KR20150033615A

KR20150033615A - 항-dll4 항체들을 함유하는 안정화된 제제들

Info

Publication number: KR20150033615A
Application number: KR1020147035879A
Authority: KR
Inventors: 스콧 월시; 다니엘 딕스
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2015-04-01
Also published as: CA2872275A1; PT2854849T; WO2013181486A1; EP2854849B1; PH12014502429B1; JP6144758B2; AR092325A1; CA2872275C; ES2668900T3; PL2854849T3; NO2887943T3; US20130323260A1; MA37645B1; MX357146B; UY34842A; CN104349791A; PH12014502429A1; SI2854849T1; TWI609696B; TW201400130A

Abstract

본원 발명은 인간 델타-유사 리간드 4 (Dll4)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약제학적 제제들을 제공한다. 상기 제제들은 항-Dll4 항체 이외에도, 포스페이트 버퍼, 유기 공용매, 이당류, 그리고 염을 함유할 수 있다. 본원 발명의 약제학적 제제들은 수개월 동안 저장 후에 그리고 열적인 그리고 여타의 물리적 스트레스에 도입된 후에도 상당한 정도의 항체 안정성을 나타낸다.

Description

항-DLL4 항체들을 함유하는 안정화된 제제들{STABILIZED FORMULATIONS CONTAINING ANTI-DLL4 ANTIBODIES}

본 출원은 PCT 국제출원으로서 2013년 5월 31일에 출원된 것이며, 2012년 5월 31에 출원된 미국 가특허출원 제61/653,478호, 이의 개시 전체는 본원에 편입됨, 의 우선권을 주장한다.

[기술 분야]

본원 발명은 치료적 항체 제제들 분야에 관련된다. 보다 구체적으로, 본원 발명은 인간 델타-유사 리간드 4 (Dll4)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약제학적 제제들의 분야에 관련된다.

[서열 목록]

서열 목록의 ST.25 적용(compliant) 컴퓨터 ST.25 해독가능 텍스트 파일이 37 C.F.R. §1.821(e)에 따라 본원 명세서와 동시에 출원된다. 텍스트 파일의 내용은 본원 명세서에 편입된다. 37 C.F.R. §1.821(f)에 따라 ST.25 적용(compliant) 컴퓨터 ST.25 해독가능 텍스트 파일의 내용과 동일한 서열 목록의 출력 카피는 본원 명세서의 일부로서 포함되며 본원 명세서에 참고 문헌으로서 편입된다.

노치신호전달 경로(Notch-signaling pathway)는 광범위한 진핵 생물들에서 많은 생물학적 과정들, 이를테면 분화, 증식, 및 생체 항상성을 위하여 사용되는 세포-대-세포 통신 시스템이다. 델타 유사 4 (Dl4) 또는 델타-유사 리간드 4 (Dll4) (이하에서 "Dll4")는 혈관 내피(vascular endothelium)에 의하여 높은 선택적 발현을 나타내는 노치 리간드들의 델타 패밀리의 멤버이다. (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4는 노치 1 및 노치 4를 포함하는, 노치 수용체들에 대한 리간드이다. 인간 Dll4의 아미노산 서열이 서열 번호 9에 표현되어 있다. Dll4-노치 신호전달 경로가 혈관신생의 조절에 작용하는 중요한 역할과 그의 인간 건강 및 의학에 대한 영향을 감안하면, Dll4-기초 약물을 개발하고 알맞게 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 Dll4-기초 약물의 하나는 Dll4에 특이적인 치료적 항체이다.

인간 치료제들로서 유용한 항체들을 제조하기 위한 방법들은 키메릭 항체들 및 인간화된 항체들의 생성을 포함한다. (예를 들면, U.S. 6,949,245 참조). 예를 들면, 인간 항체들을 생산할 수 있는 비인간 트렌스제닉 마우스들을 생성하는 방법들을 설명하고 있는 WO 94/02602 (Abgenix) 및 U.S. 6,596,541 (Regeneron Pharceuticals)을 참고하라. 미국 특허 제 7,488,806호, 제 7,534,868호, 그리고 제7,919,593호, 그리고 미국 특허 출원 제U.S. 2011-0150905A1호는 인간 Dll4에 대한 항체들을 개시한다.

치료적 항체들은 환자들에의 투여에 적절한 항체들을 만드는 방식으로 제제화되어야 할 뿐만 아니라 저장 및 뒤 이은 사용 동안에 그들의 안정성을 유지하는 방식으로 제제화되어야 한다. 예를 들면, 액체 용액 내의 치료적 항체들은 상기 용액이 적절히 제제화되지 않는 한 단편화, 응집, 그리고 바람직하지 않은 화학적 변형의 경향이 있다. 액체 제제 내의 항체의 안정성은 상기 제제에 사용된 부형제들의 종류에 의존할 뿐 아니라, 상기 부형제들의 서로에 대한 상대적 비율들 및 용량들에도 의존한다. 더욱이, 액체 항체 제제의 제조 시에는 안정성 이외의 여타의 고려 사항들도 참작해야 한다. 그러한 부가적인 고려 사항들의 예시에는 용액의 점도 및 주어진 제제에 의하여 수용될 수 있는 항체의 농도, 그리고 시각적 품질 및 제제의 호소력(appeal)이 포함된다. 따라서, 치료적 항체를 제제화하는 경우, 제제가 안정하게 유지되며, 적절한 농도의 항체를 함유하며, 그리고 적절한 점도를 가지도록 함은 물론 상기 제제가 환자들에게 편리하게 투여될 수 있도록 하는 여타의 성질들에도 상당한 주의가 필요하다.

Dll4에 대한 항체들은 적절한 제제화가 요구되는 치료적으로 관련되는 마크로 분자의 하나의 예시이다. 비록 일부 항-Dll4 항체들이 공지되어 있으나, 그럼에도 불구하고 환자들에게 투여하기에 충분히 안정하고 적절한 항-Dll4 항체들을 포함하는 신규한 약제학적 제제들에 대한 필요성이 당해 기술분야에 남아 있다.

[요약]

본원 발명은 인간 델타-유사 리간드 4 (Dll4)에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 포함하는 약제학적 제제들을 제공함으로써 전술한 필요성을 충족시킨다.

일 측면에서, 다음을 포함하는 액체 약제학적 제제가 제공된다: (i) Dll4에 특이적으로 결합하는 항체; (ii) 버퍼; (iii) 유기 공용매; 그리고 (iv) 열 안정화제들.

일 실시예에서, 상기 항체는 약 20 ±3 mg/mL 내지 약 75 ±11.25 mg/mL의 농도로 제공된다. 다른 일 실시예에서, 상기 항체는 약 25 mg/mL ±3.75 mg/mL의 농도로 제공된다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 항체는 약 50 mg/mL ±7.5 mg/mL 의 농도로 제공된다.

일 실시예에서, 본 발명의 예시적인 항-Dll4 항체들은 서열 번호 2, 3, 4, 6, 7 및 8 (예컨대, REGN421)의 각각의 아미노산 서열들을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인들을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 HCVR, 그리고 서열 번호 5의 아미노산을 갖는 LCVR 내에 함유된 CDR 서열들을 포함한다.

일 실시예에서, 상기 액체 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.6; pH 6.0 ±0.5, pH 6.0 ±0.4, pH 6.0 ±0.3, pH 6.0 ±0.2, pH 6.0 ±0.1, pH 6.0 ±0.05, pH 6.0 ±0.01, 또는 pH 6.0이다. 특정 실시예에서, 상기 액체 제제의 pH는 약 pH 6.0 ±0.5이다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 약 pH 5.8 내지 약 pH 8.0; 또는 약 pH 6.0 내지 약 7.5의 유효 완충 범위를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 약 6.0 내지 약 7.5의 pKa를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 6.0의 pKa를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 6.4의 pKa를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 6.5의 pKa를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 7.2의 pKa를 갖는다.

일 실시예에서, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 5mM ±0.75mM 내지 50mM ±7.5mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 5mM ±0.75mM 또는 약 5mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 10mM ±1.5mM 또는 약 10mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 15mM ±2.25mM 또는 약 15mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 20mM ±3mM 또는 약 20mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 25mM ±3.75mM 또는 약 25mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 30mM ±4.5mM 또는 약 30mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 35mM ±5.25mM 또는 약 35mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 40mM ±6mM 또는 약 40 nM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 45mM ±6.75mM 또는 약 45mM의 농도이다. 일 실시예에서, 상기 포스페이트는 50mM ±7.5mM 또는 약 50mM의 농도이다.

일 실시예에서, 상기 유기 공용매는 폴리옥시에틸렌 모이어티를 함유하는 비이온성 폴리머이다. 일부 실시예들에서, 상기 유기 공용매는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188, 그리고 폴리에틸렌 글리콜3350 중 여하한 하나 또는 그 이상이다. 특정 실시예에서, 상기 유기 공용매는 폴리소르베이트 20이다.

일 실시예에서, 상기 유기 공용매는 약 0.005% ±0.00075% 내지 약 1% ±0.15% "부피에 대한 중량(weight to volume)"또는 "w/v"의 농도이며, 여기서, 예컨대, 0.1g/ml = 10%이며 0.01g/ml = 1%이다. 일 실시예에서, 상기 유기 공용매는 폴리소르베이트 20이며, 이는 0.2% ±0.03% w/v, 또는 약 0.2% w/v의 농도이다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 유기 공용매는 폴리소르베이트 20이며, 이는 0.01% ±0.0015% w/v 또는 약 0.01% w/v의 농도이다.

일 실시예에서, 상기 안정화제는 슈가, 염, 아미노산, 또는 이들의 여하한 하나 또는 그 이상의 조합이다. 일 실시예에서, 상기 슈가는 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 글리세롤 그리고 트레할로스로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 상기 염은 소듐 클로라이드; 그리고 상기 아미노산은 글라이신이다. 일 실시예에서, 상기 안정화제는 수크로오스 및 소듐 클로라이드의 조합을 포함한다.

일 실시예에서, 상기 수크로오스는 약 5% 내지 약 40%, w/v의 농도이며; 그리고 상기 소듐 클로라이드는 약 50mM 내지 약 250mM이다. 특정 실시예에서, 상기 제제는 10% ±1.5%, 약 10%, 또는 10%의 수크로오스; 그리고 150mM ±22.5mM, 약 150mM, 또는 150mM의 소듐 클로라이드를 포함한다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 제제는 20% ±3%, 약 20%, 또는 20%의 수크로오스를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 제제의 점도는 약 1 cPoise 내지 약 5 cPoise이다. 일 실시예에서, 상기 제제의 점도는 1.5 cPoise ±0.23 cPoise, 약 1.5 cPoise, 또는 1.5 cPoise이다.

일 실시예에서, 상기 제제의 삼투질농도는 생리학적 범위에 내에 가깝다. 일 실시예에서, 상기 제제는 약 300 mOsm(milli-Osmoles per kilogram) 내지 약 700 mOsm의 삼투질농도를 갖는다. 일 실시예에서, 상기 제제의 삼투질농도는 650 mOsm ±98 mOsm, 약 650 mOsm, 또는 650 mOsm이다.

일 실시예에서, -80℃에서 24개월 동안 저장된 후 액체 약제학적 제제로부터 회수된(recovered) 항-Dll4 항체의 적어도 95%는 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 측정하여 비-응집되며 비-분해된(degraded) 것이다. 일 실시예에서, -80℃에서 24개월 동안 저장된 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 57%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 비-염기성 및 비-산성 형태 (즉, 주요 피크 또는 주요 하전 형태 또는 "영역 2 피크")이다. 일 실시예에서, 항-Dll4는 평균적으로 -80℃에서 24개월 동안 저장된 후, 저장 전 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, -30℃에서 18개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 95%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, -30℃에서 18개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 57%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 -30℃에서 18개월 동안 저장 후, 저장 전 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%을 유지한다.

일 실시예에서, -20℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 95%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, -20℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 60%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 -20℃에서 6개월 동안 저장 후, 저장 전 항체의 결합 활성에 비하여, 평균 이의 결합 활성의 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 5℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 95%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 5℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 61%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 5℃에서 6개월 동안 저장 후, 저장 전 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 25℃에서의 6개월의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 97%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 25℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 53%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 25℃에서 6개월 동안 저장 후, 저장 전 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 45℃에서의 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 94%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 45℃에서의 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 45%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 45℃에서의 28일 동안의 열적 스트레스 후, 열적 스트레스 조건의 적용 전의 상기 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 37℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 96%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 37℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 51%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 37℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후, 열적 스트레스 조건의 적용 전의 상기 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 25℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 97%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 25℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 57%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 25℃에서 28일 동안의 열적 스트레스 후, 열적 스트레스 조건의 적용 전의 상기 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 120분의 교반 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 98%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 120분의 교반 스트레스 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 59%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4는 120분의 교반 스트레스 후, 교반 스트레스 조건의 적용 전 상기 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 실시예에서, 8번의 동결/해동 사이클들 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 98%는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 비-응집되며 비-분해된 것이다. 일 실시예에서, 8번의 동결/해동 사이클들 후 상기 액체 약제학적 제제로부터 회수된 항-Dll4 항체의 적어도 58%는 이온 교환 크로마토그래피로 측정하여 주요 하전 형태이다. 일 실시예에서, 상기 항-Dll4는 8번의 동결/해동 사이클들 후 동결/해동 스트레스 조건의 적용 전 상기 항체의 결합 활성에 비하여, 그의 결합 활성의 평균 약 65% 내지 약 135%를 유지한다.

일 측면에서, 다음을 포함하는 액체 약제학적 제제가 제공된다: (i) 20± mg/ml 내지 75 ±1.25mg/ml의 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 인간 항체; (ii) 5mM±0.75mM 내지 50mM ±7.5mM의 포스페이트; (iii) 0.005% ±.000075% 내지 1% ±0.15% (w/v)의 폴리소르베이트 20; (iv) 5% ±0.75% 내지 40% ±6% (w/v)의 수크로오스; 그리고 (v) 50mM ±7.5mM 내지 250mM ±37.5mM의 소듐 클로라이드, pH는 약 5.5 내지 약 6.5임. 본 측면의 상기 항-Dll4 항체는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하여 상기 HCVR / LCVR 조합은 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역들 (HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2-LCDR3)을 포함하며, 이는 각각 서열 번호: 2 - 3 - 4 / 서열 번호: 6 - 7 - 8의 아미노산 서열들을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 항-Dll4 항체는 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다. (미국 특허 제 7,488,806호, 제7,534,868호, 및 제7,919,593호, 그리고 미국 특허 출원 공개 제 2011-0150905호의 항체 REGN421).

일 실시예에서, 상기 액체 제제는 (i) 25 mg/ml ±3.75 mg/ml의 항체 REGN421; (ii) 10 ±1.5mM 포스페이트; (iii) 0.2% ±0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20; (iv) 10% ±1.5% (w/v) 수크로오스; 그리고 (v) 150mM ±22.5mM 소듐 클로라이드, pH는 6.0 ±0.5임, 를 포함한다. 실시예에서, 28일 동안 45℃에서 상기 제제의 열적 스트레스 후, 상기 항체의 ≥ 94%는 그의 자연의 배열을 보유하며, 상기 항체의 ≥ 45%는 주요 하전 형태이며, 그리고 상기 항체의 ≥ 98%는 그의 결합 활성을 보유한다. 또 다른 일 실시예에서, 28일 동안 37°에서 상기 제제의 열적 스트레스 후, 상기 항체의 ≥ 97%는 자연의 것이며 상기 항체의 ≥ 59%는 주요 하전 형태이며, 그리고 상기 항체의 약 100%는 그의 결합 활성을 보유한다. 일 실시예에서, 28일 동안 25°에서 상기 제제의 열적 스트레스 후, 상기 항체의 ≥ 97%는 자연의 것이며 상기 항체의 ≥ 57%는 주요 하전 형태이며, 그리고 상기 항체의 약 100%는 그의 결합 활성을 보유한다. 이 특정 제제의 일 실시예에서, 동결 후 해동의 8 사이클들 후, 상기 항체의 ≥ 98%는 자연의 것이며 상기 항체의 ≥ 59%는 주요 하전 형태이며, 그리고 상기 항체의 약 100%는 그의 결합 활성을 보유한다. 이 특정 제제의 일 실시예에서, 120분의 교반 스트레스 후, 상기 항체의 ≥ 98%는 자연의 것이며 상기 항체의 ≥ 58%는 주요 하전 형태이며, 그리고 상기 항체의 적어도 약 98%는 그의 효능을 보유한다.

일 측면에서, 여하한 전술한 측면들의 액체 약제학적 제제가 용기 내에 제공된다. 일 실시예에서, 상기 용기는 폴리카보네이트 바이알이다. 다른 일 실시예에서, 상기 용기는 유리 바이알이며, 이는 일부 실시예들에서 플루오로카본-코팅된 부틸 고무 마개를 갖는 타입 1 보로실리케이트 유리 바이알이다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 용기는 백, 이를테면 정맥 내 점적(drip) (IV) 백이며, 이는 일부 실시예들에서 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀으로 제조된다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 용기는 주사 장치, 이를테면 마이크로인퓨져(microinfuser) 또는 주사기이다.

일 측면에서, (a) 25 mg/mL ±3.75 mg/mL의 항-Ang-2 항체, (b) 10mM ±1.5mM 포스페이트, pH 6 ±0.5, (c) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20, (d) 10% w/v ±1.5% 수크로오스, 그리고 (e) 150mM ±22.5mM 소듐 클로라이드를 포함하는 약제학적 제제가 제공되는데, 여기서 (a) 상기 항체는 서열 번호 1의 HCVD 및 서열 번호 5의 LCVD를 포함하며, (b) 상기 항체는 약 146 kDa, 약 147 kDa, 또는 약 150 kDa의 분자 질량을 가지며, (c) 상기 항체들의 약 82% 내지 약 87%는 푸코실화된 올리고사카라이드 사슬들을 함유하며, 그리고 (d) 상기 항체의 중쇄들은 C-말단 라이신이 없다.

일 실시예에서, 상기 약제학적 제제는 (a) 25 mg/mL ±3.75 mg/mL의 항-Ang-2 항체, (b) 10mM ±1.5mM 포스페이트, pH 6 ±0.5, (c) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20, (d) 10% ±1.5% 수크로오스, 그리고 (e) 150mM ±22.5mM 소듐 클로라이드로 구성되어 제공되며, 여기서 (a) 상기 항체는 서열 번호 1의 HCVD 및 서열 번호 5의 LCVD를 포함하며, (b) 상기 항체는 약 146 kDa, 약 147 kDa, 또는 약 150 kDa의 분자 질량을 가지며, (c) 상기 항체들의 약 82% 내지 약 87%는 푸코실화된 올리고사카라이드 사슬들을 함유하며, 그리고 (d) 상기 항체의 중쇄들은 C-말단 라이신이 없다.

일 측면에서, 전술한 측면들의 여하한 하나의 약제학적 조성물, 용기, 그리고 지시 사항들의 설명서(instructions)를 포함하는 키트가 제공된다. 일 실시예에서, 상기 용기는 미리 충전된 주사기이다. 일 실시예에서, 상기 용기는 FLUROTEC-코팅된 4023/50-고무 마개로 피팅된 보로실리케이트 바이알이다.

본원 발명의 여타의 실시예들은 상세한 설명의 검토 결과로부터 명백할 것이다.

[상세한 설명]

본원 발명이 설명되기 전에, 본 발명은 설명된 특정한 방법들 및 실험 조건들로 한정되지 않으며, 따라서 방법들 및 조건들은 변화될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원 명세서에서 사용된 용어는 특정의 실시예들을 설명하기 위한 목적만을 위한 것이며, 제한적 의도로 사용된 것이 아님을 이해하여야 하는데, 이는 본원 발명의 보호범위는 오직 첨부된 청구항들에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원 명세서에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원 명세서에서, "약"이라는 용어는, 특정한 인용된 수치 값 또는 값들의 범위를 참조하여 사용되는 경우, 그 값이 5% 이하로 인용된 값으로부터 변화될 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원 명세서에서, "약 100"이라는 표현은 95 및 105 그리고 그 사이의 모든 값들(예컨대, 95.00, 95.01, 95.02, 95.03, 95.04, ..., 104.96, 104.97, 104.98, 104.99, 105.00)을 포함한다.

비록 본원 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가의 여하한 방법들 및 물질들이 본원 발명의 실시 및 실험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법들 및 물질들이 이하에서 설명된다.

약제학적 제제들

본원 명세서에서, "약제학적 제제"라는 표현은 적어도 하나의 활성 성분(예컨대, 인간 또는 비-인간 동물에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 소분자, 마크로분자, 화합물, 기타 등등), 그리고 적어도 하나의, 활성 성분 또는 하나 또는 그 이상의 부가적인 불활성 성분들과 조합되는 경우, 인간 또는 비-인간 동물에의 치료적 투여에 적절한, 불활성 성분의 조합을 의미한다. '제제"라는 용어는, 본원 명세서에서, 특히 달리 지시되지 않는 한 "약제학적 제제"를 의미한다. 본원 발명은 적어도 하나의 치료적 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 제제들을 제공한다. 본원 발명의 어떤 실시예들에 따르면, 상기 치료적 폴리펩타이드는 인간 델타-유사 리간드-4 (Dll4) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 좀 더 구체적으로, 본원 발명은 다음을 포함하는 약제학적 제제들을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 인간 항체 (ii) 포스페이트 버퍼; (iii) 비-이온성 계면활성제인 유기 공용매; 그리고 (iv) 카보하이드레이트 또는 무기 염, 또는 카보하이드레이트와 무기 염의 조합인 안정화제. 본원 발명에 포함되는 특정의 예시적인 성분들 및 제제들이 이하에서 설명된다.

DLL4에 특이적으로 결합하는 항체들

본원 발명의 약제학적 제제들은 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 본원 명세서에서, "Dll4"라는 용어는 노치의 혈관-특이적 리간드인 인간 델타-유사 리간드 4를 의미한다. Dll4-노치 신호전달 경로는 일반적으로 혈관 가지형성을 차단하고 혈관 성숙을 촉진함으로써 혈관 신생을 조절하는 것으로 이해된다. (Dll4가 가지 형성의 음성 조절제로서; Sainsin and Harris, Trends in Molecular Medicine, Vol. 13(9):389-395, Sep. 2007. 에서 평가됨) Dll4-노치 경로에 길항하는 인자들은 "과도한 그러나 비기능적 혈관 신생을 촉발함으로써" 종양 성장의 속도를 억제하는 것으로 나타나고 있다. (Sainsin at 389. 참조) Dll4는 VEGF에 의하여 상향 조절되며 기능적인 신(neo)-혈관의 체계적 발달을 촉진하는 것으로 생각된다. 예시적인 인간 Dll4 아미노산 서열은 서열 번호 9에 기재되어 있다. 인간 Dll4에 대한 항체들은 특허 제7,488,806호, 제7,534,868호, 그리고 제7,919,593호에 기재되어 있다.

"항체"라는 용어는, 본원 명세서에서, 일반적으로 네 개의 폴리펩타이드 사슬들을 포함하는 면역글로뷸린 분자들: 디설파이드 결합들에 의하여 서로 연결된 두 중쇄들 (H) 그리고 두 경쇄들 (L)은 물론, 그의 멀티머들(예컨대, IgM)을 지시하는 것으로 의도되며; 그러나, 오직 중쇄들로만 구성된 면역글로뷸린 분자들 (즉, 경쇄들이 없는) 또한 "항체" 라는 용어의 정에 내에 포괄된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원 명세서에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨) 그리고 중쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 세 도메인들, CH1, CH2 그리고 CH3 를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원 명세서에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨) 그리고 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)를 포함한다. 상기 V_H 및 V_L 영역들은 추가로 프레임 워크 영역들 (FR)로 지칭되는 보다 보존적인 영역들로 점재되는(interspersed) 상보성 결정 영역들(CDRs)로 지칭되는 초가변 영역들로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L 은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 다음의 순서로 배열된 세 CDRs 및 네 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

특히 달리 지시되지 않는 한, "항체"라는 용어는, 본원 명세서에서, 완전한 항체 분자들은 물론 그의 항원-결합 단편들을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 항체의 "항원 결합 부위" 또는 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "항체 부위" 또는 "항체 단편")이라는 용어는, 본원 명세서에서, 인간 Dll4 또는 그의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 또는 그 이상의 단편들을 지시한다.

본원 명세서에서 사용되는 "분리된(isolated) 항체"는, 한편으로 Dll4에, 그리고 다른 한편으로 여타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 (또는 다중-특이성) 항체들을 주요한 예외로 하고, 실질적으로 상이한 항원 특이성들을 갖는 여타의 항체들이 없는 항체를 지시하는 것으로 의도된다. (예컨대, 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 실질적으로 인간 Dll4 이외의 항원들에 특이적으로 결합하는 항체들이 없다.) 더욱이, 분리된 항체는 실질적으로 여타의 세포 물질 또는 화학 물질들이 없을 수 있다.

"특이적으로 결합한다"라는 용어, 또는 이와 유사한 것들은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 항원과 생리학적 조건들 하에서 비교적 안정한 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10^-6 M 또는 더 큰 해리 상수에 의하여 특징지어질 수 있다. 두 분자들이 특이적으로 결합하는지 아닌지를 측정하는 방법들은 해당 분야에 널리 알려져 있으며 예를 들면, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 그러나, 여타의 항원들 이를테면 여타의 종들로부터의 Dll4 분자들 (오소로그(orthologs))에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 본원 발명의 문맥에서, 인간 Dll4는 물론 하나 또는 그 이상의 부가적인 항원들에 결합하는 다중특이성 (예컨대, 이중특이성) 항체들은 인간 Dll4에 "특이적으로 결합하는" 것으로 간주된다.

본원 발명의 약제학적 제제들에 포함될 수 있는 예시적인 항-인간 Dll4 항체들은 미국 특허 제7,488,806호, 제7,534,868호, 제7,919,593호, 그리고 미국 특허 출원 제2011-0150905호에 설명되어 있다.

본원 발명의 어떤 실시예들에 따르면, 상기 항-인간 Dll4 항체는 IGHV3-33.01 서브타입의 중쇄 가변 영역 및 IGKV3-11.01 서브타입의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 IgG1이다. (Barbie and Lefranc, The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments, Exp. Clin. Immunogenet. 1998; 15:171-183; and Scaviner, D. et al., Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions, Exp. Clin. Immunogenet., 1999; 16:234-240 참조). 본원 명세서에서 제공된 생식세포(germline) IGHV3-33 및 IGKV3-11 서열들, 그리고 아미노산 위치 할당 번호들은 Lefranc, M.-P., et al., IMGT? the international ImMunoGeneTics information system? Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009)에 기재된 바와 같은 국제 면역유전학 (IMGT) 정보 시스템과 일치한다.

일부 실시예들에서, 상기 항-인간 Dll4 항체는 정규(canonical) 중쇄 가변 영역에 비하여 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역들에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 포함하며, 이는 항체의 노출된 표면을 가로질러 변경된 하전 분포를 초래할 것이며, 그러므로 주변의 용매 및 부형제들과의 그것의 상호작용에 영향을 줄 것으로 합리적으로 예측된다. 일부 실시예들에서, 상기 아미노산 치환은 IGHV3-33의, 각각, IMGT 위치들 54, 86, 및 90에서 알라닌에 대한 세린, 트레오닌에 대한 메치오닌, 및/또는 글루타민에 대한 글루타믹 애시드의 치환을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 항-인간 Dll4 항체는 정규 경쇄 가변 영역에 비하여 하나 또는 그 이상의 CDRs에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 포함하는데, 이는 항체의 노출된 표면을 가로질러 변경된 하전 분포를 초래할 것이며, 그러므로 용매 환경과의 그것의 상호작용에 영향을 줄 것으로 합리적으로 예측된다. 일부 실시예들에서, 상기 아미노산 치환은 IGKV3-11의 IMGT 위치 106에서 글루타민에 대한 히스티딘의 치환을 포함한다.

본원 발명의 어떤 실시예들에 따르면, 상기 항-인간 Dll4 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 서열 번호 3의 HCDR2, 그리고 서열 번호 4의 HCDR3을 포함한다. 어떤 실시예들에서, 상기 항-인간 Dll4 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 HCVD를 포함한다.

본원 발명의 어떤 실시예들에 따르면, 상기 항-인간 Dll4, 또는 그의 항원-결합 단편은, 서열 번호 6의 LCDR(경쇄 (카파) 상보성 결정 영역) 1, 서열 번호 7의 LCDR2, 그리고 서열 번호 8의 LCDR3을 포함한다. 어떤 실시예들에서, 상기 항-인간 Dll4 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 5의 LCVD를 포함한다.

본원 명세서의 실시예들에서 사용되는 비-제한적, 예시적인 항체는 미국 특허 제7,488,806호, 미국 특허 제 7,534,868, 미국 특허 제 7,919,593, 및 미국 특허 2011-0150905와 같이 REGN421로 지시된다. 이 항체는 서열 번호: 1/5를 갖는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍, 그리고 서열 번호: 2 - 3 - 4 / 서열 번호: 6 - 7 - 8에 의하여 대표되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함한다.

본원 발명의 약제학적 제제들에 함유된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 용량은 제제들이 사용되는 것으로 의도되는 목적 및 특정 상황들은 물론, 제제들에서 희망 되는 특이적 특성들에 의존할 수 있다. 어떤 실시예들에서, 상기 약제학적 제제들은 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 20 mg/mL ±3 mg/mL 내지 75 mg/mL ±11.25 mg/mL의 항체; 25 ±3.75 mg/mL 내지 70 ±10.5 mg/mL의 항체; 30 ±4.5 mg/mL 내지 65 ±9.75 mg/mL의 항체; 35 ±5.25 mg/mL 내지 60 ±9 mg/mL의 항체; 40 ±6 mg/mL 내지 55 ±8.25 mg/mL of 항체; 45 ±6.75 mg/mL 내지 50 ±7.5 mg/mL of 항체; 25 mg/mL ±3.75 mg/mL; 약 25 mg/mL; 25 mg/mL; 50 mg/mL ±7.5 mg/mL; 약 50 mg/mL; 또는 50 mg/mL의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유할 수 있는 액체 제제들이다.

부형제들 및 pH

본원 발명의 약제학적 제제들은 하나 또는 그 이상의 부형제들을 포함한다. "부형제"라는 용어는, 본원 명세서에서, 제제에 희망되는 농도, 점도 또는 안정화 효과를 제공하기 위하여 첨가되는 여하한 비-치료적 작용제를 의미한다.

어떤 실시예들에서, 본 발명의 약제학적 제제는 인간 Dll4 항체를 거친 취급 또는 교반 조건들, 이를테면, 예컨대, 볼텍싱하에서 안정화시키는 용량 및 타입의 적어도 하나의 유기 공용매를 포함한다. 일부 실시예들에서, "안정화(stabilizes)"에 의하여 의미하는 것은 거친 취급의 진행에 걸쳐, 이를테면 약 60 분 또는 약 120분 동안의 항체-유기 공용매 용액의 볼텍싱에 의하여 항체 (몰 농도에 기초하여)의 그의 자연 상태, 즉, 단편화되거나 또는 응집되지 않은, 로 Dll4 항체의 적어도 95%의 유지이다.

어떤 실시예들에서, 상기 유기 공용매는 비-이온성 계면활성제, 이를테면 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드)이다. 본원 발명의 제제들에 포함될 수 있는 특이성 비-이온성 계면활성제들은 예컨대, 폴리소르베이트들 이를테면 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 그리고 폴리소르베이트 85; 폴록사머들 이를테면 폴록사머 181, 폴록사머 188, 폴록사머 407; 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 폴리소르베이트 20은 TWEEN 20, 솔비탄 모노라우레이트 그리고 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우레이트로서 알려져 있다. 폴록사머 188은 또한 PLURONIC F68로서 알려져 있다.

본원 발명의 약제학적 제제들 내에 함유되는 비-이온성 계면활성제의 용량은 제제들에서 희망되는 특이적 성질들을 물론 제제들이 의도되는 목적 및 특정 환경들에 따라 달라질 수 있다. 어떤 실시예들에서, 상기 제제들은 0.01% ±0.0015% 내지 1% ±0.15%의 계면활성제를 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 제제들은 약 0.0085%; 약 0.01%; 약 0.02%; 약 0.03%; 약 0.04%; 약 0.05%; 약 0.06%; 약 0.07%; 약 0.08%; 약 0.09%; 약 0.1%; 약 0.11%; 약 0.12%; 약 0.13%; 약 0.14%; 약 0.15%; 약 0.16%; 약 0.17%; 약 0.18%; 약 0.19%; 약 0.20%; 약 0.21%; 약 0.22%; 약 0.23%; 약 0.24%; 약 0.25%; 약 0.3%; 약 0.4%; 약 0.5%; 약 0.6%; 약 0.7%; 약 0.8%; 약 0.9%; 약 1%; 약 1.1%; 약 1.15%; 또는 약 1.2%의 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188을 포함할 수 있다.

본원 발명의 약제학적 제제들은 또한 하나 또는 그 이상의 안정화제들을 인간 Dll4 항체를 열적 스트레스 조건들 하에서 안정화하는 용량 및 타입으로 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, "안정화(stabilizes)"에 의하여 의미되는 것은 상기 항체 및 열 안정화제를 함유하는 용액이 약 28일까지 동안 약 45℃에서 유지되는 경우 자연 형태로 상기 항체의 약 94% 이상을 유지하는 것이다. 일부 실시예들에서, "안정화(stabilizes)"에 의하여 의미되는 것은 상기 항체 및 열 안정화제를 함유하는 용액이 약 28일까지 동안 약 37℃에서 유지되는 경우 자연 형태로 상기 항체의 약 96% 이상을 유지하는 것이다. 본원 명세서에서, "자연(native)"은 크기 배제에 의한 상기 항체의 주요 형태, 이는 일반적으로 상기 항체의 온전한 모노머 임, 를 의미한다.

어떤 실시예들에서, 상기 열 안정화제는 수크로오스, 솔비톨, 글리세롤, 트레할로스 그리고 만니톨, 또는 이의 여하한 조합으로부터 선택되는 슈가 또는 슈가 알코올이며, 제제 내에 함유되는 용량은 제제가 사용되도록 의도되는 목적 및 특이적 환경들에 따라 변화될 수 있다. 어떤 실시예들에서, 상기 제제들은 약 5% 내지 약 40%의 슈가 또는 슈가 알코올; 약 1% 내지 약 20%의 슈가 또는 슈가 알코올; 약 5 % 내지 약 15%의 슈가 또는 슈가 알코올; 약 7.5% 내지 약 12.5%의 슈가 또는 슈가 알코올; 약 10%의 슈가 또는 슈가 알코올; 10% ±1.5%의 슈가 또는 슈가 알코올; 또는 10%의 슈가 또는 슈가 알코올을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 약제학적 제제들은 4% ± 0.6%; 5% ±0.75%; 6% ±0.9%; 7% ±1.05%; 8% ±1.2%; 9% ±1.35%; 10% ±1.5%; 11% ±1.65%; 12% ±1.8%; 13% ±1.95%; 또는 약 14% ±2.1% 슈가 또는 슈가 알코올 (예컨대, 수크로오스, 트레할로스 또는 만니톨)을 포함할 수 있다.

본원 발명의 약제학적 제제들은 또한 버퍼 또는 버퍼 시스템을 포함할 수 있으며, 이는 안정한 pH의 유지 및 인간 Dll4 항체를 안정화하는 것을 돕는데 작용한다. 일부 실시예들에서, "안정화(stabilizes)"에 의하여 의미되는 것은 여기서 상기 항체 및 버퍼를 함유하는 용액이 약 28일까지 동안 약 45℃에서 유지되는 경우 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 상기 항체의 적어도 94%가 자연 형태로 유지되는 것이다. "자연의" 또는 "자연의 배열(conformation)"에 의하여 의미되는 것은 응집되거나 분해되지 않은 항체 분획(fraction)이다. 이것은 일반적으로 항체 본체의 상대적 크기를 측정하는 분석, 이를테면 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의하여 측정된다. 비-응집된 그리고 비-단편화된 항체는 자연의 항체와 동일시되는 분획에서 용출되며, 일반적으로 주요 용출 분획이다. 응집된 항체는 자연의 항체보다 큰 크기를 지시하는 분획에서 용출된다. 단편화된 항체는 자연의 항체보다 작은 사이즈를 지시하는 분획에서 용출된다.

일부 실시예들에서, "안정화(stabilizes)"에 의하여 의미되는 것은 여기서 상기 항체 및 버퍼를 함유하는 용액이 약 28일까지 동안 약 45℃에서 유지되는 경우 양이온 교환 크로마토그래피에 의하여 측정하여 항체의 적어도 45%가 주요 하전 형태인 것이다. "주요 하전" 또는 "주요 하전 형태"에 의하여 의미되는 것은 이온 교환 수지로부터 용출되는 항체의 분획이 주요 피크, 이는 일반적으로 보다 "염기성" 피크들에 의하여 한쪽으로 우회되고(flanked) 보다 "산성" 피크들에 의하여 다른 쪽으로 우회됨, 내인 것이다.

본원 발명의 약제학적 제제들은 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 제제들은 약 5.5; 약 5.6; 약 5.7; 약 5.8; 약 5.9; 약 6.0; 약 6.1; 약 6.2; 약 6.3; 약 6.4; 또는 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 pH는 6.0 ±0.5; 6.0 ±0.4; 6.0 ±0.3; 6.0 ±.2; 6.0±0.1; 약 6.0; 또는 6.0이다.

일부 실시예들에서, 상기 버퍼 또는 버퍼 시스템은 pH 5.5 - 7.4의 범위와 완전히 또는 부분적으로 중복되는 완충 범위를 갖는, 적어도 하나의 버퍼, 이를테면, 예컨대, pH 4.8 내지 pH 8.8의 유용한 완충 범위를 갖는 버퍼를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 버퍼는 약 7.21의 pKa를 갖는다. 어떤 실시예들에서, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼를 포함한다. 어떤 실시예들에서, 상기 포스페이트는 5 mM ±0.75 mM 내지 15 mM ±2.25 mM; 6 mM ±0.9 mM 내지 14 mM ±2.1 mM; 7 mM ±1.05 mM 내지 13 mM ±1.95 mM; 8 mM ±1.2 mM 내지 12 mM ±1.8 mM; 9 mM ±1.35 mM 내지 11 mM ±1.65 mM; 10 mM ±1.5 mM; 또는 약 10 mM의 농도로 존재한다. 어떤 실시예들에서, 상기 버퍼 시스템은 포스페이트를 10 mM ±1.5 mM로, pH 6.0 ±0.5로 포함한다.

예시적인 제제들

본원 발명의 일 측면에 따르면, 상기 액체 약제학적 제제는 낮은 점도 (즉, 10 cPoise 미만, 또는 약 1.5 cPoise)를 가지며 600 내지 700 mOsm 사이의, 또는 약 650 mOsm의 삼투질농도를 가지며; 그리고 다음을 포함한다: (i) 25 mg/mL ±3.75 mg/mL, 또는 50 mg/mL ±7.5 mg/mL의 인간 Dll4에 특이적으로 결합하는 인간 항체 (예컨대, REGN421); (ii) 약 pH 6.0 ±0.5로 완충하는 버퍼 시스템; (iii) 슈가 및 염을 포함하는 열 안정화제, 이는 으로서 작용함; 그리고 (iv) 유기 공용매.

일 실시예에 따르면, 상기 약제학적 제제는 다음을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하며 치환된 IGHV3-33 타입 중쇄 가변 영역 및 치환된 IGKV3-11 타입 경쇄 가변 영역을 포함하는 20 ±3 mg/mL 내지 60 ±9 mg/mL의 인간 IgG1 항체; (ii) pH 6.0 ±0.5로 완충하는 포스페이트 버퍼; (iii) 수크로오스 및 소듐 클로라이드; 그리고 (iv) 비-이온성 세제(detergent), 이를테면 폴리소르베이트.

일 실시예에 따르면, 상기 약제학적 제제는 다음을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 2의 HCDR1, 서열 번호 3의 HCDR2, 서열 번호 4의 HCDR3, 서열 번호 6의 LCDR1, 서열 번호 7의 LCDR2, 그리고 서열 번호 8의 LCDR3를 포함하는 25 mg/ml ±3.75 mg/mL의 인간 IgG1 항체; (ii) 10 mM ±1.5 mM 포스페이트, pH 6.0 ±0.5; (iii) 10% ±1.5% 수크로오스; (iv) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드; 그리고 (v) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20.

일 실시예에 따르면, 상기 약제학적 제제는 다음을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 2의 HCDR1, 서열 번호 3의 HCDR2, 서열 번호 4의 HCDR3, 서열 번호 6의 LCDR1, 서열 번호 7의 LCDR2, 그리고 서열 번호 8의 LCDR3를 포함하는, 50 mg/ml ±7.5 mg/mL의 인간 IgG1 항체; (ii) 10 mM ±1.5 mM 포스페이트, pH 6.0 ±0.5; (iii) 10% ±1.5% 수크로오스; (iv) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드; 그리고 (v) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20.

일 실시예에 따르면, 상기 약제학적 제제는 다음을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호 5의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 25 mg/ml ±3.75 mg/mL의 인간 IgG1 항체, 의 농도의; (ii) 10 mM ±1.5 mM 포스페이트 pH 6.0 ±0.5; (iii) 10% ±1.5% 수크로오스; (iv) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드; 그리고 (iv) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20.

일 실시예에 따르면, 상기 약제학적 제제는 다음을 포함한다: (i) 인간 Dll4에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 1의 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호 5의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 50 mg/ml ±7.5 mg/mL의 인간 IgG1 항체; (ii) 10 mM ±1.5 mM 포스페이트, pH 6.0 ±0.5; (iii) 10% ±1.5% 수크로오스; (iv) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드; 그리고 (v) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20.

본원 발명에 의하여 포괄되는 약제학적 제제들의 부가적인 비-제한적 예시들은 본 명세서의 다른 곳에 설명되며, 이하에서 제공되는 작업 실시예들을 포함한다.

약제학적 제제들의 안정성 및 점도

본원 발명의 약제학적 제제들은 대체로 높은 수준의 안정성을 나타낸다. 약제학적 제제들에 관하여 "안정한"이라는 용어는 본원 명세서에서 상기 약제학적 제제들 내의 항체들이 정의된 조건들 하에서 저장 후 수용 가능한 정도의 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 보유하는 것을 의미한다. 제제는 거기에 함유된 항체가 비록 정의된 총 시간 동안 저장 후 그의 화학적 구조 또는 생물학적 기능의 100%를 유지하지 않더라도 안정할 수 있다. 특정 환경 하에서, 정의된 총 시간 동안 저장 후 항체의 구조 또는 기능의 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 유지가 "안정한" 것으로 간주될 수 있다.

안정성은 무엇보다, 정의된 온도에서 정의된 총 시간 동안 저장 후 상기 제제 내 남아있는 자연의 항체의 백분율을 측정함으로써 측정될 수 있다. 자연의 항체의 백분율은, 무엇보다, 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 [SE-HPLC]),에 의하여 측정될 수 있는데, 따라서 자연은 비-응집된 그리고 비-단편화된 것을 의미한다. 본원 명세서에서 사용되는 "수용 가능한 정도의 안정성"이라는 구는 적어도 90%의 자연의 형태의 항체가 상기 항체의 주어진 온도에서 정의된 총 시간 동안 저장 후 제제 내에서 탐지될 수 있음을 의미한다. 어떤 실시예들에서, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 자연의 형태의 상기 항체가 정의된 온도에서 정의된 총 시간 동안 저장 후 상기 제제 내에서 탐지될 수 있다. 이후에 안정성이 측정되는 정의된 총 시간은 적어도 14일, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 또는 그 이상일 수 있다. 안정성이 평가되는 약제학적 제제가 저장될 수 있는 정의된 온도는 약 -80℃ 내지 약 45℃의 여하한 온도, 예컨대, 약 -80℃, 약 -30℃, 약 -20℃, 약 0℃, 약 4°-8℃, 약 5℃에서의 저장 일 수 있다. 열적 스트레스가 안정성을 평가하기 위하여 상기 약제학적 제제에 적용될 수 있다. 열적 스트레스는 예를 들면 상기 제제를 약 14일 또는 약 28일 동안 약 25℃, 약 35℃, 약 37℃, 또는 약 45℃에서 유지하는 것을 포함한다.

예를 들면, 약제학적 제제는 만약 5℃에서 6개월 동안 저장 후, SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5%가 자연 상태(즉, 자연의 피크 분획 상태인 것)라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 25℃에서 6개월 동안 저장 후 SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5%가 자연의 상태라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 37℃에서 28일 동안 저장 후, SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.5%가 자연의 상태라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 45℃에서 28일 동안 저장 후 SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 자연의 상태라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 -20℃에서 6개월 동안 저장 후 SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 98.5%, 99% 또는 99.5%가 자연의 상태라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 -30℃에서 18개월 동안 저장 후 SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 99% 또는 99.5%가 자연의 상태라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 -80℃에서 6개월 동안 저장 후 SE-HPLC로 탐지된 항체의 적어도 99% 또는 99.5%가 자연의 상태이라면 안정한 것으로 간주될 수 있다.

안정성은 무엇보다, 총 결합된 피크 면적에 대한 이온 교환 동안에 주요 항체의 분획 ("주요 하전 형태")에서 이동한 항체의 백분율을 측정함으로써 측정될 수 있으며, 여기서 안정성은 주요 하전 형태의 항체의 분획에 비례한다. 이론에 얽매이지 않되, 항체의 탈아미드화(deamidation)는 항체가 비-탈아미드화된 항체에 비하여 좀더 음성으로 하전되고 따라서 좀 더 산성으로 되도록 할 수 있다(예컨대, Robinson, N., Protein Deamidation, PNAS, April 16, 2002, 99(8):5283-5288 참조). 본원 명세서에서 사용되는 "안정성의 수용 가능한 정도"와 같은 문구는 정의된 온도에서 정의된 총 시간 동안 저장 후 제제 내에서 탐지된 항체의 적어도 53%가 주요 하전 형태인 것을 의미한다. 일부 실시예들에서 안정성의 수용 가능한 정도는 주어진 온도, 또는 열적, 동결/해동, 또는 교반 스트레스 하에서 정의된 총 시간 동안 저장 후 항체의 적어도 약 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 주요 하전 형태로 탐지될 수 있는 것을 의미한다. 안정성이 측정되는 정의된 총 시간은 적어도 2주, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 또는 그 이상일 수 있다. 안정성을 평가하는 경우 약제학적 제제가 저장될 수 있는 온도는 약 -80℃ 내지 약 45℃의 여하한 온도, 예컨대, 약 -80℃, 약 -30℃, 약 -20℃, 약 0℃, 약 4°-8℃, 약 5℃, 약 25℃, 약 37℃, 또는 약 45℃에서의 저장일 수 있다. 예를 들면, 약제학적 제제는 만약 -80℃, -30℃, 또는 -20℃에서 3개월의 저장 후 항체의 약 57%, 58%, 59%, 60%, 또는 61% 이상이 주요 하전 형태이라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 5℃에서 6개월 동안 저장 후, 항체의 약 59%, 59.1%, 59.2%, 59.3%, 59.4%, 59.5%, 59.6%, 59.7%, 59.8%, 59.9%, 60%, 60.1%, 60.2%, 60.3%, 60.4%, 60.5%, 60.6%, 60.7%, 60.8%, 60.9%, 61%, 또는 61.1% 이상이 주요 하전 형태이라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 25℃에서 6개월 동안 저장 후, 항체의 약 53% 이상이 주요 하전 형태이라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 37℃에서 28일 동안 저장 후, 항체의 약 50%, 50.5%, 51%, 또는 51.5% 이상이 주요 하전 형태이라면 안정한 것으로 간주될 수 있다. 약제학적 제제는 또한 만약 45℃에서 28일 동안 저장 후, 항체의 약 45%, 45.1%, 45.2%, 45.3%, 45.4%, 45.5%, 45.6%, 45.7%, 45.8%, 45.9%, 또는 50% 이상이 주요 하전 형태로 탐지될 수 있으면 안정한 것으로 간주될 수 있다.

항체의 그의 표적에 대한 결합 친화성을 측정하는 것 또한 안정성의 평가에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 제제는 만약, 예컨대, -80℃, -30℃, -20℃, 5℃, 25℃, 37℃, 45℃, 기타 등등에서 정의된 총 시간 동안 (예컨대, 14일 내지 24개월) 저장 후, 제제 내에 함유된 항-Dll4 항체가 상기 저장 전 항체의 결합 친화성으로 측정된 효능의 적어도 50% 내지 약 150%까지의 효능을 유지한다면 안정한 것으로서 간주될 수 있다. 결합 친화성은 예컨대, ELISA 또는 플라스몬 공명에 의하여 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 Dll4 활성 분석에 의하여, 이를테면 예컨대, Dll4을 발현하는 세포와 항 Dll4 항체를 포함하는 제제를 접촉시킴으로써 측정될 수 있다. 그러한 세포에 대한 항체의 결합은 직접적으로 이를테면 FACS 분석을 통하여 측정될 수 있다. 대안적으로, Dll4/노치 시그널링 경로의 다운스트림 활성은 항체의 존재 하에, 그리고 항체 없는 Dll4/노치 신호전달 경로의 활성에 비교하여 측정될 수 있다. 일부 실시예들에서, Dll4는 세포에 내생적일 수 있다. 여타의 실시예들에서, Dll4는 세포 내에서 이소성으로(ectopically)(이종구조로서((heterologously)) 발현된다.

제제 내에서 항체의 안정성을 평가하는 부가적인 방법들은 이하에서 제공되는 실시예들에 입증되어 있다.

투여 용기들 및 방법들

본원 발명의 약제학적 제제들은 의약들 및 여타의 치료적 조성물들의 저장 또는 투여에 적절한 여하한 용기 내에 함유될 수 있다. 예를 들면, 상기 약제학적 제제들은 한정된 부피를 갖는 밀봉된 그리고 멸균된 플라스틴 또는 유리 용기 이를테면 바이알, 앰플, 주사기, 카트리지, 병, 또는 IV 백 내에 함유될 수 있다. 예컨대, 투명한 그리고 불투명한 (예컨대, 황색) 유리 또는 플라스틱 바이알들을 포함하는 상이한 타입들의 바이알들이 함유 본원 발명의 제제들을 수용하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 여하한 타입의 주사기가 본원 발명의 약제학적 제제들의 수용 또는 투여에 사용될 수 있다.

본원 발명의 약제학적 제제들은 "표준(normal) 텅스텐" 주사기들 또는 "낮은(low) 텅스텐" 주사기들 내에 수용될 수 있다. 이 분야의 통상의 기술자들이 이해하는 바와 같이, 유리 주사기들의 제조 공정은 일반적으로 유리에 꽂아 주사기로부터 액체가 배출될 수 있는 구멍을 형성하는 기능을 하는 뜨거운 텅스텐 막대를 사용하는 것과 관련된다. 이 공정은 주사기의 내부 표면에 텅스텐의 미량의 퇴적을 초래한다. 수반되는 세척 및 여타의 가공 단계들이 주사기 내의 텅스텐 용량을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본원 명세서에서, "표준 텅스텐"이라는 용어는 500 ppb (parts per billion)의 텅스텐 또는 그 이상을 함유하는 주사기를 의미한다. "낮은 텅스텐"이라는 용어는 텅스텐 500 ppb 미만을 함유하는 주사기를 의미한다. 예를 들면, 본원 발명에 따른, 낮은 텅스텐 주사기는 약 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 미만의 또는 그 이하의 ppb의 텅스텐을 함유할 수 있다.

주사기들에 사용된 고무 플런저들, 그리고 바이알들의 입구들을 막는데 사용되는 고무 마개들은 주사기 또는 바이알의 의약 성분들의 오염을 방지하기 위하여, 또는 그들의 안정성을 보존하기 위하여 코팅될 수 있다. 따라서, 본원 발명의 약제학적 제제들은, 일부 실시예들에 따르면, 코팅된 플런저를 포함하는 주사기 내 또는 코팅된 고무 마개로 밀봉된 바이알 내에 수용될 수 있다. 예를 들면, 상기 또는 마개는 플루오로카본 필름으로 코딩될 수 있다. 본원 발명의 약제학적 제제들의 수용하는 바이알들 및 주사기들에 사용하는데 적절한 코팅된 마개들 및 플런저들의 예시들은 예컨대, 미국 특허 제4,997,423호; 제5,908,686호; 제6,286,699호; 제6,645,635호; 그리고 제7,226,554호에 개시되어 있다. 본원 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 특별한 예시적인 코팅된 고무 마개들 및 플런저들은 "FluroTec?"이라는 상표명으로, West Pharmaceutical Services, Inc. (Lionville, PA)로부터 상업적으로 입수 가능하다. FluroTec?은 약물 제품이 고무 표면에 부착하는 것을 최소화하거나 또는 방지하는데 사용되는 플루오로카본 코팅의 일예이다.

본원 발명의 일부 실시예들에 따르면, 약제학적 제제들은 플루오로카본-코팅된 플런저를 포함하는 낮은 텅스텐 주사기 내에 수용될 수 있다.

상기 약제학적 제제들은 비경구적 경로들 이를테면 주사 (예컨대, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 기타 등등.) 또는 경피, 점막, 비강, 폐 또는 경구 투여로 환자에게 투여될 수 있다. 수많은 재사용 할 수 있는 펜 또는 자기주사기 전달 장치들이 본원 발명의 약제학적 제제들의 피하로의 전달에 사용될 수 있다. 예시들은 다음으로 제한되는 것은 아니나, AUTOPEN^TM(Owen Mumford, Inc., Woodstock, 미국), DISETRONIC^TM펜 (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, 스위스), HUMALOG MIX 75/25^TM펜, HUMALOG^TMpen, HUMALIN^TM70/30^TM펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN^TMI, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD^TM펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN^TM, OPTIPEN PRO^TM,OPTIPEN STARLET^TM, 그리고 OPTICLIK^TM(sanofi-aventis, Frankfurt, 독일)를 포함한다. 본원 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 응용되는 일회용 펜 또는 자기주사기 전달 장치들의 예시들은, 다음으로 제한되는 것은 아니나, SOLOSTAR^TM펜 (sanofi-aventis), FLEXPEN^TM(Novo Nordisk), 그리고 KWIKPEN^TM(Eli Lilly), SURECLICK^TM 자기주사기 (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET^TM(Haselmeier, Stuttgart, 독일), EPIPEN (Dey, L.P.), 그리고 HUMIRA^TM펜 (Abbott Labs, Abbott Park, IL)을 포함한다.

본원 발명의 약제학적 제제들을 전달하기 위한 마이크로인퓨저의 사용 또한 본원 명세서에서 계획된다. 본원 명세서에서, "마이크로인퓨저"라는 용어는 연장된 시간의 기간에 걸쳐 (예컨대, 약 10, 15, 20, 25, 30 또는 그 이상의 분) 치료적 제제의 큰 부피(예컨대, 약 2.5mL 또는 그 이상까지)를 천천히 투여하기 위하여 디자인된 피하 전달 장치를 의미한다. 예컨대, 미국 특허 제6,629,949호; 미국 제 6,659,982호; 및 Meehan et al., J. Controlled Release 46:107-116 (1996) 참조. 마이크로인퓨저들은 고 농도로 함유된(예컨대, 약 100, 125, 150, 175, 200 또는 그이상의 mg/mL) 치료적 단백질들 또는 점성 용액들 큰 용량들의 전달에 특히 유용하다.

일 실시예에서, 상기 약제학적 제제는 IV 점적을 통하여 투여되며, 따라서 상기 제제는 생리학적으로 수용 가능한 용액을 함유하는 IV 백 내에 희석된다. 일 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 주입 백 내에 멸균 제제로 조제되어, 약물 생산품의 단일 투약량은 100mL, 250mL (또는 정맥내 점적 전달에 적절한 여타의 유사 용량)의 생리학적 버퍼 (예컨대, 0.9% 생리식염수)에 희석된다. 일부 실시예들에서, 상기 주입 백은 폴리비닐 클로라이드 (예컨대, VIAFLEX, Baxter, Deerfield, 일리노이)로 제조된다. 일부 실시예들에서, 상기 주입 백은 폴리올레핀으로 제조된다 (EXCEL IV Bags, Braun Medical Inc., Bethlehem, 펜실베니아).

약제학적 제제들의 치료적 용도들

본원 발명의 약제학적 제제들은 무엇보다, Dll4 또는 노치 신호전달 경로에 의하여 매개되는 질환들 또는 장애들을 포함하는 Dll4 활성과 관련된 여하한 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 본원 발명의 약제학적 제제들의 투여에 의하여 치료되거나 또는 예방되는 예시적인, 비-제한적 질환들 및 장애들은 새로운 혈관들이 형성되는 생물학적 공정인 혈관 신생에 관련된 다양한 질환들을 포함한다. 비정상적 혈관 신생은 예컨대, 증식망막병증(proliferative retinopathies), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 건선(psoriasis)을 포함하는 몇몇의 질환 조건들에 관련된다. 또한, 혈관 신생이 종양 성장 및 유지에 결정적인 역할을 한다는 것이 잘 수립되어 있다.

실시예들

이하의 실시예들은 본 발명의 방법들 및 조성물들을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 이 분야의 통상의 기술자에게 제공하기 위하여 제공되며 발명자들이 그들의 발명으로 생각하는 보호 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다. 사용된 수치들 (예컨대, 용량들, 온도, 기타 등등.)에 대하여 정확성을 확보하기 위한 노력이 있었으나 일부 실험적 오차들 및 편차들이 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부(parts)는 몰 부(parts by mole)이며, 분자량은 평균 분자량, 퍼센트 농도 (%)는 용질의 그램 질량을 용액의 밀리리터 부피로 나누어 100%를 곱한 (예컨대, 10% 수크로오스는 0.1그램의 수크로오스/밀리리터의 용액을 의미한다.), 온도는 섭씨 온도, 그리고 압력은 대기 압력 또는 근처를 의미한다.

초기의 제제 개발 활동들은 정맥 및 피하 주사를 위하여 생리적 삼투질농도에 가깝게 그리고 낮은 점도를 유지하는 동시에 상기 단백질과 양립할 수 있으며 그의 안정성을 증진시키는 부형제를 확인하기 위한, 항-Dll4 항체들의 동결건조된 제제들 및 액체들 내의 유기 공용매들, 열 안정화제들, 그리고 버퍼들을 스크린 하는 것과 관련된다. 버퍼 조건들 또한 최대 단백질 안정성을 위한 최적의 pH를 측정하기 위하여 조사되었다.

실시예 1: 예시적인 항-DLL4 제제

제제 개발 활동들은 단백질의 안정성을 증진시키는 부형제들을 확인하기 위하여 항-Dll4 항체의 액체 제제들 내에서 버퍼들, 유기 공용매들, 그리고 열 안정화제들의 스크리닝을 포함하였다. 버퍼 조건들 또한 최대 단백질 안정성을 위한 최적의 pH를 측정하기 위하여 조사되었다. 이들 연구들로부터 생성된 결과들이 임상적 용도에 적절한 안정한, 액체 제제를 개발하기 위하여 사용되었다. 항-Dll4 (예컨대, REGN421)가 25 ±3.75 mg/ml 또는 50 ±7.5 mg/ml로 제제화되었다. 일 실시예에서, 항-Dll4 항체는 10 ±1.5 mM 포스페이트 (pH 6.0 ±0.5), 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20, 10% ±1.5% 수크로오스, 그리고 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드에 제제화된다. 모노염기성 포스페이트 그리고 디염기성 포스페이트의 조합인 포스페이트 버퍼가 낮은 응집 속도 및 항-Dll4 안정성을 위한 최적의 pH에서 그것의 완충 용량을 위하여 선택되었다. 항-Dll4 항체 REGN421가 최적의 안정성 및 가장 낮은 응집 속도 그리고 pH 6.0에서 하전 변형체들의 형성을 갖는 것으로 관찰되었다. 폴리소르베이트 20이 교반 안정화 작용제로서 선택되었으며, 이는 항체가 교반되거나 달리 취급되는 경우 응집 및 침전의 속도를 감소시켰다. 용액에서 항체의 응집 속도를 감소시키는 것으로 관찰된 수크로오스가 열적 안정화 작용제의 성분으로서 선택되었다. 용액에서 항체의 하전된 종들의 형성을 감소시키는 것으로 관찰되었던 소듐 클로라이드가 열적 안정화 작용체의 여타 성분으로서 선택되었다.

실시예 2: 스트레스 안정성 연구 방법론

광학 밀도 (405 nm) 및 역-상 고-성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)가 제제화된 항-Dll4 항체의 물리적 안정성을 평가하기 위하여 개발 연구들에 사용되었다. 물리적 안정성은 용액 내의 항체의 가용성 형태들의 회수(recovery)로서 정의된다. 항체의 손실은 침전 또는 흡착 중 하나에 기인할 수 있다. 입자들의 존재는 시각적 관찰에 의하여 또는 405 nm에서 광학 밀도 (OD) 측정들에 의하여 탐지될 수 있는데 (혼탁도 측정들), 여기서 OD 증가는 입자들의 형성에 기인한 혼탁도 증가를 지시한다. 시각적으로 또는 OD 측정들에 의하여 측정된 입자들의 존재는 샘플이 안정성을 유지하는 데 실패했다는 것을 지시한다. 항-Dll4 항체의 회수는 RP-HPLC 및 280 nm에서 UV 분광광도법 중 하나에 의하여 측정되었다. 각각의 테스트 샘플의 농도는 정의된 농도의 항체를 사용하여 생성된 표준 곡선에 비한 용리된 항체 피크의 면적으로부터 측정된다.

크기 배제-HPLC (SE-HPLC)가 항-Dll4 항체의 순도를 평가하고 대상 항-Dll4 항체와 분자 크기가 다른 항체 응집체들, 단편들 그리고 불순물들의 상대 용량의 측정을 제공하기 위하여 사용되었다. 정제된 항-Dll4 항체는 일반적으로 작은 응집체 피크로서 그리고 작은 저분자량 피크가 수반되는 큰 자연의 다이머 피크로서 용출되었다. 이 방법은 고-해상도 실리카-기초 크기 배제 칼럼 및 포스페이트 - 소듐 클로라이드 버퍼를 사용하였다. 215 nm에서의 흡광도가 기록되었으며 순도 측정을 위하여 통합되었다. SE-HPLC에 의한 항-Dll4 항체를 위한 순도 특성은 주요 피크의 면적이 총 피크 면적의 ≥ 90.0%이라는 것을 요구하였다. 높은 그리고 낮은 분자량 피크들 면적들에 대한 총 피크 면적의 백분율들이 표들에 보고된다.

항체 하전 변형체들은 Dionex로부터의 약한 양이온 교환 칼럼 (ProPac? WCX-10, 4 x 250 mm)을 이용하여 pH 6.0에서 포스페이트 버퍼 내의 얕은 염 기울기에 걸쳐서(1mL/분으로 44분에 걸쳐 40 mM 내지 120 mM NaCl) 양이온 교환 크로마토그래피에 의하여 분석되었다. 215 nm에서의 흡광도가 기록되었으며 하전 이종성(charge heterogeneity)을 평가하기 위하여 통합되었다. 항-Dll4 항체의 크로마토그램들이 피크들을 세 주요 그룹들: 산성, 주요 그리고 염기성으로 나눔으로써 통합되었다. 제일 먼저 용출된 피크들의 그룹은 산성 종들 (이것은 높은 pH 및 온도에 노출된 물질을 분석함으로써 측정되었다)로 지정되었다. 크로마토그램에서 주요 피크는 주요 피크, 주요 하전 형태, 또는 주요 하전 변형체로서 지정되었다. 피크들의 최종 그룹은 염기성 종들로서 보고되었다. 이 지정은 양성 전하의 높은 수준에 가장 기인할 것 같은 연장된 칼럼 보유(retention)에 기초하여 이루어졌다. 항체 테스트 샘플의 피크 패턴은 참조 표준(reference standard)의 피크 패턴에 비교되었으며 산성, 주요 그리고 염기성 종들의 퍼센트 피크 면적들이 보고되었다.

항-Dll4 항체의 활성 또는 효능은 결합 분석을 이용하여 평가되었다. 바이오틴화된(biotinylated)-hDll4-hFc의 노치1에의 결합을 차단하는 항체의 능력이 특이적 그리고 민감성 ELISA를 이용하여 측정되었다. ELISA는 바이오틴-hDll4-hFc 및 항-Dll4 항체의 혼합물로 구성된 용액에서 결합되지 않은 바이오틴화된 hDll4-hFc를 측정하였다. 이 혼합물은 인간 노치1로 코팅된 마이크로적정 플레이트들에 첨가되었다. 고정된 용량의 바이오틴-hDll4-hFc가 다양한 용량들의 항체로 적정 되었으며; 그리고 항체:바이오틴 hDLL4 hFc 복합체가 세척되었다. 플레이트에 결합한 채 남아있는 바이오틴-hDll4-hFc의 용량이 HRP(horseradish peroxidase)에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 이용하여 탐지되었다. 분석된 샘플들은 상대 효능의 측정을 위하여 참조 표준에 비교되었다. HRP 색계측 기질들(colorimetric substrates)이 탐지를 위하여 사용되었으며 OD450 nm가 측정되었다. OD450 nm 값들이 용액들 내의 항체의 농도들에 대하여 좌표화 되었으며 IC₅₀ 이 비-선형 회귀 분석을 이용하여 측정되었다. IC₅₀은 바이오틴-hDLL4-hFc의 h노치1-hFc 코팅된 플레이트들에의 최대 결합의 50%를 차단하는데 요구되는 항체 농도로서 정의되었으며, 이들 값들은 항체의 hDLL4에 대한 차단 효능을 반영한다. 이 효능은 동일한 플레이트 상에 실행된 참조 표준 샘플에 비교하여 측정되었으며 참조 표준 IC₅₀ 값의 퍼센트로서 표현되었다.

실시예 3: 버퍼 및 pH

항-Dll4의 안정성에 대한 pH 및 버퍼의 영향이 고려되었다. REGN421 항체 ("REGN421")가 10 mM 포스페이트 버퍼 또는 10 mM 히스티딘 버퍼 중 하나와 제제화되었을 때 가장 안정하였다. 포스페이트가 액체 상태로 저장하는 동안에 히스티딘 산화의 잠재적 위험에 대한 염려로 인하여 제제를 위한 버퍼로서 선택되었다. 모노염기성 포스페이트 및 디염기성 포스페이트의 혼합물은 모든 부형제들이 REGN421 항체와 함께 첨가되는 경우 pH 6.0을 초래하였다.

상승된 온도에서 인큐베이션된 완충된 REGN421의 분석은 주요 단백질 분해 경로들이 응집체들, 분열 생성물들, 그리고 하전 변형체들의 형성임을 나타내었다. 그러므로, REGN421 안정성에 대한 pH 및 버퍼의 영향을 평가하기 위하여, REGN421 테스트 샘플들이 단백질의 열적 안정성을 증가시키는 조건들을 확인하기 위하여 45℃에서 다양한 버퍼들 내에서 5.0 내지 8.0 범위의 pH 값들에서 배양되었다. (표 1) REGN421는 SE-HPLC 및 양이온 교환- 고성능 액체 크로마토그래피 (CEX-HPLC) 분석 모두에 의하여 측정하여 단백질이 pH 6.0에서 제제화되는 경우 최대 안정성을 갖는다. REGN421를 포스페이트 또는 히스티딘 버퍼 내에서 pH 6.0에서 제제화하는 것은 숙시네이트 또는 사이트레이트 버퍼 내에서 pH 6.0에서 제제화하는 것에 비하여 보다 큰 단백질 안정성을 유도한다. 포스페이트가 REGN421 제제를 위하여 선택되었는데, 이는 액체 상태에서 장기간 동안의 저장 동안에 히스티딘 산화의 잠재적 위험에 대한 염려 때문이다.

표 1에 나타난 결과를 위하여, FluroTec?코팅된 4432/50 부틸 고무 마개를 갖는 2mL 타입 1 보로실리케이트 유리 바이알 내에서 0.2% 폴리소르베이트 20을 함유하는 10 mM 테스트 버퍼 내의 0.3mL의 25 mg/mL REGN421가 45에서 28일 동안 테스트 되었다. 혼탁도는 출발 물질에 비교한 상대적 OD₄₀₅의 변화로서 보고되었다. 출발 물질 결과들은 모든 14 제제들에 대한 출발 물질의 평균 결과들을 나타낸다. OD = 광학 밀도; RP-HPLC = 역상 고성능 액체 크로마토그래피; SE-HPLC = 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피; CEX-HPLC = 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피.

표　1: 45℃에서 28일 동안 인큐베이션된 REGN421의 안정성에 대한 버퍼 및 pH의 효과

실시예 4: 교반 스트레스에 대한 보호제들의 선택

0.2% 폴리소르베이트 20가 유기 공용매로서 선택되었는데, 그것이 액체 상태에서 교반되는 경우 REGN421를 안정화하였기 때문이다. 유기 공용매들 없이 교반을 수반하는 REGN421의 안정성을 모니터하기 위하여 초기에 수행된 연구들은 다양한 결과들을 산출하였다. 교반된 REGN421의 SE-HPLC를 통한 분석은 한 특정 연구에서 항체의 응집의 증가를 입증하였으나, REGN421에 수행된 여타의 교반 연구들의 다수에서 응집에 현저한 증가는 관찰되지 않았다. 두 대표적 안정성 연구들로부터의 결과들이 표 2에 도시된다. 폴리소르베이트 20을 REGN421 제제에 첨가하는 보수적인 접근방법이 그럼에도 불구하고 REGN421의 제조, 선적 및 취급 동안에 일어날 수 있는 잠재적 교반 의존성 단백질 불안정성을 방지하기 위하여 취해졌다. 폴리소르베이트 20이 여타의 유기 공용매들에 우선하여 선택되었는데, 이는 그것이 REGN421의 열적 안정성을 변화시키지 않았기 때문이다.

표 2에 도시된 항체 안정성 결과들을 위하여, FluroTec?코팅된 4432/50 부틸 고무 마개가 구비된 2mL 타입 1 보로실리케이트 유리 바이알 내의 10 mM 포스페이트, pH 6.0에서 0.3mL의 25 mg/mL REGN421가 유기 공용매들과 조합되었으며 120분의 볼텍싱에 도입되었다. 혼탁도가 출발 물질에 비교된 상대 OD₄₀₅의 변화로서 보고되었다. 출발 물질 결과들은 모든 아홉 제제들에 대한 출발 물질의 평균 결과들을 나타낸다. OD = 광학 밀도; RP-HPLC = 역상 고성능 액체 크로마토그래피; SE-HPLC = 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피.

표 2: 항체 안정성 - 교반에 대한 유기 공용매들의 효과

실시예 5: 열적 스트레스에 대한 보호제들의 선택

안정화제들 이를테면 슈가들, 아미노산들, 그리고 무기 염들이 REGN421의 열적 안정성을 증가시키기 위한 그들의 능력에 대하여 조사되었다. 조사된 열 안정화제들의 요약이 표 3에 제공된다. 수크로오스 및 트레할로스를 함유하는 제제들이 SE-HPLC 분석에 의하여 측정된 최소 용량의 REGN421 응집체 형성을 나타내었다. 소듐 클로라이드의 상기 제제에의 첨가는 하전 변형체들의 형성의 감소를 나타내었으나 (CEX-HPLC) 증가된 용량의 응집체 형성 (SE-HPLC)을 초래하였다. 수반되는 연구가 10% 수크로오스 및 150 mM 소듐 클로라이드 (NaCl)의 조합과 제제화에 따른 REGN421의 열적 안정성을 조사하기 위하여 수행되었다. 이 연구의 목표는 제제에 수크로오스를 포함함에 의하여 NaCl-유도 응집을 감소시키고, 이로써 유지 제제 내에서 하전 변형체 형성에 대한 NaCl의 보호 효과들을 유지하는 것이다. 수크로오스 농도는 제제의 삼투질농도를 제어하기 위하여 20% (NaCl 없음) 내지 10% (NaCl와 함께)로 조절되었다. CEX-HPLC 분석에 의하여 측정된 (하전 변형체들의 형성) 이 제제에서 REGN421의 열적 안정성은 단일 안정화 작용제로서 NaCl를 사용한 결과와 유사하였으며 (표 3), 하전 변형체 형성에 대한 NaCl의 보호 효과를 입증한다. 더욱이, 응집체 형성의 속도는 NaCl를 단일 안정화 작용제로서 사용하는 제제에 비하여 현저히 감소되었으며, 상기 제제에 대한 수크로오스의 안정화 효과들을 입증한다. 이들 결과들에 기초하여, REGN421가 10% 수크로오스 및 150 mM NaCl로 제제화되었다.

표 3에 도시된 항체 안정성 결과들을 위하여, FluroTec?코팅된 4432/50 부틸 고무 마개가 구비된 2mL 타입 1 보로실리케이트 유리 바이알 내에 0.3mL의 10 mM 포스페이트, pH 6.0, 0.2% 폴리소르베이트 20, 그리고 25 mg/mL REGN421, 플러스 지시된 열 안정화제가 28일 동안 45℃에 도입되었다. 혼탁도는 출발 물질에 비교한 상대 OD₄₀₅변화로서 보고되었다. 출발 물질 결과들은 45℃에서 배양되지 않은 모든 열 제제들에 대한 평균 결과들을 나타낸다. OD = 광학 밀도; RP = 역상 고성능 액체 크로마토그래피; SE = 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피; CEX = 고성능 액체 크로마토그래피.

표　3: 안정성에 대한 열 안정화제들의 효과

실시예 6: 스트레스 안정성 연구들 또는 REGN421 제제

가속화된 스트레스 연구들이 REGN421를 25℃에서 6개월 동안 유지함으로써 수행되었다. 이 가속화된 조건에서, 하전 변형체 프로파일에서 보다 산성 종들을 향한 쉬프트가 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX-HPLC)에 의하여 관찰되었다. 순도의 2% 내지 5% 감소가 6개월 동안 저장 후, 순도의 1.6% 감소 및 SE-HPLC에 의하여 탐지된 고분자량 응집체 형성의 1.2% 증가와 함께, SDS PAGE에 의하여 관찰되었다. 25℃에서 6개월 동안 저장 후 결합 분석에 의하여 측정된 REGN421의 효능 손실은 없었다.

REGN421 항체에 수행된 부가적인 가속화된 그리고 스트레스 안정성 연구들은 60 분 또는 120분 동안 볼텍스되거나, -80℃에서 주위 온도로 여덟 사이클들 동안 동결 및 해동되거나, 45℃에서 28일 동안 배양되거나, 37℃에서 28일 동안 배양되거나, 또는 25℃에서 28일 동안 배양되는 경우 상기 단백질이 물리학적으로 안정하다는 것을 지시한다. (표 4). 이들 연구들 동안에, 상기 용액은 가시적으로 맑게 유지되었으며, 단백질의 손실은 관찰되지 않았으며, 그리고 이들 스트레스들 후에 pH 변화는 일어나지 않았다. 그러나, 상기 단백질이 ≥ 25℃에서 28일 동안 배양된 경우 REGN421의 순도의 감소가 크기 배제 HPLC 및 양이온 교환 HPLC에 의하여 탐지되었는데, 이는 REGN421가 스트레스 조건들에 노출되는 경우 분자량 및 하전 변형체들의 변화가 일어남을 지시한다. 상기 단백질이 37℃에서 배양된 경우 45℃에서 배양된 경우에 비하여 보다 작은 수준의 화학적 분해가 탐지되었다. REGN421는 25℃에서 14일 평가 기간에 걸쳐서 그리고 교반 및 동결/해동 사이클들 후에 물리적으로 그리고 화학적으로 안정하였다. Dll4/노치 결합 분석을 이용하여 측정된 바와 같이 어떠한 스트레스를 받은 샘플들에 대하여도 효능의 현저한 손실은 관찰되지 않았다.

표　4: 25 mg/mL 항-Dll4 항체의 스트레스 안정성

표 4에 도시된 항체 안정성 결과들을 위하여, FluroTec?코팅된 4432/50 부틸 고무 마개가 있는 2mL 타입 1 보로실리케이트 유리 바이알에 0.3mL의 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 0.2% 폴리소르베이트 20, 10% 수크로오스, 150 mM NaCl, 그리고 25 mg/mL HIH685P가 유기 공용매들과 조합되었으며 다양한 디자인된 스트레스들에 도입되었다. 혼탁도가 출발 물질에 비한 405 nm에서 OD의 상대 변화로서 보고되었다. 결합 분석을 위한 수용 기준은 참조 표준의 50-150%였다. OD = 광학 밀도; RP = 역상 고성능 액체 크로마토그래피; SE = 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피; CEX = 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피.

실시예 7: 제제화된 항-DLL4 항체의 저장 안정성

-80℃, -30℃, 또는 -20℃에서 24개월 저장 후 UV 분광광도법에 의하여 관찰된 바와 같이, 또는 SDS-PAGE에 의하여 측정된 바와 같이 REGN421의 현저한 손실은 없었다. 순도의 0.8% 감소 및 응집체 형성의 0.4% 증가가 5℃에서 24개월 동안 저장 후 SE-HPLC에 의하여 탐지되었다. 테스트 된 조건들에서 24개월 저장 후 CEX HPLC에 의하여 탐지된 바와 같이 하전 변형체들에 현저한 변화는 없었다. 저장 기간 말에 결합 분석에 의하여 측정된 바와 같이 효능에 변화는 없었다. REGN421는 5℃에서 24개월 저장 후 모든 분석에 대하여 계속 수용기준에 부합하였다. 표 5 참조.

표　5: 25 mg/mL REGN421의 안정성 (10mM 포스페이트, pH 6.0, 0.2% 폴리소르베이트 20, 10% 수크로오스, 그리고 150 mM NaCl)

실시예 8: IV 전달 장치와의 적합성

25 mg/mL REGN421 제제가 표준 생리식염수를 함유하는 디-(2-에틸헥실)-프탈레이트 (DEHP) 를 갖는 폴리비닐 클로라이드 (PVC)로 구성된 정맥주사 (IV) 백 내에 희석되었다. 낮은 복용량 (0.1 mg/kg 및 40kg 환자), 중간 복용량 (4 mg/kg 및 40kg 환자), 그리고 고복용량 (16 mg/kg 및 120kg 환자)을 포함하는 세 가지 상이한 복용량들의 REGN421가 이 연구에서 조사되었다. 낮은 복용량에 대하여, 부가적인 "위약(placebo)"이 교반에 대하여 REGN421를 안정화시키는 것을 돕기 위하여 상기 백에 첨가되었다.

희석된 REGN421를 함유하는 IV 백들은 먼저 24 시간 동안 5℃에서 유지되었으며 이후 부가적인 24 시간 동안 25℃에서 유지되었다. 이들 인큐베이션들이 완료된 후, 상기 IV 백들은 주입 세트들에 연결되었고, 희석된 항체로 준비되었으며, 그리고 주위 온도에서 한 시간 동안 유지되었다. 희석된 항체가 주입세트들을 통하여 25mL/hr 내지 500mL/hr 범위의 속도로 펌프되었다. 주요 공급자들을 대표하는 세 주입 펌프들 및 세 주입 세트들 (Alaris, Baxter, 그리고 Hospira)이 이 조사에 이용되었다. 이들 주입 세트들은 인라인 필터들을 갖는 주입 세트들을 포함하는 기초(basic) 물질들 (DEHP과 PVC, 트리옥틸-트리멜리테이트(TOTM), 그리고 폴리올레핀들과 PVC) 모두를 대표한다. 모든 주입 세트들은 0.2 μm 폴리에테르설폰 필터를 함유하였다.

REGN421는 다양한 주입 세트들에서 24 시간 동안 5℃에서 유지, 24 시간 동안 25℃에서 유지(표 6 참조), 1시간 동안 주위 온도에서 유지, 그리고 다양한 주입 펌프들을 이용하여 25mL/hr 또는 500mL/hr 중 하나의 속도로 주입 세트들을 통하여 펌프된 경우 물리적으로 안정하였다. 침전물들은 가시적 조사 또는 혼탁도에 의하여 탐지되지 않았으며, 용액의 pH는 안정하였으며, 그리고 어떠한 테스트된 샘플에서도 RP-HPLC로 측정된 바와 같이 단백질 농도의 감소는 없었다. 상기 단백질은 또한 화학적으로 안정하였다. 이 적합성 연구에서, 각각 SE-HPLC 및 CEX-HPLC로 측정된 바와 같이 분자량 종들 또는 하전 변형체들의 증가는 관찰되지 않았다.

표 6

이 데이터는 다음의 결과들을 뒷받침한다: (a) REGN421는 생리식염수를 함유하는 50mL IV 백에 4 mg의 REGN421 희석 또는 희석 생리식염수의 250mL IV 백 내에 1920 mg의 REGN421 희석에 따라서 안정하였다. 상기 생리식염수의 생리식염수 함유 IV 백은 DEHP 함유 PVC로 구성되었다. (b) 희석된 REGN421는 5℃에서 24 시간 또는 25℃에서 24시간까지의 기간들 동안에 IV 백 내에서의 인큐베이션 후 안정하였다. (c) 희석된 REGN421는 주입 펌프를 이용하여 투여될 수 있다. (d) 희석된 REGN421는 DEHP를 함유하는 PVC, TOTM 또는 폴리올레핀을 함유하는 PVC, 중 하나로 구성된 주입 세트로 투여될 수 있다. (e) 인라인 0.2 μm 폴리에테르술폰 필터의 사용은 REGN421에 적합하다. (f) 희석된 REGN421은 25mL/hr 내지 500mL/hr 범위의 속도로 투여될 수 있다.

실시예 9: 분자 질량 측정

제제화된 REGN421가 단백질 구조 및 활성에 대하여 특성화되었다. 글리코실화 없는 자연의 REGN421의 예측되는 단백질 분자량은 대략적으로 146 kDa이다. 비-환원 SDS-PAGE가 헤테로테트라머(heterotetrameric) 분자의 분자량을 확인하기 위하여 그리고 손상되지 않은 항체로 공-정제된(co-purified) 높은 그리고 낮은 분자량 단백질 형태들의 수준을 조사하기 위하여 수행되었다. 알킬레이팅 작용제가 디설파이드 셔플링(shuffling)을 방지하기 위하여 그리고 가열에 의한 항체 분해를 최소화하기 위하여 샘플 제조 동안에 추가되었다. 전기영동 및 쿠마씨 염색 다음 측정된 글리코실화된 항체의 관찰된 분자량은 대략적으로 150 kDa으로 관찰되었다. REGN421의 질량 또한 환원 조건들 하에서 SDS-PAGE를 이용하여 조사되었다. 샘플들은 전기영동 전에 환원되고 가열되었으며, 그리고 단백질 밴드들이 쿠마씨 블루로 염색함으로써 탐지되었다. REGN421가 항체 중쇄 (대략적으로 50 kDa) 및 경쇄 (대략적으로 25 kDa)에 대응되는 두 주요 밴드들로서 탐지되었다.

모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)가 또한 REGN421의 질량을 평가하기 위하여 적용되었다. CE-SDS는 환원된 IgG 폴리펩타이드 사슬들을 크기로 해상(resolve)할 수 있으며 그리고 REGN421 항체에 존재할 수 있는 변형체들 및 이종성의 정량화를 허용한다. 비-글리코실화된 중쇄의 백분율이 비-글리코실화된 그리고 글리코실화된 중쇄들에 대응되는 보정된(corrected) 피크 면적들의 합계에 대한 비-글리코실화된 중쇄의 보정된 피크 면적의 비율로부터 계산되었다. 두 주요(principal) 피크들이 REGN421 항체에 대한 CE-SDS 환원 전기영동도들에서 관찰되었다. 약물 물질들 로트들에 대한 두 주요 피크들이 IgG 대조 표준(control standard)에서 환원된 경쇄 (LC) 및 글리코실화된 중쇄들 (HC)로서 확인되는 두 주요 피크들과 정렬(align)된다. REGN421 및 IgG 대조 표준에 대하여 표지된 HC 및 LC의 피크들 분자량들은 각각 대략적으로 60 kDa 및 25 kDa이다. 이 방법으로 측정된 중쇄 및 경쇄들의 분자량들은 인간 IgG1에 대하여 예측된 것보다 약간 큰데, 이는 이 기술이 중쇄 및 경쇄들의 분자량들을 약간 과대평가할 수 있음을 제안한다. REGN421의 테스트된 로트들의 비-글리코실화된 중쇄 (NGHC) 형태의 상대 존재비 (relative abundance)는 탐지된 총 피크 면적의 대략적으로 1.5%를 나타낸다.

실시예 10: 푸코실화 분석

REGN421 약품 물질 로트들이 항체 중쇄로부터 N-링크된 올리고사카라이드들을 제거하기 위하여 PNGase F로 처치되었다. 유리 올리고사카라이드들은 이후 형광 작용제, 안트라아닐릭 애시드(anthranilic acid)로 환원 말단에서 유도되었다. 변형된 올리고사카라이드들은 역상 HPLC 및 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다. HPLC 크로마토그램의 조사는 상기 변형된 올리고사카라이드들이 두 주요 그룹들, 비-푸코실화된 두 개의 안테나 구조 (bi-antennary) 종들 및 푸코실화된 두 개의 안테나 구조 종들로 분리되었음을 나타내었다. 각각의 그룹 (푸코실화된 vs 비-푸코실화된) 내에서, 올리고사카라이드들은 디갈락토실 (G2), 모노갈락토실 (G1) 또는 비갈락토실(agalactosyl) (G0) 형태들로 더 분리되었다. 올리고사카라이드 구조 지정들(assignments)은 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 각각의 분획된 올리고사카라이드의 질량 분석을 통하여 달성되었다. 크로마토그램들에서 대응되는 피크들의 통합에 기초하여, 분석된 REGN421 로트들은 82.4 내지 87.0% (84.6% ±1.47%; av ±SD)의 푸코실화된 올리고사카라이드 사슬들을 함유하였다(표 7). 모아진 올리고사카라이드들의 질량 분석은 푸코실화된 두 개의 안테나 구조 올리고사카라이드들이 우세한 종들이라는 것을 입증하는데, 이는 HPLC 분석과 일치한다. REGN421의 다양한 테스트된 로트들 사이의 N-링크된 슈가 사슬들 내의 갈락토실화의 용량에서의 관찰된 차이는 항체 생산 동안에 일어날 수 있는 이종성을 반영한다.

표 7: REGN421 글리코실화 패턴들

실시예 11: 중쇄 C-말단 라이신 분석

펩타이드 맵핑이 REGN421의 C-말단 서열을 확인하기 위하여 사용되었다. REGN421가 6.0 M 유레아, 100 mM 트리스, pH 7.5에서 변성되고, 5 mM DTT로 환원되었으며 그리고 12.5 mM 아이오도아세타마이드로 알킬화되었다. 상기 단백질은 이후 1.0 M로 유레아 농도를 낮추기 위하여 6배 희석되고 다음에 트립신으로 (1:20 효소 대 기질 비율) 37℃에서 세 시간 동안 소화되었다. 펩타이드들은 HPLC로 분리되었고 질량분석기로 분석되었다. REGN421로부터의 자연의 C-말단 펩타이드의 확인을 위한 표준들로서, 가장 적당한 것으로 추정되는 C-말단 펩타이드 서열들 (SLSLSP, SLSLSPG, 그리고 SLSLSPGK; 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11, 그리고 서열 번호 12)에 대응되는 세 합성 펩타이드들이 생성되었으며 REGN421의 트립신 맵에서 실제 C-말단 펩타이드의 확인을 증진시키기 위하여 REGN421 트립신 소화된 펩타이드들을 용출하기 위하여 사용된 기울기와 비교하여 동일한 용매 용출 기울기를 이용하여 HPLC로 분석되었다. SLSLSPGK (서열 번호 12)의 예측되는 트립신 유도 C-말단 펩타이드는 어떠한 테스트 된 REGN421 로트들의 트립신 맵에서도 발견되지 않았는데, 이는 C-말단 Lys이 제거되었음을 지시한다. 트립신 맵에서, 합성 펩타이드들의 하나와 (SLSLSPG; 서열 번호11) 공동-용출되는 오직 하나의 펩타이드 (46.60분에 용출)가 있다. 이 펩타이드는 질량 분석 (예측되는 질량 659.69, 관찰된 질량 660.2)을 통하여 REGN421 중쇄의 C-말단 펩타이드에 대응된다. 이 결과들은 번역 후 가공이 중쇄 C-말단으로부터 예측되는 Lys의 완전한 제거에 이르게 함을 제안한다.

SEQUENCE LISTING <110> WALSH, Scott DIX, Daniel <120> Stabilized Formulations Containing Anti-Dll4 Antibodies <130> 7400P <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asn Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Ser Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Asp Ala Ser 1 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175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 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Claims

다음을 포함하는 약제학적 제제:
(i) 인간 델타-유사 리간드 4 (Dll4)에 특이적으로 결합하는 항체;
(ii) pH 6.0 ±0.5의 버퍼;
(iii) 유기 공용매; 그리고
(iv) 두 열 안정화제들.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 서열 번호 2의 HCDR1, 서열 번호 3의 HCDR2, 서열 번호 4의 HCDR3, 서열 번호 6의 LCDR1, 서열 번호 7의 LCDR2, 그리고 서열 번호 8의 LCDR3를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항체는 서열 번호 1의 HCVD 및 서열 번호 5의 LCVD를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 항체는 약 150 kDa의 분자량을 가지며; 그리고
(b) 상기 항체들의 약 82% 내지 약 87%는 푸코실화된 것임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 농도는 25 mg/mL± 3.75 mg/mL임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 버퍼는 포스페이트임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 6항에 있어서,
상기 포스페이트 농도는 10 mM ±1.5 mM임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유기 공용매는 폴리소르베이트 20임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 8항에 있어서,
상기 폴리소르베이트 20 농도는 0.2% w/v ±0.03%임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안정화제는 수크로오스 및 소듐 클로라이드로 구성됨을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 10항에 있어서,
상기 수크로오스 농도는 10% ±1.5% (w/v)이며 상기 소듐 클로라이드 농도는 150 mM ±22.5 mM임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
25 mg/mL ±3.75 mg/mL 항체, 10mM ±1.5mM 포스페이트, pH 6 ±0.5, 0.2% w/v ±0.03% 폴리소르베이트 20, 10% w/v ±1.5% 수크로오스, 그리고 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 94%는 45℃에서 28일 동안 저장 후 자연 형태(native conformation)를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 45%는 45℃에서 28일 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 형태(main charge form)임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 97%는 25℃에서 28일 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 57%는 25℃에서 28일 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 형태임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 97%는 37℃에서 28일 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 51%는 37℃에서 28일 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 형태임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 98%는 5℃에서 6개월 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 61%는 5℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 형태임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
5℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 상대 효능 퍼센트는 저장 전 상기 항체의 효능의 적어도 100%임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 99%는 -80℃에서 6개월 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을. 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 57%는 -80℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 형태임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
-80℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 상대 효능 퍼센트는 저장 전 상기 항체의 효능의 적어도 100%임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 99%는 -30℃에서 6개월 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 57%는 -30℃에서 6개월 동안 저장 후 주요 하전 변형체 임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
-30℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 상대 효능 퍼센트는 저장 전 상기 항체의 효능의 적어도 65%임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 98%는 -20℃에서 6개월 동안 저장 후 자연 형태를 가짐을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 적어도 60%는 -20℃에서 6개월 동안 저장 후 상기 항체의 주요 하전 변형체임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 -20℃에서 6개월 동안 저장 후 상대 효능 퍼센트는 저장 전 상기 항체의 효능의 적어도 100%임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
다음을 포함하는 약제학적 제제:
(a) 25 mg/mL mL ±3.75 mg/mL의 항-Dll4 항체,
(b) 10 mM ±1.5 mM 포스페이트, pH 6 ±0.3,
(c) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20,
(d) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드, 그리고
(e) 10% ±1.5% 수크로오스,
여기서:
(a) 상기 항체는 서열 번호 1의 HCVD 및 서열 번호 5의 LCVD를 포함하며;
(b) 상기 항체 약 150 kDa의 분자량이며; 그리고
(c) 상기 항체들의 약 82% 내지 약 87%는 푸코실화된 것임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 31항에 있어서,
(a) 25 mg/mL ±3.75 mg/mL의 상기 항체,
(b) 10 mM ±3 mM 포스페이트, pH 6 ±0.5,
(c) 0.2% ±0.03% 폴리소르베이트 20,
(d) 150 mM ±22.5 mM 소듐 클로라이드, 그리고
(e) 10% ±1.5% 수크로오스, 물 내에, 로 구성됨을 하는 약제학적 제제.
용기 내에 함유된 제 1항 내지 제 32항 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물.
제33항에 있어서,
상기 용기는 바이알임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 34항에 있어서,
상기 바이알은 유리임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제33항에 있어서,
상기 용기는 IV 점적 백(drip bag)임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제36항에 있어서,
상기 백은 폴리비닐 클로라이드로 제조된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제36항에 있어서,
상기 백은 폴리올레핀으로 제조된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 용기 및 지시 사항들의 설명서를 포함하는 키트.
제 39항에 있어서,
상기 용기는 FLUROTEC-코팅된 4023/50 고무 마개로 피팅된(fitted) 유리 바이알임을 특징으로 하는 키트.