KR20100041849A - Ｃｄ200에 대한 항체와 면역 반응의 저해에서 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해함으로써 면역 반응을 저해하는 방법과 조성물을 제시한다. 또한, 본 발명에서는 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해함으로써 이식편 거부반응을 저해하고 이식편 생존을 촉진하거나 연장시키는 방법과 조성물을 제시한다.

Description

ＣＤ200에 대한 항체와 면역 반응의 저해에서 이들의 용도{ANTIBODIES TO CD200 AND USES THEREOF IN INHIBITING IMMUNE RESPONSES}

관련된 출원

본 출원은 2007년 7월 25일 제출된 U.S. 가출원 No. 60/962,022에 우선권을 주장하는데, 상기 출원은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

기술분야

본 발명은 면역 반응을 예방 또는 저해하는 OX-2/CD200(이후, CD200) 결합제와 방법에 관계한다. 본 발명에 개시된 조성물과 방법은 자가면역 질환 환자와 이식편 수용자를 치료하는데 이용될 수 있다. 이식편의 관용(tolerance)을 촉진하기 위한 치료 방법은 CD200-결합제, 예를 들면, 항-CD200 항체를 이식물 또는 이식편 수용자에 투여하여 이식편의 생존을 연장시키는 단계를 포함한다.

배경기술

면역 세포는 전염성 병원체(infectious agent)와 같은 외래 침입자를 공격하고 제거하는데 도움을 준다. 하지만, 특정 상황, 예를 들면, 자가면역 질환, 알레르기, 그리고 조직 또는 기관 이식의 거부반응에서, 면역계는 질병의 원인이 될 수 있다. 공여자로부터 수용자로 이식편(가령, 세포, 조직 또는 기관)의 이식에서, 상기 이식편에 대한 수용자의 면역 반응은 질병을 유발한다. 그럼에도 불구하고, 세포, 조직과 기관의 이식은 매우 일반적이고, 종종 구명 절차(life-saving procedure)이다. 기관 이식은 만성 기관 부전(chronic organ failure)으로 고통받는 대부분의 환자에 대한 선호되는 치료법이다. 이식물의 면역 거부반응(즉, 이식편 거부반응)을 저해하는 치료에서 상당한 발전에도 불구하고, 이러한 거부반응(급성과 만성 거부반응 모두 포함)은 성공적인 기관 이식에서 여전히 최대 장애물이다. 신장 이식의 1년 생존율(surviving rate)은 예로써, 사망한 공여자로부터 신장의 경우에 평균 88.3%, 그리고 생존 공여자로부터 제공된 신장의 경우에 94.4%이다. 이식된 신장의 상응하는 5년 생존율은 63.3%와 76.5%이다(the Organ Procurement and Transplantation Network (OPTN)과 공동으로 the Scientific Registry of Transplant Recipients (SRTR)에 의해 발표된 연례 보고서의 OPTN/SRTR Annual Report, 2002. Chapter 1. http//. 참조). 간 이식의 경우에, 1년 생존율은 사망한 공여자와 생존 공여자로부터 획득된 간에 대하여 각각, 80.2%와 76.5%이다. 상응하는 5년 간 이식편 생존율은 63.5%와 73.0%이다(the Organ Procurement and Transplantation Network (OPTN)과 공동으로 the Scientific Registry of Transplant Recipients (SRTR)에 의해 발표된 연례 보고서의 OPTN/SRTR Annual Report, 2002. Chapter 1. http//. 참조). 면역억제 약물, 특히 시클로스포린 A와 더욱 구체적으로, 타크롤리무스의 이용은 기관 이식의 성공률을 극적으로 향상시켰다. 이들 약제는 급성 거부반응을 저해하는데 특히 성공적이었다. 하지만, 상기 수치에서 확인되는 바와 같이, 이식 이후에 단기와 장기 생존율 둘 모두를 향상시키는 것이 여전히 필요하다.

복수 유형의 이식이 존재한다. 한 개체로부터 동일한 개체로 이식된 이식편은 자가조직 이식편(autologous graft) 또는 자가이식편(autograft)으로 불린다. 2개의 유전적으로 동일한 또는 친연성(syngeneic) 개체들 간에 이식된 이식편은 친연성 이식편(syngeneic graft)으로 불린다. 동일한 종의 2개의 유전적으로 상이한 개체 간에 이식된 이식편은 동종유래 이식편(allogenic graft) 또는 동종이식편(allograft)으로 불리고, 상이한 종의 개체 간에 이식된 이식편은 이종유래 이식편(xenogenic graft) 또는 이종이식편(xenograft)으로 불린다.

현재, 40,000회 이상의 신장, 심장, 폐, 간과 췌장 이식이 매년 미국에서 실시되고 있다(Abbas et al., 2000; Cellular and Molecular Immunology (4^th edition), p. 363-383 (W. B. Saunders Company, New York). 다른 가능한 이식물에는 혈관 조직, 눈, 각막, 렌즈, 피부, 골수, 근육, 연결 조직, 위장 조직, 신경 조직, 뼈, 줄기 세포, 도세포(islet), 연골, 간세포, 그리고 조혈 세포(hematopoietic cell)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 유감스럽게도, 공여자보다 이식물에 대한 후보가 더욱 많은 실정이다. 이러한 부족량을 극복하기 위하여, 이종이식편을 이용하는 방법을 알아내려는 많은 노력이 수행되고 있다. 이 분야에서 진전이 이루어지고 있긴 하지만, 현재 대부분의 이식은 동종이식이다.

이런 이유로, 이식에서, 공여자의 유전적 배경(genetic background)은 종종, 수용자의 유전적 배경과 상이하고(가령, 동종이식), 따라서 공여자와 수용자는 그들의 조직적합성 항원(histocompatibility antigen), 다시 말하면, 인간에서 HLA 시스템으로 불리는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)의 항원에서 상이하다. 이런 이유로, 수용자는 이식편을 외래 물질로서 인식하고, 다양한 면역 반응이 이식편을 거부하고 제거하려는 작용을 시작한다. 이식편 거부반응은 이식편에 대한 수용자의 면역 반응을 지칭한다. 이식편 거부반응에서 작용하는 면역 반응은 (1) 이식 직후에 발생하는 강한 거부반응인 초급성 거부반응; (2) 이식후 수개월 이내에 관찰되는 급성 거부반응(가속화된 체액 거부반응과 de novo 급성 체액 거부반응과 같은 급성 혈관 거부반응 역시 포함됨); 그리고 (3) 이식후 수개월 시점에 관찰되는 만성 거부반응으로 구분될 수 있다. 거부반응은 정상적으로, T-세포 매개된 및/또는 체액 항체 공격의 결과이지만, 부가적인 이차 인자, 사이토킨과 다른 면역 세포, 예를 들면, 대식세포를 수반할 수 있다. 수용자의 면역 세포가 동종이식편 상에서 외래 물질로서 인식하는 분자는 동종항원(alloantigen)으로 불리고, 이종이식편에서 이들 분자는 이종항원(xenoantigen)으로 불린다. 동종항원 또는 이종항원과 반응하는 수용자의 림프구 또는 항체는 각각, 동종반응성(alloreactive) 또는 이종반응성(xenoreactive)인 것으로 기술된다.

세포 면역(cellular immunity)(T 세포로 대표되는 면역적격 세포(immunocompetent cell)에 기인)과 체액 면역(humoral immunity)(항체에 기인)은 이식편 거부반응에서 복잡하게 동조된 방식으로 작용한다(참조: Rocha et al. 2003 Immunol. Rev. 196: 51-64). 공여자 기관으로부터 항원에 대한 T 세포 반응은 일반적으로, 급성 거부반응을 매개하는 것으로 인정되고 있다. 동종이식에서, CD8+ 세포독성 T 세포는 동종이식편 상에서 및/또는 이식편 내에 백혈구(즉, 항원-제시 세포) 상에서 발현된 공여자 MHC 분자를 인식한다. 동종이식편이 클래스 I과 클래스 II 부위 둘 모두에서 수용자와 상이한 사례에서, MHC 분자의 인식은 CD8+과 CD4+ T 세포 둘 모두의 활성화로 이어진다. 동종유래 MHC 항원이 수용자의 CD4+/T 보조 세포를 촉진하는 신호를 제공하긴 하지만, 수용자 대식세포는 T 보조 세포의 활성에 필수적인 이차 신호, 인터류킨 1(IL-I)을 제공한다. 활성화된 T 보조 세포는 IL-2를 생산하는데, 이는 세포독성 T 세포와 림포카인(lymphokine)-활성화된 킬러 세포(killer cell)의 증식, 그리고 IL-4와 IL-6의 방출로 이어진다. 이에 더하여, IL-2는 인터페론 감마(interferon gamma), 그리고 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)와 다른 친염증성 사이토킨(proinflammatory cytokine)의 방출을 촉진한다.

APC(항원-제시 세포, 예를 들면, 수상돌기 세포) 역시 앞서 언급된 바와 같이, 이식편 거부반응에 관여한다. 동종이식편과 이종이식편 항원은 이식편을 침윤하는 수용자 APC에 의해 가공되고 간접적으로 제시될 수 있다. 공여자 항원을 제시하는 수용자 APC는 순환(circulation)을 통하여 림프절(lymph node)로 운반되고, 여기서 이들은 T 세포를 활성화시킨다. APC 활성은 림프구 증식과 궁극적으로, 공여자 이식편 내로 T 세포 침윤으로 이어진다.

이식편 거부반응에서 다른 면역 반응은 B-세포에 의해 매개되는, 항-공여자 항체(가령, 동종이식편의 경우에 동종항체)의 생산이다. 하지만, 이러한 반응은 B-세포 성장, 분화, 그리고 항체의 분비를 촉진하는 CD4+ T 세포의 활성을 필요로 한다. 내피 세포(endothelial cell) 상에서 발현된 MHC 항원에 동종항체의 결합은 보체와 응고(coagulation) 경로를 수반하는 복합적 반응을 활성화시키고, 궁극적으로 염증과 이식편 손상을 결과한다. 동종항체는 또한, 항체 분자의 Fc 영역을 통하여 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 매개한다. 동종항체와 보체의 활성은 이식편의 초급성, 급성 체액, 그리고 만성 거부반응에 중요하고, 공여자 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 항원에 대한 동종항체는 다양한 이식된 기관의 만성 거부반응과 연관된다.

이식편 거부반응의 결과로써, 이식편은 궁극적으로, 괴사된다. 더 나아가, 수용자는 열병(fever), 백혈구 증가증(leukocytosis)과 피곤(fatigue)과 같은 심각한 전신 증상(systemic symptom)뿐만 아니라 이식 부위에서 종기(swelling)와 압통(tenderness)이 발생한다. 감염과 같은 심각한 합병증 역시 발생할 수 있다.

면역적격 세포의 기능을 억제하는 한정된 숫자의 면역억제제가 이식편 거부반응을 억제하는데 이용되고 있다. 이런 면역억제제에는 시클로스포린(cyclosporine)(CsA); 타크롤리무스(tacrolimus)(FK-506); 아자티오프린(azathioprine)(AZ); 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)(MMF); 미조리빈(mizoribine)(MZ); 레플루노마이드(leflunomide)(LEF); 부신피질 스테로이드(adrenocortical steroid)(일명, 부신피질 호르몬(adrenocortical hormone), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 코르티코이드(corticoid)), 예를 들면, 프레드니솔론(prednisolone)과 메틸프레드니솔론(methylprednisolone); 시롤리무스(sirolimus)(일명, 라파마이신); 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin)(DSG); 그리고 FTY720(일명, Fingolimod, 화학명: 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]-1,3-프로판디올 염산염)이 포함된다. 또한, T 세포의 활성화에 필요한 보조자극 신호를 전달하는 역할을 하는 분자(costimulatory signal transduction molecule)인 CTLA-4와 CD28을 차단하는 작용제가 면역억제제로서 임상적으로 개발되고 있다; 이런 작용제에는 CTLA-4의 가용성 영역과 이를 인코딩하는 유전자를 이용하는 CTLA-4 약물이 포함된다.

일반적인 면역억제제, 예를 들면, 코르티코스테로이드와 사이토킨 길항물질은 독성과 감염에 대한 감소된 저항력을 비롯한 바람직하지 않은 부작용을 유발할 수 있다. 따라서 자가면역(autoimmunity)을 치료하고 이식편 생존을 촉진하는 대안적인, 그리고 더욱 특이적인 방법이 요구된다.

면역억제를 유도하고 이식편 생존을 촉진하는 것으로 생각되는 한 가지 분자는 OX-2, 또는 CD200이다. CD200은 B 세포, 일부 T 세포, 수상돌기 세포와 다른 세포의 표면 상에서 발현되고, 면역글로불린 유전자 집단(immunoglobulin gene family)의 분자에 고도의 상동성(homology)을 보유한다. CD200은 면역 억제에 관여하고, 예로써 CD200-발현 세포는 Th1 사이토킨 생산의 자극을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Gorczynski et al., 1998 Transplantation 65: 1106-1114). 이에 더하여, 가용성 CD200은 생쥐에서 동종-과 이종이식편 생존을 촉진하고 생쥐에서 양 적혈구(sheep erythrocyte)에 대한 항체 반응을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Gorczynski et al. 1999 J. Immunol. 163: 1654-1660). 더 나아가, CD200-적중(knockout) 생쥐는 야생형 생쥐와 비교하여 APC 활성화를 하향-조절하는 감소된 능력을 나타내고, 중추신경계(central nervous system)에서 만성 염증, 초염증 반응, 그리고 일정한 실험적 자가면역 질환에 대한 증가된 감수성(susceptibility)을 유발한다(Hoek et al. 2000 Science 290: 1768-1771). CD200의 면역억제 효과는 단핵구/골수 계통(lineage)의 세포와 T-림프구 기원의 세포 상에서 발현되는 수용체인 CD200R에 CD200 결합의 결과인 것으로 생각된다(Hoek et al. supra; Gorczynski et al. 2000 J. Immunol. 165: 4854).

CD200이 면역억제 효과를 유도하는 것으로 밝혀지긴 했지만, CD200에 대한 항체는 이들 면역억제 효과를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 가령, 항-CD200 항체(항-CD200 F(ab')₂ 단편 포함)는 생쥐에서 쥐 도세포 이종이식편의 CD200Fc-유도된 연장된 생존을 소멸시켰다(Gorczynski et al. 2002 Transplantation. 73: 1948-53).

앞서 언급된 공개된 보고서에 대조적으로, 본 발명에서는 항-CD200 항체와 항-CD200 항체를 포함하는 조성물이 이식편 생존을 촉진한다는 것을 증명한다. 따라서 본 발명에서는 이식편 거부반응을 저해하고 이식편 생존을 촉진하는 신규한 조성물과 방법을 제시한다.

요약

본 발명은 항-CD200 항체의 투여가 면역 공격(immunological challenge), 예를 들면, 이식된 조직 또는 기관에 대한 면역학적 반응을 저해할 수 있다는 발견에 관계한다. 따라서 본 발명의 목적은 면역학적 반응을 억제, 치료 또는 예방하는 방법과 제약학적 작용제를 제시하는 것인데, 특정 구체예에서, 면역학적 반응은 세포, 조직 또는 기관의 이식을 동반한다(가령, 이식편 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환). 또한, 면역학적 반응은 이식된 세포, 조직 또는 기관의 수용자에서 후기 시점에, 예를 들면, 거부반응 에피소드 동안(rejection episode) 동안 발생할 수 있다. 본 발명의 방법과 작용제는 CD200의 생물학적 기능을 조절하거나, 또는 CD200을 발현하는 세포의 활성을 조절하기 위하여 의학적 기술과 제약학적 기술(가령, 제약학적 작용제, 예를 들면, 저분자량 화합물과 항체)을 이용할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 CD200에 특이적으로 결합하는 작용제에 관계한다. CD200-결합제에는 폴리펩티드, 소형 분자, 유기금속 화합물, 면역조절제, 항체, 항체의 항원-결합 단편, 프로드러그(prodrug) 및/또는 펩티드모방체 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상기 작용제는 CD200과 CD200 수용체(CD200R)의 상호작용을 저해 또는 감소시키거나, 또는 감소시키지 않는다.

특정 구체예에서, CD200에 특이적으로 결합하는 작용제는 항-CD200 항체이다. 본 명세서에서, 항체에는 단클론과 다클론 항체, 조작된 항체(키메라 항체, 단일 사슬 항체, CDR-합체된 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 면역-제거된 항체, 그리고 인위적으로 선택된 항체), 그리고 합성 또는 반합성 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 항체에는 또한, 항체의 다른 변형과 유도체(가령, 분리된 또는 재조합 항체, 항체 접합체 또는 항체 유도체), 그리고 뮤린, 키메라, 인간, 인간화, 영장류화(primatized) 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 또한, 항원-결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab^')₃, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb), 다른 일가(monovalent)와 이가(divalent) 단편, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-사슬 항체(가령, scFv, scFab, scFabΔC), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody), CD200에 특이적인 결합을 공여할 만큼 충분한, 항체의 최소한 일부분을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 이들의 융합체와 유도체가 포함된다. 특정 측면에서, 본 발명은 키메라, 인간화, 인간과 면역-제거된 항-CD200 항체, 그리고 이들의 항원-결합 단편에 관계한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA, IgD 및/또는 IgE 골격(framework)을 포함하는 항체에 관계한다.

특정 구체예에서, CD200에 특이적으로 결합하는 작용제는 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제이다. 일부 구체예에서, CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 작동체 기능을 나타내고, 다른 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 감소된 작동체 기능을 나타내거나 작동체 기능이 부재한다. 다른 구체예에서, 상기 작용제는 가용성 CD200R 또는 비-작동성(non-agonistic) 가용성 CD200이다.

따라서 특정 구체예에서, 본 발명은 병든 개체에서 면역 반응을 저해하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 i) CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제와 ii) 면역억제제 또는 면역조절제 또는 약물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 체액 반응이다. 다른 구체예에서, 면역 반응은 항체 매개된 반응이다. 상기 작용제는 일부 구체예에서, 작동체 기능을 나타낸다. 대안으로, 상기 작용제는 감소된 작동체 기능을 나타내거나, 또는 작동체 기능이 부재한다. 특정 구체예에서, 상기 작용제는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 다른 구체예에서, 상기 작용제는 가용성 CD200R 또는 비-작동성 가용성 CD200이다. 상기한 임의의 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 T 세포, B 세포, T와 B 세포 둘 모두, 또는 다른 면역 세포를 표적한다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 시클로스포린 A 또는 라파마이신이다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 병든 개체에서 체액 면역 반응을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이런 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 그리고 면역-제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군에서 선택된다. 항원-결합 단편은 또한, 단일-사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab')₃, Fd, Fv, 도메인 항체, 그리고 CD200에 특이적인 결합을 공여하는 항-CD200 면역글로불린의 임의의 단편으로 구성된 군에서 선택될 수도 있다. 상기한 임의의 항체 또는 항원-결합 단편은 분자, 예를 들면, 중합체 또는 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 중합체는 일부 구체예에서, 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)일 수 있다.

체액 면역 반응의 저해에는 예로써, 아래의 반응 중에서 하나 이상의 저해가 포함될 수 있다: a) APC에 의한 항원 제시; b) 보조(CD4+) T 세포의 활성화; c) 보조(CD4+) T-세포의 증식; d) B 세포의 분화; e) B 세포의 증식; 그리고 f) 항체의 B-세포 생산. 특정 구체예에서, 상기 방법은 B-세포 항체의 생산에서 감소를 결과하는데, 여기서 상기 항체는 IgG, IgM, IgG1, 그리고 IgG2a 면역글로불린에서 선택된다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 병든 개체에서 체액 면역 반응을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 면역조절제 또는 면역억제제를 상기 개체에 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 면역조절제 또는 면역억제제는 T 세포, B 세포, T와 B 세포 둘 모두, 또는 다른 면역 세포를 표적화할 수 있다. 특정 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 칼시뉴린 저해물질이다. 다른 구체예에서, 칼시뉴린 저해물질은 타크롤리무스와 시클로스포린 A에서 선택된다.

다른 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 단편과 공동으로 투여되는 면역조절제 또는 면역억제제는 아드리아마이신(adriamycin), 아자티오프린(azathioprine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine) A, 시톡산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 비-스테로이드성 소염제, 시롤리무스(sirolimus)(rapamycin), 그리고 타크롤리무스(tacrolimus)로 구성된 군에서 선택된다. 대안적 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 무로모납(muromonab)-CD3, 알렘투주맙(alemtuzumab), 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab), 리툭시맙(rituximab), 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)과 IVIg로 구성된 군에서 선택되는 항체이다. 특정 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 보체 경로(complement pathway)의 저해물질이 아니다(가령, 상기 작용제는 항체(가령, 항-C5 항체) 또는 보체 활성을 저해하는 분자가 아니다).

본 발명에 개시된 방법의 특정 구체예에서, 체액 면역억제가 필요한 개체는 포유동물이고, 다른 구체예에서 상기 개체는 인간 개체이다. 특정 구체예에서, 상기 개체는 이식을 받았거나, 또는 받을 예정이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 병든 개체에서 순환 B 세포의 총수를 감소시키는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 구체예에서, 본 발명은 병든 개체에서 활성화된 CD200-양성 T 세포의 총수를 감소시키는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 더 나아가, 일부 구체예는 병든 개체에서 B 세포 활성화를 저해하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 가령, 상기 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편과 상기 작용제는 개체에서 순환 면역글로불린의 양을 감소시킬 만큼 충분한 양으로 투여된다. 상기한 임의의 구체예에서, 개체는 포유동물, 예를 들면, 영장류 또는 인간 개체이다. 임의적으로, 개체는 세포, 조직 또는 기관 이식을 받았거나, 또는 받을 예정이다.

특정 측면에서, 본 발명은 이식편 수용자에서 이식편 거부반응을 저해하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제의 치료 효과량을 상기 수용자에 투여하는 단계를 포함한다. 치료 효과량은 이식편 거부반응을 저해하는데 효과적인, a) 항-CD200 항체와 b) 면역조절제 또는 면역억제제의 병합의 양을 지칭한다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 그리고 면역-제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군에서 선택된다. 항원-결합 단편은 또한, 단일-사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab')₃, Fd, Fv, 도메인 항체, 그리고 CD200에 특이적인 결합을 공여하는 항-CD200 면역글로불린의 임의의 단편으로 구성된 군에서 선택될 수도 있다. 상기한 임의의 항체 또는 항원-결합 단편은 분자, 예를 들면, 중합체 또는 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 중합체는 일부 구체예에서, 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)일 수 있다.

이식편 거부반응을 저해하는 특정 구체예에서, 상기 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 상기 면역조절제 또는 면역억제제는 이식 이전에 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 항체와 작용제는 이식 시점에 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 항체와 작용제는 이식 이후에 투여된다. 일부 구체예에서, 이식편 거부반응은 이식된 세포, 조직 또는 기관의 급성 체액 거부반응이다. 다른 구체예에서, 이식편 거부반응은 이식된 세포, 조직 또는 기관의 만성 체액 거부반응이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 이식편 수용자는 조혈 세포 또는 골수 이식, 췌장 도세포의 동종유래 이식, 또는 심장 이식, 신장-췌장 이식, 신장 이식, 간 이식, 폐 이식, 그리고 췌장 이식으로 구성된 군에서 선택되는 고형 기관(solid organ) 이식의 수용자이다. 이식편의 추가적인 실례에는 동종이식된 세포, 조직 또는 기관, 예를 들면, 혈관 조직, 눈, 각막, 렌즈, 피부, 골수, 근육, 연결 조직, 위장 조직, 신경 조직, 뼈, 줄기 세포, 연골, 간세포, 또는 조혈 세포(hematopoietic cell)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

이식편 거부반응을 저해하는 일부 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 T 세포 또는 B 세포, 또는 T 세포와 B 세포 둘 모두를 표적화하는 작용제이다. 특정 구체예에서, 상기 작용제는 보체 경로(complement pathway)를 표적화하지 않고 및/또는 보체-매개된 면역 반응을 저해하지 않는다. 특정 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 칼시뉴린 저해물질이다. 다른 구체예에서, 칼시뉴린 저해물질은 타크롤리무스와 시클로스포린 A에서 선택된다.

이식편 거부반응을 저해하는 추가적인 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 아드리아마이신(adriamycin), 아자티오프린(azathioprine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine) A, 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 비-스테로이드성 소염제, 시롤리무스(sirolimus)(rapamycin), 그리고 타크롤리무스(tacrolimus)(FK-506)로 구성된 군에서 선택된다. 대안적 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 무로모납(muromonab)-CD3, 알렘투주맙(alemtuzumab), 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab), 리툭시맙(rituximab), 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)과 IVIg로 구성된 군에서 선택되는 항체이다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체와 면역조절제 또는 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법은 이식편 수용자에서 체액 면역 반응의 저해를 결과한다. 가령, 특정 구체예에서, 상기 방법은 항-공여자 항체의 생산에서 감소를 결과한다. 항-공여자 항체는 IgG, IgM, IgG1, 그리고 IgG2a 면역글로불린에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 이식편 수용자는 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 급성 이식편 거부반응을 나타내거나, 또는 이로부터 고통받는다. 다른 구체예에서, 이식편 수용자는 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 만성 이식편 거부반응을 나타내거나, 또는 이로부터 고통받는다.

다른 구체예에서, 항-CD200 항체와 면역조절제 또는 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법은 이식편 수용자에서 세포 면역 반응의 저해를 결과한다. 가령, 특정 구체예에서, 상기 방법은 골수 조직에서 수용자 CD4+와 CD8+ T 세포의 생산에서 감소를 결과한다. 일부 구체예에서, 이식편 수용자는 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 급성 이식편 거부반응을 나타내거나, 또는 이로부터 고통받는다. 다른 구체예에서, 이식편 수용자는 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 만성 이식편 거부반응을 나타내거나, 또는 이로부터 고통받는다.

특정 측면에서, 본 발명은 이식편 수용자에서 이식편 거부반응을 치료 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제의 치료 효과량을 상기 수용자에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 이식편 수용자에서 이식편 생존을 촉진 또는 연장하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 (b) 면역조절제 또는 면역억제제의 치료 효과량을 상기 이식편 수용자에 투여하는 단계를 포함한다. 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 그리고 면역-제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군에서 선택된다. 항원-결합 단편은 또한, 단일-사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab')₃, Fd, Fv, 도메인 항체, 그리고 CD200에 특이적인 결합을 공여하는 항-CD200 면역글로불린의 임의의 단편으로 구성된 군에서 선택될 수도 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 이식편 생존을 연장 또는 촉진하는 방법은 대조 수용자에서 관찰되는 이식편 생존과 비교하여, 수용자에서 이식편 생존을 최소한 대략 15%, 최소한 대략 20%, 최소한 대략 25%, 최소한 대략 30%, 최소한 대략 40%, 또는 최소한 대략 50% 증가시킨다. 대조 수용자는 예로써, 이식후 치료를 받지 않는 이식편 수용자, 또는 이식후 단독요법(monotherapy)이 제공되는 이식편 수용자이다.

특정 구체예에서, 이식편 생존을 촉진하는 방법은 장기 이식편 생존을 촉진하는데, 여기서 장기 이식편 생존은 이식후 최소한 대략 6개월, 이식후 최소한 대략 1년; 이식후 최소한 대략 5년; 이식후 최소한 대략 7.5년; 그리고 이식후 최소한 대략 10년으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 본 발명에 개시된 요법은 수용자의 여생 동안 이식편의 적응(accommodation)과 이식편 생존을 촉진한다.

본 발명의 임의의 구체예에서, 이식편 수용자는 영장류 이식편 수용자, 예를 들면, 비-인간 영장류 이식편 수용자이다. 다른 구체예에서, 이식편 수용자는 인간 이식편 수용자이다.

본 명세서에 기술된 임의의 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 개체 또는 이식편 수용자에 전신 투여될 수 있다. 대안으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 개체 또는 이식편 수용자에 국소 투여될 수도 있다.

항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 면역조절제 또는 면역억제제의 병합을 포함하는 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 면역조절제 또는 면역억제제는 순차적으로 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편과 작용제는 동시에 투여된다.

본 출원에서는 상기한 임의의 측면과 구체예의 병합을 고려한다. 본 명세서에 언급된 모든 참고문헌과 문서는 순전히 참조로서 편입된다.

상세한 설명

I. 개요

A. 이식물 또는 이식편의 거부반응

초급성 거부반응(hyperacute rejection)은 이식후 수분 내지 수시간 이내에 발생하고 이식된 조직 항원에 대한 기 형성된 항체에 기인한다. 이는 이식편 맥관구조(vasculature)의 출혈(hemorrhage)과 혈전성 폐색(thrombotic occlusion)으로 특징된다. 내피(endothelium)에 항체의 결합은 보체(complement)를 활성화시키고, 항체와 보체는 이식편 내피에서 다수의 변화를 유도하고, 이들 변화는 혈관내 혈전증(intravascular thrombosis)을 촉진하고 혈관 폐색(vascular occlusion)으로 이어지며, 결과적으로 이식된 기관의 비가역적 허혈 손상(irreversible ischemic damage)을 유발한다(Abbas et al., 2000 Cellular and Molecular Immunology (4th edition), p. 363-383 (W. B. Saunders Company, New York)). 초급성 거부반응은 종종, 이미 존재하는 IgM 동종항체, 예를 들면, 적혈구 세포 상에서 발현된 ABO 혈액 그룹 항원을 지향하는 항체에 의해 매개된다. 자연 항체(natural antibody)에 의해 매개되는 이러한 유형의 거부반응은 이종이식 거부반응의 주요 원인이다. 자연 IgM 항체에 기인한 초급성 거부반응은 동종이식편에서 더 이상 문제가 되지 않는데, 그 이유는 동종이식편이 통상적으로, 공여자와 수용자 ABO 타입과 매치되도록 선택되기 때문이다. ABO 매치된 동종이식편의 초급성 거부반응은 여전히 발생할 수 있고, 통상적으로 단백질 동종항원, 예를 들면, 외래 MHC 분자, 또는 혈관 내피 세포 상에서 발현되는 충분히 정의되지 않은 동종항원을 지향하는 IgG 항체에 의해 매개된다. 이런 IgG 항체는 예로써, 수혈(blood transfusion), 이전 이식, 또는 다태 임신(multiple pregnancy)을 통한 동종항원에 이전 노출의 결과로써 발생할 수 있다.

급성 거부반응은 T 세포, 대식세포와 항체에 의해 매개된 혈관과 실질(parenchymal) 손상의 과정이고, 통상적으로 이식후 첫 주 시점에 발생한다(Abbas et al., supra). T 림프구는 혈관 내피와 실질 세포 상에 존재하는 MHC 분자를 비롯한 동종항원에 반응함으로써 급성 거부반응에서 중심적인 역할을 수행한다. 활성화된 T 세포는 이식편 세포의 직접적인 용해를 유도하거나, 또는 괴사(necrosis)를 유발하는 염증성 세포를 동원하고 활성화시키는 사이토킨을 생산한다. CD4⁺와 CD8⁺ T 세포 둘 모두 급성 거부반응의 원인이 된다. 이식편 내에서 동종유래 세포의 파괴는 고도로 특이적이고 CD8⁺ 세포독성 T 림프구 사멸의 징표이다. CD4⁺ T 세포는 사이토킨을 분비하고 이식편 내에서 지연형 과민증(delayed-type hypersensitivity)-유사 반응을 유도함으로써 급성 이식편 거부반응을 매개하는데 중요하다; 일부 증거는 CD4⁺ T 세포가 급성 거부반응을 매개하는데 충분하다는 것을 암시한다(Abbas et al., supra). 항체는 또한, 생산되는 항체가 혈관 벽에 결합하고 보체를 활성화시킬 때, 이식편 수용자가 이들 혈관 벽 항원에 대한 체액 면역 반응을 개시한 이후에 급성 거부반응을 매개할 수도 있다(Abbas et al., supra).

만성 거부반응은 연장된 기간 동안 발생하는 정상 기관 구조의 상실을 수반하는 섬유증(fibrosis)으로 특징된다. 만성 거부반응의 병인(pathogenesis)은 급성 거부반응의 병인만큼 충분히 알려져 있지 않다. 이식편 동맥 폐색은 내막 평활근(intimal smooth muscle) 세포의 증식의 결과로써 발생한다(Abbas et al., supra). 이러한 과정은 가속화된 또는 이식편 동맥경화증(arteriosclerosis)으로 불리고 이식후 6개월 내지 1년 이내에 임의의 혈관발달된 기관 이식에서 발생할 수 있다.

동종이식편은 부분적으로, T 세포의 활성화에 의해 거부된다. 이식물 수용자는 동종이식편 내에서 외래 항원의 CD4⁺ T 세포 인식 이후에 거부반응 반응을 개시한다. 이들 항원은 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)에 의해 인코딩되는데, 이러한 복합체에는 클래스 I과 클래스 II MHC 분자가 존재한다. 인간에서 클래스 I MHC 분자는 HLA-A, HLA-B와 HLA-C이다. 인간에서 클래스 II MHC 분자는 HLA-DR, HLA-DQ와 HLA-DP로 불린다. 생쥐에서, 클래스 I MHC 분자는 H-2K, H-2D와 H-2L이고, 클래스 II MHC 분자는 I-A와 I-E이다. CD4⁺ T 세포가 가공된 또는 본래 외래 MHC 항원에 결합할 때, 이들은 활성화되고 클론 증식(clonal proliferation)을 겪는다. 이들 활성화된 T 세포는 단핵구/대식세포, B 세포와 세포독성 CD8⁺ T 세포를 활성화시키는데 도움을 주는 사이토킨을 분비한다. 이들 활성화된 단핵구/대식세포는 조직 손상을 유발하는 작용제를 방출하고, B 세포는 보체-매개된 이식편 파괴로 이어지는 동종항체를 생산하고, 그리고 CD8⁺ T 세포는 아폽토시스(apoptosis)와 세포 용해(cell lysis)의 유도를 통하여 항원-특이적 방식으로 이식편 세포를 사멸시킨다.

이식편 거부반응에서 체액 면역의 중요성은 초기에, 이식편 수용자가 이식 이전에 항-공여자 HLA 항체를 보유하고, 따라서 항체 억제의 효과적인 치료 섭생이 없으면 이식편이 급속하게 파괴되는 초급성 거부반응에 한정되는 것으로 생각되었다. 최근에, 체액 면역은 급성과 만성 거부반응 둘 모두를 매개하는 중요 인자(important factor)인 것으로 확인되고 있다. 가령, 임상적 관찰 결과로써, 클래스 I 또는 클래스 II 항-HLA 동종항체(일명, "항-MHC 동종항체")가 발생할 수 있는 환자에서 이식편 생존은 이런 항체가 발생할 수 없는 환자에서 이식편 생존과 비교하여 감소하는 것으로 증명되었다. 임상 데이터와 실험 데이터에서는 또한, 다른 공여자-특이적 동종항체와 자기항체가 거부반응의 중요한 매개인자임을 암시한다. 동종이식편 거부반응에서 공여자-특이적 항체의 역할을 뒷받침하는 증거에 관한 검토를 위하여, Rifle et al., Transplantation, 2005 79:S14-S18을 참조한다.

B. 면역억제제

이식이 성공하기 위하여, 여러 방식의 거부반응이 극복되어야 한다. 이런 이유로, 거부반응을 예방 또는 저해하는데 복수의 접근법이 이용된다. 이식편 거부반응의 저해는 다양한 방식의 공격을 예방하거나 저해하기 위하여, 예를 들면, T-세포 공격을 저해하고, 항체 반응을 저해하고, 그리고 사이토킨과 보체 효과를 저해하기 위하여 종종 여러 유형의 면역억제제의 투여를 필요로 한다. 공여자와 수용자를 매치시키기 위한 사전 스크리닝(prescreening) 역시 거부반응, 특히 초급성 거부반응을 예방하는데 중요한 인자이다. 이식에 앞서 항-HLA 항체의 면역흡착(immunoadsorption)은 초급성 거부반응을 감소시킬 수 있다. 이식 이전에, 수용자 또는 호스트는 항-T 세포 반응물, 예를 들면, 단클론 항체 OKT3, 항-흉선세포 글로불린(anti-Thymocyte Globulin, ATG), 시클로스포린(cyclosporine) A, 또는 타크롤리무스(tacrolimus)(FK 506)가 투여될 수 있다. 부가적으로, 이식 이전에 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 및/또는 아자티오프린(azathioprine)(또는 다른 퓨린 유사체)이 호스트에 투여될 수 있다. 이식 거부반응을 예방 또는 저해하는데 도움을 주는데 이용되는 약물에는 ATG 또는 ALG, OKT3, 다클리주맙(daclizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 15-데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), LF15-0195, 시클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 퓨린 유사체(purine analog), 예를 들면, 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 브레디닌(bredinin), 브레퀴나르(brequinar), 레플루노마이드(leflunomide), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시롤리무스(sirolimus), 항-CD4 단클론 항체, CTLA4-Ig, 리툭산(rituxan), 항-CD154 단클론 항체, 항-LFA1 단클론 항체, 항-LFA-3 단클론 항체, 항-CD2 단클론 항체, 그리고 항-CD45가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

이식편 거부반응을 지연시키는 이용되는(즉, 이식편 생존을 연장시키는데 이용되는) 다수의 약물은 다양한 방식으로 작용한다. 여러 면역억제제의 작용 기전에 관한 검토를 위하여 Stepkowski (2000). Exp. Rev. Mol. Med. 21 June, world wide web at expertreviews.org/00001769h.htm을 참조한다.

시클로스포린 A는 이식편 거부반응을 저해하기 위한 가장 폭넓게 이용되는 면역억제제 중의 하나이다. 이는 인터류킨-2 또는 IL-2의 저해물질이다(이는 인터류킨-2의 mRNA 전사를 예방한다). 더욱 직접적으로, 시클로스포린은 T 세포 수용체 자극 이후에 정상적으로 발생하는 칼시뉴린 활성화를 저해한다. 칼시뉴린은 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자)를 탈인산화(dephosphorylation)시키고, 따라서 NFAT가 핵으로 들어가 인터류킨-2 프로모터에 결합할 수 있도록 한다. 이러한 과정을 차단함으로써, 시클로스포린 A는 CD4⁺ T 세포의 활성화 및 만약 그렇지 않으면 발생하게 되는 일련의 현상을 저해한다. 타크롤리무스는 칼시뉴린 저해를 통하여 인터류킨-2의 생산을 저해함으로써 작용하는 다른 면역억제제이다.

라파마이신(Sirolimus), SDZ RAD, 그리고 인터류킨-2 수용체 차단제는 인터류킨-2의 작용을 저해하고, 따라서 앞서 기술된 일련의 현상을 예방하는 약물이다.

퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 생합성(biosynthesis)의 저해물질 역시 이식편 거부반응을 저해하는데 이용된다. 이들 저해물질은 DNA 합성을 예방하고, 따라서 T 세포 증식을 비롯한 세포 분열(cell division)을 저해한다. 결과적으로, 새로운 T 세포의 형성을 예방함으로써 T 세포 활성을 저해한다. 퓨린 합성의 저해물질에는 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 미페틸(mycophenolate mofetil, MMF)과 미조리빈(mizoribine)(bredinin)이 포함된다. 피리미딘 합성의 저해물질에는 브레퀴나르 나트륨(brequinar sodium)과 레플루노마이드(leflunomide)가 포함된다. 시클로포스파미드(cyclophosphamide)는 퓨린과 피리미딘 합성 둘 모두의 저해물질이다.

T 세포 활성화를 저해하는 또 다른 방법은 T 세포에 대한 항체로 수용자를 치료하는 것이다. OKT3은 T 세포 수용체의 일부인 CD3에 대한 뮤린 단클론 항체이다. 상기 항체는 먼저, T 세포 수용체를 통하여 T 세포를 활성화시키고, 이후 활성화된 T 세포의 아폽토시스를 유도한다.

동종이식 거부반응을 지연시키는 다수의 다른 약물과 방법이 당업자에게 공지되어 있고 이들에 의해 이용되고 있다. 한 가지 접근법은 예로써, 방사선요법으로 T 세포를 격감시키는 것이다. T 세포의 격감은 특히, 주요 HLA의 부분적인 미스매치(partial mismatch)가 존재하는 경우에 골수 이식에 종종 이용되고 있다. 수용자에 CD40 리간드-CD40 상호작용의 저해물질(차단제) 및/또는 CD28-B7 상호작용의 차단제의 투여 또한 이용되고 있다(U.S. Patent 6,280,957). 공개된 PCT 특허 출원 WO 01/37860에서는 Th1 면역 반응을 저해하기 위한 항-CD3 단클론 항체와 IL-5의 투여를 개시한다. 공개된 PCT 특허 출원 WO 00/27421에서는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)-α 길항물질을 투여함으로써 각막 이식 거부반응의 예방 또는 치료를 위한 방법을 교시한다. Glotz et al., 2002 Am. J. Transplant. 2:758-760에서는 정맥내 면역글로불린(IVIg)의 투여가 항-HLA 항체의 역가에서 현저하고 지속적인 감소를 유도할 수 있고, 따라서 HLA-미스매치된 기관의 생존을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 유사한 프로토콜에는 혈장 교체(plasma exchange)(Taube et al., 1984 Lancet 1 :824-828), 또는 면역억제제에 결부된 면역흡착 기술(Hiesse et al., 1992 Nephrol. Dial. Transplant. 7:944-951), 또는 이들 방법의 병합(Montgomery et al., 2000 Transplantation 70:887-895)이 포함된다. Changelian et al., 2003 Science 302:875-878에서는 면역억제가 통상의 감마 사슬(γc)을 이용하는 사이토킨 수용체(인터류킨 -2, -4, -7, -9, -15, -21)의 적절한 신호전달에 필요한 효소인 야누스 키나아제(Janus kinase) 3(JAK3)의 경구 저해물질에 의해 유발되고, 결과적으로 T 세포 활성화가 저해되는 모형을 교시한다. ICAM-I에 대한 안티센스 핵산은 심장 동종이식편 이식의 연구에서 단독으로, 또는 백혈구-기능 연관된(leukocyte-function associated) 항원 1(LFA-1)에 특이적인 단클론 항체와 공동으로 이용되고 있다(Stepkowski, supra). 유사하게, 항-ICAM-I 항체는 심장 동종이식편을 치료하기 위하여 항-LFA-1 항체와 공동으로 이용되고 있다(Stepkowski, supra). 부가적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 쥐 심장 또는 신장 동종이식편 모형에서 시클로스포린과 공동으로 이용되고, 이식편의 생존을 연장시키는데 상승효과를 결과한다(Stepkowski, supra). 만성 이식 거부반응은 분화, 증식, 그리고 아폽토시스에 관여하는 사이토킨인 TGF-β의 길항물질을 투여함으로써 치료되고 있다(U.S. Patent Application Publication US 2003/0180301).

C. CD200과 면역억제

면역 반응을 억제하는데 관여하는 것으로 생각되는 다른 기전은 분자 CD200을 필요로 한다. CD200은 면역계 세포(가령, T-세포, B-세포와 수상돌기 세포 (Barclay et al., 2002 TRENDS Immunol. 23:285-290)), 그리고 특정 암 세포를 비롯한 다양한 세포 유형에서 발현되는 고도로 보존된 I형 막통과 당단백질(transmembrane glycoprotein)이다. 상기 단백질은 골수 세포(myeloid cell)와 T 세포의 하위-개체군 상에서 수용체 CD200R과 상호작용한다(Wright et al. 2003 J. Immunol. 171: 3034-3046; Wright et al., 2000 Immunity 13:233-242); 이러한 CD200:CD200R 상호작용은 면역조절 신호를 세포에 전달하고 아폽토시스-연관된 면역 관용(immune tolerance)을 비롯한 면역억제를 유도한다(Rosenblum et al. 2004 Blood 103: 2691-2698).

기존 연구, 특히 Gorczynski 등에 의한 다수의 논문에서는 CD200이 면역억제성임을 암시하였다. 가령, Gorczynski et al., Clin. Immunol. 104:256-264 (2002)에서는 생쥐 콜라겐-유도된 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모형에서, 가용성 CD200(CD200Fc)으로 치료가 CIA를 개선한다는 것을 교시한다. 이식 환경(transplant setting)에서, Gorczynski et al., Eur. J. Immunol. 31: 2331-2337 (2001)에서는 가용성 CD200 단백질이 동종이식편 생존을 촉진하는 반면, 항-CD200 항체가 면역억제를 예방하고 동종이식편 생존의 단축된 기간을 유발한다고 보고한다.

기존 보고서에 대조적으로, 본 발명에서는 항-CD200 항체의 투여가 이식편 생존을 촉진한다는 것을 증명한다. 임의의 특정 작용 기전에 한정됨 없이, 이식편의 연장된 생존은 T-세포의 사멸 또는 비활성화(inactivation) 및/또는 B-세포 활성의 저해(가령, 이식편에 대한 체액 반응의 저해)에 기인할 수 있다. 가령, CD200은 휴면 세포(resting cell) 상에서 더욱 낮은 수준의 발현과 비교하여 활성화된 T와 B 세포 상에서 고도로 발현된다. 따라서 항-CD200 항체의 투여는 활성화된 T 세포와 B 세포를 항체로 코팅시켜 이들 세포가 항체-매개된 세포 세포독성(antibody-mediated cell cytotoxicity(ADCC), 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 및/또는 다른 작동체 기능, 예를 들면, 아폽토시스에 민감해지도록 만들 수 있다. 이런 이유로, 항체 투여의 한 가지 가능한 결과는 활성화된 면역 세포의 사멸과 면역 반응의 억제일 수 있다. 하지만, 하기에 기술된 바와 같이, 이러한 효과는 작동체 기능을 갖는 항체뿐만 아니라 작동체 기능이 부재하는 항체에서도 관찰된다. 이런 이유로, B 및/또는 T 세포의 사멸이 관련되는 경우에, 작동체 기능은 줄거리의 일부에 불과한 것으로 보인다. 하기에서 확인되는 바와 같이, 작동체 기능을 갖는 또는 작동체 기능을 갖지 않는 항체를 이용하는 지에 상관없이, CD200과 CD200 수용체(CD200R)의 상호작용 저해는 면역 반응을 억제하고 이식편 생존을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 자가면역 질환을 개선하는 데에도 이용될 수 있다. 다시 말하면, 임의의 특정 작용 기전에 한정됨 없이, CD200R에 CD200의 결합의 저해는 중요한 첫 번째 단계인 것으로 보인다.

따라서 항-CD200 항체 투여는 아래의 기전 중에서 하나 이상을 통하여 이식편 생존을 연장시킬 수 있다: (i) 항체 생산의 저해(가령, 예로써 B 세포의 사멸에 의한 B 세포의 총수에서 감소를 통하여); (ii) 예로써, T 세포의 총수에서 감소(가령, T 세포 사멸)에 의한 사이토킨 생산(가령, TNF-α와 IL-12의 생산)의 변경; (iii) 정맥내 면역글로불린(IVIg) 효과의 유도(가령, 세포 표면으로부터 떨어진 가용성 CD200은 항-CD200 항체에 결합하여 복합체를 형성할 수 있다); (iv) 차후에 면역 세포의 무기력(anergy)을 유발하는 항원 제시의 간섭; (v) 면역 조절의 유도; 및/또는 (vi) 면역촉진성인 다른 미지의 CD200 상호작용의 활성의 저해 또는 차단. 이러한 후자 기전에 대한 가능한 시나리오로서, 상이한 CD200 수용체가 존재하고(가령, 5개의 수용체가 생쥐에서 알려져 있고, 2개의 수용체가 인간에서 알려져 있다), 그리고 이들 상이한 수용체가 상이한 신호전달 기전(가령, 확대된 세포질 도메인 vs. 어댑터 단백질(adapter protein), 예를 들면, DAP12)을 이용하는 것이다 (Wright et al. J. Immunol., 2003, 171: 3034-3046). 따라서 상이한 CD200R에 의해 매개된 상이한 신호전달 경로가 면역계에 대한 반대 효과를 나타낼 가능성도 있다. 부가적으로 또는 대안으로, CD200의 면역억제 활성이 CD200:CD200R 상호작용을 통하여 매개되는 것으로 생각되긴 하지만, 항-CD200 수용체 항체가 CD200 수용체를 가교 연결(cross linking)하고, 따라서 상기 수용체를 활성화시키고 면역 억제를 유도할 수도 있다.

II. CD200-결합제

본 발명은 이식편 거부반응을 저해 또는 예방하고 이식편 생존을 연장하기 위한 조성물과 방법에 관계한다. 특정 측면에서, 본 발명은 CD200-결합제에 관계한다. 본 명세서에서, CD200-결합제는 CD200에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. CD200-결합제의 실례에는 폴리펩티드, 항체, 소형 분자, 그리고 펩티드모방체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 구체예에서, 이들 CD200-결합제는 CD200과 CD200R의 상호작용을 파괴한다. 다른 구체예에서, 이들 CD200-결합제는 격감 또는 제거를 위하여 CD200-발현 세포를 표적할 수 있다.

특정 측면에서, 이들 CD200-결합제는 폴리펩티드이다. 본 발명에 이용되는 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 상이한 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 화학적 합성으로 획득된다. 다른 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 하나 이상의 항체의 단편 또는 복수 단편으로부터 작제된 항체이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 본 발명에 개시된 항-CD200 항체이다.

따라서 특정 구체예에서, 이들 CD200-결합제는 항-CD200 항체이다. 본 명세서에서, "항체"는 CD200에 결합할 수 있는 완전 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 여기에는 단클론과 다클론 항체, 조작된 항체(키메라 항체, 단일 사슬 항체, CDR-합체된 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 인위적으로 선택된 항체 포함), 파지 전시 또는 대체 기술을 이용하여 생산된 합성이나 반-합성 항체, 그리고 항체의 다른 변형과 유도체(가령, 분리된, 재조합 또는 합성 항체, 항체 접합체 또는 항체 유도체, 그리고 항원-결합 단편이 포함된다. 또한, 뮤린, 키메라, 인간, 인간화, 영장류화(primatized) 항체가 포함된다. 항원-결합 단편에는 예로써, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab^')₃, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb), 다른 일가(monovalent)와 이가(divalent) 단편, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-사슬 항체(가령, scFv, scFab, scFabΔC), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody), CD200에 특이적인 결합을 공여할 만큼 충분한, 항체의 최소한 일부분을 포함하는 폴리펩티드; 그리고 이들의 융합체와 유도체가 포함된다. Fd 단편은 V_H와 C_H1 도메인으로 구성되는 항체 단편이다; Fv 단편은 항체의 단일 팔(single arm)의 V_L과 V_H 도메인으로 구성된다; scFv 단편은 펩티드 링커(peptide linker)에 의해 연결된 중쇄 가변 영역(V_H)과 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 단일 사슬 항체이다; scFab 단편은 펩티드 링커에 의해 경쇄에 연결된 Fd(fragment difficult)를 포함하는 단일 사슬 항체이다; scFabΔC 단편은 시스테인(cysteine)이 없는 scFab 변이체(예로써, Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007) 참조)이고, dAb 단편(단일 도메인 항체)은 단일 가변 도메인(가령, V_H 또는 V_L 도메인)(Ward et al., Nature 341 :544-546 (1989))을 포함한다. 예로써, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005)을 포함한다. 소형 단편, 예를 들면, Fv와 scFv는 그들의 작은 크기와 이에 따른 우수한 조직 분포로 인하여, 진단과 치료 적용에 유리한 특성을 갖는다. 소형 단편의 생체내 안정성(in vivo stability)과 생체내 반감기(in vivo half-life)를 개선하기 위하여, 이들 단편은 예로써, 폴리(에틸렌) 글리콜과 같은 분자에 접합(직접적으로 또는 간접적으로)될 수 있다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 작동체 세포에 결합하는 증가된 또는 감소된 능력을 갖는 변이성 또는 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하도록 하는 방식으로 가공되거나 생산된 항체에 관계한다; 이들 변이성 항체에는 불변 영역 또는 Fc 영역이 변경된 당화 패턴을 보유하는 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 조작된 또는 변이성 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하는 항체는 작동체 기능, 예를 들면, ADCC와 CDC를 조절하는데 유용할 수 있다. 조작된 또는 변이성 불변 영역 또는 Fc 영역을 보유하는 이들 항체는 예로써, CD200이 정상 조직에서 발현되는 사례에서 유용하다; 이들 사례에서 작동체 기능이 없는 변이성 항-CD200 항체는 정상 조직을 손상시키지 않으면서 바람직한 치료 반응을 유도한다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 제시된 중쇄 및/또는 경쇄에 상동하거나 유사한 중쇄와 경쇄를 비롯한 본 명세서에 제시된 중쇄와 경쇄를 포함하는 항-CD200 항체에 관계한다. "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)" 또는 "유사성(similarity)"은 2개의 펩티드 또는 2개의 핵산 분자 사이에 서열 유사성을 지칭한다. 상동성과 동일성은 각각, 비교의 목적으로 정렬되는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서 동등한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다; 비교된 서열에서 동등한 위치가 동일하거나 유사한 아미노산 잔기(가령, 입체적 및/또는 전자적 특성에서 유사한)에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 상동한(유사한) 것으로 지칭될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 비율로서 표시는 비교된 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산의 총수의 함수를 지칭한다. "상동성"은 유사한 기능 또는 모티프(motif)를 보유하는 유전자 또는 단백질을 확인하는데 이용되는, 서열 유사성의 수학적으로 기초된 비교를 설명한다. 본 명세서에서, "동일성"은 서열 정합(sequence matching)이 극대화되도록 서열을 정렬할 때, 다시 말하면, 갭(gap)과 삽입을 고려하여 2개 이상의 서열 내에서 상응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 따라서 동일성을 결정하는 방법은 조사된 서열 사이에 최대 정합(largest match)을 제공하도록 설계된다(참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 1988, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)), BLAST X (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). "무관한" 또는 "비-상동한" 서열은 본 발명의 서열과 40% 이하, 바람직하게는, 25% 이하의 동일성을 공유한다. 두 서열을 비교할 때, 잔기(아미노산 또는 핵산)의 부재 또는 추가 잔기의 존재 역시 동일성 및 상동성/유사성을 감소시킨다.

따라서 본 발명은 리더 서열이 없는 본 발명에 개시된 항체에 관계한다. 따라서 본 발명의 항체는 리더 서열이 부재하거나 다른 리더 서열로 치환된 중쇄와 경쇄를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하기 위하여 숙주 세포가 이용되면, 이용된 특정 숙주 세포에 따라 적절한 리더 서열이 선택될 수 있다.

항체는 당분야에 널리 공지된 방법으로 생산될 수 있다. 가령, 단클론 항-CD200 항체는 면역원(immunogen)으로서 CD200 양성 세포, CD200 폴리펩티드, 또는 CD200 폴리펩티드의 단편을 이용하여 동물 내에서 면역 반응을 발생시킴으로써 산출되는데, 이들 동물로부터 항체-생산 세포 및 차례로, 단클론 항체가 분리된다. 이런 항체의 서열은 결정되고, 상기 항체 또는 이의 변이체는 재조합 기술에 의해 생산된다. 재조합 기술은 상기 단클론 항체의 서열에 기초한 키메라 항체, CDR-합체된 항체, 인간화 항체와 완전 인간 항체, 그리고 CD200에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 생산하는데 이용될 수 있다.

게다가, 재조합 라이브러리("파지 항체")로부터 유래된 항체는 표적 특이성(target specificity)에 기초하여 항체 또는 폴리펩티드를 분리하는 미끼(bait)로서, CD200-양성 세포, 또는 이로부터 유래된 폴리펩티드를 이용하여 선택될 수 있다. 비-인간과 키메라 항-CD200 항체의 생산과 분리는 당업자의 이해 범위에 속한다.

비-인간 세포에서 생산된 항체를 개선하기 위하여 재조합 DNA 기술이 이용된다. 따라서 진단 또는 치료 적용에서 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위하여 키메라 항체가 작제될 수 있다. 게다가, 면역원성은 CDR 합체(grafting) 및 임의적으로, 골격 변형(framework modification)으로 항체를 인간화함으로써 최소화될 수 있다(참조: U.S. Patent No. 5,225,539).

항체는 동물 혈청으로부터 획득되거나, 또는 단클론 항체 또는 이의 단편의 경우에, 세포 배양액 내에서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 세균 배양액, 또는 바람직하게는, 포유동물 세포 배양액 내에서 절차를 비롯한 확립된 절차에 따라 항체를 생산할 수 있다. 적절하게는, 선택된 세포 배양 시스템은 항체 산물을 분비한다.

다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 항체의 생산 과정은 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주, 예를 들면, 대장균(E. coli) 또는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 벡터는 적절한 해독 틀 내에서, 항체 단백질을 인코딩하는 두 번째 DNA 서열에 연결된, 신호 펩티드를 인코딩하는 첫 번째 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 이후, 항체 단백질은 회수되고 분리된다. 임의적으로, 발현 카세트는 적절한 해독 틀 내에서 신호 펩티드에 각각 작동가능하게 개별적으로 연결된 항체 단백질을 인코딩하는 폴리시스트론, 가령 이중시스트론 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유한다.

시험관내에서 하이브리도마 세포 또는 포유동물 숙주 세포의 증폭은 적절한 배양 배지에서 수행되는데, 상기 배지에는 포유동물 혈청(가령, 소 태아 혈청), 또는 미량 원소와 성장 지속 보충물질(가령, 정상 생쥐 복막 삼출액 세포, 비장 세포, 골수 대식세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트랜스페린, 저밀도 지단백, 올레산 등과 같은 영양 세포)에 의해 임의적으로 보충된 통상적인 표준 배양 배지(가령, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 또는 RPMI 1640 배지)이다. 박테리아 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포의 증폭은 당분야에 공지된 적절한 배양 배지에서 유사하게 수행된다. 가령, 세균에 적합한 배양 배지는 LE, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 x YT, 또는 M9 최소 배지이다. 효모에 적합한 배양 배지는 YPD, YEPD, 최소 배지, 또는 완전 최소 탈락 배지(Complete Minimal Dropout Medium)이다.

시험관내 생산은 상대적으로 순수한 항체 제조물을 제공하고, 원하는 항체를 다량으로 제공하는 규모 확대(scale-up)가 가능하다. 세균 세포, 효모, 식물, 또는 포유동물 세포의 배양 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 균질성 현탁액 배양(가령, 공기리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서), 그리고 영속화되거나 포획된 세포 배양(가령, 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트라이지에서)이 포함된다.

다량의 원하는 항체는 생체내에서 포유동물 세포를 증폭함으로써 획득될 수도 있다. 이를 위하여, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 항체-생산 종양의 성장을 유도하기 위하여 조직적합성 포유동물에 주입된다. 임의적으로, 동물은 주입에 앞서, 탄화수소, 바람직하게는, 프리스탄(pristane)(테트라메틸-펜타데칸)과 같은 미네랄 오일로 자극된다. 1주 내지 3주후, 항체는 이들 포유동물의 체액으로부터 분리된다. 가령, 적절한 골수종 세포와 Balb/c 생쥐로부터 유래된 항체-생산 비장 세포의 융합으로 수득되는 하이브리도마 세포, 또는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0으로부터 유래된 형질감염된 세포는 임의적으로 프리스탄으로 미리-처리된 Balb/c 생쥐에 복강내 주입된다. 1주 내지 2주후, 이들 동물로부터 복수를 채취한다.

상기한 기술은 예로써, Kohler and Milstein,(1975) Nature 256:495-497; U.S. Patent No. 4,376, 110; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harbor에서 기술된다. 재조합 항체 분자의 제조 기술은 상기한 참고 문헌 및 예로써, W097/08320; U.S. Patent No. 5,427,908; U.S. Patent No. 5,508,717; Smith, 1985, Science, Vol.225, pp 1315-1317; Parmley and Smith 1988, Gene 73, pp 305-318; De La Cruz et al, 1988, Journal of Biological Chemistry, 263 pp 4318-4322; U.S. Patent No. 5,403,484; U.S. Patent No. 5223409; W088/06630; WO92/15679; U.S. Patent No. 5780279; U.S. Patent No. 5571698; U.S. Patent No. 6040136; Davis et al., Cancer Metastasis Rev.,1999;18(4):421-5; Taylor, et al., Nucleic Acids Research 20(1992): 6287-6295; Tomizuka et al.,Proc. Nat. Academy of Sciences USA 97(2)(2000): 722-727에서 기술한다. 이들 참고문헌은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

세포 배양 상층액은 CD200-양성 세포의 면역형광 염색, 면역블랏팅, 효소 면역법, 예를 들면, 샌드위치 검사 또는 다트-검사, 또는 방사선면역법으로 원하는 항체를 선별한다.

항체의 분리를 위하여, 배양 상층액 또는 복수 내에서 면역글로불린은 예로써, 황산암모늄을 이용한 침전, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 흡습성 물질에 대한 투석, 선별 막을 통한 여과 등으로 농축될 수 있다. 필요한 경우, 항체는 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에서 크로마토그래피 및/또는 (면역-)친화성 크로마토그래피, 가령, CD200-양성 세포주로부터 유래된 하나 이상의 표면 폴리펩티드, 또는 단백질-A 또는 -G 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제된다.

다른 구체예에서, 적절한 포유동물 내에서 CD200에 대항하는 항체를 분비하는 세균 세포주의 제조 공정을 제시한다. 가령, 토끼는 CD200-양성 조직 또는 세포, 또는 CD200 폴리펩티드 또는 이의 단편으로부터 주합 시료(pooled sample)로 면역화된다. 면역화된 토끼로부터 생산된 파지 전시 라이브러리는 당분야에 공지된 방법(가령, 본 발명에 편입되는 다양한 참고문헌에 개시된 방법)에 따라 원하는 항체에 대하여 작제되고 패닝(panning)된다.

단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포 역시 제시된다. 바람직한 하이브리도마 세포는 유전적으로 안정하고, 원하는 특이성의 본 발명에 개시된 단클론 항체를 분비하며, 해동과 시험관내에서 또는 생체내에서 복수(ascite)로서 증식에 의해 심온-동결(deep-frozen) 배양액으로부터 확장될 수 있다.

다른 구체예에서, CD200에 대항하는 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주의 제조 공정을 제시한다. 상기 공정에서, 적절한 포유동물, 예를 들면, Balb/c 생쥐는 CD200의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항원성 단편, 또는 CD200-양성 세포로부터 유래된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항원성 단편, CD200-양성 세포 자체, 또는 본 발명에 개시된 정제된 폴리펩티드를 보유하는 항원성 담체로 면역화된다. 면역화된 포유동물의 항체-생산 세포는 배양액 내에서 짧게 성장되거나, 또는 적절한 골수종 세포주의 세포와 융합된다. 이런 융합에서 수득된 하이브리드 세포는 클로닝되고, 원하는 항체를 분비하는 세포 클론은 선별된다. 가령, CD200-양성 만성 림프구 백혈병(CLL) 세포주로 면역화된 Balb/c 생쥐의 비장 세포는 골수종 세포주 PAI 또는 골수종 세포주 Sp2/0-Ag 14의 세포와 융합된다. 수득된 하이브리드 세포는 원하는 항체의 분비를 위하여 선별되고, 양성 하이브리도마 세포는 클로닝된다.

수개월, 예를 들면, 2 내지 4개월 동안 수회, 예를 들면, 4 내지 6회, CD200-양성 세포주의 10⁶ 내지 10⁷개 세포를 피하 및/또는 복강내 주입함으로써 Balb/c 생쥐를 면역화시키는 것으로 특성화되는, 하이브리도마 세포주의 제조 공정이 바람직하다. 면역화된 생쥐로부터 비장 세포는 최종 주입이후 2 내지 4일 시점에 채취되고, 융합 프로모터, 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에 골수종 세포주 PAI의 세포와 융합된다. 적절하게는, 골수종 세포는 대략 4000 분자량의 대략 30% 내지 50% 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 용액 내에서, 면역화된 생쥐로부터 유래된 3- 내지 20-배 과량의 비장 세포와 융합된다. 융합이후, 이들 세포는 앞서 기술된 바와 같이 적절한 배양 배지에서 확장되고, 통상의 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포보다 커지지 않도록 규칙적인 간격으로 선별 배지, 예를 들면, HAT 배지로 보충된다.

상기 항체와 이들의 단편은 "키메라(chimeric)"일 수 있다. 키메라 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 2개 이상의 상이한 종(가령, 생쥐와 인간)으로부터 부분을 포함한다. 키메라 항체는 인간 불변 도메인 유전자 분절 내로 원하는 특이성의 생쥐 가변 영역을 절단접합(splicing)함으로써 생산될 수 있다(참조: U.S. patent No. 4,816,567). 이러한 방식으로, 비-인간 항체는 인간 임상 적용에 더욱 적합하게 변형될 수 있다.

본 발명의 단클론 항체에는 비-인간(즉, 생쥐) 항체의 "인간화"형태가 포함된다. 인간화 또는 CDR-합체된 mAb는 인간에 대한 치료제로서 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 생쥐 항체처럼 순환계로부터 급속하게 제거되지 않고 전형적으로, 유해한 면역 반응을 유발하지 않기 때문이다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 내부로 도입된다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종, "수입(import)" 잔기로 지칭되는데, 이들은 전형적으로, "수입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화 항체를 제조하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, 인간화는 본질적으로, Winter 등(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verheoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))의 방법에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 또한, Staelens et al. 2006 Mol. Immunol 43: 1243-1257을 참조한다. 특정 구체예에서, 비-인간(가령, 생쥐) 항체의 인간화 형태는 수용자 항체의 초가변(CDR) 영역 잔기가 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼, 또는 원하는 특이성(specificity), 친화성(affinity)과 결합 능력(binding capacity)을 갖는 비-인간 영장류로부터 초가변 영역 잔기로 치환된 인간 항체(수용자 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 골격 영역 잔기 역시 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다(일명, "복귀 돌연변이(back mutation)"). 이에 더하여, 항체 서열 내에서 선택된 위치에서 아미노산을 변화시키기 위하여 파지 전시 라이브러리(phage display library)가 이용될 수 있다. 인간화 항체의 특성 역시 인간 골격의 선택에 의해 영향을 받는다. 더 나아가, 인간화 항체와 키메라 항체는 항체 특성, 예를 들면, 친화성 또는 작동체 기능을 더욱 개선하기 위하여, 수용자 항체 또는 공여자 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.

완전 인간 항체 역시 본 발명에서 제시된다. "인간 항체"에는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역(존재하면)을 보유하는 항체가 포함된다. 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(가령, 시험관내에서 무작위 또는 특정 부위 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, "인간 항체"에는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 생쥐의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 접합된 항체(즉, 인간화 항체)가 포함되지 않는다. 완전 인간 또는 인간 항체는 인간 항체 유전자를 보유하는(가변(V), 다양성(D), 접합(J)과 불변(C) 엑손을 보유하는) 유전자도입(transgenic) 생쥐로부터, 또는 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 가령, 면역화이후, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 완전 레퍼토리(repertoire)의 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자도입 동물(가령, 생쥐)을 생산하는 것이 현재 가능하다(참조: Jakobovits et al., PNAS, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). 유전자도입 생쥐 계통은 정렬되지 않은 인간 면역글로불린 유전자로부터 유전자 서열을 보유하도록 조작될 수 있다. 이들 인간 서열은 인간 항체의 중쇄와 경쇄 모두를 코딩하고, 생쥐 내에서 정확하게 기능하여 인간에서와 유사한 광범위한 항체 레퍼토리를 제공하는 재정렬(rearrangement)이 진행된다. 유전자도입 생쥐는 다양한 일련의 특이적인 항체와 이들의 인코딩 RNA를 산출하기 위하여 표적 단백질(가령, CD200, 이의 단편, 또는 CD200을 발현하는 세포)로 면역화될 수 있다. 이후, 이런 항체의 항체 사슬 성분을 인코딩하는 핵산이 상기 동물로부터 전시 벡터(display vector) 내로 클로닝될 수 있다. 전형적으로, 중쇄와 경쇄 서열을 인코딩하는 핵산의 독립된 개체군이 클로닝되고, 이들 독립된 개체군은 이후, 벡터 내로 삽입으로 재조합되고, 따라서 상기 벡터의 임의의 정해진 사본은 중쇄와 경쇄의 무작위 조합을 수용한다. 벡터는 항체 사슬이 상기 벡터를 보유하는 전시 패키지(display package)의 외부 표면 상에서 조합되고 전시될 수 있도록 상기 항체 사슬을 발현하도록 설계된다. 가령, 항체 사슬은 파지의 외부 표면으로부터 파지 외피 단백질(phage coat protein)과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이후, 전시 패키지는 표적에 대한 항체 결합의 전시에 대하여 스크리닝(screening)될 수 있다.

이에 더하여, 인간 항체는 파지-전시 라이브러리로부터 유래될 수 있다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). 합성 인간 항체 V-영역의 무작위 조합을 이용하는 합성 파지 라이브러리가 산출될 수 있다. 항원 상에서 선별에 의해, V-영역이 성격상 상응하는 인간 영역과 매우 유사한 완전 인간 항체가 만들어질 수 있다(참조: 특허 US 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666; Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367).

인간 항체의 산출을 위하여, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)를 더욱 참조하는데, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. 인간 항체는 U.S. 특허 5,939,598과 6,673,986에서 더욱 구체적으로 논의되고 기술된다. 또한, 1995년 6월 5일 제출된 U.S. 특허 6,114,598, 6,075,181과 6,162,963을 참조한다. 또한, 1996년 10월 2일 제출된 U.S. 특허 6,150,584; US 특허 6,713,610과 6,657,103, 그리고 U.S. 특허 출원 10/421,011(US 2003-0229905 A1), 10/455,013(US 2004-0010810 A1), 10/627,250(US 2004-0093622 A1), 10/656,623(US 2006-0040363 A1), 10/658,521(US 2005-0054055 A1), 10/917,703(US 2005-0076395 A1)과 10/978,297(US 2005-0287630 A1)을 참조한다. 또한, 1993년 7월 23일 제출된 PCT/US93/06926, 1996년 6월 12일 특허 공개된 유럽 특허 No. EP 0 463 151 B1, 1994년 2월 3일 공개된 국제 특허 출원 No., WO 94/02602, 1996년 10월 31일자 공개된 국제 특허 출원 No. WO 96/34096 및 1998년 6월 11일 공개된 WO 98/24893을 참조한다. 앞서 언급된 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 본 발명에 순전힌 참조로서 편입된다.

대안적 접근법에서, GenPharm International, Inc. 등은 "소형좌위(minilocus)"접근법을 이용하였다. 소형좌위 접근법에서, 외인성 Ig 좌위는 상기 Ig 좌위로부터 조각(개별 유전자)의 통합을 통하여 모방된다. 따라서 하나 이상의 V_H 유전자, 하나 이상의 D_H 유전자, 하나 이상의 J_H 유전자, mu 불변 영역 및 두 번째 불변 영역(바람직하게는, 감마 불변 영역)이 동물 내로 삽입을 위한 구조체(construct)로 형성된다. 이러한 접근법은 U.S. Pat. No. 5,545,807(Surani et al.); U.S. Pat. No. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650과 5,814,318(각각, Lonberg and Kay); U.S. Pat. No. 5,591,669(Krimpenfort and Berns); U.S. Pat. No. 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215(Berns et al.); U.S. Pat. No. 5,643,763(Choi and Dunn); GenPharm International을 참조한다. 또한, U.S. 특허 5,569,825, 5,877,397, 6,300,129, 5,874,299, 6,255,458과 7,041,871을 참조하는데, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 또한, 유럽 특허 No. 0 546 073 B1 및 국제 특허 출원 No. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852와 WO 98/24884를 참조하는데, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 또한, Taylor et al. (1992 Nuc. Acids. Res., 20:6287), Chen et al. (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al. (1993 PNAS U S A. 90: 3720-4), Choi et al., (1993 Nature Genetics 4: 117), Lonberg et al. (1994 Nature 368: 856-859), Taylor et al. (1994 International Immunology 6: 579-591), Tuaillon et al. (1995 J Immunol. 154: 6453-65), Fishwild et al. (1996 Nature Biotechnology 14: 845), Tuaillon et al. (2000 Eur J Immunol. 10: 2998-3005)를 참조하는데, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

특정 구체예에서, 면역-제거된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제시된다. 면역-제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 일정한 종에 대하여 면역성이 없거나 감소된 면역성을 나타내도록 변형될 수 있다. 면역 제거(de-immunization)는 당업자에게 공지된 다양한 기술을 이용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 변형함으로써 달성될 수 있다(참조: PCT 출원 No. WO 04/108158과 WO 00/34317). 가령, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 내에서 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하고, 예로써, 재조합 기술을 이용하여 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 제거함으로써 면역 제거될 수 있다. 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이후, 하나 이상의 바람직한 생물학적 활성, 예를 들면, 결합 친화성을 유지하지만 면역원성이 감소된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 확인하기 위하여 임의적으로 생산되고 검사될 수 있다. 잠재적인 T 세포 에피토프 및/또는 B 세포 에피토프를 확인하는 방법은 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, 계량적 방법(참조: PCT Publication No. WO 02/069232), in vitro 또는 in silico 기술, 그리고 생물학적 검사 또는 물리적 방법(가령, MHC 분자에 펩티드 결합의 결정, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종으로부터 T 세포 수용체에 펩티드:MHC 복합체의 결합 결정, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종의 MHC 분자를 포함하는 유전자도입 동물로 상기 단백질 또는 이의 펩티드 일부의 검사, 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 종으로부터 면역계 세포로 재구성된 유전자도입 동물로 검사 등)을 이용하여 수행될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 개시된 면역-제거된 항-CD200 항체에는 면역-제거된 항원-결합 단편, Fab, Fv, scFv, Fab'와 F(ab')₂, 단클론 항체, 뮤린 항체, 조작된 항체(가령, 키메라, 단일 사슬, CDR-합체된, 인간화, 완전 인간 항체 및 인위적으로 선택된 항체), 그리고 합성 합체와 반-합성 항체가 포함된다.

다른 구체예에서, CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체(insert)를 포함하는 재조합 DNA가 생산된다. DNA는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA와 이의 상보성 DNA로 구성되는 이중 가닥 DNA, 또는 이들 상보성(단일 가닥) DNA 자체를 포괄한다.

더 나아가, CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 인증된 DNA 서열, 또는 이의 돌연변이체를 포함하는 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 DNA일 수 있다. 인증된 DNA의 돌연변이체는 하나 이상의 아미노산이 결실되거나, 삽입되거나, 또는 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환된 상기한 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA이다. 적절하게는, 상기 변형은 인간화와 발현 최적화 적용에서 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR 외부에서 발생한다. 돌연변이체 DNA에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 동일한 아미노산을 코딩하는 새로운 코돈(codon)을 갖는 다른 뉴클레오티드로 치환되는 침묵 돌연변이체(silent mutant) 역시 포함된다. 돌연변이체 서열에는 축퇴(degenerate) 서열 역시 포함된다. 축퇴 서열은 무제한의 뉴클레오티드가 최초 인코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 다른 뉴클레오티드로 치환된다는 점에서, 유전자 코드(genetic code)의 의미에서 축퇴이다. 이들 축퇴 서열은 그들의 상이한 제한 부위(restriction site) 및/또는 특정 숙주, 특히, 대장균(E. coli)에 의해 선호되는 특정 코돈의 빈도로 인하여, 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 최적 발현을 달성하는데 유용하다.

돌연변이체는 당분야에 공지된 방법에 따라, 인증된 DNA의 시험관내 돌연변이유발에 의해 획득되는 DNA 돌연변이체를 포괄하도록 의도된다.

완전 4합체 면역글로불린 분자의 조립(assembly) 및 키메라 항체의 발현을 위하여, 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 삽입체는 중쇄와 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 상응하는 DNA와 융합되고, 예로써, 하이브리드 벡터 내로 통합후 적절한 숙주 세포 내로 전달된다.

인간 불변 도메인 IgG, 예를 들면, γ1, γ2, γ3 또는 γ4; 특정 구체예에서, γ1 또는 γ4에 융합된 CD200 또는 CD200-양성 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 포함하는 재조합 DNA가 이용될 수 있다. 인간 불변 도메인 κ 또는 λ, 바람직하게는, κ에 융합된 본 발명에 개시된 세포주를 지향하는 항체의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 포함하는 재조합 DNA 역시 제시된다.

다른 구체예는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA에 관계하는데, 여기서 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인은 스페이서(spacer) 기에 의해 연결되고, 숙주 세포 내에서 항체의 가공을 용이하게 하는 신호 서열 및/또는 상기 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드 및/또는 절단 부위 및/또는 펩티드 스페이서 및/또는 작용제를 인코딩하는 DNA 서열을 임의적으로 포함한다. 작용제를 코딩하는 DNA는 진단 또는 치료 적용에서 유용한 작용제를 코딩하는 DNA인 것으로 의도된다. 따라서 독소 또는 효소, 특히, 프로드러그의 활성화를 촉매할 수 있는 효소인 작용제 분자가 특히 바람직하다. 이런 작용제를 인코딩하는 DNA는 자연 발생 효소 또는 독소 인코딩 DNA의 서열, 또는 이의 돌연변이체를 보유하고, 당분야에 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

따라서 본 발명의 단클론 항체 또는 항원-결합 단편은 다른 작용제, 예를 들면, 치료제 또는 검출가능 라벨(detectable label)에 접합되지 않은 나신 항체 또는 이들의 항원-결합 단편일 수 있다. 대안으로, 이러한 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 작용제, 예를 들면, 세포독성제, 소형 분자, 호르몬, 효소, 성장 인자, 사이토킨, 리보자임, 펩티드모방체, 화학물질, 프로드러그, 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자(가령, 안티센스, RNAi, 유전자-표적화 구조체 등), 또는 검출가능 라벨(가령, NMR 또는 X-선 조영제(contrasting agent), 형광 분자 등)에 접합될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD200 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편(가령, Fab, Fv, 단일-사슬 scFv, Fab'와 F(ab')₂)은 상기 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자에 연결된다. 상기 항-CD200 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편에 연결되는 분자에는 알부민을 비롯한 혈청 단백질, 폴리펩티드, 다른 단백질 또는 단백질 도메인, PEG 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

포유동물 세포 내에서 클로닝된 중쇄와 경쇄 유전자의 발현을 위하여 여러 벡터 시스템이 가용하다. 한 종류의 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 원하는 유전자 서열의 통합에 의존한다. 안정적으로 통합된 DNA를 보유하는 세포는 대장균(E. coli) gpt(Mulligan, R. C. and Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) 또는 Tn5 neo(Southern, P. J. and Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982))와 같은 약물 내성 유전자(drug resistance gene)를 동시에 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 연결되거나, 또는 공동-트랜스펙션(co-transfection)에 의해 동일 세포 내로 도입될 수 있다(Wigler, M. et al., 세포, 16: 77 (1979)). 두 번째 종류의 벡터는 염색체외(extrachromosomal) 플라스미드에 자기 복제 능력을 공여하는 DNA 요소를 이용한다. 이들 벡터는 소 유두종 바이러스(bovine papillomavirus)(Sarver, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)), 폴리오마 바이러스(polyoma virus)(Deans, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 : 1292 (1984)), 또는 SV40 바이러스(Lusky, M. and Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981))와 같은 동물 바이러스로부터 유래될 수 있다.

면역글로불린 cDNA는 항체 단백질을 인코딩하는 성숙 mRNA를 나타내는 서열로만 구성되기 때문에, 유전자의 전사와 RNA의 처리를 조절하는 부가적인 유전자 발현 요소가 면역글로불린 mRNA의 합성에 요구된다. 이들 요소에는 절단접합 신호(splice signal), 유도성 프로모터(inducible promoter)를 비롯한 전사 프로모터(transcription promoter), 인핸서(enhancer) 및 종결 신호(termination signal)가 포함될 수 있다. 이들 요소를 통합하는 cDNA 발현 벡터에는 Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983); Cepko, C. L. et al., Cell, 37: 1053 (1984); Kaufman, R. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985)에 기술된 것들이 포함된다.

본 발명의 치료 구체예에서, 이중특이성 항체가 고려된다. 이중특이성 항체는 최소한 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 보유하는 단클론, 바람직하게는, 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 결합 특이성 중에서 하나는 세포(가령, 암 세포 또는 면역 세포) 상에서 CD200 항원에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는, 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 아단위에 대한 결합 특이성이다.

이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업자의 이해 범위 내에 속한다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현(co-expression)에 기초하는데, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 보유한다(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 원하는 결합 특이성을 보유하는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 적절하게는, 이러한 융합은 힌지, CH2와 CH3 영역 중에서 최소한 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인으로 달성된다. 이러한 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우에, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 독립된 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 생물체 내로 공동-형질감염된다. 이중특이성 항체를 산출하기 위한 현재 공지된 예시적인 방법의 더욱 상세는 예로써, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986); WO 96/27011; Brennan et al., Science 229:81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994); Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)을 참조한다. 이중특이성 항체에는 교차-연결된 또는 이형접합체(heteroconjugate) 항체 역시 포함된다. 이형접합체 항체는 임의의 통상적인 교차-연결 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 적절한 교차-연결 작용제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 교차-연결 기술과 함께 U.S. Pat. No. 4,676,980에서 기술된다.

재조합 세포 배양액으로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 분리하는 다양한 기술 역시 보고되었다. 가령, 이중특이성 항체는 루이신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 산출되었다(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos와 Jun 단백질로부터 루이신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해, 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결될 수 있다. 항체 동종이합체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이형이합체를 형성한다. 이러한 방법은 항체 동종이합체의 생산에도 이용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 기술된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 이들 단편은 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 짝지음(pairing)이 불가능하도록 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서 한쪽 단편의 V_H와 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L과 V_H 도메인과 쌍을 이루도록 강제되고, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv(scFv) 이합체의 이용으로 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략 역시 보고되었다(참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)). 대안으로, 항체는 Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)에 기술된 바와 같이 "선형 항체(linear antibody)"일 수 있다. 간단히 말하면, 이들 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 분절(V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편이 두 번째 분자에 연결된 융합 분자에 관계한다. 따라서 본 발명에서는 항-CD200 항체 접합체를 제시한다. 항-CD200 항체 접합체는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 이질성 모이어티를 포함한다. 이질성 모이어티에는 폴리펩티드(가령, 인간 혈청 알부민), 소형 분자, 핵산, 중합체(자연과 합성 중합체, 예를 들면, PEG 포함), 금속 등이 포함될 수 있다. 이질성 모이어티는 검출가능 또는 표지화(labeling) 모이어티, 예를 들면, 형광 또는 발광 작용제이거나, 또는 세포독성 작용제, 항생제, 또는 방사성동위원소 또는 방사성핵종(radionuclide)일 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 항체 접합체 또는 융합 분자는 예로써, 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 불규칙 펩티드(heteroclitic peptide), 화학치료제, 면역조절제, 표적화 모이어티, 또는 핵산 구조체(가령, 안티센스, RNAi, 또는 유전자-표적화 구조체)를 포함할 수 있다.

항-CD200 항체 또는 이의 단편의 증가된 완전성 또는 수명이 바람직한 특정 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 생체내에서 단편의 반감기를 증가시키는 분자에 접합될 수 있다. 이런 분자에는 중합체, 예를 들면, PEG 또는 다른 중합체 ― 가령, 폴리알킬렌(polyalkylene), 폴리알케닐렌(polyalkenylene), 폴리옥시알킬렌(polyoxyalkylene) 등이 포함된다. 대안으로, 단편은 폴리펩티드, 단백질 도메인, 혈청 단백질, 또는 알부민에 융합되거나, 또는 달리 연결될 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 예로써, Fab, Fv, 단일-사슬 단편 또는 scFv, Fab', F(ab')₂, 또는 F(ab')₃일 수 있다.

III. 면역 반응을 저해하는 방법

A. 체액 면역 반응을 저해하는 방법

면역계는 외래 항원에 2가지 유형의 항원-특이적 반응을 산출할 수 있다: T 림프구에 의해 매개된, 면역계의 작동체 기능을 지칭하는 세포-매개된 면역(cell-mediated immunity), 그리고 B 림프구에 의한 항원-특이적 항체의 생산을 지칭하는 체액 면역. 체액 면역은 활성화된 B 세포에 의해 매개되는데, 이들 세포는 침입 미생물(invading microbe), 예를 들면, 바이러스 또는 세균의 표면 상에 항원에 특이적인 항체를 분비한다. 항체는 파괴를 위하여 이들 침입 미생물에 결합하고 이들을 표적한다.

대부분의 항원에 대한 체액 면역의 발생은 항체-생산 B 세포 또는 B 림프구뿐만 아니라 보조 T(Th) 세포 또는 Th 림프구의 관여를 필요로 한다(Mitchison, Eur. J. Immunol., 1 :18-25 (1971); Claman and Chaperon, Transplant Rev., 1 :92-119 (1969); Katz et al, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 70:2624-2629 (1973); Reff et al., Nature, 226: 1257-1260 (1970)). Th 세포는 흉선(thymus)-의존성 항원에 의한 자극에 대한 반응으로 일정한 신호를 제공한다. Th 세포에 의해 방출된 가용성 분자(가령, IL-4와 IL-5와 같은 사이토킨)가 일부 B 림프구 활성화를 매개하긴 하지만, B 세포 활성화는 B 세포와 Th 세포 사이에 접촉(contact)-의존성 상호작용을 또한 필요로 한다(Hirohata et al., J Immunol, 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol, 143:1745-1765 (1989); Brian, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol, 145:2025-2034 (1990); Noelle et al, J. Immunol, 146:1118-1124 (1991)).

본 발명에서는 항-CD200 항체의 투여가 B 세포 활성을 저해한다는 것을 증명한다. 구체적으로, 본 발명에서는 항-CD200 항체가 면역 자극 이후에 순환 면역글로불린(가령, IgG와 IgM)의 수준을 감소시킬 수 있음을 증명한다.

따라서 특정 구체예에서, 본 발명은 CD200-결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 병든 개체에서 체액 면역 반응을 예방 또는 저해하기 위한 방법과 조성물에 관계한다. 특정 구체예에서, 결합제는 본 발명에 개시된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 구체예에서, 항-CD200 항체의 투여는 B 세포를 저해하는데 효과적이다. 가령, 본 발명의 항-CD200 항체는 순환 B 세포 및/또는 성숙, 항체-분비 B 세포를 표적화 및/또는 저해하는데 효과적이다. 따라서 본 발명의 방법과 조성물은 순환 B 세포와 순환 면역글로불린을 감소 또는 격감시키는데 효과적일 수 있다. 다른 구체예에서, 항-CD200 항체의 투여는 순환 IgG 및/또는 IgM 면역글로불린의 감소된 수준을 결과한다.

특정의 작용 방식에 한정됨 없이, 항-CD200 항체는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 상기 항체가 결합하는 B 세포의 ADCC, CDC 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 매개할 수 있다. 상기 항체는 뮤린, 키메라, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 면역-제거된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 임의적으로, 상기 항체는 증가된 작동체 기능을 유도할 수도 있다. 하지만, 앞서 기술된 바와 같이, 작동체 기능이 아마도 일정한 역할을 수행하긴 하지만, 원하는 효과를 산출하는 유일한 수단은 아니다.

체액 면역 반응의 예방 또는 저해가 필요한 개체는 특정 구체예에서, 자가면역 질환 환자 또는 이식물 수용자이다. 따라서 특정 구체예에서, 본 발명은 환자에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)과 이식편 거부반응의 치료와 예방을 위한 면역치료 조성물과 방법에 관계하는데, 여기서 상기 조성물과 방법은 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제를 포함하고, 상기 작용제는 바람직하게는, 항-CD200 항체이다. 특정 구체예에서, 이식물 수용자 또는 자가면역 질환 환자는 인간이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 이식물 수용자에서 급성 또는 만성 체액 거부반응을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관계한다.

특정 구체예에서, 상기 작용제, 예를 들면, 항-CD200 항체는 이러한 작용제(가령, 항-CD200 항체)의 부재에서 가능한 용량보다 낮은 용량으로, 전통적인 치료 약물과 병용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법은 더욱 격심한 형태의 요법, 예를 들면, 방사선 요법(radiation therapy), 고용량 면역조절 요법(high-dose immunomodulatory therapy), 또는 비장 절제(splenectomy)에 대한 필요를 회피한다. 병합 치료는 하기에 더욱 상세하게 논의되는데, 여기에는 예로써, 아드리아마이신(adriamycin), 아자티오프린(azathioprine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine) A, 시톡산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 비-스테로이드성 소염제, 라파마이신(rapamycin), 시롤리무스(sirolimus), 그리고 타크롤리무스(tacrolimus)가 포함된다. 다른 실례에는 항체, 예를 들면, OKT3™(muromonab-CD3), CAMPATH™-1G, CAMPATH™-1H(alemtuzumab), 또는 CAMPATH™-1M, SIMULEC™(basiliximab), ZENAPAX™(daclizumab), RITUXAN™(rituximab), 그리고 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)이 포함된다.

체액 면역 반응을 저해하기 위하여 이식물 수용자에 항-CD200이 투여되는 구체예에서, 항-CD200 항체는 단독으로, 또는 GVHD와 이식편 거부반응의 치료 또는 예방을 위한 한 가지 이상의 치료제 또는 섭생(regimen)과 공동으로, 이식 이전에 또는 이식 이후에 이식물 수용자에 투여될 수 있다. 가령, 항-CD200 항체는 동종유래 이식편(allogeneic graft)의 이식 이전에 또는 이식 이후에, 이식물 수용자로부터 동종항체를 격감시키는데 이용될 수 있다. 항-CD200 항체는 또한, GVHD와 이식편 거부반응에 대한 예방 조처(prophylaxis)로서, 이식 이전에 탈체에서 이식편으로부터, 또는 공여자 내에서 CD200+ 항체-생산 세포를 면역-격감시키는데 이용될 수 있다.

체액 거부반응에 대한 예방 또는 치료가 필요한 이식물 수용자는 당분야의 통상적인 지식과 기술에 따라 확인될 수 있다. 가령, 이식편 거부반응에 대한 예방 조처가 필요한 이식물 수용자는 이식 이전에, 검출가능 순환 항-HLA 동종항체를 보유하는 환자 또는 환자 개체군으로서 확인된다. 다른 실례에서, 환자 또는 환자 개체군은 이식 이전에, 패널 반응성(panel reactive) 동종항체를 보유하는 것으로 확인된다. 이식후 이식물 수용자 내에서 검출가능 순환 항-HLA 동종항체의 존재 역시 본 발명에 따라서, 체액 거부반응에 대한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 확인하는데 이용될 수 있다. 체액 거부반응에 대한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 또한, 이식물 수용자가 체액 거부반응이 발생할 위험이 있거나, 또는 체액 거부반응이 이미 발생했음을 지시하는 다른 임상적 기준(clinical criteria)에 따라서 확인될 수 있다. 가령, 체액 거부반응에 대한 치료가 필요한 이식물 수용자는 초기 단계 체액 거부반응, 예를 들면, 순환 항-공여자 동종항체로 특징되는 잠복성 체액 반응(latent humoral response)에서 환자 또는 환자 개체군으로서 확인된다. 초기 단계 체액 거부반응은 순환 항-공여자 동종항체 and C4d 침착으로 특징되는 침묵 반응(silent reaction), 또는 순환 항-공여자 동종항체, C4d 침착, 그리고 조직 병리로 특징되는 준임상적 거부반응(subclinical rejection)이다. 후기 단계에서, 수용자는 당분야의 통상적인 지식과 기술에 따라서 특징되는 체액 거부반응의 임상적 징후(clinical indication), 예를 들면, 순환 항-공여자 동종항체, C4d 침착, 조직 병리, 그리고 이식편 기능장애가 나타나는 환자 또는 환자 개체군으로서 확인된다.

본 발명에 개시된 항-CD200 항체는 다양한 종류의 이식된 세포, 조직, 그리고 기관의 수용자에서 체액 면역 반응을 저해 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 가령, 이식편은 수용자에 자가조직, 동종, 또는 이종이다. 이식편은 골수 이식편, 말초혈 줄기 세포 이식편, 피부 이식편, 동맥과 정맥 이식편, 췌장 도세포(pancreatic islet cell) 이식편, 그리고 신장, 간, 췌장, 갑상선, 그리고 심장의 이식물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포, 조직 또는 기관 이식편일 수 있다. 한 구체예에서, 자가조직 이식편은 골수 이식편, 동맥 이식편, 정맥 이식편, 또는 피부 이식편이다. 다른 구체예에서, 동종이식편은 골수 이식편, 각막 이식편, 신장 이식물, 심장 이식물, 간 이식물, 폐 이식물, 췌장 이식물, 췌장 도세포 이식물, 또는 신장과 췌장의 병합 이식물이다. 다른 구체예에서, 이식편은 이종이식편이고, 공여자는 바람직하게는, 돼지이다. 더 나아가, 단독으로 또는 두 번째 작용제와 공동으로 항-CD200 항체는 인공 관절(artificial joint), 스텐트(stent), 또는 심장박동조절장치(pacemaker device)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 비-생물학적 이식편 또는 이식물에 대한 유해한 면역 반응을 억제하는 데에도 이용될 수 있다.

따라서 본 발명은 병든 개체에서 체액 면역 반응(가령, 체액 이식편 거부반응)을 저해 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 단독으로 또는, 바람직하게는 하나 이상의 다른 치료제와 공동으로, CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제, 예를 들면, 항-CD200 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 순환 B 세포의 총수를 감소시키고 및/또는 순환 면역글로불린(가령, IgG 및/또는 IgM)의 양을 감소시킬 만큼 충분한 양으로 투여된다.

B. 세포 면역 반응을 저해하는 방법

세포 면역 반응은 항원-제시 세포가 항원을 CD4+ T 보조(Th) 림프구에 제시하여 T 세포 활성화, 증식, 그리고 작동체 T 림프구(가령, 세포독성 CD8+ T 세포)의 분화를 결과할 때, 개시된다. 항원에 노출(가령, 외래 조직의 감염 또는 이식에 기인한 노출) 이후에, 고유 T 세포는 Th1과 Th2 세포로 분화한다. Th1 세포는 IFN-γ과 IL-2를 생산하는데, 이들 둘 모두 세포-매개된 면역 반응과 연관된다. Th1 세포는 외래 조직 이식편의 거부반응, 그리고 많은 자가면역 질환(가령, 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia))에 통상적으로 관여하는 면역 반응에서 일정한 역할을 한다. Th2 세포는 IL-4와 같은 사이토킨을 생산하고, 항체-매개된 면역 반응(즉, B 세포-매개된 반응), 예를 들면, 알레르기와 알레르기 염증 반응(가령, 천식)에 통상적으로 관여하는 반응과 연관된다. Th2 세포는 또한, 이식편 거부반응의 원인이 될 수도 있다. 다수의 상황에서, 세포 면역 반응은 예로써, 세균이나 바이러스 감염으로부터 신체를 보호하고, 암 세포의 증식을 저해하는 등에서 바람직하다. 하지만, 다른 상황에서, 예를 들면, 이식편 수용자에서 이런 작동체 T 세포는 바람직하지 않다.

면역계가 항원에 대하여 활성화되거나, 또는 항원에 관대해지는 지의 여부는 T 작동체 세포 활성화와 T 조절 세포 활성화 간의 균형에 좌우된다. T 조절 세포는 면역학적 관용(immunological tolerance)의 유도와 유지를 담당한다. 이들 세포는 낮은 수준의 IL-2, IL-4, IL-5, 그리고 IL-12를 생산하는 T 세포이다. 조절 T 세포는 작동체 T 세포에서보다 낮은 수준이긴 하지만, TNFα, TGFβ, IFN-γ, 그리고 IL-10을 생산한다. TGFβ가 조절 T 세포에 의해 생산되는 우세한 사이토킨이긴 하지만, 상기 사이토킨은 Th1 또는 Th2 세포에서보다 낮은 수준, 예를 들면, Th1 또는 Th2 세포에서보다 1 크기 자리수(order of magnitude) 낮은 수준으로 생산된다. 조절 T 세포는 세포의 CD4+CD25+ 개체군에서 발견될 수 있다(참조: Waldmann and Cobbold. 2001 Immunity 14:399). 조절 T 세포는 배양 동안 활성화 신호(activating signal)(가령, 항원과 항원 제시 세포), 또는 MHC의 배경에서 항원을 모방하는 신호(가령, 항-CD3 항체, 플러스 항-CD28 항체)로 자극된 Th1, Th2, 또는 고유 T 세포의 증식과 사이토킨 생산을 능동적으로 억제한다.

본 발명에서는 항-CD200 항체 치료가 자극 이후에 활성화된 CD4+와 CD8+ T 세포의 총수를 감소시킨다는 것을 증명한다. 따라서 본 발명은 CD200-결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 병든 개체에서 세포 면역 반응을 예방 또는 저해하는 방법과 조성물에 관계한다. 특정 구체예에서, 결합제는 본 발명에 개시된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 구체예에서, 항-CD200 항체의 투여는 T 세포 활성화 및/또는 증식을 저해하거나, 또는 활성화된 T 세포의 총수를 감소시키는데 효과적이다. 가령, 본 발명의 항-CD200 항체는 Th1 및/또는 Th2 세포를 비롯한, 활성화된 CD200-발현 T 세포를 표적화 및/또는 저해하는데 효과적이다. 따라서 본 발명의 방법과 조성물은 활성화된 T 세포, 그리고 만약 그렇지 않으면 Th2 세포에 의해 활성화되는 B 세포를 감소 또는 격감시키는데 효과적이다(상기 참조). 따라서 T 세포의 항-CD200 저해는 활성화된 B 세포 및/또는 순환 면역글로불린의 감소를 결과한다.

특정의 작용 방식에 한정됨 없이, 항-CD200 항체는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 상기 항체가 결합하는 T 세포의 ADCC, CDC 및/또는 아폽토시스(apoptosis)를 매개할 수 있다. 상기 항체는 조절 T 세포의 총수 또는 기능을 증가시킬 수 있다. 상기 항체는 뮤린, 키메라, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 면역-제거된 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 임의적으로, 상기 항체는 증가된 작동체 기능을 유도할 수도 있다.

세포 면역 반응의 예방 또는 저해가 필요한 개체는 특정 구체예에서, 자가면역 질환 환자 또는 이식물 수용자이다. 따라서 특정 구체예에서, 본 발명은 환자에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)과 이식편 거부반응의 치료와 예방을 위한 면역치료 조성물과 방법에 관계하는데, 여기서 상기 조성물과 방법은 항-CD200 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 이식물 수용자 또는 자가면역 질환 환자는 인간이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 이식물 수용자에서 급성 또는 만성 T-세포 매개된 거부반응을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관계한다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 이러한 항-CD200 항체의 부재에서 가능한 용량보다 낮은 용량으로, 전통적인 치료 약물과 병용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법은 더욱 격심한 형태의 요법, 예를 들면, 방사선 요법(radiation therapy), 고용량 면역조절 요법(high-dose immunomodulatory therapy)(가령, T 세포를 표적화하는 고용량의 치료제), 또는 비장 절제(splenectomy)에 대한 필요를 회피한다. 병합 치료는 하기에 더욱 상세하게 논의되는데, 여기에는 예로써, 아드리아마이신(adriamycin), 아자티오프린(azathioprine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine) A, 시톡산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 비-스테로이드성 소염제, 라파마이신(rapamycin), 시롤리무스(sirolimus), 그리고 타크롤리무스(tacrolimus)가 포함된다. 다른 실례에는 항체, 예를 들면, OKT3™(muromonab-CD3), CAMPATH™-1G, CAMPATH™-1H(alemtuzumab), 또는 CAMPATH™-1M, SIMULEC™(basiliximab), ZENAPAX™(daclizumab), RITUXAN™(rituximab), 그리고 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)이 포함된다.

따라서 세포 또는 T-세포 매개된 면역 반응을 저해하기 위하여 이식물 수용자에 항-CD200이 투여되는 구체예에서, 항-CD200 항체는 단독으로, 또는 GVHD와 이식편 거부반응의 치료 또는 예방을 위한 한 가지 이상의 다른 치료제 또는 섭생(regimen)과 공동으로, 이식 이전에 또는 이식 이후에 이식물 수용자에 투여될 수 있다. 가령, 항-CD200 항체는 T 세포의 활성화를 차단 또는 저해하거나, 동종항원 제시를 교란시키거나, 또는 조절 T 세포를 확장하는데 이용된다.

C. CD200을 과다발현하는 세포를 격감시키거나 제거하는 방법

본 발명에 따라, CD200-결합제를 포함하는 치료제를 개체에 투여함으로써 CD200을 발현하는 세포를 개체 내에서 격감시키는 방법이 제시된다. 앞서 언급된 바와 같이, CD200은 특정 면역 세포 상에서 발현된다. CD200의 이러한 본질적으로 상이한 발현은 치료를 위하여 활성화된 면역 세포(즉, CD200-양성 세포)를 표적화하는 방법을 제공한다. 가령, CD200-양성 면역 세포는 자가면역 질환 또는 이식편 거부반응을 치료하는 방법에서 격감을 위하여 표적화될 수 있다.

앞서 언급된 바와 같이, CD200은 골수 세포 상에서 CD200R과의 상호작용을 통하여, 골수 활성 및/또는 이동을 위한 저해 신호를 전달함으로써 면역억제를 조절한다. CD200-적중(knockout) 생쥐는 예로써, 면역 자극(immunogenic stimuli)이후 더욱 활발한 면역 반응을 나타내고(Hoek et al. Science 2000), CD200-발현 세포는 자극된 면역 세포의 사이토킨 프로필에서 전환(shift)을 유도함으로써 면역억제를 이끌어낸다. 구체적으로, CD200-양성 세포는 혼성 세포 개체군 분석에서 Th1에서 Th2 사이토킨 생산으로의 전환을 유도할 수 있다. CD200-양성 세포는 이러한 면역 반응을 억제할 수 있고, 따라서 CD200-양성 세포는 면역 세포 공격(immune cell attack)을 회피할 수 있다. 하지만, 면역 세포의 막 상에서 CD200의 발현은 치료 시에 이들 세포를 표적화하는데 이용될 수 있다. 가령, 항-CD200 항체는 CD200-양성 세포를 특이적으로 표적하고, CD200-양성 세포를 면역 작동체 세포에 표적화시킬 수 있다. 상기 항체는 임의적으로, CD200:CD200R 상호작용을 파괴할 수도 있다. 이런 이유로, 본 발명의 구체예는 CD200-결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 격감을 위한 CD200-양성 세포를 표적화하는 방법에 관계한다.

한 측면에서, 본 발명은 뮤린, 키메라, 인간화, 또는 인간 항-CD200 항체 또는 이의 단편을 병든 개체에 투여함으로써 CD200-양성 표적 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 조절하는 방법에 관계한다. 본 발명은 증가된 ADCC 및/또는 CDC를 유도하는 변이성 항-CD200 항체 및 감소된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내거나 이러한 활성이 없는 변이성 항-CD200 항체에 관계한다.

IV. 이식 환자를 치료하는 방법

본 발명에 이용된 CD200-결합제와 폴리펩티드 및/또는 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료 적용에 특히 적합하다. 따라서 CD200-결합제, 그리고 항-CD200 항체와 이의 변이체는 질병의 진단과 예후에서, 그리고 질병 진행의 모니터링에서 복합 요법을 비롯한 요법에서 이용될 수 있다. 특정 기전에 한정됨 없이, 항-CD200 항체, 항원-결합 단편, 폴리펩티드, 또는 다른 CD200-결합제는 CD200-양성 세포를 제거함으로써, 예를 들면, 이들 세포에 결합하고 면역 공격과 세포 사멸을 위하여 이들 세포를 표적화함으로써 이식편 생존을 촉진할 수 있다. 가령, 항-CD200 항체 또는 다른 결합제는 상기 항체 또는 결합제가 결합되는 CD200-양성 세포로 작동체 세포 또는 다른 리간드(가령, 보체 성분)를 동원하고 작동체-매개된 세포 사멸(cell death)을 위하여 상기 CD200-양성 세포를 표적한다.

특정 측면에서, 본 발명은 CD200-결합제를 투여하는 단계를 포함하는, 이식(가령, 이종이식 또는 동종이식)을 받았거나 받을 예정인 환자를 치료하는 방법에 관계한다. 특정 구체예에서, 결합제는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 부가적으로, 상기 항체는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 또는 면역-제거된 항-CD200 항체일 수 있다. 따라서 이식 환자를 치료하는 방법은 본 발명에 열거된 CD200-결합제와 항체 중에서 한 가지를 포함한다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 CD200-결합제는 예로써, T-세포, B-세포와 수상돌기 세포와 같은 면역 세포를 비롯하여, 표면 상에 CD200을 발현하는 임의 유형의 세포를 격감시키는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 항-CD200 항체는 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들면, 이식 거부반응과 연관된 면역 반응에 관여하는 면역 세포의 표적화된 파괴에 유용하다. 본 발명에 개시된 항-CD200 항체로 저해 또는 예방될 수 있는 전형적인 면역 반응에는 예로써, 염증 반응(가령, 항-CD200 항체가 염증성 사이토킨, 예를 들면, TNF-α와 INF-γ의 생산을 저해한다), 동종항원 및/또는 이종항원에 특이적인 항체의 생산, 그리고 T-세포 매개된 반응이 포함된다.

이런 이유로, 본 발명에 개시된 방법과 조성물에 따라서, 본 발명은 동종이식편 환자를 치료하는 방법에 관계한다. 본 발명의 항-CD200 항체 또는 다른 CD200-결합제는 이식된 기관, 조직, 또는 세포의 환자 수용성(acceptance)을 감소시킬 수 있는 CD200-양성 면역 세포를 감소시키거나 제거하기 위하여, 이식이나 동종이식 절차 이전에 또는 이러한 절차 이후에 환자에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 증가된 작동체 기능을 갖는 항-CD200 항체가 이식 환자에 제공된다.

본 발명의 항-CD200 항체는 앞서 기술된 바와 같이 폭넓은 범위의 기관, 조직, 그리고 세포 이식편의 거부반응을 저해하거나, 또는 이들의 생존을 촉진하는데 이용될 수 있다. 또한, 이들 항체는 예로써, 골수 이식 이후에 이식편 대 숙주 질환을 저해하는데 이용될 수 있다.

이식편 수용자가 인간인 특정 구체예에서, 동종이식편은 MHC 미스매치(mismatch)될 수 있다. 특정 구체예에서, MHC 미스매치된 동종이식편은 HLA 미스매치된 동종이식편이다. 다른 구체예에서, 수용자는 동종이식편에 ABO 미스매치된다.

CD200-결합제 또는 항체를 포함하는 치료제는 복합 요법으로 환자에 투여될 수 있다. 따라서 이식편 거부반응을 치료하거나 예방하기 위한, 또는 이식 생존(transplant survival)을 강화하거나 연장하기 위한 면역 세포의 특정 개체군의 표적된 사멸이 복합 요법의 일부로서 수행될 수 있다. 가령, CD200-결합제(가령, 본 발명에 개시된 항-CD200 항체)를 포함하는 첫 번째 치료제를 복용하는 환자에 두 번째 치료제 역시 제공될 수 있다. CD200-결합제는 두 번째 치료제와 동시에 제공될 수 있다. 대안으로, 이러한 CD200 길항물질은 두 번째 치료제 이전에 또는 이후에 제공될 수도 있다. 두 번째 치료제에는 폴리펩티드, 소형 분자, 화학물질, 금속, 유기금속 화합물, 무기 화합물, 핵산 분자, 올리고뉴클레오티드, 압타머, 거울상 압타머, 안티센스 핵산, 잠금 핵산(LNA) 저해물질, 펩티드 핵산(PNA) 저해물질, 면역조절제, 항원-결합 단편, 프로드러그, 또는 펩티드모방체 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 구체예에서, 두 번째 치료제에는 소염제, 면역억제제 및/또는 항-전염성 작용제가 포함된다.

본 발명의 복합 요법에는 예로써, 스테로이드, 항-말라리아제, 아스피린, 비-스테로이드성 소염제, 면역억제제, 또는 세포독성제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는 본 발명에 개시된 CD200-결합제(가령, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편)가 포함된다. 코르티코스테로이드(가령, 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone)과 프레드니솔론(predisolone)), 메토트렉세이트(methotrexate), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 마크로라이드 면역역제제(macrolide immunosuppressant)(가령, 시롤리무스(sirolimus)와 타크롤리무스(tacrolimus)), 유사분열 저해물질(가령, 아자티오프린(azathioprine), 시클로포스파미드(cyclosphamide)와 메토트렉세이트(methotrexate), T 림프구의 활성을 저해하는 진균 대사물질(가령, 시클로스포린(cyclosporine)), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate), 그리고 세포독성과 DNA-손상 작용제(가령, 클로람부실(chlorambucil))가 포함된다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 OKT3(muromonab-CD3), 아자티오프린(azathioprine), 레플루노마이드(leflunomide), 브레퀴나르(brequinar), ATG, ALG, 15-데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), LF15-0195(Tesch et al. Kidney Int. 2001 60(4): 1354-65; Yang et al. J. Leukocyte Biol. 2003;74:438-447), CTLA-4-Ig(belatacept), 리툭산(rituxan), IVIg와 브레디닌(bredinin)에서 선택된다. 소염제에는 탈리도미드(thalidomide)와 이의 유사체, 예를 들면, 레날리도마이드(lenalidomide)(Revlimid, CC-5013)와 CC-4047(Actimid)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 동종이식 또는 이식 환자의 경우에, 예로써, 항-CD200 요법은 인터류킨-2 수용체의 α-사슬에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 인간 IgG1 단클론 항체인 다클리주맙, 그리고 면역 세포 또는 다른 세포를 표적화하는 다양한 다른 항체(가령, 항-T 세포 항체)를 비롯한 항체 치료제와 병합될 수 있다. 이런 복합 요법은 면역 반응을 저해하는데 유용할 수 있다. 본 발명은 또한, 하나 이상의 작용제에 접합된 CD200-결합제(가령, 본 발명에 개시된 항체와 이들의 변이체)를 포함하는 이식 환자용 치료제에 관계한다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 면역억제제가 투여된다. 다른 구체예에서, 면역조절 치료 방법, 예를 들면, 혈장 사혈(plasmapheresis), 비장 절제(splenectomy) 또는 면역 흡착(immunoadsorption)이 항-CD200 항체와 병용된다. 반대로, 항-CD200 항체를 포함하는 복합 요법은 이런 치료에 대한 요구를 배제시킬 수도 있다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체는 세포 면역 기능의 저해물질과 공동으로 투여된다. 이런 저해물질에는 시클로스포린(cyclosporine) A, 타크롤리무스(tacrolimus), 라파마이신(rapamycin), 항-T 세포 항체, 다클리주맙(daclizumab), 그리고 무로모납(muromonab)-CD3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에서 증명된 바와 같이, 항-CD200 항체와 세포 면역 기능의 저해물질의 병합은 대조 이식편 수용자(가령, 치료를 받지 않은 수용자 또는 단독요법, 예를 들면, 세포 면역 기능의 저해물질이 제공된 수용자)에서 관찰되는 생존과 비교하여 이식편의 생존을 증가시킨다. 증가된 생존에는 예로써, 생존 기간(예로써, 일(day), 월(month), 또는 연(year)으로 측정됨)에서 최소한 대략 15%, 최소한 대략 20%, 최소한 대략 25%, 최소한 대략 30%, 최소한 대략 40%, 또는 최소한 대략 50% 증가가 포함된다.

특정 구체예에서, 항-CD200 항체와 T 세포 저해물질을 포함하는 병합 치료(combination treatment)는 동종이식편의 장기 생존으로 이어진다. 인간에서 장기 생존에는 예로써, 이식후 최소한 대략 5년, 최소한 대략 7.5년, 그리고 최소한 대략 10년 생존이 포함된다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 T 세포 활성의 저해물질을 포함하는 병합 치료는 이식편의 적응(accommodation)으로 이어진다.

특정 기전에 한정됨 없이, 이런 병합에서 세포 면역 기능의 저해물질은 T 세포 반응을 저해하고 사이토킨 프로필(cytokine profile)을 변화시킬 수 있는 반면, 항-CD200 항체는 항체 반응과 아마도, T 세포 반응을 저해한다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체의 투여는 만약 그렇지 않으면 이식편 생존의 동일하거나 유사한 수준을 달성하기 위하여 요구되는 용량보다 낮은 용량으로 세포 면역 기능의 저해물질(가령, 시클로스포린 A)의 성공적인 이용을 가능하게 한다.

따라서 특정 측면에서, 본 발명은 CD200-결합제, 예를 들면, 항-CD200 항체와 이들의 항원-결합 단편을 이용하여 기존의 면역억제제(시클로스포린, 아자티오프린, 부신피질 스테로이드, FK-506 등)의 이식편 거부반응에 대한 억제 효과를 강화시키는 방법에 관계한다.

복합 요법의 성격에 따라, 항-CD200 항체의 투여는 다른 치료제의 투여 동안 및/또는 투여 이후에 지속될 수 있다. 항체의 투여는 단일 분량(single dose), 또는 복수 분량(multiple dose)으로 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 항-CD200 항체의 투여는 통상적인 치료제에 최소한 수일 앞서 시작되고, 다른 사례에서, 투여는 통상적인 치료제의 투여 직전에 또는 투여 시점에 시작된다. 일부 사례에서, 항-CD200 항체는 다른 치료제 이후에 투여되거나, 또는 다른 치료제와 교대로 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 다양한 세포독성 화합물을 전달하는데 이용될 수 있다. 임의의 세포독성 화합물이 본 발명의 항체에 용합될 수 있다. 융합은 화학적으로 또는 유전적으로(가령, 단일의 융합된 분자로서 발현을 통하여) 달성될 수 있다. 세포독성 화합물은 생물학적 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드, 또는 소형 분자일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 소형 분자의 경우에 화학적 융합이 이용되는 반면, 생물학적 화합물의 경우에 화학적 또는 유전적 융합이 이용될 수 있다.

세포독성 화합물의 무-제한적 실례에는 치료 약물, 방사선 방출 화합물, 식물, 진균 또는 세균 기원의 분자, 생물학적 단백질, 그리고 이들의 혼합물이 포함된다. 세포독성 약물은 세포내 작용 세포독성 약물, 예를 들면, 근거리, 높은 에너지 α-방사체를 비롯한 근거리 방사선 방사체일 수 있다. 효소 활성 독소와 이의 단편은 예로써, 디프테리아 독소 A 단편, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래됨), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파-사크린(alpha-sacrin), 특정의 유동(Aleurites fordii) 단백질, 특정의 디안틴(Dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAP, PAPII와 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 저해물질, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 저해물질, 젤로닌(gelonin), 미토길린(mitogillin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin)과 에노마이신(enomycin)에 의해 예시된다. 면역 독소의 효소 활성 폴리펩티드를 제조하는 절차는 WO85/03508에 기술된다. 특정의 세포독성 모이어티는 예로써, 아드리아마이신(adriamycin), 클로람부실(chlorambucil), 다우노마이신(daunomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 또는 백금으로부터 유래된다. 항체를 세포독성 작용제와 접합하는 절차는 기존 문헌에서 기술되었고, 당업자의 이해 범위 내에 속한다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따라, 치료적 처리의 진행 및/또는 효능을 모니터링하기 위한 방법이 제시된다. 상기 방법은 면역조절제를 투여하는 단계 및 개체 내에서 CD200 수준을 최소한 2회 측정하여 이러한 치료의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 가령, CD200의 사전 처리 수준이 확정될 수 있고, 이러한 치료제의 최소한 1회 투여후, CD200의 수준이 다시 결정될 수 있다. CD200 수준에서 감소는 효과적인 치료를 지시한다. CD200 수준의 측정은 치료의 용량 또는 빈도를 증가시키기 위한 가이드로서 의사에 의해 활용될 수 있다. 당연히, CD200 수준이 직접적으로 모니터링되거나, 또는 대안으로, CD200과 상관하는 임의의 마커가 모니터링될 수 있다.

V. 투여 방식과 제제

본 발명의 항체(순수한 항체, 표지된 항체, 독소에 융합된 항체 등인 지에 상관없이)의 투여 경로는 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 뇌내(intracerebral), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 안구내(intraocular), 동맥내(intraarterial), 척수강내(intrathecal), 흡입이나 병소내 경로에 의해, 또는 서방 시스템(sustained release system)에 의해, 공지된 방법, 예를 들면, 주사 또는 주입이다. 적절하게는, 항체는 주입 또는 일시 주사(bolus injection)에 의해 연속적으로 투여된다. 이들 항체는 국소 또는 전신 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체는 제약학적으로 허용되는 담체(제약학적ly acceptable carrier)와의 혼합물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 조제와 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition에서 확인할 수 있다. 이러한 치료 조성물은 정맥내, 또는 코 또는 폐를 통하여, 바람직하게는, 액상 또는 분말 에어로졸(동결건조된)로서 투여될 수 있다. 조성물은 또한, 원하는 경우에 비경구 또는 피하 투여될 수 있다. 전신 투여되는 경우에, 이러한 치료 조성물은 무균이고, 실질적으로 발연원이 없고, pH, 등장성(isotonicity)과 안정성의 관점에서 적절한 비경구 허용가능 용액에 담겨 제공되어야 한다. 가령, 제약학적 조성물은 인간 치료제로서 투여에 적합하도록 발열원 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 이들 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

본 구체예에 열거된 조성물과 방법에 따라서, 본 발명은 항-CD200 항체를 포함하는 임의의 제약학적 조성물에 관계한다. 키메라, 인간화, 인간과 면역-제거된 항-CD200 항체, 그리고 단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 단편이 포함된다. 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이 변화된 작동체 기능을 갖는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간과 면역-제거된 변이 항-CD200 항체, 그리고 항원-결합 단편이 포함된다. 본 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 면역조절제 또는 면역억제제, 예를 들면, T 세포 기능의 저해물질을 더욱 포함할 수 있다.

이용하기 적합한 제약학적 조성물에는 본 발명의 하나 이상의 항체가 그들의 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 내포된 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료 효과량(therapeutically effective amount)은 질병을 예방하거나, 완화시키거나 또는 상기 질환의 증상을 개선하는데 효과적인, 또는 치료되는 개체의 생존을 연장시키는데 효과적인, 또는 이식된 기관, 조직 또는 세포의 생존을 연장시키는데 효과적인 항체의 양을 의미한다. 치료 효과량의 결정은 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어, 당업자의 능력 범위 내에 속한다. 치료 효과량은 시험관내와 생체내 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명에서는 병든 개체(가령, 이식편 수용자)의 생존을 연장시키거나, 또는 이러한 개체에서 질병을 저해하기 위한 약제 또는 약제 패키지의 제조에서 CD200-결합제와 면역조절제 또는 면역억제제의 용도를 제시한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 면역억제제가 약제 또는 약제 패키지에 포함된다. 특정 구체예에서, 결합제(가령, 항-CD200 항체 또는 이의 단편)와 면역조절제 또는 면역억제제는 병든 개체에 동시 투여에 적합한 제제 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 결합제(가령, 항-CD200 항체 또는 이의 단편)와 면역조절제 또는 면역억제제는 병든 개체에 순차적 투여에 적합한 제제 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 병든 개체에 장기적 투여에 적합한 제제 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 병든 개체, 예를 들면, 이식편 수용자에 장기적 투여에 적합한 제제 내에 존재한다.

특정 구체예에서, CD200-결합제는 항체와 동결건조보호제(lyoprotectant)를 포함하는 동결건조된 제제에서 항체이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 면역조절제 또는 면역억제제는 면역억제제와 동결건조보호제를 포함하는 동결건조된 제제 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 항체와 면역억제제는 항체, 면역억제제와 동결건조보호제를 포함하는 동일한 동결건조된 제제 내에 존재한다. 특정 구체예에서, CD200-결합제, 예를 들면, 항-CD200 항체는 카트리지를 포함하는 주사기를 포함하는 주사 시스템 내에 존재하고, 여기서 상기 카트리지는 주사에 적합한 제제 내에 항체를 내포한다. 특정 구체예에서, 면역조절제 또는 면역억제제는 카트리지를 포함하는 주사기를 포함하는 주사 시스템 내에 존재하고, 여기서 상기 카트리지는 주사에 적합한 제제 내에 면역조절제 또는 면역억제제를 내포한다. 특정 구체예에서, 항-CD200 항체와 면역조절제 또는 면역억제제는 카트리지를 포함하는 주사기를 포함하는 주사 시스템 내에 존재하고, 여기서 상기 카트리지는 주사에 적합한 제제 내에 항체와 면역조절제 또는 면역억제제를 내포한다. 항체 및/또는 면역조절제 또는 면역억제제는 단위 약형(unit dosage form)으로 존재할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 체액 반응과 세포 반응을 비롯한 면역 반응을 저해하는 방법, 그리고 이식된 세포, 조직 또는 기관의 이식편 거부반응을 저해하거나, 또는 이식된 세포, 조직 또는 기관의 생존을 연장시키는 방법을 제시한다. 특히, 동종이식된 세포, 조직 또는 기관의 생존을 연장시키는 방법이 제시된다. 이들 방법은 선택적으로, 하나 이상의 면역억제 및/또는 면역조절 방법과 공동으로, CD200-결합제, 예를 들면, 항-CD200 항체를 이용하는 것에 관계한다. 또한, 본 발명에서는 하나 이상의 약제 또는 약제 패키지의 제조에서 선택적으로, 하나 이상의 면역억제제와 함께, CD200-결합제, 예를 들면, 항-CD200 항체의 용도를 제시한다. 이런 약제 또는 약제 패키지는 예로써, 자가면역 질환 환자 또는 이식물 수용자에서 면역 반응을 저해하는데 유용하다.

본 발명에 따른 조성물은 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해함으로써 이식편 거부반응을 저해하고 이식편 생존을 촉진하거나 연장시키는데 효과적이다.

도면의 간단한 설명
도 1A-1F에서는 항체 chC2aB7-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5와 6)을 도시한다. 도 1C에서는 SEQ ID NO: 3(핵산서열)과 SEQ ID NO: 1(아미노산 서열)을 도시한다. 개략적으로 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 3은 연속적이지만 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열로 묘사된다. 도 1F에서는 SEQ ID NO: 6(핵산서열)과 SEQ ID NO: 4(아미노산 서열)를 도시한다. SEQ ID NO:5(도 1E에 도시됨)에서는 SEQ ID NO:4(도 1D에 도시됨)를 인코딩한다.
도 2A-2F에서는 항체 chC2aB7-hG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13과 14)을 도시한다. 도 2C에서는 SEQ ID NO: 10(핵산서열)과 SEQ ID NO: 9(아미노산 서열)를 도시한다. SEQ ID NO: 9는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1- 337에 해당한다. 개략적으로 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 10은 연속적이지만 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열로 묘사된다. 도 2F에서는 SEQ ID NO: 14(핵산서열)와 SEQ ID NO: 13(아미노산 서열)을 도시한다. SEQ ID NO: 12(도 2E에 도시됨)는 SEQ ID NO:11(도 2D에 도시됨)을 인코딩한다.
도 3A-3F에서는 항체 hB7V3V2-hG1의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19와 20)을 도시한다. 도 3C에서는 SEQ ID NO: 17(핵산서열)과 SEQ ID NO: 15(아미노산 서열)를 도시한다. 도 3F에서는 SEQ ID NO: 20(핵산서열)과 SEQ ID NO: 18(아미노산 서열)을 도시한다. SEQ ID NO: 19(도 3E에 도시됨)는 SEQ ID NO: 18(도 3D에 도시됨)을 인코딩한다.
도 4A-4F에서는 항체 hB7V3V2-hG2G4의 중쇄와 경쇄에 대한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25와 26)을 도시한다. 도 4C에서는 SEQ ID NO: 23(핵산서열)과 SEQ ID NO: 21(아미노산 서열)을 도시한다. 개략적으로 도시된 바와 같이, SEQ ID NO: 23은 연속적이지만 인트론을 포함하는 상응하는 뉴클레오티드 서열로 묘사된다. 도 4F에서는 SEQ ID NO: 26(핵산서열)과 SEQ ID NO: 24(아미노산 서열)를 도시한다. SEQ ID NO:25(도 4E에 도시됨)는 SEQ ID NO:24(도 4D에 도시됨)를 인코딩한다.
도 5에서는 활성화된 T-세포 상에서 CD200 발현의 유세포분석 결과를 도시한다. CD3+ 인간 세포는 mOKT3으로 활성화되고, 수확되고, 세척되고, 인간 CD25, CD200, CD5, CD4와 CD8에 특이적인 지정된 형광색소(fluorochrome)-접합된 항체로 착색되었다. 세포는 세척되고, CellQuest 소프트웨어를 이용하여 FACSCalibur 유세포분석기(flow cytometer)에서 면역형광(immunofluorescence)에 대하여 분석되었다. 인간 T 세포의 활성화는 CD200 발현의 극적인 상향조절(upregulation)을 결과한다.
도 6에서는 활성화된 T-세포의 ADCC에 대한 항-CD200 항체의 효과를 증명한다. CD3+ 인간 T 세포는 72시간 동안 10 ㎍/㎖ 고정된(평판-코팅된) mOKT3으로 자극되었다. 활성화된 T 세포는 이후, 표적으로서 이용을 위하여 크롬산염으로 처리되고 작동체 세포로서 정제된 자가조직 CD56+(NK) 세포와 함께 배양되었다. 세포는 작동체 기능을 매개할 수 있는 인간화 항-CD200 항체(V3V2-G1), 또는 작동체 기능이 부재하도록 조작된 인간화 항-CD200 항체(V3V2-G2G4)의 존재 또는 부재에서, 25:1(A) 또는 10:1(B) 작동체:표적 세포 비율에서 37℃에서 4시간 동안 공동 배양되었다. 데이터는 특이적인 용해(lysis) 비율로서 제시된다. 작동체 기능을 갖는 항-CD200 항체는 활성화된 T-세포 표적의 ADCC를 효과적으로 매개하는 반면, 작동체 기능이 없는 항-CD200 항체는 ADCC를 매개하지 못하였다.
도 7A-B에서는 T 세포의 저해물질(시클로스포린 A)과 공동으로 투여된 항-CD200 항체가 뮤린 심장 동종이식편 모형에서, 항체 생산의 현저한 감소 또는 체액 면역 반응의 저해를 유도한다는 것을 보여준다. 도 7A에서는 다양한 면역조절 치료 이후에, 심장 동종이식편 수용자에서 순환 항-공여자 IgG 항체의 상대적인 수준을 보여준다. 도 7B에서는 다양한 면역조절 치료 이후에, 심장 동종이식편 수용자에서 순환 항-공여자 IgM 항체의 상대적인 수준을 보여준다. MFI는 평균 형광 강도이다.
도 8에서는 항-CD200 항체와 시클로스포린 A를 비롯한 다양한 면역조절 치료 이후에, 생쥐 심장 동종이식편 수용자에서 비장 CD4+와 CD8+ T 세포의 수준을 보여준다. 이식편 수용자로부터 비장 세포는 유세포분석법으로 분석되었다.
도 9A-C에서는 항-CD200 항체와 시클로스포린 A로 치료 이후에, 생쥐 심장 동종이식편 수용자에서 CD3CD200; CD3CD200R, CD19CD200, CD19CD200R, CD11cCD200, 그리고 CD11cCD200R 양성 세포의 수준을 보여준다.
도 10에서는 OX90NE(SEQ ID NO:27)와 OX90mG2a(SEQ ID NO:28)의 중쇄 서열을 도시한다. 이들 두 분자 간에 4개의 아미노산 차이는 굵은 글씨체로 표시된다(아미노산 잔기 236, 319, 321과 323). 각각의 가변 영역은 아미노산 잔기 1-118을 포함한다. 각각의 불변 영역은 아미노산 잔기 119-448을 포함한다.
도 11에서는 OX90 항체가 CD200R1 수용체에 CD200의 결합을 차단한다는 점에서, 차단 항체(blocking antibody)임을 보여준다.

VI. 예증

실시예 1

항체 hB7V3V2에 의한 T 세포 사멸

작동체 기능을 매개하는 불변 영역(가령, IgG1 불변 영역)을 포함하는 항-CD200 항체와 함께, 활성화된 T 세포의 배양이 T 세포의 사멸을 유도하는 지를 평가하기 위하여, T 세포는 활성화시키고 아래에 기술된 바와 같이 설정된 사멸 검사를 수행하였다.

A) CD3+ T 세포 분리

인간 말초혈 림프구(PBL)는 Accuspin™System을 이용한 헤파린화된 전혈의 밀도 변화도 원심분리(density gradient centrifugation)로 정상적인 건강한 지원자로부터 획득하였다. 15 ㎖의 Histopaque-1077(Sigma, St. Louis, MO; cat# H8889)을 각 Accuspin 튜브(Sigma, St. Louis, MO; cat# A2055)에 첨가하고, 상기 튜브는 이후, Histopaque가 프릿(frit)을 통과할 수 있도록 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 30 ㎖의 전혈은 프릿 위에 층을 만들고, 튜브는 브레이크(brake) 없이 실온에서 15분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. PBL 접촉면은 회수하고, 단핵 세포는 2% 열-비활성화된 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 PBS(Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; cat# F-0500-D)에서 2회 세척하고 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. CD3+ T 세포는 제조업체의 지시에 따라, HTCC-5 칼럼(R&D Systems) 통과로 분리하였다. 용출된 세포는 세척하고, 계산하고, 5% 열-비활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes와 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 재현탁시켰다.

B. 평판-결합된 mOKT3으로 활성화

12-웰 평판(Falcon)의 웰은 PBS에 희석된 10 ㎍/㎖ mOKT3(Orthoclone)과 함께 4℃에서 하룻밤 배양으로 표면을 덮었다. 잔류 항체는 제거하고, 이들 평판은 PBS로 부드럽게 씻어냈다. 앞서 기술된 바와 같이 분리되고 정제된 CD3+ T 세포는 5% 열-비활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes와 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 2x10⁶/웰의 최종 농도로 이들 평판에 첨가하였다. 세포는 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기(humidified incubator) 내에서 37℃에서 72시간 동안 유지시켰다.

C. mOKT3-활성화된 CD3+ 표적 세포의 ⁵¹ 크롬 표지화

배양 기간의 종결 시점에서, mOKT3-활성화된 CD3+ 세포를 회수하고, 세척하고, 혈청-없는 RPMI 1640에서 10⁷개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포는 37℃에서 2시간 동안 125 μCi의 ⁵¹크롬(Perkin Elmer, Billerica, MA)/10⁶개 세포의 첨가로 크롬산염 처리하였다. 표지된 세포는 회수하고, 5% 열-비활성화된 단일 공여자 혈청을 포함하는 RPMI에서 세척하고, 동일한 매체 내에서 2x10⁵개 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다.

D. 자기조직 NK 작동체 세포의 제조

동일한 개체로부터 인간 말초혈 림프구(PBL)는 앞서 기술된 바와 같이 밀도 변화도 원심분리로 획득하였다. PBL 접촉면은 회수하고, 단핵 세포는 2% 열-비활성화된 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 PBS(Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; cat# F-0500-D)에서 2회 세척하고 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. CD56+ 세포는 제조업체의 지시에 따라, 항-CD56-접합된 자성 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, Cat # 120-000-307) 위에서 양성 선택(positive selection)으로 분리하였다. 용출된 세포는 세척하고, 계산하고, 5% 열-비활성화된 단일 공여자 혈청, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes와 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 1.3x10⁶개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포는 3 ㎖의 동일한 매체 내에서 4x10⁶개 세포/웰의 최종 농도로 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기 내에서 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양 기간의 종결 시점에서, 이들 세포는 회수하고, 세척하고, 계산하고, 2 mM L-글루타민, 10 mM Hepes, 2 x 10^-5M 2-메르캅토에탄올과 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 혈청-없는 RPMI에서 재현탁시켰다.

E. ADCC 검사

앞서 기술된 바와 같이 준비된 ⁵¹Cr-표지된 mOKT3-활성화된 CD3+ 표적 세포는 96-웰 평판의 웰 내에서 50 ㎕에서 10⁴개 세포/웰로 분포시켰다. CD56+ 작동체 세포는 수집하고, 세척하고, 계산하고, 2.5x10⁶개 세포/㎖(25:1의 작동체 : 표적 세포 비율의 경우에) 또는 10⁶개 세포/㎖(10:1의 작동체 : 표적 세포 비율의 경우에)로 재현탁시키고, 표적 세포를 포함하는 웰에 분포시켰다(100 ㎕/웰). 항-CD200 항체(V3V2-G1 또는 V3V2-G2/G4)의 10배 희석액은 10, 1, 0.1과 0.01 ㎍/㎖의 최종 농도로 이들 작동체와 표적에 첨가하였다. 포함된 검사 대조(Assay control)는 아래와 같다: 1) 항체의 부재(0 Ab)에서 작동체와 표적; 2) 작동체의 부재(자발적 용해)에서 표적 세포; 3) 0.2% Tween-80(최대 방출)과 함께 배양된 작동체와 표적. 모든 세포 배양 조건은 삼중으로 수행되었다. 세포는 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기 내에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 기간의 종결 시점에서, 이들 평판은 원심분리하여 이들 세포를 펠릿으로 만들고, 150 ㎕의 세포 상층액은 신틸레이션 바이알(scintillation vial)로 이전하고 감마 신틸레이션 계수기(gamma scintillation counter)(Wallac)에서 계산하였다. 이의 결과는 아래의 공식에 따라, 특이적 용해 비율(percent specific lysis)로서 표시된다:

F. 유세포분석법

앞서 기술된 바와 같이 준비된 100 ㎕의 세포 현탁액(mOKT3 -활성화된 CD3+ 세포 또는 정제된 CD56+ NK 세포)은 96-웰 둥근 바닥 평판(Falcon, Franklin Lakes NJ; cat# 353077)의 웰에 분포시켰다. 세포는 아래의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-, 피코에리트린(PE)-, PerCP-Cy5.5-, 또는 알로피코시아닌(APC)-접합된 항체(Becton-Dickinson, San Jose, CA); 항-인간 CD25-FITC(cat# 555431); 항-인간 CD3-APC(cat# 555335); 항-인간 CD200-PE(cat# 552475); 항-인간 CD8-PerCP-Cy5.5(cat# 341051); 항-인간 CD4-APC(cat# 555349); 항-인간 CD5-APC(cat# 555355)와 항-인간 CD56-APC(cat# 341025)의 지정된 병합과 함께, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 각 표지된 항체에 대한 아이소타입 대조 역시 포함되었다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척(3분 동안 1800 rpm 원심분리)한 이후, 세포는 300 ㎕의 PBS(Mediatech, Herndon, VA; cat# 21-031-CV)에 재현탁시키고, FacsCaliber 기계와 세포Quest 소프트웨어(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용한 유세포분석법으로 분석하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 활성화된 T 세포는 그들의 표면 상에서 높은 CD200 발현을 나타낸다. 활성화된 T 세포는 NK 세포가 작동체 세포로 이용되는 경우에, hB7V3V2-G1의 존재에서 효과적으로 사멸되지만 hB7V3V2-G2G4의 존재에서는 그렇지 않다(도 6). 이들 데이터는 작동체 기능을 보유하는 항-CD200 항체가 활성화된 T 세포를 제거할 수 있음을 증명한다. 이런 항체는 이식 환경에서 또는 자가면역 질환을 치료하기 위하여 치료적으로 유용할 수 있다.

조절 T 세포 이외에, 형질세포양 수상돌기 세포가 인간 암에서 음성 면역조절 역할(negative immunoregulatory role)을 수행하는 것으로 밝혀졌다(Wei S, et al., Cancer Res. 2005 Jun 15; 65(12):5020-6). 이런 이유로, 항-CD200 요법과 형질세포양 수상돌기 세포를 제거하는 요법의 복합이 유익할 수 있다.

실시예 2

항-CD200 mAb는 생쥐 심장 이식 모형에서 급성 동종이식편 거부반응을 예방한다.

칼시뉴린(calcineurin) 저해물질, 예를 들면, 시클로스포린 A(CsA)와 타크롤리무스는 좁은 치료 범위를 갖는 것으로 알려져 있다. 심지어 치료 용량에서, 이들 약물은 신독성(nephrotoxicity)의 위험이 상당하다(Seron, D., and F. Moreso. 2004, Transplant Proc 36:257S). 준치료 수준(subtherapeutic level)의 CsA 또는 타크롤리무스로 치료는 현저하게 낮은 발생률의 신독성을 결과하긴 하지만 동시에, 현저한 이식편 거부반응을 보였다(Seron, D., and F. Moreso, 2004. Transplant Proc 36:257S; Dunn et al., 2001, Drugs 61:1957; Scott et al. 2003 Drugs 63:1247). 현재 치료 섭생(therapy regimen)의 한계와 부작용은 CsA의 요구량을 감소시키고 저용량 CsA와 상승 작용하여 급성 거부반응을 예방하고 이식편 생존을 연장시키는 신규한 약물에 대하여 탐색하는 것이 유의미함을 지시한다.

본 연구에서는 C57BL/6-에서-BALB/c 완전 MHC-미스매치된 생쥐 심장 이식 모형에서 이식편 생존을 조사하였다. 각 실험 군은 5마리 동물로 구성되었다. 아래와 같은 치료제가 투여되었다:

- 항-CD200 mAb: 100 ㎍/생쥐/day, 0 - 14 일, i.p.

- 라파마이신(Rapa): 2 ㎎/kg/day, 0 - 13 일, 경구

- 시클로스포린 A(CsA):

저용량/장기 치료: 5 ㎎/kg/day, 0 일 - 종점, s. c.

고용량/장기 치료: 15 ㎎/kg/day, 0 일 - 종점, s. c.

고용량/단기 치료: 15 ㎎/kg/day, 0 - 28 일, s.c.

이용된 항-CD200 mAb는 European Collection of Cell Cultures(ECACC No. 03062502; Hoek et al., Science 290:1768-1771 (2000))로부터 하이브리도마로서 획득되는 쥐 항-생쥐 CD200 mAb인 OX90으로부터 유래된 키메라 항체인 OX90mG2a이었다. 상기 쥐 항체는 뮤린 IgG2a 불변 영역에 융합된 쥐 중쇄 가변 영역과 뮤린 kappa 불변 영역에 융합된 쥐 경쇄 가변 영역을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 표 1의 데이터를 획득하기 위하여 이용되는 항체는 표 2에서 항체가 획득된 항체 제조물과 상이한 항체 제조물로부터 획득되었다. 표 2에는 OX90NE으로 불리는 항체를 이용한 데이터가 추가적으로 포함된다. 항체 OX90NE는 감소된 작동체 기능을 갖도록 조작된 쥐 항-생쥐 CD200 항체이다. 이는 OX90mG2a 중쇄의 4개의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성되었다(경쇄는 동일하다). OX90mG2a와 OX90NE의 서열은 도 10에 도시된다. 다양한 OX90 항체는 도 11에 도시된 바와 같이, 차단 항체(blocking antibody)이다. 높은 수준의 뮤린 CD200을 발현하는 A20 라인의 세포는 20 ㎍/㎖ 12B4(대조) 또는 OX90 변이체 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포는 세척하고 R-PE와 접합된 10 ㎍/㎖ CD200R1-Fc(Invitrogen/molecular probes, 카탈로그 Z 25155)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 결합은 유세포분석법으로 분석하였다. 보이는 바와 같이, OX90hG2G4, OX90NE와 OX90mG2a는 A20 세포 상에서 CD200에 R-PE 표지된 CD200R1-Fc의 결합을 효과적으로 차단하는 반면, 대조 항체 12B4는 결합을 차단하지 못하였다.

이식편 조직구조

검시에서, 심장 조직 시료는 10% 완충된 포름알데히드(formaldehyde)에 고정시키고, 파라핀(paraffin)에 포매(embedding)하고, 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)(H&E) 착색을 위하여 절단하였다. 이들 현미경적 조각은 1명의 병리학자가 거부반응의 중증도(severity)에 대하여 맹검 방식(blinded fashion)으로 조사하였다 (B. G.). 이식편 거부반응의 기준에는 혈관염(vasculitis), 혈전증(thrombosis), 출혈(hemorrhage)과 림프구 침윤(lymphocyte infiltration)의 존재가 포함되고, 이들 거부반응은 아래와 같이 기록되었다: 0, 변화 없음; 1, 극미한 변화; 2, 경미한 변화; 3, 중간 변화; 또는 4, 정상 조직과 비교하여 유의한 변화.

면역조직화학

4개의 마이크로미터(micrometer) 조각은 Tissue-Tek Optimum Cutting Temperature(O. C. T.) 겔(Skura Finetek, Torrance, CA)에 포매된 심장 동결된 조직 시료로부터 절단하고, 젤라틴-코팅된 유리 현미경 슬라이드(gelatin-coated glass microscope slide)에 올려놓고, Elite Vectastain ABC 키트(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)를 이용한 표준 간접 아비딘(avidin)-비오틴(biotin) 면역과산화효소(immunoperoxidase) 방법으로 착색하였다. 견본(specimen)은 각각, 비오틴-접합된 쥐 항-생쥐 CD4 mAb(클론 YTS 191.1.2, Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Canada)와 비오틴-접합된 쥐 항-생쥐 CD8 mAb(클론 53-6.7, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포의 존재에 대하여 평가하였다. 이식편내 단핵구(monocyte)/대식세포(macrophage) 침윤은 비오틴-접합된 쥐 항-생쥐 Mac-1 mAb(Cedarlane)로 검출하였다. 생쥐 IgG와 IgM 침착은 각각, 비오틴-접합된 염소 항-생쥐-IgG와 염소 항-생쥐-IgM(Cedarlane)를 이용하여 이식편 내에서 검출하였다. 보체 침착(complement deposition)의 확인을 위하여, 조직 조각은 다클론 염소 항-생쥐 C3 또는 항-생쥐 C5 혈청(Quidel, San Diego, CA), 비오틴화된 토끼 항-염소 IgG(Vector Laboratories), 그리고 HRP-접합된-스트렙타비딘(streptavidin)(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)과 함께 순차적으로 배양하였다. 슬라이드는 항체 배양 단계 간에 인산염-완충된 염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고 광 현미경(light microscopy) 하에 조사하였다. 음성 대조(negative control)는 상기 일차 항체를 생략함으로써 수행되었다. 항체 반응성(antibody reactivity)은 치료 군당 5마리 동물로부터 조직 시료를 이용하여 각 조각의 5개 고전력 필드(high-powered field)에서 평가하였다. 착색 강도는 아래와 같이 0 내지 4+ 등급으로 나누었다: 0, 음성; 1+, 분명치 않음; 2+, 약함; 3+, 중간; 그리고 4+, 강함.

실험 군과 생존 데이터:

치료	개별 생존(day)	MST±SD(day)
1) 치료되지 않음	8, 8, 9, 9 (조직학적 데이터)	8.5±0.6
2) CsA(저용량/장기)	9, 10, 10, 10, 11, 11 (조직학적 데이터)	10.1±0.3
3) CsA(고용량/장기)	15, 16, 16, 17 (조직학적 데이터)	16±0.8
4) OX90mG2a	8, 9, 9, 9, 10, 11	9
5) OX90mG2a + CsA (고용량/장기)	>100 x 4	>100
6) OX90mG2a + CsA (고용량/단기)	56(B), 71(B), 75(B)	71
7) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	53, 54, 54, >76(A), >76(A), >81(A-), >81(A-)	>76
8) OX90mG2a + Rapa	>100 x 6	>100

* 맥박의 정도는 아래와 같이 기록된다: A, 강한 박동; B, 맥박의 강도에서 경미한 감소; C, 맥박의 강도에서 눈에 띄는 감소; 또는 D, 심장 임펄스(cardiac impulse)의 완전한 중단. MST = 평균 생존 기간; SD = 표준 편차.

심장 이식편 생존:

군	개별 생존*	평균 생존 (day)
1) OX90mG2a	9, 10, 10, 11	10
2) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	13#, 13#, 14#, 31#, 40**, 75, 78	75
3) OX-90NE + CsA (저용량/장기)	14#, 16#, 39, 39, 64, 67, 68	64
4) 아이소타입 대조(12B4) + CsA(저용량/장기)	12, 12, 13, 14	12.5

* 맥박의 정도는 아래와 같이 기록된다: A, 강한 박동; B, 맥박의 강도에서 경미한 감소; C, 맥박의 강도에서 눈에 띄는 감소; 또는 D, 심장 임펄스(cardiac impulse)의 완전한 중단.

** 심장 이식편의 강한 박동 중에 폐사한 동물

# 앞서 언급된 바와 같이, 예상치 못한 조기 거부반응은 항체의 이러한 배치(batch)에서 가능한 문제점에 기인할 수도 있다.

아이소타입 대조(12B4) 군에서 심장 이식편은 급속하게 거부되었다. 더 나아가, 아이소타입 대조(12B4) + CsA 군과 CsA 단독요법 군 간에 생존 기간에서 차이가 관찰되지 않았다. 표 1과 2에서 데이터는 항-CD200 요법이 생존을 연장시키는데 강한 효과를 나타낸다는 것을 증명한다. 이는 작동체 기능을 갖는 항체와 작동체 기능이 부재하는 항체 둘 모두에서 관찰되었다.

검시(연구 종결시점 또는 거부반응 시점)에서 심장 동종이식편의 조직학적 변화의 평균 스코어*

군	Vasc	Infar	Lymph	Throm	Hemo
1) 치료되지 않음 (POD8/종점)	3.0	3.0	3.0	4.0	3.0
2) CsA(고용량/장기, POD16/종점)	2.0	1.0	2.0	3.0	2.0
3) CsA(저용량/단기)	3.0	2.0	2.0	4.0	2.0
4) OX90mG2a (POD9/종점)	2.0	1.0	2.0	3.0	2.0
5) OX90mG2a + CsA (고용량/장기, POD100)	0.0	1.0	1.0	1.0	0.0
6) OX90mG2a + CsA (고용량/단기)	2.0	0.0	2.0	0.0	1.0
7) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	1.0	1.0	2.0	1.0	1.0
8) OX-90NE + CsA (저용량/장기)	2.0	1.0	2.0	1.0	2.0
9) 아이소타입 대조(12B4) + CsA (저용량/장기)	2.0	2.0	2.0	3.0	2.0

*평균 스코어: 0 - 정상; 1- 극미한 변화; 2 - 경미한 변화; 3 - 중간 변화; 4 - 유의한 변화. POD = 수술후 일자.

생존과 이식편 생존 이외에, 순환 항-공여자 항체 수준과 비장 내에서 T 세포 개체군의 총수를 유세포분석법으로 측정하였다. 고용량의 CsA와 공동으로 항-CD200 mAb는 장기 생존 수용자에서 항-공여자 항체 생산을 저해한다(도 7A와 7B). 게다가, 고용량의 CsA와 공동으로 항-CD200 mAb는 장기 생존 수용자에서 비장 CD4+와 CD8+ T 세포 개체군을 유의하게 하향조절한다(도 8). 부가적으로, 아래의 세포 개체군을 유세포분석법으로 측정하였다: CD3CD200; CD3CD200R; CD19CD200; CD19CD200R; CD11cCD200; 그리고 CD11cCD200R. 이들 결과는 도 9A-C에 도시된다.

IgG, IgM, C3과 C5, 그리고 다른 이식편내 세포 마커(가령, CD4, CD8과 Mac-1)의 이식편내 침착을 동결된 이식편 조각에서 측정하였다. 이의 결과는 표 4-6에 제시된다.

면역조직화학에 의해 검출된 체액 마커의 이식편내 침착 이식편의 동결된 조각은 수집되고 착색되었다(희생된 동물의 경우에).

군(치료)	IgG	IgM	C3	C5
1) 치료되지 않음	4+	2+	3+	3+
2) CsA(고용량/장기)	3+	2+	3+	3+
3) CsA(저용량/장기)	3+	2+	3+	3+
4) OX90mG2a	2+	2+	3+	3+
5) OX90mG2a + CsA (고용량/장기, POD100)	1+	1+	3+	2.5+
6) OX90mG2a + CsA (고용량/단기)	2+	2+	3+	3+
7) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	2+	2+	3+	3+
8) OX-90NE + CsA (저용량/장기)	2+	2+	3+	3+
9) 아이소타입 대조(12B4) + CsA (저용량/장기)	2+	2+	3+	3+

착색 강도 등급: 0은 음성, 1+는 분명치 않음, 2+는 약함, 3+는 중간, 그리고 4+는 강함.

면역조직화학에 의해 측정된 이식편내 세포 마커 이식편의 동결된 조각은 수집되고 착색되었다(희생된 동물의 경우에).

군(치료)	CD4	CD8	Mac
1) 치료되지 않음	3+	2+	3+
2) CsA(고용량/장기)	2+	2+	3+
3) CsA(저용량/장기)	2+	2+	3+
4) OX90mG2a	2+	1+	3+
5) OX90mG2a + CsA (고용량/장기, POD100)	1+	1+	1+
6) OX90mG2a + CsA (고용량/단기)	2+	2+	2+
7) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	2+	1+	2+
8) OX-90NE + CsA(저용량/장기)	2+	2+	3+
9) 아이소타입 대조(12B4) + CsA (저용량/장기)	2+	2+	3+

착색 강도 등급: 0은 음성, 1+는 분명치 않음, 2+는 약함, 3+는 중간, 그리고 4+는 강함.

면역조직화학에 의해 측정된 이식편내 CD200과 CD200R 침착 이식편의 동결된 조각은 수집되고 착색되었다(희생된 동물의 경우에).

군(치료)	CD200	CD200R
1) 치료되지 않음	3+	2+
2) CsA(고용량/장기)	3+	2+
3) CsA(저용량/장기)	3+	2+
4) OX90mG2a	2+	1+
5) OX90mG2a + CsA (고용량/장기, POD100)	2+	1+
6) OX90mG2a + CsA (고용량/단기)	2+	1+
7) OX90mG2a + CsA (저용량/장기)	2+	1+
8) OX-90NE + CsA(저용량/장기)	2+	1+
9) 아이소타입 대조(12B4) + CsA (저용량/장기)	3+	2+

착색 강도 등급: 0은 음성, 1+는 분명치 않음, 2+는 약함, 3+는 중간, 그리고 4+는 강함.

상기 데이터는 CsA와 공동으로 항-CD200 mAb가 생쥐 심장 이식 모형에서 심장 동종이식편 생존을 유의하게 연장시킨다는 것을 증명한다. 중요하게는, 항-CD200 mAb는 장기 동종이식편 수용을 달성하는데 CsA의 요구량을 유의하게 감소시킨다.

실시예 3

급성 동종이식편 거부반응의 예방에서 항-CD200 mAb, OX90NE-AG의 효과

앞서 기술된 OX90NE 항체는 초기에, 작동체 기능이 부재하는 것으로 생각되었지만, 이후에 OX90NE는 일부 작동체 기능을 여전히 유지하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 작동체 기능이 부재하는 상이한 항체, OX90NE-AG로 추가의 실험을 수행하였다. OX90NE-AG 항체는 OX90NE 항체와 유사하지만 Asn 298 잔기가 Gln 잔기로 대체되는 추가의 돌연변이를 포함한다. AG는 상기 항체가 무당화(aglycosylation)된다는 것을 가리킨다(Asn298은 당화(glycosylation)될 수 있지만 Gln298은 당화될 수 없다); 결과의 항체는 ADCC 또는 CDC를 매개할 수 없다.

앞서 기술된 실험과 유사하게, 본 연구에서는 C57BL/6-에서-BALB/c 완전 MHC-미스매치된 생쥐 심장 이식 모형에서 이식편 생존을 조사하였다. 각 실험 군은 5마리 동물로 구성되었다. 아래와 같은 치료제가 투여되었다:

- OX90NE-AG: 100 ㎍/생쥐/day, 0 - 14 일, i.p.

- 시클로스포린 A(CsA): 15 ㎎/kg/day, 0 일 - 종점, s.c.

이의 결과는 하기 표 7에 제시된다.

실험 군과 생존 결과

군	개별 생존 일자*
CsA + OX90NE-AG 변이체(POD16에 희생됨)	16(A) x 5
CsA + OX90NE-AG 변이체(POD100에 희생됨) 고용량/장기 치료	>90(A), >90(A), >90(A), >90(A), >90(A)

* 맥박의 정도는 아래와 같이 기록된다: A, 강한 박동; B, 맥박의 강도에서 경미한 감소; C, 맥박의 강도에서 눈에 띄는 감소; 또는 D, 심장 임펄스(cardiac impulse)의 완전한 중단. MST = 평균 생존 기간; SD = 표준 편차; POD = 수술후 일자.

본 연구에 이용되는 10마리 생쥐 모두 동일하게 치료되었다. 5마리 생쥐는 표 3-6에 제시된 바와 같은 추가 분석의 목적으로 16 일후 시점에 희생시켰다. 다른 5마리 생쥐는 90 일 시점까지 계속 생존하고 100 일 시점에 희생되는데, 상기 시점에서 표 3-6에서 관찰되는 것과 유사한 분석을 16 일과 100 일 시점에 희생된 양쪽 생쥐 군에서 수행된다.

본원에 개시된 구체예에 대한 다양한 개변이 가능하다. 가령, 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명에 개시된 특정 서열은 OX-2/CD200 결합에 이용되는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 다소 변형될 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편의 기능을 파괴하지 않는, 항체 서열에서 단일 또는 복수 아미노산의 치환이 빈번하게 수행될 수 있다. 따라서 본 발명에 개시된 특정 항체에 70% 이상의 상동성을 보유하는 폴리펩티드 또는 항체는 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 개시된 특정 항체에 80% 이상의 상동성을 보유하는 항체가 고려된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 개시된 특정 항체에 90% 이상의 상동성을 보유하는 항체가 고려된다. 이런 이유로, 상기한 상세는 바람직한 구체예의 예시일 뿐이며 본 발명을 한정하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다른 개변 역시 본 발명에 속한다.

참고문헌

아래의 참고문헌은 본 발명이 속하는 분야의 현황을 더욱 상세하게 기술하기 위하여 순전히 참조로서 편입된다. 이들 참고문헌에 기술된 내용 중에서 본 발명에 개시된 내용과 상충되는 부분은 본 발명을 우선한다.

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SEQUENCE LISTING <110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTIBODIES TO OX-2/CD200 AND USES THEREOF IN INHIBITING IMMUNE RESPONSES <130> ALXN-132-WO1 <140> PCT/US08/009037 <141> 2008-07-25 <150> 60/962,022 <151> 2007-07-25 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45 Phe Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr 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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 2 <211> 2010 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tactctgggt gaagcagaac 180 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attgatcctt 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gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1606 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 320 325 330 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1654 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 335 340 345 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg 1707 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 350 355 360 agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac 1767 caacctctgt ccctaca ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1817 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 365 370 ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1865 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 375 380 385 ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1913 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 390 395 400 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 1961 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc 2009 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 435 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 2057 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 440 445 450 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 2105 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 455 460 465 tgagtgcgac ggccagaatt cattgatcat aatcagccat accacatttg tagag 2160 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactctaga 60 gacatccaga tgacacagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 120 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 180 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggttccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 300 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 6 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (16)..(717) <400> 6 aagcttgccg ccacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca 51 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu 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Leu 110 115 120 gaa ata aaa cgg act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 435 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 125 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 483 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 531 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 160 165 170 gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc 579 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 175 180 185 aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 627 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 190 195 200 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 675 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 205 210 215 220 ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 720 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 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cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1560 accatctcca aagccaaagg tgggacccac ggggtgcgag ggccacatgg acagaggtca 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc 1980 cctgtctctg ggtaaatga 1999 <210> 9 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile 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act ctc aca gtt tcc tca gcc tcc 495 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser 125 130 135 acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc 543 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 140 145 150 155 tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc 591 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 160 165 170 gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg 639 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 175 180 185 cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc 687 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 190 195 200 agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc 735 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 205 210 215 tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt 783 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 220 225 230 235 ggtgagaggc 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ggcaaggagt acaagtgca 1600 <210> 11 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser 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gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 13 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ala Ala Ala Ile His 225 230 235 240 <210> 14 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (16)..(735) <400> 14 aagcttgccg ccacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca 51 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala 1 5 10 aca gct aca ggt gtc cac tct aga gac atc cag atg aca cag tct cca 99 Thr Ala Thr Gly Val His Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 15 20 25 tct tcc atg tat gca tct cta gga gag aga gtc act atc act tgc aag 147 Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 30 35 40 gcg agt cag gac att aat agc tat tta agc tgg ttc cag cag aaa cca 195 Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro 45 50 55 60 ggg aaa tct cct aag acc ctg atc tat cgt gca aac aga ttg gta gat 243 Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 65 70 75 ggg gtt cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg caa gat tat tct 291 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser 80 85 90 ctc acc atc agc agc ctg gag tat gaa gat atg gga att tat tat tgt 339 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys 95 100 105 cta cag tat gat gag ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 387 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 110 115 120 gaa ata aaa cgg act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 435 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 125 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 483 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 531 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 160 165 170 gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc 579 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 175 180 185 aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 627 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 190 195 200 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 675 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 205 210 215 220 ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tca gcg 723 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ala 225 230 235 gcc gca att cat tga 738 Ala Ala Ile His 240 <210> 15 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 16 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ttgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc aacagtctgg atctgagctg aagaagcctg gggcttcagt gaagatctcc 120 tgcaaggctt ctggttattc attcactgac tacatcatac tctgggtgag gcagaaccct 180 ggaaagggcc ttgagtggat tggacatatt gatccttact atggtagttc taactacaat 240 ctgaaattca agggcagagt gacaatcacc gccgaccagt ctaccaccac agcctacatg 300 gagctctcca gtctgagatc tgaggacact gcagtctatt actgtggaag atctaagagg 360 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tttcctcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 17 <211> 1402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (2)..(1399) <400> 17 c atg gga tgg agc cgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca ata att gca ggt 49 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile Ala Gly 1 5 10 15 gtc cat tgc cag gtc cag ctg caa cag tct gga tct gag ctg aag aag 97 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atc tcc tgc aag gct tct ggt tat tca ttc 145 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 act gac tac atc ata ctc tgg gtg agg cag aac cct gga aag ggc ctt 193 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga cat att gat cct tac tat ggt agt tct aac tac aat 241 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 ctg aaa ttc aag ggc aga gtg aca atc acc gcc gac cag tct acc acc 289 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Thr 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctc tcc agt ctg aga tct gag gac act gca gtc 337 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gga aga tct aag agg gac tac ttt gac tac tgg ggc caa 385 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtt tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc 433 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 ttc ccg cta gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 481 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 529 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 577 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 625 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1345 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1393 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 ggt aaa tga 1402 Gly Lys 465 <210> 18 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Met Asp Met Arg Val Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 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gctgctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtt 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagattata ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atttcgcagt ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gtacacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711 <210> 20 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (55)..(762) <400> 20 tttccatggg tcttttctgc agtcaccgtc cttgacacga agcttgccgc cacc atg 57 Met 1 gac atg agg gtc tct gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg ctc 105 Asp Met Arg Val Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu 5 10 15 tca ggg gcc agg tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tct tcc ctg 153 Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 tct gca tct ata gga gac aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag 201 Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 35 40 45 gac att aat agc tat tta agc tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa gct 249 Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 65 cct aag ctg ctg atc tat cgt gca aac aga ttg gta gat ggg gtt cca 297 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro 70 75 80 tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat tat act ctc acc atc 345 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 agc agc ctg cag cct gaa gat ttc gca gtt tat tat tgt cta cag tat 393 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr 100 105 110 gat gag ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 441 Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 489 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 145 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 537 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 150 155 160 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 585 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 633 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 681 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 729 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 225 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 765 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 235 <210> 21 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 22 <211> 2002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccctc 60 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagatg 120 tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tactctgggt gaagcagaac 180 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attgatcctt actatggtag ttctaactac 240 aatctgaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 300 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgg aagatctaag 360 agggactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtttcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 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aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1560 accatctcca aagccaaagg tgggacccac ggggtgcgag ggccacatgg acagaggtca 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc 1980 cctgtctctg ggtaaatgat ga 2002 <210> 23 <211> 2163 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (94)..(798) <220> <221> CDS <222> (1191)..(1226) 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aca gcc tac atg cag ctc 402 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 90 95 100 aac agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt gga aga tct 450 Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Ser 105 110 115 aag agg gac tac ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtt 498 Lys Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 120 125 130 135 tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc 546 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 140 145 150 tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag 594 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 155 160 165 gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg 642 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 170 175 180 acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc 690 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 185 190 195 tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc 738 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 200 205 210 215 cag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg 786 Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 220 225 230 gac aag aca gtt ggtgagaggc cagctcaggg agggagggtg tctgctggaa 838 Asp Lys Thr Val 235 gccaggctca gccctcctgc ctggacgcac cccggctgtg cagccccagc ccagggcagc 898 aaggcaggcc ccatctgtct cctcacccgg aggcctctgc ccgccccact catgctcagg 958 gagagggtct tctggctttt tccaccaggc tccaggcagg cacaggctgg gtgcccctac 1018 cccaggccct tcacacacag gggcaggtgc ttggctcaga cctgccaaaa gccatatccg 1078 ggaggaccct gcccctgacc taagccgacc ccaaaggcca aactgtccac tccctcagct 1138 cggacacctt ctctcctccc agatccgagt aactcccaat cttctctctg ca gag cgc 1196 Glu Arg aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag cccaggcctc 1246 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 240 245 gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc 1306 agctgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cca cct gtg gca gga 1362 Ala Pro Pro Val Ala Gly 250 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 1410 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 255 260 265 tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa 1458 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 270 275 280 285 gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat 1506 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt 1554 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag 1602 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 320 325 330 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag 1650 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 335 340 345 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggtgggaccc acggggtgcg agggccacat 1701 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 350 355 ggacagaggt cagctcggcc caccctctgc cctgggagtg accgctgtgc caacctctgt 1761 ccctaca ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1810 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 360 365 370 cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1858 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 375 380 385 ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1906 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 390 395 400 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1954 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 tcc ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag 2002 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 2050 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 450 cac tac aca cag aag 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Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 28 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Gly Tyr Glu Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Glu Leu Ala Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr 180 185 190 Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 245 250 255 Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 275 280 285 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 290 295 300 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu 340 345 350 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 355 360 365 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 370 375 380 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 405 410 415 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 420 425 430 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (39)

1. 병든 개체에서 면역 반응을 저해하는 방법에 관계하는데, i) CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제와 ii) 면역억제제 또는 면역조절제의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 면역 반응은 체액 반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 면역 반응은 항체 매개된 반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
4. 청구항 2에 있어서, 작용제는 작동체 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
5. 청구항 2에 있어서, 작용제는 작동체 기능이 부재하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 작용제는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 작용제는 가용성 CD200R 또는 비-작동성(nonagonistic) 가용성 CD200인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 면역억제제는 시클로스포린 A 또는 라파마이신인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
9. 청구항 3에 있어서, 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 영장류화 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 그리고 면역-제거된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
10. 청구항 3에 있어서, 항원-결합 단편은 단일-사슬 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, F(ab')₃, Fd, Fv, 도메인 항체, 그리고 CD200에 특이적인 결합을 공여하는 항-CD200 면역글로불린의 임의의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 면역조절제 또는 면역억제제는 칼시뉴린 저해물질인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 칼시뉴린 저해물질은 타크롤리무스와 시클로스포린 A로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
13. 청구항 1에 있어서, 면역조절제 또는 면역억제제는 아드리아마이신(adriamycin), 아자티오프린(azathioprine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine) A, 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 비-스테로이드성 소염제, 시롤리무스(sirolimus)(rapamycin), 그리고 타크롤리무스(tacrolimus)(FK-506)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
14. 청구항 1에 있어서, 면역조절제 또는 면역억제제는 무로모납(muromonab)-CD3, 알렘투주맙(alemtuzumab), 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab), 리툭시맙(rituximab), 그리고 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)으로 구성된 군에서 선택되는 항체인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
15. 청구항 1에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 개체는 세포, 조직 또는 기관 이식을 받았거나, 또는 받을 예정인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 이식편 거부반응을 예방하거나, 또는 이식편 생존을 촉진하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 동종이식편의 이식에 앞서 작용제와 약물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
19. 청구항 1에 있어서, 작용제는 i) 약물에 앞서, ii) 약물 이후에, 또는 iii) 약물과 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
20. 청구항 16에 있어서, 동종이식편의 거부반응 에피소드(rejection episode)동안 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
21. 청구항 17에 있어서, 이식편 거부반응은 이식된 세포, 조직 또는 기관의 급성 또는 만성 체액 거부반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
22. 청구항 16에 있어서, 개체는 조혈 세포 또는 골수 이식, 췌장 도세포의 동종유래 이식, 또는 심장 이식, 신장-췌장 이식, 신장 이식, 간 이식, 폐 이식, 그리고 췌장 이식으로 구성된 군에서 선택되는 고형 기관(solid organ) 이식의 수용자인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
23. 청구항 1에 있어서, 항-공여자 항체의 생산에서 감소를 결과하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
24. 청구항 17에 있어서, 이식편 거부반응은 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 이식편 수용자에서 급성 이식편 거부반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
25. 청구항 17에 있어서, 이식편 거부반응은 세포, 조직 또는 기관 동종- 또는 이종이식의 이식편 수용자에서 만성 이식편 거부반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
26. 청구항 16에 있어서, 장기 이식편 생존을 촉진하고, 여기서 상기 장기 이식편 생존은 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법:
    (a) 이식후 최소한 6개월;
    (b) 이식후 최소한 1년; 그리고
    (c) 이식후 최소한 5년.
27. 청구항 26에 있어서, 이식편의 적응(accommodation)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
28. 청구항 1에 있어서, 개체는 항체 매개된 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 앓는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
29. 청구항 28에 있어서, 자가면역 질환은 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia)인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
30. 청구항 1에 있어서, 작용제는 전신 투여되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
31. 청구항 1에 있어서, 작용제는 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
32. 청구항 1에 있어서, 면역 반응은 일차 반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
33. 청구항 1에 있어서, 면역 반응은 이차 반응인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.
34. 개체에 투여된 면역억제제 또는 면역조절제의 효과량을 구성하는 것을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 i) 상기 면역억제 또는 면역조절 약물과 ii) CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 작용제 없이 상기 약물을 투여할 때와 비교하여 면역억제(immunosuppression) 또는 면역조절(immunomodulation)을 달성하기 위하여 상기 약물이 더욱 적은 양으로 요구되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 청구항 34에 있어서, 개체는 동종이식을 받았거나, 또는 받을 예정인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 청구항 34에 있어서, 개체는 자가면역 질환 또는 항체 매개된 염증성 질환을 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 청구항 34에 있어서, 약물은 시클로스포린 A 또는 라파마이신인 것을 특징으로 방법.
38. 거부반응 에피소드 동안 동종이식편 수용자에서 동종이식편의 거부반응을 저해하는 방법에 있어서, 상기 방법은 CD200과 CD200R 간에 상호작용을 저해하는 작용제의 효과량을 상기 동종이식편 수용자에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 동종이식편의 거부반응이 저해되는 것을 특징으로 하는 거부반응 저해 방법.
39. 청구항 38에 있어서, 작용제는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 저해 방법.

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