KR101173223B1 - 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 항암용 조성물, WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA에 대해 상보적인 서열을 갖는 핵산 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 항체를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물, 및 (A) 항암제 후보 미처리 종양세포 중 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 측정하는 단계; (B) 항암제 후보 처리 후 종양세포 중 (A)단계의 유전자에 대응되는 유전자 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 (C) 상기 (A)단계의 발현량에 비해 상기(B)단계의 발현량을 증가시키는 항암제 후보를 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물에 의해 항암이 가능하고, 조성물 및 방법에 의해 항암제 스크리닝이 가능하다.

Description

항암용 조성물{Composition for Anti-cancer}

본 발명은 항암용 조성물, 항암제 스크리닝용 조성물 및 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는 종양세포 조기 노화에 의해 항암효과를 나타내는 항암용 조성물, 항암제 스크리닝용 조성물, 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

종양세포 조기 노화는 스트레스-유도 조기 노화라고도 하며, 다양한 자극에 의해 종양세포에서 발생하는 노화를 의미한다. 종양세포는, 일정한 횟수만큼만 분열하고 노화되는 정상세포와 달리, 암화 과정에서 복제성 노화의 특성이 변화되어 무한정 분열하는 세포들이므로, 종양세포는 세포 노화과정이 진행되지 않을 것이라는 개념이 일반적이었다. 그러나, 최근 종양세포도 다양한 자극에 의해 세포노화가 급격히 유도됨이 알려지게 되었고 이를 스트레스-유도 조기 노화 (stress-induced premature senescence)라 한다(Sugrue et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 94:9648-9653, 1997; Douglas et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004). 종양세포의 노화를 유도할 수 있는 스트레스원으로는 유전적 독성 화학물질 (예, etoposide, cyclophophamide), 방사선, 자외선 등이 보고되었다(Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007; Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394, 2002).

최근 스트레스 유도 조기노화를 이용한 종양세포의 노화를 통한 종양세포 증식 억제가 암 환자 치료를 위한 효율적인 기전으로 제시되었으며 (Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001; Campisi, Science, 309:886, 2005), 세포노화 유도 기전 연구를 통한 암 치료의 효율성 증대가 필수적임이 제안되었다 (Narita and Lowe, Nature Medicine, 11:920-921, 2005). 또한, 종양의 악성화가 저지된 암 환자의 조직 분석 결과, 종양세포 노화가 효율적으로 유도되었음이 보고되었고(Collado et al., Nature, 436:642, 2005), 종양 억제 단백질 p53이 작용해 세포 노화를 통해 종양조직이 효율적으로 제거됨이 종양모델 동물 실험에서 입증되었다(Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007). 이는 암 치료에 세포노화가 유용하게 활용될 수 있음을 제시하는 것이다. 실질적으로 종양세포의 노화기전 활성화는 세포사멸 기전 활성화보다 낮은 용량의 항암제나 방사선 투여를 가능하게 함으로서 암치료 부작용을 개선할 수 있고, 세포사멸에 대한 저항성을 획득한 종양세포의 암 치료 저항성 극복에 이용될 수 있다(Rebbaa, Cencer Lett, 216:1-13, 2005).

따라서, 조기세포 노화에 의해 항암작용을 나타내는 항암제 및 항암제 스크리닝 방법의 개발이 필요하다.

한편 WIG1 (wildtype p53 induced gene-1; ZMAT3, zinc finger matrin type 3)은 NCBI Access No. NM_152240 또는 NM_022470인 유전자이고, YPEL5 [yippee-like 5 (Drosophila)]는 NCBI Access No. NM_016061, NM_001127401, NM_001127400, 또는 NM_001127399인 유전자로 종양세포 조기노화와 관련하여 알려진 바가 없다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 WIG1(wildtype p53 induced gene-1; 일명 ZMAT3, zinc finger matrin type 3) 및 YPEL5(yippee-like 5)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 항암은 종양세포노화에 의한 것일 수 있다.

상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있으며, 상기 억제제는 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 상기 siRNA는 바람직하게 센스서열이 서열번호 7(WIG1용) 또는 9(YPEL5용)의 염기서열로 암호화된 것으로, 바람직하게는 상기 센스서열과 상기 센스서열에 상보적인 안티센스서열로 이루어진 이중 가닥 siRNA일 수 있다. 상기 이중 가닥 siRNA는 서열번호 7 또는 9로 암호화된 센스서열과 각각에 상보적인 서열번호 8 또는 10으로 암호화된 안티센스서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.

상기 단백질에 대한 억제제는 바람직하게 항체로, 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지 방법 (Benny K. C. Lo ed., Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Humana Press (2004))에 의해 직접 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 약학조성물일 수 있으며, 본 발명의 조성물 중 억제제에 의해 종양세포노화를 유도하여, 항암작용을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA에 대해 상보적인 서열을 갖는 핵산 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 항체를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

상기 핵산은 상기 mRNA에 상보적인 DNA(Deoxyribonucleic acid)일 수 있다.

상기 DNA는 시판중인 DNA칩에 포함되는 프로브 등일 수 있으며, 공지 방법 (Piet Herdewijn ed., Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Vol. 288, Humana Press (2005))에 의해 직접 제조한 것일 수 있다. 상기 mRNA에 상보적인 DNA는 바람직하게는 서열번호 11(WIG1용) 또는 12(YPEL5용)의 염기서열로 암호화된 것일 수 있다.

상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지 방법 (Benny K. C. Lo ed., Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Humana Press (2004))에 의해 직접 제조할 수 있다.

상기 항암제는 종양세포 조기노화 유도에 의해 항암효과를 나타내는 것일 수 있으며, 바람직하게는 유전자 억제제 또는 항체 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 유전자 억제제는 바람직하게 siRNA일 수 있다.

또한, 본 발명은 (A) 항암제 후보 미처리 종양세포 중 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 측정하는 단계; (B) 항암제 후보 처리 후 종양세포 중 (A)단계의 유전자에 대응되는 유전자 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 (C) 상기 (A)단계의 발현량에 비해 상기(B)단계의 발현량을 증가시키는 항암제 후보를 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 미처리 종양세포는 항암제 후보 처리 전 종양세포일 수 있다.

상기 항암제 후보는 항암효과를 나타낼 것이 예상되는 것인 한, 이로써 제한되는 것은 아니나 바람직하게 방사선, 유전자 억제제 또는 항체 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유전자 억제제는 바람직하게 siRNA일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, mRNA 측정은 상기 mRNA서열과 상보적인 서열을 갖는 핵산에 의할 수 있으며, 바람직하게 상기 핵산은 상기 mRNA에 상보적인 DNA일 수 있다. 상기 DNA는 시판중인 DNA칩에 포함되는 프로브 등이거나, 직접 제조한 것일 수 있다. 상기 mRNA에 상보적인 DNA는 바람직하게는 서열번호 11(WIG1용) 또는 12(YPEL5용)의 염기서열로 암호화된 것일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 구체적으로 mRNA 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, 노던 블랏팅 또는 DNA칩에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 단백질 측정은 항체에 의할 수 있으며, 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지 방법 (Benny K. C. Lo ed., Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Humana Press (2004))에 의해 직접 제조할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 구체적으로 단백질 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), 방사선면역분석, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 또는 단백질칩에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 항암제는 종양세포 조기노화 유도에 의해 항암효과를 나타내는 항암제일 수 있다.

WIG1, YPEL5 유전자와 상기 유전자가 암호화하는 단백질과 종양세포 조기노화의 관련성이 실시예로 확인되었으므로, 본 발명은 상기 유전자 또는 단백질 억제제의 항암용도, 상기 유전자 mRNA에 대해 상보적인 서열을 갖는 핵산 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 항체의 항암제 스크리닝 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.

본 발명의 항암용도, 암치료용 조성물, 암 치료방법에서는 유전자 억제제, 예를 들어 siRNA 기준으로 성인 1일 1회 0.01ng/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있고, 단백질 억제제, 예를 들어 항체 기준으로 성인 1일 1회 2~10mg/kg 의 용량으로 투여할 수 있으며, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물, 방법, 용도에 있어서, 핵산, 항체, 유전자 억제제, 단백질 억제제 등은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하여 제제화할 수 있다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 제제화시 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA등을 참조할 수 있다.

본 발명에 있어서, WIG1은 서열번호 1의 염기서열{NCBI(National Center for Biotechnology Information) Access No. NM_152240} 또는 서열번 호2의 염기서열(NCBI Access No. NM_022470) 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열의 유전자로 암호화될 수 있고, YPEL5는 서열번호 3의 염기서열(NCBI Access No. NM_016061), 서열번호 4의 염기서열(NCBI Access No. NM_001127401), 서열번호 5의 염기서열(NCBI Access No. NM_001127400) 또는 서열번호 6의 염기서열(NCBI Access No. NM_001127399) 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열의 유전자로 암호화될 수 있다.

상기한 WIG1 및 YPEL5 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌{Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)} 및 프레드릭 등의 문헌{Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994)}에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에 의해 항암제 스크리닝이 가능하며, 본 발명의 조성물에 의해 항암이 가능하다.

도 1은 MCF7세포주에 선량 6 Gy의 방사선 조사 후 4일째 노화의 형태를 보여주는 위상차 현미경의 세포 사진(A)과 세포증식율을 나타낸 그래프(B)이다.
도 2는 선량 6 Gy의 방사선조사 후 4일 경과한 MCF7세포주의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 활성 염색사진(A)과 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프(B)이다.
도 3은 선량 6 Gy의 방사선조사 후 10일 동안 형성된 종양세포주의 집락 촬영사진(A)과 집락 계수 결과 그래프(B)이다.
도 4는 방사선 조사 후 4일째까지 날짜별로 증가하는 WIG1단백질의 발현을 확인한 웨스턴블럿팅 결과(A)와 YPEL5 단백질의 발현을 확인한 웨스턴블럿팅 결과(B)이다.
도 5는 WIG1에 대한 작은 간섭 RNA (siWIG1)를 주입한 후 유방암 종양세포주에서 WIG1 단백질 발현의 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과(A)와 YPEL5에 대한 작은 간섭 RNA (siYPEL5)를 주입한 후 유방암 종양세포주에서 YPEL5 단백질의 발현 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과(B)이다.
도 6의 A는 siWIG1을 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 형태를 촬영한 사진(좌)과 세포 증식율 그래프(우)를 나타내고, B는 siYPEL5를 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 형태를 촬영한 사진(좌)과 세포 증식율 그래프(우)를 나타낸다.
도 7의 A는 siWIG1을 주입하고 4일 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 사진(좌)과 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프(우)를 나타내고, B는 siYPEL5를 주입하고 4일 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 사진(좌)과 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프(우)를 나타낸다.
도 8은 siWIG1을 주입하고 10일 후 형성된 집락의 계수 결과를 나타낸 그래프(A)와 siYPEL5을 주입하고 10일 후 형성된 집락의 계수 결과를 나타낸 그래프(B)이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

< 실시예 1> 종양세포주에서의 방사선유도노화에 의한 항암제 스크리닝 1

1-1. 세포배양

종양세포주인 유방암 세포주 MCF-7 (ATCC, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다.

상기 유방암 세포주에 ¹³⁷Cs 감마선 방출기 (Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, Ontario, Canada) 로부터 방출되는 6 Gy 감마-방사선을 3.81 Gy/분의 용량으로 노출한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1~4 일간 배양하였다.

또한, 상기 유방암 세포주 중 감마-방사선에 노출되지 않은 세포주를 대조군으로 하였다.

1-2. 방사선유도노화 확인

세포의 노화 여부는 상기 1-1의 대조군과 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암 세포주의 특징적인 세포 형태 변화를 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1의 A에 나타내었다. 그 결과 대조군과 달리 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암 세포주는 노화세포의 특징인 세포의 크기가 커지며 평평해진 것을 확인할 수 있다.

또한 세포의 증식율을 측정하기 위해 35mm 배양접시에 1 x 10³ 개의 세포를 분배하고 대조군과 방사선 조사 후 4일 경과한 종양 세포주에 트립신-EDTA (WelGENE Inc. Cat# LS 015-10)를 처리하여 세포를 수확하고 0.4% 트립판 블루(Gibco BRL, Cat# 15250-061)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 살아있는 세포를 세어 대조군과 비교하였다.

그 결과 방사선을 조사한 세포는 대조군에 비하여 증식율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. (도 1B)

1-3. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 유방암세포주의 방사선유도노화 확인

종양세포주의 방사선노화를 확인하기 위해, 상기 1-1의 대조군과 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암 세포주에 대하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.

세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된세포를 PBS로 다시 한번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.

베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 2의 A에 나타내었다.

또한, 방사선 조사 후 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정한 결과 방사선처리 후 4일 경과 시에 대부분의 잔존하는 세포들이 베타-갈락토시다아제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 2B). 즉, 상기 결과로부터 방사선 조사 후 4일 경과시 암 세포주의 세포노화가 명백하게 진행되었음을 확인하였다.

1-4. 집락형성분석(Colony formation assay)을 이용한 유방암세포주의 방사선유도노화 확인

상기 1-1의 대조군과 방사선 조사된 유방암 세포주(MCF7)를 60mm 직경의 배양접시에 500개의 세포가 분배되도록 계대배양하였다. 7-10일 간 세포 배양기에서 배양한 후 형성된 세포 집락은 Diff Quick 시약 (Sysmex Cat # 38721)을 이용하여 염색하였다. 먼저, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1번 세척하고 용액 A를 0.5 ml 가하여 부드럽게 섞어주고 제거한 후, 용액 B를 0.5 ml 가하여 다시 부드럽게 섞어준 후 제거하였다. 다시 용액 C를 0.5 ml 가하여 부드럽게 섞어주고 제거하였다.

충분한 증류수로 세포를 세척한 후 실온에서 세포를 30분간 말리고 집락계수기 (Image Product International #880)로 집락형성 분석 결과, 방사선이 조사된 노화 유방암세포주의 경우 세포 집락의 형성이 나타나지 않았다 (도 3A와 도 3B).

1-5. 미세배열(microarray) 분석을 통한 방사선유도노화에 의해 변화된 유전자 발굴 및 그를 이용한 항암제 스크리닝

상기 1-1에서 준비한, 방사선 조사 후 4일 경과한 유방암세포주(MCF7)는 PBS로 세척 후, TRI Reagent^®(MRC, Inc. Cat # TR-118) 시약을 이용하여 세포 시료에서 총 RNA를 분리하고 자외선분광분석기 (Ultrospec 3100 PRO, Amersham Bioscience)를 이용하여 정량하였다. 역전사효소를 이용하여 500 ng의 총 RNA에서 cDNA를 합성한 후 시험관내 증폭/전사 과정 (Illumina^® TotalPrep RNA Amplification kit, Ambion Inc.)을 통하여 비오틴-표지된 cRNA를 합성하였다. 1.5 μg의 증폭된 비오틴-표지 cRNA를 BeadChip (Illumina Human-6 BeadChip^® Illumina, Inc.)과 교잡반응시킨 후, Cy3 형광시료 (Amersham Fluorolink streptavidin-Cy3, GE Healthcare Bio-Sciences) 로 현상하였다. 교잡된 신호는 공초점 스캐너 (BeadStation 500GXDW; Illumina, Inc.)를 사용하여 스캔한 후 Illumina BeadStudio^®소프트웨어로 분석하였다.

상기와 같이 미세배열 분석을 수행한 결과, 다음과 같이 방사선유도노화세포에서 mRNA의 발현양이 변화하는 유전자가 동정되었다. (표 1)

또한, 유방암 세포주 MCF-7대신 폐암세포주 H460(ATCC, USA)을 사용한 것을 제외하고, 상기 1-1 ~ 1-5와 동일하게 실시하였으며, 그 결과를 하기 표에 함께 나타내었다.

[표 1] 종양세포에서 방사선 조사에 의해 유도된 노화 과정 중 mRNA의 발현이 변화하는 유전자

따라서, 상기 유전자를 활용하여 종양세포 노화에 의한 항암제 스크리닝이 가능함을 알 수 있다. 예를 들어, 항암제 후보 (방사선 등) 미처리 종양세포 중 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 mRNA 발현량을 DNA칩으로 측정하고, 항암제 후보 (방사선 등) 처리 후 종양세포 중 대응되는 유전자 mRNA 발현량을 DNA칩으로 측정하여 항암제 후보 처리 후 mRNA 발현량을 증가시키는 항암제 후보를 선별함으로써 항암제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 상기 BeadChip에 포함되는 WIG1 DNA 프로브(서열번호 11의 서열로 암호화됨) 및/또는 YPEL5 DNA 프로브(서열번호 12의 서열로 암호화됨)로 mRNA 발현량을 측정할 수 있다.

또한, 상기 유전자를 억제하는 억제제(방사선 등)는 종양세포노화에 의해 항암효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 2> 종양세포주에서의 방사선유도노화에 의한 항암제 스크리닝 2

상기 1-1에서와 동일한 방법으로 준비한, 방사선 조사 후 1~4일 경과한 유방암세포주(MCF7)는 PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액(50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 10 g/ml 아프로티닌, 2 g/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 11,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법{bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20ug의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.

전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-WIG1 항체 (Santa Cruz사) 또는 항-YPEL5 항체 (ProteinTech Group사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 항체 (Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약(Amersham 사)으로 확인하고 WIG1 단백질 발현에 대한 결과를 도 4A에, YPEL5 단백질에 대한 결과를 도 4B에 나타냈다.

도에서 GAPDH 또는 ACTIN은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.

방사선 조사 후 1일 이후 WIG1및 YPEL5 단백질의 발현량이 증가하고, 이는 상기 실시예 1-5.의 미세배열 분석에서 발굴한 유전자 mRNA 발현량의 변화가 단백질 수준에서도 변화함을 확인할 수 있다.

따라서, 상기 단백질을 활용하여 종양세포 노화에 의한 항암제 스크리닝이 가능함을 알 수 있다. 예를 들어, 항암제 후보 (방사선 등) 미처리 종양세포 중 WIG1 및 YPEL5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 항-WIG1 항체 및 항-YPEL5 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항체로 측정하고, 항암제 후보 (방사선 등) 처리 후 종양세포 중 대응되는 유전자가 암호화하는 단백질 발현량을 항-WIG1 항체 및 항-YPEL5 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항체로 측정하여 항암제 후보 처리 후 단백질 발현량을 증가시키는 항암제 후보를 선별함으로써 항암제를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 상기 항-WIG1 항체 (Santa Cruz사) 또는 항-YPEL5 항체 (ProteinTech Group사)로 단백질 발현량을 측정할 수 있다.

또한, 상기 단백질을 억제하는 억제제(항체 등)는 종양세포노화에 의해 항암효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 3> WIG1 및 YPEL5 유전자 억제제( siRNA )의 종양세포 유도노화에 의한 항암작용 확인

3-1. WIG1 및 YPEL5 유전자에 대한 작은 간섭RNA의 주입

WIG1 및 YPEL5 유전자의 발현량 감소에 의한 효과를 확인하기 위해 종양세포주인 유방암 세포주 MCF-7 (ATCC, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 DMEM 배양 배지 안에서 배양하고 작은 간섭 RNA의 주입 하루 전, 60 mm 배양접시로 계대배양한 후 3 μl의 RNAiMAX (invitrogen, Cat#13778-075)와 OptiMEM^®I 배양배지 (Invitrogen, Cat#31985) 를 섞고 WIG1 또는 YPEL5 유전자에 대한 작은 간섭 RNA {siWIG1(서열번호 7과 8의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임) 또는 siYPEL5(서열번호 9와 10의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임)}를 50 nM의 농도로 세포에 처리하였다. 6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM 배양 배지로 교환한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 4 일간 배양하였다.

또한, 상기 종양세포주 중 비특이적 작은 간섭 RNA{서열번호 13과 14의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 주입한 세포주를 대조군으로 하였다.

siRNA는 모두 바이오니아(대한민국)에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다. 구체적으로, β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 사용하여 siRNA를 합성하였다(참조: Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 이어, 전기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan)을 사용한 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)에 적용하여, RNA를 분리하고 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(Shimadzu, Japan)에 적용하여, 합성하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그런 다음, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜서, 목적하는 이중가닥 siRNA를 각각 제조하였다.

3-2. 특이적 작은 간섭 RNA에 의한 단백질의 발현량 감소 확인

방사선 조사 대신 상기 3-1에 제시한 방법으로 siWIG1 또는 siYPEL5를 주입한 종양세포를 사용한 것을 제외하고, WIG1 또는 YPEL5 단백질 발현의 감소를 실시예2와 같은 방법으로 확인하고 그 결과를 도5의 A와 B에 나타내었다. 도 5는 WIG1에 대한 작은 간섭 RNA (siWIG1)를 주입한 후 유방암 종양세포주에서 WIG1 단백질 발현의 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과(A)와 YPEL5에 대한 작은 간섭 RNA (siYPEL5)를 주입한 후 유방암 종양세포주에서 YPEL5 단백질의 발현 감소를 확인한 웨스턴블럿팅 결과(B)를 나타낸다. 도에서 Actin은 각 시료에서 동일량으로 발현되는 유전자로서 시료 간 사용된 단백질량이 동일함을 나타낸다.

그 결과 siWIG1 또는 siYPEL5 주입 후 4일까지 유방암 세포주 내 WIG1 또는 YPEL5 단백질의 발현이 대조군 수준 이하로 감소함을 확인하였다.

3-3. siWIG1 및 siYPEL5에 의한 종양세포주의 노화유도 확인

상기 3-2.에서 준비한 세포의 노화 여부를 확인하기 위해 siWIG1 또는 siYPEL5 주입 후, 4일이 경과한 유방암 세포주의 특징적인 세포 형태 변화를 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)으로 관찰하고, 그 결과를 도 6의 A(좌)와 B(좌)에 나타내었다. 도 6의 A(좌)는 siWIG1을 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 형태를 촬영한 사진이고, B(좌)는 siYPEL5를 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 형태를 촬영한 사진(좌)이다. 그 결과 대조군과 달리 siWIG1 또는 siYPEL5 주입 후 4일이 경과한 종양세포주는 노화세포의 특징인 세포의 크기가 커지며 평평해진 것을 확인할 수 있다.

또한 세포의 증식율을 측정하기 위해 방사선 조사 대신 상기 3-1에 제시한 방법으로 siWIG1 또는 siYPEL5를 주입한 후 4일이 경과한 세포를 사용한 것을 제외하고, 상기 1-2의 세포 증식율 측정방법과 같은 방법으로 실시하였고, 그 결과를 도 6의 A(우)와 B(우)에 나타내었다. 도 6의 A(우)는 siWIG1을 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 세포 증식율 그래프(우)를 나타내고, B는 siYPEL5를 주입하고 4일 후 작은 간섭 RNA에 의해 노화된 세포의 세포 증식율 그래프(우)를 나타낸다. 그 결과, siWIG1 또는 siYPEL5을 주입한 세포는 대조군에 비하여 증식율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. (도 6)

3-4. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 종양세포주의 siWIG1 및 siYPEL5에 의한 노화 유도 확인

방사선 조사 대신 상기 3-1에서 준비한 것과 동일하게 siWIG1 또는 siYPEL5을 주입한 후 4일이 경과한 종양세포주를 사용한 것을 제외하고, 상기 1-3과 동일하게 실시하였다.

베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도7의 A와 B에 나타내었다. 도 7의 A는 siWIG1을 주입하고 4일 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 사진(좌)과 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프(우)를 나타내고, B는 siYPEL5를 주입하고 4일 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 사진(좌)과 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프(우)를 나타낸다.

대조군과 비교하여 4일 경과 후, 염색된 세포수가 대폭 늘어남을 확인할 수 있었다. 즉, 대조군의 종양세포주는 노화현상이 일어나지 않으나, siWIG1 또는 siYPEL5를 주입한 후 4일 경과된 종양세포주는 베타-갈락토시다아제의 활성을 나타내는 세포가 증가함으로써 노화현상이 현저하게 일어남을 알 수 있었다 (도 7).

3-5. 집락형성 분석을 이용한 종양세포주의 siWIG1 및 siYPEL5에 의한 노화 유도 확인

방사선 조사 대신 상기 3-1에서 준비한 것과 동일하게 siWIG1또는 siYPEL5을 주입한 종양세포주를 사용한 것을 제외하고, 상기 1-4와 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 8에 나태내었다. 도 8은 siWIG1을 주입하고 10일 후 형성된 집락의 계수 결과를 나타낸 그래프(A)와 siYPEL5을 주입하고 10일 후 형성된 집락의 계수 결과를 나타낸 그래프(B)이다. 그 결과, siWIG1 또는 siYPEL5을 주입한 종양세포주가 대조군에 비하여 세포 집락의 형성이 크게 감소됨을 알 수 있었다. (도 8A와 도 8B).

따라서, WIG1 또는 YPEL5 유전자의 발현을 감소시킴으로써 종양세포주에서 노화가 유도됨을 알 수 있다.

상기 결과로부터 WIG1 및/또는 YPEL5 유전자를 억제하는 억제제(siRNA 등)는 종양세포노화에 의해 항암효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

1. WIG1(wildtype p53 induced gene-1) 및 YPEL5(yippee-like 5)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 항암용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 항암은 종양세포노화에 의한 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 mRNA인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 억제제는 siRNA인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 siRNA는 센스서열이 서열번호 7 또는 9로 암호화된 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 단백질에 대한 억제제는 항체인 조성물.
7. WIG1(wildtype p53 induced gene-1) 및 YPEL5(yippee-like 5)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA에 대해 상보적인 서열을 갖는 핵산 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 항체를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 핵산은 상기 mRNA에 상보적인 DNA인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 DNA는 서열번호 11 또는 12의 염기서열로 암호화된 것인 조성물.
10. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 종양세포 조기노화 유도에 의한 항암제인 조성물.
11. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 유전자 억제제 또는 항체인 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 유전자 억제제는 siRNA인 조성물.
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