KR20140139547A - 헤테로사이클릭 화합물 및 그의 용도 - Google Patents

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펠릭스 곤잘레스 로뻬스 데 투리소
샤오린 하오
브라이언 루카스
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암젠 인크
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Abstract

일반적인 염증, 관절염, 류마티스성 질환, 골관절염, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 건선, 염증 요인이 있는 피부 질환, 자가면역 질환 예컨대 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 모든 형태의 과민증을 포함하는 알러지성 병태를 비제한적으로 포함하는 만성 염증 병태를 치료하기 위한 치환된 바이사이클릭 헤테로아릴 및 이를 함유하는 조성물. 본 발명은 또한 p110δ 활성으로 매개되고, 그것에 의존하거나 그것과 연관된 암을 치료하는 방법을 제공하고, 그 암은 비제한적으로 백혈병, 예컨대 급성 골수 백혈병 (AML) 골수이형성 증후군 (MDS) 골수-증식성 질환 (MPD) 만성 골수성 백혈병 (CML) T-세포 급성 림프모구 백혈병 (T-ALL) B-세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL) 비호지킨 림프종 (NHL) B-세포 림프종 및 고형 종양, 예컨대 유방암을 포함한다.

Description

헤테로사이클릭 화합물 및 그의 용도{HETEROCYCLIC COMPOUNDS AND THEIR USES}
본원은 미국 가출원 번호 61/620,270 (2012년 4월 4일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이는 참조로 본원에 편입되어 있다.
본 발명은 일반적으로 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K) 효소, 및 더 상세하게는 PI3K 활성의 선택적 억제제 및 그와 같은 물질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
3'-인산화된 포스포이노시티드를 통한 세포 신호전달(signaling)은 다양한 세포 과정, 예를 들면, 악성 변환, 성장 인자 신호전달, 염증, 및 면역력과 관련되어 왔다(검토를 위해 Rameh et al., J. Biol Chem, 274:8347-8350 (1999) 참고). 이들 인산화된 신호전달 산물인 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI 3-키나아제; PI3K)를 생성하는 것을 담당하는 효소는 본래 바이러스 종양단백질 및 이노시톨 고리의 3'-하이드록실에 있는 포스파티딜이노시톨(PI) 및 그의 인산화된 유도체를 인산화하는 성장 인자 수용체 티로신 키나아제와 연관된 활성으로서 확인되었다(Panayotou et al., Trends Cell Biol 2:358-60 (1992)).
PI 3-키나아제 활성화의 일차 산물인 포스파티딜이노시톨-3,4,5-삼인산(PIP3)의 수준은 다양한 자극으로 세포를 처리할 때 증가한다. 이는 대다수의 성장 인자 및 많은 염증성 자극, 호르몬, 신경전달물질 및 항원에 대한 수용체를 통한 신호전달을 포함하므로, PI3K의 활성화는 하나를 나타내며, 가장 우세하지 않은 경우, 포유동물 세포 표면 수용체 활성화와 연관된 신호 전달 사건을 나타낸다(Cantley, Science 296:1655-1657 (2002); Vanhaesebroeck et al. Annu.Rev.Biochem, 70: 535-602 (2001)). 따라서, PI 3-키나아제 활성화는 세포 성장, 이동, 분화, 및 세포자멸사(apoptosis)를 포함하는 광범위한 세포 반응에 관여한다(Parker et al., Current Biology, 5:577-99 (1995); Yao et al., Science, 267:2003-05 (1995)). PI 3-키나아제 활성화 후 생성되는 인산화된 지질의 하류 표적이 완전히 규명되지 않았음에도 불구하고, 플렉스트린-상동성(PH) 도메인- 및 FYVE-핑거 도메인-함유 단백질들이 다양한 포스파티딜이노시톨 지질에 결합할 때 활성화된다는 것이 공지되어 있다(Sternmark et al., J Cell Sci, 112:4175-83 (1999); .Lemmon et al., Trends Cell Biol, 7:237-42 (1997)). PI3K 효과기를 함유하는 PH-도메인의 두 그룹인 티로신 키나아제 TEC 패밀리의 멤버 및 AGC 패밀리의 세린/트레오닌 키나아제들이 면역 세포 신호전달의 맥락에서 연구되어 왔다. PtdIns (3,4,5)P3에 대해 분명한 선택성을 갖는 PH 도메인을 함유하는 Tec 패밀리의 멤버들은 Tec, Btk, Itk 및 Etk를 포함한다. PH의 PIP3로의 결합은 Tec 패밀리 멤버의 티로신 키나아제 활성에 매우 중요하다(Schaeffer and Schwartzberg, Curr.Opin.Immunol. 12: 282-288 (2000)). PI3K에 의해 조절되는 AGC 패밀리 멤버는 포스포이노시티드-의존적 키나아제(PDK1), AKT(PKB로도 불림) 및 단백질 키나아제 C(PKC)와 S6 키나아제의 소정의 동형체를 포함한다. AKT의 3개의 동형체가 존재하며 AKT의 활성화는 PI3K-의존적 증식 및 생존 신호와 강하게 연관되어 있다. AKT의 활성화는 PDK1에 의한 인산화에 좌우되며, 이것은 또한 3-포스포이노시티드-선택적 PH 도메인을 가져 AKT와 상호작용하는 막으로 그것을 동원한다. 다른 중요한 PDK1 기질은 PKC 및 S6 키나아제이다(Deane and Fruman, Annu.Rev.Immunol. 22_563-598 (2004)). 시험관내에서, 단백질 키나아제 C(PKC)의 일부 동형체들은 PIP3에 의해 직접 활성화된다(Burgering et al., Nature, 376:599-602 (1995)).
현재, PI 3-키나아제 효소 패밀리는 그의 기질 특이성에 따라 3개의 계열로 분류되어 왔다. 계열 I PI3K는 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트, 및 포스파티딜-이노시톨-4,5-바이포스페이트(PIP2)를 인산화하여 각각 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트(PIP), 포스파티딜이노시톨-3,4-바이포스페이트, 및 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트를 생산할 수 있다. 계열 II PI3K는 PI 및 포스파티딜-이노시톨-4-포스페이트를 인산화하는 반면, 계열 III PI3K는 PI만을 인산화할 수 있다.
PI 3-키나아제의 초기 정제 및 분자 클로닝은 PI 3-키나아제가 p85 및 p110 서브유닛으로 이루어진 헤테로다이머로 밝혀졌다(Otsu et al., Cell, 65:91-104 (1991); Hiles et al., Cell, 70:419-29 (1992)). 그 이후로, 4개의 뚜렷이 다른 계열 I PI3K가 확인되었고, PI3K α, β, γ, 및 δ로 지정되었으며, 각각 뚜렷이 다른 110 kDa 촉매적 서브유닛 및 조절 서브유닛으로 이루어진다. 보다 구체적으로, 촉매적 서브유닛 중 3가지, 즉, p110α, p110β 및 p110δ는 각각 동일한 조절 서브유닛인 p85와 상호작용하는 반면, p110γ는 뚜렷이 다른 조절 서브유닛인 p101과 상호작용한다. 하기에 기술된 바와 같이, 인간 세포 및 조직 내에서 이들 PI3K 각각의 발현 패턴은 또한 뚜렷이 다르다. 일반적으로 PI 3-키나아제의 세포 기능에 대해 최근에 상당한 정보가 축적되었음에도 불구하고, 개별적인 동형체가 수행하는 역할은 완전히 이해되지 못하고 있다.
소 p110α의 클로닝이 기술되어 왔다. 이 단백질은 사카로마이세스 세레비시애 단백질인 Vps34p(액포 단백질 가공과 연관된 단백질)와 관련되어 있는 것으로 확인되었다. 재조합 p110α 산물은 또한 p85α와 회합하여, 형질감염된 COS-1 세포 내에서 PI3K 활성을 생성하는 것으로 나타났다(Hiles et al., Cell, 70, 419-29 (1992) 참고).
p110β로 지정된 두 번째 인간 p110 동형체의 클로닝이 문헌[Hu et al., Mol Cell Biol, 13:7677-88 (1993)]에 기재되어 있다. 이 동형체는 세포 내에서 p85와 회합하는 것으로 알려져 있고, p110β mRNA가 수많은 인간 및 마우스 조직에서 뿐만 아니라 인간 탯줄 정맥 내피 세포, 주르카트(Jurkat) 인간 백혈병 T 세포, 293 인간 배아 신장 세포, 마우스 3T3 섬유아세포, HeLa 세포, 및 NBT2 랫트 방광 암종 세포에서 발견되었기 때문에, 이 동형체는 도처에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 그러한 광범위한 발현은 이 동형체가 신호전달 경로에서 폭넓게 중요하다는 것을 제시한다.
PI 3-키나아제의 p110δ 동형체의 확인이 문헌[Chantry et al., J Biol Chem, 272:19236-41 (1997)]에 기술되어 있다. 인간 p110δ 동형체는 조직-제한된 방식으로 발현되는 것으로 관찰되었다. 그것은 림프구 및 림프 조직에서 높은 수준으로 발현되며 면역계에서 PI 3-키나아제-매개된 신호전달에서 핵심 역할을 하는 것으로 나타났다(Al-Alwan etl al. JI 178: 2328-2335 (2007); Okkenhaug et al JI, 177: 5122-5128 (2006); Lee et al. PNAS, 103: 1289-1294 (2006)). P110δ는 또한 유방 세포, 멜라닌세포 및 내피 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났고(Vogt et al. Virology, 344: 131-138 (2006), 그 이후로 유방암 세포에 대해 선택적 전이 특성을 부여하는 것과 관련되어 왔다(Sawyer et al. Cancer Res. 63:1667-1675 (2003)). P110δ 동형체에 관한 세부사항은 또한 미국 특허 제5,858,753호; 제5,822,910호; 및 제5,985,589호에서 발견될 수 있다. 또한 문헌[Vanhaesebroeck et al., Proc Nat. Acad Sci USA, 94:4330-5 (1997)], 및 국제 공보 WO 97/46688호를 참조한다.
PI3Kα, β, 및 δ 하위유형 각각에서, p85 서브유닛은 표적 단백질 내의 인산화된 티로신 잔기들(적절한 서열 맥락 내에 존재함)과 그 SH2 도메인의 상호작용에 의해 PI 3-키나아제를 원형질막에 국한시키는 작용을 한다(Rameh et al., Cell, 83:821-30 (1995)). p85의 5가지 동형체들(p85α, p85β, p55γ, p55δ 및 p50α)이 3가지 유전자에 의해 인코딩된 것으로 확인되었다. Pik3r1 유전자의 대안적인 전사체들이 p85α, p55α 및 p50α 단백질을 인코딩한다(Deane and Fruman, Annu.Rev.Immunol. 22: 563-598 (2004)). p85α는 도처에서 발현되는 반면, p85β는 주로 뇌 및 림프 조직에서 발견된다(Volinia et al., Oncogene, 7:789-93 (1992)). p85 서브유닛의 PI 3-키나아제 p110α, β, 또는 δ 촉매적 서브유닛으로의 회합은 이들 효소의 촉매적 활성 및 안정성에 필요한 것으로 보인다. 또한, Ras 단백질의 결합은 또한 PI 3-키나아제 활성을 상향조절한다.
p110γ의 클로닝은 효소의 PI3K 패밀리 내에서의 추가의 복잡성을 여전하게 밝혀내었다(Stoyanov et al., Science, 269:690-93 (1995)). p110γ 동형체는 p110α 및 p110β와 밀접히 관련되지만(촉매 도메인에서 45-48% 동일성), 지적한 바와 같이 표적 서브유닛으로서 p85를 이용하지 않는다. 대신에, p110γ는 또한 헤테로삼량체 G 단백질의 βγ 서브유닛에 결합하는 p101 조절 서브유닛에 결합한다. PI3K감마에 대한 p101 조절 서브유닛은 본래 돼지에서 클로닝되었고, 이어 인간 오쏠로그가 확인되었다(Krugmann et al., J Biol Chem, 274:17152-8 (1999)). p101의 N-말단 영역과 p110γ의 N-말단 영역 사이의 상호작용은 Gβγ를 통해 PI3Kγ를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 최근에, p110γ에 결합하는 p84 또는 p87PIKAP(87 kDa의 PI3Kγ어댑터 단백질)인 p101-동족체가 확인되었다(Voigt et al. JBC, 281: 9977-9986 (2006), Suire et al. Curr.Biol. 15: 566-570 (2005)). p87PIKAP는 p110γ 및 Gβγ에 결합하는 영역에서 p101에 상동이며 또한 G-단백질-커플링된 수용체의 하류에 있는 p110γ의 활성화를 매개한다. p101과 달리, p87PIKAP는 심장에서 높게 발현되며 PI3Kγ 심장 기능에 중요할 수 있다.
항시적으로 활성인 PI3K 폴리펩타이드가 국제 공보 WO 96/25488호에 기재되어 있다. 이 공보는 인터-SH2(iSH2) 영역으로서 알려진 p85의 102-잔기 단편이 링커 영역을 통해 쥣과(murine) p110의 N-말단 영역에 융합된 키메라 융합 단백질의 제조를 개시하고 있다. p85 iSH2 도메인은 분명하게 온전한 p85와 비교될 수 있는 방식으로 PI3K 활성을 활성화시킬 수 있다(Klippel et al., Mol Cell Biol, 14:2675-85 (1994)).
따라서, PI 3-키나아제는 그의 아미노산 동일성에 의해 또는 그의 활성에 의해 규정될 수 있다. 이 성장하는 유전자 패밀리의 추가의 멤버는 사카로마이세스 세레비시애의 Vps34 TOR1, 및 TOR2(및 그의 포유동물 동족체, 예컨대 FRAP 및 mTOR), 혈관확장성 운동실조증 유전자 산물(ATR) 및 DNA-의존적 단백질 키나아제의 촉매적 서브유닛(DNA-PK)을 포함하는 더 먼 관계인 지질 및 단백질 키나아제를 포함한다. 일반적으로, 문헌[Hunter, Cell, 83:1-4 (1995)]을 참고한다.
PI 3-키나아제는 또한 백혈구 활성화의 수많은 측면과 관련이 있다. p85-연관된 PI 3-키나아제 활성은 항원에 대한 반응으로 T-세포의 활성화에 중요한 공동자극인자 분자인 CD28의 세포질 도메인과 물리적으로 회합하는 것으로 나타났다(Pages et al., Nature, 369:327-29 (1994); Rudd, Immunity, 4:527-34 (1996)). CD28을 통한 T 세포의 활성화는 항원에 의한 활성화를 위한 역치를 낮추고 증식 반응의 크기 및 지속시간을 증가시킨다. 이들 효과는 중요한 T 세포 성장 인자인 인터루킨-2(IL2)를 포함하는 수많은 유전자의 전사 증가와 관련된다(Fraser et al., Science, 251:313-16 (1991)). PI 3-키나아제와 더 이상 상호작용할 수 없는 CD28의 돌연변이는 IL2 생산을 개시할 수 없게 하는데, 이는 T 세포 활성화에서 PI 3-키나아제의 매우 중요한 역할을 제시한다.
효소의 패밀리의 개별적인 멤버에 대한 특이적 억제제들은 각 효소의 기능을 해독하기 위한 매우 유용한 도구를 제공한다. 두 화합물, LY294002 및 워트만닌(wortmannin)은 PI 3-키나아제 억제제로서 널리 사용되어 왔다. 그러나, 이들 화합물은 계열 I PI 3-키나아제의 4개의 멤버 간을 구별할 수 없기 때문에 비특이적 PI3K 억제제이다. 예를 들면, 다양한 계열 I PI 3-키나아제 각각에 대한 워트만닌의 IC50 값은 1-10nM의 범위이다. 유사하게, 이들 PI 3-키나아제 각각에 대한 LY294002에 대한 IC50 값은 약 1μM이다(Fruman et al., Ann Rev Biochem, 67:481-507 (1998)). 그러므로, 개별적인 계열 I PI 3-키나아제의 역할을 연구하는데 있어서 이들 화합물의 유용성은 제한된다.
워트만닌을 이용한 연구에 기초하여, PI 3-키나아제 기능이 또한 G-단백질 커플링된 수용체를 통한 백혈구 신호전달의 일부 측면에 필요하다는 증거가 있다 (Thelen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91:4960-64 (1994)). 게다가, 워트만닌 및 LY294002는 중성구 이동 및 과산화물 방출을 차단하는 것으로 나타났다. 그러나, 이들 화합물이 PI3K의 다양한 동형체 간을 구별하지 못한다는 점을 고려하면, 이들 연구들로부터 어떤 특정한 PI3K 동형체 또는 동형체들이 이들 현상에 관여하는지 그리고 상이한 계열 I PI3K 효소들이 일반적으로 정상 조직과 병든 조직에서 무슨 기능을 수행하는지 여전히 불명확하다. 대부분의 조직에서 몇 가지 PI3K 동형체들의 공동-발현은 최근까지 각 효소의 활성을 분리하는 노력을 좌절시켜왔다.
다양한 PI3K 동질효소들의 활성의 분리는 동형체-특이적 넉아웃(knock-out) 및 키나아제 데드 넉인(dead knock-in) 마우스의 연구를 가능하게 한 유전적으로 조작된 마우스의 개발 및 일부 상이한 동형체들에 대해 보다 선택적인 억제제의 개발로 인해 최근에 진전되었다. p110α 및 p110β 넉아웃 마우스가 생성되었으며, 둘 모두는 배아 치사이고, p110 알파 및 베타의 발현 및 기능과 관련된 정보를 이들 마우스로부터 거의 얻을 수 없다(Bi et al. Mamm.Genome, 13:169-172 (2002); Bi et al. J.Biol.Chem. 274:10963-10968 (1999)). 보다 최근에는, 키나아제 활성을 손상시키지만 돌연변이 p110α키나아제 발현을 유지하는 ATP 결합 포켓(p110αD933A)의 DFG 모티프에 단일 점 돌연변이를 갖는 p110α 키나아제 데드 넉인 마우스가 생성되었다. 넉아웃 마우스와 달리, 넉인 접근법은 넉아웃 마우스보다 신호전달 복합 화학양론, 스캐폴드 기능 및 모사체 소분자 접근법을 보다 현실적으로 유지한다. p110α KO 마우스와 유사하게, p110αD933A 동종접합 마우스는 배아 치사이다. 그러나, 이형접합 마우스는 생존가능하며 번식하지만 인슐린-수용체 기질(IRS) 단백질, 인슐린의 핵심 매개체, 인슐린-유사 성장 인자-1 및 렙틴 작용을 통해 심각하게 둔화된 신호전달을 나타낸다. 이들 호르몬에 대한 불량성 반응성은 고인슐린혈증, 당 불내증, 과식, 비만 증가 및 이형접합체에서의 전체적인 성장 감소를 야기한다(Foukas, et al. Nature, 441: 366-370 (2006)). 이들 연구는 다른 동형체들에 의해 대체되지 않는 IGF-1, 인슐린 및 렙틴 신호전달의 중간체로서 p110α의 규정되고 중복되지 않은 역할을 밝혀내었다. 본 발명자들은 이 동형체의 기능을 더 이해하기 위해 p110β 나아제-데드 넉인 마우스의 설명을 기다려야 할 것이다(마우스는 제조되었으나 아직 공개되지 않았음; Vanhaesebroeck).
P110γ 넉아웃 및 키나아제-데드 넉인 마우스가 모두 생성되었으며 선천성 면역계의 세포들의 이동에서의 일차 결함 및 T 세포의 흉선 발달에서의 결함을 갖는 유사하고 가벼운 표현형(phenotypes)을 전체적으로 보여준다(Li et al. Science, 287: 1046-1049 (2000), Sasaki et al. Science, 287: 1040-1046 (2000), Patrucco et al. Cell, 118: 375-387 (2004)).
P110γ와 유사하게, PI3K 델타 넉아웃 및 키나아제-데드 넉인 마우스가 제조되었고, 가볍고 유사한 표현형을 가지고 생존가능하다. p110δD910A 돌연변이 넉인 마우스는 거의 검출될 수 없는 변연부 B 세포 및 CD5+ B1 세포와 함께, B 세포 발달 및 기능, 및 B- 및 T 세포 항원 수용체 신호전달에서 델타를 위한 중요한 역할을 입증하였다(Clayton et al. J.Exp.Med. 196:753-763 (2002); Okkenhaug et al. Science, 297: 1031-1034 (2002)). p110δD910A 마우스가 광범위하게 연구되어 왔고 델타가 면역계에서 수행하는 다양한 역할을 설명해왔다. T 세포 의존적 및 T 세포 비의존적 면역 반응은 p110δD910A에서 심각하게 약화되며, TH1(INF-γ) 및 TH2 사이토카인(IL-4, IL-5)의 분비는 손상된다(Okkenhaug et al. J.Immunol. 177: 5122-5128 (2006)). p110δ에서 돌연변이를 갖는 인간 환자가 또한 최근에 기술되어 왔다. 종래 알려지지 않은 병인학의 일차 B 세포 면역결핍 및 감마-저글로불린혈증을 갖는 대만 소년이 p110δ의 엑손 24 내의 코돈 1021에서 m.3256G의 A로의 단일 염기-쌍 치환을 나타내었다. 이 돌연변이는 p110δ 단백질의 고도로 보존된 촉매 도메인 내에 위치하는 코돈 1021에서 미스센스 아미노산 치환(E의 K로의 치환)을 야기하였다. 상기 환자는 다른 확인된 돌연변이가 없으며 그의 표현형은 연구된 범위내의 마우스에서의 p110δ 결핍과 일치한다(Jou et al. Int.J.Immunogenet. 33: 361-369 (2006)).
모든 계열 I PI3 키나아제 동형체에 대한 다양한 성공과 더불어 동형체-선택적 소분자 화합물들이 개발되어 왔다(Ito et al. J. Pharm. Exp. Therapeut., 321:1-8 (2007)). p110α에서의 돌연변이가 몇 가지 고형 종양에서 확인되었기 때문에 알파에 대한 억제제가 바람직하며, 예를 들면, 알파의 증폭 돌연변이는 난소, 자궁경부, 폐 및 유방암의 50%와 연관되며 활성화 돌연변이는 창자의 50% 및 유방암의 25% 이상에 기술되어 왔다(Hennessy et al. Nature Reviews, 4: 988-1004 (2005)). 야마노치는 동등한 효력으로 알파 및 델타를 억제하면서 베타 및 감마에 대해 각각 8배 및 28배 선택적인 화합물 YM-024를 개발하였다(Ito et al. J.Pharm.Exp.Therapeut., 321:1-8 (2007)).
P110β는 혈전 형성과 관련되어 있고(Jackson et al. Nature Med. 11: 507-514 (2005)), 이 동형체에 대해 특이적인 소분자 억제제들이 응고 장애와 관련된 징후를 위해 숙고되고 있다(TGX-221: 베타에 대해 0.007uM; 델타에 대해 14배 선택적이며, 감마 및 알파에 대해 500배 넘게 선택적임)(Ito et al. J.Pharm.Exp.Therapeut., 321:1-8 (2007)).
p110γ에 대한 선택적 화합물들이 자가면역 질환에 대한 면역억제제로서 몇몇 그룹에 의해 개발되고 있다(Rueckle et al. Nature Reviews, 5: 903-918 (2006)). 아주 흥미롭게, AS 605240은 류마티스성 관절염의 마우스 모델에서 효과적이며(Camps et al. Nature Medicine, 11: 936-943 (2005)), 전신 홍반성 낭창의 모델에서 질환의 개시를 지연하는 것으로 나타났다(Barber et al. Nature Medicine, 11: 933-935 (205)).
델타-선택적 억제제들이 또한 최근에 기술되어 왔다. 가장 선택적인 화합물은 퀴나졸리논 퓨린 억제제(PIK39 및 IC87114)를 포함한다. IC87114는 높은 나노몰 범위(세 자리 수)에서 p110δ를 억제하며 p110α에 대해 100배가 넘는 선택성을 가지고, P110β에 대해 52배 선택적이지만 p110γ에 대해 선택성이 부족하다(대략 8배). 그것은 시험된 임의의 단백질 키나아제들에 대해 활성을 나타내지 않는다(Knight et al. Cell, 125: 733-747 (2006)). 델타-선택적 화합물 또는 유전적으로 조작된 마우스(p110δD910A)를 이용하여, B 및 T 세포 활성화에서 핵심 역할을 하는 것 외에도, 델타는 또한 중성구 이동 및 감작된 중성구 호흡 폭발(respiratory burst)에 일부 관련되어 있으며 항원-IgE 매개된 비만 세포 탈과립화의 부분적 차단을 야기하는 것으로 나타났다(Condliffe et al. Blood, 106: 1432-1440 (2005); Ali et al. Nature, 431: 1007-1011 (2002)). 따라서, p110δ는 비제한적으로 자가면역 질환 및 알러지를 포함하는, 비정상적인 염증 상태에 관여하는 것으로도 알려진 많은 핵심 염증성 반응의 중요한 매개체로서 부각되고 있다. 이 개념을 지지하기 위해, 유전적 도구 및 약리학적 제제를 이용한 연구로부터 도출된 p110δ 표적 검증 데이터의 수가 늘어나고 있다. 따라서, 델타-선택적 화합물 IC 87114 및 p110δD910A 마우스를 이용하여, Ali 등(Nature, 431: 1007-1011 (2002))은 델타가 알러지성 질환의 쥣과 모델에서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 기능성 델타의 부재시, 수동적인 피부 과민증(PCA)이 유의하게 감소하며 이는 알러지항원-IgE 유도된 비만 세포 활성화 및 탈과립화의 감소에 기인할 수 있다. 또한, IC 87114를 이용한 델타의 억제는 난백알부민-유도된 기도 염증을 이용한 천식의 쥣과 모델에서 염증 및 질환을 유의하게 개선하는 것으로 나타났다(Lee et al. FASEB, 20: 455-465 (2006)). 화합물을 이용한 이들 데이타는 상이한 그룹에 의한 알러지성 기도 염증의 동일한 모델을 이용한 p110δD910A 돌연변이 마우스에서 확증되었다(Nashed et al. Eur.J.Immunol. 37:416-424 (2007)).
염증성 및 자가면역 환경에서 PI3Kδ 기능의 추가적인 특성규명이 여전히 필요하다. 더욱이, PI3Kδ의 본 발명자들의 이해는 p110δ의 그의 조절 서브유닛 및 세포내 다른 단백질과 둘 다의 구조적 상호작용의 추가 정교화를 요구한다. 또한 동질효소 p110 알파(인슐린 신호전달) 및 베타(혈소판 활성화)에 대한 활성과 연관된 잠재적인 독성학을 피하기 위해, PI3K 델타의 더 강하고 선택적이거나 특이적인 억제제가 여전히 필요하다. 특히, PI3Kδ의 선택적이거나 특이적인 억제제가 이 동질효소의 역할을 더 탐색하고 동질효소의 활성을 조절하는 우수한 의약품을 개발하는데 바람직하다.
요약
본 발명은 인간 PI3Kδ에서 개선된 특성 및 생물학적 활성을 갖는 신규 화합물을 포함한다.
상세한 설명
본 발명의 하나의 측면은 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
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Figure pct00002
.
본 발명의 또 하나의 측면은 PI3K-매개된 병태 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
어떤 구현예에서, PI3K-매개된 병태 또는 장애는 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, PI3K-매개된 병태 또는 장애는 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, 고혈압, 심부 정맥 혈전증, 뇌졸중, 심근경색증, 불안정한 협심증, 혈전색전증, 폐 색전증, 혈전용해 질환, 급성 동맥 허혈, 말초 혈전성 폐색, 및 관상동맥 질환로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, PI3K-매개된 병태 또는 장애는 암, 결장암, 교모세포종, 자궁내막암종, 간세포 암, 폐암, 흑색종, 신장 세포 암종, 갑상선 암종, 세포 림프종, 림프증식성 장애, 소세포 폐암, 편평상피 세포 폐 암종, 신경아교종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 및 백혈병으로부터 선택된다. 또 하나의 구현예에서, PI3K- 매개된 병태 또는 장애는 제 II 형 당뇨병으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, PI3K-매개된 병태 또는 장애는 호흡 질환, 기관지염, 천식, 및 만성 폐쇄성 폐 질환으로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 발명의 또 하나의 측면은 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 관한 것이고 이 치료는 상기 구현예에 따른 임의의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증의 치료에 관한 것이고, 이 치료는 임의의 상기 또는 이하의 구현예에 따른 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 p110δ 활성으로 매개된, 그것에 의존적인 또는 그것과 연관된 암의 치료에 관한 것이고, 이 치료는 임의의 상기 또는 이하의 구현예에 따른 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 급성 골수 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수-증식성 질환, 만성 골수성 백혈병, T-세포 급성 림프모구 백혈병, B-세포 급성 림프모구 백혈병, 비-호지킨 림프종, B-세포 림프종, 고형 종양 및 유방암으로부터 선택된 암의 치료에 관한 것이고, 이 치료는 임의의 상기 또는 이하의 구현예에 따른 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 측면은 상기 구현예에 따른 임의의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은 상기 구현예에 따른 임의의 화합물의 약제로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환, 및 자가면역 질환의 치료용 약제의 제조에서의, 상기 구현예에 따른 임의의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 몇 개의 비대칭 중심을 가질 수 있고 라세미 혼합물의 형태로 전형적으로 묘사된다. 본 발명은 라세미 혼합물, 부분적으로 라세미 혼합물 및 별개의 거울상이성질체 및 부분입체이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 종래의 수단에 의해 제조된 염을 의미하고 당해분야의 숙련가에 의해 잘 알려져 있다. "약리적으로 허용가능한 염"은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 말산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 석신산, 말레산, 살리실산, 벤조산, 페닐아세트산, 만델산 등을 비제한적으로 포함하는 무기 및 유기산의 염기성 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 산성 관능기 예컨대 카복시 그룹을 포함할 때, 이때 카복시 그룹에 대한 적당한 약제학적으로 허용가능한 양이온 쌍은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고 알칼리성, 알칼리토, 암모늄, 사급 암모늄 양이온 등을 포함한다. "약리적으로 허용가능한 염"의 추가의 예에 대해 이하를 참조한다: Berge 등, J. Pharm. Sci. 66:1 (1977).
"이탈 그룹"은 일반적으로 친핵체, 예컨대 아민, 티올 또는 알코올 친핵체에 의해 쉽게 치환가능한 그룹을 의미한다. 그와 같은 이탈 그룹은 당해기술에 공지되어 있다. 그와 같은 이탈 그룹의 예는, 비제한적으로, N하이드록시석신이마이드, N하이드록시벤조트리아졸, 할라이드, 트리플레이트, 토실레이트 등을 포함한다. 바람직한 이탈 그룹은 적절한 경우 본원에서 명시되어 있다.
"보호 그룹"은 일반적으로, 선택된 반응성 그룹, 예컨대 카복시, 아미노, 하이드록시, 머캅토 등이 원하지 않는 반응, 예컨대 친핵성, 친전자성, 산화, 환원 등을 겪지 않도록 하기 위해 사용된, 당해기술에서 잘 알려진 그룹을 의미한다. 바람직한 보호 그룹은 적절한 경우 본원에서 명시되어 있다. 아미노 보호 그룹의 예는, 비제한적으로, 아랄킬, 치환된 아랄킬, 사이클로알케닐알킬 및 치환된 사이클로알케닐 알킬, 알릴, 치환된 알릴, 아실, 알콕시카보닐, 아르알콕시카보닐, 실릴 등을 포함한다. 아랄킬의 예는, 비제한적으로, 벤질, 오르토-메틸벤질, 트리틸 및 벤즈하이드릴을 포함하고, 이것은 할로겐, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 니트로, 아실아미노, 아실 등, 및 염, 예컨대 포스포늄 및 암모늄 염으로 임의로 치환될 수 있다. 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸, 인다닐, 안트라세닐, 9-(9-페닐플루오레닐), 펜안트레닐, 듀레닐 등을 포함한다. 사이클로알케닐알킬 또는 치환된 사이클로알킬레닐알킬 라디칼의 예는, 바람직하게는 6-10 개의 탄소 원자를 가지며, 비제한적으로, 사이클로헥세닐 메틸 등을 포함한다. 적당한 아실, 알콕시카보닐 및 아르알콕시카보닐 그룹은 벤질옥시카보닐, t-부톡시카보닐, 이소-부톡시카보닐, 벤조일, 치환된 벤조일, 부티릴, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 트리클로로 아세틸, 프탈로일 등을 포함한다. 보호 그룹의 혼합물은 동일한 아미노 그룹을 보호하기 위해 사용될 수 있고, 예컨대 일차 아미노 그룹은 아랄킬 그룹 및 아르알콕시카보닐 그룹 둘 모두에 의해 보호될 수 있다. 아미노 보호 그룹은, 그것이 부착되는 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리를 또한 형성할 수 있고, 그 예는 1,2-비스(메틸렌)벤젠, 프탈이미딜, 석신이미딜, 말레이미딜 등이고 여기서 이들 헤테로사이클릭 그룹은 인접 아릴 및 사이클로알킬 고리를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 헤테로사이클릭 그룹은 모노-, 디- 또는 트리-치환된, 예컨대 니트로프탈이미딜일 수 있다. 아미노 그룹은 부가 염의 형성을 통한 원하지 않는 반응, 예컨대 산화에 대항하여 또한 보호될 수 있고, 그 예는하이드로클로라이드, 톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 등이다. 많은 아미노 보호 그룹은 카복시, 하이드록시 및 머캅토 그룹을 보호하는데 또한 적당하다. 예를 들면, 아랄킬 그룹. 알킬 그룹은 또한 하이드록시 및 머캅토 그룹, 예컨대 tert-부틸을 보호하기 위한 적당한 그룹이다. 실릴 보호 그룹은 하나 이상의 알킬, 아릴 및 아랄킬 그룹에 의해 임의로 치환된 실리콘 원자이다. 적합한 실릴 보호 그룹은, 비제한적으로, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리이소프로필실릴, tert-부틸디메틸실릴, 디메틸페닐실릴, 1,2-비스(디메틸실릴)벤젠, 1,2-비스(디메틸실릴)에탄 및 디페닐메틸실릴을 포함한다. 아미노 그룹의 실릴화는 모노- 또는 디-실릴아미노 그룹을 제공한다. 아미노알코올 화합물의 실릴화는 N,N,O-트리실릴 유도체를 야기할 수 있다. 실릴 에테르 관능성으로부터 실릴 관능성의 제거는, 별개의 반응 단계로서 또는 알코올 그룹과의 반응 동안 원위치에서, 예를 들면 금속 수산화물 또는 암모늄 플루오라이드 시약으로 처리함으로써 쉽게 달성된다. 적합한 실릴화제는, 예를 들면, 트리메틸실릴 클로라이드, tert-부틸-디메틸실릴 클로라이드, 페닐디메틸실릴 클로라이드, 디페닐메틸 실릴 클로라이드 또는 이들의 이미다졸 또는 DMF과의 복합 산물이다. 아민의 실릴화 방법 및 실릴 보호 그룹의 제거 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 상응하는 아미노산, 아미노산 아마이드 또는 아미노산 에스테르로부터의 이들 아민 유도체들을 제조하는 방법은 아미노산/아미노산 에스테르 또는 아미노알코올 화학을 포함하는 유기 화학의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
보호 그룹은 분자의 나머지 부분에 영향을 미치지 않을 조건 하에서 제거된다. 이들 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 산 가수분해, 수소첨가분해 등을 포함한다. 바람직한 방법은 알코올, 아세트산 등 또는 이들의 혼합물과 같은 적합한 용매계 내에서 탄소상 팔라듐을 이용한 수소첨가분해에 의한 벤질옥시카보닐 그룹의 제거와 같은, 보호 그룹의 제거를 수반한다. t-부톡시카보닐 보호 그룹은 디옥산 또는 메틸렌 클로라이드과 같은 적합한 용매계 내에서, HCl 또는 트리플루오로아세트산과 같은 무기 또는 유기산을 이용하여 제거될 수 있다. 수득한 아미노 염은 쉽게 중화되어 유리 아민을 생성할 수 있다. 카복시 보호 그룹, 예컨대 메틸, 에틸, 벤질, tert-부틸, 4-메톡시페닐메틸 등은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 가수분해 및 수소첨가분해 조건 하에서 제거될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 하기 예에 도시된 환식 및 비환식 아미딘 및 구아니딘 그룹, 헤테로원자 치환된 헤테로아릴 그룹(Y' = O, S, NR) 등과 같은, 호변체 형태로 존재할 수 있는 그룹들을 함유할 수 있다는 것에 유의해야 하고:
Figure pct00003
비록 본원에서 한 가지 형태가 명명되고/거나, 설명되고/거나, 표시되고/거나 청구되어 있음에도 불구하고, 모든 호변체 형태가 그러한 명명, 설명, 표시 및/또는 청구항에 본질적으로 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물의 전구약물들이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 전구약물은 상기 전구약물을 환자에게 투여한 후 가수분해, 대사 등과 같은 생체내 생리적 작용을 통해 화학적으로 본 발명의 화합물로 변형되는 활성 또는 불활성 화합물이다. 전구약물을 제조하고 사용하는 것과 관련된 적합성 및 기술은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 에스테르를 포함하는 전구약물의 일반적인 논의를 위해 문헌[Svensson 및 Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) 및 Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)]을 참조한다. 마스킹된 카복실레이트 음이온의 예는 다양한 에스테르, 예컨대 알킬(예를 들면, 메틸, 에틸), 사이클로알킬(예를 들면, 사이클로헥실), 아랄킬(예를 들면, 벤질, p-메톡시벤질), 및 알킬카보닐옥시알킬(예를 들면, 피발로일옥시메틸)을 포함한다. 아민은 생체내에서 에스테라제에 의해 절단되어 유리 약물 및 포름알데하이드를 방출하는 아릴카보닐옥시메틸 치환된 유도체들로서 마스킹되어 왔다(Bungaard J. Med. Chem. 2503 (1989)). 또한, 이미다졸, 이마이드, 인돌 등과 같은 산성 NH 그룹을 함유하는 약물은, N-아실옥시메틸 그룹으로 마스킹되어 왔다(Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)). 하이드록시 그룹은 에스테르 및 에테르로서 마스킹되어 왔다. EP 제039,051호(Sloan 및 Little, 4/11/81)는 만니히-염기 하이드록삼산 전구약물, 그의 제조 및 용도를 개시한다.
본 명세서 및 청구항은 표현 "... 및 ...로부터 선택되는" 및 "는 .... 또는 ...이다" (때때로 마쿠쉬 그룹으로서 지칭됨)를 이용한 종류의 목록을 함유한다. 이 표현이 본원에서 사용되는 경우, 달리 언급되지 않으면, 전체로서의 상기 그룹, 또는 이의 임의의 단일 멤버, 또는 이의 임의의 하위그룹을 포함하는 것을 의미한다. 이 표현의 사용은 단지 속기 목적을 위한 것이며 어떤 식으로든 개별적인 요소 또는 필요에 따라 하위그룹의 제거를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실험
하기의 약어가 사용된다:
aq. - 수성
BINAP - 2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-바이나프틸
cond - 농축된
DCM 디클로로메탄
DMF - N,N-디메틸포름아미드
Et2O - 디에틸 에테르
EtOAc - 에틸 아세테이트
EtOH - 에틸 알코올
h - 시간(초)-
min - 분
MeOH - 메틸 알코올
rt 실온
satd - 포화된
THF - 테트라하이드로푸란
일반
하기 사용된 시약 및 용매들은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 1H-NMR 스펙트럼은 Bruker 400 MHz 및 500 MHz NMR 분광기 상에서 기록되었다. 유의미한 피크는 다중도(s, 단일항; d, 이중항; t, 삼중항; q, 사중항; m, 다중항; br s, 광범위 단일항), 결합 상수(s) Hertz (Hz) 및 양성자의 수의 순서로 표로 작성된다. 질량 분광분석법 결과는 전하 대비 질량의 비에 이어서, 각 이온의 상대적 존재비(괄호()로 표시)로서 기록되었다. 전기분무 이온화(ESI) 질량 분광분석법 분석은 Agilent 1100 시리즈 LC/MSD 전기분무 질량 분광분석기 상에서 수행되었다. 모든 화합물은 전달 용매로서 0.1% 포름산을 갖는 아세토니트릴:물을 이용한 양성 ESI 모드에서 분석될 수 있다. 역상 분석적 HPLC를 고정상으로서 Agilent Eclipse XDB-C18 5μm 칼럼(4.6 x 150 mm) 상에서 Agilent 1200 시리즈를 이용하고 0.1% TFA를 갖는 아세토니트릴:H2O로 용출시켜 수행되었다. 역상 반예비(Semi-prep) HPLC를 고정상으로서 Phenomenex GeminiTM 10μm C18 칼럼 (250 x 21.20 mm) 상에서 Agilent 1100 시리즈를 이용하고 0.1% TFA를 갖는 아세토니트릴:H2O로 용출시켜 수행되었다. 키랄 화합물은 이소프로판올/ 헥산 구배, AD 칼럼을 이용하여 정제된다. 키랄성의 배정은 생화학적 데이터에 기초한다.
실시예 1: 4-아미노-6-(((1S)-1-(8- 플루오로 -2-(2-( 메틸 - 설포닐 )- 페닐)-3-퀴놀리닐 )-에틸)-아미노)-5- 피리미딘카보니트릴 N-(2- 플루오로페닐 )- 신남아마이드의 제조
Figure pct00004
물 (112 mL) 및 아세톤 (45 mL) 중 2-플루오로아닐린 (25.0g, 225 mmol) 및 칼륨 카보네이트 (47 g, 337 mmol)의 용액에 0℃에서 아세톤 (45 mL) 중 신나모일 클로라이드 (37.0 g, 225 mmol, 1 당량)을 2 시간에 걸쳐 부가했다. 반응을 1 시간 동안 0℃에서 교반하고, 200 mL의 빙수로 켄칭했다. 백색 결정성 고형물을 여과하고 물로 세정했다. 고형물을 2 시간 동안 공기 건조하고, 그 다음 400 mL의 헥산으로 세정했다. 고형물을 진공하에서 밤새 건조하여 N-(2-플루오로페닐)-신남아마이드 (56 g, 103% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.49 (br t, J = 7.8Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 15.3 Hz, 1 H), 7.57 (m, 3H), 7.41 (m, 3 H), 7.17 (m, 3 H), 6.61 (d, J = 15.6 Hz, 1 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 242.1 (M + 1).
8- 플루오로퀴놀린 -2(1H)-온
Figure pct00005
N-(2-플루오로페닐)-신남아마이드 (10.5g, 44 mmol)을 클로로-벤젠 (60 mL)에서 용해시키고 알루미늄 트리클로라이드 (29.0 g, 218 mmol, 5 당량)을 부가했다. 반응을 125℃로 3 시간 동안 가열하고 그 다음 실온으로 45 분에 걸쳐 냉각했다. 반응을 교반하면서 300 g의 얼음에 붓고, 이로써 황갈색 고형물이 생성되었다. 고형물을 여과하고 100 mL의 물 및 3×100 mL의 헥산으로 세정하고 고진공 하에서 건조했다. 고형물을 1 L의 DCM로 추출하고 여과하여 불용성 부산물을 제거했다. 용매를 진공에서 제거하여 8-플루오로퀴놀린-2(1H)-온을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 10.95 (br s, 1H), 7.77 (dd, J = 9.8, 1.6 Hz, 1 H), 7.35 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.27 (ddd, J = 10.2, 7.8, 1.2 Hz, 1 H), 7.14 (td, J = 8.0, 5.1 Hz, 1 H), 6.76 (d, J = 9.4 Hz, 1 H).
2- 클로로 -8- 플루오로퀴놀린
Figure pct00006
8-플루오로퀴놀린-2(1H)-온 (26.0 g, 159 mmol)을 포스포릴 트리클로라이드 (163 ml, 1.73 mol, 11 당량)로 슬러리화하고 125℃로 2 시간 동안 가열했다. 반응을 실온으로 냉각시키고 격렬한 교반과 함께 1.2 L의 빙수에 부었다. 혼합물이 실온으로 냉각되었을 때, 오렌지색 고형물을 여과하고 물로 세정하고 진공하에서 밤새 건조하여 27 g의 미정제의 물질을 얻었다. 미정제의 물질을, 환류로 ~700 mL의 헥산에서 용해시켜 헥산으로부터 재결정화하고 잔여 타르를 데칸트로 제거했다. 헥산 용액을 0℃로 냉각하고 침전물 2-클로로-8-플루오로퀴놀린을 여과했다. 모액을 진공에서 농축하고 헥산으로부터 재결정화하여 2-클로로-8-플루오로퀴놀린의 제 2 수확물 (21.3 g, 74% 총 수율)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δppm 8.14 (dd, J = 8.6, 1.2 Hz, 1 H), 7.62 (br d, 1H), 7.52 (td, J = 7.8, 4.7 Hz, 1 H), 7.45 (m, 2 H).
1-(2- 클로로 -8- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에탄올
Figure pct00007
2-클로로-8-플루오로퀴놀린 (5.00 g, 27.5 mmol)을 THF (60 mL)에서 용해시키고 -78℃로 냉각했다. 이 용액에, 새로 제조되고 적정된 리튬 디이소프로필아마이드 (THF 중 1M 용액, 30 mL, 30 mmol, 1.1 당량)을 5 분에 걸쳐 부가했다. 반응을 -78℃에서 20 분 동안 교반되도록 하고, 그 후 아세트알데하이드 (2.3 mL, 41.3 mmol, 1.5 당량)을 주사기로 30 초에 걸쳐 부가했다 (발열). -78℃에서 30 분 후, 반응을 50% 포화된 NH4Cl 용액으로 켄칭하고 EtOAc로 희석했다. 층들을 분리하고 염수로 세정하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과했다. 미정제의 반응 혼합물을 30 g의 실리카겔 상에 침전시키고 8:2 헥산:EtOAc로 용출하는 60 g의 실리카겔의 플러그에 통과시켰다. 분획 함유 생성물 및 가깝게 (제 2) 용출하는 레지오이성질체를 수집했다. 분획을 농축하고 미정제의 고형물을 140 mL의 9:1 헥산:EtOAc에서 환류에서 30 분 동안 슬러리화했다. 실온으로 냉각한 후, 고형물을 여과하고 소량의 차가운 9:1 헥산:EtOAc로 세정하여 순수한 1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (3.1 g, 13.7 mmol, 50% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 8.43 (br s, 1 H), 7.64 (td, J = 7.8, 5.1 Hz, 1 H), 7.41 (ddd, J = 10.2, 7.4, 1.2 Hz, 1 H), 5.39 (qdd, J = 6.3, 3.9, 0.8 Hz, 1 H), 2.22 (d, J = 3.9 Hz, 1 H), 1.62 (d, J = 6.3 Hz, 3 H).
1-(2- 클로로 -8- 플루오로퀴놀린 -3-일)- 에타논
Figure pct00008
톨루엔 (183 mL)를 함유하는 둥근바닥 플라스크에 1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (6.20 g, 27.5 mmol) 및 이산화망간 (19.1 g, 220 mmol, 8 당량)을 부가했다. 반응을 2 시간 동안 가열 환류하고, 실온으로 냉각시키고, 여과하고 농축했다. 생성물을 헥산으로 희석하고 여과하여 백색 고형물로서 1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에타논 (4.43 g, 72% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.71 (br d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.56 (td, J = 7.8, 5.1 Hz, 1 H), 7.54 (ddd, J = 9.8, 7.8, 1.6 Hz, 1 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 223.9 (M + 1).
( R)- 1-(2- 클로로 -8- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에탄올
Figure pct00009
둥근바닥 플라스크에서 무수 THF (200 mL)에서 (+)dip-클로라이드(tm) (17.5g, 540 mmol, 2.2 당량)를 용해시키고 용액을 (드라이아이스/MeCN 배쓰를 사용하여) -55℃로 냉각했다. 이 용액에 1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에타논 (5.50 g, 24.5 mmol)을 THF (50 mL) 중 용액으로서 부가했다. 반응을 실온으로 서서히 밤새 따뜻하게 했다. 이 시간 후 반응을 10 mL 아세톤 및 100 mL의 10% Na2CO3으로 켄칭하고 2 시간 동안 실온에서 교반되도록 했다. 에틸 아세테이트 (750 mL)을 부가하고 층들을 분리했다. 유기 상을 50% 포화된 중탄산나트륨 용액으로 3회 그리고 염수로 1회 세정했다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 미정제의 물질을 고진공 하에서 75℃에서 농축하여 파이넨을 제거했다. 잔여물을 150 mL의 헥산 및 150 mL의 물에서 3 시간 동안 실온에서 슬러리화했다. 형성된 백색 침전물을 여과하고 건조하여 4.9g의 98% ee 생성물을 얻었다. 고형물을 25 mL의 비등 EtOAc에서 용해시키고 25 mL의 뜨거운 헥산을 부가하여 침전물을 환류에서 형성했다. 혼합물을 -15℃로 냉각하고, 여과하고, 차가운 9:1 헥산:EtOAc로 세정하여 (R)-1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (4.07g, 73% 수율)을 얻었다. 키랄 HPLC (헥산 중 10% IPA, Chiralcel AD-H)는 > 99.9% ee인 생성물을 보여준다. 원하는 거울상이성질체는 9.6 분에서 용출하고, 원하지 않는 거울상이성질체는 8.1 분에서 용출한다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 8.43 (br s), 7.64 (br d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.50 (td, J = 7.8, 4.7 Hz, 1 H), 7.41 (ddd, J = 10.2, 7.8, 1.2 Hz, 1 H), 5.40 (qd, J = 5.9, 0.8 Hz, 1 H), 2.22 (br s, 1 H), 1.62 (d, J = 6.3 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 226.0 (M + 1).
(S)-2-(1-(2- 클로로 -8- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00010
둥근바닥 플라스크에서 THF (240 mL) 중 프탈이마이드 (6.38 g, 43.3 mmol), 트리페닐포스핀 (1.14 g, 43.3 mmol), 및 (R)-1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (8.15 g, 36.2 mmol)을 배합했다. 용액을 0℃로 냉각하고 디이소프로필아조디카복실레이트 (DIAD, 8.5 mL, 43.3 mmol)을 적가했다. 반응을 실온으로 밤새 따뜻하게 했다. 반응을 ~100 mL의 용적으로 농축하고 1 L의 Et2O 및 200 mL의 물로 희석했다. 층들을 분리하고 수성 층을 200 mL의 Et2O로 역추출했다. 배합된 유기 층들을 160 mL의 염수로 세정하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 100% DCM을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 (S)-2-(1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (10.5 g, 82% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.60 (br s, 1 H), 7.74 (m, 2 H), 7.64 (m, 3 H), 7.45 (td, J = 7.8, 4.9 Hz, 1 H), 7.35 (ddd, J = 10.2, 7.8, 1.2 Hz, 1 H), 5.89 (q, J = 7.2 Hz, 1 H), 1.90 (d, J = 7.0 Hz, 3 H).
2-((1S)-1-(8- 플루오로 -2-(2-( 메틸티오 )- 페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3-디온
Figure pct00011
(S)-2-(1-(2-클로로-8-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (14.0 g, 39.5 mmol), 2-(메틸티오)-페닐보론산 (9.95 g, 59.2 mmol), 및 칼륨 카보네이트 (16.4 g, 118 mmol)을 300mL의 무수 DMF에서 N2의 대기 하에서 배합했다. 용액에 N2을 ~5분 동안 살포한 후 PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (3.22 g, 3.95 mmol)을 부가했다. 용액을 100℃에서 3 시간 동안 가열하고, 그 다음 50℃로 냉각했다. 용액을 진공 하에서 농축하여 갈색을 띤 잔여물을 얻었고, 이것을 EtOAc (600 mL)로 희석했다. 그 다음 유기 층들을 H2O (3×80 mL), 그 다음 염수 (1×100 mL)로 세정했다. 배합된 수성 층들을 DCM (3×200 mL)로 추출했다. 배합된 유기 층들을 MgSO4 상에서 건조시키고 그 다음 진공 하에서 농축했다. 수득된 잔여물을 20% 헥산 내지 40% EtOAc/헥산의 구배로 용출하는 실리카겔 플래시 크로마토그래피로 정제했다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 배합하고, 진공 하에서 농축하여 2-((1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸티오)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (14.6 g, 33.0 mmol, 84 % 수율)을 밝은 황색 거품으로서 얻었다. 양성자 NMR은 25℃에서 53/47 비의 회전장애이성질체를 반영한다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8.71 (br s, 0.53 H), 8.65 (br s, 0.47 H), 7.79 (m, 1H), 7.66 (s, 4 H), 7.55 (m, 1 H), 7.45-7.27 (일련의 m, 3.6 H), 6.87 (m, 1.4 H), 5.70 (q J = 6.4 Hz, 0.47 H), 5.63 (q, J = 6.8 Hz, 0.53 H), 2.47 (br s, 1.4 H), 1.91 (m, 3 H), 1.52 (br s, 1.6 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 443.2 (M + 1).
2-((1S)-1-(8- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐)-3-퀴놀리닐 )-에틸)-1H- 이소인돌 -1,3(2H)-디온
Figure pct00012
70 mL의 DCM에 13.56g (1.2g/1mmol의 기재)의 습성 몬모릴로나이트 (~0.2g H2O/1g의 점토), 및 옥손 (17.37 g, 28.2 mmol)1을 부가했다. 이 서스펜션에 DCM (10 mL)에서 용해된 2-((1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸티오)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (5.0 g, 11.3 mmol)의 용액을 부가했다. 슬러리를 실온에서 72 시간 동안 교반하고 그 다음 소결 깔때기를 통해 여과했다. 고형물을 DCM (~600 mL)로 세정하고 여과물을 진공 하에서 농축하여 2-((1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-3-퀴놀리닐)-에틸)-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온 7.11g (97%)을 밝은 황색 고형물로서 얻었다. 양성자 NMR은 25℃에서 59/41 비의 회전장애이성질체를 반영한다. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8.86 (s, 0.59 H), 8.79 (s, 0.41 H), 8.26 (d, J = 7.8 Hz, 0.41 H), 8.04 (d, J = 7.8 Hz, 0.59 H), 7.89-7.36 (일련의 m, 9.6 H), 7.20 (d, J = 7.6 Hz, 0.41 H), 5.70 (q, J = 7.1 Hz, 0.59 H), 5.54 (q, J = 7.3 Hz, 0.41 H), 3.19 (s, 1.75 H), 3.15 (s, 1.25 H), 1.98 (d, J = 7.3 Hz, 1.75 H), 1.85 (d, J = 7.1 Hz, 1.25 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 475.0 (M + 1).
1. Hirano, M.; Tomaru, J.; Morimoto, T. Bull . Chem . Soc . Jpn ., 1991, 64, 3752-54.
(1S)-1-(8- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐)-3-퀴놀리닐 )- 에탄아민
Figure pct00013
2-((1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (9.10 g, 19.2 mmol), 및 하이드라진 수화물 (9.32 mL, 192 mmol)을 EtOH (190 mL)에 부가했다. 65℃에서 3 시간 동안 가열한 후, 그 결과로 생긴 슬러리를 실온으로 냉각시키고, 900 mL의 EtOAc로 희석하고, 소결 깔때기를 통해 여과했다. 여과물을 H2O (3×200 mL), 염수(1×200 mL)로 세정하고 그 다음 MgSO4 상에서 건조시킨 후 진공 하에서 농축하여 (1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민 (6.06 g, 17.6 mmol, 92 % 수율)을 밝은 오렌지색 고형물로서 얻었다. 양성자 NMR은 25℃에서 73/27 비의 회전장애이성질체를 반영한다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8.55 (d, J = 1.5Hz, 0.73 H), 8.50 (d, J = 1.5 Hz, 0.27 H), 8.26 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 0.27 H), 8.23 (dq, J = 7.8 1.2 Hz, 0.73 H), 7.73 (m, 3 H), 7.52 (m, 1.27 H), 7.40 (m, 1.73 H), 4.16 (q, J = 6.6 Hz, 0.27 H), 4.03 (q, J = 6.4 Hz, 0.73 H), 3.36 (s, 0.79 H), 3.17 (s, 2.21 H), 1.36 (m, 3H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 345.2 (M + 1).
4-아미노-6-(((1S)-1-(8- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐)-3-퀴놀리닐 )-에틸)-아미노)-5- 피리미딘카보니트릴
Figure pct00014
(1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민 (9.16 g, 26.6 mmol), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (13.7 mL, 80 mmol), 및 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (4.32 g, 27.9 mmol)을 n-부탄올 (67 mL)에서 배합하고 그 다음 110℃로 N2의 대기 하에서 가열했다. 110℃에서 3시간 후, 반응의 온도는 120℃로 2 시간 동안 증가되었다. 빙욕에서 냉각한 후, 혼합물을 여과하여 14 g의 갈색을 띤 고형물이 남았다. 여과물을 120℃로 3 시간 동안 가열하고, 40℃로 냉각하고 진공 하에서 농축하여 갈색 오일이 남았다. 오일 및 고형물을 배합하고, 2% MeOH/DCM로 용출하는 실리카겔 플래시 칼럼으로 정제했다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 배합하고, 진공 하에서 농축하여 밝은 황색을 띤 고형물을 얻었다. 불순한 생성물을 함유하는 분획을 배합하고, 1.5% MeOH/DCM 내지 2% MeOH/DCM의 구배로 용출하는 실리카겔 플래시 칼럼 상에서 정제했다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 배합하고, 진공 하에서 농축하여 밝은 황색을 띤 고형물을 얻었다. 배합된 순수한 고형물을 가열 (~60℃)과 함께 EtOH에서 용해시키고, 그 다음 진공 하에서 농축하고, EtOH으로의 용해를 반복하고, 그 다음 진공 하에서 농축했다. 그 다음, 수득된 고형물을, 잔여 에탄올이 0.5중량 % 미만이 될 때까지 120℃에서 진공 라인에서 건조했다. 수득된 고형물로서 4-아미노-6-(((1S)-1-(8-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-3-퀴놀리닐)-에틸)-아미노)-5-피리미딘카보니트릴, 10.3g (84% 수율)을 얻었다. 양성자 NMR은 25℃에서 87/13 비의 회전장애이성질체를 반영한다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.80 (br s, 0.13 H), 8.58 (br s, 0.87 H), 8.13 (dd, J = 7.7, 1.2 Hz, 0.87 H), 7.95-7.52 (일련의 m, 8H), 7.30-6.99 (br m, 2 H), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.62 (오중항, J = 6.9 Hz, 0.13 H), 5.22 (오중항, J = 6.9 Hz, 0.87 H), 3.37 (s, 2.57 H), 3.31 9s, 0.43 H), 1.60 (d, J = 6.9 Hz, 0.4 H), 1.35 (d, J = 6.9 Hz, 2.6 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 463.1 (M + 1).
실시예 2: (S)-4-아미노-6-((1-(7- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴 2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3- 카브알데하이드의 제조
Figure pct00015
POCl3 (0.837 L, 9.17 mmol)을 기계적 교반기가 구비된 3-목 플라스크에서 0℃에서 DMF (253 mL, 3.28 mmol)에 적가했다. 반-고형 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고 N-(3-플루오로페닐)-아세트아마이드 (200 g, 1.31 mol)을 한번에 부가했다. 수득한 혼합물을 75℃에서 밤새 가열했다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 주의 깊게 빙수 (9 kg)에 부었다. 수득한 고형물을 여과하고, 물, NaHCO3으로 세정하고, 공기 중에서 건조했다. 미정제의 혼합물 (200 g, 73%)을 EtOAc (5 L)에서 재결정화하여 2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-카브알데하이드를 황백색 침상물 (150 g)로서 얻었다. 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 210 (M + 1).
1-(2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에탄올
Figure pct00016
THF (600 mL) 중 2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-카브알데하이드 (44.7 g, 213 mmol)의 서스펜션을 MeMgBr (78.0 mL, 234 mmol 1.1 당량)으로 -20℃에서 처리했다. 밤새 교반 후, 반응을 NH4Cl 용액으로 켄칭하고 Et2O (300 mL 및 100 mL)로 추출했다. 유기 층들을 물, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하고 EtOAc (100 mL) 및 헥산 (1 L)로부터 재결정화했다. 1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올의 담황색 고형물을 수득했다 (41 g, 85%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 226 (M + 1).
1-(2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3-일)- 에타논
Figure pct00017
1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (7.7 g, 34 mmol), MnO2 (30 g, 10 당량) 및 톨루엔 (200 mL)을 2 시간 동안 가열 환류했다. LC-MS는 반응의 완료를 보여주었다. 여과에 이은 용매의 제거로 1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에타논의 황백색 고형물을 얻었다 (6.2 g, 81%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 224 (M + 1).
(R)-1-(2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에탄올
Figure pct00018
THF (1.34 L) 중 1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에타논 (164 g, 733 mmol)의 용액을 THF (3.5 L) 중 (+)DIP-Cl (517.5 g, 2.2 당량)의 용액에 -45℃ (드라이아이스 및 아세토니트릴)에서 적가했다. 반응을 서서히 밤새 실온까지 따뜻하게 했다. 그 다음 반응을 아세톤 (750 mL) 및 10 % Na2CO3 (750 mL)로 0℃에서 켄칭하고 실온에서 1 시간 동안 교반한 후 EtOAc (3.5 L)을 부가했다. 혼합물을 실온까지 따뜻하게 하고 10% Na2CO3 및 물로 세정했다. 유기 층을 염수로 건조하고, 농축하고 헥산 (1.0 L) 및 물 (1.8 L)로 처리했다. 혼합물을 실온에서 40 분 동안 교반하고 여과했다. 백색 고형물을 물 및 헥산으로 세정하고, 공기 중에서 밤새 건조했다 (143 g). 이 물질을 60℃에서 4 시간 동안 고진공 (2 mm Hg) 하에서 회전식-증발기 상에서 건조하여 (R)-1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)에탄올의 백색 분말을 얻었다 (122 g, 73.7%). AD 칼럼상 키랄 HPLC (헥산 중 이소프로판올, 10%)는 ee >99%를 보여주었다. 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 226 (M + 1).
S)-2-(1-(2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00019
THF (70 mL) 중 (R)-1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에탄올 (3.03 g, 13.4 mmol), 프탈이마이드 (2.37 g, 1.20 당량) 및 PPh3 (4.23 g, 1.20 당량)의 혼합물에 DIAD (3.13 mL, 1.20 당량)을 0℃에서 적가했다. 그 다음 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후 EtOAc (200 mL) 및 물 (200 mL) 사이에서 분할했다. 유기 층을 분리하고, 물, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축했다. 잔여물을 실리카겔(DCM)상 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (S)-2-(1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (3.8 g, 80%)의 백색 거품을 얻었다. 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 355 (M + 1).
(S)-tert-부틸 (1-(2- 클로로 -7- 플루오로퀴놀린 -3-일)-에틸)- 카바메이트
Figure pct00020
EtOH (10 mL) 중 (S)-2-(1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (1.0g, 2.8 mmol)의 용액에 NH2NH2 (10 eq, 0.88 mL)을 실온에서 적가한 후 90℃까지 30 분 동안 따뜻하게 했다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 농축하고, EtOAc (20 mL) 및 물 (5 mL) 사이에서 분할했다. 유기 층을 분리하고, 물, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하여 무색 오일을 얻었고, 이것을 THF (10 mL)에서 용해시키고 BOC2O (1.1 eq, 0.68 g) 및 TEA (1.0 eq, 0.39 mL)로 환류에서 처리했다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 농축하고 실리카겔상 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산, 1/9)로 정제하여 백색 고형물 (S)-tert-부틸 (1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트 (0.70 g, 76%)를 얻었다. 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 325 (M + 1).
(S)-tert-부틸 (1-(7- 플루오로 -2-(2-( 메틸티오 )- 페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸)- 카바메이트
Figure pct00021
(S)-tert-부틸 (1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트 (382 mg, 1.2 mmol), 2-(메틸티오)-페닐보론산 (257 mg, 1.3 당량), Na2CO3 (623 mg, 5.0 당량), Pd(PPh3)4 (93 mg, 5%), MeCN (9 mL) 및 물 (3 mL)의 혼합물을 85℃로 N2 하에서 밤새 가열했다. 실온으로 냉각한 후, 반응을 EtOAc (10 mL) 및 물 (5 mL) 사이에서 분할했다. 유기 층을 분리하고, 세정하고, 건조시키고 농축했다. 잔여물을 실리카겔상 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물 (S)-tert-부틸 (1-(7-플루오로-2-(2-(메틸티오)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트를 얻었다 (460 mg, 94.8%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 413 (M + 1).
(S)-tert-부틸 (1-(7- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸)- 카바메이트
Figure pct00022
N2 대기 하에서, (S)-tert-부틸 (1-(7-플루오로-2-(2-(메틸티오)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트 (412 mg, 999 μmol)을 아세톤 (3.00 ml, 40.8 mmol) 및 물 (3 mL)에서 용해시키고, NMO (351 mg, 3.00 mmol), 그 다음 OsO4 (12.7 mg, 0.05 mmol)을 부가했다. 반응을 실온에서 밤새 교반되도록 했다. LC-MS는 반응이 완료되지 않았음을 보여주였다. 반응을 OsO4 (12.7 mg, 0.05 mmol)로 다시 처리하고 밤새 교반했다. LC-MS는 단지 약간의 개시 시약을 보여주었다. 반응을 5 mL의 포화된 나트륨 티오설페이트 용액의 부가로 켄칭했다. 반응을 EtOAc로 희석하고 5% Na2CO3로 세정했다. 그 다음 유기 층을 염수로 세정하고, (Na2SO4) 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축했다. 미정제의 잔여물을 헥산 중 30% 내지 60% EtOAc로 용출하여 정제하여 백색 고형물 (S)-tert-부틸 (1-(7-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트를 제공했다 (440 mg, 99%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 445 (M + 1).
(S)-4-아미노-6-((1-(7- 플루오로 -2-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴
Figure pct00023
(S)-tert-부틸 (1-(7-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바메이트 (440 mg, 1.0 mmol)에 HCl, 4M (1 mL)을 부가했다. 수득한 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반했다. 용매를 제거하고 미정제된 (S)-1-(7-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민을 추가 워크업 없이 사용했다. DMF (4 mL) 중 (1S)-1-(7-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민 (100 mg, 290 μmol), 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (45 mg, 290 μmol) 및 DIEA (101 μl, 581 μmol)의 용액을 100℃로 밤새 가열했다. 용매를 감압 하에서 제거하고 MeOH/DCM의 3%를 사용하는 예비 TLC를 통해 정제하여 (S)-4-아미노-6-((1-(7-플루오로-2-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5-카보니트릴의 백색 분말을 얻었다 (6.9 mg, 5.1%). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1.51 (d, J=7.09 Hz, 3 H) 3.17 (s, 3 H) 5.43 (d, J=6.85 Hz, 1 H) 7.48 (d, J=2.45 Hz, 1 H) 7.60 - 7.63 (m, 1 H) 7.66 - 7.69 (m, 2 H) 7.73 (d, J=1.47 Hz, 1 H) 7.81 (s, 1 H) 8.07 (dd, J=9.05, 6.11 Hz, 1 H) 8.13 - 8.17 (m, 1 H) 8.49 (s, 1 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 463 (M + 1).
실시예 3: 4-아미노-6-((S)-1-(7- 플루오로 -2-(3- 플루오로페닐 )-퀴놀린-3-일)- 에틸아미노 )-피리미딘-5- 카보니트릴의 제조.
2-((S)-1-(7- 플루오로 -2-(3- 플루오로페닐 )-퀴놀린-3-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00024
MeCN (8mL) 및 물 (2 mL) 중 (S)-2-(1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (150mg, 423 μmol), 3-플루오로페닐보론산 (65 mg, 465 μmol) 및 나트륨 카보네이트 (90 mg, 846 μmol)의 용액을 N2로 퍼지하고, 그 다음 Pd(PPh3)4 (24 mg, 21 μmol)을 부가하고, 수득한 혼합물을 90℃에서 밤새 교반했다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고 물, 염수로 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 100% EtOAc로 용출된 예비 TLC를 사용하는 정제로 2-(((S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바모일)-벤조산을 얻었다 (120 mg, 66%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 433 (M + 1). 2-(((S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)-카바모일)-벤조산을 EtOH (2 mL)에서 용해시키고 농축 HCl (0.1 mL)을 부가했다. 수득한 용액을 80℃로 4 시간 동안 가열했다. 용매를 제거하고 포화 NaHCO3을 반응 혼합물에 부가하고 EtOAc로 추출했다. 유기 층을 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하고 NH3 가스로 포화된 3% MeOH/DCM를 사용하는 예비 TLC를 통해 정제하여 2-((S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온의 백색 고형물을 얻었다 (85 mg, 49%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 415 (M + 1).
4-아미노-6-((S)-1-(7- 플루오로 -2-(3- 플루오로페닐 )-퀴놀린-3-일)- 에틸아미노 )-피리미딘-5- 카보니트릴
Figure pct00025
EtOH (2 mL) 중 2-((S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (60.0 mg, 145 μmol)의 용액에 NH2NH2 (1.0 mL, 1.45 mmol, 10 당량)을 부가하고 수득한 용액을 80℃로 2 시간 동안 가열했다. 침전물을 여과 제거하고 여과물을 감압 하에서 제거하여 (1S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민을 얻었다. DMF (2 mL) 중 (1S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에탄아민의 미가공 잔여물에 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (22 mg, 145 μmol) 및 DIEA (0.06 mL, 319 μmol)을 부가했다. 수득한 혼합물을 100℃로 밤새 가열했다. 용매를 감압 하에서 제거하고 15-60% MeCN/H2O w/ 0.01% TFA를 사용하는 분취 HPLC를 통해 정제하여 4-아미노-6-((S)-1-(7-플루오로-2-(3-플루오로페닐)-퀴놀린-3-일)-에틸아미노)-피리미딘-5-카보니트릴의 백색 고형물을 얻었다 (9.3 mg, 16%). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1.63 (d, J=6.85 Hz, 3 H) 5.70 (q, J=7.01 Hz, 1 H) 7.25 - 7.34 (m, 1 H) 7.44 - 7.54 (m, 2 H) 7.55 - 7.63 (m, 2 H) 7.74 (dd, J=9.78, 2.45 Hz, 1 H) 8.05 (s, 1 H) 8.18 (dd, J=9.05, 5.87 Hz, 1 H) 8.72 (s, 1 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 403 (M + 1).
실시예 4: (S)-4-아미노-6-((1-(7- 플루오로 -2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴의 제조
2-((S)-1-(7- 플루오로 -2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00026
디옥산 (3.0 L) 중 (S)-2-(1-(2-클로로-7-플루오로퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (85.6 g, 241 mmol), Pd(PPh3)4 (14 g, 12 mmol, 0.05eq) 및 2-(트리부틸스탄닐)-피리딘 (107 g, 289 mmol, 1.2 당량)의 혼합물을 N2 하에서 90℃로 가열했다. 밤새 교반 후, LC-MS는 30% 완료를 보여주었다. 반응 혼합물을 101℃로 추가 2 일 동안 가열했다. 그 다음 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 경사분리하고 잔여 200 mL 용액을 여과하여 Pd 잔여물을 제거했다. 배합된 용매를 300 mL로 농축하고 여과하여 황갈색 고형물을 얻었고, 이것을 EtOAc/헥산 (1/1)으로 세정하고 건조하여 (82.1 g)을 제공했다. 모액을 100 mL로 농축하고 EtOAc/헥산, 1/1 (200 mL)로 처리하여 생성물의 제 2 수확물 (2.2 g)을 얻었다. 2-((S)-1-(7-플루오로-2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온의 전체 황갈색 고형물을 수득했다 (84.3 g, 88%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 398 (M + 1).
(S)-1-(7- 플루오로 -2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)- 에탄아민
Figure pct00027
무수 에탄올 (15 mL) 중 2-((S)-1-(7-플루오로-2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (2.1 g, 5.3 mmol)에 NH2NH2 (0.85 g, 26 mmol)을 5 분에 걸쳐 적가했다. 반응 혼합물을 90℃로 30 분 동안 가열하고 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 EtOAc로 세정했다. 수득한 EtOAc 용액을 물, 염수로 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 제거로 (S)-1-(7-플루오로-2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에탄아민의 황갈색 오일을 얻었다 (1 g, 71%). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 468 (M + 1).
4-아미노-6-((S)-1-(7- 플루오로 -2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)- 에틸아미노 )-피리미딘-5- 카보니트릴
Figure pct00028
THF (3 mL) 중 (S)-1-(7-플루오로-2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에탄아민 (85 mg, 0.32 mmol), 4,6-디클로로-5-시아노피리미딘 (55 mg, 0.32 mmol, 1.0 당량) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (68 μl, 0.38 mmol, 1.2 당량)의 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한 후 50℃로 가열했다. 4 시간 후, 혼합물을 농축하고 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc/1/1)로 정제하여 백색 고형물을 얻었고, 이것을 밀봉된 튜브에서 110℃에서 밤새 디옥산 (3 mL) 중 포화된 NH3로 처리했다. 반응 혼합물을 농축하고 역상 HPLC (MeCN/H2O/0.1% TFA)로 정제하고 동결건조하여 백색 분말 4-아미노-6-((S)-1-(7-플루오로-2-(피리딘-2-일)-퀴놀린-3-일)-에틸아미노)-피리미딘-5-카보니트릴을 얻었다 (19 mg, 15%). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1.78 (d, J=6.85 Hz, 3 H) 5.82 (q, J=6.85 Hz, 1 H) 7.71 (td, J=8.80, 2.45 Hz, 1 H) 7.89 (dd, J=9.66, 2.32 Hz, 1 H) 8.10 (ddd, J=7.83, 5.62, 0.98 Hz, 1 H) 8.19 (s, 1 H) 8.27 (dd, J=9.05, 5.87 Hz, 1 H) 8.45 (d, J=7.83 Hz, 1 H) 8.63 (td, J=7.95, 1.47 Hz, 1 H) 8.94 (s, 1 H) 9.03 - 9.09 (m, 1 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 386 (M + 1).
실시예 5: (S)-4-아미노-6-((1-(5- 클로로 -3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -2-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴의 제조
2-((3- 클로로 -2- 니트로페닐 )-아미노)-부탄산
Figure pct00029
무수 DMSO (4.2 L) 중 1-클로로-3-플루오로-2-니트로벤젠 (2.00 Kg, 11.4 mol), 2-아미노부티르산 (1.22 kg, 11.8 mol) 및 K2CO3 (1.58 Kg, 11.4 mol)의 혼합물을 80℃에서 16 시간 동안 가열했다 (반응이 개시된 후, 내부 온도는 최대 110℃로 되었다). 이때 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을, 격렬한 교반과 함께 주의 깊게 물 (10 L)에 부었다. 수성 층을 메틸 tert-부틸 에테르 (2×5 L)로 세정하여 유기 불순물을 제거했다. 그 다음 수성 층을 농축 HCl로 pH ~1.5로 산성화하여 오렌지색 고형물을 얻었다. 오렌지색 고형물을 여과로 수집하고, 물 (2×4 L)로 세정하고 공기-건조하여 2-((3-클로로-2-니트로페닐)-아미노)-부탄산 (2.85 Kg)을 얻었고, 이것을 다음 단계에서 있는 그대로 사용했다. 1H NMR (DMSO - d 6) δ ppm 7.35 (t, J=8.3 Hz, 1 H), 6.82 - 6.91 (m, 2 H), 6.25 (d, J=7.6 Hz, 1 H), 4.14 (td, J=7.4, 5.4 Hz, 1 H), 3.4 (br. s., 1 H), 1.74 - 1.92 (m, 2 H), 0.88 (t, J=7.4 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 259.2 (M+1).
8- 클로로 -3-에틸-3,4- 디하이드로퀴녹살린 -2(1H)-온
Figure pct00030
2-((3-클로로-2-니트로페닐)-아미노)-부탄산 (1.5 Kg, 5.8 mol), 4 N 수성 HCl (4.35 L, 17.4 mol) 및 EtOH (5.3 L)의 용액에 SnCl2.2H2O (3.93 Kg, 17.4 mol)을 부가했다. 반응 혼합물을 5 시간 동안 가열 환류했다. 이때 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 실온으로 냉각한 후 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시켰다. 수득한 잔여물을 빙수욕을 사용하여 0℃로 냉각하고 10 N KOH (12 L, 180 mol)의 수용액을 격렬한 교반과 함께 주의 깊게 부가했다. 여과로 불용성 고형물을 제거한 후, 여과물을 DCM (2×10 L)로 추출하고 물, 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 증발하여 8-클로로-3-에틸-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-온 (1.1 Kg)을 황색 고형물로서 얻었고, 이것을 추가 정제없이 사용했다. 1H NMR (DMSO - d 6) δ ppm 9.70 (s, 1 H), 6.65 - 6.83 (m, 3 H), 6.31 - 6.44 (m, 1 H), 3.66 - 3.72 (m, 1 H), 1.53 - 1.71 (m, 2 H), 0.92 (t, J=7.4 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 211.2 (M+1).
8- 클로로 -3- 에틸퀴녹살린 -2(1H)-온
Figure pct00031
무수 1,4-디옥산 (15 L) 중 8-클로로-3-에틸-3, 4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-온 (1.30 Kg, 6.17 mol)의 용액에 DDQ (1.47 Kg, 6.48 mol)을 부가했다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반했다 (내부 온도는 DDQ 부가 후 최대 45℃로 되었다). 이 시간 후 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 혼합물을 감압 하에서 증발하여 갈색 잔여물을 얻었다. 이 잔여물에 2M 수성 NaOH을 부가하여 pH를 7 - 8로 조정했다. 수득한 황색 고형물을 여과로 수집하고, 포화된 수성 NaHCO3에서 현탁시키고, 1 시간 동안 교반하고, 여과하여 밝은 녹색 고형물을 얻었다. 밝은 녹색 고형물을 포화된 수성 NaHCO3에서 현탁시키고, 교반하고, 여과하고 포화된 수성 NaHCO3 및 물로 세정하여 황백색 고형물을 얻었다. 황백색 고형물을 물에서 현탁시키고, 잘 혼합하고, 여과하고, 물로 세정하고 공기-상에서 밤새 건조시키고, 고진공 하에서 50℃에서 건조시켜 8-클로로-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (1 Kg)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6) δ ppm 7.69 - 7.75 (m, 1 H), 7.59 - 7.65 (m, 1 H), 7.29 (t, J=8.0 Hz, 1 H), 2.84 (q, J=7.4 Hz, 2 H), 1.23 (t, J=7.4 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 209.1 (M+1).
3,5- 디클로로 -2- 에틸퀴녹살린
Figure pct00032
POCl3 (2.68 L, 28.8 mol) 중 8-클로로-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (1.00 Kg, 4.79 mol)의 증점된 슬러리를 100℃에서 2 시간 동안 교반했다. 이때 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 대부분의 POCl3를 감압 하에서 제거한 후, 잔여물을 빙수에 주의 깊게 붓고 2M 수성 NaOH 및 포화된 수성 NaHCO3의 배합으로 중화했다. 수득한 서스펜션을 DCM (3×4 L)로 추출했다. 유기 상을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 미정제의 물질을 헥산/EtOAc (30/1)로 용출하는 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3,5-디클로로-2-에틸퀴녹살린 (840 g)을 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO - d 6) δ ppm 8.01-8.08 (m, 2 H), 7.84 (t, J=8.0 Hz, 1 H), 3.10 - 3.17 (d, J=7.3 Hz, 2 H), 1.36 (t, J=7.3 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 227.1 (M+1).
2-(1- 브로모에틸)-3,5-디클로로퀴녹살린
Figure pct00033
3,5-디클로로-2-에틸퀴녹살린 (1.10 Kg, 4.84 mol)을 CCl4 (4.4 L)에서 실온에서 용해시켰다. 그 다음 1,3-디브로모-5, 5-디메틸히단토인 (762 g, 2.66 mol) 및 벤조일 퍼옥사이드 (116 g, 0.48 mol)을 부가했다. 수득한 서스펜션을 환류에서 2 시간 동안 가열했다. 이때 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 실온으로 냉각한 후 백색 결정이 반응 용기에서 형성되었다. 백색 결정을 여과로 수집하고, 포화된 수성 NaHCO3 (3×5 L)로 세정하고, 고진공 하에서 건조하여 2-(1-브로모에틸)-3,5-디클로로퀴녹살린을 백색 고형물로서 얻었다 (1.05 Kg). 1H NMR (DMSO - d 6) δ ppm 8.04 - 8.12 (m, 2 H), 7.78 - 7.90 (m, 1 H), 5.76 - 5.84 (m, 1 H), 2.09 (d, J=6.7 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 304.8 [(M+1) (79Br)], 306.9 [(M+1) (81Br)]
2-(1-(3,5- 디클로로퀴녹살린 -2-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00034
DMF (8.2 L) 중 2-(1-브로모에틸)-3,5-디클로로퀴녹살린 (1.00 Kg, 3.27 mol)의 용액에 칼륨 프탈이마이드 (1.21 Kg, 6.54 mol)를 부가했다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반했다. 이때 LC-MS 분석은 반응의 완료를 보여주었다. 혼합물을 50 L 분별 깔때기로 이동시키고 물 (12 L) 및 EtOAc (6 L)을 교반하면서 그것에 부가했다. 다량의 백색 고형물을 붕괴시키고 여과로 수집했다. 수성 상을 분리하고 EtOAc (2×4 L)로 다시 추출했다. 배합된 유기 층들을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용적은 감압 하에서 5 L로 감소되었다. 실온으로 냉각한 후, 생성물을 백색 고형물로서 수득했다. 백색 고형물을 여과하고, 헥산으로 분쇄하고 진공하에서 건조하여 2-(1-(3,5-디클로로퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (1.24 Kg)을 얻었다. 1H NMR (DMSO - d 6) δ ppm 8.02 - 8.21 (2 H, m), 7.83 - 8.02 (m, 5 H), 5.89 (q, J=6.8 Hz, 1 H), 1.87 (d, J=6.8 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 372.0 (M+1).
(S)-2-(1-(3,5- 디클로로퀴녹살린 -2-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00035
라세미 2-(1-(3,5-디클로로퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (1 Kg)을 Novasep HPLC 유닛 상에서 정제했다. 분리 과정에 사용된 조작 조건은 다음과 같았다:
칼럼: Chiralpak®AS 20μM, 11 cm id×25 cm L
이동상: 헥산-IPA 70-30
유속: 400 mL/분
온도: 25℃
UV 검출: 340 nm
용해도는 이동상에서 1g/L였다. 교반 및 가열은 샘플을 용액 내에서 유지하기 위해 필요했다. 용액을 여과한 후 사용했다. 주사 용적은 8.0 분 마다 510 mL였다. 크로마토그래피 과정으로부터 수집된 분획은 45℃에서 Artisan 박막 증발기 및 회전식 증발기룰 사용하여 증발되었다. 용매 제거 후, 생성물은 일정한 중량으로 진공 오븐에서 40℃에서 건조되어 하기를 얻었다: (S)-2-(1-(3,5-디클로로-퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온, 제 1 거울상이성질체 (425.7 g, 85.1% 수율, 98.7% e.e.) 및 (R)-2-(1-(3,5-디클로로퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온, 제 2 거울상이성질체 (432.5 g, 86.2% 수율, 97.7% e.e.).
2-((1S)-1-(5- 클로로 -3-(2-( 메틸티오 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -2-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3-디온
Figure pct00036
기계적 교반기, 콘덴서, 질소 가스 주입구 및 온도 프로브가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 DMF (2.16 L), (S)-2-(1-(3,5-디클로로퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (273 g, 733 mmol) 및 2-(메틸티오)-페닐보론산 (136 g, 807 mmol)를 충전했다. 혼합물에, 칼륨 카보네이트 (203 g, 147 mmol) 및 DCM (29.9 g, 36.7 mmol)의 착화물, [1,1-비스(디페닐-포스피노)-페로센]팔라듐(ii) 클로라이드를 부가했다. 혼합물을 N2 (2x)로 진공 퍼지하고, 100℃로 가열했다. 반응을 LC-MS로 모니터링하고, 4 시간 후 완료된 것으로 간주했다. 반응을 실온 (21℃)으로 냉각시키고, 그 다음 2 개의 배치로 분할했다. 각 배치를 4 L 분별 깔때기에서 EtOAc (1.08 L) 및 물 (1.35 L) 사이에서 분할했다. 상 분리 후, 유기 층을 염수 (2×500 mL)로 세정하고 농축하여 미정제의 생성물을 얻었다. 미정제의 물질의 배합된 배치를 실리카겔 상에 로딩하고 플래시 크로마토그래피 (ISCO/RediSepTM) (헥산:EtOAc = 10:0 내지 6:4)로 정제하여 생성물을 밝은 갈색 고형물 320g로서 98% LC 순도 및 95% 수율로 제공했다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.15 - 8.31 (m, 1 H), 8.07 (m, 1H), 7.93 (m, 1 H), 7.77 (m, 2 H), 7.64 (br.s., 2 H), 7.16 - 7.55 (m, 3 H), 6.58 - 7.02 (m, 1 H), 5.72 - 5.98 (m, 1H), 3.29 (s, 3 H), 1.79 (d, J=6.9 Hz, 3 H) 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 460.0 (M+1).
2-((1S)-1-(5- 클로로 -3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -2-일)-에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00037
부가 깔때기, 질소 유입구, 오버헤드 교반기 및 열전대가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 몬모릴로나이트 K10 (274 g, 274 mmol) 및 물 (54.2 mL)를 충전했다. 혼합물을 ~10 분 동안 격렬하게 교반했고, 이때 유리 유동 분말을 수득했다. 이때 DCM (1.26 mL), 그 다음 옥손 (421 g, 685 mmol)을 부가했다. 반응 온도는 15℃로 떨어졌다. DCM (630 mL) 중 2-((1S)-1-(5-클로로-3-(2-(메틸티오)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (126 g, 274 mmol)의 용액을 부가 깔때기를 통해 실온 (18-20℃)에서 몬모릴로나이트/옥손 서스펜션에 부가하고 내부 온도는 물/빙욕으로 21℃ 미만으로 조절되었다. 반응을 실온 (19-21℃)에서 교반하고 LC로 모니터링했다. 그것은 96 시간 후에 완료된 것으로 간주되었다. 반응 혼합물을 여과하고 고형물을 DCM (2×250 mL)으로 세정했다. 배합된 유기 용액을 Na2SO3 (2×250 mL)의 10wt% 수용액으로 세정하고, 농축하고 건조하여 생성물을 밝은 황색 고형물 110g로서 97.6% LC 순도 및 82% 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.14 - 8.29 (m, 1 H), 7.64 - 8.14 (m, 8 H), 7.52 (dd, J=5.5, 3.0 Hz, 1 H), 7.21 - 7.38 (m, 1 H), 5.59 - 5.94 (m, 1 H), 3.10 - 3.27 (m, 3 H), 1.66 - 1.91 (m, 3 H)
질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 492.0 (M+1).
(S)-1-(5- 클로로 -3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -2-일)- 에탄아민
Figure pct00038
질소 유입구와 함께 오버헤드 교반기, 열전대 및 환류 콘덴서가 구비된 5 L 3-목 동근바닥 플라스크에 (S)-2-(1-(5-클로로-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (193 g, 392 mmol), 물 (1351 mL) 및 하이드라진, 물 (711 mL, 785 mmol) 중 35 wt.% 용액을 충전했다. 수득한 백색 슬러리를 격렬하게 65℃에서 질소 하에서 6 시간 동안 교반하고 그 다음 실온으로 밤새 냉각되도록 했다. 이 시간 후 LC-MS 분석은 원하는 생성물로의 완전한 전환을 보여주었다. 백색 고형물을 여과로 단리하고, 물로 세정하고 유리 필터 상에서 질소의 스트림 하에서 4 시간 동안 건조하여 (S)-1-(5-클로로-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에탄아민 (129.7g)을 얻었다. 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 362.0 (M+1).
(S)-4-아미노-6-((1-(5- 클로로 -3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -2-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴
오버헤드 교반기, 질소 유입구 및 열전대가 구비된 3 L 3-목 동근바닥 플라스크에 (1S)-1-(5-클로로-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에탄아민 (130 g, 358 mmol), 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (55.4 g, 358 mmol), 부탄-1-올 (920 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (187 mL, 1.08 mol)을 충전했다. 반응 혼합물을 95-100℃의 내부 온도로 6 시간 동안 가열하고 그 다음 실온으로 밤새 냉각되도록 했다. 이 시간 후 반응을 100℃의 내부 온도로 가열하고 그 다음 50℃의 내부 온도로 냉각했다. 에틸 아세테이트 (~1.5 L)을 50℃에서 부가하고 반응을 실온으로 냉각되도록 했다. 수득한 용액을 물 (3×1 L), 10 wt% 수성 NaHSO4 (4×1 L) 및 염수 (1×500 mL)로 세정했다. 분리된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축했다. 수득한 잔여물을 톨루엔 (1 L)에서 현탁시키고, 진공에서 증발시키고 고진공 하에서 36 시간 동안 건조했다 (247g의 미정제의 물질이 수득됨). 미정제의 물질을 EtOAc (2 L)에서 현탁시키고, 여과하고 10 wt% 수성 NaHSO4 용액 (4×1 L)로 세정했다. 백색 고형물은 EtOAc 층을 형성하기 시작했다. 자석 교반 막대를 부가하고 서스펜션을 실온에서 밤새 그리고 0℃ 2 시간 동안 교반했다. 백색 고형물을 EtOAc의 여과로 단리하고 유리 필터 상에서 질소의 스트림 하에서 2일 동안 건조하고, EtOAc 여과물 (여과물 A)을 확보했다. 그 다음 백색 고형물 (51 g)을 EtOAc (2 L)에서 현탁시키고 포화된 수성 NaHCO3를 부가했다 (1 L). 수득한 서스펜션을 15 분 동안 교반하고 그 결과 2개의 층 혼합물이 생겼다. 유기 층을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축하여 원하는 생성물을 얻었다. 그 다음 여과물 A를 진공에서 농축하고, 실리카 상에서 흡착하고 MPLC (DCM/MeOH + 10% NH4OH: 100/0 내지 90/10)로 정제하여 92 g의 원하는 생성물을 얻었다. 2 개의 단리된 생성물을 배합하고, EtOH (500 mL)에서 용해시켰다. 수득한 용액을 진공에서 농축했다. EtOH 중 용해 및 농축의 이러한 과정을 3 회 반복했다 (3×500 mL). 수득한 고형물을 분말로 분쇄(모르타르 및 막자)하고 84 시간 동안 P2O5 상에서 진공 오븐 (온도: 90-100℃)에서 건조했다. 이 시간 후 물질을 다시 분쇄하고, 과대크기의 팬으로 이동시키고 고진공 하에서 100-110℃에서 24 시간 동안 건조하여 (S)-4-아미노-6-((1-(5-클로로-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에틸)-아미노)-피리미딘-5-카보니트릴 (127.9 g)을 얻었다. 1H NMR (DMSO -d 6) δ ppm 8.06 - 8.20 (m, 3 H), 7.96-7.77 (m, 5 H), 7.64-7.65 및 6.79-6.80 (m, 1 H), 7.28 (br.s., 2H), 5.42-5.45 (m, 1 H), 3.32 및 3.22 (s, 3 H), 1.51 및 1.40 (d, J=6.6 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 480.0 (M+1). 분석 샘플의 Karl Fisher 및 GC 분석은, 물질이 0.45wt%의 물 및 0.55wt%의 EtOH를 함유했다는 것을 보여주었다.
실시예 6: 2-((S)-1-(6-아미노-5- 시아노피리미딘 -4- 일아미노 )-에틸)-3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -5- 카보니트릴의 제조
2-((S)-1-(1,3- 디옥소이소인돌린 -2-일)-에틸)-3-(2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )-퀴녹살린-5- 카보니트릴
Figure pct00040
콘덴서, 질소 유입구, 오버헤드 교반기 및 열전대가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 2-((1S)-1-(5-클로로-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-2-일)-에틸)이소인돌린-1,3-디온 (400 g, 813 mmol), 디시아노아연 (143 g, 1.22 mol) 및 1,4-디옥산 (4.0 L)을 충전했다. 용액을 격렬하게 교반하고 Ar으로 1 시간 동안 탈가스했다. 그 다음 이 용액에 XPhos 전촉매 (66.1 g, 89 mmol)를 부가했다. 그 다음 혼합물을 Ar으로 1 시간 동안 탈가스하고 90℃로 가열했다. 반응을 LC로 모니터링하고, 8 시간 후 완료된 것으로 간주했다. 반응을 실온 (20-21℃)으로 냉각시키고 2 개의 배치로 분할했다. 각 배치에 대해, EtOAc (2.0 L), NaHCO3 (400 mL) 및 물 (400 mL)을 부가했다. 혼합물을 10 분 동안 교반하고 침전물이 형성되었다. 침전물을 여과하여 순수한 생성물을 백색 고형물 201.5g로서 얻었다. 모액을 염수 (800mL)로 세정하고 유기 층을 농축하여 미정제의 생성물 ~400g을 얻었다. 그 다음 미정제의 물질을 EtOAc (1.2 L)에서 30 분 동안 실온에서 슬러리화했다. 고형물을 여과하고, EtOAc (2×400mL)로 세정하고 건조하여 생성물을 황갈색 고형물 220g로서 얻었다. 모든 고형물을 배합하고, 유리 프릿 상에서 가변운 진공 및 N2의 스트림 하에서 2 일 동안 건조하여 생성물을 백색 고형물 378g로서 99.6% LC 순도 및 96 % 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.47 - 8.68 (m, 2 H), 7.66 - 8.19 (m, 7 H), 7.52 (dd, J=5.5, 3.0 Hz, 1 H), 7.22 - 7.40 (m, 1 H), 5.61 - 5.95 (m, 1H), 3.11 - 3.27 (m, 3 H), 1.68 - 1.93 (m, 3H) 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 483.0 (M+1).
2-((S)-1- 아미노에틸)-3- (2-( 메틸설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -5- 카보니트릴
Figure pct00041
질소 유입구, 오버헤드 교반기 및 열전대가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 하이드라진 수화물 (381 mL, 783 mmol) 및 EtOH (3.0 L)을 충전했다. 그 다음 이 용액에 2-((S)-1-(1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-에틸)-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-5-카보니트릴 (378 g, 783 mmol)을 한번에 부가하고 80℃로 가열했다. 반응을 LC로 모니터링하고, 반응이 80℃에 일단 도달하면 완료된 것으로 간주했다. 반응을 실온 (20-21℃)로 냉각하고, 이때 DCM (3.0 L) 및 포화 NaHCO3 용액 (600 mL)을 부가했다. 상 분리 후, 유기 층을 염수 (2×600 mL)로 세정하고, 농축하고 진공 및 N2 흐름 하에서 24 시간 동안 건조하여 생성물을 밝은 황색 고형물 257.7g로서 94.4% LC 순도, (R 거울상이성질체 검출되지 않음) 및 93% 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.45 - 8.54 (m, 2 H), 8.18 (dt, J=7.7, 1.5 Hz, 1 H), 8.05 (dd, J=8.5, 7.4 Hz, 1 H), 7.76 - 8.00 (m, 3 H), 3.83 - 4.03 (m, 1 H), 3.25 - 3.32 (m, 3 H), 1.19 - 1.39 (m, 3 H) 질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 353.0 (M+1).
2-((S)-1-(6-아미노-5- 시아노피리미딘 -4- 일아미노 )-에틸)-3-(2-( 메틸 - 설포닐 )- 페닐 )- 퀴녹살린 -5- 카보니트릴
Figure pct00042
기계적 교반기, 콘덴서, 질소 가스 주입구 및 온도 프로브가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 2-((S)-1-아미노에틸)-3-(2-(메틸설포닐)-페닐)-퀴녹살린-5-카보니트릴 (257.7 g, 731 mmol), 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (120 g, 775 mmol), 및 부탄-1-올 (2.5 L)을 충전했다. 용액을 실온 (19-22℃)에서 5 분 동안 교반하고 N,N-디이소프로필에틸아민 (363 mL, 219 mmol)을 한번에 부가했다. 용액을 95℃로 가열하고, LC로 모니터링하고, 4 시간 후 완료된 것으로 간주했다. 반응을 실온으로 냉각시키고 이때 EtOAc (2.0 L) 및 물 (500 mL)을 부가했다. 2 개의 층들을 분리하고 유기 층을 염수 (500 mL)로 세정하고, 대부분의 EtOAc가 제거될 때가지 농축하고, 침전물이 형성되었다. 침전물을 여과하고 최소량의 MeOH로 세정했다. 고형물을 진공하에서 18 시간 동안 건조하여 밝은 황색 고형물, 305g을 얻었다. 모액을, 더 많은 생성물이 침전될 때까지 농축했다. 고형물을 여과하고, MeOH (2×200mL)로 세정하고, 진공하에서 24 시간 동안 건조하여 생성물을 고형물 (45g)로서 얻었다. 기계적 교반기, 질소 가스 주입구 및 온도 프로브가 구비된 5 L 3-목 둥근바닥 플라스크에 배합된 350g 미정제의 생성물 및 MeOH (3.5 L)을 충전했다. 혼합물을 실온 (19-22℃)에서 2 일 동안 교반했다. 고형물을 여과하고, MeOH (2x 350mL)로 세정하고, 진공 및 N2 흐름 하에서 24 시간 동안 건조하여 크림색 고형물 (276.2g)을 99.4% HPLC 순도, (R-거울상이성질체는 검출되지 않음) 및 80% 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.43 - 8.59 (m, 2 H), 8.01 - 8.23 (m, 2 H), 7.71- 7.99 (m, 4 H), 7.61 (d, J=7.0 Hz, 1 H), 7.24 (br. s., 2 H), 5.33 - 5.68 (m, 1 H), 3.19 - 3.33 (m, 3 H), 1.34 - 1.55 (m, 3 H)
질량 스펙트럼 (ESI) m/z = 471.1 (M+1).
실시예 7: (S)-4-아미노-6-((1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일)- 퀴녹살린 -2-일)에틸)아미노)피리미딘-5- 카보니트릴의 제조
2-((4- 플루오로 -2- 니트로페닐 )아미노)부탄산
Figure pct00043
디메틸 설폭사이드 (410 ml, 1.10 mol) 중 2,5-디플루오로니트로벤젠 (119 ml, 1.10 mol), 2-아미노부탄산 (114 g, 1.10mol), 및 칼륨 카보네이트 (152.2 g, 1.10 mol)의 혼합물을 80℃에서 23 시간 동안 교반했다. ([각주 1]: 혼합물은 진한 오렌지 적색 색상을 가졌다. 혼합물의 내부 온도는 1 시간 동안 ~110℃까지 상승되었고 그 다음 80℃로 내려갔다). 23 시간 후, 반응을 실온으로 냉각시키고 주의 깊게 물에 부었다 (2 L + 1 L). 수성 혼합물을 디에틸 에테르 (1 L×2)로 세정하여 유기 불순물을 제거했다. 그 다음 수성 층을 농축된 HCl (300 mL)로 ~ pH 1.5로 산성화하여 황색 고형물을 산출했다. 황색 고형물을 여과로 수집하고, 물 (3 L)로 세정하고, 공기-건조하여 원하는 생성물, 습윤성 오렌지색 고형물을 얻었다. 습윤성 오렌지색 고형물을 3 L 톨루엔으로부터 재결정화하고 실온에서 밤새 정치하여 원하는 생성물을 오렌지색 결정성 고형물로서 얻었다. 오렌지색 결정성 고형물을 여과하고, 톨루엔 (2 L)으로 세정하고, 고진공 하에서 80℃에서 4 시간 동안 그 다음 동결건조기 상에서 밤새 건조하여 2-(4-플루오로-2-니트로페닐아미노)-부탄산 (203.6 g, 76.4% 수율)을 오렌지색 결정성 고형물로서 얻었다. 오렌지색 결정성 고형물을 추가 정제없이 다음 단계로 옮겼다.
1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 13.30 (br. s. 1 H), 8.28 (d, J=7.4 Hz, 1 H), 7.90 (dd, J=9.4, 2.9 Hz, 1 H), 7.49 - 7.60 (m, 1 H), 7.09 (dd, J=9.6, 4.7 Hz, 1 H), 4.49 (dt, J=7.2, 5.5 Hz, 1 H), 1.79 - 2.00 (m, 2 H), 0.85 - 0.93 (m, 3 H), 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 243.1 (M + 1).
3-에틸-7- 플루오로 -3,4- 디하이드로퀴녹살린 -2(1H)-온
Figure pct00044
5-L 3목 동근바닥 플라스크 중 2-(4-플루오로-2-니트로페닐아미노)부탄산 (181.7 g, 750.0 mmol), 3 N 수성 HCl (750.0 ml, 2250 mmol), 및 에탄올 (1923 ml, 750.0 mmol)의 비균일한 혼합물에 염화 주석(II) 이수화물 (507.7 g, 2250 mmol)을 부가하고 오렌지색 혼합물을, 오버헤드 교반기를 4 시간 동안 사용하여 78℃에서 교반하면서 가열했다 ([각주 1]: 오렌지색 비균일한 혼합물은 오렌지색 균일 혼합물이 되었고 오렌지색 색상은 ~ 2 시간에 걸쳐 적색으로 변했다). 4 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압 하에서 농축하여 에탄올을 제거하고, 실온에서 48 시간 동안 정치했다. 수득한 황색 침전물을 여과로 수집하고 물 (500 mL)로 세정했다. 황색 고형물을 빙수 (1 L)에서 현탁시키고 혼합물을 KOH (~250 g)로 ~ pH 13로 조정했다. 비균일한 혼합물을 DCM (1 L×3)로 추출했다. 배합된 유기 층들을 물 (1 L×1) 및 염수 (1 L×1)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 3-에틸-7-플루오로-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-온 (60.92 g, 41.8% 수율)을을 밝은 황색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 10.26 (s, 1 H), 6.68 (dd, J=8.6, 5.5 Hz, 1 H), 6.47 - 6.61 (m, 2 H), 5.95 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 3.62 (ddd, J=6.7, 5.0, 2.0 Hz, 1 H), 1.50 - 1.72 (m, 2 H), 0.92 (t, J=7.4 Hz, 3 H), 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 195.1 (M + 1).
3-에틸-7- 플루오로퀴녹살린 -2(1H)-온
Figure pct00045
3-에틸-7-플루오로-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-온 (60.61 g, 312.1 mmol) 및 1,4-디옥산 (1350 ml)의 균일 용액에 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (75.91 g, 327.7 mmol)을 부가하고, 혼합물을, 오버헤드 교반기를 실온에서 2.5 시간 동안 사용하여 교반했다. 이때, 혼합물을 감압 하에서 농축하여 갈색 잔여물을 얻었다. 갈색 잔여물을 포화된 수성 NaHCO3 (2 L)에서 현탁시키고, 30 분 동안 교반하고, 여과하고, 포화된 수성 NaHCO3 (1 L)로 세정하여 밝은 녹색 고형물을 얻었다. 밝은 녹색 고형물을 포화된 수성 NaHCO3 (500 mL)에서 재현탁시키고, 잘 혼합하고, 여과하고, 포화된 수성 NaHCO3 (500 mL)로 세정하고 황백색 고형물을 얻었다. 황백색 고형물을 물 (500 mL)에서 현탁시키고, 잘 혼합하고, 여과하고, 물 (1 L)로 세정하고, 공기-상에서 밤새 건조시키고, 고진공 하에서 22℃에서 2 시간 동안 건조하여 3-에틸-7-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (56.87 g, 94.8% 수율)을 황백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 12.36 (br. S, 1 H.), 7.76 (dd, J=9.0, 5.9 Hz, 1 H), 7.11 (td, J=8.8, 2.7 Hz, 1 H), 7.00 (dd, J=9.6, 2.7 Hz, 1 H), 2.78 (q, J=7.4 Hz, 2 H), 1.20 (t, J=7.4 Hz, 3 H) 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 193.0 (M + 1).
3-(1- 브로모에틸 )-7- 플루오로퀴녹살린 -2(1H)-온
Figure pct00046
3-에틸-7-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (20.61 g, 107.2 mmol) 및 1,3-디브로모-5,5-디메틸히단토인 (18.77 g, 64.34 mmol)을 사염화탄소 (1072 ml, 107.2 mmol)에서 현탁시켰다. 이러한 비균일한 혼합물에 벤조일 퍼옥사이드 (3.463 g, 10.72 mmol)을 부가하고, 혼합물을 교반 (오일 배쓰 온도: 80℃)하면서 20 시간 동안 환류에서 가열했다. 20 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 냉각 후, 혼합물을, 교반하면서 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 (1 L)에 부었다. 침전물을 여과로 수집하고 물 (1 L)로 세정하여 3-(1-브로모에틸)-7-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (23.19 g, 79.8% 수율)을 황갈색 고형물로서 얻었다:
1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 12.68 (br. S, 1 H.), 7.85 (dd, J=9.0, 5.9 Hz, 1 H), 7.19 (td, J=8.8, 2.7 Hz, 1 H), 7.05 (dd, J=9.8, 2.7 Hz, 1 H), 5.62 (q, J=6.7 Hz, 1 H), 1.99 (d, J=6.7 Hz, 3 H), ~90% 순수한
질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 271.0 [M+H(79Br)]+ 및 273.0 [M+H (81Br)]+
2-(1- 브로모에틸 )-3- 클로로 -6- 플루오로퀴녹살린
3- 클로로 -2-(1- 클로로에틸 )-6- 플루오로퀴녹살린
Figure pct00047
1 L 동근바닥 플라스크 중 3-(1-브로모에틸)-7-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (58.86 g, 217.1 mmol) 및 옥시 염화인 (198.8 ml, 2171 mmol)의 비균일한 혼합물을 100℃에서 2 시간 동안 교반했다. 혼합물은 반응의 개시에서 비균일적이었고 그 다음 1 시간에 걸쳐 균일한 흑색 용액이었다. 2 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압 하에서 농축했다. 이러한 흑색 잔여물에 얼음 (~ 400 ml)을 나누어서 그리고 그 다음 물 (200 ml)을 교반하면서 주의 깊게 부가했다. 혼합물을 NH4OH (200 ml) 및 얼음 (~ 200 ml)으로 교반하면서 중화했다. 수득한 침전물을 여과로 수집하고, 물 (1 L)로 헹구고, 고진공 하에서 밤새 건조하여 3-클로로-2-(1-클로로에틸)-6-플루오로퀴녹살린을 포함하는 2-(1-브로모에틸)-3-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (58.31 g, 92.8% 수율)을 갈색 고형물로서 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6 ), 브로모에틸 유사체 및 클로로에틸 유사체의 비 = 2.5:1 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 288.9 [M+H(79Br)]+ 및 291.0 [M+H (81Br)]+
2-(1-(3- 클로로 -6- 플루오로퀴녹살린 -2-일)에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00048
N,N-디메틸포름아미드 (700.0 ml, 197.5 mmol) 중 3-클로로-2-(1-클로로에틸)-6-플루오로퀴녹살린 (48.39 g, 197.5 mmol)를 함유하는 2-(1-브로모에틸)-3-클로로-6-플루오로퀴녹살린 (57.17 g, 197.5 mmol)의 혼합물에 칼륨 프탈이마이드 (91.43 g, 493.6 mmol)을 실온에서 부가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반했다. 1 시간 후, 혼합물에 물 (2 L)을 부가했다. 혼합물을 DCM (500 mL×3)로 추출했다. 배합된 유기 층들을 염수 (1 L×1)로 세정하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 적색 액체를 얻었다. 적색 액체를 실리카의 플러그 (5.5 인치 직경×5 인치 높이)를 통해 여과하고, 헥산 중 EtOAc의 20%, 그 다음 헥산 중 EtOAc의 30%, 및 그 다음 EtOAc의 100%을 용출물로서 사용하여 2 개의 분획을 얻었다. 제 2 분획, 원하는 생성물 2-(1-(3-클로로-6-플루오로퀴녹살린-2-일)에틸)이소인돌린-1,3-디온 (53.367 g, 75.97% 수율)을 분홍색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.25 (dd, J=9.4, 5.9 Hz, 1 H), 7.81 - 7.95 (m, 6 H), 5.86 (q, J=6.8 Hz, 1 H), 1.86 (d, J=7.0 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 356.0 (M + 1).
2-(1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일) 퀴녹살린 -2-일)에틸) 이소인돌린 -1,3- 디온
Figure pct00049
1,4-디옥산 (1175 ml, 140.9 mmol) 중 2-(1-(3-클로로-6-플루오로퀴녹살린-2-일)에틸)이소인돌린-1,3-디온 (50.14 g, 140.9 mmol), 2-트리-n-부틸스탄닐피리딘 (80% 순수) (76.95 ml, 211.4 mmol), 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (16.29 g, 14.09 mmol)의 용액을 110℃에서 29 시간 동안 교반했다. 29 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압 하에서 농축하여 녹색 시럽성 고형물을 얻었다. 이 잔여물에 DCM (200 mL)을 부가했다. 혼합물을 환류 하에서 20 분 동안 가열하고, 그 다음 교반하면서 0℃로 냉각했다. 고형물을 여과로 수집하고 EtOAc-헥산 (1:5, 500 mL)로 세정하여 원하는 생성물 (52.82 g, 94.07% 수율)을 얻었다. 암갈색 고형물을 CH2Cl2:MeOH (9:1, 400 mL, 따뜻함)에서 용해시키고, 실리카겔의 플러그 (150 g, 8.5cm 직경×5.5cm 높이)를 통해 여과하여 잔여 팔라듐을 제거하고 CH2Cl2:MeOH (9:1, 600 mL)로 세정했다. 여과물을 감압 하에서 농축하여 갈색 고형물 (49.94 g, 88.9% 수율)을 얻었다. 갈색 고형물을 EtOAc-헥산 (1:9, 400 mL)에서 현탁시키고, 혼합물을 환류 하에서 40 분 동안 가열했다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, EtOAc-헥산 (1:9, 600 mL)로 세정하고, 건조하여 원하는 생성물 2-(1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에틸)이소인돌린-1,3-디온 (47.76 g, 85.06% 수율)을 황갈색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.47 - 8.53 (m, 1 H), 8.20 (dd, J=9.4, 5.9 Hz, 1 H), 7.94 (dd, J=9.4, 2.7 Hz, 1 H), 7.85 (td, J=8.9, 2.9 Hz, 1 H), 7.64 - 7.80 (m, 6 H), 7.30 - 7.37 (m, 1 H), 6.42 (q, J=6.9 Hz, 1 H), 1.76 (d, J=7.0 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 399.1 (M + 1).
1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일) 퀴녹살린 -2-일) 에탄아민
Figure pct00050
에탄올 (768.3 ml, 118.6 mmol) 중 2-(1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에틸)이소인돌린-1,3-디온 (47.26 g, 118.6 mmol)의 비균일한 혼합물에 하이드라진, 일수화물 (28.77 ml, 593.1 mmol)을 부가하고 혼합물을 95℃에서 1 시간 동안 교반했다. 비균일한 반응 혼합물은 15 분 후에 용액으로 되었지만, 아주 큰 백색 ppt가 뒤따랐다. 1 시간 후 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 침전물을 스팻툴라로 분쇄하고, 여과하고 EtOAc (3×250 mL 부분씩)로 세정했다. 여과물을 감압 하에서 농축했다. 잔여물을 EtOAc (600 mL) 및 물 (300 mL)에서 재용해시켰다. 유기 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc (100 mL×3)로 추출했다. 배합된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에탄아민 (30.95 g, 97.25% 수율)을 갈색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.75 (dq, J=4.7, 0.9 Hz, 1 H), 8.20 (dd, J=9.0, 5.9 Hz, 1 H), 7.98 - 8.11 (m, 2 H), 7.91 (dd, J=9.4, 2.7 Hz, 1 H), 7.78 - 7.86 (m, 1 H), 7.56 - 7.61 (m, 1 H), 4.66 (q, J=6.7 Hz, 1 H), 2.08 (br. S, 2 H), 1.35 (d, J=6.7 Hz, 3 H). 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 269.0 (M + 1). [키랄 HPLC] 헥산 중 이소프로판올의 10% 등용매를 용출물로서 사용하는(Chiralpak AD-H 칼럼, 0.46×250mm, 5 um): 254 nm에서 9.350 분 및 10.678 분에서 2 개의 피크, 헥산 중 이소프로판올의 10% 등용매를 용출물로서 사용하는 (Chiralpak OD-H 칼럼, 0.46×250mm, 5 um): 254 nm에서 9.69 분 및 11.22 분에서 2 개의 피크.
(S)-1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일) 퀴녹살린 -2-일) 에탄아민
(R)-1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일) 퀴녹살린 -2-일) 에탄아민
Figure pct00051
키랄 분리: 라세미 혼합물 (30.95 g)을, SFC를 사용하는 키랄 분리에 제공했다. 샘플을 800 mL MeOH(+소량 TFA)에서 용해시키고, 1.3 mL 샘플 용액, 즉 50.3 mg 각각을 분리 시스템 상에 주입했다. 반-예비 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC)을, 하기를 갖는 Thar 350 SFC (유출구 압력: 117 bar, 327 nm에서)를 사용하여 수행했다: AS-H 칼럼, 250×30 mm (5 마이크론) 이동상: 36 g/분 MeOH(0.2% DEA) 플러스 54 g/분 CO2 (온도 = 22℃). 키랄 분리 후, 각 분획을 톨루엔 및 에탄올로 2회 공-증발시켜 디에틸아민을 제거했다. AS-H 칼럼 상의 제 1 피크 및 AD-H 칼럼 상의 제 2 피크 (10.678 분): (R)-1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에탄아민 (13.5173 g, 50.4 mmol, 43.7 % 수율)을 갈색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.76 (dq, J=4.7, 0.9 Hz, 1 H), 8.20 (dd, J=9.0, 5.9 Hz, 1 H), 7.99 - 8.10 (m, 2 H), 7.91 (dd, J=9.4, 2.7 Hz, 1 H), 7.82 (td, J=8.9, 2.9 Hz, 1 H), 7.56 - 7.61 (m, 1 H), 4.66 (q, J=6.7 Hz, 1 H), 2.07 (s, 2 H), 1.35 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 그것은 트리페닐포스핀 옥사이드를 함유했고; 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 269.0 (M + 1). [HPLC] 4.996 분에서 피크, 254 nm에서 99.56% 순수; 헥산 중 이소프로판올의 10% 등용매를 용출물로서 사용하는 [키랄 HPLC](Chiralpak AD-H 칼럼, 0.46×250mm, 5 mm): 254 nm에서 11.432 분에서 피크 (제 2-용출 거울상이성질체); [거울상이성질체 과잉 분석]: AS-H 칼럼 상의 99% ee, 제 1-용출 거울상이성질체. AS-H 칼럼 상의 제 2 피크 및 AD-H 칼럼 상의 제 1 피크 (9.350 분): (S)-1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에탄아민 (12.6738 g, 47.2 mmol, 40.9 % 수율)을 갈색 시럽성 고형물로서 얻었다: 1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.73 - 8.78 (m, J=4.8, 1.2, 0.9, 0.9 Hz, 1 H), 8.20 (dd, J=9.4, 5.9 Hz, 1 H), 7.99 - 8.10 (m, 2 H), 7.91 (dd, J=9.4, 2.7 Hz, 1 H), 7.82 (td, J=8.9, 2.9 Hz, 1 H), 7.58 (ddd, J=7.4, 4.9, 1.4 Hz, 1 H), 4.66 (q, J=6.4 Hz, 1 H), 2.07 (br. s., 2 H), 1.35 (d, J=6.7 Hz, 3 H); 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 269.0 (M + 1). 헥산 중 이소프로판올의 10% 등용매를 용출물로서 사용하는 [키랄 HPLC] (Chiralpak AD-H 칼럼, 0.46×250mm, 5 mm): 254 nm에서 9.135 분에서 피크(제 1-용출 거울상이성질체); [거울상이성질체 과잉 분석]: AS-H 칼럼 상의 98.86%ee, 제 2-용출 거울상이성질체. 입체화학은 다음 단계에서 S-이성질체로서 확인되었다.
(S)-4-아미노-6-((1-(6- 플루오로 -3-(피리딘-2-일) 퀴녹살린 -2-일)에틸)아미노)-피리미딘-5- 카보니트릴
Figure pct00052
부탄-1-올 (3.91 mL) 중 4-아미노-6-클로로피리미딘-5-카보니트릴 (0.060 g, 0.39 mmol), (S)-1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에탄아민 (0.105 g, 0.391 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.205 mL, 1.17 mmol)의 혼합물을 120℃에서 3 시간 동안 교반했다. 3 시간 후, 혼합물을 열로부터 제거하고 실온에서 정치했다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 황색 고형물을 얻었다. 황색 고형물에 물 (30 mL)을 부가했다. 수득한 고형물을 여과하고, 물 (30 mL)로 세정하고, 공기-건조하여 생성물을 갈색 고형물로서 얻었다. 갈색 고형물을, CH2Cl2 중 CH2Cl2:MeOH:NH4OH (89:9:1)의 0 내지 50% 구배를 14 분에 걸쳐 사용하고 그 다음 CH2Cl2 중 CH2Cl2:MeOH:NH4OH (89:9:1)의 50% 등용매를 14 분 동안 용출물로서 사용하는 40 g의 Redi-Sep 칼럼상 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 밝은 황색 고형물 (0.1246 g)을 얻었다. 밝은 황색 고형물을 EtOAc-헥산 (1:4)에서 현탁하고, 여과하고, 건조하여 (S)-4-아미노-6-(1-(6-플루오로-3-(피리딘-2-일)퀴녹살린-2-일)에틸아미노)피리미딘-5-카보니트릴 (0.1121 g, 0.290 mmol, 74.1 % 수율)을 황갈색 고형물로서 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO - d 6) δ ppm 8.66 - 8.74 (m, 1 H), 8.19 (dd, J=9.4, 5.9 Hz, 1 H), 7.99 - 8.09 (m, 2 H), 7.95 (dd, J=9.4, 2.7 Hz, 1 H), 7.80 - 7.89 (m, 2 H), 7.70 (d, J=7.4 Hz, 1 H), 7.53 (ddd, J=6.9, 5.0, 1.8 Hz, 1 H), 7.20 (br. s., 2 H), 6.09 - 6.21 (m, 1 H), 1.54 (d, J=6.7 Hz, 3 H); 질량 스펙트럼 (ESI) m/e = 387.1 (M + 1). 헥산 중 이소프로판올의 10% 등용매를 용출물로서 사용하는 [키랄 HPLC] (Chiralpak AD-H 칼럼, 0.46×250mm, 5 mm): 254 nm에서 16.038 분에서 피크.
생물학적 분석
PI3K 의 재조합 발현
polyHis 태그로 N-말단이 표지된, PI3k α, β 및 δ의 전장 p110 서브유닛을 sf9 곤충 세포 내에서 배큘로 바이러스 발현 벡터와 함께 p85를 이용하여 공동발현시켰다. P110/p85 이형이량체를 순차적인 Ni-NTA, Q-HP, Superdex-100 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 α, β 및 δ 동질효소를 20mM Tris, pH 8, 0.2M NaCl, 50% 글리세롤, 5mM DTT, 2mM Na 콜레이트 중에서 -20℃에서 보관하였다. polyHis 태그로 N-말단이 표지된, 끝이 잘린 PI3Kγ, 잔기 114-1102를 Hi5 곤충 세포 내에서 배큘로 바이러스를 이용하여 발현시켰다. γ 동질효소를 순차적인 Ni-NTA, Superdex-200, Q-HP 크로마토그래피에 의해 정제하였다. γ 동질효소를 NaH2PO4, pH 8, 0.2M NaCl, 1% 에틸렌 글리콜, 2mM β-머캅토에탄올 중에서 -80℃에서 냉동 보관하였다.
알파 베타 델타 감마
50 mM Tris pH 8 pH 7.5 pH 7.5 pH 8
MgCl2 15 mM 10 mM 10 mM 15 mM
Na 콜레이트 2 mM 1 mM 0.5 mM 2 mM
DTT 2 mM 1 mM 1 mM 2 mM
ATP 1 uM 0.5 uM 0.5 uM 1 uM
PIP2 없음 2.5 uM 2.5 uM 없음
시간 1 h 2 h 2 h 1 h
[효소] 15 nM 40 nM 15 nM 50 nM
시험관내 효소 분석
백색 폴리프로필렌 플레이트(Costar 3355)에서 상기 성분들의 최종 농도를 이용하여 25 μL에서 분석을 수행하였다. 포스파티딜 이노시톨 포스포수용체, PtdIns(4,5)P2 P4508은 Echelon Biosciences사로부터 구입하였다. 알파 및 감마 동질효소의 ATPase 활성은 이들 조건 하에서 PtdIns(4,5)P2에 의해 크게 자극되지 않았으므로, 이들 동질효소의 분석으로부터 생략되었다. 시험 화합물을 디메틸 설폭사이드에 용해시키고 3배 연속 희석으로 희석하였다. DMSO(1 μL) 중의 화합물을 시험 웰 마다 첨가하고, 효소를 이용하여 그리고 효소 없이, 화합물을 함유하지 않는 반응 대비 억제를 결정하였다. 실온에서 분석 배양 후, 반응을 중지시키고 제조사의 설명에 따라 동등한 부피의 상업적 ATP 생물발광 키트(Perkin Elmer EasyLite)를 첨가함으로써 잔류 ATP를 결정하였고, AnalystGT 발광분석기를 이용하여 검출하였다.
항- IgM 에 의한 인간 B 세포 증식 자극
인간 B 세포의 분리:
Leukopac 또는 인간 신선한 혈액으로부터 PBMC를 분리한다. Miltenyi 프로토콜 및 B 세포 단리 키트 II를 이용하여 인간 B 세포를 분리한다. 인간 B 세포를 AutoMacs.칼럼을 이용하여 정제하였다.
인간 B 세포의 활성화
96 웰 편평한 바닥 플레이트를 이용하여, B 세포 증식 배지(DMEM + 5% FCS, 10 mM Hepes, 50 μM 2-머캅토-에탄올) 중에서 웰당 50000개의 정제된 B 세포를 플레이팅(plating)한다; 250 ng/mL CD40L-LZ 재조합 단백질(Amgen) 및 2 μg/mL 항-인간 IgM 항체(Jackson ImmunoReseach Lab.#109-006-129)를 함유하는 150 μL 배지를 PI3K 억제제를 함유하는 50 μL B 세포 배지와 혼합하고 37℃ 배양기에서 72시간 동안 배양한다. 72시간 후, 밤새 ~18시간 동안 0.5-1 uCi /웰 3 H 티미딘으로 B 세포를 펄스 표지하고, TOM 수확기를 이용하여 세포를 수확한다.
IL -4에 의한 인간 B 세포 증식 자극
인간 B 세포의 분리:
Leukopac 또는 인간 신선한 혈액으로부터 인간 PBMC를 분리한다. Miltenyi 프로토콜-B 세포 분리 키트를 이용하여 인간 B 세포를 분리한다. 인간 B 세포를 AutoMacs.칼럼에 의해 정제하였다.
인간 B 세포의 활성화
96-웰 편평한 바닥 플레이트를 이용하여, B 세포 증식 배지(DMEM + 5% FCS, 50 μM 2-머캅토에탄올, 10mM Hepes) 내에 웰당 50000개의 정제된 B 세포를 플레이팅하고, 250 ng/mL CD40L-LZ 재조합 단백질(Amgen) 및 10 ng/mL IL-4(R&D system # 204-IL-025)를 함유하는 배지(150 μL)를 화합물을 함유하는 50 150 μL B 세포 배지와 혼합하고 37℃ 배양기에서 72시간 동안 배양한다. 72시간 후, 밤새 내지 18시간 동안 0.5-1 uCi /웰 3H 티미딘으로 B 세포를 펄스 표지하고, TOM 수확기를 이용하여 세포를 수확한다.
특이적 T 항원( 테타누스독소증 변성독소)-유도된 인간 PBMC 증식 분석
인간 PBMC를 냉동된 스톡으로부터 준비하거나 또는 이들을 피콜 구배를 이용하여 신선한 인간 혈액으로부터 정제한다. 96 웰 둥근-바닥 플레이트를 사용하고 배양 배지(RPMI1640 + 10% FCS, 50uM 2-머캅토에탄올,10 mM Hepes)를 이용하여 2x105 PBMC/웰을 플레이팅한다. IC50 결정을 위해, PI3K 억제제를 10 μM부터 0.001 μM까지 하프로그(half log) 증분 및 3회로 시험하였다. T 세포 특이적 항원인 테타누스독소증 변성독소(University of Massachusetts Lab)를 1　μg/mL로 첨가하고 37℃ 배양기에서 6일간 배양하였다. IL2 ELISA 분석을 위해 6일 후 상청액을 수집한 다음, 세포를 ~18시간 동안 3H-티미딘으로 펄스하여 증식을 측정하였다.
계열 Ia 및 계열 III PI3K 의 억제를 검출하기 위한 GFP 분석
AKT1(PKBa)은 미토겐성 인자(IGF-1, PDGF, 인슐린, 트롬빈, NGF 등)에 의해 활성화된 계열 Ia PI3K에 의해 조절된다. 미토겐성 자극에 반응하여, AKT1은 사이토졸로부터 원형질막으로 이동한다. 포크헤드(FKHRL1)는 AKT1에 대한 기질이다. 그것은 AKT에 인산화될 때(생존/성장), 세포질에 있다. AKT의 억제(정체/세포자멸사) - 핵으로의 포크헤드(forkhead) 전좌(translocation)
FYVE 도메인은 PI(3)P에 결합한다. 대부분은 PI3K 계열 III의 항시적 작용에 의해 생성된다
AKT 막 주름짓기( ruffling ) 분석( CHO - IR - AKT1 - EGFP 세포/ GE Healthcare )
분석 완충제로 세포를 세정한다. 분석 완충액 중의 화합물로 1시간 동안 처리한다. 10 ng/mL 인슐린을 첨가한다. 실온에서 10분 후 고정시키고 및 영상화한다.
포크헤드 전좌 분석( MDA MB468 Forkhead - DiversaGFP 세포)--
세포를 성장 배지에서 1시간 동안 화합물로 처리한다. 고정하고 영상화한다.
계열 III PI (3)P 분석( U2OS EGFP -2 XFYVE 세포/ GE Healthcare )--
세포를 분석 완충제로 세정한다. 분석 완충액 중의 화합물로 1시간 동안 처리한다. 고정하고 영상화한다.
모든 3가지 분석에 대한 대조군은 10 uM 워트만닌이다 :
AKT는 세포질이다
포크헤드는 핵이다
PI(3)P는 엔도솜으로부터 감소됨
바이오마커 분석: CD69 또는 B7.2( CD86 ) 발현의 B-세포 수용체 자극
헤파린화된 인간 전혈을 10 μg/mL 항-IgD(서던 Biotech, #9030-01)로 자극시켰다. 그리고 나서, 상기 자극된 혈액 90 μL를 96-웰 플레이트의 웰 마다 분주하고 IMDM + 10% FBS (Gibco)에 희석된 다양한 농도의 블로킹 화합물(10-0.0003 μM) 10 μL로 처리하였다. 샘플을 37℃에서 4시간(CD69 발현의 경우) 내지 6시간(B7.2 발현의 경우) 배양하였다. 처리된 혈액(50 μL)을 10 μL 각각의 CD45-PerCP(BD Biosciences, #347464), CD19-FITC(BD Biosciences, #340719), 및 CD69-PE(BD Biosciences, #341652)를 이용한 항체 염색을 위해 96-웰, 딥 웰 플레이트(Nunc)로 이동시켰다. 처리된 혈액의 두 번째 50 μL 을 10 μL 각각의 CD19-FITC(BD Biosciences, #340719) 및 CD86-PeCy5(BD Biosciences, #555666)를 이용한 항체 염색을 위해 두 번째 96-웰, 딥 웰 플레이트로 이동시켰다. 모든 염색은 실온에서 어두운 곳에서 15-30분간 수행하였다. 그리고 나서, 혈액을 450 μL의 FACS 용해 용액(BD Biosciences, #349202)을 이용하여 실온에서 15분간 용해시키고 고정시켰다. 그리고 나서, 샘플을 FACS 분석에 앞서 PBS + 2% FBS에서 2회 세정하였다. 샘플을 CD69 염색을 위해 CD45/CD19 이중 양성 세포 상으로, 또는 CD86 염색을 위해 CD19 양성 세포 상으로 게이트하였다.
감마 카운터스크린: 포스포 - AKT 발현을 위한 인간 단핵구의 자극
인간 단핵구 세포주 THP-1을 RPMI + 10% FBS(Gibco)에서 유지시켰다. 자극 1일 전, 세포를 혈구계 상에서 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion)를 이용하여 계수하고 배지 mL 당 1 x 106 세포의 농도로 현탁시켰다. 그리고 나서, 8개의 상이한 화합물들을 시험하기 위해 100 μL의 세포 및 배지(1 x 105 세포)를 4-96-웰, 딥 웰 디쉬(Nunc)의 웰 마다 분주하였다. 세포를 다양한 농도(10-0.0003μM)의 블로킹 화합물로 처리하기에 앞서 밤새 휴지시켰다. 배지(12 μL)에 희석된 상기 화합물을 37℃에서 10분간 세포에 첨가하였다. 인간 MCP-1(12 μL, R&D Diagnostics, #279-MC)을 배지에 희석하고 50 ng/mL의 최종 농도로 각 웰에 첨가하였다. 자극을 실온에서 2분간 지속시켰다. 미리-가열된 FACS Phosflow Lyse/Fix 완충제(37℃의 1 mL)(BD Biosciences, #558049)를 각 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 추가 10-15분간 37℃에서 배양하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 10분간 회전시키고, 상청액을 흡인 제거하고, 격렬히 흔들면서 1 mL의 차가운 90% MEOH을 각 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 -70℃에서 밤새 또는 항체 염색 전 30분간 얼음에서 배양하였다. 플레이트를 회전시키고 PBS + 2% FBS(Gibco)에서 2회 세정하였다. 세정물을 흡인하고 세포를 남아있는 완충제에 현탁시켰다. 1:100의 토끼 pAKT(50 μL, Cell Signaling, #4058L)를 교반하면서 실온에서 1시간 동안 각 시료에 첨가하였다. 세포를 세정하고 1500 rpm에서 10분간 회전시켰다. 상청액을 흡인하고 세포를 남아있는 완충제에 현탁시켰다. 2차 항체인 1:500의 염소 항-토끼 Alexa 647(50 μL, Invitrogen, #A21245)을 교반하면서 실온에서 30분간 첨가하였다. 그리고 나서, 세포를 완충제에서 1회 세정하고 FACS 분석을 위해 150 μL의 완충제에 현탁시켰다. 세포는 유동 세포분석기에서 작동시키기 전에 피펫팅에 의해 매우 잘 분산될 필요가 있다. 세포를 LSR II(Becton Dickinson) 상에서 작동시키고 단핵구 모집단에서 pAKT의 발현 수준을 결정하기 위해 전방 및 측방 산란 상에서 게이트하였다.
감마 카운터스크린: 마우스 골수에서 포스포 - AKT 발현을 위한 단핵구의 자극
5마리의 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Labs.)로부터 마우스 대퇴골을 해부하고, RPMI + 10% FBS 배지(Gibco) 내로 수집하였다. 대퇴골의 말단을 자르고 25 게이지 바늘을 이용하여 1 mL의 배지로 씻어내어 마우스 골수를 제거하였다. 그리고 나서, 골수를 21 게이지 바늘을 이용하여 배지에 분산시켰다. 배지 부피를 20 mL로 증가시키고 세포를 혈구계 상에서 트립판 블루 배제를 이용하여 계수하였다. 그리고 나서, 세포 현탁액을 배지 1 mL 당 7.5 x 106 세포로 증가시키고 8개의 상이한 화합물을 시험하기 위해 100 μL(7.5 x 105 세포)를 4-96-웰, 딥 웰 디쉬(Nunc) 내로 웰 마다 분주하였다. 세포를 다양한 농도(10-0.0003μM)의 블로킹 화합물로 처리하기에 앞서 세포를 2시간 동안 37℃에서 휴지시켰다. 배지(12 μL)에 희석된 화합물을 37℃에서 10분간 골수 세포에 첨가하였다. 마우스 MCP-1(12 μL, R&D Diagnostics, #479-JE)을 배지에 희석하고 50 ng/mL의 최종 농도로 각 웰에 첨가하였다. 자극을 실온에서 2분간 지속시켰다. 1 mL의 37℃ 미리-가열된 FACS Phosflow Lyse/Fix 완충제(BD Biosciences, #558049)를 각 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 추가 10-15분간 37℃에서 배양하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 10분간 회전시켰다. 상청액을 흡인 제거하고 격렬히 흔들면서 1 mL의 차가운 90% MEOH를 각 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 -70℃에서 밤새 또는 항체 염색 전 30분간 얼음 위에서 배양하였다. 플레이트를 회전시키고 PBS + 2% FBS(Gibco)에서 2회 세정하였다. 세포를 흡인하고 세포를 남아있는 완충제에 현탁시켰다. 그리고 나서, Fc 블록(2 μL, BD Pharmingen, #553140)을 실온에서 10분간 웰당 부가하였다. 블록 후, 50 μL의 완충제에 희석된 일차 항체; 1:50의 CD11b-Alexa488(BD Biosciences, #557672), 1:50의 CD64-PE(BD Biosciences, #558455), 및 1:100의 토끼 pAKT(세포 신호전달, #4058L)를 교반하면서 실온에서 1시간 동안 각 시료에 첨가하였다. 세포에 세정 완충액을 첨가하고 1500 rpm에서 10분간 회전시켰다. 상청액을 흡인하고, 세포를 남아있는 완충제에 현탁시켰다. 2차 항체; 1:500의 염소 항-토끼 Alexa 647(50 μL, Invitrogen, #A21245)을 교반하면서 실온에서 30분간 첨가하였다. 그리고 나서, 세포를 완충제에서 1회 세정하고 FACS 분석을 위해 100 μL의 완충제에 현탁시켰다. 세포를 LSR II(Becton Dickinson)에서 작동시키고 단핵구 모집단에서 pAKT의 발현 수준을 결정하기 위해 CD11b/CD64 이중 양성 세포 상에서 게이트하였다.
pAKT 생체내 분석
항-IgM FITC(50 ug/마우스)(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)의 정맥 내 주사(0.2 mL) 15분 전에 마우스(형질전환 주 3751, 암컷, 10-12주, Amgen Inc, Thousand Oaks, CA)에 위관영양법(Oral Gavage Needles Popper & Sons, New Hyde Park, NY)에 의해 비히클 및 화합물을 경구(0.2 mL) 투여한다. 45분 후, CO2 챔버 내에서 마우스를 희생시킨다. 심장 천자(0.3 mL)(1cc 25 g 주사기, Sherwood, St. Louis, MO)를 통해 혈액을 채혈하고, 이를 15 mL 원뿔형 바이알(Nalge/Nunc International, Denmark) 내로 이동시킨다. 혈액을 6.0 mL의 BD Phosflow Lyse/Fix 완충제(BD Bioscience, San Jose, CA)로 즉시 고정시키고, 3회 반전시키고 37℃ 수조에 둔다. 비장의 절반을 제거하고 0.5 mL의 PBS(Invitrogen Corp, Grand Island, NY)를 함유하는 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 조직 그라인더(펠렛 막자, Kimble/Kontes, Vineland, NJ)를 이용하여 비장을 분쇄하고, 6.0 mL의 BD Phosflow Lyse/Fix 완충제로 즉시 고정시키고, 3회 반전시키고 37℃ 수조에 둔다. 조직이 수집되면 마우스를 자궁경부를 탈구시키고 시체를 없앤다. 15분 후, 15 mL 원뿔형 바이알을 37℃ 수조로부터 제거하고 조직이 추가 가공될 때까지 얼음 상에 둔다. 분쇄된 비장을 70 μm 세포 여과기(BD Bioscience, Bedford, MA)를 통해 또 하나의 15 mL 원뿔형 바이알 내로 여과하고 9 mL PBS로 세정한다. 비장세포 및 혈액을 ＠2,000 rpm에서 10분간(차가움) 회전시키고 완충제를 흡인한다. 세포를 2.0 mL의 차가운(-20℃) 90% 메틸 알코올(Mallinckrodt Chemicals, Phillipsburg, NJ)에 재현탁시킨다. 원뿔형 바이알을 빠르게 소용돌이시키면서 MeOH를 서서히 첨가한다. 그리고 나서, FACS 분석을 위해 세포를 염색할 때까지 조직을 -20℃에서 보관한다.
다중-용량 TNP 면역화
면역화 전 0일째에 7-8 주령 BALB/c 암컷 마우스(Charles River Labs.)로부터 안와후 안구 출혈에 의해 혈액을 수집한다. 혈액을 30분간 응고시키고 혈청 마이크로테이너 튜브(Becton Dickinson)에서 10,000 rpm에서 10분간 회전시켰다. 혈청을 수집하고, 매트릭스 튜브(Matrix Tech. Corp.)에 분주하고 ELISA가 수행될 때까지 -70℃에서 보관하였다. 마우스에게 면역화 전 및 분자의 생명에 기초한 차후의 기간에 경구로 화합물을 제공하였다. 그리고 나서, 마우스를 PBS 중의 50 μg의 TNP-LPS(Biosearch Tech., #T-5065), 50 μg의 TNP-피콜(Biosearch Tech., #F-1300), 또는 100 μg의 TNP-KLH(Biosearch Tech., #T-5060) 및 1% 명반(Brenntag, #3501)으로 면역화시켰다. TNP-KLH 및 명반 용액은 면역화 전 1시간 동안 10분마다 3-5회 혼합물을 반전시킴으로써 제조하였다. 마지막 처리 후 5일째에, 마우스를 CO2 희생시키고 심장 천자하였다. 혈액을 30분간 응고시키고 혈청 마이크로테이너 튜브에서 10,000 rpm에서 10분간 회전시켰다. 혈청을 수집하고, 매트릭스 튜브에 분주하고, 추가 분석이 수행될 때까지 -70℃에 보관하였다. 그리고 나서, 혈청 내 TNP-특이적 IgG1, IgG2a, IgG3 및 IgM 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. TNP-특이적 항체를 포획하기 위해 TNP-BSA(Biosearch Tech., #T-5050)를 사용하였다. TNP-BSA(10 μg/mL)를 사용하여 384-웰 ELISA 플레이트Corning Costar)를 밤새 코팅하였다. 그리고 나서, 플레이트를 세정하고 10% BSA ELISA 블록 용액(KPL)을 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후, ELISA 플레이트를 세정하고 혈청 샘플/표준을 연속으로 희석하고 1시간 동안 플레이트에 결합하게 하였다. 플레이트를 세정하고 Ig-HRP 콘주게이트된 2차 항체(염소 항-마우스 IgG1, Southern Biotech #1070-05, 염소 항-마우스 IgG2a, Southern Biotech #1080-05, 염소 항-마우스 IgM, Southern Biotech #1020-05, 염소 항-마우스 IgG3, Southern Biotech #1100-05)를 1:5000으로 희석하고 플레이트 상에서 1시간 동안 배양하였다. TMB 페록시다아제 용액(SureBlue Reserve TMB from KPL)을 사용하여 항체를 시각화하였다. 플레이트를 세정하고 샘플을 분석된 Ig에 따라 대략 5-20분 TMB 용액에서 현상시켰다. 상기 반응을 2M 황산을 이용하여 중지시키고 플레이트를 450 nm의 OD에서 판독하였다.
Ex # PI3K d IC50 (mM) PI3K b IC50
(mM)		 PI3Ka IC50 (mM) PI3Kg IC50 (mM) PI3K: b/d PI3K: a/d PI3K: g/d
1 0.0030 4.7400 9.9800 1.6100 1580 3327 537
2 0.0078 1.3600 7.0400 0.8040 174 903 103
3 0.0051 0.4340 3.4200 0.0629 85 671 12
4 0.0100 0.5220 12.0600 0.4480 52 1206 45
5 0.0026 0.6520 5.1600 0.6200 251 1985 238
6 0.0070 5.8000 25.0000 2.8000 829 3571 400
7 0.0117 2.4900 12.7000 3.9000 213 1085 333
Ex # 온 타겟 항-IgM mu 비장세포 pAKT (Hu 비장세포 PAKT) PI3KIII, (uM) PI3KbMDA468
FH PI3KbMBMDA468
(uM)		 생체내 pAKT 데이타, ED50 (uM) WB,비장세포
1 0.0022 >10 5.97, 2.6 0.041, 0.010
2 0.0012 >10 >10, 0.811 0.36, 0.26
3 0.0015 >10 3.8000, 0.483 데이터 없음
4 0.0018 >10 1.9500, 0.62 데이터 없음
5 0.0050 >10 >10, >10 0.056, 0.012
6 0.0060 >10 >10, 11 0.13 (WB)
7 0.0104 (Hu B 세포 항-IgM) >10 >10 데이터 없음
류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환, 및 자가면역 질환과 같은 PI3Kδ-매개된-질환의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 종래의 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 및 비히클을 함유하는 복용량 단위 제형으로 경구로, 비경구로, 흡입 분무에 의해, 직장으로, 또는 국소로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 비경구는, 피하, 정맥내, 근육내, 흉골내, 주입 기술 또는 복강내를 포함한다.
본원에서 질환 및 장애의 치료는 또한 본 발명의 화합물, 그의 약제학적 염, 또는 이들의 약제학적 조성물을, 예방적 치료를 필요로 한다고 여겨지는 대상(즉, 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간)에게 예방적 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 질환은 예를 들면, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환, 및 자가면역 질환 등이다.
본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물을 이용하여 PI3Kδ-매개된 질환, 암, 및/또는 고혈당증을 치료하기 위한 복용 요법은, 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용된 특정한 화합물을 포함하는 다양한 인자에 기초한다. 따라서, 상기 복용 요법은 널리 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용하여 일상적으로 결정될 수 있다. 하루 당 체중의 kg 당 약 0.01 mg 내지 30 mg, 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 10 mg/kg, 더 바람직하게는 약 0.25 mg 내지 1 mg/kg의 순서의 복용량 수준이 본원에 개시된 모든 사용 방법에 유용하다.
본 발명의 약제학적으로 활성 화합물은 인간 및 다른 포유동물을 포함하는, 환자에게 투여하기 위한 약물을 생산하는 종래 조제 방법에 따라 가공될 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 캡슐, 정제, 현탁액, 또는 액체의 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 주어진 양의 활성 성분을 함유하는 복용량 단위의 형태로 제조된다. 예를 들면, 이들은 약 1 내지 2000 mg, 바람직하게는 약 1 내지 500 mg, 더 바람직하게는 약 5 내지 150 mg의 활성 성분의 양을 함유할 수 있다. 인간 또는 다른 포유동물을 위한 적합한 1일 용량은 환자의 상태 및 다른 인자에 따라 널리 달라질 수 있지만, 다시 한번, 일상적인 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
활성 성분은 또한 염수, 덱스트로오스, 또는 물을 포함하는 적합한 담체와 함께 조성물로서 주사로 투여될 수 있다. 일일 비경구 복용 요법은 총 체중의 kg 당 약 0.1 내지 약 30 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 및 더 바람직하게는 약 0.25 mg 내지 1 mg/kg일 것이다.
주사가능 제제, 예컨대 멸균한 주사가능 수성 또는 유성 현탁액은, 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균한 주사가능 제제는 또한 예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액으로서, 비-독성의 비경구로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균한 주사가능 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균한 고정유가 용매 또는 분산매로서 종래에 이용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 이용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용된다.
약물의 직장 투여용 좌약은 약물을 적합한 무-자극 부형제, 예컨대 상온에서 고체지만 직장 온도에서 액체이며 따라서 직장에서 용해되어 약물을 방출할 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물의 활성 성분의 적합한 국소 용량은 1 내지 4회, 바람직하게는 하루에 1회 또는 2회 투여되는 0.1 mg 내지 150 mg이다. 국소 투여를 위해, 활성 성분은 0.001% 내지 10% w/w, 예를 들면, 제형 중량의 1% 내지 2중량%이며, 10% w/w만큼 포함될 수 있지만, 바람직하게는 5% w/w 이하, 및 더 바람직하게는 제형의 0.1% 내지 1%로 포함될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제형은 피부를 통해 침투하기에 적당한 액체 또는 반-액상 제제 (예를 들면, 도찰제, 로션, 연고, 크림, 또는 페이스트) 및 눈, 귀, 또는 코에 투여하는데 적합한 액적을 포함한다.
투여를 위해, 본 발명의 화합물은 대개는 투여의 명시된 경로에 적합한 하나 이상의 보조제와 배합된다. 화합물은 락토오스, 수크로오스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로오스 에스테르, 스테아르산, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 옥사이드, 나트륨 및 인의 칼슘 염 및 황산, 아카시아, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리딘, 및/또는 폴리비닐 알코올과 혼합될 수 있으며, 종래의 투여를 위해 정제로 만들거나 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참께 오일, 트라가칸쓰 검, 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다. 다른 보조제 및 투여 방식은 약제학적 기술에 잘 알려져 있다. 담체 또는 희석제는 단독으로 또는 왁스, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 다른 물질과 함께 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은, 시간 지연 물질을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 고체 형태(과립, 분말 또는 좌약 포함) 또는 액체 형태(예를 들면, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼)로 구성될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균과 같은 종래의 약제학적 작업에 놓여지고/거나 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충제 등과 같은 종래의 보조제를 함유할 수 있다.
경구 투여용 고체 복용 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분말, 및 과립을 포함할 수 있다. 그러한 고체 복용 형태에서, 활성 화합물은 수크로오스, 락토오스, 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 그러한 복용 형태는 또한 일반적인 실시에서와 마찬가지로, 불활성 희석제 외의 추가의 물질, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 및 알약의 경우, 복용 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 알약은 장용 코팅을 이용하여 추가로 제조될 수 있다.
경구 투여용 액체 복용 형태는 물과 같이 본 기술분야에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 또한 보조제, 예컨대 습윤제, 감미제, 풍미제, 및 방향제를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있으므로 광학 이성질체의 형태 뿐만 아니라 그의 라세미 또는 비-라세미 혼합물의 형태로 존재할 수 있다. 광학 이성질체는 종래의 공정에 따른 라세미 혼합물의 분해에 의해, 예를 들면, 광학 활성 산 또는 염기로 처리함으로써 부분입체이성질체 염의 형성에 의해, 수득될 수 있다. 적절한 산의 예는 타르타르산, 디아세틸타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산, 및 캄포르설폰산이며 결정화에 의한 부분입체이성질체의 혼합물의 분리가 이들 염으로부터 광학 활성 염기를 유리시킨다. 광학 이성질체의 분리를 위한 상이한 공정은 거울상이성질체의 분리를 최대화하기 위해 최적으로 선택된 키랄 크로마토그래피를 이용하는 것을 포함한다. 또 하나의 이용가능한 방법은 본 발명의 화합물을 활성화된 형태의 광학적으로 순수한 산 또는 광학적으로 순수한 이소시아네이트와 반응시켜 공유 부분입체이성질체 분자를 합성하는 것을 포함한다. 상기 합성된 부분입체이성질체는 크로마토그래피, 증류, 결정화 또는 승화와 같은 종래의 수단에 의해 분리될 수 있고, 이후 가수분해되어 거울상이성질체적으로 순수한 화합물을 전달할 수 있다. 본 발명의 광학 활성 화합물은 마찬가지로 활성 출발 물질을 이용하여 수득될 수 있다. 이들 이성질체들은 유리 산, 유리 염기, 에스테르 또는 염의 형태일 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 화합물은 분자식은 동일하지만 서로에 대해 원자가 상이하게 배열된 화합물인 이성질체로서 존재할 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물의 알킬렌 치환체들은 정상적으로 그리고 바람직하게는 이들 그룹의 각각에 대한 정의에서 명시된 바와 같이 분자 내로 배열 및 삽입되며, 이는 좌측으로부터 우측으로 기재되어 있다. 그러나, 어떤 경우에, 당해분야의 숙련가는 이들 치환체가 분자 내의 다른 원자에 대해 배향이 역전된 본 발명의 화합물을 제조할 수 있음을 인식할 것이다. 즉, 삽입될 치환체는 그것이 역 배향으로 분자 내로 삽입되는 것을 제외하면 전술한 바와 같이 동일할 것이다. 당해분야의 숙련가는 본 발명의 화합물의 이들 이성질체 형태가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 함을 인식할 것이다.
본 발명의 화합물은 무기 또는 유기산으로부터 유도된 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염은, 비제한적으로, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 디글루코네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 2-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 메실레이트, 및 운데카노에이트를 포함한다. 또한, 상기 염기성 질소-함유 그룹은 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 설페이트 같은 디알킬 설페이트, 장쇄 할라이드 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드, 벤질 및 펜에틸 브로마이드과 같은 아랄킬 할라이드 등과 같은 제제를 이용하여 4기화(quaternize)될 수 있다. 그렇게 함으로써 물 또는 오일용해성 또는 분산성 산물이 수득된다.
약제학적으로 허용가능한 산부가 염을 형성하는데 이용될 수 있는 산의 예는 염산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 석신산 및 시트르산과 같은 유기산을 포함한다. 다른 예들은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘과의 염 또는 유기 염기와의 염을 포함한다.
본 발명의 화합물의 대사작용으로 불안정한 에스테르 또는 전구약물 형태를 포함하는, 카복실산 또는 하이드록실 함유 그룹의 약제학적으로 허용가능한 에스테르가 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다. 대사작용으로 불안정한 에스테르는, 예를 들면, 혈액 수준 증가 및 화합물의 상응하는 비-에스테르화된 형태의 효능을 연장할 수 있는 것이다. 전구약물 형태는 투여될 때 분자의 활성 형태로 존재하지 않지만 대사, 예를 들면 효소 또는 가수분해 절단과 같은 몇 가지 생체내 활성 또는 생체변환 후 치료적으로 활성이 되는 것이다. 에스테르를 포함하는 전구약물의 일반적인 논의를 위해, 문헌[Svensson 및 Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) 및 Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)]을 참조한다. 마스킹된 카복실레이트 음이온의 예는 다양한 에스테르, 예컨대 알킬(예를 들면, 메틸, 에틸), 사이클로알킬(예를 들면, 사이클로헥실), 아랄킬(예를 들면, 벤질, p-메톡시벤질), 및 알킬카보닐옥시알킬(예를 들면, 피발로일옥시메틸)을 포함한다. 아민은 유리 약물 및 포름알데하이드를 유리하는 생체내 에스테라제에 의해 절단되는 아릴카보닐옥시메틸 치환된 유도체로서 마스킹되어 왔다(Bungaard J. Med. Chem. 2503 (1989)). 또한, 이미다졸, 이마이드, 인돌 등과 같은 산성 NH 그룹을 함유하는 약물은 N-아실옥시메틸 그룹으로 마스킹되어 왔다(Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)). 하이드록시 그룹은 에스테르 및 에테르로서 마스킹되어 왔다. EP 제039,051호(Sloan 및 Little, 4/11/81)는 만니히-염기 하이드록삼산 전구약물, 그의 제조 및 용도를 개시하고 있다. 본 발명의 화합물의 에스테르는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 에스테르 뿐만 아니라 산성 모이어티 및 하이드록실 함유 모이어티 사이에 형성된 다른 적합한 에스테르를 포함할 수 있다. 대사적으로 불안정한 에스테르는, 예를 들면, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 이소-프로폭시메틸, α-메톡시에틸, α-((C1-C4)-알킬옥시)에틸과 같은 그룹, 예를 들면, 메톡시에틸, 에톡시에틸, 프로프옥시에틸, 이소-프로프옥시에틸, 등; 2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일메틸 그룹, 예컨대 5-메틸-2-옥소-1,3,디옥소렌-4-일메틸, 등; C1-C3 알킬티오메틸 그룹, 예를 들면, 메틸티오메틸, 에틸티오메틸, 이소프로필티오메틸, 등; 아실옥시메틸 그룹, 예를 들면, 피발로일옥시메틸, α-아세톡시메틸, 등; 에톡시카보닐-1-메틸; 또는 α-아실옥시-α-치환된 메틸 그룹, 예를 들면 α-아세톡시에틸을 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명의 화합물은 통상의 용매 예컨대 에탄올, N,N-디메틸-포름아미드, 물, 등으로부터 결정화될 수 있는 결정성 고체로서 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 결정형은 모 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 다형체, 용매화물 및/또는 수화물로서 존재할 수 있다. 그와 같은 형태 모두는 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 화합물은 단일 활성 약제학적 제제로서 투여될 수 있지만, 이들은 또한 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 다른 제제와 배합되어 사용될 수 있다. 배합으로서 투여될 때, 상기 치료제는 동시에 또는 상이한 시간에 제공되는 별개의 조성물로서 제형화되거나, 또는 상기 치료제는 단일 조성물로서 제공될 수 있다.
전술된 것은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명을 개시된 화합물로 한정하고자 하는 것은 아니다. 당해분야의 숙련가에게 명백한 변화 및 변형들은 첨부된 청구항에 규정된 본 발명의 범위 및 특성 내에 속하는 것으로 의도된다.
전술한 설명으로부터, 당해분야의 숙련가는 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용법 및 조건에 맞게 조정할 수 있다.

Claims (22)

  1. 하기로부터 선택된 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00053

    Figure pct00054
    .
  2. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00055
  3. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00056
  4. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00057
  5. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00058
  6. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00059
  7. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00060
  8. 청구항 1에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물 또는 그의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00061
  9. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 2의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 3의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 4의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 5의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 6의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 7의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 치료적으로 효과적인 양의 청구항 8의 화합물; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 청구항 2에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  17. 청구항 3에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  18. 청구항 4에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  19. 청구항 5에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  20. 청구항 6에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  21. 청구항 7에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  22. 청구항 8에 있어서, 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 골관절염, 건선성 관절염, 건선, 염증성 질환 및 자가면역 질환, 염증성 창자 장애, 염증성 안구 장애, 염증성 또는 불안정한 방광 장애, 염증 요인이 있는 피부 질환, 만성 염증 병태, 자가면역 질환, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 파종성 뇌척수염, 특발성 혈소판감소 자색반병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 용혈성 빈혈, 알러지성 병태 및 과민증으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물.
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