KR102344598B1

KR102344598B1 - 간암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102344598B1
Application number: KR1020210054499A
Authority: KR
Inventors: 남석우; 양희두
Original assignee: 주식회사 네오나
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2021-12-29
Also published as: KR20200119538A; KR20210056959A

Abstract

본 발명은 let-7i-5p의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 let-7i-5p의 발현 억제제는 간세포암종에서 종양 세포 성장, 증식, 이동 및 침습, 미세소관 형성, 및 혈관신생 활성을 억제하였으므로, 이를 간암의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용할 수 있다.

Description

간암의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LIVER CANCER}

본 발명은 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, let-7i-5p의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간암은 전 세계적으로 다섯 번째로 빈발하는 암이지만 그로 인한 사망률은 3위에 해당하는 공격적인 암이다(Ahn J, Flamm SL Hepatocellular carcinoma Dis Mon 2004;50:556-573) 치료목적의 수술은 단지 15%에서 25% 정도의 환자에게만 가능하고 대부분의 간암 환자들은 국부적으로 진행하거나 전이되는 질병들에 의해 비교적 단기간 내에 사망한다(Roberts LR, Gores GJ Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic targets Semin Liver Dis 2005;25:212-225) 간암의 주요 원인으로 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 및 아플라톡신 B1(aflatoxin B1) 등이 잘 알려져 있다. 하지만, 지난 20년간 간암 환자의 전체적인 생존율은 크게 증가하지 않았고, 간암의 발달(development) 및 진전(progression) 기작은 여전히 잘 알려져 있지 않은 상태이다(Bruix J, et al Focus on hepatocellular carcinoma Cancer Cell 2004;5:215-219) 지금까지, 분자표적치료(molecular targeted therapy)가 성숙한 간암의 치료에 효과적인 것으로 나타났지만(Shen YC, Hsu C, Cheng AL Molecular targeted therapy for advanced hepatocellular carcinoma: current status and future perspectives J Gastroenterol;45:794-807), 어떻게 이러한 유전적 변화가 간암 환자들 개개인에게 관찰되는 임상적 특징들을 야기하는지는 불명확하다.

HDACs (Histone deacetylases)는 종종 보조억제자(corepressors)나 다중-단백질 전사복합체(multi-protein transcriptional complexes)들에 의해 유전자 프로모터에 붙을 수 있으며, 그곳에서 DNA에 직접 결합하지 않고 크로마틴(chromatin) 변형을 통해 전사를 조절한다(Thiagalingam S, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Thiagalingam A, Ponte JF Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code Ann N Y Acad Sci 2003;983:84-100) 암호화된 사람 HDACs는 18개가 있으며, 이들은 클래스 I (HDAC 1, 2, 3 및 8), 클래스 II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10), 클래스 III (SIRT 1-7), 및 클래스 IV (HDAC11) 효소들로 분류된다(Yang XJ, Seto E The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:206-218) 히스톤 아세틸화 효소(acetyltransferases) 및 HDACs 모두 세포 증식, 분화 및 세포주기 조절에 관여한다는 사실이 알려져 있다(Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8-21) 또한, HDACs의 병리학적 활성 및 조절감소(deregulation)가 암, 면역질환, 및 근이영양증(muscular dystrophy)과 같은 여러 질병들을 야기할 수 있다는 사실이 보고되었다(Yang XJ, Seto E HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention Oncogene 2007;26:5310-5318). HDAC6는 HDACs의 클래스 IIb 패밀리 멤버이고, 미세소관(MTs)[0004] 과 관련 있는 세포질내 탈아세틸화효소(cytoplasmic deacetylase)로 작용하며, 알파-튜뷸린(α-tubulin)을 탈아세틸화시킨다(Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, et al HDAC6 is a microtubule-associated Mis18α. Nature 2002;417:455-458).

한편, miRNA는 세포 내에 존재하는 20-25 핵산(nucleotide) 길이의 작은 RNA (endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적인 서열에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다.

KR

10-2012-0014893

A

본 발명의 목적은 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 간암 환자 진단 또는 예후 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 간암 환자 진단 또는 예후 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 따른 let-7i-5p의 발현 억제제는 간세포암종에서 종양 세포 성장, 증식, 이동 및 침습, 미세소관 형성, 및 혈관신생 활성을 억제하였으므로, 이를 간암의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물로 이용할 수 있으며, 이의 발현 조절에 따른 간암 환자 진단 또는 예후 진단을 위한 정보제공방법에 활용할 수 있다.

도 1은 간세포암종에서 HDAC6에 의해 조절되는 miRNA들을 식별한 도이다.
도 2는 HCC 세포주에서 유의미하게 조절되는 Let-7i-5p를 확인한 도이다.
도 3은 HDAC6가 HCC에서 JNK-c Jun-miR-221-의존적으로 let-7i-5p를 억제하는 것을 나타낸 도이다.
도 4는 oncomiR let-7i-5p의 HCC에서의 기능적 특성을 확인한 도이다.
도 5는 HCC 세포주에서 let-7i-5p에 의해 표적화되어 직접적으로 하향-조절되는 THBS1를 확인한 도이다.
도 6은 let-7i-5p의 TSP1 억제 활성을 확인한 도이다.
도 7은 간세포암종에서 TSP1의 종양 억제자로서의 기능을 확인한 도이다.
도 8은 TSP1의 CD47 수용체를 통한 항-혈관신생 효과를 확인한 도이다.
도 9는 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 신호전달 축의 CD47를 통한 항-혈관신생 및 항-전이 효과를 HCC에서 확인한 도이다.
도 10은 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 축의 CD47를 통한 항-전이 잠재력의 약화를 확인한 도이다.
도 11은 HCC 세포의 대식세포 식작용 및 엑소좀 상호작용에서의 CD47-TSP1 상호작용의 효과를 확인한 도이다.
도 12는 HCC 세포의 대식세포 식작용에서 CD47-TSP1 상호작용의 항-식세포 효과를 확인한 도이다.
도 13은 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 축이 HCC 종양 형성을 조절하는 것을 in vivo로 확인한 도이다.
도 14는 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 축이 HCC 종양 형성을 조절하는 것을 in vivo로 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 let-7i-5p의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, let-7i-5p는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)일 수 있다.

일 구현예에서, let-7i-5p의 발현 억제제는 HDAC6(Histone deacetylase 6)일 수 있다.

일 구현예에서, let-7i-5p의 발현 억제제는 let-7i-5p의 발현을 억제하는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 앱타머일 수 있으며, 서열번호 2의 안티센스 let-7i-5p일 수 있다.

일 구현예에서, let-7i-5p의 발현 억제제는 TSP1의 분비를 증가시킬 수 있다.

일 구현예에서, 간암은 let-7i-5p 고발현 간암일 수 있으며, 간세포암종(hepatocellular carcinoma)일 수 있고, stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, ⅣA 또는 ⅣB 병기(phase)의 간세포암종일 수 있으며, 초기 병기보다 치료가 어려운 stageⅢ 내지 Ⅳ 병기의 간세포암종인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, let-7i-5p의 발현 억제제가 종양 세포 성장, 증식, 이동 및 침습을 억제할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 TSP1(thrombospondin-1)를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

일 구현예에서, 상기 발현양 측정은 mRNA의 발현 수준 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준을 확인함으로써 알 수 있다. mRNA의 양은 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양은 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, TSP1는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

간암은 TSP1 저발현 간암일 수 있으며, 간세포암종일 수 있고, stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, ⅣA 또는 ⅣB 병기(phase)의 간세포암종일 수 있으며, 초기 병기보다 치료가 어려운 stageⅢ 내지 Ⅳ 병기의 간세포암종인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, TSP1가 종양 세포 성장, 증식, 이동 및 침습, 미세소관 형성 및 혈관신생 활성을 억제할 수 있다.

일 구현예에서, TSP1은 CD47과 상호작용할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 TSP1를 암호화한 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, TSP1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, TSP1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 10³ 내지 10¹²IU (10 내지 10¹⁰PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁵ 내지 10¹⁰IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명의 TSP1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 10³ 내지 10⁸개를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁴ 내지 10⁷개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명의 TSP1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸IU)/㎏, 세포의 경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에서, 사용된 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간암의 발생, 발달 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 간암 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 감염증의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여 하는 것이 가장 바람직하다. 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료에서 let-7-5p 또는 TSP1의 발현을 확인하는 것을 포함하는 간암의 진단 또는 예후 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, let-7-5p이 정상 대조군에 비해 1.18배 이상 과발현되어 있으면 간암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하고; 또는 SP1이 정상 대조군에 비해 -1.40배 이하로 발현이 감소되어 있으면 간암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 사용된 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 피검 화합물 또는 조성물을 let-7-5p 또는 TSP1을 발현하는 세포주에 처리하고; 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 세포주에서 상기 let-7-5p 또는 TSP1의 발현 정도를 측정하며; 및 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 let-7-5p의 발현량이 감소되거나, TSP1의 발현량 또는 분비량이 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것을 포함하는 간암 치료제 후보물질의 스크리닝 방에 관한 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HCC를 억제하는 HDAC6의 표적 miRNA 확인

1-1. HDAC6에 의해 조절되는 miRNA 탐색

HCC(hepatocellular carcinoma)에서 HDAC6(Histone deacetylase 6)에 의해 조절되는 miRNA를 탐색하기 위하여, HDAC6을 트랜스펙션한 Hep3B 세포를 miRNA 마이크로어레이 분석을 수행하여 빈 벡터를 트랜스펙션한 Hep3B 세포와 비교 분석하였다. 구체적으로, Hep3B 세포를 pcDNA3.1_Mock (mock) 또는 pcDNA3.1_HDAC6 (HDAC6)로 트랜스펙션하고 각 시료의 데이터를 기본 변수를 이용하여 Genome Studio software (Illumina, San Diego, CA)로 추출하였다. 일차 마이크로어레이 데이터는 NCBI GEO public database (accession number: GSE100017)에서 입수할 수 있다. 그 결과, 129개의 miRNA가 HDAC6-트랜스펙션된 Hep3B 세포에서 하향-조절되는 것으로 나타났다 (GSE100017; < -1.5배 변화, p < 0.05). 그 후, 상기 miRNA들을 밴다이어그램 분석을 수행하여 HCC에서 비정상적으로 과발현된 것으로 공지된 miRNA들 (GSE39678; > 1.5배 변화, p < 0.05)과 비교하였다 (도 1A). 이를 통해, HCC에서 HDAC6에 의해 조절되는 18개의 miRNA들을 후보로 선발하였다 (도 1B). 이들 중 가장 많이 억제된 상위 5개의 miRNA들 중 miR-335-3p, miR-17-5p 및 miR-338-3p는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스 (GSE36915, GSE31384 및 GSE76903)에서 이용할 수 있는 HCC 환자의 코호트 연구에서 지속적으로 과발현되지 않는 것으로 나타나 후보에서 제외하였다. 또한, Cancer Genome Atlas 간 간세포암종 프로젝트(liver hepatocellular carcinoma project) (TCGA_LIHC)로부터 얻은 이들 5개의 miRNA의 캐퓰란-메이어 생존 분석에서, 나머지 let-7i-5p 및 miR-182-5p의 발현이 높은 HCC 환자들의 5-년 생존율이 let-7i-5p 및 miR-182-5p의 발현이 낮은 HCC 환자들에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다 (도 2A).

또한, HCC 세포주 (SNU-182, SNU-449 및 SNU-475)에서 총 RNA를 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 분리한 후, 상기 두 miRNAdp 특이적인 cDNA를 micscipt II RT 키트 (Qiagen, Manchester, UK) 및 Tetro cDNA 합성 키트 (Bioline, London, UK)를 이용하여 합성하였다. qRT-PCR은 SensiFASTTM SYBR®NoROX Kit (Bioline)로 수행되었다. HCC 세포주 (SNU-182, SNU-449 및 SNU-475)에서 상기 두 miRNA의 qRT-PCR 분석을 수행한 결과, let-7i-5p만이 모든 HCC 세포주에서 HDAC6의 재-활성화에 의해 지속적으로 하향-조절된 것을 확인하였다 (도 2B).

또한, 8개의 let-7-5p 패밀리 miRNA들 중 let-7i-5p 만이 NCBI GEO 데이터베이스의 HCC 환자의 7가지의 코호트 (GSE10694, GSE31384, GSE36915, GSE39678, GSE40744, GSE76903 및 GSE67882)에서 과발현되어 있는 것으로 나타났다 (표 1).

1-2. HCC에서의 let-7i-5p의 발현 확인

이에, HCC에서 let-7i-5p의 비정상적인 발현을 확인하기 위해, 40 비교-쌍(matched-pair) (HCC 조직 vs 비 암성 주변 간 조직)의 HCC 조직과 11가지의 HCC 세포주를 이용하여 상기와 같은 방법으로 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 상기 40 비교-쌍의 HCC 조직 및 이에 상응하는 비 암성 주변 간 조직은 한국의 국가 바이오뱅크(National Biobank)에서 입수하였으며, 헬싱키 선언에 따라 각 피험자로부터 서면 동의를 얻고, 카톨릭 대학교 의대의 성의 캠퍼스의 IRB(Institutional Review of Board)에서 승인을 받았다 (승인번호: MC12EISI0106). 그 결과, 40명의 HCC 환자들 중 20명 (50%)에게서 비-암성 간 조직에 비해 let-7i-5p의 현저한 과발현이 나타났다 (도 3A). 또한, 11가지의 HCC 세포주 중 9가지의 HCC 세포주에서 형질전환되지 않은 불멸화 간세포주 MIHA (immortalized non-transformed hepatocyte cell line)에 비해 let-7i-5p의 현저한 과발현이 나타났다 (도 3B).

1-3. HDAC6의 신호전달 경로에 의한 let-7i-5p 발현 조절 확인

그 후, let-7i-5p 발현이 HDAC6 및 이의 상류 조절 신호전달 경로에 의해 조절되는지 확인하기 위해, HCC 세포 (SNU-387 및 SNU-423)에 이소성(ectopic) HDAC6를 도입하였다. 그 결과, HDAC6의 이소성 과발현은 let-7i-5p를 현저히 억제하였으며, HDAC6 특이적 억제제인 Tubastatin A를 동일 세포에 처리하자 let-7i-5p의 발현이 회복되었다 (도 3C). HCC에서 HDAC6를 직접적으로 억제하는 JNK-c-Jun 경로-의존적 종양 형성(oncogenic) miR-221-3p를 양성대조군으로 이용한 결과, 비-형질전환 간세포 MIHA 및 L-02 세포주에서의 miR-221-3p 유사물의 이소성 발현은 HDAC6를 억제하였으며, 동시에 let-7i-5p의 유도를 야기하였다 (도 3D). 또한, c-Jun 낙다운 및 JNK-특이적 억제제 SP600125 처리에 의한 JNK 억제가 HDAC6 발현을 회복시켰으며, 이로 인해 HCC 세포에서 let-7i-5p가 억제되었다. 또한, HDAC6 낙다운은 동일 세포에서 let-7i-5p 발현을 회복시켰다 (도 3E 및 F).

이를 통해, let-7i-5p 발현이 JNK/c-Jun-miR-221-3p-HDAC6 조절 축의 하위에 위치함을 알 수 있었다.

실시예 2. let-7i-5p의 HCC에 대한 특성 확인

2-1. MTT 및 세포 생존 분석을 통한 let-7i-5p의 종양 형성에 대한 특성 확인

간암에서의 let-7i-5p의 종양 형성 특성을 확인하기 위하여, 인비트로 종양형성(in vitro tumorigenesis)을 확인하기 위해, 안티센스 let-7i-5p (AS-let-7i-5p)를 이용하여 MTT 분석 및 세포 생존 분석을 수행하였다. 구체적으로, MTT 분석을 위해, SNU-387 및 SNU-423 세포를 12-웰 플레이트에 분주하고 AS-let-7i-5p를 트랜스펙션한 뒤, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액 (Sigma) 0.5 mg/ml과 1시간 동안 인큐베이션한 뒤, VICTOR3 Multilabel 플레이트 리더기 (PerkinElmer, Waltham, MA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포 생존 분석을 위해, 세포들을 6-웰 플레이트에 분주하고 72시간 동안 배양한 뒤, 트립신으로 세포를 수득한 뒤 트립판 블루 용액 (Sigma, St. Louis, MO)으로 염색하였다. 염색한 뒤, 세포를 헤모사이토메터 (Marienfeld Superior, Lauda-Koonigshofen, Germany)로 계수하여 세포 생존을 확인하였다. 그 결과, let-7i-5p의 이소성 발현이 종양 세포 성장을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4A).

2-2. let-7i-5p의 종양 세포 증식에 대한 효과 확인

또한, 세포 증식을 확인하기 위해, BrdU(Bromodeoxyuridine) 분석 및 Clonogenic 분석을 수행하였다. 구체적으로, BrdU 분석을 위해, SNU-387 및 SNU-423 세포를 24-웰 플레이트에 40%-50%의 밀도로 분주한 뒤, BrdU 세포 증식 분석 키트 (Millipore)를 이용하여 확인하였다. Clonogenic 분석을 위해서는, 상기의 세포들을 60 mm² 세포 배양 플레이트에 분주한 뒤 AS-let-7i-5p를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24시간 후, 2 × 10³ 및 4 × 10³개의 세포들을 6-웰 플레이트에 분주하고 2주 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포들을 PBS로 세척하고 1% 파라포름알데하이드로 상온에서 30분 동안 고정하였다. 고정된 세포들을 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 상온에서 1시간 동안 염색한 뒤, 콜로니를 clono-계수 프로그램으로 계수하였다. 그 결과, BrdU 분석 및 Clonogenic 분석 모두 AS-let-7i-5p 트랜스펙션한 세포들에서 현저하게 종양 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4B).

2-3. let-7i-5p의 종양 세포 사멸에 대한 효과 확인

또한, AS-let-7i-5p 트랜스펙션에 의한 SNU-387 및 SNU-423 세포의 사멸 정도를 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 세포들을 AS-let-7i-5p로 트랜스펙션하고 72시간 뒤, 트립신으로 떼어내어 1 × 바인딩 버퍼 (1 × 10⁶ cells/mL)로 재부유하고 1 × 10⁵개의 세포를 함유하도록 10 ul를 5 ml 배양 튜브로 옮겼다. 그 후, Annexin V-FITC 5 ul 및 PI(propidium iodide ) 용액 10 ul를 첨가하고 세포들을 상온에서 암조건으로 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1 × 바인딩 버퍼 400 ul를 각 튜브에 첨가하고 사멸 분획을 FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 검출하였다. 그 결과, AS-let-7i-5p 트랜스펙션이 HCC 세포의 사멸을 현저히 유도하는 것을 알 수 있었다 (도 4C). 이 결과는 caspase-3 및 PARP 절단을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과에서도 동일하게 나타났다 (도 4D).

2-4. let-7i-5p의 종양 세포 이동 및 침습에 대한 효과 확인

또한, 상피-간엽 전이(Epithelial-tomesenchymal transition, EMT)가 암 진행의 핵심 과정으로 제시되어 왔으므로, HCC 세포의 악성 작용에서의 let-7i-5의 역할을 확인하기 위해, 스크래치 상처 치유 분석을 수행하였다. 구체적으로, SNU-387 및 SNU-423 세포를 AS-let-7i-5p로 트랜스펙션한 뒤 24시간 동안 인큐베이션하고, 세포들을 떼어내어 6-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁶개로 분주하였다. 하룻밤 동안 배양한 뒤, 세포 단일층을 멸균된 마이크로피펫 팁으로 긁어냈다. 스크래치 0시간 후 초기 스크래치의 간격과 24시간 후의 간격을 IX71 photomicrograph (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 그 결과, AS-let-7i-5p를 트랜스펙션하면 HCC 세포의 상처 치유 효과가 현저히 감소된 것을 알 수 있었다 (도 4E).

또한, 암세포의 이동 및 침습 특성을 확인하기 위하여, 변형된 Boyden chamber assay (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 세포 이동성을 확인하였다. 구체적으로, 침습 분석을 위해, 마트리젤 (BD Biosciences)을 코팅 버퍼로 희석하여 0.3 mg/ml의 농도로 만들었다. 그 후 마트리젤 100 ul로 트랜스웰 세포 배양 인서트(Transwell cell culture insert)의 상부 표면을 코팅하였다. 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 인서트의 표면에 세포를 분주하고 이를 화학 자극 물질로서 2% FBS를 함유하는 배지가 담긴 24-웰 플레이트에 장착하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 배양한 뒤 Diff-Quik staining kit (Sysmex, Kobe, Japan).를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지를 Axiovert 200 도립 현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 ×200 배율로 확인하였으며, 세포의 수는 랜덤하게 세 곳에서 계수하였다. 그 결과, SNU-387 및 SNU-423 세포주 모두에서 let-7i-5p의 억제가 화학-자극적 이동 및 침습 반응을 현저히 억제하는 것으로 나타났다 (도 4F).

상기 결과들을 통해, let-7i-5p의 비정상적 발현이 HCC의 항-사멸 및 전이 특성에 기여하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. let-7i-5p의 표적 분자 스크리닝

3-1. let-7i-5p의 표적 분자 탐색

let-7i-5p의 표적 분자를 확인하기 위하여, 표적 예측 프로그램인 TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)를 이용하였다. 이를 통해, let-7i-5p의 표적 분자로서 1,207 가지의 유전자를 선발하였다 (데이터 미도시). 선발된 분자들 중 세포 사멸 과정과 관련된 분자들을 DAVID Functional Annotation Tool 6.7 (https://david.ncifcrf.gov/)를 이용하여 선택하였다. 이로 인해 선택된 54 가지의 유전자 (GO: 0006915, GO: 0012501) 중 HCC 데이터세트 (Catholic_LIHC)에서 하향-조절되는 10가지의 유전자를 선택하고 추가적으로 세 개의 큰 HCC 코호트 연구 (TCGA_LIHC, ICGC_LIRI-JP 및 GSE77314)와 비교하였다. HCC에서 let-7i-5p의 표적 유전자를 선택하기 위해, 상기에서 선택한 10가지의 유전자에 대한 4개의 코호트 연구 (Catholic_LIHC, TCGA_LIHC, ICGC_LIRI-JP 및 GSE77314)의 배수 변화 (< -1.5 배, p < 0.001)에서의 중요성 점수를 계산하였다 (표 2). 그 결과. THBS1 (thrombospondin-1 gene)이 HCC 환자들의 4가지 코호트 연구에서 가장 현저하게 하향-조절되는 유전자로 나타났다. 또한, THBS1는 TCGA_LIHC 데이터세트의 50 비교-쌍 (HCC 조직 vs 비 암성 주변 간 조직)의 HCC에서도 현저하게 하향-조절되는 것으로 나타났다 (도 5A). 또한, HCC 서브 세트의 40 비교-쌍을 qRT-PCR 분석한 결과, THBS1가 HCC 서브 세트의 40 비교-쌍 중 26개의 비교-쌍 (65%)에서 현저히 하향-조절된 것으로 나타났다 (< -2.0 배, p <0.001) (도 5B의 왼쪽 패널). 또한, 동일한 HCC 서브 세트에서 let-7i-5p가 THBS1와 유의미하게 음의 상관 관계 (r = -0.55, P < 0.001)를 가지는 것으로 나타났다 (도 5B의 오른쪽 패널).

3-2. let-7i-5p의 TSP1 억제 활성 확인

TSP1(thrombospondin-1)는 여러 세포 유형에서 분비되는 당단백질이므로, SNU-387 및 SNU-423 세포주와 MIHA의 배양액에서 TSP1이 분비되는 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 그 결과, MIHA와 달리 SNU-387 및 SNU-423 세포주에서는 TSP1의 분비가 검출되지 않았다 (도 6A).

또한, 루시퍼레이즈 분석을 위해, SNU-387 및 SNU-423 세포주의 cDNA로부터 TSP-1 mRNA의 3'-UTR을 PCR로 증폭한 뒤, psiCHECK-2 벡터 (Promega, Madison, WI)의 XhoI/NotI 위치에 클로닝하여 리포터 벡터 psiCHECK2-THBS1_3' UTR를 제작하였다. 그 후 psiCHECK2-THBS1-3' UTR와 안티센스 let-7i-5p (ASlet-7i-5p)의 듀얼 루시퍼레이즈 리포터 분석을 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)를 이용하여 수행하였으며 이의 결과를 음성 대조군인 대조군 안티센스 억제제 처리군 (N.C)의 결과와 비교하였다. 그 결과, SNU-387 및 SNU-423 세포주 모두에서 AS-let-7i-5p 처리로 인해 대조군에 비해 루시퍼레이즈 활성이 현저히 증가되었다 (도 6B).

또한, 상기 두 세포주에 Dicer siRNA (siDicer) 및/또는 AS-let-7i-5p를 트랜스펙션한 뒤, 유도된 TSP1을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, Dicer 낙다운은 TSP1의 유도를 유발했으나, let-7i-5p 처리는 Dicer 낙다운 효과를 약화시켰다 (도 6C의 위쪽 패널). 또한, AS-let-7i-5p를 트랜스펙션한 후 상기 두 세포주에서의 TSP1 분비 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, AS-let-7i-5p가 TSP1의 분비를 증가시키는 것으로 나타났다 (도 6C의 아래쪽 패널).

3-3. TSP1의 종양 세포 이동 및 침습에 대한 효과 확인

MIHA 세포로부터 부분 정제된 TSP1 (MIHA_ppTSP1)를 처리한 것의 상처 치유 효과를 확인한 결과, AS-let-7i-5p가 HCC의 상처 치유 효과를 억제한 것과 유사한 정도인 것으로 나타났다 (도 6D).

또한, 암세포의 이동 및 침습 특성을 확인하기 위하여, 변형된 Boyden chamber assay (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 세포 이동성을 확인한 결과, AS-let-7i-5p 처리 및 MIHA_ppTSP1 처리 모두 HCC 세포의 이동 및 침습을 현저히 억제한 것으로 나타났다 (도 6E).

상피-간엽 전이에 대한 let-7i-5p 및 MIHA_ppTSP1의 조절 효과를 확인하기 위해, EMT 조절 분자로, EMT의 특징인 N-cadherin, Fibronectin, Slug 및 Snail과 상피 마커인 E-cadherin의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 그 결과, AS-let-7i-5p 처리군 및 MIHA_ppTSP1 처리군 모두에서 N-cadherin, Fibronectin, Slug 및 Snail의 발현이 현저히 감소하였고, E-cadherin의 발현은 현저히 증가하였다 (도 6F).

상기 결과들을 통해, let-7i-5p가 TSP1을 직접적으로 억제하여 HCC의 종양 형성에 기여하는 것을 알 수 있다.

실시예 4. TSP1의 HCC에 대한 효과 확인

4-1. TSP1의 종양 성장 및 증식에 대한 효과

상기 실시예들에서 let-7i-5p가 TSP1을 직접적으로 조절하였으므로, TSP1의 간암에서의 종양 억제 역할을 확인하기 위해, SNU-387 및 SNU-423 세포주에 재조합 TSP1 (rTSP1), 293T 세포 배양액에서 부분 정제된 TSP1 (293T_ppTSP1) 및 MIHA_ppTSP1를 각각 처리한 후, 상기 실시예 2에서와 같이 수행함으로써 인비트로 종양 형성을 세포 성장 및 증식 분석을 통해 확인하였다. 세포 성장 및 증식 분석 결과, rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1 처리군 모두 세포 성장 및 증식을 현저히 억제 시키는 것을 확인하였다 (도 7A 및 B).

4-2. TSP1의 종양 세포 사멸에 대한 효과

rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1의 HCC 세포주에 대한 사멸 효과를 확인하기 위해 rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1 처리에 의한 SNU-387 및 SNU-423 세포의 사멸 정도를 각각 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 분석하고, 세포 사멸 관련된 분자들 (절단된 caspase-3 및 PARP)를 웨스턴블롯 분석함으로써 확인하였다. 그 결과, SNU-387 및 SNU-423 세포주 모두에서, rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1의 처리로 인해 세포 사멸이 현저히 증가되었으며, 절단된 caspase-3 및 PARP가 현저히 유도된 것을 알 수 있었다 (도 7C 및 D).

4-3. TSP1의 종양 세포 이동 및 침습에 대한 효과 확인

HCC 세포주에서 rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1 처리로 인한 종양 세포의 이동 및 침습에대한 효과를 상기 실시예 2-3의 방법으로 확인하였다. 그 결과, rTSP1, 293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1은 SNU-387 및 SNU-423 세포주 모두에서 침습 반응을 현저히 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 TSP1-특이적 중화 항체인 A6.1의 공동 처리에 의해 약화되었다 (도 7E). 또한, pcDNA3.1_HDAC6를 이용한 HDAC6 발현, AS-let-7i-5p를 이용한 let-7i-5p 억제, 세포질 TSP1 (293T_ppTSP1 및 MIHA_ppTSP1) 및 재조합 TSP1(rTSP1)의 처리에 의해서도 HCC 세포의 침습적 반응이 억제되고, 이는 TSP1-특이적 중화 항체인 A6.1의 공동 처리에 의해 회복되는 것으로 나타났다 (도 7F).

상기 결과들을 통해, HCC의 항-사멸 및 전이 특성에 미치는 let-7i-5p의 영향이 TSP1에 의한 것임을 알 수 있었다.

실시예 5. HDAC6-LET-7I-5P-TSP1 신호전달 축의 하위 메커니즘 확인

5-1. TSP1의 항-미세소관 형성 활성에 대한 CD47의 영향 확인

분비된 TSP1가 세포 표면 수용체 CD47을 통해 혈관신생을 매개하는지 확인하기 위하여, Ras-형질전환 마우스 섬유아세포 (Ras-NIH3T3) 및 HUVEC(human umbilical vascular endothelial cell)에서 rTSP1 및 MIHA_ppTSP1에 대한 인비트로 미세소관 형성 분석(microtubule formation assay)을 수행하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트에 Matrigel Basement Membrain Matrix (BD Biosciences)를 37℃에서 1시간 동안 코팅하고, Ras-NIH3T3, HUVEC 또는 SNU-423 세포를 분주하여 배양하였다. MIHA_ppTSP1, rTSP1 및 CD47 결합 모티프를 함유하는 항-TSP1 항체 (3F352, US Biologicals, Salem, MA)를 처리하여 O/N로 인큐베이션하였다. 그 후, 관 구조의 노드 수를 정량하였다. 그 결과, Ras-NIH3T3 및 HUVEC에서 MIHA_ppTSP1 및 rTSP1의 처리는 미세소관 형성을 현저히 억제하였으며, CD47 수용체 결합 모티프와 상호작용하는 항-TSP1 항체 (3F352)에 대한 C-말단 도메인의 차단은 TSP1의 항-미세소관 형성 활성을 유의미하게 감소시켰다 (도 8A 및 B).

5-2. CD47 수용체를 통한 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 신호전달 축의 종양 혈관신생 조절 확인

HDAC6-let-7i-5p-TSP1 신호전달 축이 CD47 수용체를 통해 종양의 혈관신생을 조절하는지 확인하기 위하여, pcDNA3.1_HDAC6 또는 AS-let-7i-5p로 트랜스펙션한 SNU-423 세포를 동일한 갯수의 Ras-NIH3T3 또는 HUVEC과 공동 배양하여 인비트로 미세소관 형성 분석을 수행하였다. 그 결과, pcDNA3.1_HDAC6 또는 AS-let-7i-5p로 트랜스펙션한 SNU-423 세포와 공배양한 Ras-NIH3T3 및 HUVEC에서 미세소관 형성 활성이 현저히 억제되었고, 3F352를 처리하면 미세소관 형성 활성이 다시 회복되는 것을 알 수 있었으며, MIHA_ppTSP1 및 rTSP1를 처리한 공-배양 배지에서도 동일한 결과가 나타났다 (도 9A 및 B).

상기 결과는 HDAC6-let-7i-5p-TSP1 신호전달 축이 CD47 세포 표면 수용체와의 상호작용을 통해 항-혈관신생 활성을 나타내는 것을 나타낸다.

5-3. TSP1 및 CD47의 상호작용에 의한 HCC 세포의 전이성 영향 확인

cDNA3.1_HDAC6, AS-let-7i-5p, MIHA_ppTSP1 또는 rTSP1의 처리에 의한 HCC 세포의 이동 및 침습성에 대한 영향을 확인한 결과, 상기 물질들의 처리에 의해 HCC 세포의 이동 및 침습이 현저히 감소하였으며, 이와 같은 효과가 3F352 처리에 의해 회복되는 것을 알 수 있었다. 이를 통해, HCC 세포의 TSP1-CD47 매개된 악성 특성의 자가분비(autocrine) 및/또는 주변분비(paracrine) 메커니즘을 나타내는 것을 알 수 있다 (도 9C 및 D, 및 도 10A 내지 D).

5-4. TSP1의 대식세포 식작용 조절 네트워크에서 CD47에 대한 영향 확인

대식세포 식작용(macrophage phagocytosis) 조절 네트워크의 CD47과 SIRPα(signal regulatory protein α)의 상호작용에서 TSP1이 CD47 수용체를 점유하여 CD47-SIRPα의 상호작용을 방해하여 대식세포가 HCC를 식작용할 수 있게 하는지를 확인하기 위하여, 인비트로 식작용 분석을 수행하였다. 구체적으로, HCC 세포주인 SNU-387 및 SNU-423를 각각 단일 세포 현탁액으로 만든 후, CFSE (abcam, Cambridge, UK)로 표지하였다. 그 후, C57BL/6 마우스로부터 복막 대식세포를 수득하고 SNU-387 및 SNU-423와 2시간 동안 공배양한 뒤, pcDNA3.1_HDAC6, AS-let-7i-5p, MIHA_ppTSP1 및 rTSP1로 각각 처리된 HCC 세포와 비교하였다. 식작용 지수는 종양 세포를 포획하는 대식세포의 수를 대식세포의 총 수로 나눠 계산하였다. 그 결과, pcDNA3.1_HDAC6, AS-let-7i-5p, MIHA_ppTSP1 또는 rTSP1가 처리된 HCC 세포 모두 대식세포 식작용 활성이 현저히 증가하였으며, 이는 3F352의 처리로 인해 현저히 약화되었다 (도 11A 및 도 12).

이를 통해, HDAC6-let-7i-p-TSP1 신호전달 축이 대식세포와 HCC 사이의 CD47-SIRPα 상호작용을 CD47-TSP1 상호작용으로 전환함으로써 대식세포의 HCC 세포에 대한 식작용을 재-활성화하는 것을 알 수 있다.

5-5. CD47-TSP1이 HCC 세포의 엑소좀 상호작용에 미치는 영향

종양-유래 엑소좀 요소, 특히, 다양한 마이크로 RNA들이 HCC의 악성 특성을 촉진하므로, 간세포에서 세포질 TSP1의 조절에서 종양 세포 유래 나노소포가 어떤 역할을 하는지 확인하기 위하여, HCC 세포의 배양 배지로부터 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, HCC의 배양 배지를 모아서 원심분리한 후, Exoquick Exosome Precipitation Solution (System Biosciences, Palo Alto, CA)를 첨가하여 잘 섞어주었다. 4℃에서 O/N로 인큐베이션한 후, 혼합물을 1500g로 30분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하여 얻은 엑소좀 펠렛을 PBS 50ul에 재부유하였다. 분리된 엑소좀의 컵-모양 구조와 크기를 전자 현미경으로 확인하였다 (도 11B). 그 후 HCC-유래 엑소좀을 엑소좀 특이적 마커 CD81, CD9 및 TSG101의 존재와 HSP70 및 HSP90의 부재를 확인하였다 (도 11C). 엑소좀 및 공여자 세포 분획 사이의 let-7i-5p qRT-PCR 분석 Ct (threshold cycle) 값의 비교를 통해 let-7i-5p가 전체 세포 파쇄물에서보다 엑소좀에 주로 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 11D). 그 후, 비-악성 형질전환된 간세포가 HCC-유래 엑소좀을 취할 수 있는지 확인하기 위하여, PKH67 dye (녹색 형광)-표지된 엑소좀을 MIHA와 인큐베이션하였다. 그 결과, 수여 세포 (MIHA)에서 녹색 형광이 공촛점 현미경으로 관찰되었다 (도 11E). 이에, HCC-유래 엑소좀과 인큐베이션된 MIHA 세포에서의 상대적인 let-7i-5p 발현량을 측정하였으며 비-처리된 MIHA와 비교한 결과, HCC-유래 엑소좀이 처리된 세포에서 let-7i-5p의 발현이 유도되었으며, 이로 인해 TSP1이 MIHA 세포에서 억제되었다 (도 11F).

이를 통해, HCC 세포 및 비-형질전환 간세포 간의 세포간 교차가 악성 형질전환 및 간세포암에서 암세포의 성장을 가능하게 하는 HCC 유래 엑소좀에 의해 매개되는 것을 알 수 있다.

5-6. HDAC6-let-7i-5p-TSP1 신호전달 활성화의 암-예방 효과의 인비보 확인

상기의 내용들을 인비보에서 확인하기 위해, H-ras 형질전환 마우스(Ras-Tg 마우스) (Laboratory of Human Genomics, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Korea)에 13주령일 때부터 매주 pcDNA3.1_HDAC6 50 ug (Turbofect in vivo Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 정맥 주사), AS-let-7i-5p 0.25 mg/kg (Invivofectamine 3.0 (Invitrogen)으로 정맥 주사), 또는 재조합 TSP1 (R&D Systems) 0.5 ug (Invivofectamine로 꼬리 혈관 주사)을 간 특이적으로 전달하였다 (도 13A의 위쪽 패널). 그 후 17주, 19주, 21주 및 23주령에 ultrasound machine (Philips, Amsterdam, Nederland)로 초음파 영상을 찍고, 25주령차에 간을 수득하여 HCC를 확인하였다. 음성 대조군 (N.C) 마우스 간의 HCC는 17주령부터 초음파로 감지되었으며 4마리 중 4마리 모두 대형 및 다중 HCC로 발달되었다. 그러나, HDAC6를 과발현한 마우스에서는 21주령에 HCC가 검출되었고 (1마리 제외), let-7i-5p 억제군 (AS-let-7i-5p) 및 rTSP1-처리군에서는 4마리 중 1 내지 4마리에서 상대적으로 작은 HCC가 발달되었다 (도 13A 아래쪽 패널, 및 도 14A 내지 E). 또한, 웨스턴 블롯 분석 결과, pcDNA3.1_HDAC6 군의 인접 정상 간에서 HDAC6 및 TSP1의 과발현이 확인되었으며, AS-let-7i-5p 군의 인접 정상 간에서 TSP1 발현이 증가된 것을 확인하였다 (도 13B). 또한, let-7i-5p 하향-조절이 pcDNA3.1_HDAC6 군의 마우스 인접 정상 간에서 일관되게 관찰되었다 (도 13C).

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LIVER CANCER <130> PN2104-187 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7i-5p <400> 1 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense let-7i-5p <400> 2 aacagcacaa acuacuaccu ca 22 <210> 3 <211> 1112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP1 <400> 3 Met Gly Leu Ala Trp Gly Leu Gly Val Leu Phe Leu Met His Val Cys 1 5 10 15 Gly Thr Asn Arg Ile Pro Glu Ser Gly Gly Asp Asn Ser Val Phe Asp 20 25 30 Ile Phe Glu Leu Thr Gly Ala Ala Arg Lys Gly Ser Gly Arg Arg Leu 35 40 45 Val Lys Gly Pro Asp Pro Ser Ser Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asp Ala 50 55 60 Asn Leu Ile Pro Pro Val Pro Asp Asp Lys Phe Gln Asp Leu Val Asp 65 70 75 80 Ala Val Arg Ala Glu Lys Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Gln 85 90 95 Met Lys Lys Thr Arg Gly Thr Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Asp His 100 105 110 Ser Gly Gln Val Phe Ser Val Val Ser Asn Gly Lys Ala Gly Thr Leu 115 120 125 Asp Leu Ser Leu Thr Val Gln Gly Lys Gln His Val Val Ser Val Glu 130 135 140 Glu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Gln Trp Lys Ser Ile Thr Leu Phe Val 145 150 155 160 Gln Glu Asp Arg Ala Gln Leu Tyr Ile Asp Cys Glu Lys Met Glu Asn 165 170 175 Ala Glu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ser Val Phe Thr Arg Asp Leu Ala 180 185 190 Ser Ile Ala Arg Leu Arg Ile Ala Lys Gly Gly Val Asn Asp Asn Phe 195 200 205 Gln Gly Val Leu Gln Asn Val Arg Phe Val Phe Gly Thr Thr Pro Glu 210 215 220 Asp Ile Leu Arg Asn Lys Gly Cys Ser Ser Ser Thr Ser Val Leu Leu 225 230 235 240 Thr Leu Asp Asn Asn Val Val Asn Gly Ser Ser Pro Ala Ile Arg Thr 245 250 255 Asn Tyr Ile Gly His Lys Thr Lys Asp Leu Gln Ala Ile Cys Gly Ile 260 265 270 Ser Cys Asp Glu Leu Ser Ser Met Val Leu Glu Leu Arg Gly Leu Arg 275 280 285 Thr Ile Val Thr Thr Leu Gln Asp Ser Ile Arg Lys Val Thr Glu Glu 290 295 300 Asn Lys Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg Pro Pro Leu Cys Tyr His 305 310 315 320 Asn Gly Val Gln Tyr Arg Asn Asn Glu Glu Trp Thr Val Asp Ser Cys 325 330 335 Thr Glu Cys His Cys Gln Asn Ser Val Thr Ile Cys Lys Lys Val Ser 340 345 350 Cys Pro Ile Met Pro Cys Ser Asn Ala Thr Val Pro Asp Gly Glu Cys 355 360 365 Cys Pro Arg Cys Trp Pro Ser Asp Ser Ala Asp Asp Gly Trp Ser Pro 370 375 380 Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser Cys Gly Asn Gly Ile Gln 385 390 395 400 Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn Asn Arg Cys Glu Gly Ser 405 410 415 Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln Glu Cys Asp Lys Arg Phe 420 425 430 Lys Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser 435 440 445 Val Thr Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser 450 455 460 Pro Ser Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly Glu Ala Arg Glu 465 470 475 480 Thr Lys Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Asn Gly Cys Leu Ser Asn 485 490 495 Pro Cys Phe Ala Gly Val Lys Cys Thr Ser Tyr Pro Asp Gly Ser Trp 500 505 510 Lys Cys Gly Ala Cys Pro Pro Gly Tyr Ser Gly Asn Gly Ile Gln Cys 515 520 525 Thr Asp Val Asp Glu Cys Lys Glu Val Pro Asp Ala Cys Phe Asn His 530 535 540 Asn Gly Glu His Arg Cys Glu Asn Thr Asp Pro Gly Tyr Asn Cys Leu 545 550 555 560 Pro Cys Pro Pro Arg Phe Thr Gly Ser Gln Pro Phe Gly Gln Gly Val 565 570 575 Glu His Ala Thr Ala Asn Lys Gln Val Cys Lys Pro Arg Asn Pro Cys 580 585 590 Thr Asp Gly Thr His Asp Cys Asn Lys Asn Ala Lys Cys Asn Tyr Leu 595 600 605 Gly His Tyr Ser Asp Pro Met Tyr Arg Cys Glu Cys Lys Pro Gly Tyr 610 615 620 Ala Gly Asn Gly Ile Ile Cys Gly Glu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Trp 625 630 635 640 Pro Asn Glu Asn Leu Val Cys Val Ala Asn Ala Thr Tyr His Cys Lys 645 650 655 Lys Asp Asn Cys Pro Asn Leu Pro Asn Ser Gly Gln Glu Asp Tyr Asp 660 665 670 Lys Asp Gly Ile Gly Asp Ala Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Lys 675 680 685 Ile Pro Asp Asp Arg Asp Asn Cys Pro Phe His Tyr Asn Pro Ala Gln 690 695 700 Tyr Asp Tyr Asp Arg Asp Asp Val Gly Asp Arg Cys Asp Asn Cys Pro 705 710 715 720 Tyr Asn His Asn Pro Asp Gln Ala Asp Thr Asp Asn Asn Gly Glu Gly 725 730 735 Asp Ala Cys Ala Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ile Leu Asn Glu Arg 740 745 750 Asp Asn Cys Gln Tyr Val Tyr Asn Val Asp Gln Arg Asp Thr Asp Met 755 760 765 Asp Gly Val Gly Asp Gln Cys Asp Asn Cys Pro Leu Glu His Asn Pro 770 775 780 Asp Gln Leu Asp Ser Asp Ser Asp Arg Ile Gly Asp Thr Cys Asp Asn 785 790 795 800 Asn Gln Asp Ile Asp Glu Asp Gly His Gln Asn Asn Leu Asp Asn Cys 805 810 815 Pro Tyr Val Pro Asn Ala Asn Gln Ala Asp His Asp Lys Asp Gly Lys 820 825 830 Gly Asp Ala Cys Asp His Asp Asp Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Asp 835 840 845 Lys Asp Asn Cys Arg Leu Val Pro Asn Pro Asp Gln Lys Asp Ser Asp 850 855 860 Gly Asp Gly Arg Gly Asp Ala Cys Lys Asp Asp Phe Asp His Asp Ser 865 870 875 880 Val Pro Asp Ile Asp Asp Ile Cys Pro Glu Asn Val Asp Ile Ser Glu 885 890 895 Thr Asp Phe Arg Arg Phe Gln Met Ile Pro Leu Asp Pro Lys Gly Thr 900 905 910 Ser Gln Asn Asp Pro Asn Trp Val Val Arg His Gln Gly Lys Glu Leu 915 920 925 Val Gln Thr Val Asn Cys Asp Pro Gly Leu Ala Val Gly Tyr Asp Glu 930 935 940 Phe Asn Ala Val Asp Phe Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Thr Glu Arg 945 950 955 960 Asp Asp Asp Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Gln Ser Ser Ser Arg 965 970 975 Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln Val Thr Gln Ser Tyr Trp Asp Thr 980 985 990 Asn Pro Thr Arg Ala Gln Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Val Lys Val Val 995 1000 1005 Asn Ser Thr Thr Gly Pro Gly Glu His Leu Arg Asn Ala Leu Trp His 1010 1015 1020 Thr Gly Asn Thr Pro Gly Gln Val Arg Thr Leu Trp His Asp Pro Arg 1025 1030 1035 1040 His Ile Gly Trp Lys Asp Phe Thr Ala Tyr Arg Trp Arg Leu Ser His 1045 1050 1055 Arg Pro Lys Thr Gly Phe Ile Arg Val Val Met Tyr Glu Gly Lys Lys 1060 1065 1070 Ile Met Ala Asp Ser Gly Pro Ile Tyr Asp Lys Thr Tyr Ala Gly Gly 1075 1080 1085 Arg Leu Gly Leu Phe Val Phe Ser Gln Glu Met Val Phe Phe Ser Asp 1090 1095 1100 Leu Lys Tyr Glu Cys Arg Asp Pro 1105 1110

Claims

let-7i-5p의 발현을 억제하는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 핵산 앱타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 let-7i-5p의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하고, 상기 let-7i-5p의 발현 억제제는 TSP1의 분비를 증가시키는 것인, HDAC6(Histone deacetylase 6)가 저발현 또는 비활성되고, let-7i-5p가 고발현되며, TSP1(thrombospondin-1)이 저발현된 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 let-7i-5p의 발현 억제제는 종양 세포 성장, 증식, 이동 및 침습을 억제하는 것인, HDAC6(Histone deacetylase 6)가 저발현 또는 비활성되고, let-7i-5p가 고발현되며, TSP1(thrombospondin-1)이 저발현된 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
let-7i-5p의 발현을 억제하는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 핵산 앱타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 let-7i-5p의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하고, 상기 let-7i-5p의 발현 억제제는 TSP1의 분비를 증가시키는 것인, CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물.
제4항에 있어서,
상기 면역항암제 조성물은 CD47을 발현하는 간암세포에 대한 면역세포의 식작용을 활성화시키는 것인, CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물.
삭제
제4항에 있어서,
상기 let-7i-5p의 발현 억제제는 간암 세포의 미소소관 형성을 억제시키는 것인, CD47-양성 간암의 치료용 면역항암제 조성물.