KR20150063447A - 알파-시누클레인을 인식하는 항체 - Google Patents

알파-시누클레인을 인식하는 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일클론 항체 5C1 및 관련 항체를 제공한다. 5C1 항체는 α-시누클레인의 잔기 118-126 내 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, α-시누클레인, 특히 α-시누클레인 침착물의 축적과 연관된 질병을 치료 및/또는 진단하는데 유용하다. 이러한 질병은 루이체 질환, 예컨대 파킨슨병, 확산성 루이체 질환(DLBD), 알츠하이버 질환의 루이체 변이체(LBV), 복합 알츠하이머 및 파킨슨 질환, 순수 자율신경계 부전 및 다계통 위축증(MSA)을 포함한다.

Description

알파-시누클레인을 인식하는 항체{ANTIBODIES RECOGNIZING ALPHA-SYNUCLEIN}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 10월 8일 출원된 미국 출원 제61/711,204호, 2012년 10월 26일 출원된 미국 출원 제61/719,281호, 2013년 6월 27일 출원된 미국 출원 제61/840,432호, 및 2013년 8월 30일 출원된 미국 출원 제61/872,366호의 35 U.S.C. §119(e) 하의 혜택을 주장하며, 이들 모두를 모든 목적을 위해 그 전체로 참조하여 편입시킨다.
서열 목록
서열번호 1-40을 포함하는 서열 목록을 그 전체로 참조하여 본원에 첨부하고 편입시킨다. ASCII 형식의 상기 목록은 _______일에 생성되었고, 명칭은 ______.txt이며, 크기는 ______ bytes이다.
루이체 질환(LBD)이라고도 알려진 시누클레인병증(synucleinopathy)은 도파민 시스템의 퇴행, 운동 변경, 인지 장애, 및 루이체(LB) 및/또는 루이 신경돌기의 형성을 특징으로 한다(McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). 시누클레인병증은 파킨슨병(특발성 파킨슨병 포함), 루이체 수반 치매(DLB)라고도 알려진 확산성 루이체 질환(DLBD), 알츠하이머병의 루이체 변이체(LBV), 복합성 알츠하이머 및 파킨슨병, 순수 자율신경계 부전 및 다계통 위축증(MSA; 예를 들면, 올리브교소뇌 위축증, 줄무늬체흑질변성 및 샤이-드래거 증후군)을 포함한다. 몇몇 비운동 징후 및 증상은 질환의 전구 단계(즉, 증상발현전, 준임상, 전임상, 또는 전운동 시기)의 시누클레인병증에 대한 조짐으로 여겨진다. 이러한 초기 징후에는 예를 들면, REM 수면 행동 장애(RBD), 후각 상실 및 변비가 포함된다(Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). 루이체 질환은 노화 집단에서의 운동 장애 및 인지 악화에 대한 일반적인 원인으로 지속된다(Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95).
α-시누클레인은 β-시누클레인 및 γ-시누클레인 및 시노레틴을 포함하는 단백질의 거대 패밀리의 일부이다. α-시누클레인은 시냅스와 연관된 정상 상태에서 발현되고 신경 가소성, 학습 및 기억에서 역할을 하는 것으로 여겨진다. 몇몇 연구는 PD 발병에서의 중추적인 역할과 α-시누클레인이 연루되어 있다고 한다. 이 단백질은 응집되어 병리적 상태에서 불용성 소섬유를 형성할 수 있다. 예를 들면, 시누클레인은 LB에 축적된다(Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). α-시누클레인 유전자 내 돌연변이는 흔치 않은 파킨슨증의 가족형과 함께 분리된다(Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). 형질전환 마우스(Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) 및 초파리(Feany et al., Nature (2000) 404:394-8)에서 α-시누클레인의 과발현은 루이체 질환의 몇몇 병리적 측면을 모방한다. 또한, 시누클레인의 가용성 올리고머가 신경 독성일 수 있다고 제안된 바 있다(Conway et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J. Biochem. (2003) 42:7871-7878). 인간, 마우스, 및 파리와 같이 다양한 종 및 동물 모델에서 유사한 형태적 및 신경적 변경이 존재하는 α-시누클레인의 축적은 이 분자가 루이체 질환의 발병 원인이 됨을 시사한다.
본 발명은 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3개 경쇄 CDR 및 단일클론 항체 5C1의 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3개 중쇄 CDR을 갖는 단일클론 항체를 제공하고, 단 CDRH2 이외에 각각의 CDR은 최대 4 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있고, CDRH2는 최대 6 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 5C1은 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이다. 경우에 따라서, 이 항체는 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3 경쇄 CDR 및 단일클론 항체 5C1의 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3 중쇄 CDR을 갖는다. 경우에 따라, 단일클론 항체는 단일클론 항체 5C1의 인간화, 키메라, 또는 비니어드(veneered) 형태이다. 경우에 따라, 항체는 Fab 단편, 또는 단쇄 Fv이다. 경우에 따라서, 항체는 인간 IgG1의 이소타입을 갖는다. 경우에 따라, 항체는 인간 IgG2의 이소타입 또는 IgG4 이소타입을 갖는다.
본 발명은 H4(서열번호 17)와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 인간 알파 시누클레인에 특이적으로 결합한다. 일부 이러한 항체는 서열번호 9의 3 카밧 CDR 및 서열번호 24의 3 카밧 CDR을 포함한다. 일부 항체에서, 위치 H11, H27, H30, H48, 및 H73 중 1 이상은 각각 L, Y, T, I, 및 K가 차지하고, 위치 L12 및 L14는 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 H11, H27, H30, H48, 및 H73은 각각 L, Y, T, I, 및 K가 차지하고, 위치 L12 및 L14는 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 H67, H69, H91, 및 H94 중 1 이상은 각각 A, L, F, 및 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 H67, H69, 및 H94는 각각 A, L, 및 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 H94는 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 L2, L45, L49, 및 L87 중 1 이상은 각각 V, K, N, 및 F가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 L2, L49, 및 L87은 각각 V, N, 및 F가 차지한다. 일부 항체는 H4(서열번호 17)와 95% 이상이 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)과 95% 이상 동일한 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 항체에서, H4 및 L3(각각 서열번호 17 및 31) 유래의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 성숙한 경쇄 가변 영역의 CDR 내 임의의 차이는 위치 H60-H65에 존재한다.
일부 항체는 H4(서열번호 17)로 지정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)으로 지정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 항체는 H5(서열번호 18)로 지정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)으로 지정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
임의의 상기 항체에서, 항체는 불변 영역에 1 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 경우에 따라, 돌연변이는 불변 영역에 의한 보체 고정 또는 활성화를 감소시킨다. 경우에 따라, 항체는 EU 번호매김에 의한 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 및 331 중 1 이상에 돌연변이를 갖는다. 경우에 따라서, 항체는 위치 318, 320 및 322에 알라닌을 갖는다.
임의의 상기 항체에서, 성숙한 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있고, 성숙한 경쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합될 수 있다.
임의의 상기 항체에서, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해서 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소된 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태일 수 있다.
임의의 상기 항체에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 이소타입일 수 있다. 일부 항체에서, 알로타입은 G1m3이다. 일부 항체에서, 알로타입은 G1m1이다.
본 발명은 또한 마우스 항체 5C1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하는 단계, 상기 마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화 중쇄를 코딩하는 핵산 및 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계, 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시켜 인간화 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항체를 인간화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포가 항체를 분비하도록 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체 5C1의 인간화, 키메라 또는 비니어드 형태를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항체의 중쇄 및 경쇄 및 선별 마커를 코딩하는 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 벡터의 복제수가 증가된 세포를 선별하기 위한 조건 하에서 세포를 증식시키는 단계; 선별된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 항체의 수율을 기반으로 선별된 단일 세포로부터 복제된 세포를 저축(banking)하는 단계를 포함하는, 항체 5C1의 인간화, 키메라 또는 비니어드 형태를 생산하는 세포주를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 이러한 방법은 선별 조건 하에서 세포를 증식시키는 단계 및 100 mg/L/106 세포/24시 이상을 천연적으로 발현 및 분비하는 세포주를 스크리닝하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 임의의 상기 언급된 항체를 포함하는 약학 조성물을 더욱 제공한다.
본 발명은 임의의 상기 언급한 항체의 효과적인 요법(regime)을 투여하여서 질환의 치료 또는 예방을 실시하는 것을 포함하는 루이체 질환을 치료하거나 또는 예방을 실시하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 상기 언급한 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 루이체 질환을 갖거나 또는 루이체 질환의 위험성이 있는 환자에서 루이체 형성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 상기 언급된 항체의 유효한 요법(regime)을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 방법에서, 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 질환은 REM 수면 행동 장애(RBD)이다. 일부 방법에서, 질환은 루이체 수반 치매(DLB) 또는 다계통 위축증(MSA)이다. 일부 방법에서, 환자에서의 인지 기능 감퇴를 억제한다. 일부 방법에서, 신경돌기 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집을 감소시킨다. 일부 방법에서, 환자에서의 신경돌기 위축증이 감소된다. 일부 방법에서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도가 보존된다. 일부 방법에서, 이 방법은 환자에서 시냅토파이신 및/또는 MAP2를 보존한다.
본 발명은 또한, 임의의 상기 언급된 항체에 의해 정의된 바와 같은 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 시누클레인 응집을 억제하거나 또는 루이체 또는 시누클레인 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 이러한 방법에서 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 환자에서 인지 기능의 감퇴를 억제한다. 일부 방법에서, 신경돌기 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집을 감소시킨다. 일부 방법에서, 환자의 신경돌기 위축증을 감소시킨다. 일부 방법에서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도는 보존된다. 일부 방법에서, 이 방법은 환자에서 시냅토파이신 및/또는 MAP2를 보존한다.
본 발명은 임의의 상기 언급된 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계로서, 여기서 항체는 루이체에 결합하는 것인 단계, 및 환자에서 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 루이체를 검출하는 방법을 더 제공한다. 경우에 따라, 항체는 표지된다.
본 발명은 임의의 상기 언급한 항체를 코딩하는데 적합한 단리된 핵산, 벡터 또는 벡터들, 및 숙주 세포를 더 제공한다.
도 1은 마우스 5C1 중쇄 성숙한 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다. 카밧 정의에 따른 CDR 영역은 밑줄 및 굵게 표시하였다.
도 2는 마우스 5C1 경쇄 성숙 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다. 카밧 정의에 따른 CDR 영역은 밑줄 및 굵게 표시하였다.
도 3은 모리스 수중 미로 시험(Morris water maze test)의 프로브 부분에서 기억력 수행에 대한 5C1을 이용한 능동 면역요법의 결과를 도시한다.
도 4는 라운드 빔 시험(round beam test)에서 속력 및 실수에 대한 5C1을 이용한 능동 면역요법의 결과를 도시한다.
도 5는 상이한 인간화된 5C1 항체의 친화성을 시험한 ELISA 어세이의 결과를 도시한다.
도 6은 9E4 항체가 결합하는 α-시누클레인의 에피토프를 결정하기 위해 사용된 알라닌 스캔 돌연변이유발 실험의 결과이다. 도면의 상단부는 9E4 항체(좌측 패널) 또는 대조군 항체 1H7(우측 패널)로 염색된 전장 α-시누클레인(표시한 바와 같이 야생형 또는 잔기 118-126의 개별 점 돌연변이)의 웨스턴 블랏을 보여준다. 도면의 하단부는 9E4 항체가 결합되는 α-시누클레인의 에피토프를 도시한다.
도 7은 5C1 항체가 결합되는 α-시누클레인의 에피토프를 결정하기 위해 사용된 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험의 결과이다. 도면의 상단부는 5C1 항체(좌측 패널) 또는 대조군 항체 1H7(우측 패널)로 염색된 전장 α-시누클레인(표시한 바와 같이, 야생형 또는 잔기 118-126의 개별 점 돌연변이)의 웨스턴 블랏을 보여준다. 도면의 하단부는 5C1 항체가 결합되는 α-시누클레인의 에피토프를 도시한다.
도 8은 5D12 항체가 결합되는 α-시누클레인의 에피토프를 결정하기 위해 사용된 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험의 결과이다. 도면의 상단부는 5D12 항체(좌측 패널) 또는 대조군 항체 1H7(우측 패널)로 염색된 전장 α-시누클레인(표시한 바와 같이, 야생형 또는 잔기 118-126의 개별 점 돌연변이)의 웨스턴 블랏을 보여준다. 도면의 하단부는 5D12 항체가 결합되는 α-시누클레인의 에피토프를 도시한다.
도 9는 9E4, 5C1 및 5D12 항체의 결합 부위에 가장 가까운 α-시누클레인의 아미노산에 대한 공-막대 모형을 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 야생형 인간 α-시누클레인이다
서열번호 2는 문헌 [Jensen et al. (1995)]에 보고된 바와 같은, α-시누클레인의 비아밀로이드 성분(NAC) 도메인이다.
서열번호 3은 문헌 [Ueda et al. (1993)]에 보고된 바와 같은 α-시누클레인의 비아밀로이드 성분(NAC) 도면이다.
서열번호 4는 인간 α-시누클레인의 5C1 펩티드 면역원 아미노산 잔기 118-129이다.
Figure pct00001

서열번호 5는 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 쥣과동물 5C1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00002

서열번호 6은 신호 펩티드(밑줄표시)를 갖는 쥣과동물 5C1 중쇄 가변 영역이다.
Figure pct00003

서열번호 7은 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 쥣과동물 5C1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00004

서열번호 8은 신호 펩티드(밑줄표시)를 갖는 쥣과동물 5C1 경쇄 가변 영역 서열이다.
Figure pct00005

서열번호 9는 CDR을 밑줄로 표시한 쥣과동물 5C1의 성숙한 중쇄 가변 영역이다. 밑줄표시된 CDR은 밑줄표시한 CDRH1이 카밧 및 초티아 정의의 혼합인 것을 제외하고는 카밧에 의해 정의된 바와 같다.
Figure pct00006

서열번호 10은 5C1 중쇄 CDR1의 서열이다.
Figure pct00007

서열번호 11은 5C1 중쇄 CDR2의 서열이다.
Figure pct00008

서열번호 12는 5C1 중쇄 CDR3의 서열이다.
Figure pct00009

서열번호 13은 인간 VH 억셉터 FR(Acc# AAY42876.1)이다.
Figure pct00010

서열번호 14는 인간화된 5C1H1의 서열이다.
Figure pct00011

서열번호 15는 인간화된 5C1H2의 서열이다.
Figure pct00012

서열번호 16은 인간화된 5C1H3의 서열이다.
Figure pct00013

서열번호 17는 인간화된 5C1H4의 서열이다.
Figure pct00014

서열번호 18은 인간화된 5C1H5의 서열이다.
Figure pct00015

서열번호 19는 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1H1을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00016

서열번호 20은 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1H2를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00017

서열번호 21은 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1H3을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00018

서열번호 22는 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1H4를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00019

서열번호 23은 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 인간화된 5C1H5를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00020

서열번호 24는 CDR은 밑줄로 표시한 쥣과동물 5C1의 성숙한 경쇄 가변 영역 서열이다. 밑줄표시한 CDR은 카밧에 의해 정의된 바와 같다.
Figure pct00021

서열번호 25는 5C1 경쇄 CDR1의 서열이다.
Figure pct00022

서열번호 26은 5C1 경쇄 CDR2의 서열이다.
Figure pct00023

서열번호 27은 5C1 경쇄 CDR3의 서열이다.
Figure pct00024

서열번호 28은 인간 VL 억셉터 FR(Acc# CAB51293.1)이다.
Figure pct00025

서열번호 29는 인간화된 5C1L1의 서열이다.
Figure pct00026

서열번호 30은 인간화된 5C1L2의 서열이다.
Figure pct00027

서열번호 31은 인간화된 5C1L3의 서열이다.
Figure pct00028

서열번호 32는 인간화된 5C1L4의 서열이다.
Figure pct00029

서열번호 33은 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1L1을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00030

서열번호 34는 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1L2를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00031

서열번호 35는 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1L3을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00032

서열번호 36은 신호 펩티드를 코딩하는 서열(밑줄표시)을 갖는 인간화된 5C1L4를 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00033

서열번호 37은 예시적인 인간 IgG1 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00034

서열번호 38은 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열이다.
Figure pct00035

서열번호 39는 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열이다.
Figure pct00036

서열번호 40은 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
Figure pct00037
정의
기본적인 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍을 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 처음에 발현되면, 이 가변 영역은 전형적으로 절단가능한 신호 펩티드에 연결된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙한 가변 영역이라고 한다. 따라서, 예를 들면, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다. 불변 영역은 임의의 또는 모든 CH1 영역, 힌지 영역, H2 영역, 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10 또는 그 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (개괄적으로, [Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7] 참조)(모든 목적을 위해 이 전체를 참조하여 편입시킴).
각 경쇄/중쇄 쌍의 성숙한 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개 결합 부위는 동일하다. 사슬은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각쌍의 2 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 배열되고, 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 한다. N 말단에서 C 말단으로, 경쇄 및 중쇄 모두는 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 영역에 대한 아미노산의 배치는 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)], 또는 [Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다. 카밧(Kabat)은 또한 상이한 중쇄 간 또는 상이한 경쇄 간 상응하는 잔기가 동일한 번호로 지정(예를 들면, H83은 성숙한 중쇄 가변 영역 내에서 카밧 번호매김에 의해 위치 83을 위미하고, 유사하게, 위치 L36은 성숙한 경쇄 가변 영역 내에서 카밧 번호매김에 의해 위치 36을 의미함)되는 광범위하게 사용되는 번호매김 관례(카밧 번호매김)를 제공한다. 카밧 번호매김은 달리 명확하게 언급하지 않으면 항체의 가변 영역 내 위치를 언급하는데 전반적으로 사용된다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은 표적과의 특이적인 결합에 대해 그들이 유래된 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 개별 중쇄, 개별 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Fv, 단쇄 항체, 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일(가변) 도메인 항체는 통상의 항체에서 그들 VL 파트너(또는 그 반대)와 분리된 VH 영역(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546)을 비롯하여, VH 영역이 VL 영역과 회합되지 않은 종 예컨대 낙타과 또는 연골 어류(예를 들면, 수염 상어) 유래의 VH 영역(때때로 VHH라고도 알려짐)(예를 들면, WO 9404678 참조)을 포함한다. 하나의 사슬이 그의 천연 파트너와 분리된 단일 도메인 항체는 때때로 Dab라고 알려져 있으며, 낙타과 또는 연골 어류 유래의 단일 도메인 항체는 때때로 나노바디라고 알려져 있다. 불변 영역 또는 불변 영역의 부분은 단일 도메인 항체에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 예를 들면, 낙타과 유래의 천연 단일 가변 영역 항체는 VHH 가변 영역, 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 단일 도메인 항체, 예컨대 나노바디는 통상의 항체와 유사한 접근법을 통해 인간화될 수 있다. Dab 항체는 일반적으로 인간 기원의 항체로부터 얻는다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학 분리에 의해 생산될 수 있다.
용어 "항체"는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화된 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이중기능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예를 들면, [Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)] 참조). 일부 이중특이적 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍은 5C1에 의해 결합된 것과는 다른 알파 시누클레인 상의 상이한 에피토프에 특징적인 인간화된 5C1 중쇄/경쇄 쌍 및 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다.
일부 이중특이적 항체에서, 하나의 중쇄 경쇄 쌍은 이하에 더욱 개시하는 바와 같은 인간화된 5C1 항체이고 중쇄 경쇄 쌍은 혈관 뇌장벽 상에 발현되는 수용체, 예컨대 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 렙틴 수용체, 또는 지단백질 수용체, 또는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체로부터 유래된다(Friden et al., PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). 이러한 이중특이적 항체는 수용체-매개된 트랜스사이토시스에 의해 혈관 뇌장벽을 가로질러 전달될 수 있다. 이중특이적 항체의 뇌 흡수는 혈관 뇌 장벽 수용체에 대한 그 친화성이 감소되도록 이중특이적 항체를 조작하여 더욱 강화될 수 있다. 수용체에 대한 친화성 감소는 뇌에서의 보다 광범위한 분포를 야기한다(예를 들면, [Atwal. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011] 참조).
예시적인 이중특이적 항체는 또한 (1) 각각의 경쇄 및 중쇄가 단펩티드 연결을 통해 나란히 2개의 가변 도메인을 함유하는, 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig)(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) 표적 항원 각각에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성시키는 2개 단쇄 디아바디의 융합체인, Tandab; (3) 다가 분자가 생성되는 scFv와 디아바디의 조합체인, 플렉시바디; (4) Fab에 적용시, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 단백질이 생산될 수 있는, 단백질 키나아제 A 내 "이량체 및 도킹 도메인"을 기반으로하는, 소위 "독 및 락" 분자; (5) 예를 들면, 인간 Fc-영역의 양 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는, 소위 스콜피온 분자를 포함한다. 이중특이적 항체를 제조하는데 유용한 플랫폼의 예에는 BiTE(Micromet), DART(MacroGenics), Fcab 및 Mab2(F-star), Fc-조작된 IgGl(Xencor) 또는 DuoBody(Fab 암 교환 기반, Genmab)가 포함된다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 존재이다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 단백질 항원의 경우, 에피토프는 1 이상의 단백질의 3차원 폴딩에 의해 병치된 인접한 아미노산 또는 비인접한 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매 처리시 전형적으로 손실된다. 전형적으로, 에피토프는 고유한 공간적 입체형태에서 적어도, 2, 3, 또는 그 이상, 일반적으로, 적어도 5 또는 8-10 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 예를 들면, X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명법을 포함한다. 예를 들면, [Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]를 참조한다. 에피토프는 C 말단 잔기 또는 N 말단 잔기를 포함할 수 있다. 에피토프는 또한, 포함할 필요는 없지만, 폴리펩티드의 자유 아미노 기 또는 폴리펩티드의 자유 카르복실 기를 포함할 수도 있다. 따라서, 에피토프는 C 말단 또는 N 말단 잔기를 포함할 수 있지만, 반드시 각각 자유 카르복실 기 또는 자유 아미노 기를 포함할 필요는 없다. 항체 결합 특이성은 때때로 아미노산 범위에 의해 정해진다. 항체가 서열번호 1의 아미노산 118-126 내 에피토프에 결합했다고 하면, 예를 들어, 이는 그 에피토프가 범위의 외측 한계를 한정하는 것들을 포함하는 언급된 아미노산 범위 내에 존재함을 의미한다. 반드시 그 범위 내 모든 아미노산이 에피토프의 일부분을 구성함을 의미할 필요는 없다. 따라서, 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 118-126 내 에피토프는 서열번호 1의 다른 절편 중에서도, 아미노산 118-124, 119-125, 120-126, 120-124, 또는 120-122로 이루어질 수 있다.
동일하거나 또는 중복되는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합과 경쟁하는 한 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역어세이로 동정할 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 동정하기 위한 그 항원과 결합된 항체의 X선 결정학을 통해 정할 수 있다(이 에피토프는 접촉 잔기에 의해 한정됨). 다르게, 2개의 항체는 한 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 항원 내 모든 아미노산이 다른 것의 결합을 감소 또는 제거시키면 동일한 에피토프를 갖는다. 2개 항체는 한 항체의 결합을 제거하거나 또는 감소시키는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 또는 제거시키면 중복된 에피토프를 갖는다.
항체간 경쟁은 시험 중인 항체가 공동 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 어세이를 통해 결정된다. 예를 들면, 문헌 [Junghans et al. (1990), Cancer Res. 50:1495]을 참조한다. 시험 항체는 과도한 시험 항체(예를 들면, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁적 결합 어세이에서 측정시 적어도 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 기준 항체의 결합을 억제하면 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 어세이에 의해 동정된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 방해가 일어나므로 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 치환 상수로 그들의 지정된 표적에 결합된다. 이러한 결합은 1 이상의 미관련 표적에 대해 발생되는 비특이적 결합과 구별되고 검출가능할 정도로 충분히 규모가 큰 특이적 결합이다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간 핏(예를 들면, 자물쇠 열쇠 유형) 간의 결합 형성 결과인 반면 비특이적 결합은 일반적으로 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 반드시 단일클론 항체가 하나 그리고 오직 하나의 표적에 결합함을 의미하는 것이 아니다.
항체 서열을 비교시, 서열 동일성 비율은 카밧 번호매김 관례에 의해 최대로 정렬된 항체 서열로 결정한다. 정렬 후, 대상 항체 영역(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)을 기준 항체의 동일 영역과 비교하면, 대상 및 기준 항체 영역 간 서열 동일성 비율은 대상 및 기준 항체 영역 둘 모두 내 동일 아미노산이 차지한 위치의 수를 2개 영역의 정렬된 위치의 총수로 나누고, 100을 곱해 백분율로 전환시킨 것이며, 갭은 계산하지 않는다.
보존성 또는 비보존성으로 아미노산 치환을 분류하기 위한 목적의 경우, 아미노산은 다음과 같은 그룹으로 나뉜다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 배양에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존성 치환은 동일 부류 내 아미노산 간 치환을 포함한다. 비보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원이 다른 부류의 구성원으로 교환되는 것으로 구성된다.
단일클론 항체는 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는 항체가 전형적으로 그 생산 또는 정제로부터 발생한 다른 오염물 및 방해 단백질이 적어도 50% w/w 순수함을 의미하지만, 그 제제가 그 용도를 용이하게 하려는 의도로 과량의 약학적 허용 담체(들) 또는 다른 비히클과 배합되는 가능성을 배제하지 않는다. 때때로 단일클론 항체는 이러한 단일클론 항체의 응집물 또는 단편 또는 다른 단백질 및 오염물이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% w/w 순수하다. 일부 이러한 단일클론 항체는 응집물 또는 단편을 포함할 수 있지만 다른 단백질 및 오염물은 적어도 99% w/w 순수하다.
1 이상의 언급된 성분을 "포함하는" 조성물 또는 방법은 특별히 언급하지 않은 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체를 포함하는 조성물은 항체 단독으로 또는 다른 성분들과 조합하여 함유될 수 있다.
값 범위의 지정은 그 범위를 한정하거나 또는 그 범위 내의 모든 정수, 및 범위 내 정수에 의해 한정되는 모든 하위범위를 포함한다.
달리 문맥에서 명확하게 하지 않으면, 용어 "약"은 언급된 값의 측정 오차 범위(SEM) 내 값을 포함한다.
통계적 유의함은 p≤0.05를 의미한다.
"환자"는 예방적 또는 치료적 처치를 받는 인간 또는 다른 포유동물 피험체를 포함한다.
개체는 위험 인자를 갖는 개체를 위험 인자가 없는 개체 보다 질환이 발병될 통계적으로 유의하게 높은 위험성에 두게하는 1 이상의 기지의 위험 인자(예를 들면, 유전적, 생화학적, 가족력, 상황적 노출)를 피험체가 갖는다면 높은 질환 위험성이 있는 것이다.
용어 "증상"은 환자에 의해 감지되는, 주관적인 질환 증거, 예컨대 변화된 걸음걸이를 의미한다. "징후"는 의사가 관찰한 객관적인 질환 증거를 의미한다.
"인지 기능"은 정신 과정 예컨대 주의, 기억력, 언어 생산 및 이해, 문제 해결, 및 주변에 대한 관심 및 자기 돌봄 중 임의의 것 또는 전부를 의미한다.
"강화된 인지 기능" 또는 "개선된 인지 기능"은 기준치, 예를 들면 진단 또는 치료 개시에 비해 개선을 의미한다. "인지 기능의 감퇴"는 이러한 기준치에 비해 기능이 감소된 것을 의미한다.
동물 모델 시스템 예컨대 래트 또는 마우스에서, 인지 기능은 피험체가 공간 정보를 이용한 미로(예를 들면, 모리스 수중 미로, 바네스 원형 미로, 고가 방사상 미로, T 미로 등), 공포 조건화, 능동적 회피, 조사된 공개장, 야간 활동 미터, 십자형 높은 미로, 2구획 탐색 시험 또는 강제적 수영 시험을 이용하는 것을 포함하는 방법으로 측정될 수 있다.
인간에서, 인지 기능은 1 이상의 몇몇 표준 시험으로 측정할 수 있다. 인지 기능에 대한 시험 또는 어세이의 예는 기술되어 있고(Ruoppila and Suutama, Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53,44-65, 1997), 표준 심리측정 시험(예를 들면, 웩슬러 기억 스케일, 웩슬러 성인 지능 스케일, 레이븐의 표준 진행 매트릭스, 샤이에-써스톤 성인 정신 능력 시험), 신경심리 시험(예를 들면, 루리아-네브라스카), 초인지 자가 평가(예를 들면, 초기억 설문지), 시공간 스크리닝 시험(예를 들면, 포펠로이터 그림, 시계 인식, 허니콤 그리기 및 삭제, 인지 스크리닝 시험(예를 들면, 폴슈타인의 약식 정신 상태 시험) 및 반응 시간 시험을 포함한다. 인지 수행에 대한 다른 표준 시험법은 알츠하이머 질환 평가 스케일-인지 서브스케일(ADAS-cog); 변화의 임상적인 전반적 인상 스케일(CIBIC-플러스 스케일); 알츠하이머 질환 협력 연구 일상 생활 활동 스케일(ADCS-ADL); 약식 정신 상태 시험(MMSE); 신경정신학적 목록(NPI); 임상적 치매 등급화 스케일(CDR); 캠브릿지 신경정신학 시험 자동화 배터리(CANTAB) 또는 산도즈 임상 평가-노인병학(SCAG), 스트룹 시험, 트레일 메이킹, 웩슬러 디지트 스팬, 및 CogState 전산화 인지 시험을 포함한다. 또한, 인지 기능은 영상 기술 예컨대 양전자 방출 단층촬영법(PET), 기능적 자기 공명 영상법(fMRI), 단일 광자 단층 촬영법(SPECT), 또는 뇌기능 측정을 가능하게 하는 다른 영상 기술을 이용해 측정할 수도 있다.
발명의 구체적인 설명
I. 개요
본 발명은 단일클론 항체 5C1 및 관련 항체, 예컨대 α-시누클레인 상의 동일 에피토프(즉, α-시누클레인의 에피토프 118-126)에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, α-시누클레인 축적, 구체적으로 루이체 내 축적과 연관된 질병을 치료하는데 유용하다. 이러한 질병은 루이체 질환, 예컨대 파킨슨병, 확산성 루이체 질환(DLBD), 알츠하이머병의 루이체 변이체(LBV), 복합 알츠하이머 및 파킨슨병, 순수 자율신경계 부전 및 다계통 위축증(MSA)을 포함한다. 이 항체는 또한 루이체 질환의 진단에 유용하다.
II. 표적 분자
천연 인간 야생형 α-시누클레인은 하기 아미노산 서열을 갖는 140 아미노산의 펩티드이다:
Figure pct00038
(Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993; 유전자은행 수탁 번호: P37840). 이 단백질은 3개의 인식 도메인, 아미노산 1-61을 포괄하는 KTKE 반복 도메인, 약 아미노산 60-95에 걸친 NAC(비아밀로이드 성분) 도메인, 및 약 아미노산 98-140에 걸친 C 말단 산성 도메인을 갖는다. 문헌 Jensen 등 (1995)은 NAC가 다음의 아미노산 서열을 갖는다고 보고하였다(Jensen et al., Biochem. J. 310.1: 91-94; 유전자은행 수탁 번호 S56746):
Figure pct00039
그러나, 우에다 등(1993)은 NAC가 다음의 아미노산 서열을 갖는다고 보고하였다(Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6):
Figure pct00040
문맥에서 명확하게 하지 않으면, α-시누클레인 또는 이의 단편에 대한 언급은 상기 기재한 천연 인간 야생형 아미노산 서열, 및 이의 인간 대립형질 변이체, 구체적으로 루이체 질환과 관련된 것들(예를 들면, E46K, A30P 및 A53T, 제1 문자는 서열번호 1에서의 아미노산을 나타내고, 숫자는 서열번호 1에서의 코돈 위치이며, 제2 글자는 대립형질 변이체에서 아미노산임)을 포함한다. 이러한 변이체는 경우에 따라서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 알파 시누클레인 응집을 강화시키는, 유도된 돌연변이들 E83Q, A90V, A76T은 또한 개별적으로 또는 서로 및/또는 인간 대립형질 변이체 E46K, A30P 및 A53T와의 조합으로 존재할 수 있다.
III. 루이체 질환
루이체 질환(LBD)은 도파민 시스템의 퇴행, 운동 변경, 인지 손상, 및 루이체(LB)의 형성을 특징으로 한다(McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). 루이체는 신경 세포에서 발견되는 구형 단백질 침착물이다. 뇌에서 이들의 존재는 아세틸콜린 및 도파민을 포함하는 화학 메신저의 작용을 방해하는 뇌의 정상 기능을 파괴한다. 루이체 질환은 파킨슨병(특발성 파킨슨병 포함), 루이체 수반 치매(DLB)라고도 알려진 확산성 루이체 질환(DLBD), 알츠하이머 질환의 루이체 변이체(LBV), 복합 알츠하이머 및 파킨슨병 및 다계통 위축증(MSA; 예를 들면, 올리브교소뇌 위축증, 줄무늬체흑질 변성 및 샤이-드래거 증후군)을 포함한다. DLBD는 알츠하이머 및 파킨슨 병 둘 모두의 증상을 공유한다. DLBD는 주로 루이체 위치에서 파킨슨병과 상이하다. DLBD에서, 루이체는 주로 피질에 형성된다. 파킨슨병에서, 이들은 주로 흑질에 형성된다. 다른 루이체 질환은 순수 자율신경계 부전, 루이체 연하장애, 우발적 LBD, 및 유전적 LBD(예를 들면, α-시누클레인 유전자, PARK3 및 PARK4의 돌연변이)를 포함한다.
IV. 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
5C1은 그 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역이 각각 서열번호 9 및 서열번호 24로 지정된, 본 발명의 예시적인 항체이다. 본 발명은 또한 α-시누클레인과의 결합에 대해 5C1과 경쟁하거나, 또는 5C1과 동일하거나 또는 중복된 에피토프에 결합하고, 유사한 기능적 특성, 예컨대 α-시누클레인의 신경원 응집 감소, 인지 기능 개선, 및/또는 시냅스 밀도 및/또는 수상돌기 밀도 보존을 갖는 항체를 제공한다.
이러한 결합 특이성을 갖는 다른 항체는 α-시누클레인 또는 이의 단편(예를 들면, 아미노산 잔기 118-126, 또는 이의 일부분을 포함하는 단편)을 마우스에 면역화하고, 경우에 따라서 5C1과 경쟁하는, α-시누클레인과의 결합에 대해 얻어진 항체를 스크리닝하여 생산할 수 있다. 단편의 사용은 5C1과 동일한 에피토프를 갖는 항체를 생성하는데 바람직하다. 항체는 또한 다음에서의 그들의 효과에 대해 스크리닝될 수 있다: (1) 행동 검정법, 예컨대 모리스 수중 미로(MWM) 시험 또는 수평 빔 시험, 및/또는 뇌조직에서 α-시누클레인, α-시누클레인 응집, 시냅토파이신, MAP2, 및/또는 PSD95의 검출을 위한 면역 검정법이 수행되는 α-시누클레인 형질전환 설치류 모델; (2) 행동 검정법 예컨대 모리스 수중 미로(MWM) 시험 또는 수평 빔 시험 및/또는 뇌 조직 내 α-시누클레인, α-시누클레인 응집, 시냅토파이신, MAP2, 및/또는 PSD95의 검출을 위한 면역학적 검정법을 이용한, α-시누클레인 축적을 특징으로 하는 질환에 대한 설치류 또는 다른 인간외 동물 모델; 및/또는 (3) 적절한 행동 검정법을 이용한 α-시누클레인 축적과 연관된 병태를 갖는 인간. 상기 임의의 접근법에 부가하여, 또는 다르게, 항체는 돌연변이적 변화들의 모음에 대해 5C1과 동일하거나 또는 유사한 결합 프로파일을 보이는 항체를 동정하기 위해 α-시누클레인의 돌연변이유발된 형태에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이는 α-시누클레인 도처에서 또는 에피토프가 존재하는 것으로 알려진 이의 섹션(예를 들면, 잔기 118-126)을 통해서, 보다 광범위하게 이격된 간격으로, 또는 한번에 한 잔기를 알라닌(또는 알라닌이 이미 존재하면 세린)으로의 체계적인 치환일 수 있다.
도 6-8 및 실시예 6은 잔기 118-126 내에 결합하는 2종의 다른 항체, 즉 9E4 및 5D12와 비교한 5C1의 에피토프를 특징으로 한다. 알라닌 돌연변이유발법은 알파 시누클레인의 118-126에서, 한번에 한개씩, 개별 아미노산을 돌연변이시키는 효과를 시험한다. 잔기 118-126 내 상이한 아미노산의 돌연변이에 의해 야기된 결합 친화성의 상대적인 변화에 대한 프로파일(달리 말해서, 결합에 대한 기여도)은 에피토프를 특징으로 한다. 5C1의 경우, 임의의 잔기 120-122의 돌연변이유발은 결합이 최고로 감소하였다. 잔기 123 또는 124의 돌연변이유발은 결합이 유의하게 감소되었지만, 임의의 위치 120-122 만큼은 아니었다. 잔기 118, 119, 125 또는 잔기 126의 돌연변이유발은 결합 친화성이 여전히 덜 손실되었고, 실질적으로 변화하지 않았다. 간략하게, 돌연변이유발의 효과는 대략 다음의 3가지 카테고리로 하위분류될 수 있다: 잔기 120-122의 경우 실질적으로 완전한 결합 감소(음성 대조군과 구별안됨), 잔기 118, 119, 125 및 126의 경우 실질적으로 결합 감소 없음(양성 대조군과 구별안됨), 및 잔기 123 및 124의 경우 결합 친화성이 중간정도 감소. 따라서 5C1의 에피토프는 서열번호 1의 잔기 120-124로 이루어지거나 또는 이로 실질적으로 이루어진 선형 에피토프인 것을 대체로 특징으로 할 수 있고, 여기서 잔기 120-122가 결합에 최고로 기여한다. 본 단락에서의 임의의 기술에 의해 특징되는 바와 같은 5C1 에피토프를 갖는 항체를 제공한다. 일부 항체는 잔기 120-122로 실질적으로 이루어지고 잔기 119-120은 배제하는 것을 특징으로 하며 이는 잔기 120-122 각각이 임의의 다른 잔기에 비해 결합에 보다 더 기여하고 잔기 1129 및 120은 결합에 대해 검출가능할 정도로 기여하지 않는다는 것을 의미한다(예를 들면, 실시예의 알라닌 스캐닝 방법에 의함). 잔기 123 및 124는 이러한 항체에서 결합에 대해 미미한 기여를 할 수도 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
5D12의 경우, 에피토프는 다음과 같은 알라닌 돌연변이유발에 의해 특징된다. 잔기 120-122 중 임의의 돌연변이유발은 결합을 최고로 감소시킨다. 잔기 118, 199, 123 또는 124의 돌연변이유발은 결합을 유의하게 감소시키지만 임의의 위치 120-122에서는 그만큼은 아니다. 잔기 125 또는 잔기 126의 돌연변이유발은 결합 친화성이 여전히 덜 상실되고, 실질적으로 변화하지 않는다. 간략하게, 돌연변이유발의 효과는 대략 다음의 3가지 카테고리로 하위분류될 수 있다. 잔기 120-122의 돌연변이에 대한 결합의 실질적으로 완전한 감소(음성 대조군과 구별되지 않음), 잔기 125 및 126의 경우 결합이 실질적으로 무 감소(양성 대조군과 구별되지 않음), 및 잔기 118, 119, 123 및 124의 경우 결합 친화성이 중간정도 감소. 5D12의 에피토프는 서열번호 1의 잔기 118-124로 이루어지거나 또는 이로 실질적으로 이루어진 선형 에피토프를 대략적으로 특징으로 할 수 있으며, 잔기 120-122가 결합에 최고로 기여한다. 이 단락 또는 실시예 6에서 기술된 임의의 내용을 특징으로 하는 5D12의 에피토프를 갖는 다른 항체가 또한 제공된다.
유사하게, 9E4 에피토프는 잔기 122 및 125의 돌연변이에 의해 특징될 수 있고 각각은 임의의 잔기 118-121, 123, 124 또는 126의 결합보다 큰 결합 감소를 보인다. 간략하게, 돌연변이유발 효과는 대략 다음의 2가지 카테고리로 분류할 수 있다: 잔기 122 및 125의 경우 결합이 실질적으로 완전하게 감소 및 잔기 118-121, 123, 124 및 126의 경우 결합이 실질적으로 무감소. 따라서 9E4 에피토프는 대략 잔기 122 및 125가 9E4와의 결합점(또는 결합에 최고 기여)을 제공하는 입체형태적 에피토프를 특징으로 할 수 있다. 이 단락 또는 실시예 6에서의 임의의 기술로 특징되는 9E4 에피토프를 갖는 다른 항체를 제공한다. 경우에 따라서, 항체는 9E4 또는 9E4와 같은 CDR을 갖는 다른 항체가 아니거나 또는 9E4의 상응하는 CDR과 85% 이상의 동일성을 갖는 5 이상의 카밧 CDR을 갖는 항체가 아니다.
선택된 쥣과동물 항체(예를 들면, 5C1)의 결합 특이성을 갖는 항체는 또한 파지 디스플레이 방법의 별법을 이용해 생산할 수 있다. Winter의 WO 92/20791을 참조한다. 이 방법은 인간 항체를 생산하는데 특히 적합하다. 이 방법에서, 선택된 쥣과동물 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 출발 물질로서 사용된다. 예를 들면, 경쇄 가변 영역이 출발 물질로서 선택되면, 구성원들이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 쥐소가동물 출발 물질) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 디스플레이하는 파지 라이브러리를 구축한다. 예를 들면, 중쇄 가변 영역은 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. α-시누클레인에 대해 강한 특이적 결합을 보이는 파지(예를 들면, 108 M-1 이상, 바람직하게는 109　M-1 이상)가 선택된다. 이러한 파지 유래의 중쇄 가변 영역은 이어서 추가 파지 라이브러리를 구축하기 위한 출발 물질로서 제공된다. 이 라이브러리에서, 각 파지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 디스플라이 라이브러리에서 동정된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 다시, α-시누클레인에 대해 강한 특이적 결합을 보이는 파지가 선택된다. 얻어진 항체는 일반적으로 쥣과동물 출발 물질과 동일하거나 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
다른 항체는 예시적인 항체, 예컨대 5C1의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA를 돌연변이유발시켜서 얻을 수 있다. 따라서, 성숙한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서 5C1과의 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이고 그 기능적 특성을 유지하고/하거나 소수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들면, 보존성 치환), 결실 또는 삽입에 의해 각각의 항체와 상이한 단일클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 전체적으로 또는 실질적으로 5C1 유래의 일부 또는 전체(예를 들면, 3. 4. 5, 및 6, 바람직하게는 6) CDR을 갖는 단일클론 항체를 포함한다. 이러한 항체는 5C1의 중쇄 가변 영역에서 전체적으로 또는 실질적으로 유래된 2 이상, 및 일반적으로 전체 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 전체적으로 또는 실질적으로 5C1의 경쇄 가변 영역에서 유래된 2 이상, 및 일반적으로 전체 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. CDR은 CDRH2(카밧으로 정의시)가 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1을 넘지 않는 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있는 것을 제외하고, 4, 3, 2, 또는 1을 넘지 않는 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 경우 상응하는 5C1 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 이러한 항체는 바람직하게는 성숙한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서 5C1과의 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이고 그 기능적 특성을 유지하고/하거나, 소수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들면, 보존성 치환), 결실 또는 삽입에 의해 5C1과 다르다.
바람직한 항체는 5C1과 유사한 기능적 활성, 예를 들면, 신경돌기 및/또는 축삭 α-시누클레인 응집 감소, 신경돌기 위축증 감소, 인지 기능 개선, 인기 감퇴 반전, 치료 또는 억제, 및/또는 시냅스 밀도 및/또는 수상돌기 밀도 보존 또는 증가를 나타낸다.
B. 키메라 및 비니어드 항체
본 발명은 비인간 항체, 특히 5C1의 키메라 및 비니어드 형태를 더 제공한다.
키메라 항체는 비인간 항체(예를 들면, 마우스)의 중쇄 및 경쇄의 성숙한 가변 영역이 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 불변 영역은 인간 유래이지만, 불변 영역은 필요에 따라서 상이한 인간이외의 종에서 기원될 수 있다(예를 들면, 적절한 동물 모델에서 인간이외의 항체의 시험을 용이하게 하기 위함). 이러한 항체는 실질적으로 또는 전체적으로 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하고, 약 2/3의 인간 불변 영역이 기여하는 인간 서열일 수 있다.
비니어드 항체는 CDR의 일부 및 일반적으로 모두 및 인간이외의 항체의 비인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하지만 B 세포 또는 T 세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들면 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)가 인간 항체 서열의 상응하는 위치 유래의 잔기로 치환된 인간화된 항체 유형이다. 그 결과 CDR은 비인간 항체로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래되고 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크는 치환에 의해 보다 더 인간-유사하게 만들어진 항체이다.
C. 인간화된 항체
인간화된 5C1 항체는 인간 α-시누클레인에 특이적으로 결합한다. 일부 인간화된 항체의 친화성(즉, Ka)은 예를 들면, 쥣과동물 5C1 항체의 친화성의 5 또는 2의 인수 내일 수 있다. 일부 인간화된 항체는 실험 오류 내에서 쥣과동물 5C1과 동일한 친화성을 갖는다. 일부 인간화된 항체는 쥣과동물 5C1 보다 높은 친화성을 갖는다. 바람직한 인간화된 항체는 인간 α-시누클레인에 대한 결합에 대해 쥣과동물 5C1과 경쟁하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다.
인간화된 항체는 비인간 "도너" 항체(예를 들면, 쥣과동물 5C1) 유래의 CDR이 인간 "억셉터" 항체 서열에 그라프트된 유전자 조작된 항체이다(예를 들면, 다음의 문헌들을 참조함: Queen의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; Winter의 미국 특허 제5,225,539호, Carter의 미국 특허 제6,407,213호, Adair의 미국 특허 제5,859,205호, 제6,881,557호, Foote의 미국 특허 제6,881,557호). 억셉터 항체 서열은 예를 들면, 성숙한 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 배선 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 5C1 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 쥣과동물 5C1에서 유래한 일부 또는 전체 CDR 및 존재하면, 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열에서 유래된 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화된 중쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 도너 항체 중쇄에서 유래된 2 이상 및 일반적으로 전체 3 CDR, 및 존재하면, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열에서 유래된 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게 인간화된 경쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 도너 항체 경쇄에서 유래된 2 이상 및 일반적으로 모든 3 CDR, 및 존재하면 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열에서 유래된 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 DAb 이외에, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 바람직하게, 상응하는 잔기(카밧으로 정의됨)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%는 각각의 CDR 간에 동일하다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 카밧으로 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 동일한 경우, 각각 실질적으로 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역에서 유래된다.
인간화된 항체가 종종 마우스 항체로부터의 모든 6 CDR(바람직하게 카밧에 의해 정의된 바와 같음)을 도입하지만, 그들은 또한 모든 CDR보다 적게(적어도 3, 4, 또는 5) 제조될 수 있다(예를 들면, 다음의 문헌들을 참조함: Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).
일부 항체에서, 특이성 결정 잔기(SDR)라고 하는, 결합에 필요한 CDR의 오직 일부분, 즉 CDR 잔기의 서브셋(Kashmiri et al., Methods (2005) 36(1):25-34)이 인간화된 항체의 결합성을 유지하는데 필요하다. SDR에 존재하지 않고 항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링 및/또는 경험에 의해서, 또는 문헌 [Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004]에 기재된 바에 의해, 초티아(Chothia) 초가변 루프(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987) 밖에 위치하는 카밧 CDR의 영역으로부터, 이전의 연구를 기반으로 동정할 수 있다(예를 들면, CDR H2 내 잔기 H60-H65 중 1 또는 그 이상 또는 전부). 이러한 인간화된 항체에 있어서, 1 이상의 도너 CDR 잔기가 부재하거나 또는 전체 도너 CDR이 빠진 위치에서, 그 위치를 차지하는 아미노산은 억셉터 항체 서열 내 상응하는 위치(카밧 번호매김에 의함)를 차지하는 아미노산일 수 있다. 포함되는 CDR 내 도너 아미노산에 대한 억셉터의 이러한 치환 수는 경쟁적인 고려 사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체 내 마우스 아미노산의 수를 감소시키는데 있어 강력하게 유리하며 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시킨다. 그러나, 치환은 또한 친화성의 변화를 야기할 수 있고, 친화성의 유의한 감소는 바람직하게는 피한다. CDR 내 치환 위치 및 치환하려는 아미노산은 또한 경험적으로 선택할 수 있다.
인간 억셉터 항체 서열은 경우에 따라서는 인간 억셉터 서열 가변 영역 프레임워크 및 도너 항체 사슬의 상응하는 가변 영역 프레임워크 간에 높은 정도의 서열 동일성(예를 들면, 65%-85% 동일성)을 제공하도록 많은 기지의 인간 항체 서열 중에서 선택될 수 있다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터 유래된 일정 아미노산은 CDR 입체형태 및/또는 항원과의 결합성에 대한 그들의 가능한 영향력을 기반으로 치환을 위해 선택될 수 있다. 이러한 영향력에 대한 조사는 모델링, 특정 위치에서 아미노산의 특징 조사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과에 대한 경험적 관찰에 의한다.
예를 들면, 아미노산이 쥣과동물 가변 영역 프레임워크 잔기 및 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 간에 상이한 경우, 인간 프레임워크 아미노산은 아미노산이
(1) 비공유적으로 항원에 직접 결합,
(2) CDR 영역에 인접,
(3) 아니면, CDR 영역과 상호작용(예를 들면, CDR 영역의 약 6Å 내에 존재)(예를 들면, 상동성의 기지 면역글로불린 사슬의 해결된 구조에 대해 경쇄 또는 중쇄를 모델링하여 동정됨), 및
(4) VL-VL 경계면에 참여하는 잔기
인 것으로 타당하게 예상되는 경우 마우스 항체 유래의 균등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
Queen의 미국 특허 제5,530,101호에 의해 정의된 바와 같은 클래스 (1)-(3)의 프레임워크 잔기는 때때로 다르게 표준 및 유표(vernier) 잔기라고도 한다. CDR 루프의 입체형태를 한정하는데 도움이 되는 프레임워크 잔기는 기준 잔기라고도 한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987), Thornton & Martin J. Mol. Biol., 263, 800-815, 1996). 항원-결합 루프 입체형태를 지지하고 항원에 대한 항체의 맞춤성을 미세 조정하는데서 역할을 하는 프레임워크 잔기를 유표 잔기라고도 한다(Foote & Winter, 1992, J Mol Bio. 224, 487-499).
치환에 대한 후보가 되는 다른 프레임워크 잔기는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성하는 잔기이다. 치환에 대한 또 다른 후보는 그 위치가 인간 면역글로불린의 경우 일반적이지 않은 억셉터 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산은 마우스 도너 항체의 균등한 위치 또는 보다 전형적인 인간 면역글로불린의 균등한 위치로부터 유래된 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명은 마우스 5C1 항체의 인간화된 형태를 제공한다. 마우스 항체는 각각 서열번호 9 및 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명은 5종의 예시적인 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역: H1, 서열번호　14; H2, 서열번호 15; H3, 서열번호 16; H4, 서열번호 17; 및 H5, 서열번호 18을 제공한다. 본 발명은 또한 4종의 예시적인 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역: L1, 서열번호 29; L2, 서열번호 30; L3, 서열번호 31; 및 L4, 서열번호 32를 제공한다. 이들 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 임의의 순열, 즉 H1L2, H1L3, H1L4, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L1, H3L2, H3L3, H3L4, H4L1, H4L2, H4L3, H4L4, H5L1, H5L2, H5L3, 또는 H5L4를 포함하는 항체들이 제공된다. 8 중쇄 역돌연변이 및 5 경쇄 역돌연변이를 포함하는, H4L3 변이체는 쥣과동물 및 키메라 5C1 항체의 친화성의 2의 인수 내에 존재하는 α-시누클레인에 대한 친화성(비아코어 장치로 측정시)을 갖는다. 하기 표 3을 참조한다. ELISA로 측정시, H4L3 변이체는 키메라 5C1 항체와 실질적으로 동일(실험 오차 내)하고 쥣과동물 5C1 항체보다 우수한 α-시누클레인에 대한 친화성을 갖는다. 도 5를 참조한다. 또한, 5 중쇄 역돌연변이 및 5 경쇄 역돌연변이를 포함하는, H5L3 변이체는 쥣과동물 및 키메라 5C1 항체의 친화성의 4 인수 내인 인간 α-시누클레인에 대한 친화성(비아코어 장치로 측정시)을 제공한다. 하기 표 3을 참조한다. 9 중쇄 역돌연변이 및 2 경쇄 역돌연변이를 포함하는 H3L4 변이체도 실험 오차 내에서, 키메라 5C1 항체와 실질적으로 동일한 인간 α-시누클레인에 대한 친화성(ELISA로 측정시)을 제공하고, 각각 9 중쇄 역돌연변이 및 개별적으로 5 및 6 경쇄 역돌연변이를 포함하는, H3L3 및 H3L1 변이체는 쥣과동물 5C1 항체보다 우수한 α-시누클레인에 대한 친화성(ELISA로 측정시)을 제공한다.
본 발명은 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역이 H4(서열번호 17)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 보이고 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역이 L3(서열번호 31)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보이는 H4L3 인간화된 5C1 항체의 변이체를 제공한다. 일부 이러한 항체에서, H4L3 내 역돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 전부를 보유한다. 본 발명은 또한 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역이 H5(서열번호 18)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 보이고 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역은 L3(서열번호 31)은 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보이는 H5L3 인간화된 5C1 항체의 변이체를 제공한다. 일부 이러한 항체에서, H5L3 내 역돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 전부가 보유된다. 본 발명은 또한, 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역이 H3(서열번호 16)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 보이고 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역은 L4(서열번호 32)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보이는 H3L4 인간화된 5C1 항체의 변이체를 제공한다. 일부 이러한 항체에서, H3L4 내 역돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 모든 11개가 유지된다. 일부 항체에서, Vh 영역 내 위치 H11, H27, H30, H48, 및 H73 중 1 이상은 각각 L, Y, T, I, 및 K가 차지한다. 일부 항체에서, Vh 영역 내 위치 H11, H27, H30, H48, 및 H73은 각각 L, Y, T, I, 및 K가 차지한다. 일부 항체에서, Vh 영역 내 위치 H67, H69, H91, 및 H94 중 1 이상은 각각 A, L, F, 및 S가 차지한다. 일부 항체에서, Vh 영역 내 위치 H67, H69, 및 H94는 예컨대 H4 버전처럼, 각각 A, L, 및 S가 차지한다. 일부 항체에서, 위치 H94는 예컨대 H5 버전처럼 S가 차지한다. 일부 항체에서, Vh 영역 내 위치 H67, H69, H91, 및 H94는 예컨대 H3 버전처럼, 각각 A, L, F, 및 S가 차지한다. 일부 항체에서, Vk 영역 내 위치 L12 및 L14 중 1 이상은 S가 차지한다. 일부 항체에서, Vk 영역 내 위치 L12 및 L14는 예컨대 L3 및 L4 버전처럼, S가 차지한다. 일부 항체에서, Vk 영역 중 위치 L2, L45, L49, 및 L87 중 1 이상은 각각 V, K, N, 및 F가 차지한다. 일부 항체에서, Vk 영역 내 위치 L2, L49, 및 L87은 예컨대 L3 버전처럼, 각각 V, N, 및 F가 차지한다. 일부 항체에서, Vk 영역 내 위치 L2, L45, L49, 및 L87은 예컨대 L1 버전처럼, 각각 V, K, N, 및 F가 차지한다. 이러한 인간화된 항체의 CDR 영역은 마우스 도너 항체의 것과 동일한, H4L3 또는 H5L3의 CDR 영역과 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. CDR 영역은 임의의 통상적인 정의(예를 들면, 초티아)에 의해 정의되지만 바람직하게는 카밧에 의해 정의된다.
인간화된 5C1 변이체 내 추가의 변이에 대한 한가지 가능성은 가변 영역 프레임워크 내 추가의 역돌연변이이다. 인간화된 mAb 내 CDR과 접촉하지 않는 많은 프레임워크 잔기들은 도너 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 상응하는 위치 유래 아미노산의 치환을 수용할 수 있고, 많은 잠재적인 CDR-접촉 잔기도 역시 치환될 수 있거나 또는 CDR 내 아미노산도 예를 들면, 가변 영역 프레임워크를 제공하는데 사용된 인간 억셉터 서열의 상응하는 위치에서 확인되는 잔기로 변경될 수 있다. 또한, 교대식 인간 억셉터 서열을 예를 들면 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 사용할 수 있다. 상이한 억셉터 서열을 사용하는 경우, 상기 추천된 역돌연변이 중 1 이상은 상응하는 도너 및 억셉터 잔기가 이미 역돌연변이없이 동일하기 때문에 수행하지 않아도 된다. 예를 들면, 위치 H11을 이미 L이 차지하고/하거나, H48을 이미 I가 차지하고/하거나 H73을 이미 K가 차지하고 있는 중쇄 억셉터 서열을 사용하는 경우, 상응하는 역돌연변이(들)는 필요하지 않다. 유사하게, 위치 L12 및/또는 L14를 S가 차지하고 있는 경쇄 억셉터 서열을 사용하는 경우, 상응하는 역돌연변이(들)는 필요하지 않다.
본 발명은 또한 성숙한 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 인간화된 5C1 H1L1, H1L2, H1L3, H1L4, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L1, H3L2, H3L3, H4L1, H4L2, H4L4, H5L1, H5L2, 또는 H5L4의 성숙한 경쇄 및 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보이는 인간화된 항체를 포함한다. 이러한 인간화된 항체의 CDR 영역은 마우스 도너 항체의 그것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. CDR 영역은 임의의 통상적인 정의(예를 들면, 초티아)에 의해 정의될 수 있지만 바람직하게는 카밧에 의해 정의된다.
D. 불변 영역의 선택
키메라, 인간화(비니어드 포함), 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 Fc 수용체와 상호작용하기에 충분한 불변 영역의 적어도 일부분에 연결될 수 있다. 불변 영역은 전형적으로 인간이지만, 비인간 불변 영역이 필요에 따라 선택될 수 있다.
불변 영역의 선택은, 부분적으로 항체-의존적 보체 및/또는 세포 매개 세포독성이 바람직한가 여부에 따라 좌우된다. 예를 들면, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체-매개 세포독성을 갖지만 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4는 보체-매개 세포독성이 불충분하거나 또는 없다. 본 발명의 항체에 포함되기에 적합한 인간 IgG1 불변 영역은 서열번호 38의 서열을 가질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 람다이거나 또는 카파일 수 있다. 본 발명의 항체에 포함되기 적합한 인간 카파 경쇄 불변 영역은 서열번호 40의 서열을 가질 수 있다. 항체는 개별 중쇄로서, 개별 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv 단편으로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 스페이서를 통해 연결된 단쇄 항체로서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 간에 알로타입 변이 및 이소알로타입 변이를 보인다. 즉, 불변 영역은 1 이상의 다형성 위치에서 상이한 개체에서 다를 수 있다. 이소알로타입은 이소알로타입을 인식하는 혈청이 1 이상의 다른 이소타입의 비다형성 영역에 결합한다는 점에서 알로타입과 다르다. 인간 불변 영역에 대한 참조는 임의의 천연 알로타입 또는 천연 알로타입 내 다형성 위치를 차지하는 잔기의 임의의 순열 또는 이하 기술된 바와 같이 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키기 위한 최대 3, 5, 또는 10 치환을 갖는 불변 영역을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 하나 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C 말단 리신은 분자의 일부 또는 전부에서 손실되거나 또는 유도화될 수 있다. 치환은 이펙터 기능 예컨대 보체-매개 세포독성 또는 ADCC를 감소 또는 증가(예를 들면, 다음의 문헌들을 참조함: Winter et al., 미국 특허 제5,624,821호; Tso et al., 미국 특허 제5,834,597호; 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006)시키거나, 또는 인간에서 반감기를 지속(예를 들면, 다음 문헌을 참조: Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004)시키기 위해 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위한 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu(EU 번호매김이 불변 영역에 대한 이 단락에서 사용됨)을 포함한다. 임의의 또는 전체 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서의 치환은 Fcy 수용체, 특히 FcyRI 수용체에 대한 친화성을 감소시킨다(예를 들면, 미국 특허 제6,624,821호 참조). 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 237에서 알라닌 치환은 이펙터 기능을 감소시키는데 사용될 수 있다. 경우에 따라서, 인간 IgG2 내 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 치환되고 위치 235는 글루타민으로 치환된다(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호 참조). 일부 측면에서, 인간 IgG1의 EU 번호매김에 의한 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329, 및 331 중 1 이상에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 측면에서, 인간 IgG1의 EU 번호매김에 의한 318, 320, 및 322 중 1 이상에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 측면에서, 이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.
E. 인간 항체
α-시누클레인에 대한 인간 항체는 이하에 기술된 다양한 기술을 통해 제공된다. 일부 인간 항체는 경쟁적 결합 실험에 의해서, 또는 아니면 5C1과 동일하거나 또는 중복되는 에피토프 특이성을 갖게 선택된다. 인간 항체는 또한 면역원으로서 α-시누클레인의 단편(예를 들면, 아미노산 잔기 118-126)만을 사용하고/하거나, α-시누클레인의 결실 돌연변이의 컬렉션에 대해 항체를 스크리닝하여 특정 에피토프 특이성에 대해 스크리닝할 수 있다. 인간 항체를 생산하는 한 기술은 트리오마 방법이 있다(Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman et al., 미국 특허 제4,634,666호). 다른 기술은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 형질전환 마우스, 예컨대 XenoMouse®, AlivaMab 마우스 또는 Veloceimmune 마우스를 면역화시키는 것을 포함한다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Lonberg et al., W093/1222, 미국 특허 제5,877,397호, 미국 특허 제5,874,299호, 미국 특허 제5,814,318호, 미국 특허 제5,789,650호, 미국 특허 제5,770,429호, 미국 특허 제5,661,016호, 미국 특허 제5,633,425호, 미국 특허 제5,625,126호, 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제5,545,806호, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, and WO 91/10741). 다른 기술은 파지 디스플레이이다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Dower et al., WO 91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047, 미국 특허 제5,877,218, 미국 특허 제5,871,907, 미국 특허 제5,858,657, 미국 특허 제5,837,242, 미국 특허 제5,733,743 및 미국 특허 제5,565,332). 이들 방법에서, 구성원들이 그들 외부 표면 상에 상이한 항체를 디스플레이하는 파지 라이브러리가 생산된다. 항체는 일반적으로 Fv 또는 Fab 단편으로서 디스플레이된다. 바람직한 특이성을 갖는 항체를 디스플레이하는 파지는 α-시누클레인 펩티드 또는 이의 단편에 대한 친화성 농축에 의해 선택된다. 다른 기술은 다음의 문헌에 개략된 일반 프로토콜에 따라 인간 B 세포로부터 DNA를 서열분석하는 것이다: Reddy et al., Nat Biotechnol. 2010 Sept 28(9):965-9 (Epub 2010 Aug 29), 및 US 20110053803, 20100099103, 20100291066, 20100035763, 및 20100151471. 간략하게, B 세포는 인간 항-α-시누클레인 항체를 갖는 것으로 의심되는 인간, 예를 들면, α-시누클레인, 이의 단편, α-시누클레인을 함유하는 보다 긴 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 항이디오타입 항체로 면역화된 인간으로부터 얻을 수 있다. B 세포에서 유래된 항체의 mRNA를 이어서 cDNA로 역전사시키고 예를 들면, 454 서열분석 기술을 이용해 서열분석한다. 각 항체로부터 사슬의 서열을 얻은 후, 그 사슬을 함께 쌍을 만들고(예를 들면, 생물정보학 이용), 클로닝하고, 발현시키고, 목적 성질에 대해 스크리닝한다.
F. 재조합 항체의 발현
항체 발현 세포주(예를 들면, 하이브리도마)를 이용해 키메라 및 인간화된 항체를 생산하기 위한 수많은 방법들이 알려져 있다. 예를 들면, 항체의 면역글로불린 가변 영역을 잘알려진 방법을 이용해 클로닝하고 서열분석할 수 있다. 한 방법에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 준비한 mRNA를 이용해 RT-PCR을 통해 클로닝될 수 있다. VH 영역 리더 펩티드에 대해 5' 프라이머로서 번역 개시 코돈 및 g2b 불변 영역 특이적 3' 프라이머를 포함하는 공통 프라이머를 적용한다. 예시적인 프라이머는 Schenk 등에 의한 미국 공개 특허 출원 제T2005/0009150호에 기술되어 있다(이하, "Schenk"). 복수의, 독립적으로 유도된 클론으로부터의 서열을 증폭 동안 변화가 도입되지 않는 것을 보장하기 위해 비교할 수 있다. VH 영역의 서열은 또한 5' RACE RT-PCR 방법 및 3' g2b 특이적 프라이머를 통해 얻은 VH 단편을 서열분석하여 결정하거나 또는 확증할 수 있다.
경쇄 가변 VL 영역은 VH 영역과 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 일 접근법에서, VL 영역의 증폭을 위해 설계된 공통 프라이머 세트를 V-J 연결 영역 하류의 Ck 영역에 특이적인 3' 프라이머, 및 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역과 혼성화되도록 설계한다. 제2 접근법에서, 5' RACE RT-PCR 방법을 적용해 VL 코딩 cDNA를 클로닝한다. 예시적인 프라이머는 상기와 같은 Schenk에 기술되어 있다. 클로닝된 서열을 이어서 인간(또는 다른 비인간 종) 불변 영역을 코딩하는 서열과 조합한다. 인간 불변 영역을 코딩하는 예시적인 서열은 인간 IgG1 불변 영역을 코딩하는 서열번호 37, 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 코딩하는 서열번호 39를 포함한다.
일 접근법에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 VDJ 또는 VJ 접합부의 하류의 스플라이스 도너 서열을 코딩하도록 재조작되고, 포유동물 발현 벡터, 예컨대 중쇄의 경우 pCMV-hγ1, 경쇄의 경우 pCMV-Mcl에 클로닝된다. 이들 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트 하류에 엑손 단편으로서 Ck 불변 영역 및 인간 γ1을 코딩한다. 서열 검증 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 CHO 세포에 공형질감염시켜서 키메라 항체를 생산한다. 조건화 배지를 형질감염 후 48시간에 수집하고 항원 결합에 대한 ELISA 또는 항체 생산에 대한 웨스턴 블랏 분석을 통해 검정한다. 키메라 항체는 상기 기술된 바와 같이 인간화된다.
키메라, 비니어드, 인간화, 및 인간 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생산된다. 재조합 핵산 구성체는 전형적으로, 천연적으로 회합되거나 또는 이종성인 발현 제어 성분(들), 예컨대 프로모터를 포함하는, 항체 사슬의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현, 및 교차 반응성 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다.
발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합부로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선별 마커, 예를 들면 앰피실린 내성 또는 히그로마이신 내성을 함유하여, 목적 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 한다.
이. 콜라이는 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하는데 유용한 원핵생물 숙주이다. 미생물, 예컨대 효소도 역시 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 바람직하다면 발현 제어 서열, 복제 기원, 종결 서열 들을 갖는 적합한 벡터를 갖는, 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 다른 해당작용 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 그중에서도, 알콜 디히드로게나아제, 이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소 유래의 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 절편을 발현하기 위한 숙주 세포이다. 다음의 문헌을 참조한다: Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). 온전한 이종성 단백질을 분비할 수 있는 수많은 적절한 숙주 세포주가 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, L 세포, 인간 배아 신장 세포, 및 골수종 세포주가 포함된다. 세포들은 비인간일 수 있다. 이들 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필수 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함한다. 발현 제어 서열은 내생성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등에서 유도된 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 다음의 문헌을 참조한다: Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
다르게, 항체 코딩 서열은 형질전환 동물의 게놈으로 도입 및 형질전환 동물의 우유에서 후속 발현을 위해 형질전환 유전자로 도입될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,741,957호, 미국 특허 제5,304,489호, 미국 특허 제5,849,992호 참조). 적절한 형질전환 유전자는 유선 특이적 유전자, 예컨대 카세인 또는 베타 락토글로불린에서 유래된 프로모터 및 인핸서에 작동적으로 연결된 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 코딩 서열을 포함한다.
관심 DNA 절편을 함유하는 벡터는 세포 숙주 유형에 따른 방법을 통해 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 형질감염법은 원핵생물 세포에 통용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱스 또는 바이러스 기반 형질감염은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는데 사용되는 다른 방법은 폴리브렌의 사용, 프로토플라스트 융합, 리포솜, 전기 천공, 및 미세주입법을 포함한다. 형질전환 동물의 생산을 위해서, 형질전환유전자를 수정된 난모세포에 미세주입하거나 또는 배아 줄기 세포의 게놈, 및 제핵 난모세포로 형질전횐된 이러한 세포의 핵에 도입될 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터(들)를 세포 배양물에 도입하고, 세포 풀을 무혈청 배지에서 성장 생산성 및 생상물 품질에 대해 스크리닝할 수 있다. 최고-생산 세포 풀을 이어서 FACS-기반 단일 세포 클로닝하여 단일클론주를 생성시킨다. 7.5 g/L 배양 이상의 생산 역가에 상응하는, 1일 세포당 50 pg 또는 100 pg 이상의 비생산성을 사용할 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생산된 항체는 탁도, 여과성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 맵핑, 질량 분광법, 및 결합 검정법, 예컨대 ELISA 또는 비아코어를 통해 시험될 수 있다. 선택된 클론은 이어서 복수의 바이알에 모아지고 후속 사용을 위해 동결 보관된다.
발현되면, 항체는 단백질 A 포획법, HPLC 정제법, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다.(예를 들면, 일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982) 참조).
코돈 최적화, 프로모터 선별, 전사 성분, 및 종결인자, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 저축, 카피수 증폭용 선별 마커의 사용, CHO 종결인자, 무혈청 단일 세포 클로닝, 단백질 역가 개선을 포함한, 항체의 상업적 생산을 위한 방법을 적용할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,786,464호, 미국 특허 제6,114,148호, 미국 특허 제6,063,598호, 미국 특허 제7,569,339호, W02004/050884, W02008/012142, W02008/012142, W02005/019442, W02008/107388, 및 W02009/027471, 및 미국 특허 제5,888,809호 참조).
G. 항체 스크리닝 어세이
항체는 결합 어세이, 기능적 스크리닝, α-시누클레인 침착과 관련된 질환의 동물 모델에서 스크리닝, 및 임상 시도를 포함하는 몇몇 스크리닝이 수행될 수 있다. 결합 어세이는 특이적 결합, 및 경우에 따라 α-시누클레인(또는 이의 단편, 예컨대 아미노산 잔기 118-126)에 대한 친화성 및 에피토프 특이성을 시험한다. 이러한 스크리닝은 때때로 예시적인 항체 예컨대 5C1과의 경쟁으로 수행된다. 경우에 따라, 항체 또는 α-시누클레인 표적인 이러한 어세이에서 고정된다. 기능적 어세이는 α-시누클레인을 천연적으로 발현하거나 또는 α-시누클레인 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA로 형질감염된 세포를 포함하는 세포 모델에서 수행될 수 있다. 적절한 세포는 신경 세포를 포함한다. 세포는 α-시누클레인의 수준 감소(예를 들면, 세포 추출물 또는 상등액의 면역침강법 또는 웨스턴 블랏팅에 의함), 응집된 α-시누클레인의 수준 감소(예를 들면, 면역조직화학법 및/또는 공초점 방법에 의함), 및/또는 α-시누클레인에 의한 독성 감소에 대해 스크리닝될 수 있다.
동물 모델 스크리닝법은 α-시누클레인 침착과 연관된 인간 질환, 예컨대 루이체 질환을 모방하는 동물 모델에서 징후 또는 증상을 치료적으로 또는 예방적으로 처리하는 항체의 능력을 시험한다. 모니터링할 수 있는 적합한 징후 또는 증상은 운동 균형, 조화, 및 인지 결핍을 포함한다. 손상 정도는 적절한 대조군, 예컨대 대조군 항체(예를 들면, 이소타입 매칭된 대조군 항체), 위약을 받거나, 또는 전혀 치료되지 않은 대조군 동물에서의 운동 균형, 조화, 또는 인지 결핍을 비교하여 결정할 수 있다. 루이체 질환의 형질전환 또는 다른 동물 모델은 인간 α-시누클레인 형질전환유전자를 발현할 수 있다. 동물 모델에서의 시험을 용이하게 하기 위해서, 동물 모델에 적절한 불변 영역을 갖는 항체를 사용할 수 있다. 항체의 인간화된 버전은 상응하는 마우스 항체 또는 키메라 항체가 적절한 동물 모델에서 유효하고 인간화된 항체가 유사한 결합 친화성(예를 들면, 실험 오차 내에서, 1.5, 2, 또는 3의 인수까지)을 갖는다면 유효할 것이라고 결론내릴 수 있다.
임상 시험은 α-시누클레인 침착과 연관된 질환을 갖는 인간에서 안정성 및 효능을 시험한다.
H. 핵산
본 발명은 또한 상기 기술된 임의의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다. 전형적으로, 핵산은 또한 성숙한 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩티드를 코딩한다. 신호 펩티드의 적절한 예는 서열번호 6의 아미노산 잔기 1-19(서열번호 5의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩됨) 및 서열번호 8의 아미노산 잔기 1-19(서열번호 7의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩됨)를 포함한다. 핵산 상의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위해 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등에 작동적으로 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형재로 존재하거나 또는 1 이상의 벡터에 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들면, 고체상 합성 또는 중복된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 하나의 인접한 핵산으로서, 예를 들면 발현 벡터 내에 연결될 수 있거나, 또는 분리될 수 있으며, 예를 들어 그 자체의 발현 벡터에 각각 클로닝될 수 있다.
V. 치료적 용도
본 발명은 루이체 질환을 앓고 있거나 또는 그러한 질환의 위험성이 있는 환자에서 루이체 질환을 치료하거나 또는 예방을 실시하는 방법을 제공한다. 치료할 수 있는 환자는 LBD의 질환 위험성이 있지만 증상을 보이지 않는 개체를 비롯하여, 현재 시누클레인병증, 예를 들면, EEG 감속, 신경정신학적 현상(우울증, 치매, 환각, 불안, 냉담, 쾌감상실), 자율신경계 변화(기립성 저혈압, 방광 장애, 변비, 배변 실금, 타액분비 과다증, 연하곤란, 성 기능장애, 뇌혈류 변화), 감각 변화(후각, 통증, 색상 구별, 복부 감각), 수면 장애(REM 수면 행동 장애(RBD), 하지 불안 증후군/주기적 말단 운동, 불면증) 및 다양한 다른 징후 및 증상(피로, 복시, 시야 흐림, 지루, 체중 감량/증량)등의 증상 또는 초기 경고 징후를 보이는 환자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 LBD의 기지의 유전적 위험성을 갖는 개체에 대해 예방적으로 투여될 수 있다. 이러한 개체는 이 질환을 경험한 친척이 있는 개체, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석으로 그 위험성이 확인된 개체를 포함한다. PD에 대한 위험성의 유전적 마커는 α-시누클레인 또는 Parkin, UCHLI, 및 CYP2D6 유전자 내 돌연변이, 특히 α-시누클레인 유전자의 위치 30 및 53에서의 돌연변이를 포함한다. 현재 파킨슨병을 앓고 있는 개체는 안정 떨림, 근육 경직, 운동완서 및 자세 불안정을 포함하는 그 임상 현상으로 인식될 수 있다.
증상이 없는 환자의 경우, 치료는 임의의 연령(예를 들면, 10, 20, 30세)에서 시작할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자가 40, 50, 60 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 시작할 필요는 없다. 치료는 전형적으로 일정 기간 동안 복수의 용량을 포함한다. 치료는 시간 경과에 따라서 치료제(예를 들면, α-시누클레인 펩티드의 절두형)에 대한 항체, 또는 활성화된 T 세포 또는 B 세포 반응을 어세이하여 모니터링할 수 있다. 반응이 떨어지면, 부스터 용량이 지시된다.
본 발명은 환자에서 유리한 치료적 반응(예를 들면, 환자에서 신경돌기 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집 감소, 신경돌기 위축증 감소, 인지 기능 개선, 및/또는 인지 감퇴 반전, 치료 또는 억제)을 생성시키는 조건 하에서 항체 조성물의 투여에 의해 환자에서 루이체 질환을 치료하거나 또는 예방을 실시하는 방법을 제공한다. 일부 방법에서, 신피질 및/또는 기저핵의 신경망내 신경돌기 위축증 영역이 대조군과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 감소될 수 있다.
인지 손상, 인지 기능의 점진적인 감퇴, 뇌 형태 변화, 및 뇌혈관 기능의 변화가 루이체 질환을 앓거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 통상적으로 관찰된다. 본 발명은 이러한 환자에서 인지 기능의 감퇴를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 시냅스 밀도 및/또는 수상돌기 밀도를 보존하거나 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 시냅스 또는 수상돌기 밀도의 변화 지수는 시냅스 형성의 마커(시냅토파이신) 및/또는 수상돌기의 마커(MAP2)에 의해 측정될 수 있다. 일부 방법에서, 시냅스 또는 수상돌기 밀도는 건강한 피험체에서의 시냅스 또는 수상돌기 밀도 수준으로 복원될 수 있다. 일부 방법에서, 환자의 시냅스 또는 수상돌기 밀도 수준은 대조군과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
VI. 약학 조성물 및 치료 방법
예방적 용도의 경우, 항체 또는 이의 약학 조성물은 질환의 위험성을 감소시키거나, 중증도를 완화시키거나, 또는 질환의 1 이상의 징후 또는 증상의 개시를 지연시키는데 유효한 요법(투여 용량, 빈도 및 경로)으로 질환에 민감하거나, 또는 아니면 그의 위험성이 있는 환자에게 투여된다. 일부 예방적 용도에서, 요법은 뇌에서 알파 시누클레인 및 이의 절단 단편의 축적을 억제 또는 지연, 및/또는 그 독성 효과를 억제 또는 지연 및/또는 행동 결손의 진행을 억제 또는 지연시키는데 효과적이다. 치료적 용도에서, 항체는 질환의 1 이상의 징후 또는 증상의 추가 악화를 적어도 억제하거나 또는 완화시키는데 효과적인 요법(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 루이체 질환을 이미 앓거나, 또는 그로 의심되는 환자에게 투여된다. 일부 치료적 용도에서, 요법은 알파 시누클레인 및 절단된 단편의 수준, 연관 독성 및/또는 행동 결손 수준의 추가적인 증가를 감소시키거나 또는 적어도 억제하는데 효과적이다.
요법은 개별적으로 치료되는 환자가 본 발명의 방법으로 치료되지 않은 비슷한 환자의 대조 개체군에서의 평균 결과보다 더 유리한 결과를 획득하거나, 또는 보다 더 유리한 결과가 p < 0.05 또는 0.01 또는 0.001 수준으로, 제어된 임상 시험 (II상, II/III상 또는 III상 시험)에서 대조군 환자 대비 치료 환자에서 검증되면 치료적으로 또는 예방적으로 효과적이라고 간주된다.
효과적인 용량은 투여 수단, 표적 부위, 루이체 질환의 유형을 포함한 환자의 생리적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지 여부, 다른 투여 약물, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 포함한, 많은 상이한 인자에 따라 다양하다.
항체에 대한 예시적인 용량 범위는 환자 체중에 대해 약 0.01∼5 mg/kg, 및 보다 일반적으로 0.1∼3 mg/kg 또는 0.15∼2 mg/kg 또는 0.15∼1.5 mg/kg이다. 항체는 이러한 용량을 매일, 격일, 주마다, 격주, 매월, 분기별, 또는 경험적 분석으로 결정된 다른 스케쥴로 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 예를 들면 6개월 이상의 장기간 동안 복수 용량으로 투여를 포함한다. 추가의 예시적인 치료 요법은 2주 마다 한번 또는 한달에 한번 또는 3 내지 6개월 마다 한번의 투여를 포함한다.
항체는 말초 경로를 통해 투여될 수 있다(즉, 투여되거나 또는 유도된 항체가 혈관 뇌 장벽을 가로질러서 뇌의 목적하는 부위에 도달하는 것). 투여 경로는, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 비내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 일부 경로는 정맥내 및 피하이다. 이러한 유형의 주사는 팔이나 다른 근육에 가장 전형적으로 수행된다. 일부 방법에서, 항체는 침착물이 축적되는 특정 조직에 직접 주사, 예를 들면 두개내 주사된다.
비경구 투여용 약학 조성물은 멸균되고 실질적으로 등장성이며 GMP 조건 하에서 제조된다. 약학 조성물은 단위 제형(단일 투여용 용량)으로 제공될 수 있다. 약학 조성물은 1 이상의 생리적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용해 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여 경로에 따라 좌우된다. 주사용인 경우, 항체는 수용액, 바람직하게는 생리적 상용성 완충액 예컨대 행크액, 링거액, 또는 생리적 염수 또는 아세테이트 완충액(주사 부위의 불편함 감소를 위함)에 제제화될 수 있다. 용액은 제형화제 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 다르게 항체는 사용전에, 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된 발열원 무함유수와 재구성을 위한 동결건조형일 수 있다.
본 발명의 요법은 치료되는 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 다른 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 파킨슨병의 경우, 알파 시누클레인에 대한 면역요법 WO/2008/103472, 레보도파, 도파민 작용제, COMT 억제제, MAO-B 억제제, 아만타딘, 또는 항콜린제를 본 발명의 요법과 조합하여 사용할 수 있다.
VII. 다른 용도
상기 기술된 항체는 임상 진단 또는 치료 또는 연구에서 α-시누클레인을 검출하는데 사용될 수 있다. 이 항체는 또한 α-시누클레인을 보유하는 세포 및 다양한 자극에 대한 그들의 반응을 검출하는 실험실 연구를 위한 연구 시약으로서 판매될 수 있다. 이러한 용도에서, 단일클론 항체는 형광 분자, 스핀-표지 분자, 효소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고, α-시누클레인에 대한 어세이를 수행하는데 필요한 모든 시약이 존재하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 이 항체는 또한 예를 들면, 친화성 크로마토그래피를 통해서 α-시누클레인을 정제하는데 사용될 수 있다.
항체는 환자에서 LB를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 PD, 또는 뇌에 LB의 존재와 연관된 다른 질환, 또는 그에 대한 감수성을 진단하거나 또는 진단을 확증하는데 유용하다. 예를 들면, 이러한 방법은 치매 증상이 존재하는 환자에 대해 사용될 수 있다. 환자가 LB를 갖는다면, 그 환자는 아마도 루이체 질환, 예컨대 파킨슨병을 앓을 것이다. 이 방법은 또한 무증상 환자에 대해서도 사용될 수 있다. 루이체 또는 α-시누클레인의 다른 이상적 침착의 존재는 향후 증상을 보이는 질환에 대한 감수성을 시사한다. 이 방법은 또한 이전에 루이체 질환으로 진단받은 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는데 유용하다.
이 방법은 항체를 투여하고 항체가 결합된후 그 항체를 검출하는 것을 통해 수행될 수 있다. 바람직하다면, 제거 반응은 전장 불변 영역이 결여된 항체 단편, 예컨대 Fab를 이용해 피할 수 있다. 일부 방법에서, 동일한 항체는 치료 및 진단 시약 둘 모두로 제공될 수 있다.
진단(예를 들면, 생체내 영상화)을 위해서, 항체는 환자의 체내로 정맥내 주사되거나, 또는 두개내 주사에 의해 뇌로 직접 투여되거나 또는 두개골을 통해 구멍을 내서 투여될 수 있다. 시약의 용량은 치료 방법에 대한 동일 범위 내여야 한다. 전형적으로, 항체는 표지되지만, 일부 방법에서, 항체는 미표지되고 2차 표지화제가 항체에 결합되도록 사용된다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 좌우된다. 예를 들면, 형광 표지는 광학적 검출에 적합하다. 상자성 표지의 사용은 외과적 중재술없이 단층촬영 검출에 적합하다. 방사능 표지는 또한 PET 또는 SPECT를 이용하여 검출할 수 있다.
진단은 상응하는 기준치 값에 대해 표지된 유전자좌의 수, 크기 및/또는 강도를 비교하여 수행한다. 기준치는 질환이 없는 개체 집단에서의 평균 수준을 의미한다. 기준치는 또한 동일한 환자에서 확인된 이전의 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 기준치는 치료 시작 전 환자에서 확인할 수 있고, 이후에 측정된 값을 기준치와 비교한다. 기준치에 비해 그 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 나타내는 신호이다.
항체는 항이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 이하 문헌을 참조함: Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5) :437-444, 1989; 및 Nissinoff, J. Immunol. 147:2429-2438, 1991). 이러한 이디오타입 항체는 약동학, 약력학, 생체분포 연구를 비롯하여 항체로 치료된 개체에서 임상적 인간-항-인간 항체(HAHA) 반응 연구에서 활용될 수 있다. 예를 들면, 항이디오타입 항체는 인간화된 5C1 항체의 가변 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 따라서 약동학적 연구에서 인간화된 5C1 항체를 검출하는데 사용될 수 있고 치료된 개체에서 인간-항-인간 항체(HAHA) 반응을 정량하는데 도움을 줄 수 있다.
VIII. 키트
또한 α-시누클레인-특이적 항체 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 예를 들면 상기 기술된 진단 방법을 수행하는데 이용될 수 있다. 키트는 또한 표지를 포함할 수 있다. 키트는 또한 전형적으로 키트의 사용을 위한 지시서를 제공하는 표식을 함유한다. 이러한 표식은 또한 측정된 표지의 수준과 α-시누클레인에 대한 항체의 수준이 상관성있는 다른 대응 요법 또는 차트를 포함할 수도 있다. 용어 표식은 키트의 제조, 운반, 판매 또는 사용 동안 임의의 시기에 키트에 부착되거나, 또는 아니면 키트에 동봉된 임의의 서면 또는 기록 물질을 의미한다. 예를 들면, 용어 표식은 광고 전단 및 브로셔, 포장 재료, 설명서, 오디오 또는 비디오 카세트, 컴퓨터 디스크를 포함할뿐만 아니라, 키트상에 직접 기재 인쇄된다.
또한, 생체내 영상법을 수행하기 위한 진단 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로 본원에 기술된 바와 같은 α-시누클레인의 에피토프에 결합하는 항체를 함유한다. 항체는 표지되거나 또는 2차 표지 시약이 키트에 포함된다. 키트는 생체내 영상 어세이를 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
상기 또는 이하에 언급된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 출판물, 수탁 번호 등은 각 개별 아이템이 특별하게 개별적으로 참조하여 편입한다고 표시된 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들 전체를 참조하여 편입시킨다. 다양한 버전의 서열이 다른 시점에 수탁 번호와 연관되어 있으면, 그 출원의 유효한 출원일에 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효한 출원일은 실제 출원일 보다 빠르거나 또는 적용가능하다면 수탁 번호를 언급한 우선 출원의 출원일을 의미한다. 유사하게 다른 시점에 상이한 버전의 출판물, 웹사이트 등이 공개되면, 달리 언급하지 않는한 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 성분, 구체예 또는 측면은 구체적으로 달리 언급하지 않으면 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명을 명확함과 이해의 목적으로 예시 및 실시예를 통해 일부 구체적으로 기술하였지만, 일정한 변화 및 변경을 첨부된 청구항의 범위 내에서 실시할 수 있음은 명백하다.
실시예
실시예 1: 쥣과동물 5C1의 단리
쥣과동물 5C1 항체는 양의 항-마우스 항체에 커플링된 펩티드 면역원 VDPDNEAYEGGC(서열번호 14)을 함유하는 펩티드 접합체를 주사한 마우스에서 생성시켰다. C 말단 GGC 펩티드에 융합된 α-시누클레인의 잔기 118-126을 포함하는 펩티드는 C 말단 시스테인 잔기에 결합된 말레이미드 링커를 통해 양의 항-마우스 항체에 커플링되었다.
실시예 2: α-시누클레인 항체의 능동 면역화
루이체 질환의 동물 모델에 대한 α-시누클레인 항체의 효과를 시험하기 위해서, 다양한 α-시누클레인 항체를 이용해 마우스를 능동 면역시켰다. 3-4월령 야생형, α-시누클레인 넉아웃, 및 α-시누클레인 형질전환(라인 61) 암컷 마우스를 사용하였다(n=14/그룹). 시험한 항체는 다음을 포함한다:
9E4(IgG1, 에피토프: α-시누클레인의 아미노산 118-126);
5C1(IgG1, 면역원: α-시누클레인의 아미노산 118-126, cys-링커);
5D12(IgG2, 면역원: α-시누클레인의 아미노산 118-126, n-링커);
1H7(IgG1, 에피토프: α-시누클레인의 아미노산 91-99); 및
27-1(IgG1 대조군 항체).
마우스는 전체 21회 주사로, 5개월 동안 10 mg/kg의 항체 용량을 투여받았다. 또한, 동물들은 해마로 인간 α-시누클레인(wt)의 단측 도입에 의해 인간 α-시누클레인(wt)을 발현하는 렌티바이러스(LV)를 주사받았다.
판독 항체는 Chemicon(에피토프: 전장 α-시누클레인), Millipore(에피토프: 전장 α-시누클레인), 및 ELADW 105(에피토프: α-시누클레인의 아미노산 121-124, 바람직하게는 잔기 122-124에서 절단된 α-시누클레인)으로부터의 α-시누클레인 항체를 포함하였다.
종결점: 항체 역가는 실험 종료 전에 모니터링하였다. 행동은 모리스 수중 미로(MWM) 및 수평 라운드 빔 시험을 시용해 평가하였다. 라운드 빔 시험은 다양한 직경의 2개 빔을 이용해 운동 균형, 조화, 및 걸음걸이를 평가한다. 빔 A(훈련 빔)는 직경이 보다 크고, 따라서 횡단이 보다 용이하다. 빔 D(시험 빔)는 직경이 보다 작아서, 횡단이 더 어렵다. 수중 미로 수행은 10주 및 종료 직전에 수행하였다. 실험 종료시, 마우스를 희생시키고, 신경병리적 측정결과를 α-시누클레인 응집, 시냅토파이신, 및 MAP2에 대해 얻었다. 또한, 생화학적 측정은 α-시누클레인, PSD95, 및 시냅토파이신에 대해 얻었다. 선택된 복수표지화 및 공초점 표지화는 시냅스, 뉴런 및 신경교 마커를 이용해 수행하였다.
결과: 결과는 5D12를 제외한 모든 항체가 α-syn 축적의 유의한 감소 및 시냅스와 수상돌기 밀도의 보존을 비롯하여 MWM 수행에서 양성 결과를 이끌어내는 것을 보여주었다. 9E4 항체는 행동 검정을 비롯하여 시험관내 및 생체내 연구에서 유효하였다. 구체적으로, 결과는 α-시누클레인 항체가 신경돌기/축삭 α-시누클레인 응집을 감소시킬 수 있음을 시사하였다.
행동 결과: 5C1 및 9E4 항체는 비록 정도가 덜하지만, 1H7이 그러했던 것처럼 α-시누클레인 형질전환 마우스의 수중 미로 수행능을 향상시켰다. 도 3을 참조한다. 대조적으로, 5D12 항체는 α-시누클레인 형질전환 마우스의 수중 미로 수행능을 개선시키지 않았다. 수평 라운드 빔 시험에서, 9E4 및 1H7 항체는 실수의 수 및 속력 둘 모두로 측정시 수행능이 개선된 반면, 5D12 및 5C1 항체는 그렇지 않았다. 도 4를 참조한다. 도 4의 데이타는 미끄러짐 수/10 cm(즉, "실수") 및 일정 거리를 여행하는데 걸린 시간으로 나눈 여행한 거리의 비율(즉, 10 cm/sec의 단위로 측정된 "속력")로 표시한다.
신경병리학적 결과: 5C1, 9E4, 및 1H7 항체는 ELADW-105 양성 신경돌기 위축증을 감소시킨 반면, 5D12 항체는 그러하지 않았다. α-시누클레인 형질전환 마우스에서, 9E4 항체는 대조군 마우스(즉, 27-1 IgG1 대조군 항체를 투여받은 마우스)와 비교하여, 신경질 내 43% 만큼 그리고 기저핵에서 40% 만큼 신경망 영역을 감소시켰다. 9E4 항체는 또한 신경질 및 기저핵에서 시냅토파이신 및 MAP2에 대한 염색을 보존하였다.
실시예 3: 5C1의 가변 도메인의 서열분석
QIAGEN®OLIGOTEX® mRNA 키트를 사용해 5C1 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 mRNA를 추출 및 정제하였다. 정제된 mRNA는 이어서 올리고 dT 안티센스 프라이머 및 INVITROGEN®SUPERSCRIPT®II 키트를 사용해 cDNA로 전사하였다. 5C1 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 축퇴성 VH 및 VL 센스 프라이머 및 유전자 특이적(CH/CL) 안티센스 프라이머를 이용하여, PCR을 통해 cDNA로부터 증폭하였다. 신호 펩티드, 가변 도메인 및 불변 영역의 서열(안티센스 프라이머까지)을 포함하도록 설계된 PCR 산물을 겔 정제하고, 블런트 벡터 또는 TA 벡터에 클로닝한 후, 서열분석하였다. 서열은 메티오닌으로부터 출발하고 가변 영역을 통해 불변 영역으로 연장된 오픈 리딩 프레임을 갖는 3 이상의 독립적인 클론의 분석으로 추론하였다.
5C1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 5의 서열을 갖는다. 위치 1-19에 신호 펩티드(밑줄표시)를 포함하는, 상응하는 단백질 서열(도 1)은 다음과 같다:
Figure pct00041
5C1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 7의 서열을 갖는다. 위치 1-19에 신호펩티드(밑줄표시)를 포함하는 상응하는 단백질 서열(도 2)은 다음과 같다:
Figure pct00042
성숙한 5C1 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열(서열번호 9)은 표 1(하기)에 나타내었고, 성숙한 5C1 경쇄 가변 영역에 대한 상응하는 아미노산 서열(서열번호 24)은 표 2(하기)에 나타내었다. 카밧 번호매김을 전체적으로 사용하였다.
실시예 4: 쥣과동물 5C1의 인간화
3H6 Vh 영역의 CDR의 분석은 5 잔기 CDR-H1(서열번호 10), 17 잔기 CDR-H2(서열번호 11), 및 6 잔기 CDR-H3(서열번호 12)을 밝혀주었다. 3H6 Vk 영역의 CDR의 유사한 분석은 16 잔기 CDR-L1(서열번호 25), 7 잔기 CDR-L2(서열번호 26), 및 9 잔기 CDR-L3(서열번호 27)을 밝혀주었다.
5C1 Vk 및 Vh 영역 사이 계면에서 잔기의 분석은 대부분의 잔기가 통상적으로 발견되는 것임을 밝혀주었다.
NCBI로부터의 미중복 단백질 서열 검색을 통해서 5C1 쥣과동물 CDR에 그라프트시킬 적합한 인간 프레임워크를 선택하였다. Vk의 경우, NCBI 수탁 코드 CAB51293.1(GI:5578786; 서열번호 28)를 갖는 인간 카파 경쇄가 선택되었다. Vh의 경우, 인간 Ig 중쇄 AAY42876.1(GI:66096557; 서열번호 13)이 선택되었다.
선택된 인간 프레임워크를 기반으로하는 역돌연변이를 갖는, 예시적인 인간화된 Vh 및 Vk 디자인을 각각 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
예시적인 인간화된 Vh 디자인
5C1 영역의 5종의 상이한 인간화된 버전, H1, H2, H3, H4, 및 H5를 디자인하였다. 역돌연변이 선택에서, 잔기 H11, H27, H30, H48, H67, H69, H73, H91, 및 H94에 대해 궁극적으로 집중하였다. 인간화된 Vh 영역 디자인 각각에서, 잔기 H11, H27, H30, H48, 및 H73은 각각 L, Y, T, I, 및 K로 역돌연변이되었는데, 초티아 정의에 따른 CDR-H1의 일부를 형성하는 잔기(H27 및 H30) 또는 인간 프레임워크 서열 내 상응하는 잔기는 저빈도 잔기였다(위치 H11에 V, 위치 H48에 M, 및 위치 H73에 E). 버전 H1(서열번호 14)의 경우, 추가의 잔기 H67 및 H69는 CDR 팩킹을 보존하기 위해 역돌연변이되었다(각각, A 및 L로). 버전 H2(서열번호 15)에서는, 역돌연변이를 도입시키지 않았다(즉, 버전 H1 내 위치 H67 및 H69의 역돌연변이가 제거됨). 버전 H3(서열번호 16)에서, 추가 잔기 H67, H69, H91, 및 H94가 역돌연변이되었다(각각 A, L, F, 및 S로). H67, H69, 및 H94 역돌연변이는 CDR 팩킹을 보존하기 위한 것인 반면, H91, Vh/Vk 계면 잔기는 계면에 대한 그 영향을 시험하기 위해 역돌연변이되었다. 버전 H4(서열번호 17)에서, 추가 잔기 H67, H69, 및 H94는 역돌연변이되었다(각각 A, L, 및 S로). 따라서, 버전 H4는 H91의 역돌연변이가 제거되었다는 점에서 H3과 다르다. 버전 H5(서열번호 18)에서, 추가 잔기 H94는 또한 CDR 팩킹을 보조하기 위해 역돌연변이되었다(S로).
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
인간화된 5C1 H1, H2, H3, H4, 및 H5를 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 각각 서열번호 19, 20, 21, 22, 및 23으로 제공된다.
예시적인 인간화된 Vk 디자인
5C1 Vk 영역의 4종의 상이한 인간화된 버전, L1, L2, L3, 및 L4를 디자인하였다. 역돌연변이를 선택하는 경우, 잔기 L2, L12, L14, L45, L49, 및 L87에 대해 궁극적으로 집중하였다. 각각의 인간화된 Vk 영역 디자인에서, 잔기 L12 및 L14는, 인간 프레임워크 서열 내 상응하는 잔기(각각 P 및 T)가 저빈도 잔기이므로 S로 역돌연변이되었다. 버전 L1(서열번호 29)의 경우, 추가 잔기 L2, L45, L49, 및 L87이 역돌연변이되었다(각각 V, K, N, 및 F로). L2는 표준/CDR 상호작용 잔기이고, L45는 쥣과동물에서 인간 프레임워크 서열로 극성/전하 스위치(K에서 Q)를 겪고, 따라서 폴딩에 영향을 줄 수 있으며, L49는 유표 잔기이고, L87은 Vh/Vk 계면 잔기이다. 버전 L2(서열번호 30)에서, 추가 잔기 L45는 K로 역돌연변이되었다. 따라서, L1와 관련하여, 잔기 L2, L49, 및 L87의 역돌연변이는 제거되었다. 버전 L3(서열번호 31)에서, 추가 잔기 L2, L49, 및 L87이 역돌연변이되었다(각각 V, N, 및 F로). 따라서, L1과 관련하여 잔기 L45의 역돌연변이가 제거되었다. 버전 L4(서열번호 32)에서, 추가 잔기는 역돌연변이되지 않았다(즉, 오직 잔기 L12 및 L14만 역돌연변이됨).
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
인간화된 5C1 L1, L2, L3, 및 L4를 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 각각 서열번호 33, 34, 35, 및 36으로 제공된다.
실시예 5: 알파-시누클레인에 대한 인간화된 5C1 항체의 친화성
α-시누클레인에 대한 5C1 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄 단백질의 다양한 조합의 친화성은 ELISA를 통해 분석하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 인간화된 5C1 항체의 H1L1 버전은 어세이 조건 하에서 α-시누클레인에 대한 친화성을 나타내지 않았다. 대조적으로, 키메라 5C1 항체는 쥣과동물 5C1 항체 보다 α-시누클레인에 대해 보다 높은 친화성을 가졌다. 인간화된 버전 H3L4, H4L3, 및 키메라 H + L3은 동등하게 수행하였고, 키메라 5C1 항체를 비롯하여 거의 그러했다. 또한, 인간화된 버전 H3L3 및 H3L1은 균등하게 수행되었지만, H3L4, H4L3, 및 키메라 H + L3 보다 약간 친화성이 낮았다.
다양한 인간화된 5C1 항체 버전을 또한 보다 상세하게 결합 친화성을 결정하기 위해서, 비아코어를 통해 분석하였다. 항인간 IgG CM5 비아코어 칩을 GE Healthcare가 공급하는 프로토콜에 따라 제조하였다. 각 인간화된 5C1 항체 버전은 다음의 방정식을 이용하여, Rmax가 50을 넘지 않는 정도로 독립적으로 포획하였다:
Rmax = (포획된 항체의 RU) * (시누클레인의 MW)/(포획된 항체의 MW) * 2
분모의 인수 2는 항체 상의 결합 부위의 수이다. 알파 시누클레인은 칩 상에서 예상되는 KD 보다 ∼10X 높게 부터 예상되는 KD 보다 ∼10X 이하까지 다양한 농도로 흘려주었다. 데이타를 수집하고 표류 및 소량의 비특이적 결합을 해결하기 위해 이중 참조를 제하였다. 데이타는 1:1 모델 및 글로벌 핏을 이용한 BIAcore 평가 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
비아코어 분석 결과를 표 3(하기)에 요약하였다. 데이타는 알파 시누클레인에 대한 친화성에 있어서 대부분의 손실은 항체 버전 일부에서 오프 속도 증가에 기인하는 것을 시사하였다. 친화성 데이타를 기반으로 H4L3이 바람직한 항체로 확인되었다.
Figure pct00051
실시예 6: 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법
항체 5C1, 9E4 및 5D12가 결합하는 에피토프는 대략적으로 중복된 펩티드에 결합하는 항체에 기인하여 알파 시누클레인의 잔기 118-126 내에 존재하는 것으로 맵핑되었다. 이 실시예는 알파 시누클레인의 위치 118과 126 사이의 각 잔기를 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법을 통해 보다 상세하게 맵핑하는 것을 기술한다. 알라닌은 그 규모가 크지 않고, 화학적으로 불활성이며, 그럼에도 불구하고 많은 다른 아미노산이 보유하는 2차 구조 선호성을 모방하는, 메틸 작용기때문에 사용된다. 도 6, 7 및 8의 상단부는 각각 항체 9E4, 5C1 및 5D12로 염색된 웨스턴 블랏 결과를 도시한다. 블랏들은 전장 알파 시누클레인 및 잔기 118-126의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법으로 생성된 알파 시누클레인의 점돌연변이체를 포함하고, 0.5 ㎍/mL의 항체로 염색되었다. 위치 122 및 125에서의 돌연변이는 9E4의 결합성을 본질적으로 제거한 반면, 다른 위치에서의 돌연변이는 있더라도 효과가 적었다. 따라서, 9E4는 주로 잔기 122 및 125와 접촉한다. 위치 120-122에서의 돌연변이는 5C1의 결합을 본질적으로 제거하였고, 위치 123 및 124는 결합을 실질적으로 감소시켰지만 제거하지는 않았다. 따라서, 5C1은 주로 잔기 120-122와 접촉하고, 그보다 덜한 정도로, 잔기 123-124와 접촉한다. 위치 120-122에서의 돌연변이는 5D12의 결합을 본질적으로 제거하였고, 위치 118, 119, 123 및 124에서의 돌연변이는 결합을 실질적으로 감소시켰지만 제거하지는 않았다. 따라서, 5D12는 주로 위치 120-122에 결합하고, 그보다 덜한 정도로, 위치 118, 119, 123, 및 124에 결합한다. 도 6-8 각각에서, 1H7 항체가 대조군으로 사용되었다. 1H7은 알파 시누클레인의 잔기 91-98에 결합하며, 따라서, 잔기 118-126에 돌연변이가 존재하는 것과 무관하게 알파 시누클레인에 결합할 것으로 예상된다.
5C1 및 5D12와 비교하여 9E4의 상이한 결합 특이성은 부분적으로, 그들의 개별적인 생산 방법을 반영한다. 9E4는 전장 알파 시누클레인으로 면역화시켜 입체형태적 에피토프에 결합하는 항체가 만들어졌다. 5C1 및 5D12는 10개 아미노산 펩티드로 면역화하여 선형 에피토프가 만들어졌다.
도 9는 9E4, 5C1 및 5D12 항체의 결합 부위에 가장 가까운 알파 시누클레인 내 아미노산의 공 및 막대 모델이다. 9E4가 결합된 에피토프의 2개의 불연속 잔기, 잔기 122 및 125는 전장 알파 시누클레인 단백질의 입체형태에서 포켓을 형성한다.
첨부된 청구항의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고 많은 변화 및 변경을 본원에 가할 수 있다. 달리 문맥에서 명확하게 하지 않으면, 임의의 단계, 특징, 구체예, 또는 측면은 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 웹사이트, 수탁 번호 등은 각 개별 출판물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조하여 편입된다고 지시한 바와 동일한 정도로 그들 전체를 참조하여 본원에 편입시킨다. 어느 정도 상이한 인용 버전이 존재하면, 출원의 유효 출원일 시점에서 가장 최근 버전을 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> NEOTOPE BIOSCIENCES LIMITED BARBOUR, ROBIN GAMES THIEL, KATE DORA NIJJAR, TARLOCHAN, S. <120> ANTIBODIES RECOGNIZING ALPHA-SYNUCLEIN <130> 057450/437818 <140> PCT/US2013/063945 <141> 2013-10-08 <150> 61/711,204 <151> 2013-10-08 <150> 61/719,281 <151> 2012-10-26 <150> 61/840,432 <151> 2013-06-27 <150> 61/872,366 <151> 2013-08-30 <160> 41 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr 20 25 30 Gly Phe Val 35 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser 20 25 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 5 atggaaaggc actggatctt tctcttcctg ttatcagtaa ctggaggtgt ccactcccag 60 gtccagctgc agcagtctgg ggctgaactg gcaaaacctg ggacctcagt gcagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac ctttactaat tactggatga actggataaa agcgaggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggggctact aatcctaaca atggttatac tgactacaat 240 cagaggttca 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gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaattcc actctacctg tctgtcagtc ctggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag ccttttccat agtaaaggaa acacctattt acattggtat 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatcaaca gggtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 ggagtggagg ctgaagatct gggagtttat ttctgttctc aaagtgcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aga 393 <210> 8 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 8 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Phe His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Asn Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Arg 130 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Ile Lys Ala Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 10 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 11 Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 12 Gly Gly His Leu Ala Tyr 1 5 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asn Leu Asn Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Gly His Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 19 atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgagctg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactggatga actgggtgcg ccaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggcgccacc aaccccaaca acggctacac cgactacaac 240 cagcgcttca aggaccgcgc caccctgacc gccgacaagt ccaccaacac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgcgctc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg cggcggccac 360 ctggcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cc 402 <210> 20 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 20 atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgagctg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactggatga actgggtgcg ccaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggcgccacc aaccccaaca acggctacac cgactacaac 240 cagcgcttca aggaccgcgt gaccatcacc gccgacaagt ccaccaacac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgcgctc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg cggcggccac 360 ctggcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cc 402 <210> 21 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 21 atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgagctg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactggatga actgggtgcg ccaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggcgccacc aaccccaaca acggctacac cgactacaac 240 cagcgcttca aggaccgcgc caccctgacc gccgacaagt ccaccaacac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgcgctc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcctc cggcggccac 360 ctggcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cc 402 <210> 22 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 22 atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgagctg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactggatga actgggtgcg ccaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggcgccacc aaccccaaca acggctacac cgactacaac 240 cagcgcttca aggaccgcgc caccctgacc gccgacaagt ccaccaacac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgcgctc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcctc cggcggccac 360 ctggcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cc 402 <210> 23 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 23 atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgccag 60 gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgagctg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tactggatga actgggtgcg ccaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggcgccacc aaccccaaca acggctacac cgactacaac 240 cagcgcttca aggaccgcgt gaccatcacc gccgacaagt ccaccaacac cgcctacatg 300 gagctgtcct ccctgcgctc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag cggcggccac 360 ctggcctact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cc 402 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Asn Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 110 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 25 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 26 Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 27 Ser Gln Ser Ala His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 29 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Asn Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 31 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Asn Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ala His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 33 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgt ccgtgtcccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgccgctc ctcccagtcc ctgttccact ccaagggcaa cacctacctg 180 cactggtacc tgcagaagcc cggccagtcc cccaagctgc tgatcaaccg cgtgtccaac 240 cgcttctccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact tctgctccca gtccgcccac 360 gtgccctgga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca ag 402 <210> 34 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 34 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 tccggcgaca tcgtgatgac ccagtccccc ctgtccctgt ccgtgtcccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgccgctc ctcccagtcc ctgttccact ccaagggcaa cacctacctg 180 cactggtacc tgcagaagcc cggccagtcc cccaagctgc tgatctaccg cgtgtccaac 240 cgcttctccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctccca gtccgcccac 360 gtgccctgga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca ag 402 <210> 35 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 35 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgt ccgtgtcccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgccgctc ctcccagtcc ctgttccact ccaagggcaa cacctacctg 180 cactggtacc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagctgc tgatcaaccg cgtgtccaac 240 cgcttctccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact tctgctccca gtccgcccac 360 gtgccctgga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca ag 402 <210> 36 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 36 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 tccggcgaca tcgtgatgac ccagtccccc ctgtccctgt ccgtgtcccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgccgctc ctcccagtcc ctgttccact ccaagggcaa cacctacctg 180 cactggtacc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagctgc tgatctaccg cgtgtccaac 240 cgcttctccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctccca gtccgcccac 360 gtgccctgga ccttcggcgg cggcaccaag gtggagatca ag 402 <210> 37 <211> 991 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 37 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgtca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacacgct gcccccatcc cgggaggaga 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 840 ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca 900 gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca 960 gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaatg a 991 <210> 38 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 39 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgtta g 321 <210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 40 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu 1 5

Claims (56)

  1. 항체 5C1과 인간 알파-시누클레인 상의 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 단일클론 항체.
  2. 인간 알파 시누클레인에 결합하는 단리된 단일클론 항체로서, 전장 인간 알파 시누클레인의 잔기 118-126의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법은 잔기 120, 121 및 122 각각이 잔기 123 및 124 각각 보다 더욱 단일클론 항체 결합에 기여하고, 잔기 123 및 124 각각은 잔기 118, 119, 125 및 126 각각 보다 더욱 결합에 기여하는 것을 나타내는 것인 단리된 단일클론 항체.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 잔기 120-122로 실질적으로 이루어지고 서열번호 1의 잔기 118-119는 배제된 에피토프에서 인간 알파 시누클레인에 결합하는 항체.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 잔기 120-124로 이루어진 에피토프에서 인간 알파 시누클레인에 결합하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 키메라, 비니어드(veneered), 인간화, 또는 인간 항체인 항체.
  6. 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3개의 경쇄 CDR, 및 단일클론 항체 5C1의 카밧에 의해 정의된 바와 같은 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체로서, 상기 5C1은 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 5C1 또는 이의 키메라, 비니어드, 또는 인간화된 형태인 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비니어드 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편, 또는 단쇄 Fv인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이소타입은 인간 IgG1인 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역 내에 1 이상의 돌연변이를 갖는 항체.
  14. 제13항에 있어서, 돌연변이는 불변 영역에 의한 보체 고정 또는 활성화를 감소시키는 것인 항체.
  15. 제14항에 있어서, EU 번호매김에 의한 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 및 331 중 1 이상에 돌연변이를 갖는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 위치 318, 320 및 322에 알라닌을 갖는 항체.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4 이소타입인 항체.
  18. H4(서열번호 17)와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서, 상기 항체는 인간 알파 시누클레인에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
  19. 제18항에 있어서, 서열번호 9의 3개 카밧 CDR 및 서열번호 24의 3개 카밧 CDR을 포함하는 항체.
  20. 제19항에 있어서, 위치 H11, H27, H30, H48 및 H73 중 1 이상은 각각 L, Y, T, I 및 K가 차지하고, 위치 L12 및 L14 중 1 이상은 S가 차지하는 것인 항체.
  21. 제20항에 있어서, 위치 H11, H27, H30, H48 및 H73은 각각 L, Y, T, I 및 K가 차지하고, 위치 L12 및 L14는 S가 차지하는 것인 항체.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 H67, H69 및 H94 중 1 이상은 각각 A, L 및 S가 차지하는 것인 항체.
  23. 제22항에 있어서, 위치 H67, H69 및 H94는 각각 A, L, 및 S가 차지하는 것인 항체.
  24. 제22항에 있어서, 위치 H94는 S가 차지하는 것인 항체.
  25. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 L2, L49 및 L87 중 1 이상은 각각 V, N 및 F가 차지하는 것인 항체.
  26. 제25항에 있어서, 위치 L2, L49 및 L87은 각각 V, N 및 F가 차지하는 것인 항체.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, H4(서열번호 17)와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 L3(서열번호 31)과 95% 이상 동일한 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고 성숙한 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되는 것인 항체.
  29. 제28항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 비하여 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소된 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태인 항체.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소타입의 것인 항체.
  31. 제28항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열번호 38의 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되고/되거나 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열번호 40의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합되는 것인 항체.
  32. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, H4 및 L3(각각 서열번호 17 및 31) 유래의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 성숙한 경쇄 가변 영역의 CDR 내 임의의 차이는 위치 H60-H65에 존재하는 것인 항체.
  33. 제18항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역은 H4(서열번호 17)로 지정된 아미노산 서열을 가지며 성숙한 경쇄 가변 영역은 L3(서열번호 31)으로 지정된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  34. 제18항에 있어서, 성숙한 중쇄 가변 영역은 H5(서열번호 18)로 지정된 아미노산 서열을 가지며 성숙한 경쇄 가변 영역은 L3(서열번호 31)으로 지정된 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편인 항체.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 95% w/w 이상 순수한 것인 항체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  38. 제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은 항체의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 핵산.
  39. 제38항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  40. 제39항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  41. 항체를 인간화하는 방법으로서,
    마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하는 단계,
    마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 코딩하는 핵산 및 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계,
    숙주 세포에서 핵산을 발현시켜 인간화 항체를 생산하는 단계
    를 포함하고, 상기 마우스 항체는 5C1인 방법.
  42. 인간화, 키메라 또는 비니어드 항체를 생산하는 방법으로서,
    항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하여 세포가 항체를 분비하도록 하는 단계, 및
    세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 단계
    를 포함하고, 상기 항체는 5C1의 인간화, 키메라 또는 비니어드 형태인 방법.
  43. 인간화, 키메라 또는 비니어드 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 방법으로서,
    항체의 중쇄 및 경쇄 및 선별 마커를 코딩하는 벡터를 세포에 도입시키는 단계,
    벡터의 복제수가 증가된 세포를 선별하기 위한 조건 하에서 세포를 증식시키는 단계,
    선별된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계, 및
    항체의 수율을 기반으로 선별된 단일 세포로부터 복제된 세포를 저축(banking)하는 단계
    를 포함하고, 상기 항체는 5C1의 인간화, 키메라 또는 비니어드 형태인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 선별 조건 하에서 세포를 증식시키고 100 mg/L/106 세포/24시 이상을 천연적으로 발현 및 분비하는 세포주를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 루이체 질환을 치료하거나 또는 예방을 실시하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 항체의 효과적인 요법(regime)을 투여하여 질환을 치료하거나 또는 예방을 실시하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 환자는 EM 수면 행동 장애(RBD)를 갖는 것인 방법.
  47. 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 루이체 형성을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  48. 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 시누클레인 응집을 억제하거나 또는 루이체 또는 시누클레인 응집을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 파킨슨병인 방법.
  50. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 다계통 위축증(MSA) 또는 루이체 수반 치매(DLB)인 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 인지 기능의 감퇴를 억제하는 것인 방법.
  52. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 신경돌기 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집을 감소시키는 것인 방법.
  53. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 신경돌기 위축증을 감소시키는 것인 방법.
  54. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도를 보존하는 것인 방법.
  55. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 시냅토파이신 및/또는 MAP2를 보존하는 것인 방법.
  56. 루이체 질환을 갖거나 또는 이의 위험성이 있는 환자에서 루이체를 검출하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계로서, 이때 항체는 루이체에 결합하는 것인 단계, 및 환자에서 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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