KR101848106B1 - Gkn2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GKN2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제에 관한 것으로, 더 상세하게는 GKN1과의 상호 작용에 의해 위 점막의 항상성을 유지시킴으로써 GKN1의 항암제로서의 부작용을 감소 또는 완화시킬 수 있는 GKN2의 신규한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 GKN2는 GKN1의 과발현에 의해 유도될 수 있는 위 점막 정상 조직의 과도한 세포사멸을 억제하여 GKN1을 유효성분으로 함유하는 위암 치료용 조성물의 부작용을 효과적으로 억제할 수 있고, GKN1과의 음성 피드백에 의한 길항 작용으로 상호 적정 수준의 발현 내지 기능을 유지할 수 있으므로 위 점막 조직의 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 GKN2는 GKN1의 과발현에 의해 유도될 수 있는 위 점막 정상 조직의 과도한 세포사멸을 억제하여 GKN1을 유효성분으로 함유하는 위암 치료용 조성물의 부작용을 효과적으로 억제할 수 있고, GKN1과의 음성 피드백에 의한 길항 작용으로 상호 적정 수준의 발현 내지 기능을 유지할 수 있으므로 위 점막 조직의 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 GKN2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제에 관한 것으로, 더 상세하게는 GKN1과의 상호 작용에 의해 위 점막의 항상성을 유지시킴으로써 GKN1의 항암제로서의 부작용을 감소 또는 완화시킬 수 있는 GKN2의 신규한 용도에 관한 것이다.
위 상피 조직은 동적 평형을 통해 항상성을 유지한다. 즉, 정상적인 위 점막 세포는 지속적인 세포 증식, 분화, 자기 재생의 과정이 세포 사멸과 상호 균형을 이루어 항상성을 유지한다. 이와 같이 지속적인 세포 증식과 세포사멸 간의 적절한 균형의 유지는 신호 경로 복합체와 전사 조절인자에 의해 조절되는데, 이러한 조절이 적절히 일어나지 않아 항상성의 균형이 깨지면 위염과 위암과 같은 다양한 질병을 초래할 수 있다. 그러나, 이에 대한 정확한 분자 기전에 대해서는 거의 연구된 바가 없는 실정이다.
위 특이적으로 발현되는 단백질인 Gastrokin 1(이하 'GKN1'이라 한다)은 18 kDa 크기의 단백질로, 위 전정부(gastric antrum)에서 주로 발현하고 있으며, 위 점막의 분화 및 세포사 조절에 중요한 역할을 한다. 또한, GKN1은 위 표면 세포의 점액 분비 과립에서 발견되고 상피 세포 분열에 관여하는 것으로 알려져 있다. 위 점막 이 외에도 GKN1은 장 점막에서 점막층을 보호하고 상해에 대한 회복과 증식을 촉진하며, 연접 주변부를 안정화시키고 특정 밀착 연접(tight junction) 단백질에 작용하여 장 점막 장벽을 보호하는 역할을 한다.
일부 연구에서는 헬리코박터 파이로리균에 감염된 위 점막 상피 세포와 그 밖의 대부분의 위암에서 GKN1이 하향 조절되고 있다고 보고하고 있다. 또한, 본 발명자들은 이전 연구를 통하여 GKN1이 위암 발생에 있어 종양 억제 활성이 있음을 확인한 바 있다(대한민국등록특허 제10-1215069호). 이와 더불어 최근에는 GKN1이 위암 세포에서 p16/Rb 경로의 활성화를 통하여 노화를 유도하고, GKN1의 과발현이 Fas가 매개하는 세포사멸을 유도하며, GKN1의 부재는 세포사멸 없이 위 상피 세포를 계속적으로 증식시키는 것으로 알려졌다. 따라서, 정상 위 점막 조직에서 GKN1의 과발현은 정상 위 점막세포에서 세포사를 유도하여 위축성 위염과 같은 질병을 야기할 수 있다. 이러한 점에서 볼 때 위 점막의 항상성 유지를 위한 분자적 기전에 대한 연구가 필요하며, 특히 GKN1의 저해제에 대한 동정이 요청되고 있다.
한편, GKN2는 TFIZ1, GDDR, blottin으로도 알려져 있는데, 위장관의 항상성 유지에 참여하는 점액 연관 단백질인 위 Trefoil factor family (TFF1)단백질과 결합하는 파트너로 알려져 있다. 또한, GKN2는 위 표면의 분비세포(foveolar cell)에서 발현되나 헬리코박터 파이로리균에 감염시 또는 위암 조직에서는 그 발현이 감소되는 것으로 보고되고 있다. 그러나, GKN2가 위 항상성 유지에 미치는 영향은 아직 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 GKN2가 위염과 위암의 발생 및 진행에 밀접한 연관성을 가지고 있고, GKN2가 GKN1의 세포사멸능을 조절하는 조절 인자로써 위 점막 조직의 상피 세포에서 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 가정 하에 위 점막 및 위암 조직에서 GKN2의 발현을 조사하였고, 세포 생존과 증식, 세포 사멸과 관련된 GKN1의 기능에 미치는 GKN2의 역할을 규명하였으며, GKN2가 GKN1의 과도한 활성을 저해하여 위 상피 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 GKN2 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암보조제, 위암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 위 점막 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GKN1 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 GKN2 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하는 위암 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항암제와 병용되는 GKN2 (Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암 보조제는 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암제에 대한 특이적인 보조제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암 보조제는 GKN1으로 인한 부작용을 감소 또는 완화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부작용은 위축성 위염; 또는 위암이 전이된 조직이나 장기의 주변 정상세포의 세포사멸일 수 있다.
또한, 본 발명은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN2는 상기 GKN1에 의해 유도되는 정상 위 점막조직 또는 위암이 전이된 조직이나 장기의 주변 정상세포의 과도한 세포사멸을 억제하여, GKN1으로 인한 부작용을 감소 또는 완화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 위 점막 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물에 있어서, 위암 세포에는 GKN1 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하고, 위암 세포 주변의 정상 위 점막 또는 위암이 전이된 조직이나 장기의 주변 정상세포에는 GKN2 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하는 위암 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 GKN2는 GKN1의 과발현에 의해 유도될 수 있는 위 점막 및 암 전위 부위에 있는 정상 세포들의 과도한 세포사멸을 억제하여 GKN1을 유효성분으로 함유하는 위암 치료용 조성물의 부작용을 효과적으로 억제할 수 있고, GKN1과의 음성 피드백에 의한 길항 작용으로 상호 적정 수준의 발현 내지 기능을 유지할 수 있으므로 위 점막 조직의 항상성 유지를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
도 1은 GKN2에 의한 GKN1의 항증식 저해효과를 (A) MTT assay (B) BrdU incorporation assay (C) colony formation assay로 확인한 결과이다.
도 2는 GKN2에 의한 GKN1의 세포사멸 저해효과를 (A) Annexin V-binding assay (B) caspase-3, -7 activity 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 GKN1에 의해 유도되는 G2/M arrest에 대한 GKN2의 억제 효과를 (A) 유세포분석기 (B) 웨스턴 블라팅을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 GKN1에 의해 유도되는 (A) miR-185 발현 (B) 후생적 조절자(DNMT1, EZH2)의 발현 억제에 대한 GKN2의 저해 효과를 나타내는 결과이다.
도 5는 비종양 위 점막에서 (A) GKN1와 GKN2 (B) GKN1, GKN2와 CagA의 발현간의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 6은 GKN1이 NF-B 불활성 및 IB 활성을 통해 GKN2 발현을 조절하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 위암 조직에서 GKN2 발현을 면역염색한 것으로 (A) 위 점막 상피세포에서 GKN2 발현 (B) 장형 위암 조직에서 GKN2 발현 (C) 장형 위암 조직에서 GKN2 음성 염색을 나타낸 것이다.
도 2는 GKN2에 의한 GKN1의 세포사멸 저해효과를 (A) Annexin V-binding assay (B) caspase-3, -7 activity 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 GKN1에 의해 유도되는 G2/M arrest에 대한 GKN2의 억제 효과를 (A) 유세포분석기 (B) 웨스턴 블라팅을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 GKN1에 의해 유도되는 (A) miR-185 발현 (B) 후생적 조절자(DNMT1, EZH2)의 발현 억제에 대한 GKN2의 저해 효과를 나타내는 결과이다.
도 5는 비종양 위 점막에서 (A) GKN1와 GKN2 (B) GKN1, GKN2와 CagA의 발현간의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 6은 GKN1이 NF-B 불활성 및 IB 활성을 통해 GKN2 발현을 조절하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 위암 조직에서 GKN2 발현을 면역염색한 것으로 (A) 위 점막 상피세포에서 GKN2 발현 (B) 장형 위암 조직에서 GKN2 발현 (C) 장형 위암 조직에서 GKN2 음성 염색을 나타낸 것이다.
본 발명은 GKN2(Gastrokine 2)를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공함에 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로는 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암 보조제를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 대한민국등록특허 제10-1215069호를 통하여 GKN1이 항암용 조성물로 기능할 수 있음을 규명한 바 있다.
보호 및 수복 기전은 위 점막이 벗겨진 부위에 상피 세포의 이동을 촉진시키고, 점액 생산을 증가시키며, 상피 증식과 분화 프로그램을 재설정하여 위점막의 무결정을 복원시키는 기능을 한다. 이때 GKN1은 외부 항원, 세균과 위산에 노출된 위 점막을 보호하기 위한 점막 장벽 기능을 한다. GKN1의 불활성화는 위 점막 부위의 암을 유발하거나 위 손상을 유발할 수 있으며 이는 결과적으로 위암과 관련된 유전적 변화를 야기할 수 있을 것이다. 한편, 헬리코박터 파이로리균에 감염되거나 위암에 걸린 위 조직에서는 GKN1과 GKN2의 발현이 감소되는데, 이는 GKN2의 발현이 GKN1 의 발현과 연관성이 있음을 의미하며, 이를 위암 예측 및 진단을 위한 도구로 사용할 수 있음을 고안할 수 있다. 그러나, GKN2가 위 점막의 항상성 유지에 어떠한 역할을 하는지는 아직 명확히 규명되지 않고 있는 실정이다.
본 발명자들은 GKN1이 비종양성 위 점막세포주 HFE-145와 AGS 위암 세포주에서 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하여 종양 억제 기능을 가지고 있음을 보고한 바 있다. 본 발명에서 본 발명자들은 GKN2가 위 점막세포의 항상성 유지를 위한 GKN1의 저해제로 작용할 수 있는지 확인하였다.
그 결과, GKN2 단독으로는 세포 생존, 증식, 세포사멸에 어떠한 영향을 미치지 않았으나, GKN2가 GKN1에 의해 유도되는 세포 생존, 세포 증식 및 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조).
세포 주기 분석에서 GKN1은 G2/M 상태의 세포 수를 현저하게 증가시키는 것으로 나타났는데, GKN2는 GKN1에 의해 유도된 G2/M arrest를 저해하고 GKN1에 의한 G0/G1 및 G2/M과 관계된 세포 주기 조절자들의 발현 변화를 저해하는 것으로 나타났다(도 3 참조).
이들 결과는 shGKN1과 anti-miR-185 형질주입에 따른 GKN1 silencing 효과와 일치하는 것으로, GKN2가 GKN1 종양 억제 활성을 조절하여 위 점막 상피 세포의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 예측할 수 있었다.
또한, GKN2가 GKN1에 의해 조절되는 후생적 변화에 미치는 영향을 확인해 보고자, 본 발명자들은 GKN2가 miR-185, DNMT1, EZH2의 발현 조절에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과는 예상한 바와 같이, GKN2가 GKN1에 의해 유도된 miR-185 발현을 감소시키고, GKN1에 의한 DNMT1과 EZH2 발현 억제 효과를 저해하는 것으로 나타났다. GKN1은 c-Myc에 결합하여 c-Myc을 하향 조절함으로써 miR-185의 발현을 증가시키는데, 본 발명자들은 GKN2 단독으로는 c-Myc의 발현에 별다른 영향을 미치지 않으나, GKN1에 의한 c-Myc 활성 억제효과는 저해하는 것을 알 수 있었다(도 4B 참조). 이들 결과로부터 본 발명자들은 GKN2가 GKN1에 의해 유도되는 miR-185 의존적 종양 억제 활성을 저해한다는 것을 알 수 있었다.
이에 본 발명자들은 GKN2와 GKN1 발현간의 상관관계를 확인하고자, 50 개의 비종양성 위 점막 조직에서 GKN2와 GKN1의 mRNA 및 단백질 발현 양상을 비교하였다. 흥미롭게도, GKN2와 GKN1의 발현에는 유의한 상관관계가 확인되었는데(P=0.0074, 표 2 참조), 이를 통하여 정상 위 점막 조직의 항상성 유지를 위해 GKN1과 함께 GKN2가 발현되어야 한다는 것을 알 수 있었다.
한편, CagA 양성 헬리코박터 파이로리 균에 감염되지 않은 점막 조직에 비해 헬리코박터 파이로리균에 감염된 위 점막 조직에서 GKN1 단백질 발현이 현저히 낮다는 것은 확인되었으나 (P=0.0013), GKN2 mRNA와 단백질 발현은 CagA 헬리코박터 파이로균의 감염과 상관관계가 없는 것으로 나타났다(P=0.3136, P=0.4668, 도 5B 참조).
GKN1과 GKN2는 특히 위 전정부와 위저부의 표면 점막 세포에 발현되는데, GKN1과 같이 GKN2도 위암 발병에 따라 하향 조절되는 것으로 나타났다. GKN2는 위 종양과 무병 조직에서 현저한 발현 양상 차이가 확인되었는데, GKN2는 위 암 조직에서 그 발현이 현저히 감소되고, TFF1 발현과 함께 림프절 전이와 깊은 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 한편, GKN2의 손실은 장형 위암의 짧은 생존 기간과 관계되어 있고, GKN1의 발현 감소는 GKN2와 관계된 것으로 확인되었다. 본 발명에서 GKN2 발현의 감소는 169개의 위암 샘플 중 134개(79.3%) 샘플에서 확인되어, 위암 세포 분화와 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났다. GKN1이 GKN2의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 GKN2 mRNA와 단백질 발현양을 GKN1 형질주입된 AGS 세포주에서 조사해 본 결과, GKN1 발현은 GKN2의 mRNA와 단백질 발현을 모두 시간 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났다(P=0.01, 도 6A, 6B 참조). 그리고 HFE-145 세포에서 GKN1 silencing은 GKN2 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 6D 참조).
GKN1이 GKN2의 발현을 조절하는 기전이 NF-B 신호전달 경로를 불활성화시킴으로써 유도되는지 확인하고자, AGS 세포주에서 TNF-a와 GKN1이 p-p65, p65, IB의 발현에 미치는 영향을 확인하였는데, GKN1은 p-p65와 p65의 발현을 저해하고, IB의 발현을 증가시켰으나 TNF-a는 p-p65와 p65의 발현을 증가시키고, IB의 발현을 저해하는 것으로 나타났다(도 6E). 그리고, HFE-145 세포주에서 shGKN1에 의해 억제된 GKN1의 발현은 p-65와 p65 발현을 증가시키고, IB의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다(도 6E). 또한, TNF-a는 HFE-145 및 AGS 세포주 모두에서 GKN2 mRNA와 단백질 발현을 저해한 반면, GKN1은 GKN2의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 6C). 이러한 결과를 종합하면, GKN2 발현은 일부 GKN1 의존적 방식으로 조절되고, 이는 NF-B 신호 전달 경로를 불활성화시키고, IB를 활성화시키는 방식으로 조절된다는 것을 알 수 있었다. 즉, GKN2와 GKN1은 위 상피 세포의 항상성을 유지시키기 위해서 음성 피드백(negative feedback) 저해 관계에 있는 것을 알 수 있었다. 그러나, GKN1 발현은 GKN2와 헬리코박터 파이로리균의 CagA와 연관되어 있고, GKN2 발현과 헬리코박터 파이로리균의 CagA와는 별다른 상관관계가 없는 것으로 나타나 GKN2 의 발현 조절에는 GKN1 이외에 다른 단백질이나 신호전달계가 관여한다고 할 수 있다.
상기와 같은 연구 결과를 통해, 본 발명자들은 GKN1을 유효성분으로 포함하는 항암제와 GKN2를 병용 투여하면 GKN1에 의해 유도되는 부작용을 감소 또는 완화시키는 것을 알 수 있었다. 바람직하게, 상기 부작용은 위암 주위 비종양성 위 점막에서의 위축성 위염과 전이성 위암 환자에서 전이된 장기나 조직에 있는 정상세포의 사멸일 수 있다. 즉, 위암 치료에 있어서 GKN1을 투여하면 위암 주위 비종양성 위 점막에서 과도한 세포사멸이 일어나 위축성 위염의 부작용이 발생할 수 있고, 위암이 복강, 림프절, 폐, 간, 뇌 등의 다른 장기나 조직으로 전이되는 전이성 위암에 있어서도 GKN1을 항암제로 사용할 때 전이된 장기나 조직의 암세포 주변 정상세포에서 과도한 세포사멸을 유도하는 부작용이 발생할 수 있다. 이 경우 GKN1의 조절 기능을 갖는 GKN2를 병용 투여한다면, GKN1은 암세포의 세포사멸을 유도하고, GKN2는 정상 세포가 세포사멸하는 부작용을 억제할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 항암제와 병용되는 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN 2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 GKN2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 GKN2 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 GKN2와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 GKN2의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 GKN2의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 GKN2의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 GKN2의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 상기 GKN2(Gastrokine 2) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법이며 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드를 사용하여 GKN2 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터인 pcDNA3.1-GKN2를 제조하였다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질주입방법을 사용할 수 있다.
또한 상기 GKN2를 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다.
한편, 본 발명은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 위 점막 항상성 유지를 위한 조성물을 제공한다.
상기 위암 예방 또는 치료용 조성물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 위 점막 항상성 유지를 위한 조성물은 위 점막이 정상 기능을 갖도록 무력해진 기능을 회복할 수 있는 약학적 조성물 또는 건강기능식품용 조성물로 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 위암 조직에는 GKN1 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하고, 위암 및 전이암 주변의 정상 점막 및 조직 부위에는 GKN2 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하는 위암 치료방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 위암 치료방법은 위암 내시경 시술 단계에서 활용할 수 있다. 이와 같은 치료 방법은, 위암 조직에는 GKN1 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 주입 또는 살포하고, 위암 주변의 정상 위 점막 부위에는 GKN2 단백질 또는 GKN 2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 주입 또는 살포함으로써, 위암 세포는 GKN1에 의해 효과적으로 사멸하고, 위암 주변 정상 위 점막 및 전이암 주위 정상 조직은 GKN2와 GKN1의 상호 작요에 의한 항상성 유지를 통해 GKN1에 의한 위축성 위염과 암 주위 정상세포의 사멸과 같은 부작용을 완화시키는 효과가 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
GKN2가 GKN1에 의한 세포증식 및 세포사멸 활성에 미치는 영향 분석
GKN2가 GKN1에 의한 세포 증식 및 세포사멸 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하기 AGS 위암 세포주에 GKN1과 GKN2 투여에 따른 세포 생존률, 세포 증식 및 군락 형성 분석을 하였다.
1-1. AGS 위암 세포주 형질 주입
이를 위하여 GKN1 과 GKN2 를 발현하지 않는 AGS 위암 세포주를 사용하였으며, 상기 세포주는 37, 5% CO2 조건에서 열로 불활성화된 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지를 이용하여 배양하였다. 한편, GKN1, GKN2의 cDNA를 발현 벡터인 pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하고, 이들 발현 벡터 2을 각각 공벡터 형질주입 세포주, GKN1 형질주입 세포주, GKN2 형질주입 세포주, GKN1 및 GKN2 형질주입 세포주의 4개의 그룹으로 나누어, 60mm 직경의 접시에 배양한 AGS 세포에 제조자 방식에 따라 Lipofectamine Plus 형질주입 시약(Invitrogen)을 이용하여 형질주입하였다.
1-2. 세포 생존률 분석
GKN1, GKN2, GKN1 및 GKN2가 각각 형질주입된 AGS 위암 세포주의 세포 생존률은 MTT [3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]를 이용하여 분석하였는데, 형질주입 후 24, 48, 72 시간에 분석하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 540nm에서 측정하였으며, 공벡터를 형질주입한 세포주의 생존률을 대조군으로 측정하였다.
1-3. 세포 증식 측정
GKN1과 GKN2가 세포 증식에 미치는 영향을 분석하기 위하여, BrdU (bromodeoxyuridine) 융합 분석을 실시하였다. 형질 주입 후 24, 28, 72 시간이 경과한 후 BrdU 세포 증식 분석 키트(Millipore, Billerica, MA, USA)로 제조자 방식에 따라 분석하였으며, 흡광도는 분광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하였고, 공벡터를 형질주입한 세포주를 대조군으로 하였다.
1-4. 군락 형성 분석
시험관 내에서 단일 세포의 증식 능력을 측정하기 위하여 플레이트 상의 군락 형성을 분석하였다. 이를 위하여 형질 주입된 AGS 세포 1×103을 6-well 플레이트에 분주하고 RPMI 1640 배지에서 2주간 배양하며 군락 형성을 분석하였다. 군락들은 1% 포름알데히드로 고정하고, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후 군락 측정 프로그램을 이용하여 측정하였다.
상기와 같은 실험 결과, GKN1을 단독으로 형질 주입한 AGS 세포주의 경우 세포 생존, 세포 증식이 시간이 경과함에 따라 현저히 감소하였으나, GKN2를 단독으로 형질 주입한 AGS 세포주는 세포 생존과 증식에 어떠한 영향을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 또한, GKN1과 GKN2를 모두 형질 주입한 AGS 세포주의 경우 GKN1이 세포 생존과 증식에 미치는 영향을 GKN2이 저해하는 것으로 나타났다(도 1A, 1B 참조). 군락 형성 분석에서도 GKN1의 단독 발현의 경우 AGS 세포의 군락 형성 수와 크기를 현저히 감소시키는 것으로 나타났으나, GKN2를 GKN1과 함께 형질 전환한 경우 GKN1의 군락 형성 감소 효과는 억제되는 것으로 확인되었다(도 1C 참조).
1-5. 세포사멸 분석
GKN1은 위암 세포의 세포사멸 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 GKN2가 GKN1의 위암 세포 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 세포사멸은 Annexin-V를 이용하여 확인하였는데, Annexin V는 세포에 결합하여 세포막의 포스파티딜세린을 염색하고, PI(propidium iodide)는 손상된 세포막과 함께 세포의 DNA를 염색하는 기능을 한다. Annexin-V 염색은 제조자(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 방식에 따라 실시하였다.
Annexin-V 염색을 위하여 상기 형질주입된 AGS 세포주를 PBS로 2번 세척하고, 100의 결합 버퍼에서 재현탁하였다. 이 후 100의 상층액을 400의 블라킹 용액과 혼합하고, 1/ml 농도의 Annexin V-FITC 5, 2/ml 농도의 PI 5를 상기 혼합한 용액에 첨가하여 암실 조건에서 15분간 반응시킨 후, 형광 활성화 세포 분류기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. PI 염색 없이 형광 양성인 세포만을 세포사멸하는 세포로 취급하였다.
한편, 본 발명자들은 caspase-3와 -7의 활성을 Apo-One Homogeneous Caspase 3/7 분석 키트(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조자 방식에 따라 수행하였다.
또한, 세포사멸과 연관된 단백질의 발현을 웨스턴 블라팅을 이용하여 분석하였다. 이를 위하여, GKN1 또는 GKN2를 형질주입한 AGS 세포를 용해시킨 후 10% 폴리아크릴아미드 겔로 분리하고 Hybond PVDF 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)으로 전기영동 하였다. 이 후 멤브레인을 블라킹하고, 세포사멸과 관련된 단백질에 대한 항체와 반응시켰다. caspase-8 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), caspase-3 항체, cleaved caspase-3 항체, PARP 항체, cleaved PARP 항체(Cell Signaling, Danvers, MA, USA) 및 GAPDH 항체(Abcam, Cambridge, UK), mouse IgG 항체, rabbit IgG 항체(Sigma) 및 ECL plus Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 이용하였고, 웨스턴 브라팅 밴드 강도는 LAS 3000 (Fuji Film, Japan)으로 정량화하였다.
그 결과, GKN1을 형질주입한 AGS 세포주에서 세포사멸을 나타내는 세포의 수와 caspase3/7 활성이 현저히 증가한 것으로 나타났다. 그러나, GKN2를 단독으로 형질주입하거나 GKN2와 GKN1을 함께 형질주입한 AGS 세포주는 세포사멸이 유도되지 않았고, caspase-3/7 활성도 관찰되지 않았다(도 2A, 2B 참조). 또한, GKN1 형질주입된 세포에서 caspase-8, caspase-3, PARP의 절단된 형태가 확인되었으나, GKN2를 단독으로 형질주입하거나 GKN2와 GKN1을 함께 형질주입한 세포에서는 이러한 변화가 관찰되지 않았다.
이와 같은 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명자들은 세포 생존, 세포 증식 및 세포 사멸과 관련한 GKN1의 활성을 GKN2가 저해하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
<실시예 2>
GKN2가 GKN1에 의해 유도된 G2/M arrest에 미치는 영향 분석
GKN2가 GKN1에 의해 유도된 G2/M arrest에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 유세포 분석을 실시하였다. 세포 주기 분석을 위해 상기 실시예 1-1에서 형질주입된 AGS 세포를 모아 암실 조건에서 45분간 PI 염색하였다. 세포 주기상의 각 상태에 따른 세포의 비율을 FACSCalibur Flow Cytometer with CellQuest 3.0 software (BD Biosciences)로 측정하였으며, 실험은 3번 반복 실시하였다.
그 결과, GKN1은 G2/M 상태에 있는 세포 수를 현저히 증가시키는 것으로 나타났으나, GKN2 자체는 세포 주기에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 나타났다. 한편, GKN1과 GKN2를 함께 형질주입한 세포에서는 GKN2가 GKN1에 의해 유도된 G2/M arrest를 효과적으로 저해하는 것으로 확인되었다(도 3 참조).
이에 본 발명자들은 GKN1과 GKN2가 세포 주기를 조절하는데 어떠한 영향을 미치는지 좀 더 명확히 하고자, G0/G1 상태의 단백질인 p53, p21, p16, CDK4 및 cyclin D1의 발현양과 G2/M 상태의 단백질인 cdc2, cdc25c, cyclin B 및 cyclin E의 발현양을 GKN1, GKN2 또는 GKN1 및 GKN2 형질주입한 후 24, 48 시간 경과한 AGS 세포주에서 관찰하였다. 이를 위하여 상기 실시예 1-5에 기재된 웨스턴 블라팅 방법으로 실험하였는데, 이때 사용된 p53 항체 및 p21 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였고, p16 항체, CDK4 항체, cyclin D1 항체, cdc2 항체, cdc25c 항체, cyclin B 항체 및 cyclin E 항체는 Cell Signaling에서 구입하여 사용하였다. 또한, 단백질 밴드는 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech)으로 가시화하였다.
그 결과, G2/M arrest와 관련하여 GKN1은 CDK4, p-cdc2, cdc25c, cyclin A와 cyclin B의 발현은 하향 조절하였고, p53, p21 및 p16의 발현은 상향 조절하였다. 한편, GKN2는 세포 주기와 관련된 상기 단백질의 발현에 별다른 영향을 미치지 않았다. 그러나, GKN2와 GKN1을 함께 형질주입한 AGS 세포주에서는 GKN1에 의한 G0/G1 및 G2/M과 관련된 세포 주기 조절자들의 발현 변화를 GKN2가 효과적으로 저해하는 것으로 확인되었다(도 3B 참조). 즉, GKN2 단독으로는 세포 주기가 세포 사멸에 어떠한 직접적인 영향을 미치지 아니하였으나, GKN2는 위암 세포주에서 GKN1의 항증식 활성을 억제하고 세포사멸을 저해하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
GKN2가 GKN1에 의해 유도된 miR-185 발현 및 DNMT1, EZH2 발현에 미치는 영향
GKN1은 miR-185의 발현 유도 및 DNMT1, EZH2 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 GKN2가 GKN1의 이러한 발현 유도에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다.
이를 위하여 본 발명자들은 GKN1, GKN2, GKN1 및 GKN2가 각각 형질주입된 AGS 위암 세포주에서 miR-185 발현이 어떻게 변화하는 Q-PCR을 이용하여 정량분석하였다. 이 경우, 인간 U6 mRNA 를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 2-CTmethod에 기초한 internal calibrator로 상대적인 양을 기록하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
Primer Name | Sequence (5'→3') |
GKN1 | F: CTTCGGGGTACCATGCTTGCCTACTCCTCTGTCCAC R: GTTGCCCTCGAGTTAGTTCTCCACCGTGTCTCCACA |
shGKN1 | GCCCAAACAAAGTCGATGAC |
GKN2 | F: CTTCGGGGTACCATGCTTGCCTACTCCTCTGTCCAC R: GTTGCCCTCGAGTTAGTTCTCCACCGTGTCTCCACA |
GAPDH | F: AAATCAAGTGGGGCGATGCTG R: GCAGAGATGATGACCCTTTTG |
miR-185_RT | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACTCAGGAA |
miR-185 | F: CAATGGAGAGAAAGGCAGTTCC R: AATCCATGAGAGATCCCTACCG |
U6 | F: ATTGGAACGATACAGAGAAGATT R: GGAACGCTTCACGAATTT |
실험 결과, GKN1을 형질주입한 AGS 세포주에서는 miR-185의 양이 현저히 증가하였으나, GKN2를 형질주입한 AGS 세포에서는 miR-185의 양에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 한편, GKN2와 GKN1을 함께 형질주입한 경우 GKN2는 GKN1에 의해 유도된 miR-185의 발현을 완전히 하향 조절하는 것으로 나타났다(도 4A 참조).
GKN1은 c-Myc에 결합하여 c-Myc의 발현을 감소시키고 miR-185의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있는데, 본 발명자들은 GKN2을 형질주입한 세포주에서 c-Myc의 발현에는 별다른 차이가 없음을 확인하였고, 다만 GKN2는 GKN1에 의해 유도된 c-Myc의 발현 억제를 저해하는 것을 확인하였다(도 4B 참조).
한편, 본 발명자들은 GKN1에 의한 DNMT1 및 EZH2의 발현 변화에 미치는 GKN2의 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블라팅을 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 실시하였다. DNMT1 항체 및 EZH2 항체는 BD Biosciences에서 구입하여 사용하였고, 단백질 밴드는 ECL 시약((Amersham Pharmacia Biotech)으로 가시화하였다.
그 결과, GKN1은 DNMT1과 EZH2의 발현을 감소시켰으나, GKN2는 DNMT1 및 EZH2의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 한편, GKN2와 GKN1을 함께 형질주입한 AGS 세포에서는 GKN2가 GKN1에 의한 DNMT1 및 EZH2의 발현 감소를 억제하는 것으로 나타났다(도 4B 참조).
<
실시예
4>
정상 위 점막에서의
GKN1
,
GKN2
및
CagA
발현 분석
정상 위 점막에서 GKN1, GKN2 및 헬리코박터 파이로리균 CagA의 발현 양상을 50개의 비종양성 위 점막 조직에서 웨스턴 블라팅의 방법으로 분석하였다. 상기 조직들은 우선 액체 질소에서 절구와 절구공이를 이용하여 고운 파우더 형태로 준비한 후, 1 x 단백질 저해제 혼합물 (Roche)이 첨가된 차가운 Nonidet P-40 용해 버퍼로 현탁시키고 , 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 상기 실시예 1-5에 기재된 방식에 따라 웨스턴 블라팅하였다. GKN1 단일항원 항체(Sigma-Aldrich), GKN2 단일클론 항체(Abcam), CagA 항체 (Santa Cruz) 및 GAPDH 항체(Abcam)와 같은 1차 항체를 사용하였으며, 항-마우스, 항-래빗, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합된 항-마우스 IgG를 2차 항체로 사용하였다. 본 실험은 한국의 가톨릭대학교 의과대학(CUMC09U089)의 기관감사위원회의 승인 하에 진행되었고, 본 실험에 사용된 샘플을 채취한 환자는 모두 가족력이 없는 것으로 확인되었다.
한편, mRNA 정량 분석을 위하여 동결된 50개의 비종양 위 점막 샘플로부터 추출된 mRNA를 정량한 후, cDNA를 Roche Molecular System (Roche, Mannheim, Germany)의 제조자 방식에 따라 역전사 키트를 사용하여 합성하였다. 한편, cDNA 50 ng을 Fullvelocity SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 20 pM/의 순방향 및 역방향 프라이머와 혼합한 후, Stratagene Mix 3000P Q-PCR system을 이용하여 Q-PCR 분석하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재하였다. 본 실험에서 SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자 특이적 비상동성 DNA 서열을 기초로 디자인하였다. 유전자 발현양의 정량 분석을 위하여 스탠다드 커브 방법을 이용하였으며, 2회 실험을 통한 평균값을 나타내었다.
그 결과, GKN1과 GKN2의 발현은 50개의 비종양 위점막 조직 샘플 중 각각 47(94%)개 및 48(96%)개의 샘플에서 확인되었다. 그러나 헬리코박터 파이로리균의 CagA의 경우는 25(50%)개의 조직에서만 확인되었고, GKN2가 발현되는 48개의 위 점막 조직 샘플 중 24(50%)개의 샘플에서 확인되었다(표 2 참조). 이를 통계적으로 분석하면 GKN1과 GKN2의 발현은 밀접한 상관관계가 있는 것으로 확인되었다(P=0.0074)(표 2 참조). 한편, GKN1 단백질의 발현 정도는 CagA가 발현된 위 점막 조직에서 현저히 낮은 것으로 확인되었으나(P=0.0013), GKN2 mRNA와 단백질 발현은 CagA 발현과 별다른 상관관계를 나타내지는 않는 것으로 확인되었다(P=0.3136 및 P=0.4668)(도 5B 참조). 이들 결과로부터 본 발명자들은 헬리코박터 파이로리균의 CagA가 GKN1의 발현의 조절에는 연관이 있으나, GKN2의 발현에는 별다른 상관관계가 없는 것으로 판단하였다.
|
GKN2 |
P
value
|
||
+ | - | |||
GKN1 | + | 46 | 1 | 0.0074 |
- | 2 | 1 | ||
CagA | + | 24 | 1 | 1 |
- | 24 | 1 |
<
실시예
5>
GKN1
이
GKN2
발현에 미치는 영향 분석
상기 실시 예들을 통하여 GKN2가 GKN1의 활성에 영향을 미치는 것을 확인하였는데, GKN1이 GKN2의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 형질주입한 AGS 세포의 시간 변화에 따른 발현양 변화를 real-time RT-PCR과 웨스턴 블라팅으로 관찰하였다. GKN2 유전자 발현은 KATO-III 위암 세포주에서 NF-B의 p50 및 p65 서브유닛에 의해 현저히 감소되고, NF-B 특이적 저해제인 IB는 GKN2의 발현을 증가시킨다는 연구 결과에 기초하여 본 발명자들은 GKN1에 의한 GKN2 발현 조절이 NF-B 경로를 불활성화시킴으로써 이루어지는지 확인해 보았다.
이를 위하여, 본 발명자들은 p-p65, p65 및 IB의 발현에 TNF-a와 GKN1이 미치는 영향을 비교하고, 이들이 HFE-145 세포 및 AGS 세포에서 GKN2에 어떠한 영향을 미치는지 real-time RT-PCR과 웨스턴 블라팅으로 관찰하였다. real-time RT-PCR을 위하여, HFE-145 및 AGS 세포주에 GKN1 또는 shGKN1을 형질주입하고 TNF-a를 처리한 후 mRNA 발현양 변화를 관찰하였다. real-time RT-PCR은 SYBR Green Q-PCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 제조자 방식에 따라 실시하였다. GKN2 mRNA 발현은 SYBR Green Q-PCR로 정량화하고 이를 GAPDH로 정상화하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 도시되었고, 웨스턴 블라팅에는 p-p65 (Cell Signaling Technology)와 p65 and IB(Santa Cruz Biotech) 항체를 사용하였다.
그 결과, GKN1의 발현 증가는 GKN2의 mRNA와 단백질 발현을 시간 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 6A, 6B 참조). GKN1에 의한 GKN2의 발현 조절을 명확히 하고자 AGS 세포에서 p-p65, p65 및 IB의 발현에 TNF-a와 GKN1이 미치는 영향을 확인해 본 결과, TNF-a는 p-p65와 p65 의 발현을 증가시키고, IB의 발현을 감소시키고, GKN1의 발현은 p-p65와 p65 의 발현을 감소시키고, IB의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, HFE-145 세포주에서 shGKN1에 의해 저해된 GKN1의 발현은 감소된 p-p65 및 p65의 발현을 증가시키고, 증가된 IB의 발현은 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 6E 참조).
한편, 본 발명자들은 GKN1 및 TNF-a가 GKN2의 mRNA 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, HFE-145 및 AGS 세포주 모두에서 TNF-a가 GKN2의 발현을 감소시키는 것을 확인하였고, 이와 반대로 GKN1은 AGS 세포에서 GKN2의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 6C 참조). 그러나 HFE-145 세포주에서 GKN1을 silencing 한 결과, GKN2의 발현이 감소되는 것으로 확인되었다(도 6D 참조). 또한 GKN1 형질주입한 AGS 세포에 TNF-a를 처리한 경우 GKN2의 발현이 회복되는 것으로 확인되었다. 이들 결과들을 통하여 GKN1은 NF-B의 경로를 불활성화시키고 IB를 활성화시킴으로써 GKN2의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
면역조직화학적 분석에 의한 위암 세포주에서의
GKN1
및
GKN2
의 발현 분석
면역조직화학적 분석을 위해, 포르말린 용액으로 고정한 후 파라핀 처리된 169개의 위암조직 샘플을 함유하도록 조직 마이크로어레이 수여부 블락을 설계하였다. 시판 마이크로어레이 기기(Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 각 암 조직으로부터 직경 2mm로 3개의 조직 코어를 취해 새로운 수여부 파라핀 블락으로 옮기고, 각 종양 근처에 위치한 정상 위 점막의 조직 코어 하나도 수여부 블락으로 옮겼다. 모든 샘플은 사용 전 날 2 ?m 절편으로 절단하여 표준 프로토콜에 따라 보관해 두었다. 또한 면역조직화학 시그널을 최대화하기 위해서, 구연산염 버퍼에서 항원 회복하는 방법과 biotinylated tyramide로 시그널을 증폭하는 방법을 둘 다 사용하였는데, 구체적으로 열로 유발된 에피토프(epitope) 회복 방법은 10 mmol/L 구연산염 버퍼(pH 6.0)로 채운 Coplin 용기에 슬라이드를 담그고, 700W 전자 레인지안의 압력 쿠커(Nordic Ware, Minneapolis, MN, USA)에서 30분 동안 버퍼를 끓여 수행한 다음, Coplin 용기를 20분 동안 식혔다. 그리고 streptavidin-peroxidase와 biotinylated tyramide를 함유하는 Renaissance TSA Indirect Kit(NEN Life Science, Boston, A, USA)를 사용하였는데, 우선 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase) 활성을 제거하기 위해 PBS로 희석된 1% H2O2에 담가 실온에서 15분간 처리하였다. 그리고 슬라이드를 TNT 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% Tween 20)로 20분간 세척한 다음, TNB 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.5% blocking reagent)로 처리하였다. 이후 절편을 GKN1 항체(1/100; Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)와 함께 4에서 밤새 배양하고, biotinylated goat anti-mouse 항체(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출한 다음, 페록시다아제 연결된 아비딘-비오틴 복합체와 함께 배양하였다. 디아미노벤지딘을 색원체로 이용하였고, 슬라이드는 메이어 헤마토크실린 용액으로 대비 염색하였다. 항원 염색 결과 분석은 세포질의 30% 이상이 양성으로 염색되었을 때 양성이라고 간주하였으며, 두 명의 병리학자가 독립적으로 검토하였다. 음성 대조군으로, 일차 항체를 비면역성 혈청으로 대체한 것을 이용하였다. GKN2의 발현 양상을 이전의 GKN1 발현 데이터와 비교해 보았다.
그 결과, 위 점막 세포의 세포질에서 중간 이상의 강도를 나타내는 GKN2의 조직 염색이 명확하게 관찰되었다(도 7 참조). 한편, 169개의 위암 조직 샘플 중 상부 위암 12 (75%)예와 하부 위암 114 (74.5%) 예에서 GKN2 발현이 감소된 것으로 확인되었다. Lauren's 분류에 따르면, GKN2는 71개의 장형(intestinal type) 위암 중 11개 (15.5%)의 샘플에서 발현되었고, 98개의 미만형(diffused type)의 위암 중 32개 (32.7%)의 샘플에서 발현되었다(표 3 참조). 통계적으로 GKN2 단백질의 발현 변화와 종양의 위치, 크기, 림프절의 전이를 포함하는 임상 병리학적 척도와의 유의한 상관관계는 없는 것으로 나타났다(Chi-Square test, P>0.05, 표 3 참조). 그러나, GKN2의 발현 감소는 장형(intestinal type)의 위암에서 더 빈번한 것으로 확인되었다(P=0.0114). 이전 연구에서, GKN1의 발현 감소는 169개의 위암 조직 샘플 중 151개(89.3%) 샘플에서 확인되었다. GKN2와 GKN1의 발현 양상을 비교하였을 때, GKN1 및 GKN2 단백질 모두가 염색되지 않은 경우는 119개(70.4%) 예로 GKN1과 GKN2의 발현은 매우 긴밀한 상관관계를 갖는 것으로 나타났다(P=0.0002, 표 3 참조).
Parameters
|
GKN2 protein expression | ||
+ | - | P-value | |
Tumor location | 0.9643 | ||
Upper | 4 | 12 | |
Lower | 39 | 114 | |
Size | 0.6827 | ||
<6.5 cm | 21 | 57 | |
>6.5 cm | 22 | 69 | |
No. of metastatic L/N* | 0.6643 | ||
N0 (=0) | 0 | 4 | |
N1 (1 ≤≥6) | 15 | 44 | |
N2 (7≤≥ == 15) | 26 | 74 | |
N3 (>15) | 2 | 4 | |
Differentiation** | 0.0114 | ||
Intestinal | 11 | 60 | |
Diffuse | 32 | 66 | |
GKN1 expression | 0.0002 | ||
+ | 11 | 7 | |
- | 32 | 119 |
* Lymph node , ** Lauren's classification
통계분석
세포 생존, 증식 및 세포사멸에 미치는 GKN1 및 GKN2의 효과는 students t-test로 실시하였다. 데이터는 3번의 독립적 실험 후 평균±표준편차로 표시하였다. GKN1, GKN2, CagA 발현양과 위암의 임상병리학 척도와의 관계는 Spearman correlation test 와 Chi-square test로 확인하였다. P<0.05인 경우에 한하여 통계적 유의성을 인정하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University
<120> Anti-cancer supplement containing GKN2
<130> PN1309-304
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GKN2 amino acid sequence from homo sapiens
<400> 1
Met Lys Ile Leu Val Ala Phe Leu Val Val Leu Thr Ile Phe Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ser His Gly Tyr Glu Val Phe Asn Ile Ile Ser Pro Ser Asn Asn
20 25 30
Gly Gly Asn Val Gln Glu Thr Val Thr Ile Asp Asn Glu Lys Asn Thr
35 40 45
Ala Ile Ile Asn Ile His Ala Gly Ser Cys Ser Ser Thr Thr Ile Phe
50 55 60
Asp Tyr Lys His Gly Tyr Ile Ala Ser Arg Val Leu Ser Arg Arg Ala
65 70 75 80
Cys Phe Ile Leu Lys Met Asp His Gln Asn Ile Pro Pro Leu Asn Asn
85 90 95
Leu Gln Trp Tyr Ile Tyr Glu Lys Gln Ala Leu Asp Asn Met Phe Ser
100 105 110
Ser Lys Tyr Thr Trp Val Lys Tyr Asn Pro Leu Glu Ser Leu Ile Lys
115 120 125
Asp Val Asp Trp Phe Leu Leu Gly Ser Pro Ile Glu Lys Leu Cys Lys
130 135 140
His Ile Pro Leu Tyr Lys Gly Glu Val Val Glu Asn Thr His Asn Val
145 150 155 160
Gly Ala Gly Gly Cys Ala Lys Ala Gly Leu Leu Gly Ile Leu Gly Ile
165 170 175
Ser Ile Cys Ala Asp Ile His Val
180
<210> 2
<211> 555
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GKN2 cDNA sequence from homo sapiens
<400> 2
atgaaaatac ttgtggcatt tctggtggtg ctgaccatct ttgggataca atctcatgga 60
tacgaggttt ttaacatcat cagcccaagc aacaatggtg gcaatgttca ggagacagtg 120
acaattgata atgaaaaaaa taccgccatc attaacatcc atgcaggatc atgctcttct 180
accacaattt ttgactataa acatggctac attgcatcca gggtgctctc ccgaagagcc 240
tgctttatcc tgaagatgga ccatcagaac atccctcctc tgaacaatct ccaatggtac 300
atctatgaga aacaggctct ggacaacatg ttctccagca aatacacctg ggtcaagtac 360
aaccctctgg agtctctgat caaagacgtg gattggttcc tgcttgggtc acccattgag 420
aaactctgca aacatatccc tttgtataag ggggaagtgg ttgaaaacac acataatgtc 480
ggtgctggag gctgtgcaaa ggctgggctc ctgggcatct tgggaatttc aatctgtgca 540
gacattcatg tttag 555
<210> 3
<211> 8939
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GKN2 polynucleotide sequence from homo sapiens
<400> 3
aagaatttct taatactctg caagataact agaggtctct aacttacagt tttgtgcagt 60
tttgggcgaa gcttaatgta aaaatttggt taaacttggt aattggggag aatgctttct 120
gagtcttgtt cctcattaat ttctggaaat tgacaccaaa tctaaaggga agaacgaaga 180
aagtcctagg ctgtttgttc tccaagcagg cctccccagc cactgtcttg gcaccccgtc 240
tcatatccgt tccctctgtg gaagaattca gccagcagaa cagtggtgaa aagacattga 300
gttggggccc aactcaggcc ttaaggaagc actcttcctt taggaggaga tgttagaagt 360
ttgtccttgt agagctataa aatgtatgca tagaacaagc atcatgcaat atttttaaag 420
ggtggaaatt aaaatgtcaa gtgcagcata gtacaaatag cagggaatat ttacagagtg 480
accaagtggt gaattttcat tactgactaa tgaacttcat tgatatcagg tatgtggttg 540
gatctcaatt ctgataaagg agtttgctag ggtgtgtcag agatatagac atggtctttt 600
ccaaagtgat catttgaaaa agagatatcc acatcttcaa gcccatataa aggatagaag 660
ctgcacaggg cagctttact tactccagca ccttcctctc ccaggcaaaa tgaaaatact 720
tgtgagtatt tgtttctgct tcttgatact cttgtggtga ctgcttgcag acaatgctca 780
tatctaatat gccatggatt ttgggagtct tagacagata ctgtgcatgc ttctaagctt 840
ctgtgattga attaatgaca tctttggcag aaatagtgtt gaataagtct gacttttttt 900
gtccttttcc tgttttgaga tgtttactta aaagaaaatt caaaaataca aagaaatctc 960
tagataattt tgatttggag gatgtttaat aataatcctt tattatgagc ttcataggga 1020
atttgggcta tttaaaacaa ctacatttgc tatctaagag agaagctgta gtttaaaaat 1080
aatatcagta atagtaataa tagtacctct catttctcaa atgcatacta agccttagac 1140
taagcatatc acatgaataa tttcatctat tcattgcaac aaccctatga gttgagtagt 1200
attctccccg ttttacagat aaggagactg agaggcagag gaatgtgatt ttcccaagcc 1260
cgtaaatgtg ggatttagaa tgtaatttat ccatctgaat ccccacttgc aggcgcaatc 1320
atggcaaatt taagcagcca gagtgtcttc aatgtcctct cattatgact aaattctccc 1380
ttaggacaaa acgttccttc tatggccact ccacccctcc atctgatccc agcctccgta 1440
gttccacatt gcagtgcccc atggacagtg ggctatgttc tgacctagaa tggaattcgc 1500
tcccctagtc tctgtccttt attctcattc agctgctaag ggagaaagca aaatgttaag 1560
tacctctttc taaagtgtta aagactatca gcttaaagag ctccctctct cagggctgtc 1620
ttgattttcc aaattgagac ctaaccctga agcacaaaag tattatataa ccatggtgta 1680
ttaaccacag tgttggaagg gagatcattt tggggcagag gacactcccc aagctctctc 1740
taatcatacc attaaagtgg tttagtcctt cgactacttg ttcaaaccac tattttagac 1800
tcattaacta gaatatacgg gagtatcata tgttgctgga gctggtctgt ggtaagagaa 1860
gatgtatccc tatggaaggc tgaatatcag cacacaggtc tttgttagat gctctactcc 1920
cagtccccag aagagaaata ttaagggtgg gatggaaagg gaagtaggaa agtcccactg 1980
acagttctta aaaatatccc ccttccccaa gactcctttc atcagcagtt ttcaaatgac 2040
agtgcagtca actatgtact gatgtagttt tcagcgatag tacagttcac tgatgttcag 2100
aagagagggt acaaaacctg ggttagcatg ttggaacaga ctcttacaga actacagcaa 2160
aatatcagaa ctgcttcaat gtcagctcac gacctgtggg cccagcactt gtgtgatagt 2220
atcactaagg cataggagaa tatgggggtt ttacttgatg tcagcctcaa aagttaattg 2280
tgctcccaag cattctattt tcatagtttc ccttaggaac ctgtcaggtc tttatcaccc 2340
atgattcatt ttaaatctgt attaccctct cagtcttaag ggattaaagt tttttaaaat 2400
taattaatta attaattatt tttttagagg acacaatttg accactgtta tccaaagcta 2460
gtgtgaatca taccagagta tttccatagt gaaatgaatc cttcactgct catctgcccc 2520
gggtttctcc tactatctac atggttataa tgctagaaag agttgggaat taggtggcaa 2580
ttgtagcacc ctgtgtctgg caaatagaat gaactcaaca aatgcctgtt aaatgagcca 2640
atgtgtgagc caatcaatgt gtgcgtggaa agggagtgct gaccatctgt ggccactcag 2700
tgtctctagg tgtacatttt ctgagatatc tgtgcctttc ctgtccagtg tttcctcctg 2760
tcccacactc aatgactacc ctataaagaa tggatgtggt gggtctgttt ttcaggtggc 2820
atttctggtg gtgctgacca tctttgggat acaatctcat ggatacgagg tgagttggtt 2880
ccttatggac tttatctctt agagatgttg ggagaggaaa gggaaggtac aagagagcct 2940
gaagacagta gagaggccat atgccttatt tgggatggaa tctcagaaat aaccaataat 3000
ggaaataatg agcttggcta ttcctctcca accacaatac ctttgcaaat gtaagccatt 3060
gctttaaaat gtggtcagtc tcatttctct tgtgatatca ctgcttctcc catatataat 3120
atagtaaact ctaaggaaaa gctttgcctt cttatggcat cataagtttt tggattggga 3180
ccccagtgga cagttttagt ttttaatccc ttgttcatag caggcagctg ctttattttg 3240
ttggaagagt tgcctttcaa atatataaga tttatggaaa aacattttgt ctttcttttc 3300
aatctaggtt tttaacatca tcagcccaag caacaatggt ggcaatgttc aggagacagt 3360
gacaattgat aatgaaaaaa ataccgccat cattaacatc catgcaggat catgctcttc 3420
taccacaatt tttgactata aacatgtaag cagcaaatga attttcatat tcatcaggac 3480
tagtttgcta aagagcagag ggatctatat atatatgggg catatatact tgaattctta 3540
gacttaacct tgcaattctt taagaattcc tcactttcac ttttctcttt aaataatcaa 3600
gcaattggtt aaaaaaacaa aaccattttg aagaaaaaca tatgacagga aacatatgca 3660
tttgcttgac cttttcaggt agaaattgga agagtaatgc tattatccca ctacaggctc 3720
agaaagtgca aagaagagta accaaagtcc aaagcaaagc ccggcatgca gacactcaaa 3780
ctcatttgtt gagtgaacaa atgaatgaat agggcttcta acacagaaca tcatgcagaa 3840
aaagaacaat tggtcaggca cagtggctca tgcctgtaat cccagcactt tgggagtctg 3900
aggcgggagg atctcttgag cccaggagtt ggagactggc ctgggcaaca tggcagaatc 3960
ccatctctac caaaaataca aaaattagct gggtgtggtg gtgcgggcct gtggtcccac 4020
ctacttggga ggctgaggtg ggaggattgc tggagcccag gaagtcaagg ctgcagtgag 4080
ctgagactgc accactgcac tccagcctgg gtgacaaaac gagatcctgt ctcaaaaaaa 4140
taaataaata aataattaaa aaatataaaa taataaaaag aacaatcaca aagcaatcac 4200
aacatagcag aaatccagag caactataca catttaatta tgtacatagg gtaggcaaaa 4260
aatcatactt tttctgtaag aaagaaaatc tgctaactaa aagcactaaa ctattttcaa 4320
gtgttagata ctggcattaa caataagtca cagaaacctg ctcagaaaac atatccttca 4380
tcagttattt attcatttgt tttccatttc ttccaccaac gaattatgaa cctgcttcta 4440
cctaggttcc aagctatgca ctatggatat aagtaggttc ctgctcatct cactagactt 4500
ttgaacatga ttttctgtcc cttttcttct agaaatgtct tcacgttcct ctttcccatt 4560
ggtgttggca gttcaatcac acatttgaaa gtatagagtc attagaaaat gtggtttaaa 4620
aggaagtggc actgaaattg tttttaagca actgtcatgg aaatcccaaa actgtcttta 4680
aaaaaaaatg gagaagtgag gatttgcttt aagcttcttc cattatcacc aggctcagcc 4740
tctgtctatt ttttgaattt taggaactga caatttgtga gaattgaaaa ataagaacca 4800
gaaagatttc tattagatac agctttctag ggtatatcat tatttggaac tctgtagaga 4860
caattttcac tccaggtgaa gactcagtgg ccttaggtcc catctggccc cagggtcttc 4920
accctccatt gctctttcaa tcccacctta ttgcaaccca tccctctcca gccagcttgg 4980
gtttgagatg gagaagggat ggggaaaact ggagaggaag aaaagatggc aaatgagggg 5040
aggatagatg agacgtgtgt gagcgtgcat gagtgtgggt atgggtatgc ttatgagagc 5100
tcctaaagca gcactgtcta acagaacttt ctgcagcggt ggaagtgttc tagatttgaa 5160
tttccaatag ggaagccccc agccgcctgt ggttattgag tactcaaaat ttgtaacaga 5220
agtgcatttt aaattttacc taatttgaat ttaaatttag atagtggcat atagctaata 5280
actatcatat tggacagcac agtttttttt ttttgttttt tttttttgac ggagtctcgc 5340
tctgtcaccc aggctggagt ccagtggtgt gatcttggct cactgcaagc tccacctccc 5400
gggttcatgc cattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggactacag gtgcccgcca 5460
ccacgcccgg ctaaattttt tgtattttta gtagagacgg ggtttcacca tgttagccag 5520
gatggtctcg atctcctgac cttgtgatct gcccttctcg gcctcccaaa gtgctgggat 5580
tacaggtgtg agccactgca cctggccagg acagcacagt tctaaaaaat attctattta 5640
ccccaaactg gggaggaagc agaataaaat taatggaaag aagccagatg cagtagctta 5700
cacctctaat ctcagcactt tgggagctca aggtgggtgg atcacttgag atcaggagtt 5760
tgagaccagc ctggctaata tggtgaaact ccatctctac taaacataaa aaattagctg 5820
ttcatggtgg tgcacacctg tagtcccagc tactctggaa gctgaggcaa gagagttgct 5880
tgaaccaggg aggtggaggc ttcagtgagc tgaggttgca ccactgcact ccagcctggg 5940
caacagagtg agagtctgtc tcaaaaaaat aataataatg gtaataataa taataaaata 6000
atggaaagag acagagtagt gcttcttctc aatctttcaa acctcaaact gcagaccctg 6060
gttccatgac atgaaaagca gaatatagtc atgggtttgc acaatttcaa aggggtagaa 6120
atgacaagtg aaaaaatgaa aatgttatgt aaaataagtc aagtggataa agttgattgc 6180
agattggaga gcaatcccac catatattca ctgtgcatgt tcaagtcttt cttccgaggt 6240
tcaggcatca tcttcaccaa gttcagattc agggaactag ggaggaacag taactgtact 6300
cttgctgcct cagggctaca ttgcatccag ggtgctctcc cgaagagcct gctttatcct 6360
gaagatggac catcagaaca tccctcctct gaacaatctc caatggtaca tctatgagaa 6420
acaggtaatt ctggggcact cttgagtatt ctctgttctt aagccaggca atactggtat 6480
ttatggagaa atgaagagtg tgagggagaa gatcatacta tcatgcctta ccataaatgt 6540
gatactcaac ttattaaagt tattaaagtg tttttacttt tattttatta ttttttaaga 6600
gcaggagcaa atcttagctt gatttccacc atatagtcct aaatacaaga atttataata 6660
aattccagtg acattatagc aaggactgat cagcttctct tctcagagca gggctatgag 6720
aaatggtgac tggaacaata ataagagaag ttctaatatt caatgaccca aagatgcaaa 6780
gaaataatac agttgagtga acatatacaa acagtgcact gcggctagag acccaaggtt 6840
taagtctccc tccacaactt cttataggtg ctacctttga catgggactt actttctttg 6900
ggcttcattg ccaccagagg taaaataaca ctggtaatta ctaatgaggc tacttcacag 6960
atagagtgtt caaaaagaga tgatgtcttg agatccctaa gttctttcta tttaataatc 7020
tgaaagagaa aaattgtcac aatttagaat aaggtacacc aatttttgtc aatttatttt 7080
atgttgttct tttctgttat accgatctag gctctggaca acatgttctc cagcaaatac 7140
acctgggtca agtacaaccc tctggagtct ctgatcaaag acgtggattg gttcctgctt 7200
gggtcaccca ttgagaaact ctgcaaacat atccctttgt ataaggggga agtggttgaa 7260
aacacacgtg agtaccaata agtcattcac tcaccaaata ttttctgaaa gctactatgt 7320
gccaggtgct ctgttgggtg ccaagtgaaa tgcaaataaa tgggaacagt actcagttca 7380
gtttgctttg ggaattaatt acatgccatg tgtgtaaatt gtgctaaatt ttaggaatac 7440
agaaatgaat taaacgtctc cagggaacac atagtctagt gaagaagctg acaagtgaaa 7500
agagaggatg gagtaaagga tttctggatg ccaatgaaaa actactcgat tcttgtatac 7560
tttcatatgt aagaatttca agtagcaaaa agtcatctgg gcccttagaa tagcatattt 7620
tgaagataat aagaaggaag tcactaagaa atgctctcag gatctagaat agaattggta 7680
taggaaagag gaggccaagc ggacttacag acagggagta aaaaccctga ttcatctggg 7740
taacatatgc cactgcagat attactgtca tttttataca aagtttctaa atgtggcaga 7800
gcaaccagag tgaaagaggt cgggccaact gatgatgaac acaacaaagg aaatttctca 7860
gagtactgga aggtagataa agaagagttt atgtttatta tatatctact gcccagaaaa 7920
aaattttaag tactcattca taaagtaaat aaaggcacat aggtatgcca ttgacacaga 7980
atggcataat atcactggga ttgagccaac cagcacttcc aaaagttgtc agttttattt 8040
aagctaatgt attattattc taataattcc aataatatat tttttaatgc tctttctctg 8100
aaaaattttc ccttttccag ataatgtcgg tgctggaggc tgtgcaaagg ctgggctcct 8160
gggcatcttg ggaatttcaa tctgtgcaga cattcatgtt taggatgatt agccctcttg 8220
ttttatcttt tcaaagaaat acatccttgg tttacactca aaagtcaaat taaattcttt 8280
cccaatgccc caactaattt tgagattcag tcagaaaata taaatgctgt atttatagat 8340
tttttggtgt ttgttgtttt ttgtaagcag caaagggaat ccaagcaatg tctttgtcac 8400
tatatagaag aaaaaaaatt gccagaattt taaataaggt gcataatgtg tgaaaattcc 8460
cagataatac cactgggtca catgtggact agtcagctgg ggtcgaattt ccatttcttc 8520
gtctgccctc tggaccagct tcccatctaa ccatccaaat atatgggagc aacctgggta 8580
gagaagaggc tcacacggtg gtggccttga cctggccagg ggagggacat agcgtatgct 8640
tatcaaacaa gttgaatgct caggtgaagg cttttagggc cattcatatg agttaaaatg 8700
tcctttaact caccaaagca gtagactcaa cctgaataaa ctttataata atatgtgttg 8760
ccctggagtg agaagggaga aagggagaga ggaaggagca cctaacgtcc aggaaaagat 8820
gcaccatact gaagatcata acaggagtga aagactagaa atgccaagtc aatacatagc 8880
agaaaagcaa cttccaatat ttcaaataaa ttgcacattg tgtacaaatc tcagatcgt 8939
<210> 4
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GKN1 amino acid sequence from homo sapiens
<400> 4
Met Leu Ala Tyr Ser Ser Val His Cys Phe Arg Glu Asp Lys Met Lys
1 5 10 15
Phe Thr Ile Val Phe Ala Gly Leu Leu Gly Val Phe Leu Ala Pro Ala
20 25 30
Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Asn Val Asn Asp Asp Asn Asn Asn Ala Gly
35 40 45
Ser Gly Gln Gln Ser Val Ser Val Asn Asn Glu His Asn Val Ala Asn
50 55 60
Val Asp Asn Asn Asn Gly Trp Asp Ser Trp Asn Ser Ile Trp Asp Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Gly Phe Ala Ala Thr Arg Leu Phe Gln Lys Lys Thr Cys Ile
85 90 95
Val His Lys Met Asn Lys Glu Val Met Pro Ser Ile Gln Ser Leu Asp
100 105 110
Ala Leu Val Lys Glu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Gly Pro Gly Gly Pro
115 120 125
Pro Pro Lys Gly Leu Met Tyr Ser Val Asn Pro Asn Lys Val Asp Asp
130 135 140
Leu Ser Lys Phe Gly Lys Asn Ile Ala Asn Met Cys Arg Gly Ile Pro
145 150 155 160
Thr Tyr Met Ala Glu Glu Met Gln Glu Ala Ser Leu Phe Phe Tyr Ser
165 170 175
Gly Thr Cys Tyr Thr Thr Ser Val Leu Trp Ile Val Asp Ile Ser Phe
180 185 190
Cys Gly Asp Thr Val Glu Asn
195
<210> 5
<211> 6408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GKN1 polynucleotide sequence from homo sapiens
<400> 5
ataacaccta gtttgagtca acctggttaa gtacaaatat gagaaggctt ctcattcagg 60
tccatgcttg cctactcctc tgtccactgc tttcgtgaag acaagatgaa gttcacagtg 120
agtagatttt tccttttgaa tttaccacca aatgattgga gactgtcaat attctgagat 180
ttaggaggtc tgcttcttat ggccccatca tggaaaattt gttttaaaaa aattctctct 240
tcaaacacat ggacacagag aggggaacaa cacacactag gtcctgttgg ggggtggaga 300
gtgaggggag ggaacttaga ggacaggtca ataggggcag caaaccacca tggcacacat 360
atacctatgt aacaaacctg cacgttctgc acatgtatcc ctttttttta gaagaagaaa 420
taatgaaaaa aaatcttttt tctatttata taatcatggc atttataagc atctctatag 480
agaaggataa ttgtgctgag attagacagc tgtctgagca cctcacactg acctattttt 540
aacaaaatga ctttccgcat cacctgattc cggtctccat gcagggtaag cagttcctaa 600
gccctagaaa gtgccgatca tccctcattc ttgaattcct ccttttattt accaaaattc 660
ctgagcatgt tcaggaaaga tgaaaagctt attatcaaaa taagtggctg agatagactt 720
cttgtcacat ttgttacagt aaaatgggtc tccaagaaag aaagatttgc cttgggctct 780
agcatggcca tttatttaag aaagcatctg aaacatgaag ctaccacagc atctctcctg 840
tggttccaga cagaagcctg agagtctagg aggaggtgga ccgagaaacc ctgccaaagt 900
aactagtagt gccgggtttc tcacaacacg atgcaaaggg gctagaatca gatgactatt 960
ttcatgtttc aacatactac acactggaaa acgttacggc agactctact ttataatggg 1020
gctgcaaatg taaaatgact acctagaact aggtcctctt aatagcagca aagtttaaaa 1080
gggtcagagg gagctccaga cacaggttag atttgatttc tctcctagtt ctgctgtgaa 1140
caagaggtat aagtttggcc aactcactta acccctgaag ctcagttacc ttatctgtaa 1200
aatgattgca ttgtactagg tgttctctaa aatttcttct acctctgact ttttaggaga 1260
ctaattttta actccttttt aagctattgg gagaaaaatt taattttttt tcaaaagtta 1320
ccttgaatct ctagagcagt tctcaaaact attttgtccc aggcaaagga aatgagacta 1380
ggtacccaga atgaggcacc ctgcataaag ctctgtgctc tgaaaaccaa tgtcagggac 1440
cctgtgataa ataattaaac caagtatcct gggacactgc tagtgacatc gcctctgctg 1500
atcactcttg ccagcgagac actctatact tgctttctca tcattggcat ccaaactgcc 1560
tactaatcca ttgctttgga aagttttttt taataaaaag attatttcta ttaggaagaa 1620
aacatcccat gttaaatagg aaaattaact gaaatcattt tcagatgtga tttttagcac 1680
ttatagccat ctcaaaccat agtattcatt tatactatgc tatttattgt aaaacttctt 1740
tttttttcca aggaaaataa gatagtttgc tttattttaa aacagtaact ttcttatatt 1800
ggggcactga ccaaaattca atactggtac aaatatgtta cctaggaggt caaaatatgt 1860
gccaggtgaa ttttctgaat ttctctaaag agagaatttt aaaccttata aaacaattag 1920
aaacaagtga gtgagaggtg agcatcaaca acctgtgtaa cataagccac agtacaaatt 1980
taagctgaat aaccaagcca tgtcagttat cccaaatcat ttttgttaat atttaggagg 2040
atacacatat tttcaataac ttaaaagtga atctttactc ctatctctta atactcgaag 2100
aagtataact ttcttctttt actagattta aataatccaa atatctactc aaggtaggat 2160
gctgtcatta actatagctg agtttatcca aaatagaaaa atcatgaaga tttataaagc 2220
attttaaaaa taatcattta tagcaagtcc ttgaaagctc taaataagaa aggcagttct 2280
ctactttcta ataacaccta tggtttatat tacataatat aattcaacaa aacagcattc 2340
tgaccaatga taatttatag gaaattcatt tgccaagtat atgttttatt ataaagttaa 2400
tattttgacc aatcttaaaa atttttaaac tctattctga catttccaga agtattatct 2460
tagcaaagtc atctttatga taccacttat taaactgaag agaaacaaga tggtacattc 2520
tgggttttac tttaaaaggg atttgattca ataatttgat ttatcactac ttgaaaatta 2580
cattttcttc ctcagtactg gatggcaatg agatgaaagc agctttcctg gctctcaact 2640
tcccttcttc atcaattttt ccagcgtttc ataaggccta cactaaaaat tctaaaacta 2700
tatatcacat taatataatt acttataatt aatcagcaat ttcacattat cgttaaaacc 2760
tttatggtta aaaaatgcaa ggtaagagaa gaaaaaaaca cattgaacta gaactgaaca 2820
cattggtaaa attagtgaat acttttcata agcttggata gaggaagaaa gaagacatca 2880
ttttgccatg taacaggaga ccaatgttat ttgtgatttc agattgtctt tgctggactt 2940
cttggagtct ttctagctcc tgccctagct aactatgtaa gtctcacctt ttcaagtttg 3000
ctaccaaaat gcatttgcaa ggaaatgtga tattaaatca ctctcaatct cttataaact 3060
tcagaatatc aacgtcaatg atgacaacaa caatgctgga agtgggcagc agtcagtgag 3120
tgtcaacaat gaacacaatg tggccaatgt tgacaataac aacggatggg actcctggaa 3180
ttccatctgg gattatggaa atgtaggtag tcaacgtgca attttcactt tattgtttaa 3240
aaatacgatt tctttttaac aaaaaatgtg catgttaacc ataaagaaat taaaaataaa 3300
ttctaattac acatagcata cagttataag taaaggtgac cattttgctc atccgatttt 3360
gttccctaga gataactact gttaataagt gttgcatgat cagttaaaat tcaaaccaac 3420
aaacactatg ttcaagggat tgtgggtata tacaacaaat atgaacatcc ttttgccttg 3480
cctgcagata ccctcaataa tgctgaaaga cttatacaac attactgctt ccaaagctta 3540
gactatctca ctttgttttc aaaggaggtt ttacgacctt ctaaagagat tgaaattgac 3600
atttcaccta aaactcggga aatgtaaatg acaatattaa ttggtaagag aggaaagaag 3660
aaagaaagaa ggaaggaaag aaagaaagaa ggaaggaagg aaagaaagaa agaaagaaag 3720
aaagagagag aaagaaagaa aaagaaaaaa gagagaaaga gagaaggaaa gaaagagaga 3780
aggaaaggaa aagagaagca aagaaagaga ggagcaaaga aaggaacact tagcactagt 3840
taggagaccc aactctggaa ttatcagcta tatatttaac aaacgttata cttttaaata 3900
gcaaactctt tattgtttca attttatctg gtcaattgga aaaataattt ttgtcttatc 3960
tgtctccttg aaatgtgagg atcaaaggag actaaaacat gatagctttt aaagtctatt 4020
tcagtaaaac agacttatat agaggggttt ttatcatgct ggaacctgga aataaagcaa 4080
accagttaga tgctcagtct ctgccctcac agaattgcag tctgtcctca caaatgtcag 4140
caatagatat gattgccaag cagtgcccca tccagtgctc ttatcccagc tcatcacgat 4200
cttggagttc ccatttctct ctgcaggtgg aactgacctc tgataagaaa agctcctcgg 4260
agaacacatg cctcactatt tgccatctac tttaacaggg ctttgctgca accagactct 4320
ttcaaaagaa gacatgcatt gtgcacaaaa tgaacaagga agtcatgccc tccattcaat 4380
cccttgatgc actggtcaag gaaaagaagg taaaaataaa aggcttttta tttttggtga 4440
ggggagaggt tttacatcct tcagtaaata acgagaagat cacagtcatt ccctcttgac 4500
tacagtatgt tgtagtgtgc agcacaaagg gggaagttat tggtgattgc ctgagggaag 4560
gcaacttctg ccacatcaaa tgctgtggct cacacctacc tctacaaccg ctgagcaaag 4620
cacttgaaac cttgactgtt agaggagcaa agctctggtc acaccaatag gagcctcagt 4680
actttgccaa ggacattttt ctgcaagagt tagttagggt tattagattt agcaaatgaa 4740
aatagaagat atccagttag gtttgaattt taggtaagca gcaggtcttt ttagtataat 4800
atatcctatg caatatttgg gatatactaa aaaaagatcc attgtttatc tgaaattcaa 4860
atgtaactgg gtattgtata ttttgtctgg ccatactaat ccaggtgagt ggaaagaaga 4920
gatccataat gttttaaaat atttgcctga gttcatattc ctataactga taaatgagta 4980
cctttcattg acaaggtaga gaaaataaat aaactgcatt ctcagaagat gattattaca 5040
tagtctaatc caaggaatct atgatgacca aatgaggtcc aagttgcaga ataaattaag 5100
cctcagactt ctgtgtttat gagaagctga ggtttcaaac cagctaaatc ccttaggaca 5160
cttagaaatg ctaagatata cagaataagc tagaaatggc tcttcttcat cttgattatg 5220
gaaaaattta gctgagcaac actcactgtt ggcctcgtat acccctcaag tcaacaaacc 5280
actgggcttg gcattcattc tctcccattc ttcctttcta cctctctttt ccacactcag 5340
cttcagggta agggaccagg aggaccacct cccaagggcc tgatgtactc agtcaaccca 5400
aacaaagtcg atgacctgag caagttcgga aaaaacattg caaacatgtg tcgtgggatt 5460
ccaacataca tggctgagga gatgcaaggt gagtagcatc cctactgtgc accccaagtt 5520
agtgctggtg ggattgtcag actatcctcg cgcgtgtcca tagtgggcac cagtgatgca 5580
gggatggtca tcaaggccaa catttgtgca gtgcttgctc tgtgccaggt actgttctat 5640
gtgctttaag tgtgttaact cggttcttca cagcaatctt ataggttcta ttttaatcct 5700
actttatgga tgaggaaact gaggtacaga gaggtcacaa aatccttgcc tgggtcaatt 5760
ccaagcattt tggctgtgga ttctgtgctc ttaaatatta tggaacactg ccttttaagt 5820
gtgaatcaag agtagactca agtcatattc aaaagaatgc atgaatggct aaatgaaaga 5880
agaatgctaa tagaatctat taactttcta tagctcagac aatcacttaa tttctggaca 5940
ttcaaagaac agctgcacac aaacaaagtg tctacctagg gacctaactt aatggcaatt 6000
ttccagatct ctgaattgat tgatttcatc acaacaagta gataaacctt gacattagca 6060
catagctagt ttggaaaccc ctactccccc aatcccctcc aagaaaagag tccttaaata 6120
gacattaata taggcttctt cttttctctt tattagaggc aagcctgttt ttttactcag 6180
gaacgtgcta cacgaccagt gtactatgga ttgtggacat ttccttctgt ggagacacgg 6240
tggagaacta aacaattttt taaagccact atggatttag tcatctgaat atgctgtgca 6300
gaaaaaatat gggctccagt ggtttttacc atgtcattct gaaatttttc tctactagtt 6360
atgtttgatt tctttaagtt tcaataaaat catttagcat tgaattca 6408
Claims (11)
- 항암제와 병용되는 GKN2 (Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 위축성 위염; 위암이 전이된 조직의 세포사멸; 및 장기의 주변 정상세포의 세포사멸로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 GKN1(Gastrokine 1) 부작용의 감소 또는 억제용 항암 보조제.
- 제1항에 있어서,
상기 GKN2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암 보조제. - 제1항에 있어서,
상기 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암 보조제. - 제1항에 있어서,
상기 항암 보조제는 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항암제 특이적인 보조제인 것을 특징으로 하는 항암 보조제. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- GKN2(Gastrokine 2) 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 위축성 위염; 위암이 전이된 조직의 세포사멸; 및 장기의 주변 정상세포의 세포사멸로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 GKN1(Gastrokine 1) 부작용으로부터 위 점막 보호용 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 조성물은 GKN1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 인간을 제외한 포유동물에 있어서,
위암 세포에는 GKN1 단백질 또는 GKN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하고, 위암 세포 주변의 정상 위 점막 또는 위암이 전이된 조직이나 장기의 주변 정상세포에는 GKN2 단백질 또는 GKN2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하는 위암 치료방법.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
KR1020130125819A KR101848106B1 (ko) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Gkn2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020130125819A KR101848106B1 (ko) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Gkn2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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KR20150046507A KR20150046507A (ko) | 2015-04-30 |
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Family
ID=53037844
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020130125819A KR101848106B1 (ko) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Gkn2를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101848106B1 (ko) |
-
2013
- 2013-10-22 KR KR1020130125819A patent/KR101848106B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Menheniott TR, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013 Jan 15;304(2):G109-21. (2012.11.15. 공개)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150046507A (ko) | 2015-04-30 |
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