CN106084049A

CN106084049A - 抗cd3单域抗体

Info

Publication number: CN106084049A
Application number: CN201610435685.1A
Authority: CN
Inventors: 李庆; 王�忠
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-06-17
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明提供一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。本发明进一步提供编码该抗CD3单域抗体的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的表达载体及宿主细胞。本发明提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3ε N‑末端部分，这些抗体可以用于比如CD3的测定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如双特异性抗体。

Description

抗CD3单域抗体

技术领域

本发明涉及抗CD3单域抗体（sdAb）及其氨基酸、核苷酸编码序列。本发明还涉及包含该核苷酸编码序列的表达载体和宿主细胞。

背景技术

自1975年单克隆抗体技术问世之后，抗原特异性的抗体已改变了生物学和医学的多个方面。除了作为重要性的研究工具，单克隆抗体的可用性为发展人类疾病的诊断和新疗法开辟了道路。然而，单克隆抗体在应用范围上有技术上的限制和缺点，例如基于哺乳动物表达***较昂贵。

在过去的几十年，一系列的新技术和方法用于改善传统抗体的性能，尤其是在肿瘤治疗中。例如，给现有抗体加有毒的化合物，包括放射性同位素被链接到单克隆抗体。然而，甚至直到今天，临床使用单克隆抗体量仍然很少。另一个提高肿瘤杀灭效率的方法是使用双特异性的抗体，将免疫细胞引到肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。而最常用的是使用抗CD3抗体将T细胞引到肿瘤细胞。它是通过同时绑定CD3和肿瘤细胞的表面抗原(TAA)，这种双特异性抗体可以能够触发T细胞介导的肿瘤细胞溶解。CD3（群集分化 3）T细胞受体有助于激活细胞毒性T细胞。它是由四个不同的链组成的一种复杂的蛋白质。在哺乳动物中，包含CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。

很多双特异性抗体使用单链抗体。单链抗体是从传统的IgG分子得到的完整的最小的抗原结合片段。不幸的是，细菌表达的scFvs产量很低。骆驼和羊驼包含一种独特类型的抗体，这类抗体缺乏轻链。因为比常规抗体缺失CH1，这些所谓的重链抗体有较低的分子量。这类免疫球蛋白可变的重链简称VHH，以区别于经典的重链可变区。因此，单个域VHH 是最小可用完整抗原结合15 kDa 片段，被称为纳米抗体。纳米抗体与Fab、Fv或单链抗体相比，有一些独特的优势，如更稳定、更易于在细菌表达。

现有技术中抗CD3抗体形式单一并且不能满足实际需求，因此有必要开发出更多的抗CD3抗体，从而为生产和设计功能蛋白提供更多的选择。

发明内容

本发明一方面涉及一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQID NO. 3。

本发明另一方面涉及一种编码本发明的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。在一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在另一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQID NO. 4所示。

本发明再一个方面涉及一种表达载体，其包含本发明的核苷酸序列。本发明还涉及包含该表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中，该宿主细胞是大肠杆菌。

本发明还涉及一种双特异性抗体，其包含本发明所述的任一CD3单域抗体。

本发明提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3ε N-末端部分，这些抗体可以用于比如CD3的测定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如双特异性抗体。

附图说明

图1是sdAb噬菌体展示库的骨架图。

图2显示了血清效价实验结果。

图3.淋巴细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物Marker III；第1-3泳道，分离自第一次抽血的淋巴细胞的总RNA；第4-7泳道，分离自第二次抽血的淋巴细胞的总RNA；第8-10泳道，分离自第三次抽血的淋巴细胞的总RNA。

图4.纯化的V_HH PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物Marker III；第1-8泳道，使用8对引物从第一次抽血的PBMC得到的纯化的V_HH PCR产物；第9-16泳道，使用8对引物从第二次抽血的PBMC得到的纯化的V_HH PCR产物；第17-24泳道，使用8对引物从第三次抽血的PBMC得到的纯化的V_HH PCR产物。

图5. sdAb噬菌体展示库的***率。使用M13R (-48)和M13F (-47)引物通过PCR扩增96个随机选取的文库克隆。具有~1100 bp DNA条带的克隆具有V_HH***物。

具体实施方式

本发明现将结合以下实验及附图进一步阐释，需要说明的是，这些实验例及附图不应解释为对本发明的限制。

1 策略

本发明通过噬菌体展示技术开发出了抗CD3的单域抗体，并且进行了以下步骤：动物免疫和免疫响应测试、sdAb噬菌体展示库的构建、噬菌体展示淘选以及FASEBA筛选和FACS验证。

2 材料

抗原蛋白： CD3-His蛋白(MP-5)

抗原细胞系: Jurkat靶标细胞, KPCN对照细胞

TRIzol® Reagent (Ambion, Cat. No. : 15596-026)

PrimeScript^TM 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara, Cat. No. : 6110A)

Sfi I酶(NEB, Cat. No. : R0123S)

宿主菌: E.coli SS320

氨苄青霉素, 100 mg/ml

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 1 M

PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO4, 1.4 mM KH₂PO4, pH 7.4

ELISA微滴定板 (Corning, Cat. No. : 9018)

包被缓冲液: 0.05 M NaHCO₃, pH 9.6

封闭缓冲液 (PBST): PBS缓冲液, pH 7.4,加入5%脱脂奶粉

洗涤缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.4, ,加入0.05% Tween 20

M13KO7辅助噬菌体(NEB, Cat. No. : N0315S)

HRP/抗M13单克隆抗体 (GE Healthcare, Cat. No. : 27-9421-01)

羊抗驼IgG[HRP] (Novus Biological, Cat. No. : NB7242)

兔抗驼IgG[HRP] (GenScript)

FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA)

Flowjo: Flowjo 7.6.1 Min software

2×YT: 16 g胰蛋白胨, 10 g酵母提取物, 5 g NaCl溶解于1 L ddH₂O.

Octet^RED96 (ForteBio)

Super Streptavidin (SSA) Dip and Read^TM Biosensors (ForteBio)

10 mM 甘氨酸-HCl, pH 2.0

3方法

3.1动物免疫和免疫响应测试

3.1.1 动物免疫

将CD3-His免疫原与佐剂或PBS混合并注射到美洲驼（llama）。在整个项目过程中，动物被免疫五次。分别在免疫之前以及第4次和第5次免疫之后采集外周血样品。梯度分离法分离出淋巴细胞。细胞中加入RNAlater并储存于-80°C。离心加入了抗凝剂的血液得到血清，并储存于-80°C。

3.1.2 免疫响应测试

使用血清样品通过ELISA评价针对固定的免疫原的免疫响应。评价了免疫前以及第4次和第5次免疫后的血清。抗原(CD3-His和CD34-Fc)分别稀释于4 μg/ml的包被缓冲液中。使用稀释的抗原对微滴定板包被过夜，4°C。随后，以洗涤缓冲液洗涤微滴定板3次，再于37°C用封闭缓冲液封闭2小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。将一系列稀释的血清加入板上，在37°C孵育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。加入羊抗驼IgG [HRP]或兔抗驼IgG [HRP]，在37°C孵育1小时。洗涤后，反应物中加入TMB底物反应10分钟，随后加入1 MHCl终止反应。MK3分光计测定每孔在450 nm的吸收值。

3.2 sdAb噬菌体展示库的构建

3.2.1 RNA提取

根据TRIzol试剂手册从分离的淋巴细胞（见3.1.1）中提取总RNA。凝胶电泳法以及OD260/280法对总RNA进行定性和定量。

3.2.2 RT-PCR和V_HH扩增

根据PrimeScript^TM 1st Strand cDNA合成试剂盒的手册使用oligo(dT)20引物将总RNA逆转录为cDNA。设计四个正义和两个反义特异性简并引物来扩增V_HH片段，引入两个SfiI限制性位点。根据GenScript标准操作程序（SOP）扩增V_HH片段。

3.2.3 展示库扩展

使用不同引物对扩增获得V_HH PCR产物。使用Sfi I消化该PCR产物并且通过凝胶纯化。凝胶纯化的片段被***到GenScript自有的噬菌粒载体（图1）中。构建实验性展示库以优化连接和转化条件。优化的连接和转化条件被用来开发实际展示库。一小部分转化细胞被稀释并划线于具有100 μg/ml氨苄青霉素的2×YT平板上。对菌落进行计算以计算文库大小。随机挑取阳性克隆并测序，以评估文库的质量。其余转化细胞被划线于具有100 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的Ø 15 cm 2 ×YT平板上。从平板上刮去菌苔。小部分细胞被用于文库质粒分离。其余加入甘油，保存于-80°C备用。

3.3 噬菌体库淘选

3.3.1 生物淘选

使用GenScript开发的标准程序对所构建的sdAb噬菌体库进行CD3-His蛋白的淘选。含有7.4 × 10⁸个克隆（CFU）的大sdAb噬菌体展示库被用于该筛选。文库生长于对数期，用M13KO7辅助噬菌体回收，并在具有100 μg/ml氨苄青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2× YT培养板中于振荡器上在30°C扩增过夜。用PEG/NaCl使噬菌体沉淀，并重悬于PBS中，储存于-80°C。为进行噬菌体淘选，将微孔板(Pierce, Prod# 15100)包被CD3-His，这是通过将它们以100 μg/ml在PBS (pH 7.0)中于4°C孵育过夜而实现的。同时，噬菌体颗粒被与含有2%脱脂奶粉的PBS封闭缓冲液在室温下孵育1小时以阻断非特异性结合。在用PBS漂洗3次后，将噬菌体颗粒加入微孔中，并在振荡器上于室温孵育1小时。孵育之后，通过用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）漂洗小孔6次随后再用PBS漂洗2次来洗去未结合的以及非特异性结合的噬菌体。结合的噬菌体立即被用来在37°C感染对数生长期的E. coli TG1细胞（OD600约为0.5）1小时。每个淘选循环之后，将被感染的细胞与10%甘油混合，随后储存于-80°C。在进行下一个循环的淘选时，将10 ml的感染的E. coli TG1细胞储液加入30 ml含有200 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的培养基中，并生长至对数期。培养物用M13KO7辅助噬菌体回收，扩增并沉淀噬菌体，以用于下一轮筛选。如上所述重复常规噬菌体展示淘选。

3.3.2 噬菌体ELISA

单个的输出噬菌体克隆生长于96深孔平板中并通过噬菌体ELISA筛选以确认CD3-His特异性克隆。使用2 μg/ml CD3-His包被96孔平板（在包被缓冲液中于4°C孵育过夜），以含有2%脱脂奶粉的PBS封闭。每孔加入约50μl的来自过夜细胞培养物的噬菌体上清液，并在4°C孵育2小时，随后用PBST洗涤四次。未结合的sdAb噬菌体通过与HRP标记的抗M13单抗在37°C孵育1小时来检测。用PBST再洗涤孔四次，每个孔中加入底物溶液。在450 nm处测定吸收值。

3.4 FASEBA筛选和FACS验证

3.4.1 FASEBA筛选和亲和分级

扩增输出噬菌体的编码sdAb片段的DNA并***到pFASEBA载体中以筛选出先导抗体。在96深孔平板中接种单个的FASEBA文库克隆并诱导表达。进行ELISA筛选以分离特异性识别CD3-His蛋白的sdAb，并且选择用于Octet的亲和分级的表达培养基。在Octet RED96仪器（ForteBio）上进行解离速率筛选（Off-rate screening）。所有测试都在30°C进行。表达培养基中的sdAb-SASA蛋白被捕获至包被BSA的生物传感器并与CD3蛋白在溶液（1x PBS, pH7.4, 0.05% Tween-20）中一起孵育。其中一种浓度（100 nM）的CD3被用于解离速率分级。基线和解离步骤仅在缓冲液（1x PBS, pH 7.4, 0.05% Tween-20）中进行。使用Fortebio数据处理软件以动力学数据分析模式通过1:1 Langmuir结合模式来测定结合动力学。与CD3以高亲和力相互作用的结合物被筛选出并进行DNA测序。

3.4.2 FACS验证

为了筛选出结合Jurkat细胞而不结合KPCN细胞的sdAb，对培养物上清液进行流式细胞分析。Jurkat细胞和KPCN细胞生长至70-80%融合率时通过离心来收集细胞。每孔接种约4×10⁵个细胞，以PBS洗涤2次。向细胞中加入200µl的培养物上清液并在室温下孵育1小时。用PBS洗涤后，向细胞中加入抗体以检测结合的sdAb。30分钟孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于PBS。使用FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) 和Flowjo软件分析细胞的sdAb结合。

4. 结果

4.1 免疫响应测试

图2显示了血清效价实验结果。免疫后第一次和第二次测试血清的效价比免疫前血清高得多。免疫后第一次和第二次测试血清的效价之间没有观察到显著差异。

4.2 sdAb噬菌体展示库构建

4.2.1 总RNA提取

从所有获得淋巴细胞中分离出约449µg总RNA（图3），约一半的总RNA被用来构建高质量文库。

4.2.2 RT-PCR和V_HH扩增

根据GenScript的SOP使用8对引物（4个正义引物x2个反义引物）进行RT-PCR。使用不同引物对获得的产物被混合在一起并进行凝胶纯化（图4）。一共获得约24 µg纯V_HH PCR产物。一般的PCR产物被用于文库构建。

4.2.3 文库扩展

至少7.4×10⁷个转化子可从一组电转化中获得，所以平行地进行了10次转化，以获得最终的文库。文库大小约~7.4×10⁸为。根据菌落筛选，***率为97.92% (94/96)（图5）。一共测序了72个克隆，64个克隆位于框内。没有一个具有相同的氨基酸序列（数据未示出），表明sdAb文库具有高度的多样性。

4.3 噬菌体文库淘选

进行了两轮淘选和噬菌体ELISA，表1列出了相关细节。

表1. 淘选和噬菌体ELISA实验的详细信息

轮次	输入(pfu)	输出(pfu)	噬菌体ELISA阳性率
				1^st	2.0×10¹¹	3.0×10⁵	~ 5%
2^nd	3.5×10¹⁰	9.7×10⁷	~ 51%

4.4 FASEBA筛选和FACS验证

4.4.1 FASEBA筛选和亲和分级

扩增第二轮输出噬菌体的编码sdAb片段的DNA，并***pFASEBA载体中以通过ELISA筛选先导抗体。通过FASEBA ELISA筛选得到32个克隆。该32个克隆都进行DNA测序，并进行与CD3的结合测试，随后通过Octet RED96进行解离速率分析。结合FACS的结果（4.4.2），利用FortteBio数据分析软件选择出曲线中低解离部分的单独克隆。表2显示了所选择的sdAb克隆的动力学数据。

表2. sdAb克隆的动力学数据

Sample ID	序列号	k_off(1/s)
			A30244	SEQ ID NO. 1	1.91E-05
A30326	SEQ ID NO. 3	2.99E-05

4.4.2 FACS验证

通过FACS来验证阳性培养物（来自4.4.1）上清液的Jurkat细胞结合，KPCN用作阴性对照细胞系。结合亲和分级的结果（4.4.1），结合MFI列于表3。

表3. 培养物上清液与Jurkat细胞和KPCN细胞*的结合MFI

Sample	A30244	A30326	NC-sdAb	TG1
					Jurkat细胞	237.03	278.03	115.03	132.03
KPCN细胞	62.5	68.8	51	54.5

*: NC-sdAb(相同形式的非相关性sdAb)的培养物上清液被设置为阴性对照，TG1的培养物上清液被设置为背景对照。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 抗CD3单域抗体

<130> 16501CN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Tyr Arg

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Asp Thr Arg Gln Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Asp Leu Leu Val Thr Trp Ala Thr Ala Tyr Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtacagc tggtggagtc tgggggagga tcggtgcagg ctgggagctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagg taccgtgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccaggaaagg agcgtcaatt tgtagcaggt attagttcag atactaggca gacaggttac 180

ggagactccg tgaagggccg attcgccatc tcccgagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agccgcggac 300

cttttggtaa catgggccac agcgtatgac tcctggggcc gggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asp Thr Met

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

35 40 45

Val Arg Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Thr Asn Thr Val Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys His Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Arg Leu Ala Gly Arg Gly Ala Ala Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcgat accatgggct ggttccgcca ggctccaggg 120

aaggagcgtg agtttgtagc agcggttaga tggagtagtg gtaatacata ctatggaaac 180

accgtgaagg gccgattcac catctccaga gacactgcca cgaacacggt gtatctggaa 240

atgaacagtc tgaaacatga ggacacggcc gtttattact gtgcagcccg attggctggt 300

aggggcgcgg ctgaccactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351

Claims

1.一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。

2.一种编码权利要求1所述的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

5.一种表达载体，其包含权利要求2至4任一项所述的核苷酸序列。

6.一种包含权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

8.一种双特异性抗体，其包含权利要求1所述的抗CD3单域抗体的氨基酸序列。