JP2000510813A - Ｉｌ−１２用処方 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 貯蔵および投与に適したＩＬ−１２濃縮調合物およびＩＬ−１２処方を得るための新規組成物ならびに製造方法が本発明により提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−１２用処方 発明の分野 一般的には、本発明は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を含んでなる 新規処方に関する。 発明の背景 ＩＬ−１２はヘテロ二量体サイトカイン（約３５ｋＤのサブユニット（ｐ３５ ）および約４０ｋＤのサブユニット（ｐ４０）からなる）であり、もともと、１ ９９２年４月２日公開のＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２（参照により本明細書に 記載されているものとみなす）に記載されているようにＴ細胞および天然キラー 細胞からのγ−インターフェロンの融合を行う因子として同定された。ＰＣＴ／ ＵＳ９１／０６３３２においてはＩＬ−１２は天然キラー細胞刺激因子またはＮ ＫＳＦと呼ばれている。１９９１年６月２６日公開のＥＰ４３３８２７には、Ｉ Ｌ−１２が細胞毒性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）として開示されている。これ らの特許公開はＩＬ−１２のクローニングおよび発現、ならびにそのサブユニッ トについても開示している。よって、組み換えＤＮＡ法を利用することにより、 ＩＬ−１２蛋白を製造することが可能である。 またインターロイキン−１２は、インターロイキン−αおよびインターロイキ ン−２（よく知られた天然キラー細胞の細胞毒性活性の活性化剤）を用いて得ら れるレベルに比肩しうるレベルの細胞溶解能を増大させることによってインビト ロで天然キラー細胞を剌激する。同定されているインターロイキン−１２のさら なるインビトロ活性は、同時刺激剤としてのＴ細胞増殖の誘導；インターロイキ ン−２により誘導される天然キラー幼若細胞の増殖の抑制；インターロイキン− ２により誘導されるＴ細胞受容体−γδ−陽性細胞の増殖の抑制；前駆細胞から のＴｈ１細胞分化の促進；Ｔｈ１の促進（しかしＴｈ２増殖は促進しない）；Ｔ 細胞細胞溶解活性の増強：細胞毒性リンパ球発生の促進；天然キラーおよび天 然キラー幼若細胞の細胞溶解活性の増強；インターロイキン−２で治療されてい る患者の末梢血単核細胞における天然キラー活性のエクスビボ促進；天然キラー 細胞上の付着分子の誘導；天然キラー幼若細胞におけるパーフォリンおよびグラ ンザイムＢ ｍＲＮＡの誘導；天然キラー細胞上のインターロイキン−２受容体 サブユニット（ｐ５５、ｐ７５）の誘導；低レベルの腫瘍壊死因子−αの誘導； インターフェロン−γ依存的または非依存的機構によるＩｇＥ合成の抑制；胎児 胸腺期間培養物におけるＴ細胞発生の転調；ならびに骨髄細胞およびＢ細胞前駆 細胞の増殖を促進するキットリガンド（kit ligand）との相乗作用を包含する。 インターロイキン−１２の知られているインビボ活性は、インターフェロン−γ の誘導；脾臓、肝臓、肺および腹腔における天然キラー細胞活性の増強；アロ− 特異的細胞毒性リンパ球の発生の促進；マウス・脾臓における骨髄外造血の誘導 ;骨髄における造血の可逆的抑制；マウスにおける貧血、リンパ球減少症および 好中球減少症の可逆的誘導；抗−ＩｇＤにより誘導されるＩｇＥ、ＩｇＧ１およ びインターロイキン−４発現の抑制；トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma g ondii）で処理されたＳＣＩＤマウスの生存率上昇；マウス感受性株におけるリ ューシマニア症の治癒；クリプトコッカス科のモデルにおける生体負荷の軽減； 腫瘍増殖の抑制；ならびに腫瘍細胞に対する免疫性の促進を包含する。またイン ターロイキン−１２は敗血性ショックのシュワルツマン反応モデルにおいてイン ビボで誘導される。 貯蔵可能な、そして蛋白の最終投与形態のさらなる製造に適した蛋白、例えば ＩＬ−１２のバルク蛋白となった濃縮形態を有することが望ましい。典型的には 、蛋白精製工程は蛋白の濃縮を結果として生じる。この濃縮蛋白はバルク蛋白と しても知られ、処方バッファー中に含有されていてもよい。次いで、典型的には 、約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの濃度のバルク蛋白を冷凍して充填 ／最終製品製造施設へと運び、そこで適当な用量濃度にまで希釈され、投与用バ イアルに入れられる。これらの希釈試料を凍結乾燥、すなわち、フリーズ−ドラ イすることができる。凍結乾燥試料は長期間貯蔵してもよく、後になって適当な 投与用希釈剤を添加することにより患者への使用直前に復元することもできる。 蛋白安定性は、とりわけ、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解サイクルの繰 り返しおよび剪断力への曝露のごとき因子によって影響を受ける可能性がある。 変性および凝集（可溶性凝集および不溶性凝集の両方の形成）のごとき物理的不 安定化因子、ならびに例えば加水分解、脱アミノ化および酸化（まだたくさん挙 げられる）を包含する化学的不安定化因子の結果として活性蛋白は消失しうる。 蛋白薬剤の安定性に関する一般的概説としては、例えば、Manning,et al.，Phar maceutical Research 6:903-918(1989)参照。 蛋白不安定化因子の生じうる場合は広く理解されているが、特定の蛋白の特定 の不安定化因子を予測することは不可能である。これらの不安定化因子は、蛋白 、蛋白副産物、あるいは低い活性、増加した活性、および／または免疫原性を有 する誘導体の生成を引き起こしうる。また、ＩＬ−１２は可溶性高分子凝集体を 形成する傾向があり、それは製品の品質および使用における有効性を減じる可能 性がある。よって、蛋白医薬処方の安全性および有効性はその安定性に左右され る。 安定性を考慮する以外に、一般的には、種々の世界中の医薬規制当局に是認さ れるかまたは是認されるであろう賦形剤を選択する。バッファーの選択および量 は、所望ｐＨ範囲を達成し、これを維持するのに重要である。 理想的には、処方は高濃度（例えば、≧２０ｍｇ／ｍｌ）のＩＬ−１２バルク 貯蔵に適するものとすべきであり、そのことにより、適当な用量に充填／最終製 品化する際に比較的小体積で済み、高蛋白濃度を必要としうる他の投与方法、例 えば、皮下投与が可能になる。したがって、濃縮工程および凍結乾燥工程の間に ＩＬ−１２蛋白の安定性をモニター（および活性レベルを維持）し、さらに長期 貯蔵の間処方を安定にする方法に対して、当該分野において必要性が存在し続け ている。 発明の概要 本発明の１の態様は、薬剤製品として有用なＩＬ−１２濃縮調合物を提供する ための新規組成物および方法を提供する。凍結状態、液体または凍結乾燥された これらの組成物は、（ａ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１２の生物学的活性フラグメント 、ＩＬ−１２のサブユニット、およびＩＬ−１２のサブユニットの多量体からな る 群より選択される蛋白；（ｂ）ポリソルベート；（ｃ）凍結保護剤；（ｄ）バル キング剤；ならびに（ｅ）該組成物のｐＨを約４.５から約７.４の範囲に維持す るバッファー剤を含んでなる。 好ましくは、スクロース、マルトース、ラクトースおよびそれらの混合物から 凍結保護剤を選択する。好ましくは、凍結保護剤は、組成物の約０.５ないし約 ５％の占める。スクロースを用いる場合、好ましい濃度は約０.５ないし約２％ であり、最も好ましくは約２％である。好ましくは、マンニトール、グリシンお よびそれらの混合物からバルキング剤を選択する。好ましくは、バルキング剤は 、組成物の約１％ないし約５％を占める。マンニトールを用いる場合には、好ま しい濃度は約３ないし５％であり、最も好ましくは約４.１５％である。スクロ ース／マンニトールの混合物が特に好ましい。 好ましくは、ツイン２０およびツイン８０からなる群からポリソルベートを選 択し、最も好ましくはツイン２０である。特定の具体例において、ポリソルベー トは約０.００１ないし０.１％の濃度で存在し、好ましくは約０.００１ないし ０.１％の濃度、最も好ましくは約０.０２％の濃度で存在する。複数のポリソル ベートを用いてもよい。 好ましい具体例において、バッファー剤は該組成物のｐＨを約５.２ないし約 ７.４の範囲、最も好ましくは約５.６に維持する。コハク酸塩、ヒスチジン、リ ン酸塩、Ｔｒｉｓ、およびジエタノールアミンからなる群から好ましいバッファ ー剤を選択し、コハク酸塩（詳細には、ナトリウムおよびカリウム塩）が最も好 ましい。 好ましくは、蛋白は約１μｇ／ｍｌないし約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは 約１ないし約１０００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５ないし約５００μｇ／ｍ ｌの濃度で存在する。 詳細には、本発明の好ましい具体例は、約５ないし約５００μｇ／ｍｌのＩＬ −１２、約２％のスクロース、約４.１５％のマンニトール、約１０ｍＭのコハ ク酸ナトリウム、および約０.０２％のツイン２０を含んでなり、約５.６のｐＨ を有する。 図面の簡単な説明 図１は、種々のｐＨにて３０℃で１６週間置いた組み換えヒト・ＩＬ−１２（ ｒｈＩＬ−１２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。 図２は、種々のｐＨにて３０℃で１２週間まで貯蔵して収集した定量的ＳＤＳ −ＰＡＧＥのデータを示す。 図３は、種々のｐＨにて３０℃で２６週間置いたｒｈＩＬ−１２のサイズ排除 クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。 図４は、種々のｐＨにて３０℃で１６週間置いたｒｈＩＬ−１２の等電点クロ マトフォーカシングの結果を示す。 図５は、１週間あたりの減少（ｒｈＩＬ−１２ヘテロ二量体）パーセントまた は増加（高分子（ＨＭＷ）凝集体）パーセントであると考えられる反応速度（ｋ ）を示す適合ラインを引くプロットを示す。 図６は、凍結保護剤およびバルキング剤の異なる組み合わせを含有するｒｈＩ Ｌ−１２処方のケーク量を比較するグラフである。 図７は、２ｘ２多変数マトリックス実験で得たＳＥＣトレースを示し、さらに ツイン８０によるミセルが高分子凝集体と同時溶出することを示す。 図８は、０.１ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２含有または不含のツイン２０含有 処方で得られたＳＥＣトレースの重ね合わせを示す。 図９は、ツイン２０をツイン８０と比較する吸着の研究の結果を示す。 図１０は、ツイン２０をツイン８０と比較する凍結／融解の研究の結果を示す 。 図１１は、種々のｒｈＩＬ−１２処方の振盪の研究の結果を示す。 図１２〜１４は、それぞれ０.１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌおよび０.０ １ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２を含有する試験処方についての経時的ｒｈＩＬ− １２濃度変化を示すグラフである。 図１５〜１７は、それぞれ０.１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌおよび０.０ １ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２を含有する試験処方についての経時的高分子凝集 体量の変化を示すグラフである。 発明の詳細な説明 本明細書の用語「凍結乾燥、凍結乾燥した、およびフリーズ−ドライされた」 は、溶液を「凍結」し、次いで、所望により減圧下で「乾燥」（減圧下が好まし い）することを含む工程を包含するが、これに限らない。本明細書の用語「バル キング剤」は、良好な凍結乾燥ケークを生じ、凍結乾燥に関連した種々のストレ ス（例えば、剪断／凍結）から蛋白を守り、蛋白活性レベルを維持するのを助け る作用剤を含んでなる。典型的なバルキング剤は、グリシン、マンニトール、Ｍ ｇＣｌ₂、ＣａＣｌ₂等を包含するが、これらに限らない。これらの作用剤は処方 の等張性に貢献する。凍結保護剤も処方の等張性に貢献する。一般的には、用語 「凍結保護剤」は、蛋白に安定性を付与して凍結により誘導されるストレスから 保護する作用剤を包含するが、該用語は、安定性を付与する作用剤、すなわち、 貯蔵中のバルク薬剤処方に安定性を付与して凍結によらないストレス保護する作 用剤を包含する。典型的な凍結保護剤はポリオール類を包含し、スクロースおよ びマンニトールのごとき糖類を包含し、さらにまたポリソルベートのごとき界面 活性剤等を包含する。用語「凍結保護剤」は、おそらくは、水素結合によって蛋 白の正しいコンホーメーションを維持することにより、乾燥工程において系から 脱水する間に蛋白に安定性を付与する薬剤を包含する。凍結保護剤は融解保護効 果を有することがあり、それゆえ、本明細書では「凍結保護剤」および「融解保 護剤」を交えて用いる。 用語「バッファー剤」は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容範囲に維持する作用 剤を包含し、コハク酸塩（ナトリウム塩）、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウム またはカリウム塩）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、 ジエタノールアミン等を包含しうる。一般的には、当業者ならば容易に理解する であろうが、「バルク」蛋白に関する濃度上限は「投与」蛋白形態に関する濃度 上限よりも高い。例えば、バッファー濃度は数ミリモラーないしその溶解度上限 までの範囲でありうる。例えば、コハク酸塩は、２００ｍＭまでである。当業者 は、生理学的に適当な濃度を達成／維持することも考慮するであろう。固体の場 合にはパーセンテージは重量／重量パーセントであり、液体の場合にはパーセン テージは重量／体積パーセントである。用語「等張」３００±５０ｍＯｓＭは、 凍結乾燥前の蛋白溶液の浸透圧の測定値を意味する。典型的には、注射用水（Ｗ ＦＩ）で復元する。生理学的浸透圧を維持することは、投与処方にとり重要であ る。しかしながら、バルク処方には、使用前に溶液が等張にされる限り、より高 濃度を効果的に用いることができる。用語「賦形剤」は、良好な凍結乾燥ケーク 特性を提供し、さらに蛋白の液体保護および凍結保護、ｐＨの維持、および貯蔵 中の蛋白の正しいコンホーメーションを提供して実質的な生物学的活性（蛋白安 定性）を維持する医薬上許容される試薬（バルキング剤）を包含する。好ましく は、賦形剤の合計濃度は、１ｋｇあたり約２５０ないし約３５０ミリオスモル（ ｍＯｓｍ）、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／ｋｇの合計浸透圧を与える。 それゆえ、本発明によれば、無傷のＩＬ−１２は２個の共有結合サブユニット を含んでなるヘテロ二量体糖蛋白であり、該サブユニットの１つは約４０ｋＤの 分子量を有し、もう１つのサブユニットは約３５ｋＤの分子量を有している。い ずれの形態のＩＬ−１２を用いて本発明を実施してもよい。例えば、ＩＬ−１２ は、３５ｋＤのサブユニットにジスルフィド結合した４０ｋＤのサブユニットを 含んでなるヘテロ二量体の形態であってもよい。ＩＬ−１２がヘテロ二量体であ る場合、４０ｋＤのサブユニットは、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２またはＥＰ ４３３８２７に示されたヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤのサブユニットに対して実 質的相同性を有しており、それらの特許公報に示されたヒト・ＩＬ−１２の３５ ｋＤのサブユニットに対して実質的相同性を有する３５ｋＤのサブユニットにジ スルフィド結合している。「実質的相同性」とは、アミノ酸レベルで７５％以上 の相同性を有し所望生物学的機能を保持していることを意味する。本発明に使用 してもよいＩＬ−１２のもう１つの形態はＩＬ−１２サブユニットである。かか るＩＬ−１２の４０ｋＤのサブユニットはヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤに対して 実質的相同性を有しており、かかるＩＬ−１２の３５ｋＤのサブユニットはヒト ・ＩＬ−１２の３５ｋＤのサブユニットに対して実質的相同性を有している。Ｉ Ｌ−１２の生物学的活性を有しているＩＬ−１２のフラグメントも、本発明処方 の製造に有用である。ホモ二量体のごときＩＬ−１２サブユニットの多量体を用 いてもよい。 本発明における使用のためには、適当な形質転換細胞中でＩＬ−１２サブユニ ットの一方または両方をコードしているＤＮＡ配列の発現により、ＩＬ−１２を 組み換え法により製造することが好ましい。例えば、既知方法を用いて、ヒト・ ＩＬ−１２をコードしているＤＮＡ配列をｐＥＤ（Kaufman et al.,Nucleic Aci ds Res.19,4484-4490(1991)）のごとき発現ベクターに連結してもよい。かかる 発現ベクターにおいて、ＣＣＡＣＣ（Kozak,M.,Nucleic Acids Res.12,857-871( 1984)）のごとき翻訳を最適化する配列を、既知方法を用いて開始コドンの５’ に付加してもよい。次いで、ＩＬ−１２サブユニットを含む発現ベクターを宿主 中に形質転換し、蛋白発現を誘導し最大にしてヘテロ二量体ヒト・ＩＬ−１２を 製造してもよい。ヘテロ二量体ＩＬ−１２の製造のためには、ＩＬ−１２サブユ ニットをコードしているＤＮＡ配列が異なる発現プラスミド中に存在していても よく、あるいは単一の発現プラスミド中に並んで存在していてもよい。 ＩＬ−１２のサブユニットまたはフラグメントを用いて本発明を実施する場合 、既知方法を用いてそれを製造してもよい。例えば、ヒト・ＩＬ−１２の４０ｋ ＤをコードしているＤＮＡ配列を発現ベクターに連結し、宿主細胞中に形質転換 し、発現を誘導し最大にしてヒトＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットを製造して もよい。同様に、ヒト・ＩＬ−１２の３５ｋＤをコードしているＤＮＡ配列を発 現ベクターに連結し、宿主細胞中に形質転換し、発現を誘導し最大にしてヒトＩ Ｌ−１２の３５ｋＤサブユニットを製造してもよい。もちろん、ＩＬ−１２サブ ユニットをコードしている縮重ＤＮＡ配列を用いて本発明に使用するＩＬ−１２ を製造してもよく、ＩＬ−１２サブユニットの対立遺伝子変種をコードしている ＤＮＡ配列についても同様に用いることができる。 いずれの適当な発現ベクターを用いて本発明で用いるＩＬ−１２を製造しても よい。哺乳動物での発現のために、上記ｐＥＤベクターのほかにもｐＥＦ−ＢＯ Ｓ（Mizushima et al,.Nucleic Acids Res.18,5322(1990)）；ｐＸＭ、ｐＪＬ３ およびｐＪＬ４（Gough et al.,EMBO J.4.645-653(1985)）；ならびにｐＭＴ２ （ｐＭＴ２−ＶＷＦ,ＡＴＣＣ ＃６７１２２の誘導体；ＰＣＴ／ＵＳ８７／０ ００３３参照）のごとき多数の発現ベクターが知られている。酵母、昆 虫および細菌細胞での使用に適した発現ベクターも知られている。かかる発現ベ クターの構築および使用は十分に当業者のレベルの範囲内である。 本発明での使用に有用な組み換え生産に適した宿主細胞は、例えば、チャイニ ーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ細胞、マウス・３Ｔ３細胞 、マウスＬ細胞、ＮＳＯ（Galfre and Milstein,Methods in Enzymology 73,3-4 6(1981)）のごときミエローマ細胞、ハムスター乳児腎臓細胞等を包含する。既 知方法を用いてＩＬ−１２をコードしているＤＮＡ配列で酵母、昆虫および細菌 細胞を形質転換し、蛋白発現を誘導し、増幅することによってＩＬ−１２を製造 してもよい。 組み換え法により製造されたＩＬ−１２を、慣用的精製法により培地または細 胞抽出物から精製するとができる。市販蛋白濃縮フィルター、例えば、Amiconま たはMillipore Pellicon限界濾過ユニットを用いてＩＬ−１２を含有する培地ま たは細胞抽出物を濃縮してもよい。濃縮工程後、ゲル濾過媒体のごとき生成マト リックスに濃縮液を適用することができる。別法として、アニオン交換樹脂、例 えば、懸垂ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基 材を用いることもできる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキス トラン、セルロースまたは蛋白精製に通常使用される他のタイプのものであって もよい。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を 含む種々の不溶性マトリックスを包含する。 培養上清からのＩＬ−１２の精製は、レクチン−アガロース、ヘパリン−トヨ 樹脂、あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのご とき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー；あるいは免疫アフィニテ ィークロマトグラフィーによる１またはそれ以上のカラム工程を包含してもよい 。最後に、疎水性逆相高品質液体クロマトグラフィー媒体、例えば、懸垂メチル または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質 液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて本発明方法および組成 物に使用するＩＬ−１２をさらに精製することができる。上記精製工程のいくつ か または全部を種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え蛋白を得るこ とができる。本発明に用いるＩＬ−１２サブユニットまたはフラグメントの精製 は、ヘテロ二量体蛋白の最適精製プロトコールとは異なるかもしれない。 好ましくは、ヒト・ＩＬ−１２を上記のごとき組み換え法により製造する場合 、下記方法により精製してもよい。ヒト・ＩＬ−１２を産生した細胞をならし培 地から濾過により取り、１０〜３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ,ｐＨ７.８〜８. ３で平衡化されたＱ−セファロースFastFlow^TM（Pharmaciaから得られる）また は同等のアニオン交換媒体にならし培地を負荷する。次いで、カラムを同じバッ ファーでさらに洗浄し、その後３０〜４５ｍＭのヒスチジン,ｐＨ５.１〜５.８ で洗浄し、次いで、もとの平衡化バッファーで洗浄する。組み換えヒト・ＩＬ− １２は、２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.８〜８.５および０.１５な いし０.５０Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーとともにカラムから溶離する。 ２０〜５０ｍＭ ＭＥＳ,ｐＨ５.７〜６.４で平衡化したＣＭ−セファロースFas tFlow^TM（Pharmaciaから得られる）または同等のカチオン交換媒体に溶離した物 質を負荷し、同バッファーでさらに洗浄する。２０〜４０ｍＭリン酸ナトリウム ,ｐＨ６.８〜７.５および０.２〜０.５ｍＭを含有するバッファーで洗浄する。 洗浄され、ＣＭ−セファロースFastFlow^TMカラムに用いる溶離バッファーで平衡 化されたAmicon^TMS1Y30または同等のスパイラルカートリッジ膜を用いて溶離し た物質を濃縮する。最終クロマトグラフィー工程のカラム体積の５％未満にまで 材料を濃縮し、Ｓ２００セファクリル^TM（Pharmaciaから得られる）または同の サイズ排除樹脂によるサイズ排除によりさらに精製する。サイズ排除カラムをリ ン酸緩衝化セイライン,ｐＨ７.２〜７.６で平衡化し、溶離し、組み換えヒト・ ＩＬ−１２のピークを集めて濾過して本発明方法に使用する。蛋白精製の当業者 は、本発明方法に使用する組み換え法により製造されたヒト・ＩＬ−１２を得る ために別の精製法を用いてもよい。 本来的にＩＬ−１２を生産する細胞の培地または抽出液からＩＬ−１２を精製 し、本発明に使用してもよい。天然において生産されるＩＬ−１２の典型的な精 製スキームはＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２およびＥＰ４３３８２７に記載され ている。 下記実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は単に説明の目的で提 供され、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。 実施例１ ｐＨの影響の試験 組み換えヒト・ＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）の安定性および溶解度に対する ｐＨの影響を、６カ月の安定性の研究において試験した。１.２ｍｇ／ｍｌの濃 度のｒｈＩＬ−１２を、ｐＨ３.５から９.６までの範囲の７種のバッファー（ｐ Ｈ３.５,酢酸Ｎａ；ｐＨ４.５,グルタミン酸Ｎａ；ｐＨ５.５,コハク酸Ｎａ；ｐ Ｈ６.５,ヒスチジン；ｐＨ７.２,リン酸Ｎａ；ｐＨ８.３,Ｔｒｉｓ；ｐＨ９.６, グリシン）中に透析した。試料を無菌的にバイアルに入れ、次いで、−８０℃、 ４℃、３０℃、４０℃および５０℃にて貯蔵した。貯蔵物から試料を定期的に取 り、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点フォーカシング（ＩＥＦ）お よびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。 図１は、３０℃で１６週間の種々のｐＨにおけるｒｈＩＬ−１２のＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析結果を示す。ISS 3〜27%Sepragelに定電流を流し、４.５％アクリル アミドスタックを用いるLaemliのバッファーを用いた。Daiichi Silver Stain I Iキットを用いてゲルを銀染色した。 図２は、種々のｐＨで３０℃で１２週間までに集めた定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ のデータを示す。ゲルをクーマシー染色し、Pharmacia LKBのゲルスキャナーを 用いてスキャンした。これにより、サイズ排除クロマトグラフィーに対応する平 均値が得られた。 図３は、３０℃で２６週間、種々のｐＨに置いたｒｈＩＬ−１２のサイズ排除 クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。Tosohaas 7.6x300mm TSK3000swx1カ ラムを、２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、３５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.０のランニン グバッファーおよび１０μｇの負荷量を用い、０.９ｍｌ／分の流速で１８分間 イソクラティック的にクロマトグラフィーを行った。該方法をHewlett Packard 1090 HPLCにて行った。 図４は、３０℃で１６週間の貯蔵後、種々のｐＨにおけるｒｈＩＬ−１２の等 電点フォーカシングの結果を示す。０.５Ｍ酢酸（アノード）および０.５ＭＮａ ＯＨ（カソード）として、PharmaciaPAGplate（ｐＩ４.０ないしｐＩ６.５）を １０００Ｖ,１５ｍＡ,１５Ｗでプレフォーカシングした。試料アプリケーター片 を用いて５μｇの各試料を負荷した。ゲル電気泳動を１０００Ｖ,１５ｍＡ,１５ Ｗで２.５時間行い、ＥｔＯＨ中２０％ＴＣＡで４５分固定し、次いで、Daiichi Silver Stain IIキットを用いて銀染色した。 図５は、種々の分解産物の精製速度をｐＨの関数としてプロットしたものを示 す。データは図１〜４に基づく。データを下表１にまとめる。 ＊図５には含まれない；図４に示すデータ ３０℃でのフォーカシングのデータからの多くの結論を以下に記載する：（１ ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に両方により観察されるように 、凝集はｐＨ４.５ないし５.５で最小となる。（２）逆相ＨＰＬＣおよびＳＤＳ −ＰＡＧＥにより示されるように、ｐ４０サブユニットのレベル増加によりヘテ ロ二量体の解離が示される。これはｐＨ５.５〜８.３で最小となる。（３）ＲＰ −ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるように、クリップ形態の生成 は ｐＨ≧５.５で最小となる。かくして、酸触媒加水分解が回避される。（４）５ ０ｋＤ種の生成はｐＨ≧５.５で最小となる。（５）ＩＥＦゲル分析により観察 された電荷の変化はｐＨ４.５〜５.５で最も安定であることを示す。塩基性ｐＨ において、試料はアノードへ移動し、脱アミノ化が潜在的に示される。これらの 結果に基づくと、最も安定なｐＨは約５.５である。 実施例２ 凍結保護剤およびバルキング剤の影響の試験 いくつかの凍結保護剤およびバルキング賦形剤を凍結乾燥特性に関して試験し た。試験した凍結保護剤はグルコース、スクロース、マルトース、トレハロース 、フルクトースおよびラクトースを包含した。試験したバルキング剤はグリシン 、マンニトールおよびソルビトールを包含した。示差熱分析的研究（データ示さ ず）後、凍結保護剤およびバルキング剤の６種の組み合わせをさらなる研究のた めに選択した：スクロース／マンニトール、マルトース／マンニトール、ラクト ース／ナンミトール、スクロース／グリシン、マルトース／グリシンおよびグル コース／グリシン。 賦形剤の６種の組み合わせを９種の割合で混合し、おだやかな凍結乾燥サイク ルを用いて凍結乾燥した。各試料は０.５ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２および１ ０ｍＭコハク酸塩ｐｐＨ５.６を含んでいた（５ｍｌバイアルに１ｍｌを入れた ）。ケーク質を１点（最悪）から５点（最良）までとして判定した。結果を図６ に示す。 凍結乾燥バイアルを上記のごとく調製し、復元し、高分子（ＨＭＷ）凝集体の レベルについて試験した。さらに、各組み合わせについて浸透圧を計算した。デ ータを表ＩＩに示す。表ＩＩ 上の値＝ケーク質（５点が最良、１点が最悪） 中の値＝計算した浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ） 下の値＝凍結乾燥し復元した後の高分子凝集体のパーセンテージ これらのデータは、ケークの質、浸透圧（３００ｍＯｓｍ／ｋｇが等張）およ び高分子凝集体レベルに基づくさらなる試験のために選択された２０個の組み合 わせを示す。 表ＩＩからの１２種の選択処方を等張となるよう最適化し、次いで、凍結乾燥 した。すべての処方は０.１ｍｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−１２、０.０２％ツイン８０ 、１０ｍＭコハク酸ナトリウム,ｐＨ５.６を含有していた。残存水分、高分子凝 集体のパーセンテージ（凍結乾燥後）、およびケークの質（１＝悪い、３＝優秀 ）を測定した。浸透圧を計算した。結果を表ＩＩＩに示す。 ケークの残存水分の分析により、組み合わせは十分な乾燥（＜１％）を提供す ることが示された。一般的には、ケークの質は良好であったが、高分子凝集体レ ベルは上昇した。これらの試料の形成に使用した凍結乾燥サイクルの最適化によ りケークの質を改善することができた。これらのデータに基づいて、５つの候補 （影を付した）をさらなる実験のために選択した。 実施例３ ポリソルベートの効果の試験 実験により、ツイン８０が凍結／融解サイクルおよび振盪中のｒｈＩＬ−１２ の沈殿防止を促進し、さらにまたガラス表面へのｒｈＩＬ−１２の吸着を防止す ることがわかった。ｒｈＩＬ−１２が非常に低蛋白濃度（１０〜１００μｇ／ｍ ｌ）で処方されるという事実のため、復元後の凍結乾燥剤型の吸着は明確な可能 性がある。この潜在的問題を改善するために、処方候補に０.０２％のでツイン ８０を添加濃度した。この濃度において、ツイン８０は所望効果を発揮した。 しかしながら、この特定濃度のツイン８０は、ＳＥＣにより分離した場合に高 分子凝集体と一緒に溶離されるミセルを形成した。図７は、２ｘ２多変数マトリ ックス実験で得られたＳＥＣトレースを示し、ツイン８０によるミセルが高分子 凝集体といっしょに溶離することを示す。このことは低蛋白濃度において人為的 に高分子種の値を上昇させ、アッセイをより不正確にする。図８は、０.１ｍｇ ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２を含むあるいは含まないツイン２０含有処方から得たＳ ＥＣトレースを重ね合わせたものを示す。この図はツイン２０のよるミセルは高 分子凝集体と一緒に溶離しないことを示す。しかしながら、取り扱いおよび吸着 に関してツイン２０がツイン８０と同様に挙動するかどうかを確認する必要があ る。 図９は、ツイン２０とツイン８０を比較する吸着の研究の結果を示す。１０ｍ Ｍコハク酸ナトリウム,ｐＨ５.６中０.００１％または０.０１％のツイン２０ま たはツイン８０のいずれかを含有する２および５μｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２ を５ｍｌガラスバイアルに入れて０、３および７日間室温放置した。蛍光分光法 （励起＝２９５ｎｍ、エミッション＝３３７ｎｍ）により試料を分析し、標準曲 線（蛍光により２ないし１０μｇ／ｍｌ）と比較した。回収率は０日目のデータ に基づく。これらのデータにより、ツイン２０は、ツイン８０よりも良好とは言 えないが、同程度であることが示される。 図１０は、ツイン２０とツイン８０を比較する凍結／融解の研究の結果を示す 。１０ｍＭコハク酸ナトリウム,ｐＨ５.６中０.００１％または０.０１％のツイ ン２０またはツイン８０のいずれかを含有する２０μｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２ を１０回の凍結／融解サイクルに供した。０、２、４、６、８および１０回目の サイクルにおいて部分試料を分取し、図９について上で説明したように蛍光によ り分析した。回収率は０回目のサイクルに基づく。これらのデータにより、ある 程度の凍結保護効果を提供することにおいてツイン２０ならびにツイン８０は同 程度であることを示される。 図１１は、振盪の研究の結果を示す。７種の異なる濃度のツイン２０を含む種 々の候補処方中の０.１ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１２を７２時間激しく振盪した 。試料を濾過し、逆相クロマトグラフィーによりアッセイした。回収率は、振盪 しなかった試料を基準にした全蛋白である。 実施例４ 安定性の研究 いくつかの処方の安定性を経時的に研究した。０.５％スクロース、１.６３％ グリシン、０.０１％ツイン２０、１０ｍＭコハク酸ナトリウム,ｐＨ５.６を含 有するスクロース／グリシン処方（ＳＧまたはＳｕｃＧｌｙという）を用いた。 ２.０％スクロース、４.１５％マンニトール、０.０２％ツイン２０、１０ｍＭ コハク酸ナトリウム,ｐＨ５.６を含有するスクロース／マンニトール処方（ＳＭ またはＳｕｃＭａｎという）を用いた。これらの処方の両方を用いて、３種の異 なる蛋白濃度（０.１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌおよび０.０１ｍｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−１２）の試験処方を作成した。種々の時間間隔におけるｒｈＩＬ− １２濃度および高分子凝集体量について試料をアッセイした。 図１２〜１４は、０.１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌおよび０.０１ｍｇ／ ｍｌ ｒｈＩＬ−１２試験処方について、ｒｈＩＬ−１２濃度の経時的変化をそ れぞれ示す。図１５〜１７は、０.１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌおよび０. ０１ｍｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−１２試験処方について、高分子凝集体量の経時的変 化をそれぞれ示す。 本発明を特定の方法、処方および組成物について説明したが、本発明を考慮し て当業者が変更および修飾を行うであろうということが理解される。上記実施例 で説明した本発明における多くの修飾および変更は、当業者により行われること が予想され、結果として、請求の範囲にあるような限定のみが本発明に存在すべ きである。したがって、特許請求されている本発明の範囲内のかかるすべての均 等な変更をカバーすることが添付した請求の範囲において企図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スミス，トレイシー・エム アメリカ合衆国01841マサチューセッツ州 ローレンス、ローガン・ストリート・ナ ンバー２エル、25番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１２の生物学的活性フラグメント、ＩＬ−１２ のサブユニット、およびＩＬ−１２のサブユニットの多量体からなる群より選択 される蛋白；（ｂ）ポリソルベート；（ｃ）凍結保護剤；（ｄ）バルキング剤； および（ｅ）組成物のｐＨを約４.５ないし約７.４の範囲に維持するバッファー 剤を含んでなる組成物。 ２．該凍結保護剤がスクロース、マルトース、ラクトースおよびそれらの混合 物からなる群より選択されるものである請求項１の組成物。 ３．該凍結保護剤がスクロースである請求項２の組成物。 ４．該処方中のスクロース濃度が約０.５ないし２％である請求項３の組成物 。 ５．該スクロース濃度が約２％である請求項４の組成物。 ６．該バルキング剤がマンニトール、グリシンおよびそれらの混合物からなる 群から選択されるものである請求項１の組成物。 ７．該バルキング剤がマンニトールである請求項６の組成物。 ８．該組成物中のマンニトール濃度が約３％ないし約５％である請求項７の組 成物。 ９．該濃度が約４.１５％である請求項８の組成物。 １０．該ポリソルベートがツイン２０およびツイン８０からなる群より選択さ れるものである請求項１の組成物。 １１．該ポリソルベートがツイン２０である請求項１０の組成物。 １２．該ポリソルベートが約０.００１ないし０．１％の濃度で存在する請求 項１１の組成物。 １３．該ポリソルベートが約０.０２％の濃度で存在する請求項１２の組成物 。 １４．該バッファー剤が該組成物のｐＨを約５.２ないし約７.４に範囲に維持 するものである請求項１の組成物。 １５．該バッファー剤が該処方のｐＨを約５.６に維持するものである請求項 １４の組成物。 １６．該バッファー剤がコハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、およ びジエタノールアミンからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。 １７．該バッファー剤がコハク酸ナトリウムである請求項１５の組成物。 １８．該バッファー剤がコハク酸カリウムである請求項１５の組成物。 １９．該蛋白がＩＬ−１２である請求項１の組成物。 ２０．該蛋白が約１ないし約１０００μｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項１の 組成物。 ２１．該蛋白が約５ないし約５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する請求項２０の 組成物。 ２２．約５ないし約５００μｇ／ｍｌのＩＬ−１２、約２％のスクロース、約 ４.１５％のマンニトール、約１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、および約０.０２ ％のツイン２０を含んでなり、約５.６のｐＨを有する請求項１の組成物。 ２３．凍結乾燥されている請求項１の組成物。