해율을 나타내었다.
In particular, (i) the production inhibition rate of TNF-a was about 79.57% in the group treated with 40 μg / ml of the water fraction in Table 15, (ii) the butanol active fraction No. 3 (MGS_B3) The inhibition rate of TNF-a was about 25.49% in the group treated with about 35.05% of water-active fraction 2 (MGS_W2) and 40 / / ml of MGS_W2.

실험예Experimental Example 3: 나한과 추출물 및  3: Nahan and extracts and 분획물의Fraction 항천식Anti-asthma 효과 분석 Effect analysis

실험예Experimental Example 3-1: 실험동물 및 난백 알부민으로 기관지 천식 유도 3-1: induction of bronchial asthma with experimental animals and albumin albumin

본 발명에서는 평균 체중 20 g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였다. 1주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하였다. 순화기간을 거친 생쥐에게 2주 간격으로 2 mg수산화알루미늄(A8222, Sigma, St. Louis, MO)과 난백알부민 20 μg(A5503, Sigma, St. Louis, MO)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 ㎕를 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 21일부터 23일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기를 이용하여 30분간 흡입시켰다. 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고, 48시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈(엔토발, 한림제약주식회사)을 투여한 뒤, 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 ㎖의 생리식염수로 기관지폐포세척을 실시하여 검체를 수거하였다. In the present invention, 6-week old Balb / c female mice with an average weight of about 20 g were used as experimental animals. The subjects who did not have any abnormality on basic physical examination after 1 week of adaptation period were included. (A8222, Sigma, St. Louis, MO) and 20 μg of albumin albumin (A5503, Sigma, St. Louis, MO) were suspended in phosphate buffer (pH 7.4 ) Was injected into the abdominal cavity and sensitized. From the 21st to 23rd day after the administration of the first egg white albumin, 1% egg albumin was inhaled for 30 minutes using an ultrasonic atomizer. Twenty-four hours after the last egg white albumin exposure, bronchial hyperresponsiveness was measured. Forty-eight hours later, the lethal dose of pentobarbital (Entobar, Hallym Pharmaceutical Co., Ltd.) was administered and bronchial incision was performed. Total 1.2 ml of physiological saline To collect specimens.

실험군은 정상대조군(NC, 난백알부민 투여 및 흡입하지 않은 군), 천식유발군(OVA, 난백알부민 투여 및 흡입한 군), 양성대조군비교군(Mon, 난백알부민 흡입 1시간 전에 montelukast 30mg/kg, 을 경구투여한 군, 실험군으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 나한과 에탄올추출물(Total), 부탄올 활성분획물(MGS_B5, MGS_B6), 나한과에서 분리한 11-O-mogroside V(MGS_W02-01) 또는 mogroside V(MGS_W02-02)를 30 mg/kg의 용량으로 경구투여한 군으로 실험을 진행하였으며, 각 군당 7두의 흰쥐를 사용하였다. In the experimental group, montelukast 30 mg / kg, 1 hour before inhalation of albumin albumin (normal, control group), asthmatic induction group (OVA, ovalbumin administration and inhaled group) (MGS_W02-01), or mogroside V (MGS_W02-01), which were isolated from Bacillus thuringiensis extracts (total), butanol active fractions (MGS_B5 and MGS_B6) (MGS_W02-02) were orally administered at a dose of 30 mg / kg, and 7 rats were used per group.

약물 및 시료는 첫 번째 난백알부민 투여 후 21일부터 23일까지 경구투여 하였으며. 각 군당 7 두의 생쥐를 사용하였다. 실험 종료 후 각 군 생쥐의 혈액, 폐세척액 및 폐조직을 분리하였다.
The drug and the sample were orally administered from the 21st to 23rd day after the administration of the first egg white albumin. Seven mice in each group were used. After the experiment, the blood, lung lavage fluid and lung tissue of each group of mice were separated.

실험예Experimental Example 3-2: 기도과민성 ( 3-2: AHP AirwayAirway hyperresponsivenesshyperresponsiveness ) 측정) Measure

천식 발생에 의한 기도과민성을 측정하기 위해 일실체적변동기록기(one chamber plethysmography, All Medicus, Korea)를 이용하였다. 기도 저항의 정도는 수학적으로 계산된 기도의 폐색을 반영하는 수치인 enhaced pause(Pehn)을 측정하여 평가하였다. Pehn의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후, PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린(A2251, Sigma-Aldrich)을 12, 25, 50 mg/㎖의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh 값을 측정하였다. 수치는 하기 수학식 2에 나타난 바와 같이 계산하였고, 기저 Penh값(PBS chanllenge)을 100%로 하여, 각 농도의 메타콜린 흡입 후 Penh의 증가율을 백분율로 표현하였다.One-chamber plethysmography (All Medicus, Korea) was used to measure airway hyperresponsiveness due to asthma. The degree of airway resistance was assessed by measuring the enhaced pause (Pehn), which is a mathematically calculated reflectance of airway obstruction. Pehn was measured at baseline in normal respiration state, and then PBS was inhaled for 3 minutes using an ultrasonic atomizer and then measured for 3 minutes. Penh values were measured after inhaling methacholine (A2251, Sigma-Aldrich) at increasing concentrations of 12, 25 and 50 mg / ml. The numerical value was calculated as shown in Equation 2 below, and the increase rate of Penh after methacholine inhalation of each concentration was expressed as a percentage, with the baseline Penh value (PBS chanlenge) as 100%.

[수학식 2] &Quot; (2) &quot;

Figure pat00008

Figure pat00008

Te : expiratory time(sec)(흡기에서 다음 흡기까지 걸리는 시간)Te: expiratory time (sec) (time taken from inspiration to next inspiration)

RT : relaxation time(호기동안 호기양이 일회호흡양의 30%가 남을 때까지 걸리는 시간)RT: relaxation time (the time it takes for the expiration volume to reach 30% of the single breath volume)

PEF : Peak expiration flowPEF: Peak expiration flow

PIF : Peak inspiration flow
PIF: Peak inspiration flow

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 난백알부민을 처리한 천식 동물모델에서 천식유도군(OVA)은 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 정상대조군에 비하여 기도과민성이 크게 증가하였다. 반면, 양성대조군인 montelukast 투여군은 천식유도군에 비해 기도과민성이 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 감소하였다. 또한 상기 모든 실험군(시료물질 투여군)에서 메타콜린(methylcholine)의 농도가 증가함에 따라 천식유발군에 비해 현저한 기도과민성의 감소가 관찰되었으며, 이러한 효과는 특히 나한과 추출물, 부탄올 활성분획물(MGS_B5), mogroside V (MGS_W02-02) 투여군에서 크게 관찰되었다.
As a result, as shown in FIG. 5, the asthma induction group (OVA) in the asthmatic animal model treated with albumin significantly increased the airway hyperresponsiveness as the methylcholine concentration increased. On the other hand, the bronchial hyperresponsiveness of montelukast treated group was significantly decreased as the concentration of methacholine increased. In addition, as the concentration of methylcholine was increased in all the experimental groups (sample preparation group), a significant decrease in airway hyperresponsiveness was observed compared to the asthmatic induction group. This effect was particularly noticeable in the case of the extracts of butanol fraction, MGS_B5, mogroside V (MGS_W02-02) treated group.

실험예Experimental Example 3-3: 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 분석 3-3: Analysis of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid

호산구의 증가는 천식에 있어 주요한 특징 중에 하나인 바, 이를 측정하기 위하여, 하기와 같이 실시하였다. 상기 실험예 3-1에서 수득한 각 개체의 기관지 폐포 세척액은 회수된 즉시 트리판블루(Trypan Blue)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 계산한 다음 사이토스핀(Cytospin, Hanil, Korea)을 이용하여 세포를 슬라이드에 부착시킨 후, Diff-Quik 염색 (Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경을 통해 검경한 후, 각 샘플별 염증세포 수를 세었다.The increase of eosinophils is one of the main characteristics of asthma. The bronchial alveolar lavage fluid obtained in Experimental Example 3-1 was stained with trypan blue immediately after collection, and the total number of cells, excluding dead cells, was calculated using a hemocytometer, (Cysospin, Hanil, Korea), and then subjected to Diff-Quik staining (Sysmex, Switzerland) to examine eosinophils and other inflammatory cells through a microscope. Then, The number was counted.

그 결과, 천식유도군에서는 정상대조군에 비해 호산구를 비롯한 염증세포의 수가 크게 증가하였다. 반면, 나한과 추출물 등의 모든 시료물질 투여군에서 염증세포 및 호산구의 현저한 감소가 관찰되었다(도 6).
As a result, the number of inflammatory cells including eosinophils was significantly increased in the asthma induction group compared with the normal control group. On the other hand, a significant decrease in inflammatory cells and eosinophils was observed in all the sample-treated groups such as Nahan and extract (Fig. 6).

실험예Experimental Example 3-4: 기관지 폐포세척액 ( 3-4: Bronchoalveolar lavage fluid ( BALFBALF ) 내 사이토카인 분석) My cytokine analysis

상기 실시예 2의 각 개체에서 분리한 기관지 폐포세척액에서 Th2 타입-사이토카인인 인터루킨(IL-5, IL-13)의 생성량을 시판용 효소면역분석(Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) 키트(R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 사이토카인의 분석은 제조사의 실험방법에 따라 실시하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, USA)기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 18과 같다.The amount of interleukin (IL-5, IL-13), which is a Th2 type cytokine, was measured in an ELISA kit (R & D System) , USA). Each cytokine was analyzed according to the manufacturer's test method, and the absorbance was measured at 450 nm through an ELISA reader (Molecular Devices, USA). The results are shown in Table 18 below.

GroupGroup IL-5 IL-5 IL-13IL-13 생성량 (pg/mL)Production (pg / mL) 억제율 (%)% Inhibition 생성량 (pg/mL)Production (pg / mL) 억제율 (%)% Inhibition 정상대조군(NC)The normal control (NC) 26.4±4.4026.4 ± 4.40 -- 21.1±1.3521.1 ± 1.35 -- 천식유도군(OVA)The asthma induction group (OVA) 43.2±5.99# 43.2 ± 5.99 # -- 43.7±7.31# 43.7 ± 7.31 # -- 양성대조군(Mon)Positive control (Mon) 35.6±9.6035.6 ± 9.60 17.517.5 37.8±5.1537.8 ± 5.15 13.513.5 나한과Nahan 추출물
(Total)extract
(Total) 29.6±8.30* 29.6 ± 8.30 * 31.531.5 28.0±2.15* 28.0 ± 2.15 * 36.036.0 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 31.3±7.45* 31.3 ± 7.45 * 27.527.5 33.0±5.18* 33.0 ± 5.18 * 24.524.5 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 32.7±6.00* 32.7 ± 6.00 * 24.324.3 36.3±6.3536.3 ± 6.35 17.117.1 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 23.6±2.62* 23.6 ± 2.62 * 45.545.5 34.0±5.86* 34.0 ± 5.86 * 22.222.2 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 32.7±3.54* 32.7 ± 3.54 * 24.424.4 34.0±3.75* 34.0 ± 3.75 * 22.222.2

#정상 대조군 (NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05) # Statistically significant (p <0.05) compared to normal control (NC)

*천식 유도군 (OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우 (p<0.05)
 * Statistically significant (p <0.05) as compared with asthma induction group (OVA)

그 결과, 표 18에서 나타낸 바와 같이, Th2 타입의 사이토카인인 IL-5 및 IL-13은 천식유발군에서 정상군에 비해 현저하게 증가하였다. 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군과 모든 시료물질 투여군은 Th2 사이토카인이 천식유발군에 비해 크게 억제되었다.
As a result, as shown in Table 18, the Th2 type cytokines IL-5 and IL-13 were significantly increased in the asthma-induced group compared to the normal group. On the other hand, the positive control group, Montelukast group, and all the test substance group, Th2 cytokine were significantly inhibited compared to the asthmatic group.

실험예Experimental Example 3-5:  3-5: 혈청내Serum IgEIgE 및  And 난백알부민Albumin albumin 특이  singularity IgEIgE 측정 Measure

난백알부민 특이 IgE의 측정을 위하여 ELISA법을 이용하였다. 난백알부민 특이 IgE는 96-well flat bottom ELISA plate에 난백알부민을 20 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M NaHCO3 완충액(pH 8.3)에 녹여 4℃에서 overnight 코팅시켰다. 그 후 1% bovine serum albumin(BSA)이 함유된 PBS로 비특이 반응을 억제시켰다. 혈청 검체는 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척하였다. 잘 세척한 후 항-마우스 IgE 단일클론성 항체(anti-mouse IgE monoclonal antibody)를 300배 희석하여 2시간 반응시켰다. 그 후, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 항-래트 IgG 다중클론성 항체(HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal Antibody)를 4000 배 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 발색은 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrate로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 19과 같다.ELISA was used for the measurement of egg white albumin specific IgE. Egg white albumin-specific IgE was dissolved in 0.1 M NaHCO 3 buffer (pH 8.3) at a concentration of 20 μg / ml in a 96-well flat bottom ELISA plate overnight at 4 ° C. Afterwards, PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) inhibited the non-specific response. Serum samples were diluted 1: 400, reacted at room temperature for 2 hours, and then washed with PBS containing 0.05% Tween 20. After washing well, anti-mouse IgE monoclonal antibody was diluted 300-fold and reacted for 2 hours. Then, peroxidase conjugated anti-rat IgG polyclonal antibody (HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal antibody) was diluted 4000 times and reacted at room temperature for 1 hour. The color development was carried out with 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine substrate, and the absorbance at 450 nm was measured. The results are shown in Table 19 below.

GroupGroup 난백알부민 특이 IgEEgg white albumin specific IgE 생성량 (pg/mL)Production (pg / mL) 억제율 (%)% Inhibition 정상대조군(NC)The normal control (NC) -- -- 천식유도군(OVA)The asthma induction group (OVA) 188.7±47.24188.7 ± 47.24 -- 양성대조군(Mon)Positive control (Mon) 143.5±49.25143.5 ± 49.25 24.024.0 나한과Nahan 추출물(Total)Extract (Total) 130.4±30.14130.4 ± 30.14 30.930.9 부탄올
활성분획물 5번
(MGS_B5)Butanol
Active fraction 5
(MGS_B5) 123.1±51.95123.1 ± 51.95 34.834.8 부탄올
활성분획물 6번
(MGS_B6)Butanol
Active fractions 6
(MGS_B6) 117.0±39.22117.0 + - 39.22 38.038.0 화합물 1
11-O-mogroside V
(MSG_W2-01)Compound 1
11- O- mogroside V
(MSG_W2-01) 147.2±57.27147.2 ± 57.27 22.022.0 화합물 2
Mogroside V
(MSG_W2-02)Compound 2
Mogroside V
(MSG_W2-02) 124.9±40.49124.9 ± 40.49 33.833.8

그 결과, 표 19에서 나타낸 바와 같이, 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)는 천식유발군에서 정상군에 비해 크게 증가하였으며, 반면 양성대조군인 Montelukast 투여군은 천식유발군에 비해 현저하게 감소되었다. 한편 나한과 추출물 등의 모든 시료물질 투여군에서 난백알부민 특이 IgE(OVA specific IgE)가 현저히 감소하였다.
As shown in Table 19, ovarian albumin-specific IgE (OVA specific IgE) was significantly increased in the asthmatic-induced group compared with the normal group, whereas the montelukast-treated group, which was a positive control group, On the other hand, OVA - specific IgE was significantly decreased in all samples treated with NaHa and extract.

실험예Experimental Example 3-6: 조직병리학적 검사 3-6: Histopathological examination

폐조직의 염증정도를 평가하기 위하여, 적출된 폐조직은 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4μm 두께로 영구조직 절편을 제작하였다.To evaluate the degree of inflammation of the lung tissue, the extracted lung tissue was subjected to formalin fixation and paraffin embedding to prepare a permanent tissue slice 4 μm thick.

이후, (1) 폐조직내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, (2) 기관지내 점액분비는 천식이 유발된 경우 현저하게 증가되므로, 이를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc., USA) 염색을 수행하였다. 광학현미경을 이용하여 폐조직의 병리학적 변화를 검경하였다.
Hematoxylin and eosin staining was performed to observe inflammation in the lung tissue. (2) Mucin secretion was significantly increased when asthma was induced, and periodic acid Schiff (PAS, IMEB) was used to observe the inflammation. , USA). Pathological changes of pulmonary tissues were examined using an optical microscope.

(1) 폐조직 내 염증반응을 관찰한 결과, 천식유발군의 폐조직의 기도 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 기도 감작되지 않은 정상대조군보다 난백알부민에 의한 천식 유도군(OVA)에서 상피세포가 손상되어 있었으며, 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었다. 반면, montelukast 투여군에서는 이러한 염증세포의 침윤의 감소가 인정되었으며, 또한 나한과 추출물(Total)을 비롯한 모든 시료물질 투여군에서, 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨이 확인되었다. 이러한 감소는 montelukast 투여군과 비교하여 볼 때, 유사하게 관찰되었다(도 7). (1) Observation of inflammatory reaction in lung tissue revealed extensive infiltration of inflammatory cells around airway and blood vessels of lung tissue of asthmatic induction group. The epithelial cells were damaged in asthma induction group (OVA) induced by egg white albumin, and many inflammatory cells including eosinophils were invaded around bronchial tubes. On the other hand, it was confirmed that infiltration of inflammatory cells was decreased in the montelukast group, and infiltration of inflammatory cells around the bronchi and blood vessels was reduced in all the sample group including the nannai extract. This reduction was similarly observed when compared to the montelukast treated group (Fig. 7).

(2) 기관지내 점액분비 결과를 관찰한 결과, 천식유발군에서는 기관지상피의 배상세포에서 점액분비의 증가가 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 점액분비가 감소되었고, 또한 나한과 추출물(Total)을 비롯한 모든 시료물질 투여군에서, 기관지상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 8).
(2) Observation of mucus secretion results in bronchial epithelium showed an increase in mucin secretion in bronchial epithelial cells. On the other hand, mucin secretion was reduced in the montelukast-treated group, and mucous secretion of the bronchial epithelial gland cells was remarkably decreased in all the sample-treated groups including the nalgrass and total extract (Fig. 8).

이상의 결과를 통해 본 발명에 따른 나한과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물이 천식의 억제 활성을 보유함을 확인하였다.
From the above results, it was confirmed that the extracts of the present invention, its fractions and the compounds isolated therefrom possess asthma-suppressing activity.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, as well as all changes or modifications derived from the meaning and scope of the appended claims and their equivalents.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Hwapyung D&F Co., Ltd <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment inflammatory diseases comprising Siraitia grosvenori extract or fractions thereof, or compounds isolated from therefrom <130> KPA140044-KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 sense primer <400> 1 aacgatgatg cacttgcaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 antisense primer <400> 2 gagcattgga aattggggta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b sense primer <400> 3 gtgtctttcc cgtggacctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b antisense primer <400> 4 tcgttgcttg gttctccttg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 sense primer <400> 5 gaagtctttg gtctggtgcc tg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 antisense primer <400> 6 gtctgctggt ttggaatagt tgc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin sense primer <400> 7 tgtttgagac cttcaacacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin antisense primer <400> 8 cgctcattgc cgatagtgat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC sense primer <400> 9 tgatcatcca gcagcagggc t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC antisense primer <400> 10 ccgagctcag aggacatatg gg 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 11 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 12 agccttctcc atggtggtga agac 24 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology          Hwapyung D & F Co., Ltd <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment          inflammatory diseases comprising Siraitia grosveniori extract or          fractions thereof, or compounds isolated from therefrom <130> KPA140044-KR <160> 12 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> IL-6 sense primer <400> 1 aacgatgatg cacttgcaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 antisense primer <400> 2 gagcattgga aattggggta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> IL-1b sense primer <400> 3 gtgtctttcc cgtggacctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b antisense primer <400> 4 tcgttgcttg gttctccttg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 sense primer <400> 5 gaagtctttg gtctggtgcc tg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 antisense primer <400> 6 gtctgctggt ttggaatagt tgc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin sense primer <400> 7 tgtttgagac cttcaacacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin antisense primer <400> 8 cgctcattgc cgatagtgat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC sense primer <400> 9 tgatcatcca gcagcagggc t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC antisense primer <400> 10 ccgagctcag aggacatatg gg 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 11 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 12 agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims (20)

나한과 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
Figure pat00009

[화학식 2]
Figure pat00010

A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, comprising the extract of Aspergillus niger, an extract thereof, a fraction thereof, a compound having the structure of the following formula (1) or (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]
Figure pat00009

(2)
Figure pat00010

 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
The method of claim 1, wherein the extract is water, carbon number 1 (C 1) to 4 will be extracted by using alcohol or a mixed solvent of (C 4) composition.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올로 추출한 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the extract is extracted with ethanol.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
The method of claim 1, wherein the fraction was fractionated using or one and the ethanol extract of water, carbon number 1 (C 1) to 4 (C 4) alcohols, chloroform, ethyl acetate, hexane, butanol, or a mixed solvent of &Lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
The composition according to claim 1, wherein the fraction is obtained by fractionating an ethanol extract of Alena with water, butanol or a mixed solvent thereof.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 추가적으로 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매를 용출용매로 사용하여 분리한 활성분획물인 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein said fraction is an active fraction that is further fractionated by column chromatography using a butanol fraction of the crude extract and ethanol extract and separated using water, methanol or a mixed solvent thereof as an elution solvent.
제6항에 있어서, 상기 활성분획물은 물과 메탄올의 혼합용매의 농도구배를 90:10 → 0:100 으로 하여 수득한 것인 조성물.
The composition according to claim 6, wherein the active fraction is obtained by adjusting the concentration gradient of the mixed solvent of water and methanol to 90:10 to 0: 100.
제6항에 있어서, 상기 활성분획물은 상기 용출용매를 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 35분 내지 190분간 용출시켜 수득한 것인 조성물.
7. The composition of claim 6, wherein the active fraction is obtained by eluting the eluting solvent at a rate of 30 to 50 ml / min for 35 to 190 minutes.
제1항에 있어서, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in the above extract, fraction thereof, or a compound represented by the following formula 1 or 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof isolated therefrom &Lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 IL-6, IL-1β, COX-2 및 MUC5AC의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. The method according to claim 1, wherein the extract is a mixture of IL-6, IL-1 [beta], COX-2 and MUC5AC &Lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.및 MUC5AC의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 1, wherein the inflammatory disease is selected from the group consisting of asthma, chronic obstructive pulmonary disease, allergy, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, psoriasis, anaphylaxis, dermatitis, diabetic retinopathy, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diabetic nephropathy, diabetic nephropathy, nephritis, Sjogren's syndrome, Crohn's disease, autoimmune pancreatitis, periodontal disease, graft- A disease, endometritis, rhinitis, tonsillitis, otitis media, sore throat, cystitis, and chronic prostatitis, and to reduce the production of MUC5AC.
나한과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
Figure pat00011

[화학식 2]
Figure pat00012

A food composition for preventing or ameliorating an inflammatory disease, comprising the extract of Aspergillus oryzae, a fraction thereof, or a compound represented by the following formula (1) or (2) isolated therefrom as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]
Figure pat00011

(2)
Figure pat00012

 제12항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것인 조성물.
The method of claim 12, wherein the extract is water, carbon number 1 (C 1) to 4 will be extracted by using alcohol or a mixed solvent of (C 4) composition.
제12항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올로 추출한 것인 조성물.
13. The composition of claim 12, wherein the extract is extracted with ethanol.
제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획하여 수득한 것인 조성물.
13. The method of claim 12, wherein said fraction is a fraction with the or one and the ethanol extract of water, carbon number 1 (C 1) to 4 (C 4) alcohols, chloroform, ethyl acetate, hexane, butanol, or a mixed solvent of &Lt; / RTI &gt;
제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과의 에탄올 추출물을 물, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
13. The composition according to claim 12, wherein the fraction is obtained by fractionating an ethanol extract of a plant with water, butanol or a mixed solvent thereof.
제12항에 있어서, 상기 분획물은 나한과 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 추가적으로 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매를 용출용매로 사용하여 분리한 활성분획물인 것인 조성물.
13. The composition of claim 12, wherein said fraction is an active fraction that is further fractionated by column chromatography using a butanol fraction of the crude extract and ethanol extract and separated using water, methanol or a mixed solvent thereof as an elution solvent.
제17항에 있어서, 상기 활성분획물은 물과 메탄올의 혼합용매의 농도구배를 90:10 → 0:100 으로 하여 수득한 것인 조성물.
18. The composition according to claim 17, wherein the active fraction is obtained by adjusting the concentration gradient of the mixed solvent of water and methanol to 90: 10 - &gt; 0: 100.
제17항에 있어서, 상기 활성분획물은 상기 용출용매를 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 35분 내지 190분간 용출시켜 수득한 것인 조성물.
18. The composition of claim 17, wherein the active fraction is obtained by eluting the elution solvent at a rate of 30 to 50 ml / min for 35 to 190 minutes.
제12항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성 폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 조성물.The method of claim 12, wherein the inflammatory disease is selected from the group consisting of asthma, chronic obstructive pulmonary disease, allergy, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, psoriasis, anaphylaxis, dermatitis, diabetic retinopathy, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diabetic nephropathy, diabetic nephropathy, nephritis, Sjogren's syndrome, Crohn's disease, autoimmune pancreatitis, periodontal disease, graft- A disease, endometritis, rhinitis, tonsillitis, otitis media, sore throat, cystitis, and chronic prostatitis.
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