KR20140146857A - Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 - Google Patents
Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20140146857A KR20140146857A KR1020130069698A KR20130069698A KR20140146857A KR 20140146857 A KR20140146857 A KR 20140146857A KR 1020130069698 A KR1020130069698 A KR 1020130069698A KR 20130069698 A KR20130069698 A KR 20130069698A KR 20140146857 A KR20140146857 A KR 20140146857A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- cells
- cell
- senescence
- aging
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 종양세포에서 HS2ST1 유전자를 억제하여 세포의 노화를 유도할 수 있으므로, 종양세포에서 항암 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 HS2ST1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법에 관한 것이다.
종양세포 조기 노화는 스트레스-유도 조기 노화라고도 하며, 다양한 자극에 의해 종양세포에서 발생하는 노화를 의미한다. 종양세포는, 일정한 횟수만큼만 분열하고 노화되는 정상세포와 달리, 암화 과정에서 복제성 노화의 특성이 변화되어 무한정 분열하는 세포들이므로, 종양세포는 세포 노화과정이 진행되지 않을 것이라는 개념이 일반적이었다. 그러나, 최근 종양세포도 다양한 자극에 의해 세포 노화가 급격히 유도됨이 알려지게 되었고 이를 스트레스-유도 조기 노화 (stress-induced premature senescence)라 한다(Sugrue et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 94:9648-9653, 1997; Mason et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004). 종양세포의 노화를 유도할 수 있는 스트레스원으로는 유전적 독성 화학물질 (예, etoposide, cyclophophamide), 방사선, 자외선 등이 보고되었다(Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007; Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394, 2002).
최근 스트레스 유도 조기노화를 이용한 종양세포의 노화를 통한 종양세포 증식 억제가 암 환자 치료를 위한 효율적인 기전으로 제시되었으며 (Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001; Campisi, Science, 309:886-887, 2005), 세포 노화 유도 기전 연구를 통한 암 치료의 효율성 증대가 필수적임이 제안되었다(Narita 및 Lowe, Nature Medicine, 11:920-922, 2005). 또한, 종양의 악성화가 저지된 암 환자의 조직 분석 결과, 종양세포 노화가 효율적으로 유도되었음이 보고되었고(Collado et al., Nature, 436:642, 2005), 종양 억제 단백질 p53이 작용해 세포 노화를 통해 종양조직이 효율적으로 제거됨이 종양모델 동물 실험에서 입증되었다(Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007). 이는 종양 치료에 세포 노화가 유용하게 활용될 수 있음을 제시하는 것이다. 실질적으로 종양세포의 노화기전 활성화는 세포사멸 기전 활성화보다 낮은 용량의 항암제나 방사선 투여를 가능하게 함으로서 암치료 부작용을 개선할 수 있고, 세포사멸에 대한 저항성을 획득한 종양세포의 암 치료 저항성 극복에 이용될 수 있다(Rebbaa, Cencer Lett, 219:1-13, 2005).
한편 HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1)은 NCBI(미국 국립생물공학정보센터; National Center for Biotechnology Information) Access No. NM_012262 (서열번호 1) 또는 NM_001134492 (서열번호 2)인 유전자로 종양세포 조기노화와 관련하여 알려진 바가 없다.
Sugrue et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 94:9648-9653, 1997, Wild-type p53 triggers a rapid senescence program in human tumor cells lacking functional p53.
Mason et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004, Molecular signature of oncogenic ras-induced senescence.
Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007, Oncogenes and senescence: breaking down in the fast lane.
Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394, 2002, Molecular determinants of terminal growth arrest induced in tumor cells by a chemotherapeutic agent.
Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001, If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells.
Campisi, Science, 309:886-887, 2005, Suppressing cancer: the importance of being senescent.
Narita 및 Lowe, Nature Medicine, 11:920-922, 2005, Senescence comes of age.
Collado et al., Nature, 436:642, 2005, Tumour biology: senescence in premalignant tumours.
Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007, Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas.
Rebbaa, Cencer Lett, 219:1-13, 2005, Targeting senescence pathways to reverse drug resistance in cancer.
이에 본 발명자들은 종양세포에서 세포내 황산화 과정을 억제할 경우(예를 들어, HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1) 유전자를 억제할 경우) 종양세포의 노화를 유도함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 세포 노화 유도용 조성물을 제공하는 데에 있다. 또한 본 발명의 다른 목적은 세포 노화 유도용 조성물을 이용한 세포 노화 유도 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있으며, 상기 억제제는 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다.
본 발명에서 상기 HS2ST1 유전자는 서열번호 1의 염기서열 (NCBI Access No. NM_012262) 또는 서열번호 2의 염기서열 (NCBI Access No. NM_001134492)을 포함한다. 또한 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 포함한다.
본 발명에서 상기 HS2ST1 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드를 포함한다. 또한 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 상기 HS2ST1 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.
본 발명에서 상기 억제제는 HS2ST1 유전자 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 즉, 상기 억제제는 HS2ST1 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 5의 센스서열(5'-UGU AGU CUC UCC CAC AGA U-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-AUC UGU GGG AGA GAC UAC A-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질에 대한 억제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 HS2ST1 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 암세포일 수 있다. 상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 유방암 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포 노화 유도용 조성물은 약학조성물일 수 있으며, 본 발명의 세포 노화 유도용 조성물 중 HS2ST1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제에 의해 종양세포에 노화가 유도되어 항암작용을 나타낼 수 있다.
본 발명의 세포 노화 유도용 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상 을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 세포 노화 유도용 조성물은 특히, 종양세포의 노화를 유도하기 위하여 유전자 억제제, 예를 들어 siRNA 기준으로 성인 1일 1회 0.01ng/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있고, 단백질 억제제, 예를 들어 항체 기준으로 성인 1일 1회 2~10mg/kg 의 용량으로 투여할 수 있으며, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 세포 노화 유도용 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포에 HS2ST1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 세포의 노화 유도 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 세포는 인간을 제외한 포유동물의 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 암세포일 수 있다. 상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 유방암세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 종양세포 노화 유도용 조성물의 제조를 위한 HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 세포 노화 유도용 조성물은 종양세포에서 HS2ST1 유전자를 억제하여 세포의 노화를 유도할 수 있으므로, 종양세포에서 항암 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 인간 유방암 세포주 MCF7에 세포내 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨를 농도별 처리 또는 미처리(대조군)하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰한 결과를 보여주는 도이다.
도 2는 인간 유방암 세포주 MCF7에 세포내 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨를 농도별 처리 또는 미처리(대조군)하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 차아염소산나트륨을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 p53 및 p21의 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 4는 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨(NaClO3)에 의한 세포내 황산화과정 중 하나인 헤파란 황산화(Heparan sulfate proteoglycan; HSPG)의 저해 효과를 보여주는 도이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 6은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 인간 섬유아 세포주 HDF의 복제성 노화에 따른 헤파란 설페이트의 발현 감소를 공초점 현미경 (LSM-710, 칼 자이스 사)으로 630 X 배율로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 8은 인간 섬유아 세포주 HDF의 복제성 노화에 따른 헤파란 설페이트의 발현 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 9는 HS2ST1 억제제 또는 HS3ST1 억제제에 의한 헤파란 황산화의 저해 효과를 보여주는 도이다.
도 10은 HS2ST1 억제제 또는 HS3ST1 억제제 처리에 의한 세포증식율 을 보여주는 도이다.
도 11은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 siControl, siHS3ST1 또는 siHS2ST1를 처리하고 2 일 동안 배양한 후 Rb의 인산화 정도 및 p21 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 12는 인간 유방암 세포주 MCF7에 각각 siControl, siHS2ST1 siHS3ST1를 처리하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰한 결과를 보여주는 도이다.
도 13은 인간 유방암 세포주 MCF7에 각각 siControl, siHS2ST1 siHS3ST1를 처리하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 유방암 세포주 MCF7에 세포내 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨를 농도별 처리 또는 미처리(대조군)하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 차아염소산나트륨을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 p53 및 p21의 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 4는 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨(NaClO3)에 의한 세포내 황산화과정 중 하나인 헤파란 황산화(Heparan sulfate proteoglycan; HSPG)의 저해 효과를 보여주는 도이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 6은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 인간 섬유아 세포주 HDF의 복제성 노화에 따른 헤파란 설페이트의 발현 감소를 공초점 현미경 (LSM-710, 칼 자이스 사)으로 630 X 배율로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 8은 인간 섬유아 세포주 HDF의 복제성 노화에 따른 헤파란 설페이트의 발현 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 9는 HS2ST1 억제제 또는 HS3ST1 억제제에 의한 헤파란 황산화의 저해 효과를 보여주는 도이다.
도 10은 HS2ST1 억제제 또는 HS3ST1 억제제 처리에 의한 세포증식율 을 보여주는 도이다.
도 11은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 siControl, siHS3ST1 또는 siHS2ST1를 처리하고 2 일 동안 배양한 후 Rb의 인산화 정도 및 p21 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 12는 인간 유방암 세포주 MCF7에 각각 siControl, siHS2ST1 siHS3ST1를 처리하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰한 결과를 보여주는 도이다.
도 13은 인간 유방암 세포주 MCF7에 각각 siControl, siHS2ST1 siHS3ST1를 처리하고 노화-관련 베타갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예
1.
세포내
황산화과정의
저해와 세포노화와의 유도와의 상관관계
확
인
1.1. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 종양세포주의
황산
화과정의 저해에 의한 노화 유도 확인
인간 유방암 세포주 MCF-7 (ATCC, USA)의 세포내 황산화과정의 저해와 세포노화와의 상관관계를 알아내기 위하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 세포내 황산화과정의 저해제인 차아염소산나트륨 0 mM, 15 mM 또는 30 mM 처리한 인간 유방암 세포주 MCF7을 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 3일 동안 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지에서 배양한 후 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.
세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.
인간 유방암 세포주 MCF7에 세포내 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨를 처리 또는 미처리(대조군)한 후 베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과 대조군과 달리 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨을 처리한 후 3일 경과한 인간 유방암 세포주 MCF-7는 노화세포의 특징인 세포의 크기가 커지며 편평해진 것을 확인할 수 있다. 특히 차아염소산나트륨 처리 농도가 높아질수록 노화세포의 특징을 보이는 세포의 비중이 커짐을 확인할 수 있다.
또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율에 관한 그래프를 도 2에 나타내었다. 특히 차아염소산나트륨 처리 농도가 높아질수록 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율이 더 커짐을 확인할 수 있다.
따라서, 상기 결과들로부터 종양세포에서 세포내 황산화과정을 억제할 경우 종양세포의 노화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있다.
1.2.
웨스턴
분석을 이용한 종양세포주의
황산화과정의
저해에 의한 노화 유도 확인
차아염소산나트륨 0 mM, 15 mM 또는 30 mM을 처리하고 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 24시간 배양 배지에서 배양된 인간 유방암 세포주 MCF-7은 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 11,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20ug의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.
전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체 (polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-actin 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-p53 항체 (polyclonal anti-p53 Ab, Leica 사) 를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 또는 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 세포노화여부를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 차아염소산나트륨을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 p53 및 p21의 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다. 도 3에서 액틴(Actin)은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.
웨스턴블럿팅 분석 결과를 통해, 차아염소산나트륨 처리에 의해 인간 유방암 세포주 MCF-7에서 노화 특이적 p53 및 p21의 발현이 증가하여 차아염소산나트륨에 의한 노화가 유도되었음을 확인할 수 있다. 특히 차아염소산나트륨 처리 농도가 높아질수록 노화 특이적 p53 및 p21의 발현 증가가 더 커져 차아염소산나트륨에 의한 노화 유도 비율이 커짐을 확인할 수 있다.
따라서, 상기 결과들로부터 종양세포에서 세포내 황산화 과정을 억제할 경우 종양세포의 노화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예
2.
차아염소산나트륨의
세포내
황산화과정
중 하나인
헤파란
황산화(
Heparan
sulfate
proteoglycan
HSPG
)의 저해 확인
차아염소산나트륨 0 mM, 15 mM 또는 30 mM을 처리하고 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 24시간 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지에서 배양하였다. 인간 유방암 세포주 MCF-7의 세포배양액을 걷어내고 PBS로 2회 세척하고 3.7 % 포름알데하이드에 20분 동안 상온에 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후 PBS로 2회 세척한 후 3% 소혈청알부민 (BSA)이 함유된 PBS 용액에 넣고 상온에서 30 분간 블로킹하고 1:100으로 희석한 항-헤파란 황산화 항체 (10E4, US biological 사)를 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. PBS로 10분간 3회 세척후 2차 항체로 Alexa 555 복합 항-쥐 항체 (Molecular probe 사)를 1:200 으로 희석한 PBS 용액에 상온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 10분간 2회 세척후 50 % 글리세롤로 마운팅 (mounting) 한 후 공초점 현미경 (LSM-710, 칼 자이스 사)으로 630 X 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과 대조군과 달리 황산화 과정의 저해제인 차아염소산나트륨을 처리한 후 24시간 경과한 인간 유방암 세포주 MCF-7에서 세포내 단백다당의 황산화과정 중 하나인 헤파란 황산화가 저해됨을 확인할 수 있다. 특히 차아염소산나트륨 처리 농도가 높아질수록 세포내 단백다당의 황산화과정 중 하나인 헤파란 황산화 저해 정도가 커짐을 확인할 수 있다.
실시예
3.
복제성
노화와
단백다당의
헤파란
황산화
과정의 연관성을
확인
3.1. 계대 횟수에 따른
복제성
노화 확인
복제성 노화를 연구하기 위하여, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA)를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml 로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30 으로 하여 각각 젊은 세포, 중간-늙은 세포, 늙은 세포로 구분하여 세포노화가 제대로 일어났는지 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.
세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 1 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.
베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 전체 세포에 대한 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율에 관한 그래프를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 p10 및 p20의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다. 도 6에서 p10 및 p20의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다.
도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 계대 횟수가 증가될수록 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.
따라서, 계대 횟수가 증가될수록 복제성 노화가 진행됨을 확인할 수 있다.
3.2.
복제성
노화에 따른
단백다당의
헤파란
황산화
정도의 변화 확인
복제성 노화와 단백다당의 헤파란 황산화 과정의 연관성을 확인하기 위하여, 항-헤파란 항체를 이용하여 염색하였다. 구체적으로, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA)를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진) 과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO2 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30 으로 하여 각각 젊은 세포, 중간-늙은 세포, 늙은 세포로 구분하였고 각각의 세포를 PBS로 2회 세척하고 3.7 % 포름알데하이드에 20분 동안 상온에 방치하여 세포를 고정시킨다. 그 후 PBS로 2회 세척한 후 3% 소혈청알부민 (BSA) 이 함유된 PBS 용액에 넣고 상온에서 30 분간 블로킹하고 1:100으로 희석한 항-헤파란 황산화 항체 (10E4, US biological 사)를 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. PBS로 10분간 3회 세척 후 2차 항체로 Alexa 555 복합 항-쥐 항체 (Alexa 555 conjugated goat anti-mouse IgG, Molecular probe 사)를 1:200으로 희석한 PBS 용액에 상온에서 30 분간 반응시켰다. PBS로 10분간 2회 세척 후 50 % 글리세롤로 마운팅 (mounting)한 후 공초점 현미경 (LSM-710, 칼 자이스 사)으로 630 X 배율로 관찰하여 도 7에 나타내었다.
도 7과 동일 실험군의 세포를 PBS 로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 ㎍/ml 아프로티닌, 2 ㎍/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,200rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20㎍의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다. 전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 단클론 항-헤파란 (monoclonal anti-HS Ab, US biology 사) 항체과 다클론 항-actin 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 혹은 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사) 를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 세포내 단백다당의 헤파란 황산화 정도를 측정하였다. 도 8은 인간 섬유아 세포주 HDF의 복제성 노화에 따른 헤파란 설페이트의 발현 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 7 및 8에서 나타난 바와 같이, 복제성 노화가 진행될수록 세포내 헤파란의 황산화 정도가 감소됨을 확인하였다.
따라서, 상기 결과들로부터 종양세포에서 세포내 황산화 과정을 억제할 경우 종양세포의 노화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예
4.
HS2ST1
억제제 및
HS3ST1
억제제에 의한
헤파란
황산화(
Heparan
sulfate
proteoglycan
;
HSPG
)의 저해 확인
단백다당의 헤파란 황산화 과정을 매개하는 효소들 1) HS3ST1 {(heparan sulfate 3-O sulfotransferase; NCBI Access No. NM_005114(서열번호 7)}, 2) HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase; Access No. NM_012262(서열번호 1) 또는 NM_001134492(서열번호 2)}의 유전자 발현량 감소에 의한 효과를 확인하기 위해 종양세포주인 인간 유방암 세포주 MCF-7 (ATCC, USA)을 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 DMEM 배양 배지 안에서 배양하고 작은 간섭 RNA의 주입 하루 전, 60 mm 배양접시로 계대배양한 후 2 μl의 RNAiMAX (invitrogen, Cat#13778-075)와 OptiMEM®I 배양배지 (Invitrogen, Cat#31985)를 섞고 HS3ST1 유전자에 대한 작은 간섭 RNA{siHS3ST1; 5'-CUG ACU ACA CCC AAG UGU U-3' (서열번호 8) 및 5'-AAC ACU UGG GUG UAG UCA G-3' (서열번호 9)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임)} 또는 HS2ST1 유전자에 대한 작은 간섭 RNA{siHS2ST1; 5'-UGU AGU CUC UCC CAC AGA U-3' (서열번호 5) 및 5'-AUC UGU GGG AGA GAC UAC A-3' (서열번호 6)로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 50 nM의 농도로 세포에 처리하였다. 6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM 배양 배지로 교환한 후, 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 4 일간 배양하였다.
또한, 상기 인간 유방암 세포주 MCF-7 중 비특이적 작은 간섭 RNA{siControl; 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3'(서열번호 10)과 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG G-3'(서열번호 11)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 주입한 세포주를 대조군으로 하였다.
siRNA는 모두 바이오니아(대한민국)에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다. 구체적으로, β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 사용하여 siRNA를 합성하였다(참조: Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 이어, 전기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan)을 사용한 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)에 적용하여, RNA를 분리하고 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(Shimadzu, Japan)에 적용하여, 합성하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그런 다음, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜서, 목적하는 이중가닥 siRNA를 각각 제조하였다.
인간 유방암 세포주에 HS3ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS3ST1), HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS2ST1) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (siControl)를 주입한 후 3 일 동안 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양한 후 세포배양액을 걷어내고 PBS 로 2회 세척하고 3.7 % 포름알데하이드에 20분 동안 상온에 방치하여 세포를 고정시킨다. 그 후 PBS 로 2회 세척한 후 3% 소혈청알부민 (BSA)이 함유된 PBS 용액에 넣고 상온에서 30 분간 블로킹하고 1:100 으로 희석한 항-헤파란 황산화 항체 (10E4, US biological 사)를 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. PBS 로 10분간 3회 세척 후 2차 항체로 Alexa 555 복합 항-쥐 항체 (Molecular probe 사)를 1:200 으로 희석한 PBS 용액에 상온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 10분간 2회 세척 후 50 % 글리세롤로 마운팅 (mounting) 한 후 공초점 현미경 (LSM-710, 칼 자이스 사)으로 630 X 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과 대조군(siCON)과 달리 HS3ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA 처리군(siHS3ST1), HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA 처리군(siHS2ST1)은 인간 유방암 세포주 MCF-7에서 세포내 단백다당의 황산화과정 중 하나인 헤파란 황산화가 저해됨을 확인할 수 있다.
실시예
5.
HS2ST1
억제제 또는
HS3ST1
억제제 처리에 의한
세포증식율
변화 여부 확인
인간 유방암 세포주 MCF-7에 실시예 4와 같이 준비한 HS3ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS3ST1), HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS2ST1) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (siControl)를 주입한 후 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1~3 일 동안 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지에서 배양한 후 도 10에 표기된 날짜별(0일, 1일, 2일, 3일)로 세포 상층액을 수확하고 트립신을 이용하여 세포를 떼어낸 후 PBS로 2차례 세척 후 0.4 % 트립판 블루 (NUNK 사) 와 1:1 로 혼합한 후 상온에서 5분 동안 방치 후 혈구계수기(MARIENFELD사) 상에서 트립판 블루에 염색되지 않은 세포의 개수를 세어 전체 세포 개수에 대한 백분율로 세포 증식율을 도 10에 나타내었다. 도 10에서 x축은 siHS3ST1, siHS2ST1 또는 siControl 처리한 후의 세포배양 일수를 나타내며, y축은 0일의 세포 개수를 기준으로 비교한 세포 증식율을 나타내다.
도 10에서 나타낸 바와 같이, siHS2ST1 처리군은 시간이 지남에 따라 대조군(siControl)군 및 siHS3ST1 처리군에 비해 종양세포(인간 유방암 세포주 MCF7)의 세포증식율이 낮아짐을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 결과를 토대로 종양세포(예를 들어, 인간 유방암 세포주 MCF7)에서 HS2ST1유전자 발현을 억제시킬 경우, 종양세포의 노화가 유도되어 세포증식율이 낮아짐을 확인할 수 있다.
실시예
6.
HS2ST1
억제제 또는
HS3ST1
억제제 처리에 의한 세포노화 유도 여부 확인
6.1.
웨스턴
분석을 이용한 종양세포주의
HS2ST1
억제제 또는
HS3ST1
억제제에 의한 노화 유도 여부 확인
실시예 4와 같이 준비한 HS3ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS3ST1), HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS2ST1) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (siControl)를 주입한 후 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 2 일 동안 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지에서 배양한 인간 유방암 세포주 MCF-7은 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 11,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)} 을 이용하여 정량하였다. 20ug의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.
전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체 (polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-actin 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), pRb 의 세린 잔기 중 인산화된 아미노산 807/811 만을 특이적으로 인지하는 항 p-pRb 항체 (anti-phospho-pRb Ab, cell signaling 사) 를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사) 를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 세포노화여부를 확인하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 인간 유방암 세포주 MCF-7에 siControl, siHS3ST1 또는 siHS2ST1를 처리하고 2 일 동안 배양한 후 Rb의 인산화 정도 및 p21 발현 정도를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다. 도 11에서 actin은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.
웨스턴블럿팅 분석 결과를 통해, siHS2ST1 처리군은 대조군(siControl)군 및 siHS3ST1 처리군에 비해 인간 유방암 세포주 MCF-7에서 노화 특이적 Rb의 인산화 감소와 노화 특이적 p21의 발현의 증가를 나타내어 노화가 더 많이 유도되었음을 확인할 수 있다.
따라서 상기 결과로부터 종양세포에서 HS2ST1유전자 발현을 억제시킬 경우, 종양세포의 노화가 유도될 수 있음을 확인할 수 있다.
6.2. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 종양세포주의 HS2ST1 억제제 또는
HS3ST1
억제제에 의한 노화 유도 여부 확인
실시예 4와 같이 준비한 HS3ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS3ST1), HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS2ST1) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (siControl)를 주입한 인간 유방암 세포 MCF7을 5% CO2 농도의 37℃ 항온 배양기에서 3일 동안 배양한 후 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.
세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.
베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 개수를 측정하여 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율에 관한 그래프를 도 13에 나타내었다.
siControl을 처리한 대조군(siCON 또는 siControl) 및 siHS3ST1 처리군과 비교하여, siHS2ST1 처리군에서 염색된 세포수 즉, 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성 세포수가 증가함을 확인할 수 있다. 특히, HS2ST1에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (siHS2ST1)를 처리한 siHS2ST1 처리군은 siControl을 처리한 대조군(siCON 또는 siControl) 및 siHS3ST1 처리군에 비해 노화현상이 현저하게 일어남을 확인할 수 있다.
따라서, 상기 결과를 토대로 종양세포(예를 들어, 인간 유방암 세포주 MCF-7)에서 HS2ST1 유전자 발현을 억제할 경우, 종양세포의 노화가 유도되어 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.
<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
<120> Composition for cell senescence comprising an inhibitor against
heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1 gene, or a protein encoded
by the gene and method for inducing cell senescence using the
same
<130> P12-095-KNUL
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 6770
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(6770)
<223> Homo sapiens heparan sulfate 2-O-sulfotransferase 1 (HS2ST1),
transcript variant 1, mRNA, Access No. NM_012262
<400> 1
ggaggggcgc gcggccgcga gcaaaggagg gagggaagga aggaagagag ggaggcgggc 60
aagcaggcgg gcgcgggggt cggggactga ggcagtagag ggaggcgaga gcccggcagc 120
cgcttcgcgc tgtttgctgc gcgggctttt ggagggggcg gccgtttagt cggctgagga 180
gaagcggaca ccagcggcgt tggtgatagc gcctggggga gggggactgg agaggcgaga 240
aggggggtcg ctgcggtggt tctctcgctg tcgctctctc tttgcctcgc tcccggctcg 300
gcgggctcct cccggcgtct ctctcgcctc cggggtcccg ctccccgccc cccgcggtat 360
gtcttgatcc cgagcagcgg gtttcatggg gctcctcagg attatgatgc cgcccaagtt 420
gcagctgctg gcggtggtgg ccttcgcggt ggcgatgctc ttcttggaaa accagatcca 480
gaaactggag gagtcccgct cgaagctaga aagggctatt gcaagacacg aagtccgaga 540
aattgagcag cgacatacaa tggatggccc tcggcaagat gccactttag atgaggaaga 600
ggacatggtg atcatttata acagagttcc caaaacggca agcacttcat ttaccaatat 660
cgcctatgac ctgtgtgcaa agaataaata ccatgtcctt catatcaaca ctaccaaaaa 720
taatccagtg atgtcattgc aagatcaggt gcgctttgta aagaatataa cttcctggaa 780
agagatgaaa ccaggatttt atcatggaca cgtttcttac ttggattttg caaaatttgg 840
tgtgaagaag aaaccaattt acattaatgt cataagggat cctattgaga ggctagtttc 900
ttattattac tttctgagat ttggagatga ttatagacca gggttacgga gacgaaaaca 960
aggagacaaa aagacctttg atgaatgtgt agcagaaggt ggctcagact gtgctccaga 1020
gaagctctgg cttcaaatcc cgttcttctg tggccatagc tccgaatgct ggaatgtggg 1080
aagcaggtgg gctatggatc aagccaagta taacctaatt aatgaatatt ttctggtggg 1140
agttactgaa gaacttgaag attttatcat gttattggag gcagcattgc cccggttttt 1200
caggggtgct actgaactct atcgcacagg aaagaaatct catcttagga aaaccacaga 1260
gaagaaactc cccactaaac aaaccattgc aaaactacag caatctgata tttggaaaat 1320
ggagaatgag ttctatgaat ttgcactaga gcagttccaa ttcatcagag cccatgccgt 1380
tcgagaaaaa gatggagacc tctacatcct cgcacaaaac tttttctatg aaaagattta 1440
ccctaagtcg aactgagtat aaggtgtgac tattggattc ttgaactaaa atttgaccct 1500
gtcttcacct ttgttctcag ctccacagtc tggattgctg acagtaggtg tatatgacaa 1560
tttgtattga gccaaattag gaaacagaca gtaacgtcaa ggaagtagat actggctggc 1620
attgtcagtg ttctaagttt caggcatttt tatttttcct ggctaaacgt tggtgaaagt 1680
tataacctcc tgcctgggag aaaatataca tcacctaaaa tgaacttatg gcaggtctaa 1740
tcaaaaggct aaatacaatt tcagaaaagg ttctgatact cttgtttttg ataaagcatt 1800
ttttcaacta accatgaatt aagatgagtc catttgcctc ttctgccttc actgagggtt 1860
tgggttatac acctctactg aattgtgtta ataactgttt ggcagtgtgt actttgtttt 1920
tgtgagtcat gtctcatgaa atttattgga atgtttaatc atatttgcta agaaatgttt 1980
ctgctgtagt tggatttgcc catatttatg taggtggttt taatttttta aatggtgatt 2040
agtgttaaaa atcaatttaa atcatgacta atatggtaaa aagataaagc atcaaagcag 2100
tatttctcat tcctgcctcc tcaatatcta atactgggaa gatacttcaa agaatattga 2160
gattgtctga agttttagtt aagattttca cacattaata tcaaaaaagt aagtttagta 2220
tttgtttctc catgggttat ttgtaaagct gtaaactgag atatcggtga ctccgtatta 2280
tgactccatt agtgagctgt ggtatgggta ggattttcct acttcttctg tacttttacc 2340
tgtagactat ttttactaag gtgctttata atgtgtttta aagcattgca tttacaaaac 2400
aaggaaaatg ctgtaaatat tgcatatttt atgtatttgg accaaaaggt tacaagtaat 2460
tagacaaaag tggttttgca ccaattttat gtcaagtaaa accatcagac ctactgttct 2520
tgtatttctc atttaacttt actgttaaga catcactgaa atgaacttca gtaagctttc 2580
aattttgata cacagttcat tattcataac ttgaggcagt aattacagtg gaatgagtac 2640
tggacaagga gtcaaaaaac ttgatttcag gtcctagctc tagcacttac agctgtgtga 2700
tcttgggcaa gtcacttaac ctctctttgc ctcaatttcc tcatcttgaa atgaggataa 2760
taatacctgc tgtacctacc tcacagggct gttgtgagga ttaaatgaga tggcatgtga 2820
aagcactttg aaaattgtaa agcgctatgt aaatgtaagg tattatagaa acatctttaa 2880
catatagttt cataccattc attttttaac aaagaaaggg aaaagtctgc ttgtaagctg 2940
gttgaaaaag ttaatcttga tataaatttg tgtttgataa atatcctctc agtgttttat 3000
cttccatgtt tcaacaacta ttgaaatatg aaatgcctgt gaactcttaa agcttcatga 3060
gcagctgctt gagttcagga agttcactgt tagaaatagg ctttgttagc tgactagggt 3120
cagggaaact tttctcttca aatttgaaag ctgtttctgt tttcatttta cattattatt 3180
cagaaatggt agctattcta tacctatggt ttaagtaaat atttctgaat aaggcttcac 3240
catactgtaa gcattttagg tagattgcct taaaggttat gggagggcat gagggaacac 3300
ttcttatgag aaaacattta taaacaaaag aaacatttat aaactaaaga aaaactaaaa 3360
gaatgacaga acaatcatct tagcaccctt tcctcacaat aatataaaaa tattaaaaga 3420
acataggcag gcttttttta aatttggctt ttttctttcc ttttttcaaa ttgactttta 3480
taggtatttc ctgaaagtgt atacaaatta tttcctcgcc caaaataaag caccacttca 3540
aggtgtggtt tgacattaca tgctaatgaa caaacccagt atgcaagtta ttcttgcacc 3600
acatgctcaa atcttcttga ggtgcattaa ctcttttagg taactagagc agtacttggt 3660
gaactagatc aggaggtcag taaactttct gtggaagggc cagagagtaa atattttagg 3720
ctttgcagcc catacggtct ctgtcacagc tagtcaaccc tgccatttta ccacaaaagc 3780
agcaatagac attatgtaaa caaatgagca cagttatgtt ccaataaaac tttatttaca 3840
aaaacagatg acatcccaga tgcagaccat gggcaaccaa ccattgcact ggccaaatca 3900
ttatttatgg agaaatcctc tttgtgtctc tactctagat gcctaaaaga gtttatatac 3960
ttctaaaagc tcctaactta tatccaaaga attgctttct gattcgtgta gtctctccca 4020
cagattcata aacttttatg acttatattg tttccaggtg ggcatggttt atttcccagt 4080
ttaacagttc agaatagggg catttatttt atcatatttt agggtgggtt aggagtatcc 4140
tttctggaga ctgagaaagg ggtgtattta attccatcag gtccagtaca gtactaggag 4200
tcataatact ttataatcaa ttaaataaat agaaccactg agacaataat gtattttttt 4260
aaagtggcaa atgtggtttt cttttttcag cctttgcgct ttttcagtat tttgaccata 4320
gggagataat ttttttataa tacaaaagta accacttgga attttaaaga taatgttatg 4380
tgtgtatgtg aaatatatat acatatatat atatatgttt atttcctaaa agaagaaaag 4440
atacctttct gttcaacttg tatcaactcc tcttttctaa ttgctgtgaa atggcaactg 4500
ttgataaatt attgtgattg ttttaaaatc taatgggaag taaaatatat tttgatttta 4560
cccagcttaa tctgtaaagt agcacttaaa tatatctgat agcaacactt aagatattgc 4620
atggggatta ctttcctatc atccatatgc atttgtgcaa cttcaaacat attgggtgct 4680
tctgaattcc tgatgattgg atttaagcta ttgaaaattg gataatttaa acttaatgat 4740
ttttataatt ttctgatctt aaaatttggt taatgcctat aatctgttgc tttttctcaa 4800
tatgtgtcct attggaaatt cctcaaatcg ttggtgccat cagtgattta caaacaatat 4860
tttgatattg cagatgactt gcttactgta tttgcattgt tagaaaacag tttgtagaca 4920
atgattcttt tttaataaaa tcaaataatt ctaaaagtgc tagagaattt aactaaaagc 4980
tggttcccaa atgcatagct ggcattttaa tttaaattca aatctacata gagaacatct 5040
gtgtaaatca tctaactgga tttttccatt ggtcattccc aaacacacct atggtcctag 5100
aatccttaag agaagcaccc tgtaaccttt tatgtggttt gcctttaaga ggcccaggtg 5160
cttctccttt atgatttgag ttggcctctt cataaattag tgctgtttac tttcagagga 5220
agcagagaag ttgctgttat gtttttgcat ccgtttaccc tatgcaaagt tgctgtatga 5280
tgccaactaa actactcttt aggcagcctt ctgaggagaa aagcaaccct gtttcaaatc 5340
cactgccaat tcagctcctc tggagtggag ctttctgatt tcttggagca ggaattttag 5400
agattgaaat gaatgatcat ttagtcagat ttatcctgta atttcatgca gctttgtggc 5460
ctttgcagta ctatttataa aatggaccct gatggtgatg aactctttag aacgcattac 5520
tgttaagcct gtgttgagac attgatgctg tctatctcat tttttagaca gtttttgtag 5580
ctttctattg agagtcaggt atgtgagcat ctctgaagca gtgttgaatg taattttcgg 5640
aaacatggat tgtgtatttt gacttttatt ttataaatac acagctcaac agtgcctttt 5700
ttttccctca tagtcctgtt ggaagatgct cactactttc tctcttctct ctccctgccc 5760
tcccccactc cattcagttg attcatttat gcaaattctg tttccaactt gaaaccattt 5820
tgtcacatct gttggagaga taatcactcc ttttccttaa cattctgcca gctttctgat 5880
gttgaagtgt ttcagttgac tacctgatgc aaaagctata aaataaacag tgggaagggg 5940
aaaaattggt gtcctgtttt aatattttct tttgtagcct tgacactgat ggacattttc 6000
caagctgact cagtgttcag tgtcaactta actctcagat agtgttgcca tcaagaaagc 6060
atgcaacatc attggtttct aatgatttta tggcttgtga caatatttta tctggactga 6120
catgcctctg ctgcttttgc tttgtacttc attgctggta ataaaatttc agatggaaaa 6180
cttacaaaat atatacttaa ttagaagaaa aaaatagaga aagggctatt agaattaaaa 6240
aaatttgaaa gtaacttaat ctaacattta tggcacagtt tggacatatc cataattttt 6300
tttgggaaca cacatttctg attttttttt tcccccttaa agaagaaagt ctcaattcca 6360
ttgattttca attcttagcc actggctcat tgctttgagc aatgcttgat tgattctatt 6420
tatattatat gatattgggt tgataaaata ccagttcaat gatgagtttt cttaacagaa 6480
tttggtttgt acttgcagtg gctgaacaaa gagcatggct tgagaatcaa agggatctgc 6540
atttagcaat gtgatgtcag taaatggaca taacaggatt gttgtaaagg ttgggcatga 6600
tgtatgcaaa gtactggcca gggtagacta ataactgatg gcatttatat gctgtgctgg 6660
aatattgtta ccaagctgat gtgccgttct caccctgcag aatactggtt ttgtcatttc 6720
ataaatgata tttttataaa tatttttgaa tgactgtaaa aaaaaaaaaa 6770
<210> 2
<211> 1623
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(1623)
<223> Homo sapiens heparan sulfate 2-O-sulfotransferase 1 (HS2ST1),
transcript variant 2, mRNA, NCBI NM_001134492
<400> 2
ggaggggcgc gcggccgcga gcaaaggagg gagggaagga aggaagagag ggaggcgggc 60
aagcaggcgg gcgcgggggt cggggactga ggcagtagag ggaggcgaga gcccggcagc 120
cgcttcgcgc tgtttgctgc gcgggctttt ggagggggcg gccgtttagt cggctgagga 180
gaagcggaca ccagcggcgt tggtgatagc gcctggggga gggggactgg agaggcgaga 240
aggggggtcg ctgcggtggt tctctcgctg tcgctctctc tttgcctcgc tcccggctcg 300
gcgggctcct cccggcgtct ctctcgcctc cggggtcccg ctccccgccc cccgcggtat 360
gtcttgatcc cgagcagcgg gtttcatggg gctcctcagg attatgatgc cgcccaagtt 420
gcagctgctg gcggtggtgg ccttcgcggt ggcgatgctc ttcttggaaa accagatcca 480
gaaactggag gagtcccgct cgaagctaga aagggctatt gcaagacacg aagtccgaga 540
aattgagcag cgacatacaa tggatggccc tcggcaagat gccactttag atgaggaaga 600
ggacatggtg atcatttata acagagttcc caaaacggca agcacttcat ttaccaatat 660
cgcctatgac ctgtgtgcaa agaataaata ccatgtcctt catatcaaca ctaccaaaaa 720
taatccagtg atgtcattgc aagatcaggt gcgctttgta aagaatataa cttcctggaa 780
agagatgaaa ccaggatttt atcatggaca cgtttcttac ttggattttg caaaatttgg 840
tgtgaagaag aaaccaattt acattaatgt cataagggat cctattgaga ggctagtttc 900
ttattattac tttctgagat ttggagatga ttatagacca gggttacgga gacgaaaaca 960
aggagacaaa aagacctttg atgaatgtgt agcagaaggt ggctcagact gtgctccaga 1020
gaagctctgg cttcaaatcc cgttcttctg tggccatagc tccgaatgct ggtaggggag 1080
ataaagttgg ctcagattga ttatcatcct tattatctct gtaatctgtg tttcatttca 1140
caagggctag atatagggaa atcggtgaaa gactagacta aaaataacat gtaattcagt 1200
aatatctagt tttgcagtta cttttaaatg catttaaaag attcctcatg tagagtgata 1260
tcctaatatc cttgcattgt tttctgagat gccggttttt agtatttctt atttttggtg 1320
ttatgttttg ctgtattcca gcagagctct tagagactgg gggtgggggt gggtgtcata 1380
aatcttattt tgtccaaagc ttactgtttt agctattcat gttaaattaa gaaaaggctt 1440
agtgggttaa aattcacctg gttttactgt taaactgatt ttgactttaa gagaagccaa 1500
ggttatggct gtggtttagt ttgctagtaa atatcaagtg gaaaataaag atactttaat 1560
aagaactgta tttcctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaa 1623
<210> 3
<211> 356
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(356)
<223> Homo sapiens heparan sulfate 2-O-sulfotransferase 1(HS2ST1)
isoform 1, protein
<400> 3
Met Gly Leu Leu Arg Ile Met Met Pro Pro Lys Leu Gln Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ala Phe Ala Val Ala Met Leu Phe Leu Glu Asn Gln Ile Gln
20 25 30
Lys Leu Glu Glu Ser Arg Ser Lys Leu Glu Arg Ala Ile Ala Arg His
35 40 45
Glu Val Arg Glu Ile Glu Gln Arg His Thr Met Asp Gly Pro Arg Gln
50 55 60
Asp Ala Thr Leu Asp Glu Glu Glu Asp Met Val Ile Ile Tyr Asn Arg
65 70 75 80
Val Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Asp Leu
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Lys Tyr His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn
100 105 110
Asn Pro Val Met Ser Leu Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Ile
115 120 125
Thr Ser Trp Lys Glu Met Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Val Ser
130 135 140
Tyr Leu Asp Phe Ala Lys Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile
145 150 155 160
Asn Val Ile Arg Asp Pro Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe
165 170 175
Leu Arg Phe Gly Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln
180 185 190
Gly Asp Lys Lys Thr Phe Asp Glu Cys Val Ala Glu Gly Gly Ser Asp
195 200 205
Cys Ala Pro Glu Lys Leu Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His
210 215 220
Ser Ser Glu Cys Trp Asn Val Gly Ser Arg Trp Ala Met Asp Gln Ala
225 230 235 240
Lys Tyr Asn Leu Ile Asn Glu Tyr Phe Leu Val Gly Val Thr Glu Glu
245 250 255
Leu Glu Asp Phe Ile Met Leu Leu Glu Ala Ala Leu Pro Arg Phe Phe
260 265 270
Arg Gly Ala Thr Glu Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Lys Ser His Leu Arg
275 280 285
Lys Thr Thr Glu Lys Lys Leu Pro Thr Lys Gln Thr Ile Ala Lys Leu
290 295 300
Gln Gln Ser Asp Ile Trp Lys Met Glu Asn Glu Phe Tyr Glu Phe Ala
305 310 315 320
Leu Glu Gln Phe Gln Phe Ile Arg Ala His Ala Val Arg Glu Lys Asp
325 330 335
Gly Asp Leu Tyr Ile Leu Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Tyr
340 345 350
Pro Lys Ser Asn
355
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(229)
<223> Homo sapiens heparan sulfate 2-O-sulfotransferase 1(HS2ST1)
isoform 2, protein
<400> 4
Met Gly Leu Leu Arg Ile Met Met Pro Pro Lys Leu Gln Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ala Phe Ala Val Ala Met Leu Phe Leu Glu Asn Gln Ile Gln
20 25 30
Lys Leu Glu Glu Ser Arg Ser Lys Leu Glu Arg Ala Ile Ala Arg His
35 40 45
Glu Val Arg Glu Ile Glu Gln Arg His Thr Met Asp Gly Pro Arg Gln
50 55 60
Asp Ala Thr Leu Asp Glu Glu Glu Asp Met Val Ile Ile Tyr Asn Arg
65 70 75 80
Val Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Asp Leu
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Lys Tyr His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn
100 105 110
Asn Pro Val Met Ser Leu Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Ile
115 120 125
Thr Ser Trp Lys Glu Met Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Val Ser
130 135 140
Tyr Leu Asp Phe Ala Lys Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile
145 150 155 160
Asn Val Ile Arg Asp Pro Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe
165 170 175
Leu Arg Phe Gly Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln
180 185 190
Gly Asp Lys Lys Thr Phe Asp Glu Cys Val Ala Glu Gly Gly Ser Asp
195 200 205
Cys Ala Pro Glu Lys Leu Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His
210 215 220
Ser Ser Glu Cys Trp
225
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens heparan sulfate
2-O-sulfotransferase 1(HS2ST1)
<400> 5
uguagucucu cccacagau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens heparan sulfate
2-O-sulfotransferase 1(HS2ST1)
<400> 6
aucuguggga gagacuaca 19
<210> 7
<211> 1965
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(1965)
<223> Homo sapiens heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1
(HS3ST1), mRNA, NCBI Access No. NM_005114
<400> 7
aacgcccgcc tgcaaggtcc tctgcgccct ggcagccagg agtcgccgcc acgaccgccg 60
ggtctcagtg ggtgcctgcg ccttctcccc gcccgcctgc cccgggccat ccagaaactt 120
gctctacccg ccgcgggtgc tcggcagtgc tgcccatggc ccagcccagg agcctattta 180
gggcgccgga cgggctggac agaggcgcgg ctcagtaatt gaaggcctga aacgcccatg 240
tgccactgac taggaggctt ccctgctgcg gcacttcatg acccagcggc gcgcggccca 300
gtgaagccac cgtggtgtcc agcatggccg cgctgctcct gggcgcggtg ctgctggtgg 360
cccagcccca gctagtgcct tcccgccccg ccgagctagg ccagcaggag cttctgcgga 420
aagcggggac cctccaggat gacgtccgcg atggcgtggc cccaaacggc tctgcccagc 480
agttgccgca gaccatcatc atcggcgtgc gcaagggcgg cacgcgcgca ctgctggaga 540
tgctcagcct gcaccccgac gtggcggccg cggagaacga ggtccacttc ttcgactggg 600
aggagcatta cagccacggc ttgggctggt acctcagcca gatgcccttc tcctggccac 660
accagctcac agtggagaag acccccgcgt atttcacgtc gcccaaagtg cctgagcgag 720
tctacagcat gaacccgtcc atccggctgc tgctcatcct gcgagacccg tcggagcgcg 780
tgctatctga ctacacccaa gtgttctaca accacatgca gaagcacaag ccctacccgt 840
ccatcgagga gttcctggtg cgcgatggca ggctcaatgt ggactacaag gccctcaacc 900
gcagcctcta ccacgtgcac atgcagaact ggctgcgctt tttcccgctg cgccacatcc 960
acattgtgga cggcgaccgc ctcatcaggg accccttccc tgagatccaa aaggtcgaga 1020
ggttcctaaa gctgtcgccg cagatcaatg cttcgaactt ctactttaac aaaaccaagg 1080
gcttttactg cctgcgggac agcggccggg accgctgctt acatgagtcc aaaggccggg 1140
cgcaccccca agtcgatccc aaactactca ataaactgca cgaatatttt catgagccaa 1200
ataagaagtt cttcgagctt gttggcagaa catttgactg gcactgattt gcaataagct 1260
aagctcagaa actttcctac tgtaagttct ggtgtacatc tgaggggaaa aagaatttta 1320
aaaaagcatt taaggtataa tttatttgta aaatccataa agtacttctg tacagtatta 1380
gattcacaat tgccatatat actagttata tttttctact tgttaaatgg agggcatttt 1440
gtattgtttt tcatggttgt taacattgtg taatatgtct ctatatgaag gaactaaact 1500
atttcactga aaaaaaaaaa aagatttttt ctggagacgc tatgtttttt tgaatataat 1560
taacttgccc ccaactcaaa atagctgtct gtgttgcaat cattgcaaaa tctaaattct 1620
tttgttactt aaaaaaacat gtttttcatg gctattacaa tcctctctct cccctctcct 1680
ttctgcattg ctctttttaa tttttaatgt ctcattgtga tcatcagatt tatttttact 1740
tggattgtaa gatttatctc ctcggcgatt ccttgtcatt tttggaggtc acagttttac 1800
tcattcccat gtgtaaactt caagtaaaca aagcaatatt caggatggag aagcagttag 1860
tgactggcta gaggtctctt gggatccatc ttgacctcaa agaatatttg cacatgcttc 1920
tgatctcagc agttataata aagaggatta aacccttggc cttca 1965
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense sequence of siRNA for Homo sapiens heparan sulfate
(glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1 (HS3ST1)
<400> 8
cugacuacac ccaaguguu 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense sequence of siRNA for Homo sapiens Homo sapiens heparan
sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1 (HS3ST1)
<400> 9
aacacuuggg uguagucag 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense sequence of non-specific siRNA
<400> 10
ccuacgccac caauuucgu 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense sequence of non-specific siRNA
<400> 11
acgaaauugg uggcguagg 19
Claims (8)
- HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 억제제는 siRNA인 세포 노화 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 센스서열이 서열번호 5, 안티센스 서열이 6인 세포 노화 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질에 대한 억제제는 항체인 세포 노화 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것인 세포 노화 유도용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포인 세포 노화 유도용 조성물.
- 인간을 제외한 포유동물의 세포에 HS2ST1 (heparan sulfate 2-O sulfotransferase 1) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 세포의 노화 유도 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 인간을 제외한 포유동물 세포의 노화 유도 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020130069698A KR101497930B1 (ko) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020130069698A KR101497930B1 (ko) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20140146857A true KR20140146857A (ko) | 2014-12-29 |
KR101497930B1 KR101497930B1 (ko) | 2015-03-03 |
Family
ID=52675897
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020130069698A KR101497930B1 (ko) | 2013-06-18 | 2013-06-18 | Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101497930B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2745376A1 (en) * | 2008-12-01 | 2010-06-10 | Lifespan Extension Llc | Methods and compositions for altering health, wellbeing, and lifespan |
-
2013
- 2013-06-18 KR KR1020130069698A patent/KR101497930B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101497930B1 (ko) | 2015-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tanjoni et al. | PND-1186 FAK inhibitor selectively promotes tumor cell apoptosis in three-dimensional environments | |
KR101102485B1 (ko) | Grs단백질 또는 이의 단편의 신규한 용도 | |
KR102344598B1 (ko) | 간암의 예방 또는 치료용 조성물 | |
WO2017223268A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS OF RESENSITIZING CELLS TO BROMODOMAIN AND EXTRATERMINAL DOMAIN PROTEIN INHIBITORS (BETi) | |
KR20070114970A (ko) | Tmprss4 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제 | |
KR101497930B1 (ko) | Hs2st1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화 유도 방법 | |
WO2012142930A1 (zh) | 抗脂肪酸合成酶多肽及其应用 | |
WO2012122941A1 (zh) | 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物 | |
KR20130033075A (ko) | 비소세포성 폐암에서 tm4sf4의 발현 또는 활성의 조절을 통한 방사선 저항성 및 암세포의 성장, 전이, 및 침윤능력을 저하시키는 방법 | |
KR101789261B1 (ko) | Dj-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 | |
KR101071305B1 (ko) | ARH1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 NF―κB 억제제 | |
KR101549667B1 (ko) | 방사선 요법으로 인한 부작용 개선 또는 예방용 조성물 및 이의 용도 | |
JP2013507950A (ja) | グアニン交換因子インヒビター及び抗癌剤としてのその使用 | |
KR101173223B1 (ko) | 항암용 조성물 | |
KR101697771B1 (ko) | Itm2a 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 하는 항암용 조성물 | |
KR102576855B1 (ko) | Tsp1을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물 | |
JP2020530844A (ja) | Setd2を阻害することにより癌を処置する方法 | |
KR101466372B1 (ko) | Papss2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 종양세포 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 종양세포 노화 유도 방법 | |
WO2012122942A1 (zh) | 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物 | |
KR102026142B1 (ko) | Crif1 억제제를 함유하는 항암 및 암전이 억제용 조성물 | |
KR100880850B1 (ko) | 고형암 세포에서 사이클로필린 a의 발현을 억제하는물질을 포함하는 시스플라틴에 대한 내성 억제용 약제학적조성물 및 그를 이용하여 고형암의 시스플라틴에 대한내성을 억제하는 방법 | |
EP2796137A1 (en) | SERCA inhibitor and Calmodulin antagonist combination | |
US20130190240A1 (en) | Tumor growth controlling method targeting galactosylceramide expression factor-1 | |
RU2577993C2 (ru) | Способ терапии злокачественной опухоли | |
KR101848106B1 (ko) | Gkn2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171208 Year of fee payment: 4 |