KR20150006052A - 글루카곤-유사 펩타이드-2 (ｇｌｐ-2) 유사체 - Google Patents

글루카곤-유사 펩타이드-2 (ｇｌｐ-2) 유사체 Download PDF

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라스무스 유스트
키르스텐 린데가르 보우브예르그
디테 리베르
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Abstract

h[Gly2]GLP-2와 비교하여 하나 이상의 치환체를 포함하고, 변경된 GLP-1 활성의 특성을 가질 수 있는, GLP-2 유사체, 및 이들의 의학적 용도가 기재되어 있다. 당해 유사체는, 당뇨병의 위-장 관련된 부작용의 예방, 치료, 또는 완화에 특히 유용하다.

Description

글루카곤-유사 펩타이드-2 (ＧＬＰ-2) 유사체{GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2 (GLP-2) ANALOGUES}
본 발명은, 변경된 GLP-1 활성을 갖는 글루카곤-유사 펩타이드-2(GLP-2) 유사체, 및 예를 들면, 대사적 내독소혈증, 당뇨병, 비만, 및 대사 증후군과 같은 질환 및 병태의 예방, 치료, 또는 완화에 있어서 이들의 의학적 용도에 관한 것이다.
저-등급 염증은 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨병 및 사망의 독립적인 위험 인자이다. 연구 발견은, 동맥에서 유리 라디칼 및 감염성 제제의 활성 및 지방 침착물(플라크)의 형성에 관여하는 죽상 동맥경화증이, 이들이 둘 다 염증성 장애이기 때문에 골 및 관절의 관절염에 비유될 수 있음을 시사한다. 염증이, 인슐린 내성의 검출보다 앞서므로 당뇨병의 양호한 예측 변수일 수 있다.
또한, 비만 마우스(ob/ob 및 db/db)는 방해된 점막 차단 기능 및 증가된 전신성 염증을 가짐이 입증되어 왔다(참조: Brun et al ., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292:G518-G525, 2007. 5 October 2006). 이들 관찰은, 고지방 식이가 유지된 C57BL6/J 마우스(참조: Cani et al., DIABETES, VOL. 57, JUNE 2008, p 1470-1481) 및 비비만성 당뇨병 마우스(참조: Hadjiyanni et al., 2009)로 추가로 연장되었다. 카니 및 동료들(참조: Cani and colleagues, gut.bmj.com, 2009)은, ob/ob 마우스에서, 장내 미생물총(gut microbiota)의 변경이, GLP-2 유도된 경로를 통해 장 투과성 및 염증을 감소시켰음을 보고하였다. 또한, 비만 및 당뇨병 환자에서 관찰된 증가된 투과성은 현재 앞서 예상된 것보다 질환 진행에서 더 많은 필수적인 역할을 갖는 경향이 있다. 증가된 장 투과성은, 장 내강(intestinal lumen)을 가로질러 증가된 세균 지질다당류(LPS)를 초래한다. 이러한 증가된 LPS는 많은 질환의 발병에 관여하는 저 등급의 만성 염증을 야기하는, 체내에 잔류하는 기관 및 순환하는 대식세포와 같은 면역 세포를 활성화한다. 이러한 현상은, 대사적 내독소혈증(ME)이라고 칭하고, 만성 질환 병리학에서 새로운 개념으로서 조명될 수 있다.
표적화 ME 및 관련된 질환은 본 발명의 범위 내이다. 제II형 진성 당뇨병, 죽상 동맥경화증, 파킨슨 질환, 및 암 전이는, 공급원이 명확하게 정의되지 않은 만성 저-등급 염증과 관련되어 발생한다. 흥미롭게도, 몇몇의 최근 연구들은 질환 발병과 혈장 내독소 수준 사이의 유의한 상호관계를 입증하였다(참조: Chang 2011, J Med Sci 2011; 31(5):191-209).
이중 GLP2-GLP1 작용제가 비만 당뇨병 설정에서 작용하게 될 가설된 메커니즘이 도 1에 도시되어 있다. GLP2 성분은 염증 및 대사적 내독소혈증을 감소시키고, 반면, GLP1 성분은 전통적인 GLP1 의존성 메커니즘을 통해 포도당 조절 및 체중 감량을 제공하였다.
사람 GLP-2는, 장의 장 내분비 L 세포에서 및 뇌간의 특정 영역에서 프로글루카곤의 전사 후 처리로부터 유도된 33개-아미노산 펩타이드이다. 이는 영양분 섭취에 반응하여, 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1 ), 옥신토모듈린, 및 글리센틴과 함께 공동-분비된다.
GLP-2는, 움(crypt)에서의 줄기 세포 증식의 자극 및 융모에서의 세포자멸사의 저해를 통해 소장 점막 상피의 유의한 성장을 유도한다[참조: Drucker et al., Proc Natl Acad Sci U S A 93:7911-7916 (1996)]. GLP-2는, 또한, 결장에 대한 성장 효과를 갖는다. 더욱이, GLP-2는 위 배출 및 위산 분비를 억제하고[참조: Wojdemann et al., J Clin Endocrinol Metab. 84:2513-2517 (1999)], 장 장벽 기능을 증진시키고[참조: Benjamin et al., Gut47:112-9 (2000)], 포도당 수송체의 상향조절을 통해 장 헥소스 수송을 자극하며[참조: Cheeseman, Am J Physiol. R1965-71 (1997)], 장 혈류를 증가시킨다[참조: Guan et al., Gastroenterology 125: 136147 (2003)].
GLP-2는, 부류 II 글루카곤 세크레틴 계열에 속하는 단일의 G 단백질-커플링된 수용체에 결합한다. GLP-2 수용체는 소장, 결장 및 위에서 발현되며, 이들은, 또한, GLP-2에 반응성인 것으로 공지되어 있는 부위이다[참조: Yusta et al., Gastroenterology 119:744-755 (2000)]. 그러나, 위장관 내의 GLP-2 수용체 자극에 대한 표적 세포 유형은 불명확하게 남아있으며, GLP-2 수용체에 커플링된 하류 세포내 조정자는 불량하게 이해된다.
소장에서의 GLP-2의 입증된 특이적이고 유리한 효과는, 장 질환 또는 손상의 치료시 GLP-2의 용도와 관해서 많은 관심을 제기하였다(참조: Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). 더욱이, GLP-2는, 화학 치료요법-유도된 장염, 허혈-재관류 손상, 덱스트란 설페이트-유도된 결장염 및 유전적 모델의 염증성 장 질환을 포함하는, 장 손상의 광범위한 수의 예비임상 모델에서의 점막 상피 손상을 예방하거나 감소시키는 것으로 밝혀져 왔다(참조: Sinclair and Drucker Physiology 2005: 357-65).
추가로, GLP-2가 위 운동성 및 위산 분비를 감소시킨다는 관찰(참조: Meier et al., GASTROENTEROLOGY 2006;130:44-54)과 함께, 위에서의 GLP-2R mRNA의 발현(참조: Yusta et al., 2000)은, 위가 GLP-2에 대하여 직접적으로 또는 간접적으로 반응성이라는 충분한 증거를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 위 내벽에 대한 손상을 특징으로 하는 조건에서의 GLP-2 또는 GLP-2의 유사체의 용도는 아직 탐구되어 있지 않았다.
GLP-2는, 다음 서열 His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp (서열번호 1)을 갖는 33개 아미노산 펩타이드로서 분비된다. 이는 N-말단에 대하여 2번 위치의 알라닌(Ala)에서 효소 DPP IV에 의해 신속하게 개열된다. 신장 청소(renal clearance) 이외에, GLP-2(1-33)의 이러한 신속한 효소적 분해는, 약 7분의 반감기를 초래한다[참조: Tavares et al., Am. J, Physiol. Endocrinol. Metab. 278:E134-E139 (2000)].
대표적인 GLP-2 유사체는, 예를 들면, 미국 특허 제5,789,379호; 제5,994,500호; 제6,184,201호; 제6,184,208호; 국제 공보 제WO 97/39031호; 제WO 01/41779호; 제WO 02/066511호 및 문헌[참조: DaCambra et al. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894)]에 기재되어 있다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 이들의 전문이 인용에 의해 명확히 포함된다.
발명의 요약
광의로, 본 발명은, 야생형 GLP-2와 비교하여 1개 이상의 치환을 포함하고, 예를 들면, 시험관내 효능 검정에서 평가되는 바와 같은, 변경된, 바람직하게는 증가된 GLP-1 활성의 특성을 가질 수 있는, GLP-2 유사체에 관한 것이다. GLP-1 활성은, 예를 들면, 천연 GLP-2에서보다 더 낮은 GLP-1 수용체에서의 EC50 값을 측정함으로써 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 위치 17에서 Gln, Lys 또는 Glu와 조합하여 야생형 GLP-2 서열의 위치 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 24, 27 및/또는 28 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 위치 17에서 Gln, Lys 또는 Glu와 조합하여 야생형 GLP-2 서열의 위치 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 20, 21, 24, 27 및/또는 28 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 위치 2에서의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 야생형 GLP-2 서열의 위치 28 내지 33의 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 임의로, 위치 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 및 32 중 하나 이상에 접합된 친지성 치환체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 임의로, 위치 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32 중 하나 이상에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
일부 실시형태에서, GLP-2 유사체는 일반 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 나타낸다:
[화학식 I]
R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-R2 (서열번호 2)
상기 화학식 I에서,
R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이고;
X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
X11은 Asn, Ser 또는 Ala이고;
X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
X14는 Leu 또는 Met이고;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X17은 Gln, Lys, Arg, His 또는 Glu이고;
X19는 Ala 또는 Val이고;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이고:
X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Y1이거나 부재하고;
X29는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
X31은 Ile, Pro이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
R2는 NH2 또는 OH이고;
단, 화학식 I의 GLP-2 유사체는
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD (서열번호 3);
HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD (서열번호 4); 또는
HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK (서열번호 5)가 아니다.
본 화학식에서, X31은, 또한, Y1일 수 있다. X28은, 또한, Gly일 수 있다. X29는, 또한, Ala일 수 있다,
추가로, Y1은 X33과 R2 사이에 존재할 수 있다. 따라서, 위치 X34는, X34가 Y1이거나 부재하는 경우에 예상될 수 있다.
일부 실시형태에서, GLP-2 유사체는, 화학식 I에 따른 GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이며, 여기서:
R1은 수소이고,
X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이고;
X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
X11은 Asn, Ser, 또는 Ala이고;
X12는 Thr 또는 Lys이고;
X14는 Leu 또는 Met이고;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X17은 Gln 또는 Lys이고;
X19는 Ala 또는 Val이고;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val 또는 Lys이고:
X28은 Gln, Asn, Y1이거나 부재하고;
X29는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
Y1은 -Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
R2는 NH2 또는 OH이고;
단, 화학식 I의 GLP-2 유사체는
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아니다.
상기 화학식에서, X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln일 수 있다.
X28은, 또한, Gly일 수 있다. X29는, 또한, Ala일 수 있다. Y1은 X33과 R2 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X14는 Leu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X14는 Met이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X19는 Ala이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X19는 Val이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X16은 Gly이고, 화학식 I의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X16은 Gly이고, 화학식 I의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X16은 Gly이고, 화학식 I의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Aib이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 I의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Aib이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 I의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Aib이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 I의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Gly이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 I의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Gly이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 a의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 X2는 Gly이고, 화학식 I의 X16은 Gly이며, 화학식 I의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, GLP-2 유사체는 일반 화학식 Ia 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 나타낸다:
[화학식 Ia]
R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Leu-X15-X16-X17-Ala-Ala-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-R2 (서열번호 6)
상기 화학식 Ia에서,
R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이고;
X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
X11은 Asn 또는 Ser이고;
X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
X15는 Asp 또는 Glu이고:
X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X17은 Gln, Lys, Arg, His 또는 Glu이고;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이고:
X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Y1이거나 부재하고;
X29는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
X31은 Ile, Pro이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
R2는 NH2 또는 OH이고;
단, 화학식 Ia의 GLP-2 유사체는
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아니다.
상기 화학식 Ia에서, X31은, 또한, Y1일 수 있다.
추가로, Y1은 X33과 R2 사이에 존재할 수 있다. 따라서, 위치 X34는, X34가 Y1이거나 부재하는 경우에 예상될 수 있다.
X28은, 또한, Gly일 수 있다. X29는, 또한, Ala일 수 있다.
일부 실시형태에서, GLP-2 유사체는, 화학식 Ia에 따른 GLP-2 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:
상기 화학식 Ia에서,
R1은 수소이고,
X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이고;
X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
X11은 Asn 또는 Ser이고;
X12는 Thr 또는 Lys이고;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X17은 Gln 또는 Lys이고;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val 또는 Lys이고;
X28은 Gln, Asn, Y1이거나 부재하고;
X29는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
Y1은 -Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
R2는 NH2 또는 OH이고;
단, 화학식 Ia의 유사체는
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아니다.
상기 화학식 Ia에서, X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln일 수 있다.
X28은, 또한, Gly일 수 있다. X29는, 또한, Ala일 수 있다.
Y1은 X33과 R2 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X16은 Gly이고, 화학식 Ia의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X16은 Gly이고, 화학식 Ia의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X16은 Gly이고, 화학식 Ia의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Aib이고, 화학식 Ia의 X16은 Gly이며, 화학식 Ia의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Aib이고, 화학식 Ia의 X16은 Gly이며, 화학식 Ia의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Aib이고, 화학식 Ia의 X16은 Gly이며, 화학식 Ia의 X17은 Glu이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Gly이고, 화학식 Ia의 X16는 Gly이며, 화학식 Ia의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Gly이고, 화학식 Ia의 X16은 Gly이며, 화학식 Ia 의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 Ia의 X2는 Gly이고, 화학식 Ia의 X16는 Gly이며, 화학식 Ia의 X17은 Glu이다.
상기한 실시형태들 중 어느 하나에서, 또는 독립적으로, X8-X9-X10-X11은 Ser-Glu-Leu-Ala일 수 있다.
상기에 기술한 일반 화학식들에서, 위치 X28 내지 X33은 몇몇의 아미노산 잔기들로부터 선택될 수 있거나, Y1일 수 있거나, 부재할 수 있다. GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1 모이어티를 포함하고, 존재하는 경우, Y1은 분자의 C-말단부를 형성하는 것으로 의도된다. 따라서, X28 내지 X33인 위치들 중 어느 하나가 Y1인 경우, 모든 하류 위치들이 부재하며; 즉, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33(또는 X34)이 부재한다). 이러한 맥락에서, 주어진 위치의 "하류"의 위치는 당해 위치의 C-말단에 위치한 것들이다.
또한, 위치 X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류의 모든 위치들도, 또한, 부재한다(존재할 수 있는 Y1은 제외함). 따라서, 부재할 수 있는 이들 위치의 유일한 조합은 X33; X32-X33; X31-X32-X33; X30-X31-X32-X33; X29-X30-X31-X32-X33; 및 X28-X29-X30-X31-X32-X33이다. 다시 말해서, 위치 XN이 존재하는 경우(여기서, N은 28 내지 33의 정수이다), 위치 X(N-1)도, 또한, 존재한다.
GLP-2 유사체는 일반 화학식 II, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 나타낼 수 있다:
[화학식 II]
R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-X14-X15-X16-X17- Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-R2(서열번호 7)
상기 화학식 II에서,
R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
X2는 Gly, Ala 또는 Aib이며;
X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이며;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X12는 Thr, Ser 또는 Lys이며;
X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
X14는 Leu 또는 Met이며;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X16은 Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이며;
X17은 Gln 또는 Lys이고;
X19는 Ala 또는 Val이며;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이며;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이며:
X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하며;
X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하며;
X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하며;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
X34는 Y1이거나 부재하며;
Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이고;
R2는 H2 또는 OH이며; 여기서,
GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하고;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재한다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X16은 Gly, Ser 또는 Ala이다. 이러한 실시형태에서, 화학식 II의 X17은 Lys일 수 있거나, 화학식 II의 X17은 Gln일 수 있다.
또한, 추가로 또는 대안으로, 화학식 II의 X2는 Gly 또는 Ala일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 화학식 II의 X16은 Gly이고, 화학식 II의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X16은 Gly이고, 화학식 II의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X2는 Gly이고, 화학식 II의 X16은 Gly이며, 화학식 II의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X2는 Gly이고, 화학식 II의 X16은 Gly이며, 화학식 II의 X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X2는 Aib이고, 화학식 II의 X16은 Gly이며, 화학식 II의 X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 X2는 Aib이고, 화학식 II의 X16은 Gly이며, 화학식 II의 X17은 Lys이다.
따라서, 화학식 II의 일부 실시형태에서:
R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
X2는 Gly 또는 Aib이며;
X3은 Glu 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이며;
X7은 Ser 또는 Thr이고;
X12는 Thr, Ser 또는 Lys이며;
X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
X14는 Leu 또는 Met이며;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X16은 Gly, Ser 또는 Ala이며;
X17은 Gln 또는 Lys이고;
X19는 Ala 또는 Val이며;
X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이며;
X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이며;
X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하고;
X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하며;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하며;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하며;
X34는 Y1이거나 부재하고;
Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
R2는 NH2 또는 OH이고; 여기서,
GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재한다.
일부 실시형태에서, X16은 Gly이고, X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, X16은 Gly이고, X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, X2는 Gly이고, X16은 Gly이며, X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, X2는 Gly이고, X16은 Gly이며, X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, X2는 Aib이고, X16은 Gly이며, X17은 Gln이다.
일부 실시형태에서, X2는 Aib이고, X16은 Gly이며, X17은 Lys이다.
일부 실시형태에서, GLP-2 유사체는 화학식 III, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 나타낸다:
[화학식 III]
R1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-Leu-X15-Gly-X17- Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-R2(서열번호 21)
상기 화학식 III에서,
R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
X3은 Glu 또는 Asp이며;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X7은 Ser 또는 Thr이며;
X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
X13은 Ile, Tyr, 또는 Gln이며;
X15는 Asp 또는 Glu이고;
X17은 Gln 또는 Lys이며;
X19는 Ala 또는 Val이고;
X20은 Arg, Lys 또는 His이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
X24는 Asn, Ala, Glu이며;
X27은 Ile, Leu, Glu 또는 Lys이고;
X28은 Gln, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하며;
X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
X30은 Lys, Y1이거나 부재하며;
X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
X32는 Thr, Y1이거나 부재하며;
X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
X34는 Y1이거나 부재하며;
Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이고;
R2는 NH2 또는 OH이고; 여기서,
GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재한다.
본 발명의 상기 실시형태 중 어느 하나에서, GLP-2 유사체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD 또는 HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD로부터 5개 이하의 아미노 변화, 예를 들면, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 변화를 갖는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 하기 서열들 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로 나타낸다:
H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; (서열번호 8)
HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKITD; (서열번호 9)
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; (서열번호 10)
HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD; (서열번호 11)
HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD; (서열번호 12)
HGEGTFTSDLSKQMESKAARDFIEWLIQTKITD; (서열번호 13)
HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD; (서열번호 14)
HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD; (서열번호 15)
HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD; (서열번호 16)
H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK; (서열번호 17)
HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD; (서열번호 18)
HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; (서열번호 19), 및
HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD; (서열번호 20).
따라서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 화합물 R1-Z-R2(여기서, R1 및 R2는 일반 화학식들에서 정의된 바와 같고, Z는, 상기 나열된 것들로부터 선택되는 펩타이드 서열이다)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 천연의 GLP-2의 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치에 상응하는 위치 중 하나 이상에서 아미노산에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 천연의 GLP-2의 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치에 상응하는 위치 중 하나 이상에서 아미노산에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 치료요법에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 담체와의 혼합물로, 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 산 부가 염인 GLP-2 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체로서 제형화되거나, 본 발명의 GLP-2 유사체의 서방출을 야기하도록 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 당뇨병(이는 제I형 또는 제II형 당뇨병일 수 있지만, 특히, 제II형 당뇨병일 수 있다)과 관련된 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 저 등급 염증은 국소 또는 전신 저 등급 염증이다. 일부 실시형태에서, 저 등급 염증으로는, 대사 증후군, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증 및 뇌졸중, 임의의 병인학의 궤양[예를 들면, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison Syndrome), 약물-유도된 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양]을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관내 위-장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군(short-bowel syndrome), 컬-드-삭 증후군(cul-de-sac syndrome), 염증성 장 질환[예를 들면, 크론 질환, 및 궤양성 결장염), 복강 스프루우(celiac sprue)(예를 들면, 글루텐 유도된 장병증 또는 복강 질환으로부터 발생함), 열대성 스프루우(tropical sprue), 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사가 포함된다. 상기 질환, 병태, 및 장애 중 일부는, 저 등급 염증과 관련된 것으로 특성확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 본 발명의 GLP-2 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, GLP-2 유사체의 발현을 발현 벡터의 발현을 지시하는 제어 서열과 조합된, 본 발명의 GLP-2 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은, 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, GLP-2 유사체의 생산 방법으로서, 상기 방법은, 당해 방법으로 생산되는 GLP-2 유사체의 발현 및 정제에 적합한 조건 하에서, GLP-2 유사체를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 GLP-2 유사체의 생산 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포는 치료요법에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조시 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 저 등급 염증은, 국소적 또는 전신적이며, 예를 들면, 대사 증후군(가장 넓은 범위의 정의), 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머 질환, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증, 및 뇌졸중, 임의의 병인학의 궤양(예를 들면, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약물-유도된 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양)을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관내 위-장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환(예를 들면, 크론 질환 및 궤양성 결장염), 복강 스프루우(예를 들면, 글루텐 유도된 장병증 또는 복강 질환으로부터 발생함), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사가 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 유효량의 본 발명의 GLP-2 유사체, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 투여함으로써, 위장-관련 장애(예를 들면, 위 또는 장)의 치료를 필요로 하는 환자에서 위장-관련 장애(예를 들면, 위 또는 장)의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 위장 관련 장애는 저 등급 염증이다. 저 등급 염증은, 국소적 또는 전신적일 수 있고, 대사 증후군, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증 및 뇌졸중, 임의의 병인학의 궤양(예를 들면, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약물-유도된 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양)을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관내 위-장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환(예를 들면, 크론 질환 및 궤양성 결장염), 복강 스프루우(예를 들면, 글루텐 유도된 장병증 또는 복강 질환), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사가 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 각각 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 본 발명의 암 화학 치료요법 약물 및 GLP-2 유사체, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는, 치료학적 키트를 제공한다.
도 1은 생리학적 경로에 대한 GLP-1 및 GLP-2의 효과를 나타낸다Cani et al., Pharmacology and Therapeutics 130 (2011) 202-212로부터 개작됨].
도 2는 경구 내당능 시험(OGTT)에 대한 화합물 12 또는 비히클 투여의 효과를 나타낸다. 포도당 챌린지 1시간 전에, 기저선 측정을 수행하고 화합물 12/비히클을 투여하였다. (A) 실험 기간 동안의 혈당 수준 (B) 혈당 측정의 AUC.
도 3은 장 습윤 중량에 대한 화합물 7 또는 비히클 투여의 효과를 나타낸다. 동물을 화합물 7 또는 비히클만으로 1일 1회 4일 동안 치료하고 5일째에 소장을 제거하여 칭량하였다.
도 4는 장 중량에 대한 시험 화합물 7 또는 비히클의 2주 투여의 효과를 나타낸다. (A) 소장 습윤 중량 (B) 대장 습윤 중량.
도 5는 포도당 항상성에 대한 시험 화합물 7 또는 비히클 투여의 2주 투여의 효과를 나타낸다. 동물을 밤새 절식시키고, (A) 공복 혈당 (B) 공복 혈장 인슐린, 및 (C) 항상성 모델 평가-인슐린 내성(homeostatic model assessment-insulin resistance: HOMA-IR)의 분석을 위해 채혈하였다.
본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 출원에서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 화학, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 면역학, 미생물학, 약리학, 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 기술은 익히 공지되어 있고 당해 분야에서 일반적으로 사용되고 있다.
본 출원에 언급된 모든 공보, 특허 및 공개된 특허 출원은, 본원에 인용에 의해 구체적으로 포함된다. 충돌하는 경우, 이의 구체적인 정의를 포함하는, 본 명세서가 제어할 것이다.
본원에 기술된 본 발명의 각각의 실시형태는, 단독으로 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 실시형태와 함께 취해질 수 있다.
정의
달리 구체화하지 않는 한, 하기 정의는, 상기 기술된 설명에서 사용되는 구체적인 용어에 대해 제공된다.
당해 명세서 전체에서, 용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은, 기술된 정수(또는 성분) 또는 정수(또는 성분)의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수(또는 성분) 또는 정수(또는 성분)의 그룹을 배제시키는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
단수형("a", "an", 및 "the")는, 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수를 포함한다.
용어 "포함하는"은, "포함하지만 이에 한정되지 않는"을 의미하기 위해 사용된다. "포함하는" 및 "포함하지만 이에 한정되지 않는"은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "환자", "대상체", 및 "개체"는 상호교환적으로 사용되며, 사람 또는 비-사람 동물을 말한다. 이들 용어는, 사람, 영장류, 가축 동물(예를 들면, 소, 돼지), 반려 동물(예를 들면, 개, 고양이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한다.
본 발명과 관련하여 용어 "용매화물"은, 용질(이 경우, 본 발명에 따른 펩타이드 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염)과 용매 사이에 형성된 규정된 입체화학의 복합체를 말한다. 이와 관련하여 용매는, 예를 들면, 물, 에탄올 또는 다른 약제학적으로 허용되는, 전형적인 소-분자 유기종, 예를 들면, 아세트산 또는 락트산을 포함하나 이들에 한정되지 않을 수 있다. 문제의 용매가 물인 경우, 이러한 용매화물은 일반적으로 수화물로서 언급된다.
본 발명의 내용에서 사용된 바와 같은 용어 "작용제"는, 문제의 수용체 유형을 활성화시키는 물질(리간드)을 말한다.
상세한 설명 및 특허청구범위 전체에서 천연의 아미노산에 대한 통상의 1 문자 및 3 문자 코드가 사용되고, 또한, 사르코신(Sar), 노르류신(Nle) 및 α-아미노이소부티르산(Aib)과 같은 다른 α-아미노산에 대한 일반적으로 허용되는 3 문자 코드도 사용된다. 본 발명의 펩타이드 내의 모든 아미노산 잔기들은 바람직하게는 L-입체배치이다. 그러나, D-입체배치 아미노산도, 또한, 존재할 수 있다.
본원에 개시된 서열들 중에는 서열의 아미노 말단(N-말단)에 "Hy-" 모이어티, 및 서열의 카복시 말단(C-말단)에 "OH" 모이어티 또는 "-NH2" 모이어티를 포함하는 서열이 존재한다. 이러한 경우, 및 달리 나타내지 않는 경우, 문제의 서열의 N-말단에서의 "Hy-" 모이어티는 수소 원자[예를 들면, 화학식 I 및 Ia에서 R1 = Hy-; N-말단에서의 유리 1차 또는 2차 아미노 그룹의 존재에 상응함]를 나타내고, 한편, 서열의 C-말단에서의 "-OH" 또는 "-NH2" 모이어티는 하이드록시 그룹[예를 들면, R2 = 화학식 I 및 Ia에서 R2 = OH; C-말단에서의 카복시(COOH) 그룹의 존재에 상응함], 또는 아미노 그룹[예를 들면, 화학식 I 및 Ia에서 R2 = NH2; C-말단에서의 아미도(CONH2) 그룹의 존재에 상응함]을 각각 나타낸다. 본 발명의 각각의 서열에서, C-말단 "-OH" 모이어티는 C-말단 "-NH2" 모이어티로 치환될 수 있거나, 그 반대로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "보존적 치환"은, 천연의 사람 GLP-2 펩타이드 서열의 소정 위치에 속하는 아미노산 잔기가 하기 표에 정의된 바와 동일한 그룹(I, II, III, IV, V, 1 , 2, 3)에 속하는 아미노산 잔기로 교환되었음을 의미한다:
Figure pct00001
본원에 사용된 바와 같은 "비-보존적" 치환은, 천연의 사람 GLP-2 서열의 아미노산 잔기의 보존적 치환 이외의 임의의 보존적 치환, 예를 들면, 비-단백질 비-천연 아미노산(Sar, Nle, Aib)으로의 치환 또는 동일한 그룹에 속하지 않는 아미노산으로의 치환을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 GLP-2 및 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 갖는다. 예시적인 활성으로는 장의 투과성을 감소시키는 것, 및 장내 염증을 변경시키는 것을 포함한다. 이는, 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, 생체내 검정에서 평가할 수 있으며, 여기서 장, 또는 이의 일부의 질량 및 투과성은, 시험 동물이 치료되거나 GLP-2 유사체에 노출된 후에 측정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 서열 His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp을 갖는 야생형 GLP-2 (1-33)에 대해 60% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 GLP-2 유사체는 약 50% 내지 88%의 서열 동일성, 예를 들면, 약 60% 내지 80% 및 소정 실시형태에서는 63%, 66%, 또는 69% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
GLP-2 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 서열을 정렬하여 갭(gap)을 도입하여, 필요에 따라, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 야생형 GLP-2 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보물 서열 내의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의하며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지는 않는다. 서열 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST2 또는 Align 소프트웨어와 같은 공공의 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 사용하여 숙련가에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996), Pearson et al., Genomics-46: 24-36, 1997], 및 molbiol. soton.ac.uk/compute/align에서 웹사이트 상의 정렬 프로그램을 참조한다.
본원에서 상요되고 본 발명에 따른 서열 동일성 퍼센트는, 이들의 디폴트 셋팅을 지닌 이들 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 보다 일반적으로, 숙련된 작업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 요구되는 임의의 알고리즘도 포함하는, 정렬을 측정하기에 적절한 매개변수을 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 X2, X3, X5, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X15, X16, X17, X20, X21, X24, X27, X28, X29, X30, X31, X32 및 X33 위치에서 하나 이상의 치환(즉, 상기 제공된 야생형 GLP-2 서열과 관련하여 하나 이상의 치환)을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 X2, X3, X5, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X15, X16, X17, X20, X21, X24, X27, X28, X29, X30, X31 , X32 및 X33 위치에서 하나 이상의 치환(즉, 상기 제공된 야생형 GLP-2 서열과 관련하여 하나 이상의 치환)을 포함한다.
일부 실시형태에서, X28, X29, X30, X31, X32 및 X33 위치에서 아미노산 잔기는 임의로 결실된다.
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은, 천연의 GLP-2 펩타이드 서열내에서 발견된 Leu 대신에, 천연의 GLP-2 펩타이드 서열의 17번 위치에 상응하는 위치에서 극성 또는 하전된 잔기(예를 들면, Gln, Lys 또는 Glu)가 GLP-1 수용체와 상호작용하여 이를 활성화시킬 수 있는 것으로 믿고 있다. 따라서, 17번 위치에서 극성의 또는 하전된 아미노산은 GLP-2 펩타이드 또는 이의 유사체의 수용체 선택성을 변경시켜, GLP-1 및 GLP-2 수용체 둘 다를 활성화시키는 이원 작용성 펩타이드를 생성할 수 있다.
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은, 16번 위치에서 소 아미노산 잔기(예를 들면, Gly, Ser 또는 Ala)가 GLP-2 펩타이드 유사체의 GLP-1 수용체 활성을 도입하거나 향상시키는데 바람직할 수 있다고 믿고 있다. 그러나, 17번 위치에서 아미노산이 극성이거나 하전되는 한 다른 아미노산 치환을 지닌 향상된 GLP-1 수용체 활성을 수득하는 것이, 또한, 가능할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 기술된 바와 같은 GLP-2 유사체는, 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치 중 하나 이상에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 기술된 GLP-2 유사체는, 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치 중 하나 이상에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 기술된 바와 같은 GLP-2 유사체는, 16, 17, 20 및 24번 위치 중 하나 이상에 접합된 친지성 치환체를 포함한다.
본 발명의 예시적인 화합물(화학식 I, 화학식 Ia 또는 화학식 II로부터 유도됨)은 하기 기술되어 있으며, 여기서, 상기 화합물은 R1 및 R2에 대해 기술된 바와 같이 N-말단 및 C-말단에서 변형될 수 있으며, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함한다:
Hy-H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD-OH (화합물 1);
Hy-HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKITD-OH (화합물 2);
Hy-HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK-NH2 (화합물 3);
Hy-HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD-OH (화합물 4);
Hy-HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD-OH (화합물 5);
Hy-HGEGTFTSDLSKQMESKAARDFIEWLIQTKITD-OH (화합물 6);
Hy-HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD-OH (화합물 7);
Hy-HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD-OH (화합물 8);
Hy-HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD-OH (화합물 9);
Hy-H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK-NH2 (화합물 10);
Hy-HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD-OH (화합물 11);
Hy-HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK-NH2 (화합물 12);
Hy-HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD-OH (화합물 13).
일부 실시형태에서, 본 발명은, 위장 염증, 예를 들면, 당뇨병과 관련된 저 수준의 위장 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 임의로, 발현 벡터의 발현을 지시하는 서열과 조합된, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는 숙주 세포는 GLP-2 유사체를 발현하여 분비할 수 있다. 다른 추가의 양상에서, 본 발명은, GLP-2 유사체를 발현하고 이로써 생산되는 GLP-2 유사체를 정제하기에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함을 포함하는, GLP-2 유사체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 추가로, 치료요법에 사용하기 위한, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 GLP-2 유사체를 발현하고 분비할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포는, GLP-2 유사체 자체로 치료할 수 있는 본원에 기술된 장애들 중 어느 하나의 치료를 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 치료학적 조성물, 또는 본 발명의 GLP-2 유사체의 투여에 대한 참조는, 내용이 달리 요구하는 경우를 제외하고는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 투여를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 위장 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조시, 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 발현 벡터, 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 당뇨병과 관련된 저 수준의 위장 염증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여함을 포함하는, 당뇨병과 관련된 저 수준의 위장 염증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 당뇨병과 관련된 저 수준의 위장 염증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 천연의 GLP-2와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역전, 또는 부가를 갖는다. 당해 정의는, 또한, 동의의 용어 GLP-2 모사체 및/또는 GLP-2 작용제를 포함한다. 또한, 본 발명의 유사체는 추가로 이의 아미노산 측쇄 그룹, α-탄소 원자, 말단 아미노 그룹, 또는 말단 카복실산 그룹 중 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 화학적 변형으로는 화학적 모이어티를 첨가하고, 신규 결합을 생성하며, 화학적 모이어티를 제거함이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 아미노산 측쇄 그룹에서의 변형은 라이신 ε-아미노 그룹의 아실화, 아르기닌, 히스티딘, 또는 라이신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트성 카복실산 그룹의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. N-말단 아미노 그룹의 변형은 데스-아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬, 및 N-아실 변형을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. C-말단 카복시 그룹의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 디알킬 아미드, 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 저급 알킬은 C1-C4 알킬이다. 또한, 측쇄 또는 말단 그룹에서 하나 이상의 기능성 그룹은, 숙련된 작업자에게 공지되어 있는 보호 그룹으로 보호될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산의 알파-탄소는 모노- 또는 디-메틸화될 수 있다.
존재하는 경우, 산화적으로 안정한 Met-대체 아미노산은, Met(O)(메티오닌 설폭사이드), Met(0)2(메티오닌 설폰), Val, Ile, Ser 및 바람직하게는 Ile, Leu, Val, Lys 또는 Ser으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것을 의미한다.
친지성 치환체
본 발명의 내용에서 사용된 화합물 내의 아미노산 측쇄들 중 하나 이상은 친지성 치환체 Z1에 접합될 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 본 발명자들은, 친지성 치환체가 혈류 중의 알부민에 결합함으로써 본 발명의 내용에서 사용된 화합물을 효소적 분해로부터 차폐시켜 화합물의 반감기를 향상시킬 수 있는 것으로 믿고 있다. 친지성 치환체는, 또한, 예를 들면, GLP-2 수용체 및/또는 GLP-1 수용체와 관련하여, 화합물의 효력을 조절할 수 있다.
소정 실시형태에서, 단지 하나의 아미노산 측쇄만이 친지성 치환체에 접합된다. 다른 실시형태에서 2개의 아미노산 측쇄는 친지성 치환체에 각각 접합된다. 다른 추가의 실시형태에서, 3개 이상의 아미노산 측쇄는 각각 친지성 치환체에 접합된다. 화합물이 2개 이상의 친지성 치환체를 함유하는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 치환체일 수 있다.
친지성 치환체 Z1은 아미노산 측쇄에서 원자에 공유결합적으로 결합될 수 있거나, 대안으로는 하나 이상의 스페이서(spacer) Z2에 의해 아미노산 측쇄에 접합될 수 있다.
용어 "접합된"은, 본원에서 다른 것에 대한 하나의 식별가능한 화학적 모이어티의 공유결합적 부착, 및 이러한 모이어티 사이의 구조적 관계를 기술하기 위해 사용된다. 임의의 특정 합성 방법을 내포하는 것으로 고려되어서는 안된다. 하나 이상의 스페이서 Z2는, 존재하는 경우, 화합물과 친지성 모이어티 사이에 공간을 제공하는데 사용된다.
친지성 치환체는, 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드를 통해 스페이서에 또는 아미노산 측쇄에 부착될 수 있다. 따라서, 친지성 치환체는, 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드의 일부를 형성하는 아실 그룹, 설포닐 그룹, N 원자, O 원자 또는 S 원자를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 친지성 치환체 중의 아실 그룹은, 아미노산 측쇄 또는 스페이서를 지닌 아미드 또는 에스테르의 부분을 형성한다. 친지성 치환체는, 10 내지 24개의 탄소(C) 원자, 예를 들면, 10 내지 20개의 C 원자를 갖는 탄화수소 쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는 이는, 11개 이상의 C 원자를 가지며, 바람직하게는 이는 18개 이하의 C 원자를 가진다. 예를 들면, 탄화수소 쇄는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 원자들을 함유할 수 있다. 탄화수소 쇄는 직쇄상 또는 분기쇄상일 수 있으며, 포화되거나 불포화될 수 있다. 상기 논의로부터, 탄화수소 쇄는, 바람직하게는 아미노산 측쇄 또는 스페이서에 대한 부착 부분을 형성하는 모이어티, 예를 들면, 아실 그룹, 설포닐 그룹, N 원자, O 원자 또는 S 원자로 치환됨이 이해될 것이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 쇄는 아실 그룹으로 치환되며, 따라서, 탄화수소 쇄는 알카노일 그룹, 예를 들면, 도데카노일, 2-부틸옥타노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 헵타데카노일, 옥타데카노일 또는 에이코사노일 그룹의 부분일 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 친지성 치환체 Z1은 하나 이상의 스페이서 Z2에 의해 아미노산 측쇄에 접합될 수 있다. 존재하는 경우, 스페이서는 친지성 치환체 및 아미노산 측쇄에 부착된다. 스페이서는 친지성 치환체 및 아미노산 측쇄에 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드에 의해 독립적으로 부착될 수 있다. 따라서, 이는 아실, 설포닐, N 원자, O 원자 또는 S 원자로부터 독립적으로 선택되는 2개의 모이어티를 포함할 수 있다. 스페이서는 직쇄상 C1 -10 탄화수소 쇄 또는 보다 바람직하게는 직쇄상의 C1 -5 탄화수소 쇄로 이루어질 수 있다. 또한, 스페이서는 C1 -6 알킬, C1 -6 알킬 아민, C1 -6 알킬 하이드록시 및 C1 -6 알킬 카복시로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
스페이서는, 예를 들면, 임의의 천연 발생 또는 비천연의 아미노산의 잔기일 수 있다. 예를 들면, 스페이서는, Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, ε-Lys, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, β-Ala(즉, 3-아미노프로파노일), 4-아미노부타노일, 5-아미노펜타노일, 6-아미노헥사노일, 7-아미노헵타노일, 8-아미노옥타노일, 9-아미노노나노일, 10-아미노데카노일 또는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일의 잔기일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 Glu, γ-Glu, ε-Lys, β-Ala(즉, 3-아미노프로파노일), 4-아미노부타노일, 8-아미노옥타노일 또는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노일의 잔기이다. 본 발명에서, γ-Glu 및 이소Glu는 상호교환적으로 사용된다. 친지성 치환체가 접합되는 아미노산 측쇄는, Glu, Lys, Ser, Cys, Dbu, Dpr 또는 Orn 잔기의 측쇄일 수 있다. 예를 들면, 이는 Lys, Glu 또는 Cys 잔기의 측쇄일 수 있다. 2개 이상의 측쇄가 친지성 치환체를 수반하는 경우, 이들은 이들 잔기로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 아미노산 측쇄는 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 또는 스페이서 또는 친지성 치환체를 지닌 설폰아미드를 형성하기 위한 카복시, 하이드록실, 티올, 아미드 또는 아민 그룹을 포함한다.
친지성 모이어티 Z1 및 스페이서 Z2를 포함하는 친지성 치환체의 예는 하기 식으로 나타낸다:
Figure pct00002
여기서, Lys 잔기의 측쇄는, 아미드 결합을 통해 γ-Glu 스페이서(Z2)에 공유결합적으로 부착된다. 헥사데카노일 그룹(Z1)은, 아미드 결합을 통해 γ-Glu 스페이서에 공유결합으로 부착된다. Lys 잔기에 접합된 친지성 모이어티 및 스페이서의 조합은, 예를 들면, 특정 화합물의 화학식에서 나타낸 경우, 약칭해서 K(헥사데카노일-γ-Glu)로 언급될 수 있다. γ-Glu는, 또한, 이소Glu로 언급될 수 있으며, 헥사데카노일 그룹은 팔미토일 그룹으로서 언급될 수 있다. 따라서, 표기법(헥사데카노일-γ-Glu)는, 예를 들면, PCT/GB2008/004121에 사용된 바와 같은 표기법(이소Glu(Palm)) 또는 (이소Glu(팔미토일)과 등가이다.
당해 분야의 숙련가는, 본 발명의 내용에서 사용된 화합물을 제조하기에 적합한 기술을 잘 알 것이다. 적합한 화학의 예의 경우, 예를 들면, 본원에서 인용에 의해 포함되는, WO98/08871, WO00/55184, WO00/55119, Madsen et al., J. Med. Chem. 50: 6126-32 (2007), 및 Knudsen et al., J. Med Chem. 43: 1664-1669 (2000)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 천연의 GLP-2의 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치에 상응하는 위치들 중 하나 이상에서 아미노산에 접합된 상기 기술된 바와 같은 친지성 치환체를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 천연의 GLP-2의 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치에 상응하는 위치들 중 하나 이상에서 아미노산에 접합된 상기 기술된 바와 같은 친지성 치환체를 갖는다.
본 발명의 펩타이드는 염 또는 다른 유도체의 형태로 제공될 수도 있음을 이해하여야 한다. 염으로는 산 부가염 및 염기성 염과 같은 약제학적으로 허용되는 염이 포함된다. 산 부가염의 예로는 염화수소염, 시트레이트 염, 락테이트 염, 말레이트 염 및 아세테이트 염이 포함된다. 염기성 염의 예로는, 양이온이 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 암모늄 이온 +N(R3)3(R4)(여기서, R3 및 R4는 임의로 치환된 C1 -6-알킬, 임의로 치환된 C2 -6-알케닐, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴을 독립적으로 나타낸다)로부터 선택되는 염이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 염의 다른 예는, 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 및 보다 최근의 편집본, 및 the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology]에 기술되어 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체의 다른 유도체로는, Mn2 + 및 Zn2 +와 같은 금속 이온, 생체내 가수분해가능한 에스테르와 같은 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물, 전구약물 또는 지질과의 배위 복합체가 포함된다. 에스테르는, 화합물 및 적절한 카복실산 또는 알코올 반응 파트너 중에 존재하는 하이드록실 또는 카복실산 그룹 사이에서 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 사용하여 형성시킬 수 있다. 화합물의 전구약물인 유도체는 모 화합물 중의 하나로 생체내 또는 시험관내 전환가능하다. 전형적으로, 화합물의 생물학적 활성 중 하나 이상은 화합물의 전구약물 형태로 환원될 것이며, 전구약물의 전환에 의해 활성화되어 화합물 또는 이의 대사산물로 방출될 수 있다. 전구약물의 예는 제거되어 반응계내에 활성 화합물을 방출할 수 있거나 생체내에서 약물의 청소를 저해하기 위해 작용될 수 있는 보호 그룹의 사용을 포함한다.
EC50 값이 1nM 이하이고, 바람직하게는 1nM 미만인 GLP-2 유사체가 GLP-2 작용제로서 정의된다.
본 발명은, 하기 실험에 추가로 기술된 하기 펩타이드를 포함한다.
GLP-2 유사체의 합성
고체 상 또는 액체 상 펩타이드 합성에 의해 본 발명의 유사체를 합성하는 것이 바람직하다. 당해 내용에서, 기술자는 PCT 공보 WO 98/11125 및 문헌[참조: Fields, GB et al,, 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis" in: Synthetic Peptides (2nd Edition)(본원에 인용에 의해 포함됨)] 및 본원의 실시예를 참조할 수 있다.
따라서, GLP-2 유사체는, 예를 들면,
(a) 고체 상 또는 액체 상 펩타이드 합성 방법에 의해 펩타이드를 합성하여 이로써 수득된 합성 펩타이드를 회수하는 단계;
(b) 펩타이드가 천연 발생 아미노산으로 이루어진 경우, 숙주 세포 내에서 펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물을 발현시키고, 당해 숙주 세포 배양물로부터 발현 생성물을 회수하는 단계;
(c) 펩타이드가 천연 발생 아미노산으로 이루어진 경우, 펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물의 시험관내 세포-유리 발현에 영향을 미쳐 당해 발현 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 방법; 또는
(a), (b), 및 (c)의 방법의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 후속적으로 당해 단편들을 결합(예를 들면, 라이게이션)시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수함을 포함하는, 다수의 방법으로 합성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 유사체의 경우, 유전자 조작 기술을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 이는, 펩타이드가 충분히 큰 경우(또는 융합 작제물로서 생산됨), 및 펩타이드가 살아있는 유기체에서 RNA로부터 번역될 수 있는 천연 발생 아미노산만을 포함하는 경우일 수 있다.
재조합체 유전자 기술의 목적을 위해, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 단편은 중요한 화학적 생성물이다. 따라서, 본 발명의 추가의 양상은, 본 발명의 GLP-2 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서, 펩타이드는 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 이루어진다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편일 수 있다.
본 발명의 핵산 단편은, 일반적으로, 적합한 벡터 내에 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 수반하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성할 것이다. 이러한 신규 벡터는, 또한, 본 발명의 일부이다. 본 발명의 이러한 벡터의 작제에 관한 세부사항은, 하기 형질전환된 세포 및 미생물의 내용에서 논의될 것이다. 벡터는, 출원 목적 및 유형에 따라, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체, 또는 바이러스 형태로 존재할 수 있지만, 소정 세포 내에서 일시적으로만 발현되는 네이키드(naked) DNA가 또한 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터(플라스미드 벡터)는 자가 복제할 수 있으므로, 후속적인 클로닝을 위한 고-수준 발현 또는 고-수준 복제의 목적을 위한 고-카피 수(high copy-number)를 가능하게 한다.
본 발명의 벡터의 일반적인 개요는, 5'로부터 3'로의 방향에서의 그리고 작동가능한 연결에서의 하기 특징을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 구동하기 위한 프로모터, 임의로, 폴리펩타이드 단편, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 단편의 분비(세포외 상으로 또는, 경우에 따라 주변 세포질 내로)를 가능하게 하는 리더 펩타이드 또는 다중 용도, 예를 들면 폴리펩타이드 단편, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 단편의 막 내로의 통합 또는 펩타이드를 수정하기 위한 조합된 분비, 정제 태크(tag) 및 효소적 트리밍을 위한 리더 펩타이드, 및 임의로 터미네이터(terminator)를 암호화하는 핵산 서열. 생산자 균주 또는 세포주 내에서 발현 벡터를 사용하여 작동시키는 경우, 형질전환된 세포의 유전적 안전성의 목적을 위해 숙주 세포내로 도입되는 경우의 벡터가 숙주 세포 게놈속에서 통합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 GLP-2 유사체를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 부분인 이러한 형질전환된 세포는, 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용된 배양된 세포 또는 세포주일 수 있거나, 본 발명의 펩타이드의 재조합체 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환된 세포는, 예를 들면, 에스케리키아 속(예를 들면, 이. 콜라이[E. coli)], 바실러스[예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)], 살모넬라, 또는 마이코박테리움[바람직하게는 비병원성, 예를 들면, 엠. 보비스(M. bovis) BCG], 효모[예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)]로부터의 세균을 포함하는 세균과 같은 미생물, 및 원생동물이다. 대안으로, 형질전환된 세포는 다중세포 유기체, 예를 들면, 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포(예를 들면, 사람으로부터 유도된 세포)로부터 유도될 수 있다. 클로닝 및/또는 최적화된 발현의 목적을 위하여, 형질전환된 세포는, 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 핵산 단편을 발현하는 세포는, 본 발명의 바람직한 유용한 실시형태이다. 이들은 본 발명의 펩타이드의 소 규모 또는 대 규모 제조를 위해 사용될 수 있다.
형질전환된 세포의 수단에 의해 본 발명의 펩타이드를 생산하는 경우, 비록 필수적이지는 않다고 해도, 세포가 발현 생성물을 배양 배지 내로 배출하거나 발현 생성물을 형질전환된 세포의 표면에 운반하는 것이 편리하다.
효과적인 생산자 세포가 확인되는 경우, 이를 기반으로, 본 발명의 벡터를 운반하고 펩타이드를 암호화하는 핵산 단편을 발현하는, 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 당해 안정한 세포주는 본 발명의 펩타이드를 분비하거나 운반함으로써 이의 정제를 가능하게 한다.
일반적으로, 숙주 세포와 혼용성인 종으로부터 유도된, 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 숙주와 관련하여 사용한다. 벡터는 보통 복제 부위, 및 형질전환된 세포 내에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹(marking) 서열을 수반한다. 예를 들면, 이. 콜라이는 이. 콜라이 종으로부터 유도된 플라스미드인 pBR322(비록 다수의 다른 유용한 플라스미드가 존재한다고 해도)를 사용하여 전형적으로 형질전환시킬 수 있다(예를 들면, Bolivar et al., 1977 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR 플라스미드, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는, 또한, 발현을 위한 원핵세포 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하여야만 하거나, 함유하도록 변형되어야만 한다.
원핵세포성 재조합체 DNA 작제물에서 가장 일반적으로 사용되는 이들 프로모터는 베타-락타마제(페니실린) 및 락토스 프로모터 시스템(참조: Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템(참조: Goeddel et al., 1979; EP 0 036 776 A)을 포함한다. 이들이 가장 일반적으로 사용된다고 해도, 다른 미생물 프로모터가 발견되어 이용되어 왔으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 세부사항은 공개되어 숙련가가 이들을 플라스미드 벡터와 기능적으로 연결하는 것을 가능하게 할 수 있다(참조: Siebwenlist et al., 1980).
원핵세포 이외에, 효모 배양물과 같은 진핵세포 미생물을 또한 사용할 수 있다. 이들 실시형태에서, 프로모터는, 또한, 발현을 구동할 수 있어야만 한다. 다수의 다른 균주가 일반적으로 이용가능하지만, 사카로마이세스 세레비지아에, 또는 일반적인 제빵 효모가 진핵세포 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 예를 들면, 피키아 스팁티스(Pichia stiptis) 및 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)가 또한 사용될 수 있다. 사카로마이세스 내에서의 발현을 위해, 예를 들면, 플라스미드 YRp7이 일반적으로 사용된다(참조: Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). 당해 플라스미드는, 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결여되어 있는 효모의 돌연변이체 균주에 대한 선택 마커를 제공하는 trpl 유전자를 이미 함유하고 있다(예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1)(참조: Jones, 1977). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병변의 존재는, 이어서, 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터내에서 적합한 촉진 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제(참조: Hitzman et al., 1980) 또는 다른 당분해 효소(참조: Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), 예를 들면, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다. 적합한 발현 플라스미드를 작제하는데 있어서, 이들 유전자와 관련된 종결 서열은, 또한, mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공하도록 발현되기에 바람직한 서열의 발현 벡터 3'내에 라이게이션된다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 추가의 이점을 갖는 다른 프로모터들은, 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 및 상기 언급된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소를 위한 프로모터 영역이다. 효모-혼용성 프로모터, 복제의 기원 및 종결 서열을 함유하는 임의의 플라스미드 벡터가 적합하다.
미생물 이외에, 다세포 유기체로부터 유도되는 세포의 배양물을, 또한, 숙주로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 임의의 이러한 세포 배양물도 척추동물 또는 무척추동물 배양물 유래에 관계없이 작업가능하다. 그러나, 척추동물 세포에서 관심이 최대가 되어 왔으며, 배양물(조직 배양물) 중의 척추동물의 증식은 최근 수년 내에 통상의 절차가 되어 왔다(참조: Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda: SF) 세포[미국 코네티컷주 06450 메리덴, 리서치 파크웨이 1000 소재의 프로테인 사이언시즈(Protein Sciences) 및 인비트로겐(Invitrogen)으로부터의 완전한 발현 시스템으로서 상업적으로 이용가능함], 네덜란드 그로닝겐 씨에이치 9704 피오박스 2312 소재의 인비트로겐으로부터 이용가능한 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 세포주 S2이다.
이러한 세포에 대한 발현 벡터는, 통상적으로 임의의 필수적인 리보소옴 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열과 함께, 발현될 유전자의 앞에 위치한 복제 기원(경우에 따라), 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터 상의 제어 기능은 흔히 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들면, 일반적으로 사용된 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 가장 빈번하게는 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40)으로부터 유도된다. SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터(early and late promoter)는, 둘 다 SV40 바이러스 복제 기원도 함유하는, 단편으로서의 바이러스로부터 용이하게 수득되므로 특히 유용하다(참조: Fiers et al., 1978). 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편도, 또한, 사용할 수 있으며, 단, 바이러스 복제 기원 내에 위치하는 BglI 부위에 대해 HindIII 부위로부터 연장하는 대략 250bp 서열을 포함한다. 또한, 바람직한 유전자 서열과 일반적으로 관련된 프로모터 또는 제어 서열을 이용하는 것이 가능하고, 또한 바람직하며, 단, 이러한 제어 서열은 숙주 세포 시스템과 혼용성이다.
복제 기원은 SV40 또는 다른 바이러스(예를 들면, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 외인성 기원을 포함하도록 벡터를 작제함으로써 제공될 수 있거나, 숙주 세포 염색체 복제 메커니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 경우, 후자가 흔히 충분하다.
재조합체 생산 공정에서 만족스러운 수율을 수득하기 위하여, 펩타이드를 친화성 태그(정제의 용이성을 위해)로서 작용할 수 있는 융합 파트너에 융합시킴으로써, 그리고/또는 펩타이드의 다중 반복물을 가짐으로써, 융합 단백질로서의 유사체를 제조하는 것이 유리할 수 있다. 당해 방법은 펩티다제에 적합한 절단 부위의 존재를 필요로 한다. 숙련가는 잠재하는 유전자 작제물을 조정하는 방법을 알 것이다.
재조합체 제조 후, 본 발명의 펩타이드는 다중-단계 크로마토그래피(예를 들면, 이온-교환, 크기-배제, 및 친화성 크로마토그래피 기술)을 포함하는, 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.
대안으로, 천연 발생 아미노산으로 구성된 펩타이드는, 세포 유리 시스템 내에서 시험관 내에서 제조할 수 있다. 이는, 특히, 펩타이드가 추정의 숙주 세포에 대해 독성일 수 있는 경우 편리하다. 따라서, 본 발명은, 또한, 본 발명의 펩타이드를 제조하기 위하여 세포-유리 시험관내 번역/발현의 사용을 고려한다. 당해 내용에서, 미국 텍사스주 78744-1832 오스틴 우드워드 2130 소재의 암비온 인크.(Ambion Inc.)로부터의 시판되는 시험관내 번역 키트, 물질, 및 기술적 서류에 대한 참조가 이루어진다.
최종적으로, 이용가능한 방법을 물론 조합하여, 예를 들면, 반-합성 유사체를 제조할 수 있다. 이러한 설정에서, 펩타이드 단편은 2개 이상의 별개의 단계 또는 방법으로 단편을 연결(예를 들면, 라이게이션)함으로써 제조하여 최종의 펩타이드 생성물을 수득할 수 있다.
생물학적 활성
전형적으로, 본 발명의 GLP-2 유사체는 GLP-1 및 GLP-2 수용체 둘 다에서 활성을 갖는다.
EC50 값은, 제공된 수용체에서 작용제 효능의 수치적 척도로서 사용될 수 있다. EC50 값은, 특정 검정에서 화합물의 최대 활성의 1/2을 달성하는데 요구되는 화합물의 농도의 척도이다. 동일한 검정에서 참조 화합물의 EC50보다 낮은 특정 수용체에서 EC50을 갖는 화합물은, 참조 화합물보다 수용체에서 보다 높은 효력을 갖는 것으로 고려될 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체는 전형적으로 야생형 사람 GLP-2(hGLP-2)보다 GLP-1 수용체(예를 들면, 사람 GLP-1 수용체)에서 보다 높은 활성을 갖는다. 따라서, GLP-1 활성을 위한 임의의 제공된 검정에서, GLP-2 유사체는, 야생형 사람 GLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2(즉, 2번 위치에서 글리신을 갖는 사람 GLP-2, 또한 테두글루타이드로서도 공지됨)보다 낮은 EC50을 가질 것이다. 따라서, 동일한 GLP-1 활성 검정에서 평가하는 경우, GLP-2 유사체의 EC50 대 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2의 EC50의 비는 전형적으로 1 미만이다. 이는, 예를 들면, 0.5 미만, 또는 0.1 미만, 또는 0.01 미만일 수 있다.
GLP-1 수용체에서 EC50은, 예를 들면, 실시에 1에서 기술된 GLP-1 수용체 효능 검정을 사용하여 평가하는 경우, 100nM 미만, 50nM 미만, 10nM 미만, 또는 보다 바람직하게는 1.0nM 미만, 0.9nM 미만, 0.8nM 미만, 0.7nM 미만, 0.6nM 미만, 0.5nM 미만, 0.4nM 미만, 0.3nM 미만, 0.2nM 미만, 0.1nM 미만, 0.09nM 미만, 0.08nM 미만, 0.07nM 미만, 0.06nM 미만, 0.05nM 미만, 0.04nM 미만, 0.03nM 미만, 0.02nM 미만, 0.01nM 미만, 0.009nM 미만, 0.008nM 미만, 0.007nM 미만, 0.006nM, 또는 0.005nM 미만일 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체는, GLP-2 수용체에서 이들의 효능이 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2의 효능과 동일할 필요가 없지만, GLP-2 활성을 보유한다. 이들은, 적당한 수준의 GLP-2 활성이 보유되는 한 보다 낮은 효능을 가질 수 있다. GLP-2 활성에 대해 임의의 제공된 검정에서, GLP-2 유사체는 야생형 사람 GLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2보다 더 낮거나 더 높은 EC50을 가질 수 있다. 동일한 GLP-2 활성 검정에서 평가하는 경우, 동일한 검정에서 GLP-2 유사체의 EC50 대 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2의 EC50의 비는, 예를 들면, 200 미만, 100 미만, 10 미만, 5 미만, 1 미만, 0.1 미만, 0.5 미만 또는 0.1 미만일 수 있다.
본 발명의 유사체 및 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2에 대한 GLP-2 및 GLP-1 수용체에서 EC50 값의 비를 비교하는 것도, 또한, 바람직할 수 있다. 바람직하게는, GLP-2 및 GLP-1 검정의 임의의 제공된 쌍의 경우, 본 발명의 유사체는 동일한 검정에서 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2에 대해 등가의 비보다 더 높은 EC50[GLP-2] / EC50[GLP-1]을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 유사체에 대한 비는 hGLP-2 또는 [Gly2]-hGLP-2에 대한 비보다 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상일 수 있다.
약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체는, 약제학적으로 허용되는 담체 중에 저장 또는 투여를 위해 제조되고, 본 발명의 GLP-2 펩타이드, 또는 이의 염 또는 유도체의 치료학적 유효량을 포함하는, 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료학적 유효량은 고려 하에 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 및 특정 포유동물의 물리적 특성에 의존할 것이다. 이들 인자 및 당해 양을 측정하기 위한 이들의 관계는 의학 분야에서 숙련의에게 익히 알려져 있다. 당해 투여의 양 및 방법은 펩타이드를 대장에 전달하기 위한 최적의 효능을 달성하기 위해 조정될 수 있지만 의학 분야에서 숙련가에게 잘 공지된, 체중, 식이, 현재 의약 및 다른 인자에 의존할 것이다.
본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염이 위 및 장-관련 장애를 치료하거나 예방하는데 효과적인 양으로 존재하는 약제학적 조성물을 제공하는 것은, 본 발명의 범위 내이다.
산성 모이어티를 갖는 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 유기 및 무기 염기를 사용하여 형성시킬 수 있다. 염기와 함께 형성된 적합한 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토 금속 염, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 또는 마그네슘 염과 같은 금속 염; 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 모노-, 디- 또는 트리-저급 알킬아민(예를 들면, 에틸-3급-부틸-, 디에틸-, 디이소프로필-, 트리에틸-, 트리부틸- 또는 디메틸프로필아민), 또는 모노-, 디- 또는 트리하이드록시 저급 알킬아민(예를 들면, 모노-, 디- 또는 트리에탄올아민)과 함께 형성된 것들과 같은 암모니아 염 및 유기 아민 염을 포함한다. 내부 염도, 또한, 형성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물이 염기성 모이어티를 함유하는 경우, 염은 유기 및 무기 산을 사용하여 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 염은, 하기 산: 아세트산, 프로피온산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 만델산, 말산, 프탈산, 염산, 하이드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 및 캄포르설폰산, 및 다른 공지의 약제학적으로 허용되는 산으로부터 형성될 수 있다. 아미노산 부가 염도, 또한, 라이신, 글리신, 및 페닐알라닌과 같은 아미노산과 함께 형성될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 또는 약제학적 조성물의 "치료학적 유효량"은 연령, 체중 및 치료되는 포유동물 종, 사용되는 특정 화합물, 특정 투여 방식 및 요구되는 효과 및 치료학적 처방에 따라 변할 것이다. 이들 인자 및 당해 양을 측정하기 위한 이들의 관계가 익히 공지되어 있으므로, 치료학적 유효 용량 수준, 본원에 기술된 장 및 위 관련 질환을 예방하고/하거나 치료하는 목적한 결과를 달성하는데 필요한 양, 및 본원에 개시된 다른 의학적 처방은 숙련가의 기술 내에 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 유효량"은, 병태 또는 병리학을 지닌 개체에서 제공된 병태 또는 병리학의 증상을 감소시키고, 바람직하게는 생리학적 반응을 표준화시키는 것이다. 생리학적 반응의 증상의 감소 또는 표준화는 당해 분야의 통상의 방법을 사용하여 측정할 수 있으며, 제공된 병태 또는 병리학에 따라 변할 수 있다. 하나의 양상에서, 본 발명의 하나 이상의 GLP-2 유사체, 또는 본 발명의 하나 이상의 GLP-2 유사체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은, 병태 또는 병리학이 없는 개체에서 측정가능한 생리학적 매개변수의 실질적으로 동일한 값(바람직하게는 당해 값의 30% 이내, 보다 바람직하게는 20% 이내, 및 더욱 더 바람직하게는 10% 이내)으로 측정가능한 생리학적 매개변수를 회복시키는 양이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물의 투여는, 장 및 위 관련 질환과 같은 관련된 의학적 지표를 예방/치료하는 목적한 효과가 달성될 때까지 용량 수준을 증가시키면서, 보다 적은 용량 수준으로 개시한다. 이는 치료학적 유효량으로 정의할 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 경우, 약제학적 조성물 단독 또는 이의 일부로서, 이러한 용량은, 약 0.01mg/kg 내지 100mg/kg 체중, 예를 들면, 10 내지 100마이크로그람/kg 체중과 같이 약 0.01mg/kg 내지 10mg/kg 체중일 수 있다.
치료학적 용도를 위하여, 본 발명의 GLP-2 유사체는, 약제학적으로 허용되고 선택된 투여 경로에 의해 펩타이드를 전달하기에 적절한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 말초 비경구 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여 경로를 포함한다. 본 발명에서 사용된 소정의 화합물은, 또한, 경구, 직장, 비강, 또는 하부 호흡기 경로에 의한 투여로 조절할 수 있다. 이들은 소위 비-비경구 경로이다. 당해 약제학적 조성물은, 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제, 및 부형제 등과 같은 펩타이드-계 약물과 함께 통상적으로 사용된 것들이다. 치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 약제 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기술되어 있다. 예를 들면, 약산성 또는 생리학적 pH에서 멸균 염수 및 포스페이트-완충된 염수를 사용할 수 있다. 적합한 pH 완충제는 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 트리스/하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS), 중탄산 암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충제인 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 또는 아세테이트 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 소정 실시형태에서, 바람직한 완충제는, pH 4 내지 8, pH 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5의 범위이다. 파라, 메타, 및 오르토-크레졸, 메틸- 및 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알코올, 벤조산나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로판산, p-하이드록시벤조산의 에스테르와 같은 방부제를 약제학적 조성물 중에 제공할 수 있다. 산화, 탈아미드화, 이성체화, 라세미화, 폐환, 펩타이드 가수분해를 방지하는 안정화제, 예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 트립토판, EDTA, 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 글루타민 및 글리신을 약제학적 조성물 속에 제공할 수 있다. 응집, 피브릴화(fibrillation) 및 침전을 방지하는 안정화제, 예를 들면, 나트륨 도데실 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로즈, 사이클로덱스트린도, 또한, 약제학적 조성물 중에 제공될 수 있다. 에탄올, 아세트산 또는 아세테이트 및 이들의 염과 같은, 응집을 방지하거나 가용화를 위한 유기 개질제를 약제학적 조성물 중에 제공할 수 있다. 염, 예를 들면, 염화 나트륨과 같은 등장성 제조제 또는 가장 바람직한 탄수화물, 예를 들면, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 슈크로스 또는 이들의 혼합물이 약제학적 조성물 중에 제공될 수 있다.
트윈(Tween) 20, 트윈 80, SDS, 폴록사머, 예를 들면, 플루로닉(Pluronic) F-68, 플루로닉 F-127과 같은 세제를 본 발명의 약제학적 조성물 중에 제공할 수 있다. 염료 및 풍미제도, 또한, 약제학적 조성물 중에 제공할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 GLP-2 유사체의 약제학적으로 허용되는 산 부가염이 이를 위해 제공된다. 현탁화제도, 또한, 사용할 수 있다.
에탄올, 3급-부탄올, 2-프로판올, 에탄올, 글리세롤, 및 프로필렌 글리콜과 같은 유기 개질제를 동결건조된 생성물의 동결건조를 위해 약제학적 제형 중에 제공할 수 있다. 벌킹제(bulking agent) 및 등장성 제조제, 예를 들면, 염화나트륨과 같은 염, 탄수화물, 예를 들면, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 슈크로스와 같은 탄수화물 또는 이의 혼합물, 아미노산(예를 들면, 글리신 및 글루타메이트) 또는 시스테인, 레시틴 또는 사람 혈청 알부민, 또는 이의 혼합물과 같은 부형제를 동결건조를 위해 약제학적 조성물 중에 제공할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여용의 정제, 캅셀제 또는 엘릭서르제; 직장 투여용 좌제; 바람직하게는 주사가능한 투여를 위한 멸균 액제 또는 멸균 산제 또는 현탁제; 등으로서 제형화되어 사용될 수 있다. 용량 및 투여 방법은 최적의 효능을 달성하기 위해 조정될 수 있지만, 숙련가에게 인식될 수 있는, 체중, 식이, 현재 의약과 같은 인자에 의존할 것이다.
투여가 정맥내 및 피하 투여와 같은 비경구인 경우, 주사가능한 약제학적 조성물은 수용액 또는 현탁액; 동결건조된, 사용직전 재구성에 적합한 고체형 또는 주사 전 액체인 현탁제, 또는 유제로서 편리한 형태로 제조될 수 있다.
동결건조된 생성물의 재구성을 위한 희석제는, 예를 들면, 상기 나열된 완충제로부터 선택될 수 있거나, 물, 염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 슈크로스, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 하이드로클로라이드; 또는 트윈 20, 트윈 80, 폴록사머(예를 들면, 플루로닉 F-68 또는 플루로닉 F-127), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 세제가 첨가되고/되거나 파라-, 메타-, 및 오르토-크레졸, 메틸- 및 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알코올, 나트륨 벤조에이트, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로판산, p-하이드록시벤조산의 에스테르가 첨가되고/되거나 에탄올, 아세트산, 시트르산, 락트산 또는 이의 염과 같은 유기 개질제가 첨가된 주사용수로부터 선택될 수 있다.
또한, 경우에 따라, 주사가능한 약제학적 조성물은, 습윤제, 또는 pH 완충제와 같은 최소량의 무-독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 흡수 향상 제제(예를 들면, 리포좀, 세제 및 유기산)도, 또한, 이용할 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 화합물은, 예를 들면, 전체적인 비경구 영양 치료요법에서의 환자(예를 들면, 신생아, 또는 악액질 또는 거식증으로 고생하는 환자)를 위한 액체 영양 공급물로서 사용하는 경우, 주입에 의해, 또는 주사, 예를 들면, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여하기 위해 제형화되며, 따라서 멸균 및 발열원이 없는 형태의 수용액으로서 이용되며, 임의로 생리학적으로 허용되는 pH, 예를 들면, 약산성 또는 생리학적 pH로 완충된다. 근육내 투여용 제형은, 식물 오일, 예를 들면, 카놀라 오일, 옥수수 오일 또는 대두 오일 중의 액제 또는 현탁제를 기반으로 할 수 있다. 이들 오일계 제형은 항산화제, 예를 들면, BHA(부틸화된 하이드록시아니솔) 및 BHT(부틸화된 하이드록시톨루엔)에 의해 안정화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 증류수 또는 염수, 인산염 완충된 염수, 5% 덱스트로스 용액 또는 오일과 같은 비히클 중에 투여될 수 있다. 본 발명의 GLP-2 유사체의 용해도는 경우에 따라, 세제 및/또는 유화제와 같은 용해도 증진제를 혼입함으로써 향상시킬 수 있다.
수성 담체 또는 비히클을 주사 부위에 또는 근처에 GLP-2 유사체를 데포시키기 위해 제공되는 젤라틴의 양을 사용하여 주사가능한 용도로 보충함으로써 목적한 작용 부위에 대해 서방출을 제공할 수 있다. 하이알루론산과 같은 대안의 겔화제도, 또한, 데포 제제(depot agent)로서 유용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물은 단독으로, 또는 소염 효과를 가진 화합물과 함께 사용될 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 병용 치료는 본 발명의 펩타이드 유사체의 유리한 치료 효과를 보강할 수 있다.
환자 치료용으로 가장 적절한 치료학적 투약 및 용법은, 물론, 치료될 질환 또는 병태, 및 환자의 체중 및 다른 매개변수에 따라 변할 것이다. 임의의 특정 이론에 얽메이지 않고, 마이크로그람/kg 또는 mg/kg 범위 내의 용량, 및 보다 짧거나 긴 치료 기간 또는 치료 빈도가 특히 소장 덩어리에 있어서 통계적으로 유의한 증가와 같은 치료학적으로 유용한 결과를 생성할 수 있음이 기대된다. 일부 예에서, 치료학적 용법은, 초기 치료의 중지 후 발생하는 조직 퇴화를 방지하는데 적절한 유지 용량의 투여를 포함할 수 있다. 사람용으로 가장 적절한 용량 크기 및 투약 용법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 안내될 수 있으며, 적절하게 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다.
유효 용량 및 치료 프로토콜은, 실험실 동물에서 낮은 용량에서 출발한 후 효과를 모니터링하면서 용량을 증가시키고, 용량 용법을 또한 전신계적으로 변화시키는, 통상의 수단에 의해 측정할 수 있다. 제공된 대상체에 대한 최적의 용량을 결정하는 경우 다수의 인자가 임상의에 의해 고려될 수 있다. 이러한 고려는 숙련가에게 공지되어 있다.
한 실시형태에서, 본 발명에 따른 GLP-2 펩타이드의 사람 용량은, 약 10 마이크로그람/kg 체중/일 내지 약 10mg/kg/일, 바람직하게는 약 50마이크로그람/kg/일 내지 약 5mg/kg/일, 및 가장 바람직하게는 약 100 마이크로그람/kg/일 내지 1mg/kg/일일 수 있다.
의학적 병태
본 발명의 GLP-2 유사체는, 저 등급의 염증, 예를 들면, 국소적 또는 전신적 저 등급 염증으로 고생하는 개체를 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 제제로서 유용하다. 저 등급 염증으로는, 대사 증후군, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증 및 뇌졸중이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 위장 장애는 식도의 상부 위장관의 장애를 포함하며, 본원에 기술된 바와 같은, 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염의 유효량을 투여함으로써 치료될 수 있다. 위 및 장-관련된 장애로는, 임의의 병인학의 궤양(예를 들면, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약물-유도된 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양), 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환(예를 들면, 크론 질환 및 궤양성 결장염), 복강 스프루우(예를 들면, 글루텐 유도된 장병증 또는 복강 질환으로부터 발생함), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사가 포함된다.
위장 점막 신생물, 또는 위장 점막 신생물의 증가된 위험을 갖는 환자의 경우, 위장 점막 신생물의 자극 또는 응집과 같은 감소된 부작용의 위험을 감소시키거나 없애도록 화합물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체로 치료할 수 있는 특정 병태는 열로부터 알파-글리아딘에 대한 독성 반응을 초래하며 글루텐-유도된 장병증 또는 셀리악 질환의 결과일 수 있고, 소장의 융모(villa)의 유의한 손실에 의해 표시되는, 셀리악 스프루우; 감염으로부터 생성되고 융모의 부분적인 평편화에 의해 표시되는 열대성 스프루우; 일반적인 가변성 면역결핍증 또는 저감마글로불린혈증을 지닌 환자에서 일반적으로 관찰되고 융모 높이에 있어서 유의한 감소에 의해 표시되는 저감마글로불린성 스프루우를 포함하는 스프루우의 각종 형태를 포함한다. GLP-2 유사체 치료의 치료학적 효능은, 영양물 흡수의 생화학적 평가에 의해, 장 침투능의 비 침입성 측정에 의해, 환자 체중 증가에 의해, 또는 이들 병태와 관련된 증상의 완화에 의해 융모 형태를 실험하기 위한 장 생검으로 모니터링할 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체는, 임의의 병인학의 궤양(예를 들면, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약물-유도된 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양)을 포함하는 위 관련된 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 제제로서 유용할 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체로 치료할 수 있거나, GLP-2 유사체가 예방학적으로 유용할 수 있는 다른 병태는, 상기 언급한 방사선 장염 이외에, 감염성 또는 감염-후 장염, 및 암-화학 치료요법 또는 독성 제제로 인한 소장 손상을 포함한다.
GLP-2 유사체는, 또한, 영양실조, 예를 들면, 악액질 및 거식증의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는, 장 손상 및 기능이상의 예방 및/또는 치료를 위해 본 발명의 펩타이드를 사용하는 것에 관한 것이다. 소장 점막의 줄기 세포는 이들의 신속한 증식 속도로 인하여 화학 치료요법의 세포독성 효과에 특히 민감하다(참조: Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). 본 발명의 GLP-2 펩타이드 작용제의 투여는, 장 움(intestinal crypt)에서 영양 효과를 향상시킬 수 있으며, 새로운 세포를 신속히 제공하여 화학 치료요법 및/또는 방사선 치료요법 후 손상된 장 상피를 대체한다. 본 발명의 GLP-2 유사체를 투여함으로써 달성되는 목표는, 보다 공격적인 화학 치료요법, 방사선 및 병용 화학치료요법 및 방사선 치료요법에 대해 내성을 증가시키면서 화학 치료요법 치료를 겪는 환자의 위장 손상과 관련된 이환률을 감소시키는 것이다. 동시 예방적 또는 치료학적 치료는 본 발명에 따라 방사선 치료요법을 겪거나 겪을 환자에게 제공될 수 있다.
항-암 화학 치료요법 후 위장 점막염은, 비록 점진적으로 완화되고 있다고 해도, 일단 확립되면 필수적으로 치료 불가능한 증가하는 문제이다. 일반적으로 사용된 세포정지성 암 약물 5-FU 및 이리노테칸을 사용하여 수행된 연구는, 이들 약물을 사용한 효과적인 화학 치료요법이 소장의 구조적 통합성 및 기능에 주로 영향을 미치지만, 결장은 덜 민감하며 증가된 점막 형성과 주로 반응함을 입증하여 왔다[참조: Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31 (1):6-16, 2003].
다른 실시형태에서, 본 발명은, DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개된 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게 GLP-2 유사체, 또는 이의 염의 유효량을 투여함으로써 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개된 병태를 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 질환은, DPP-IV 효소가 과발현된 병태를 포함한다.
한 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 상기 기술된 바와 같은 상기 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체의 서방출을 야기하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는, 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염의 유효량을 투여함으로써 신생아를 치료하는 방법에서 사용할 수 있다. 장의 발달의 결여로 인하여 신생아에게 수유하는 것의 합병증은, 본 발명의 펩타이드 작용제를 사용하여 극복할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개된 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염의 유효량을 투여함으로써 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개된 병태를 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 질환은, DPP-IV 효소가 과발현된 병태를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양상을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일반적인 펩타이드 합성
장치 및 합성 전략
펩타이드는, N-α-아미노 보호 그룹 및 측쇄 기능성에 적합한 일반적인 보호 그룹으로서 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)을 사용하는 여과를 위한 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 속에서 배취식으로 합성하였다.
표준 Fmoc 화학을 이용하여 CEM 리버티(Liberty) 펩타이드 합성기 상에서 고체 상 펩타이드 합성을 수행하였다. TentaGel S Ram 수지(1g; 0.25mmol/g)를 사용하기 전에 NMP(10ml) 중에서 팽윤시키고, 튜브와 반응 용기 사이에 DCM 및 NMP를 사용하여 이동시켰다.
커플링
CEM 디스커버 초음파 장치(Discover microwave unit)에서 NMP/DMF/DCM(1:1:1; 0.2M; 5ml) 중의 Fmoc-아미노산을 HATU/NMP(0.5M; 2ml) 및 DIPEA/NMP(2.0M; 1ml)와 함께 수지에 첨가하였다. 질소를 혼합물을 통해 버블링하면서 커플링 혼합물을 75℃에서 5분 동안 가열하였다. 이어서, 수지를 NMP(4 x 10ml)로 세척하였다.
대안으로, CEM 디스커버 초음파 장치에서 DMF/DCM(2:1; 0.2M; 5ml) 중의 Fmoc-아미노산을 COMU/DMF(0.5M; 2ml) 및 DIPEA/DMF(2.0M; 1ml)와 함께 수지에 첨가하였다. 질소를 혼합물을 통해 버블링하면서 커플링 혼합물을 75℃에서 5분 동안 가열하였다. 이어서, 수지를 NMP(4 x 10ml)로 세척하였다.
탈보호
피페리딘/NMP(20%; 10ml)을 초기 탈보호를 위해 수지에 첨가하고, 혼합물을 초음파(30초; 40℃)로 가열하였다. 반응 용기를 배수하고, 피페리딘/NMP의 제2 부분(20%; 10ml)을 첨가하고, 다시 가열(75℃; 3분)하였다. 이어서, 수지를 NMP(6 x 10ml)로 세척하였다.
대안으로, 피페리딘/DMF(20%; 10ml)를 초기 탈보호를 위해 수지에 첨가하고, 혼합물을 초음파(30초; 40℃)로 가열하였다. 반응 용기를 배수하고 피페리딘/DMF의 제2 부분(20%; 10ml)을 첨가하고, 다시 가열(75℃; 3분)하였다. 이어서, 수지를 DMF(6 x 10ml)로 세척하였다.
측쇄 아실화(임의 단계)
Fmoc-Lys(ivDde)-OH 또는 대안으로 직각의 측쇄 보호 그룹을 갖는 다른 아미노산을 아실화 위치에 도입한다. 이어서, 펩타이드 골격의 N-말단을, Boc2O 또는 대안으로 마지막 커플링에서 Boc-보호된 아미노산을 사용함으로써 Boc-보호한다. 펩타이드가 여전히 수지에 부착되어 있는 한, 직각의 측쇄 보호 그룹을 NMP 중에서 2x15분 동안 새롭게 제조된 하이드라진 하이드레이트(2 내지 4%)를 사용하여 선택적으로 개열시킨다. 우선, 보호되지 않은 라이신 측쇄를 Fmoc-Glu-OtBu 또는 다른 스페이서 아미노산과 커플링시키고, 이를 피페리딘으로 탈보호하고, 상기에 기술한 바와 같은 펩타이드 커플링 방법을 사용하여 친지성 모이어티로 아실화한다. 사용된 약어는 다음과 같다:
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)3-메틸-부틸
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-에틸
DCM: 디클로로메탄
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
EtOH: 에탄올
Et20: 디에틸 에테르
HATU: N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄암미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드
MeCN: 아세토니트릴
NMP: N-메틸피롤리돈
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
개열
수지를 EtOH(3 x 10ml) 및 Et20(3 x 10ml)로 세척하고 실온(r.t.)에서 고정 중량으로 건조시켰다. 조 펩타이드는, TFA/TIS/물(95/2.5/2.5; 40ml, 2h; r.t,) 또는 TFA/DODT(95/5; 40ml, 2h; r.t)로 처리함으로써 수지로부터 개열되었다. 대부분의 TFA를 감압 하에 제거하고, 조 펩타이드를 침전시키고, 디에틸에테르로 3회 세척하고, 실온에서 고정 중량으로 건조시켰다.
조 펩타이드의 HPLC 정제
C-18 컬럼(5 cm; 10 μm) 및 분획 수집기가 장착되고 완충제 A(0.1% TFA, aq.) 및 완충제 B(0.1% TFA, 90% MeCN, aq.)의 구배로 35ml/분으로 수행하는 PerSeptive Biosystems VISION Workstation을 사용하는 분취용 역상 HPLC에 의해 대략 또는 90% 이상으로 조 펩타이드를 정제하였다. 분획을 분석적 HPLC 및 MS에 의해 분석하였고 관련 분획을 혼주(pooling)하여 동결건조시켰다. 최종 생성물을 HPLC 및 MS로 특성확인하였다.
Fmoc-보호된 아미노산은 어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech: ACT)로부터 적합한 측쇄 보호된 형태로 구입하였다.
커플링 시약
커플링 시약 디이소프로필카보디이미드(DIC)는, 독일에 소재하는 리이델 데-핸(Riedel de-Haen)에서 구입하였다.
고체 지지체
TentaGel S 수지 0.22 내지 0.31mmol/g 상에서 펩타이드를 합성하였다. TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc[Rapp polymere, 독일]는, C-말단 아미드화된 펩타이드가 바람직한 경우에 사용하였고, 한편, TentaGel S PHB, 예를 들면, TentaGel S PHB Asp(Boc)Fmoc는, C-말단 유리 카복실산이 바람직한 경우에 사용하였다.
Asp(예를 들면, 15번 위치에서)의 탈보호는, 하기 위치(예를 들면, 16번 위치) 내의 아미노산이 Gly이고 합성 또는 탈보호 동안 가열하지 않는 경우 30% 피페리딘/NMP 내의 0.1M 포름산을 사용하여 수행하였다.
촉매 및 다른 시약
디이소프로필에틸아민(DIEA)는 독일 소재의 알드리히(Aldrich)에서 구입하였으며, 피페리딘 및 피리딘은 독일 프랑크푸루트 소재의 리이델-데 핸에서 구입하였다. 에탄디티올은 독일 프랑크푸르트 소재의 리이델-데 핸에서 구입하였다. 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt-OH), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(HOAt)은 스위스 소재의 플루카(Fluka)에서 수득하였다.
커플링 절차
아미노산을, 적절한 N-α-보호된 아미노산 및 HObt 또는 HOAt로부터 제조된 반응계 내에서 발생된 HObt 또는 HOAt 에스테르로서 DMF 중의 DIC 수단에 의해 커플링하였다. 80℃에서 수행된 닌하이드린 시험에 의해 아실화를 점검하여 시험 동안 Fmoc 탈보호를 방지하였다(참조: Larsen, B, D. and Holm. A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9).
N-α-아미노 보호 그룹(Fmoc)의 탈보호
조 펩타이드의 HPLC 정제
조 펩타이드 생성물은 PerSeptive Biosystems VISION Workstation으로부터 정제하였다. VISION 3.0 소프트웨어를 장치 제어 및 데이터 획득을 위해 사용하였다. 하기 컬럼 및 HPLC 완충제 시스템을 사용하였다:
컬럼: 크로마실(Kromasil) KR 100Å, 10mm C-8, 250 x 50.8mm.
완충제 시스템: 완충제: A: MQV 중 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
구배: 0 내지 37분. 0 내지 40% B
유동 35 ml/분, UV 검출: I = 215nm 및 280nm.
질량 분광법
펩타이드를 초 구배(super gradient) 메탄올[제조원: 아일랜드 더블린 소재의 Labscan], 밀리-Q 수(milli-Q water)[제조원: 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore)] 및 포름산[제조원: 독일 담슈타트 소재의 머크(Merck)](50:50:0.1 v/v/v) 중에 용해시켜 1 내지 10mg/mL의 농도를 수득하였다. ESI-TOF-MS에 의해 LCT 질량 분광기[제조원: 영국 맨체스터 소재의 마이크로매쓰(Micromass)]을 사용하여 ESI-TOF-MS에 의해 펩타이드 용액(20ml)을 +/- 0.1m/z의 정확도로 양의 극성 방식으로 분석하였다.
상기에 기술한 바와 같은 분취용 HPLC를 사용하여 정제한 후, 펩타이드 생성물을 수집하고 펩타이드의 동일성을 ES-MS로 확인하였다. 하기에 추가로 예시된 모든 펩타이드 합성을 위해 당해 절차를 사용하였다.
합성된 화합물
표 1의 화합물은, 상기 기술을 사용하여 합성하였다.
Figure pct00003
실시예 1 화합물 12의 합성
표준 Fmoc 화학을 사용하여 CEM 리버티 펩타이드 합성기 상에서 고체상 펩타이드 합성을 수행하였다. TentaGel S Ram S 수지(1.33g; 0.25mmol/g)를 사용하기 전에 DMF(10ml) 중에서 팽윤시키고 튜브와 반응 용기 사이에 DCM 및 DMF를 사용하여 이동시켰다.
커플링
DMF/DCM(2:1; 0.2M; 5ml) 중의 Fmoc-아미노산을 CEM 디스커버 초음파 장치에서 COMU/DMF(0.5M; 2ml) 및 DIPEA&DMF(2.0M; 1ml)와 함께 수지에 첨가하였다. 질소를 혼합물을 통해 버블링하면서 커플링 혼합물을 75℃에서 5분 동안 가열하였다. 이어서, 수지를 DMF(4 x 10ml)로 세척하였다. Fmoc-Phe-Ser(Psi Me, Me, Pro)-OH 슈도프롤린을 아미노산 수 6 및 7을 위해 사용하였다.
탈보호
피페리딘/DMF(20%; 10ml)를 초기 탈보호를 위해 수지에 첨가하고 혼합물을 초음파(30초; 40℃)로 가열하였다. 반응 용기를 배수시키고, 피페리딘/DMF의 제2 부분(20%; 10ml)을 첨가하고, 다시 가열(75℃; 3분)하였다. 이어서, 수지를 DMF(6 x 10ml)로 세척하였다.
수지를 EtOH(3 x 10ml) 및 Et20(3 x 10ml)로 세척하였고, 실온(r.t.)에서 고정 중량으로 건조시켰다. TFA/DODT(95/5; 60ml, 2h; r.t.)로 처리하여 수지로부터 조 펩타이드를 개열시켰다. 대부분의 TFA를 감압 하에 제거하였고, 조 펩타이드를 침전시켰고, 디에틸에테르로 3회 세척하였고, 실온에서 고정 중량으로 건조시켰다.
조 펩타이드의 HPLC 정제
우선, C-18 110A, 10 x 250mm 컬럼 및 분획 수집기가 장착되고 완충제 A(0.1% TFA, aq.) 및 완충제 B(0.1% TFA, 90% MeCN, aq.)의 구배로 35ml/분으로 수행하는 PerSeptive Biosystems VISION Workstation을 사용하는 분취용 역상 HPLC에 의해 45%로 조 펩타이드를 정제하였다. 분획을 분석적 HPLC 및 MS로 분석하였고, 관련 분획을 혼주시켰고, 동결건조시켰다. 생성물(143mg)을 C4 쥬피터(Jupiter) 2, 12x25cm 컬럼으로 두번째 정제하여 HPLC 및 MS에 의해 특성확인시 89%의 순도로 27mg을 수득하였다. 계산된 단일 동위원소 MW = 3377.61, 실측치 3377.57.
실시예 2. GLP-2-수용체 효능 검정
퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 cAMP AlphaScreen® 검정을 사용하여 GLP-2 유사체에 대한 cAMP 반응을 정량하였다. 테두글루타이드는 당해 검정에서 참조 화합물이었으며 대략 0.01nM의 EC50을 갖는다. cAMP의 세포내 수준에 있어서 증가를 유도하는 시험 화합물을 당해 검정에서 시험하였고, 반응을 양성 및 음성 대조군에 대해 표준화하여 농도 반응 곡선으로부터 EC50 및 최대 반응을 계산하였다. 결과는 표 2에 나열한다.
사람 GLP-1 수용체를 발현하는 세포주의 생성
사람 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(GLP-1R)(주요 수탁 번호 P43220)을 암호화하는 cDNA를 cDNA BC112126(MGC:138331/IMAGE:8327594)로부터 클로닝하였다. GLP-1-R을 암호화하는 DNA를, 서브클로닝(subcloning)을 위한 말단 제한 부위를 암호화하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5'-말단 프라이머는 효율적인 번역을 보증하기 위해 부근 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)을 추가로 암호화하였다. GLP-1-R을 암호화하는 DNA의 정확도는 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. GLP-1-R을 암호화하는 PCR 생성물을, 네오마이신(G418) 내성 마커를 함유하는 포유동물 발현 벡터 내에 서브클로닝하였다. GLP-1-R을 암호화하는 포유동물 발현 벡터를, HEK293 세포 내에 표준 인산 칼슘 형질감염 방법에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 제한된 희석 클로닝을 위해 씨딩(seeding)하고, 배양 배지 중에서 1mg/ml의 G418로 선택하였다. 3주 후, GLP-1-R 발현 세포의 12개의 생존 콜로니를 픽킹하고, 증식시키고, 하기 기술된 바와 같이 GLP-1 수용체 효능 검정에서 시험하였다. 1개의 GLP-1-R 발현 클론을 화합물 프로파일링을 위해 선택하였다.
사람 GLP-2 수용체를 발현하는 세포주의 생성
hGLP2-R은 영국 캠브리지 바브라함 소재의 MRC-geneservice로부터 영상 클론: 5363415(11924-I17)으로서 구입하였다. 포유동물 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 위해, 덴마크 리쓰코브 소재의 DNA-테크놀로지(DNA-Technology)로부터 서브클로닝용 프라이머를 수득하였다. PCR 반응에 사용된 5' 및 3' 프라이머는 클로닝을 위한 말단 제한 부위를 포함하며, 5' 프라이머의 내용은, ORF에 의해 암호화된 생성물의 서열을 변화시키지 않고 코작 컨센서스로 변형된다. 영상 클론 5363415(11924-117)을 주형으로서 상기 언급한 프라이머 및 폴리머라제 헤르쿨라제 II 융합체와 함께 총 50μl의 용적으로 사용하여 표준 PCR 반응을 수행하였다. 생성된 PCR 생성물을 GFX PCR 및 겔 밴드 정제 키트를 사용하여 정제하고 제한 효소로 소화시키고 Rapid DNA 라이게이션 키트를 사용하여 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 라이게이션 반응은 XL10 Gold Ultracompetent 세포로 형질전환하고 콜로니를 DNA 생산을 위해 엔도프리 플라스미드 맥시 키트(Endofree Piasmid maxi kit)를 사용하여 픽킹하였다. 후속적인 서열 분석을 독일 소재의 MWG 유로핀스(Eurofins)로 수행하였다. 클론은 hGLP-2 수용체, 스플라이스 변이체 rs17681684인 것으로 확인되었다.
HEK293 세포를 리포펙타민 PLUS 형질감염 방법을 사용하여 형질감염심켰다. 형질감염 전날에, HEK293 세포를 2개의 T75 플라스크 중에 2x106개 세포/T75 플라스크의 밀도로 항생제가 없는 세포 배양 배지 중에 씨딩하였다. 형질감염 당일에, 세포를 1xDPBS로 세척하고, 리포펙타민-플라스미드 복합체를 T75 플라스크 중의 세포에 온화하게 및 적가 방식으로 가하기 전에 배지를 옵티멤(Optimem)으로 5 mL/T75 플라스크의 용적으로 대체하고, 3시간 후 성장 배지로 대체하고, 다시 24시간 후 500㎍/mL의 G418이 보충된 성장 배지에 다시 가하였다. G418 선택시 4주 후, 콜로니를 픽킹하여 기능성 검정에서 시험하였다. 1개의 콜로니를 화합물 프로파일링에서 사용하기 위해 선택하였다.
GLP-1-수용체 효능 검정
퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터의 cAMP AlphaScreen® 검정을 사용하여 GLP1 및 GLP2 수용체 각각의 활성화에 대한 cAMP 반응을 정량화하였다. 엑센딘-4(ZP24)를 GLP1 수용체 활성화를 위한 참조 화합물로서 및 테두글루타이드(ZP1559)를 GLP2 수용체 활성화용 참조 화합물로서 사용하였다. cAMP의 세포내 수준에 있어서의 증가를 유발하는 시험 화합물로부터의 데이터를 양성 및 음성 대조군(비히클)에 대해 표준화하여 농도 반응 곡선으로부터 EC50 및 최대 반응을 계산하였다. 결과를 표 2에 나열한다.
Figure pct00004
실시예 3: 정상 마우스에서의 내당능에 대한 효과
정상의 사료를 공급한 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용하였다. 당해 마우스를 표준 우리 조건[광-, 온도-, 및 습도-제어된 실내(12:12h의 명-암 주기, 06.00-18.00h에서 광 제공; 24℃; 50% 상대 습도)]에 유지시키고, 각각의 투약 그룹은 10마리의 동물로 이루어졌다.
경구 내당능 시험(OGTT) 전에, 동물을 5시간 동안 절식시켰다. 포도당 챌린지(시간 t = -60분) 1시간 전에 기저선 혈당을 측정하였다. 혈액 시료 직후에, 동물에게 표시된 양의 화합물 또는 PBS(비히클)을 피하로 1회 투약하였다. 1시간 후 t = 0분째에, 2g/kg의 경구 위관 영양의 포도당(포도당 SAD 0.456g/l로부터 희석된 물 중의 0.4g/ml; 용량 용적 5ml/kg)을 동물에게 제공하였다. 포도당 투여 후, 꼬리 정맥 혈액을 t = 15, 30, 60, 120분에 포도당 측정을 위해 채혈하였다.
결과
비히클 처리된 마우스는 처음 30분째에 혈당 수준에 있어서의 증가와 함께, 포도당 챌린지에 대해 전형적인 반응을 나타내었으며, 이후 120분 후에 기저선 수준으로 되돌아왔다. 시험 화합물은 혈당 반응을 유의적으로 감소시켰다(도 2).
실시예 4: 정상 래트에서의 장 중량에 대한 효과
정상의 사료를 공급한 위스타 수컷 래트(Wistar male rat)를 사용하였다. 당해 래트를 표준 우리 조건[광-, 온도-, 및 습도-제어된 실내(12:12h의 명-암 주기, 06.00-18.00h에서 광 제공; 24℃; 50% 상대 습도)]에 유지시키고, 각각의 투약 그룹은 6마리의 동물로 이루어졌다. 래트에게 피하 경로를 통해 1일 1회 4일 동안 표시된 양의 화합물 또는 PBS(비히클)을 투여하였다. 5일째에, 래트를 희생시키고 소장 습윤 중량을 측정하였다.
결과
시험 화합물은 용량 의존적 방식으로 장 중량을 증가시켰다(도 3).
실시예 5: 식이-유도된 비만 마우스에서의 화합물 7의 효과
식이-유도된 비만은, C57BL/6J 수컷 마우스에게 고 지방 식이[리서치 다이어트(Research Diet) 60% 지방(D12492), 제조원: 미국 뉴 브런스윅 소재의 리서치 다이어트 인크(Research Diet Inc.)]을 공급하여 생성시켰다. 당해 마우스를 표준 우리 조건[광-, 온도-, 및 습도-제어된 실내(12:12h의 명-암 주기, 06.00-18.00h에서 광 제공; 24℃; 50% 상대 습도)]에 유지시켰다.
비히클 처리된 투약 그룹은 8마리의 동물을 함유하였으며, 화합물 7로 처리된 그룹은 12마리의 동물/그룹으로 이루어졌다. 모든 동물을 7일 동안(1일 1회, 피하, 100μl의 비히클) 모의 치료함으로써 동물이 취급 및 주사에 적응하도록 한 후, 14일 동안(1일 2회, SC, 5ml/kg) 치료(비히클 또는 화합물 7)하였다. 동물을 밤새(11 내지 12일째) 절식시키고 혈액을 포도당 및 인슐린의 분석을 위해 채혈하였다. 14일째에, 동물을 희생시키고, 소장 및 대장을 제거하고, 세척하고 칭량하였다.
결과
14일 동안 1일 2회 투약된 화합물 7은, 비히클 치료된 대조군과 비교하는 경우 소장 및 대장 질량을 유의하게 증가시켰다(도 4).
14일 동안 1일 2회 투약된 화합물 7은 공복 혈당 및 혈장 인슐린 수준을 감소시켰으며, 비히클 처리된 대조군보다 더 낮은 HOMA-IR 지수를 제공하였다(도 5).
본 발명은, 상기 기술된 예시적인 실시형태와 관련지어 기술되었지만, 많은 등가의 변형 및 변화가 본 기재내용을 제공하는 경우 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 앞서 제시된 본 발명의 예시적인 실시형태는 설명하기 위한 것이고 한정되지 않는 것으로 고려되어야 한다. 기술된 실시형태에 대한 각종 변화가 본 발명의 취지 및 영역으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 인용된 모든 문헌은 인용에 의해 명확히 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ZEALAND PHARMA A/S <120> GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2 (GLP-2) ANALOGUES <130> GRF/FP6894950 <150> US 61/642,447 <151> 2012-05-03 <150> US 61/785,852 <151> 2013-03-14 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue: General Formula I of PCT/EP2013/059320 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly, Ala or Aib <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Gln or Asp <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Asp, Glu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Met, Val, Leu or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Asn, Ser or Ala <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Thr, Ser or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Tyr, Phe or Gln <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa is Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln, Lys, Arg, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ala or Val <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Arg, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asp, Glu or Leu <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Xaa is Asn, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Thr, Ala, Y or absent; wherein Y is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa is Lys, Y or absent; wherein Y is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa is Ile, Pro, Y1 or absent; wherein Y is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa is Asp, Asn, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> Xaa is Y1 or is absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <400> 2 His Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Ser 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue: General Formula Ia of PCT/EP2013/059320 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly, Ala or Aib <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Gln or Asp <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Asp, Glu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Met, Val, Leu or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Asn or Ser <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Thr, Ser or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Tyr, Phe or Gln <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa is Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln, Lys, Arg, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Arg, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asp, Glu or Leu <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Xaa is Asn, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Thr, Ala, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa is Lys, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa is Ile, Pro, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa is Asp, Asn, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> Xaa is Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <400> 6 His Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue: General Formula II of PCT/EP2013/059320 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly, Ala or Aib <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Gln or Asp <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Thr, Ser or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Tyr, Phe or Gln <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gly, Ser, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln or Lys <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ala or Val <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Arg, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asp, Glu or Leu <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Xaa is Asn, Ala, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ile, Leu, Val, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (28)..(34) <223> If any of Xaa28 to Xaa33 is Y1, wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, those positions Xaa29 to Xaa34 downstream of that Y1 are absent. <220> <221> VARIANT <222> (28)..(33) <223> If any of Xaa28 to Xaa33 is absent, those positions Xaa29 to Xaa33 downstream of that position are also absent. <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Thr, Ala, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa is Lys, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa is Ile, Pro, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa is Asp, Asn, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> Xaa is Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <400> 7 His Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Ser Glu Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 8 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 9 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 10 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 11 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Ser 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Val Arg Asp Phe Ile Glu Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 13 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Glu Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 14 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 15 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Thr Ile Leu Glu Asn 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Glu Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 16 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 16 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Asp Leu Ser Thr Ile Leu Glu Asn 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Glu Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 17 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 18 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 18 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 19 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue <400> 20 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Asp Leu Ser Thr Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Glu Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-2 analogue: General Formula III of PCT/EP2013/059320 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu,or Asp <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Thr, Ser or Lys <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile, Tyr, or Gln <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln or Lys <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ala or Val <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Arg, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asp, Glu or Leu <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Xaa is Asn, Ala, Glu <220> <221> VARIANT <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ile, Leu, Glu or Lys <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Gln, Lys, Ser, Gly, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (28)..(34) <223> If any of Xaa28 to Xaa33 is Y1, wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, those positions Xaa29 to Xaa34 downstream of that Y1 are absent. <220> <221> VARIANT <222> (28)..(33) <223> If any of Xaa28 to Xaa33 is absent, those positions Xaa29 to Xaa33 downstream of that position are also absent. <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Thr, Ala, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa is Lys, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa is Ile, Pro, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa is Asp, Asn, Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> Xaa is Y1 or absent; wherein Y1 is SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 <400> 21 His Gly Xaa Gly Xaa Phe Xaa Ser Glu Leu Ala Xaa Xaa Leu Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 22 Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10

Claims (39)

  1. 화학식 I로 나타낸 GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 I]
    R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-R2
    상기 화학식 I에서,
    R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
    X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
    X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
    X5는 Ser 또는 Thr이고;
    X7은 Ser 또는 Thr이고;
    X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
    X9는 Glu 또는 Asp이고;
    X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
    X11은 Asn, Ser 또는 Ala이고;
    X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
    X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X14는 Leu 또는 Met이고;
    X15는 Asp 또는 Glu이고;
    X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X17은 Gln, Lys, Arg, His 또는 Glu이고;
    X19는 Ala 또는 Val이고;
    X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
    X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이고;
    X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하고;
    X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
    X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
    X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
    R2는 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재하며;
    단, 상기 화학식 I의 GLP-2 유사체는
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
    HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아니다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 수소이고,
    X2가 Gly, Ala 또는 Aib이고;
    X3이 Glu, Gln 또는 Asp이고;
    X5가 Ser 또는 Thr이고;
    X7이 Ser 또는 Thr이고;
    X8이 Asp, Glu 또는 Ser이고;
    X9가 Glu 또는 Asp이고;
    X10이 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
    X11이 Asn 또는 Ser이고;
    X13이 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X14가 Leu 또는 Met이고;
    X12가 Thr 또는 Lys이고;
    X15가 Asp 또는 Glu이고;
    X16이 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X17이 Gln 또는 Lys이고;
    X19가 Ala 또는 Val이고;
    X20이 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21이 Asp, Glu 또는 Leu이고;
    X24가 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27이 Ile, Leu, Val 또는 Lys이고:
    X28이 Gln, Asn, Gly, Y1이거나 부재하고;
    X29가 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
    X30이 Lys, Y1이거나 부재하고;
    X31이 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32가 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X33이 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    Y1이 -Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
    R2가 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재하고;
    단, 상기 화학식 I의 GLP-2 유사체는
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIGTKITD; 또는
    HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아닌,
    GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  3. 화학식 Ia로 나타낸 GLP-1 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 Ia]
    R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Leu-X15-X16-X17-Ala-Ala-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-R2
    상기 화학식 Ia에서,
    R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
    X2는 Gly, Ala 또는 Aib이고;
    X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
    X5는 Ser 또는 Thr이고;
    X7은 Ser 또는 Thr이고;
    X8은 Asp, Glu 또는 Ser이고;
    X9는 Glu 또는 Asp이고;
    X10은 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
    X11은 Asn 또는 Ser이고;
    X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
    X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X15는 Asp 또는 Glu이고:
    X16은 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X17은 Gln, Lys, Arg, His 또는 Glu이고;
    X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
    X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이고:
    X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하고;
    X29는 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X30은 Lys, Y1이거나 부재하고;
    X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32는 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
    R2는 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재하고;
    단, 상기 화학식 Ia의 GLP-2 유사체는
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
    HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아니다.
  4. 제3항에 있어서,
    R1이 수소이고,
    X2가 Gly, Ala 또는 Aib이고;
    X3이 Glu, Gln 또는 Asp이고;
    X5가 Ser 또는 Thr이고;
    X7이 Ser 또는 Thr이고;
    X8이 Asp, Glu 또는 Ser이고;
    X9가 Glu 또는 Asp이고;
    X10이 Met, Val, Leu 또는 Tyr이고;
    X11이 Asn 또는 Ser이고;
    X12가 Thr 또는 Lys이고;
    X13이 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X15가 Asp 또는 Glu이고;
    X16이 Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X17이 Gln 또는 Lys이고;
    X20이 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21이 Asp, Glu 또는 Leu이고;
    X24가 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27이 Ile, Leu, Val 또는 Lys이고;
    X28이 Gln, Asn, Gly, Y1이거나 부재하고;
    X29가 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X30이 Lys, Y1이거나 부재하고;
    X31이 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32가 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X33이 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    Y1이 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
    R2가 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재하며;
    단, 상기 화학식 Ia의 GLP-2 유사체는,
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; 또는
    HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK가 아닌,
    GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X17이 Gln인, GLP-2 유사체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X17이 Lys인, GLP-2 유사체.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X17이 Glu인, GLP-2 유사체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, X14가 Leu인, GLP-2 유사체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, X14가 Met인, GLP-2 유사체.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) X16이 Gly이고, X17이 Gln이거나;
    (ii) X16이 Gly이고, X17이 Lys이거나;
    (iii) X16이 Gly이고, X17인 Glu인,
    GLP-2 유사체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 Aib인, GLP-2 유사체.
  12. 제1항 또는 제2항, 또는 제1항 또는 제2항의 종속항으로서의 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X19가 Ala인, GLP-2 유사체.
  13. 제1항 또는 제2항, 또는 제1항 또는 제2항의 종속항으로서의 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X19가 Val인, GLP-2 유사체.
  14. 화학식 II로 나타낸 GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 II]
    R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-R2
    상기 화학식 II에서,
    R1은 수소, C1 -4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
    X2는 Gly, Ala 또는 Aib이며;
    X3은 Glu, Gln 또는 Asp이고;
    X5는 Ser 또는 Thr이며;
    X7은 Ser 또는 Thr이고;
    X12는 Thr, Ser 또는 Lys이며;
    X13은 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X14는 Leu 또는 Met이며;
    X15는 Asp 또는 Glu이고;
    X16은 Gly, Ser, Ala, Glu 또는 Lys이며;
    X17은 Gln 또는 Lys이고;
    X19는 Ala 또는 Val이며;
    X20은 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21은 Asp, Glu 또는 Leu이며;
    X24는 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27은 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이며:
    X28은 Gln, Asn, Lys, Ser, Y1이거나 부재하며;
    X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
    X30은 Lys, Y1이거나 부재하며;
    X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32는 Thr, Y1이거나 부재하며;
    X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    X34는 Y1이거나 부재하며;
    Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이고;
    R2는 H2 또는 OH이며; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재한다.
  15. 제14항에 있어서, 화학식 II의 X16이 Gly, Ser 또는 Ala이고, 임의로, X17이 Lys 또는 Gln인, GLP-2 유사체.
  16. 제14항에 있어서,
    R1이 수소, C1 -4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
    X2가 Gly 또는 Aib이며;
    X3이 Glu 또는 Asp이고;
    X5가 Ser 또는 Thr이며;
    X7이 Ser 또는 Thr이고;
    X12가 Thr, Ser 또는 Lys이며;
    X13이 Ile, Leu, Val, Tyr, Phe 또는 Gln이고;
    X14가 Leu 또는 Met이며;
    X15가 Asp 또는 Glu이고;
    X16이 Gly, Ser 또는 Ala이며;
    X17이 Gln 또는 Lys이고;
    X19가 Ala 또는 Val이며;
    X20이 Arg, Lys 또는 His이고;
    X21이 Asp, Glu 또는 Leu이며;
    X24가 Asn, Ala, Glu 또는 Lys이고;
    X27이 Ile, Leu, Val, Glu 또는 Lys이며:
    X28이 Gln, Asn, Lys, Ser, Y1이거나 부재하고;
    X29가 Thr, Ala, Y1이거나 부재하며;
    X30이 Lys, Y1이거나 부재하고;
    X31이 Ile, Pro, Y1이거나 부재하며;
    X32가 Thr, Y1이거나 부재하고;
    X33이 Asp, Asn, Y1이거나 부재하며;
    X34가 Y1이거나 부재하고;
    Y1이 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이며;
    R2가 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재하는, GLP-2 유사체.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) X16이 Gly이고, X17이 Gln이거나;
    (ii) X16이 Gly이고, X17이 Lys인,
    GLP-2 유사체.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) X2가 Gly이거나;
    (ii) X2가 Aib인,
    GLP-2 유사체.
  19. 화학식 III으로 나타낸 GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 III]
    R1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-Leu-X15-Gly-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-R2
    상기 화학식 III에서,
    R1은 수소, C1-4 알킬(예를 들면, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일, 또는 트리플루오로아세틸이고;
    X3은 Glu 또는 Asp이며;
    X5는 Ser 또는 Thr이고;
    X7은 Ser 또는 Thr이며;
    X12는 Thr, Ser 또는 Lys이고;
    X13은 Ile, Tyr, 또는 Gln이며;
    X15는 Asp 또는 Glu이고;
    X17은 Gln 또는 Lys이며;
    X19는 Ala 또는 Val이고;
    X20은 Arg, Lys 또는 His이며;
    X21은 Asp, Glu 또는 Leu이고;
    X24는 Asn, Ala, Glu이며;
    X27은 Ile, Leu, Glu 또는 Lys이고;
    X28은 Gln, Lys, Ser, Gly, Y1이거나 부재하며;
    X29는 Thr, Ala, Y1이거나 부재하고;
    X30은 Lys, Y1이거나 부재하며;
    X31은 Ile, Pro, Y1이거나 부재하고;
    X32는 Thr, Y1이거나 부재하며;
    X33은 Asp, Asn, Y1이거나 부재하고;
    X34는 Y1이거나 부재하며;
    Y1은 Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, 또는 Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이고;
    R2는 NH2 또는 OH이고; 여기서,
    상기 GLP-2 유사체는 1개 이하의 Y1을 함유하고;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 Y1인 경우, 당해 Y1의 하류에 상기 위치 X29 내지 X34는 부재하며;
    X28 내지 X33 중 어느 하나가 부재하는 경우, 당해 위치의 하류에 상기 위치 X29 내지 X33도, 또한, 부재한다.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK;
    HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD;
    HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD;
    HGEGTFTSDLSKQMESKAARDFIEWLIQTKITD;
    HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD;
    HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD;
    HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD;
    H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK;
    HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD;
    HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; 및
    HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD
    로부터 선택되는, GLP-2 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 친지성 치환체가 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치 중 하나 이상에 접합되는, GLP-2 유사체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 친지성 치환체가 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치 중 하나 이상에 접합되는, GLP-2 유사체.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 친지성 치환체가 16, 17, 20, 24, 27, 28 및 32번 위치 중 하나 이상에 접합되는, GLP-2 유사체.
  24. 치료요법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체를, 담체와의 혼합물로 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 GLP-2 유사체가, 약제학적으로 허용되는 산 부가염인, 약제학적 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체로서 제형화되거나, 상기 GLP-2 유사체의 서방출을 야기하도록 제형화되는, 약제학적 조성물.
  28. 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
  29. 당뇨병과 관련된 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
  30. 제29항에 있어서, 당뇨병과 관련된 저 등급 염증이, 대사 증후군, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증, 뇌졸중; 임의의 병인학의 궤양을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관 내의 위장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군(short-bowel syndrome), 컬-드-삭 증후군(cul-de-sac syndrome), 염증성 장 질환, 셀리악 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사와 관련되어 있는, 용도.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  32. 발현 벡터의 발현을 지시하는 제어 서열과 조합된, 제31항의 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  33. 제32항의 발현 벡터로 형질전환된, 숙주 세포.
  34. GLP-2 유사체를 발현시키고 이로써 생산되는 GLP-2 유사체를 정제하기에 적합한 조건 하에서 제33항의 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 생산 방법.
  35. 치료요법에 사용하기 위한, 제31항에 따른 핵산 분자, 제32항에 따른 발현 벡터, 또는 제33항에 따른 숙주 세포.
  36. 저 등급 염증으로서, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증, 뇌졸중, 임의의 병인학의 궤양을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관 내의 위장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환, 셀리악 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사와 관련된 저 등급 염증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조시, 제31항에 따른 핵산 분자, 제32항에 따른 발현 벡터, 또는 제33항에 따른 숙주 세포의 용도.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체, 제31항에 따른 핵산 분자, 제32항에 따른 발현 벡터, 또는 제33항에 따른 숙주 세포의 유효량을 투여함으로써, 위 및 장-관련된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 위 및 장-관련된 장애를 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 위장 관련된 장애가, 대사 증후군, 비만(예를 들면, 복부 비만), 당뇨병, 심혈관 질환, 위장 염증, 우울증, 알츠하이머, 관절염, 고혈압, 이상지질혈증, 뇌졸중; 임의의 병인학의 궤양을 포함하는 식도, 위, 회장, 소장, 결장 및 직장의 상부 위장관 내의 위장 장애, 소화 장애, 흡수 불량 증후군, 단장 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환, 셀리악 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증 스프루우, 및 화학 치료요법 및/또는 방사선 혈액 치료요법 유도된 점막염 및 설사와 관련된 저 등급 염증인, 방법.
  39. 암 화학 치료요법 약물 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제31항에 따른 핵산 분자, 제32항에 따른 발현 벡터, 또는 제33항에 따른 숙주 세포를, 각각 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 포함하는, 치료학적 키트.
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