KR20140066976A

KR20140066976A - 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20140066976A
Application number: KR1020137032135A
Authority: KR
Inventors: 마틴 요한네스 로에스너; 프리츠 아이첸세허
Original assignee: 마이크레오스 휴먼 헬스 비.브이.
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2014-06-03
Also published as: EP3085777A1; CN108192902A; JP2014519815A; DK3085777T3; ES2768777T3; WO2012150858A1; CN103703127A; PL3085777T3; EP2705144B1; US20160369255A1; BR112013028251B1; IL229247A0; EP2705144A1; US10174300B2; HK1195791A1; IL229247B; ES2589784T5; EP2705144B2; CA2834924C; DK2705144T3

Abstract

본 발명은 폴리펩티드, 대응하는 핵산 분자, 구조물 및/또는 벡터 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포 및/또는 상기 폴리펩티드 핵산 분자, 구조물, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 용도, 바람직하게는 감염성 질병 치료 용도를 위한 상기 조성물에 관한 것이다. 게다가 본 발명은 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터, 세포 및/또는 조성물의, 항균제로서의 용도, 바람직하게는 식품 첨가제나 소독약, 또는 박테리아 검출을 위한, 바람직하게는 진단을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

폴리펩티드 {A POLYPEPTIDE}

본 발명은 폴리펩티드, 대응하는 핵산 분자, 구조물 및/또는 벡터, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포, 및/또는 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 폴리펩티드, 대응하는 핵산 분자, 구조물 및/또는 벡터, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포, 및/또는 조성물의 의학적 용도, 바람직하게는 감염성 질병 치료용도에 관한 것이다. 게다가 본 발명은 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터, 세포 및/또는 조성물의 항균제로서의 용도, 바람직하게는 식품 첨가제 또는 소독약으로서의 용도, 또는 박테리아 검출을 위한, 바람직하게는 진단을 위한 용도에 관한 것이다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 몇 가지 심각한 감염성 질병 및 식중독에 빈번하게 관련되는 주요한 인간 병원체이다. 이의 치료는 신생의 항생제 내성 때문에 더욱더 어려워진다. 황색포도상구균을 감염시키는 파지로부터 엔돌리신은 이러한 병원체를 잠정적으로 조절하는 것으로 보여지며, 이들의 특이적인 검출에 사용될 수 있다. 대부분의 경우에서, 포도상구균(Staphylococcus)종들을 표적화하는 엔돌리신의 적용에서 주요한 장애물은 낮은 효소 활성도, 대량 생산의 어려움 및/또는 단백질 안정도이다.

예를 들면 항균제 활성 및/또는 안정도에 있어서 개선된 특징을 갖는 새로운 항균제의 필요성이 언제나 있다.

폴리펩티드에 관한 내용이 개시된다.

도 1은, 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포에 대한 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)활성도의 엔돌리신 농도에 의존하는 선형 관계.
도 2. Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)의 용해 활성도 상에서 2가 양이온의 영향력.
도 3. 냉동건조 및 재구성 이후에 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포 상에서 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21) 50 nM 의 용해 활성도.
도 4. 냉동건조 및 재구성(동결건조된 것으로 바람직한) 이후에, 새로 준비된 M23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 48 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 29) 및 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)에 비교하여, 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포 상에서 M23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 48 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 29) 50 nM의 용해 활성도.
도 5. 리소스타핀(LST; SEQ ID NO: 33 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 34) 및 Ply2638 유도체 (SEQ ID NO: 11, 10, 48, 44 및 4에 의해 각각 암호화 되는 SEQ ID NO: 31, 30, 29, 21 및 24)의 농도에 의존하는 상대적 활성도.
도 6. 혼탁도 환원 분석에서 측정된, 끝이 절단되고 (PlyTw 도메인과 함께) 개량된 Ply2638 변형들의 염화나트륨 농도(오른쪽 도표) 및 다양한 pH 값들(왼쪽 도표) 에서 상대적인 활성도.
도 7. 표준 상태에서 황색포도상구균 SA2638/2854 기질 세포들을 사용하는 것에 대하여 50 nM 쿼드러플 도메인 효소(quadruple domain enzymes) (SEQ ID NO: 47 및 8 에 의해, 각각 암호화 되는 SEQ ID NO: 27 및 28), Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21), 및 리소스타핀 (SEQ ID NO: 33 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 34)의 활성도.

여기 보고된 것은 새롭게 특성화된 Ply2638, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a(S. aureus bacteriophage 2638a) 이다. 상기 효소 및 몇 가지 조작된 유사체들이 E.Coli 내에서 가용적 방법으로 발현되었고, 재구성 이후 이들의 용해 활성도에 의하여 증명된 바와 같이 냉동건조(lyophilisation) 이후에 놀라운 안정도를 보였다. 포도상구균 속(Staphylococcus genera)의 세포벽에 부착하는 세포벽-부착 도메인에 추가적으로, 두 개의 기능적인 도메인, 예를 들면 M23 엔도펩티다제 도메인 및 아미다제 도메인은 최적의 용해 활성도에 결정적이다.

황색포도상구균 Ф11 엔돌리신(S. aureus Ф11 endolysin), Ф트워트 엔돌리신(ФTwort endolysin), 및 리소스타핀(Lysostaphin) 에서 유래한 세포 벽-부착 도메인의 복제 및/또는 촉매적인 도메인을 갖는 효소의 개량은, 강화된 용해 활성도 및/또는 변화된 pH 최적조건 및/또는 냉동건조 및 재구성 이후의 증가된 안정도를 갖는 이종의 폴리펩티드 융합 산물을 초래한다.

핵산 분자

제1 측면에서, 제1 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 또는 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 12 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. (본원에 사용된 모든 SEQ ID NOs 의 개관은 표 1로 참조된다). 바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 최소 282, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360 및 370개 뉴클레오티드, 더 바람직하게는, 최소 381개 뉴클레오티드의 길이, 및/또는 최대 510, 480, 450, 420 또는 390개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 최소 282, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370개 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 최소 381개 뉴클레오티드의 길이, 및/또는 최대 4500, 4200, 3900 및/또는 3600개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 최소 1200, 1230, 1260, 1290, 1320, 1350, 1380, 1410, 1440, 1470, 1500, 1530 또는 1560개 뉴클레오티드의 길이, 및/또는 최대 4500, 4200, 3900 및/또는 3600개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자는 최소 1890, 1920, 1950, 1980, 2010, 2040, 2070, 2100, 2130 또는 2160개 뉴클레오티드의 길이 및/또는 최대 4500, 4200, 3900 및/또는 3600개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 포도상구균 속의 펩티도글리칸 세포벽에 부착하는 세포 벽-부착 도메인을 암호화한다. 바람직하게는 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a(S. aureus bacteriophage Ф2638a) 로부터 유래한다.

ALE-1 (Lu et al., J. Biol. Chem., 2006, 281(1):549-58)의 C-말단 92 잔기의 결정구조를 갖는 정렬로부터 추정됨에 따라, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신에서 유래한 세포 벽-부착 도메인으로부터 최소한의 94 아미노산이 포도상구균 속의 세포 벽으로 효소를 안내하기에 충분할 수 있다는 것이 추정되었다.

포도상구균 속의 펩티도글리칸 세포벽에 도메인이 부착하는 것은 당업자에게 잘 알려진 분석(assay)를 사용하여 평가될 수 있다. 더 바람직한 실시예에서, 표지된 구조물을 초래하는 면역조직화학 기술 및/또는 유전자 융합 기술은, 포도상구균속의 펩티도글리칸 세포 벽에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 특이적인 부착을 평가하는데 사용될 수 있다. 위에서 언급된 면역조직화학 또는 융합 기술에서 사용된 신호의 정량화 방법은 당해 기술에 잘 알려져 있다.

일 실시예에서, 포도상구균 속의 펩티도글리칸 세포 벽-부착은, 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 형광성 융합 구조물을 사용하여 정량화될 수 있다. 이러한 세포 벽-부착 분석은 Loessner et al (Molecular Microbiology 2002, 44(2): 335-349) 및 실시예 1에 자세히 기술되어 있다. 이러한 분석 내에서 상기 형광성 융합 구조물 또는 음성 대조군, 바람직하게는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)을 포함하는 용액은, 세포들이 원심분리로 분리된 후에 상기 부착된 형광성 융합 구조물과 함께인 포도상구균, 바람직하게는 황색포도상구균 세포, 더 바람직하게는 황색포도상구균 BB255 (S. aureus BB255)에 지정된 시간 동안 영향 받기 쉽다. 음성 대조군, 바람직하게는 GPF에, 노출된 포도상구균 세포의 형광 신호에 의해 제외된 형광성 융합 구조물에 노출된 포도상구균 세포들의 형광 신호는 이러한 개시에서 의미된 바와 같은 세포 부착을 위한 측정이다.

바람직하게는, 이러한 분석을 사용하여 본원에서 정의된 음성 대조군 보다 높은 상기 분리된 세포들의 형광 신호에서 증가가 검출될 때, 본 발명의 맥락 내에서 핵산 분자는 포도상구균 속의 펩티도글리칸 세포 벽에 부착하는 폴리펩티드 도메인을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 상기 부착은 특이적인 것으로 바람직하게는 언급된다. 바람직하게는 본 발명은, SEQ ID NO: 1에 의해 암호화 되는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신 (Ply2638)의 펩티도글리칸 세포벽의 최소 50, 60, 70, 80, 90 또는 100, 150 또는 200% 의 본원에 정의된 바와 같은 부착을 나타내는 도메인 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.

일실시예에서, 본 발명은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신을 암호화 하는 SEQ ID NO: 1 와 서열 동일성 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 를 갖는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은, 상기 제1 뉴클레오티드 서열에 추가적으로 용해 도메인을 암호화하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 용해 도메인은 본원에 후에 정의된 바와 같은 펩티도글리칸 가수분해효소 활성을 나타낸다. 상기 핵산 분자는 "개량된 구조물"로 본원에 정의되고 있는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "이종의 서열" 또는 "이종의 핵산"은, 자연적으로 발견되지 않는, 상기 제1 뉴클레오티드 서열의 이웃하는 서열로 작용 가능하게 연결된 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종의(heterologous)"는 "재조합(recombinant)”을 의미할 수 있다. "재조합"은 자연에서 일반적으로 발견되는 것과는 다른 유전적 독립체를 말한다. 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 분자에 적용되었듯이, 이는 상기 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 분자가 클로닝(cloning), 제한(restriction) 및/또는 연결(ligation) 단계들, 및 자연에서 발견되는 서열 또는 분자와 다른 구조물의 생성을 초래하는 다른 절차들의 다양한 조합의 산물이라는 것을 의미한다.

"용해 활성도" 로서 또한 본원에 정의되는 "펩티도글리칸 가수분해효소 활성도"는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 평가될 수 있다. 일실시예에서 용해 활성도는 기질 세포 현탁액의 혼탁도 하락을 측정하는 것에 의하여 분광광도적으로(spectrophotometrically) 평가될 수 있다. 바람직하게는 용해 활성도는, 황색포도상구균의 혼탁도 하락을 분광광도적으로 측정하여 평가될 수 있으며, 여기에서 혼탁도는 OD₅₉₅ 분광광도적으로(Libra S22, Biochrom) 측정하여 정량화된다. 더 바람직하게는, 본원에서 확인된 바와 같은 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 200 nM은, 분광학적으로(Libra S22, Biochrom)평가되는 동안, 초기 1 ± 0.05 의 OD₆₀₀를 갖는 황색포도상구균 혼탁액과 함께 PBS 버퍼 pH 7.4, 120 mM 염화나트륨 37℃ 에서 30분 동안 배양된다. 배양의 30분 전 OD₅₉₅ 로부터 배양의 30분 후 OD₅₉₅를 제외하는 것에 의하여 혼탁도의 하락이 계산된다. 이러한 분석을 사용하여 최소 10, 20, 30, 40, 50 또는 60% 의 혼탁도 하락이 검출될 때, 본 발명의 문맥 내에서 핵산 분자는 용해 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것으로 언급될 수 있다. 바람직하게는, 최소 70%의 하락이 검출된다. 바람직하게는, 본 발명은 SEQ ID NO: 1에 의해 암호화되는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신 (Ply2638) 의 최소 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200%의 용해 활성도 또는 그 이상의 용해 활성도를 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.

일실시예에서 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1로 구성되지 않거나 또는 포함하지 않을 수 있다. SEQ ID NO:1 은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신을 암호화한다.

바람직한 실시예는 본원에 확인된 바와 같은 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 용해 도메인으로서 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 여기에서 상기 제2 서열은 엔도펩티다제 도메인을 암호화하고 제3 뉴클레오티드 서열은 아미다제 도메인을 암호화한다. 따라서 본 발명은 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로, 여기에서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, 또는 여기에서 상기 핵산 분자는 용해 도메인을 암호화하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.

본원에 사용된 엔도펩티다제 도메인은 포도상구균 속(Staphylococcus genera)의 세포 벽 내, 바람직하게는, 황색포도상구균 (S. aureus), 포도알구균 (S. simulans) 및 포도상구균 카르노서스 (S. carnosus)의 세포 벽 내에서, 발견되는 펜타글리신 크로스-브릿지(Trayer, H. R. and Buckley, C. E. (1970) Molecular properties of lysostaphin, a bacteriolytic agent specific for Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 245, 4842-4846)를 절단한다. 본원에 사용된 아미다제 도메인은 바람직하게는 감마-글루타밀-포함 기질을 가수분해한다. 폴리펩티드 내 이러한 도메인들의 활성 및 기능성은, 정제된 펩티도글리칸을 갖는 이러한 도메인들 중 어느 것을 포함하는 상기 폴리펩티드의 배양 상의 절단 산물 특징에 따라 확인 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 또는 제3 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 각각은 박테리아의 또는 박테리오파지 기원의 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф11 엔돌리신, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф트워트 엔돌리신 및 포도알구균 리소스타핀으로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소를 암호화하는 유전자로부터 유래한다. 바람직하게는, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 15와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 가지며, 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17 또는 18와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.

본 발명은 구조물 내 가능한 어떠한 위치에서 본 발명에서 의미된 대로 상기 기능적 도메인을 포함하는 본원에 정의된 모든 구조물을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본원에 정의된 핵산 분자는 본원에 확인된 바와 같은 제1 핵산 서열에 의해 암호화되는 C-말단 도메인을 갖는 폴리펩티드를 암호화하며, 포도상구균 속 표적이 될 수 있는 기능적 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 나타난다. SEQ ID NO: 9 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 본원에 정의된 핵산 분자는 훨씬 더 바람직하다. SEQ ID NO: 9 는, C-말단 SH3b 상동 세포 벽-부착 도메인 (SEQ ID NO: 1에 의해 암호화되는 Ply2638로부터의 도메인 두 가지 모두: Leu138 - Lys486)을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, N-말단 M23 글리실-글리신 엔도펩티다제 상동 도메인 (SEQ ID NO: 33에 의해 암호화 되는 숙성 리소스타핀: Ala1 - Gly154)을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 중심의 아미다제-2(a central amidase-2) 상동 도메인을 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이는 이론상으로 58.266 kDa 의 크기를 갖는다. SEQ ID NO: 9에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 포도알구균 리소스타핀으로부터의 M23 엔도펩티다제 도메인에 의해 치환된 N-말단 M23 엔도펩티다제 도메인 내 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신과 구별된다. SEQ ID NO: 9에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 냉동건조 및 재구성 이후에 용해 활성도가 유지되는 동안, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신에 비하여 적어도 20% 증가된 용해 활성도를 입증하였음을 나타낸다. 바람직한 실시예에서 상기 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화되는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도와 비교하여, 최소 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2배의 용해 활성도를 나타내는 폴리펩티드를 암호화 한다. 바람직한 실시예 내에서, 상기 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는, 본원에 정의된 냉동건조 및 재구성 이후에 새롭게 준비된 폴리펩티드에 비교하여, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%의 용해 활성도 감소 나타내는 폴리텝티드를 암호화하며, 여기에서 "새롭게 준비된"은 바람직하게는 본원에 확인된 바와 같은 분석 내에서 용해 활성도를 평가하기 전에 즉시 해빙되고, 및 -20 ℃에서 냉동건조 버퍼 1.63 mg/mL 내 (50mM 트리스(Tris), 500mM 수크로스, 200mM 마니톨(mannitol), 0.05% 폴리소르베이트20(polysorbate20) + 50% 글리세롤) 최대 2일 보관한 것으로 본원에 정의된다.

냉동건조 및 재구성(Lyophilisation and reconstitution)은 동결-건조(freeze-drying)에 의한 탈수 및 물 첨가에 의한 샘플의 잇따른 재구성으로서 본원에 정의된다. 실시예에서, 냉동건조(lyophilization) 버퍼 300ml (50 mM 포스페이트 또는 트리스, 500 mM 수크로스, 200 mM 마니톨, pH 7.4)에 대하여 3번 투석하고, 액화 질소의 기체 상태 내에서 냉동시키는 것에 의해 냉동건조 및 재구성이 행하여진다. 상기 동결-건조하는 것은 표준 조건 하에서, 바람직하게는 60 분 동안 75 mTorr 진공상태 및 -40℃ 에서, 행하여질 수 있으며, 이어서 5시간 동안 -10℃로 온도를 상승시키고, 및 동일한 진공레벨에서 -10℃ 에서 또 다른 60분이 따른다. 마지막 단계로서, 온도는 바람직하게는 10시간 동안 25℃로 상승된다. 샘플들은 물의 첨가에 의하여 재구성된다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본원에 정의된 핵산 분자는 위에 확인된 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열에 추가적으로 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열과 이종이거나 동일한 적어도 하나의 복사본(duplicate)을 포함한다. 바람직하게는 본원에 정의된 핵산 분자는 상기 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열에 추가적으로, 제1 뉴클레오티드 서열과 동일한 복사본을 포함한다. 세포 벽-부착 도메인을 암호화하는 본원에 정의된 제1 뉴클레오티드 서열의 복사본은, 본원에 확인된 바와 같은 분석 내에서, 더 구체적으로는 200, 300, 400, 또는 1000nM NaCl 를 포함하는 수정된 PBS 버퍼 및 폴리펩티드의 동일몰 양을 사용하여, 평가된 바와 같이, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화 되는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하여, 또는 상기 제1 도메인 복사본이 부족한 핵산 분자에 의해 암호화된 레퍼런스 폴리펩티드의 용해 활성도에 비교하여, 적어도 5, 10, 20, 30, 20 또는 40% 증가된 용해 활성도를 나타내는 SEQ ID NO: 20에 의해 바람직하게는 암호화된 바와 같은 폴리펩티드를 초래한다. 이러한 실시예는 또한, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신인 같은 출처에서 유래한 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열이 존재하는, 이종의 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:1 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 이종의 추가적인 복사본을 포함한다. SEQ ID NO: 6 및 20 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원에 정의된 핵산 분자 또한 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본원에 정의된 핵산 분자는 CHAP (시스테인, 히스티딘-의존 아미도하이드로라제/펩티다제; cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases) 도메인을 암호화하는 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 제4 뉴클레오티드 서열은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф11 또는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф트워트 엔돌리신에서 유래한다. 훨씬 바람직하게는, 상기 제4 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 본원에 정의된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5 또는 7 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. SEQ ID NO: 5 에 의해 정의되는 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자는, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화 되는 황색포도상구균 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신에 비교하여 및/또는 상기 제4 도메인이 부족한 구조물에 의해 암호화된 폴리펩티드에 비교하여, 증가된 용해 활성도 및/또는 변화된, 바람직하게는 감소된, pH 최적 조건을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. 용해 활성도는 본원에 초기에 정의된 상태하에서 및 분광광도적으로 평가되었다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하거나, 또는 오직 상기 제4 도메인이 부족한 상기 폴리펩티드와 다른 레퍼런스 폴리펩티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 용해 활성도에 비교하여, 적어도 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2배의 용해 활성도 증가를 나타낸다. 훨씬 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 의해 암호화 되는 폴리펩티드 또는 상기 정의된 레퍼런스 폴리펩티드에 비교하여, 적어도 2.5 배의 용해 활성도 증가를 나타낸다.

본원에서 변화되거나 감소된 pH 최적조건은, 최적의 용해 활성도에서 이온 강도가 계속 유지되는, 더 낮은 pH 값으로 변하거나 감소되는 것으로 정의된다. 용해 활성도는 바람직하게는 본원에 정의된 분광광도적으로 평가된다. 바람직하게는 용해 활성도의 pH 최적조건은, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하거나, 또는 오직 상기 제4 도메인이 부족한 상기 폴리펩티드와 다른 레퍼런스 폴리펩티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 용해 활성도에 비교하여, 0.5 -1 pH 유닛 감소된다.

본 발명은 바람직하게는, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하여, 감소된 pH 최적 조건 및/또는 증가된 용해 활성도를 갖거나, 또는 동일한 pH 최적 조건 및/또는 동일한 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 본원에 확인된, 제1, 제2, 제3 및 임의적으로 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 그와 동일한 것이, 본원에 확인된 분석 또는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하였을 때, 찾아낼 수 있는 다른 점이 없는 것으로 본원에 확인된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하여, 감소된 pH 최적 조건 및/또는 증가된 용해 활성도를 갖거나, 또는 동일한 pH 최적 조건 및/또는 동일한 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 본원에 확인된, 제1, 제2, 및 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도에 비교하여, 감소된 pH 최적 조건 및/또는 증가된 용해 활성도를 갖거나, 또는 동일한 pH 최적 조건 및/또는 동일한 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 본원에 확인된, 제1, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 정의된 폴리펩티드의 개별적 도메인을 암호화하는, 본원에 확인된 뉴클레오티드 서열의, 즉, 제1, 제2, 제3, 제4 뉴클레오티드 서열의, 각각은, 삽화된 공개문헌의 실험적인 부분 및 문헌에 넓게 서술되고(Sambrook, Maniatis et al. (1989) 당해 기술의 기술자들에게 잘 알려진, 핵산 조각을 조립하고 구조화하는 것으로 알려진 어느 통상적인 방법에 의하여 조립될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 함께 연결된다.

따라서, 본 발명의 핵산 분자는 폴리펩티드, 바람직하게는 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 세포 벽-부착 도메인을 통해 포도상구균 속에 부착할 수 있는, 및/또는 본원에 정의된 제2, 제3 및 제4 뉴클레오티드 서열, 각각에 의해 암호화되는 엔도펩티다제 및/또는 아미다제 도메인 및 임의적으로 CHAP 도메인을 통하여 상기 박테리아를 용해할 수 있는, 본원에 확인된 폴리펩티드를 암호화한다.

바람직한 실시예에서, 본원에 정의된 본 발명의 핵산 분자는 임의적으로 정제의 편의를 위해 태그(tag)를 암호화하는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 태그는 FLAG-tag, poly(His)-tag, HA-tag 및 Myc-tag 로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더 바람직하게는 상기 태그는 6xHis-tag 이다. 훨씬 바람직하게는 상기 태그는 SEQ ID NO: 43 와 동일한 N-말단 6xHis-tag 이다.

폴리펩티드

다른 측면에서, 본원 초기에 확인된 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 폴리펩티드는 이전 항목에서 정의된 세포 벽-부착 도메인 및 바람직하게는 엔도펩티다제 도메인 및/또는 아미다제 도메인을 포함한다.

본 발명에 의해 포함된 폴리펩티드 도메인은 SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및/또는 42 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는 본 발명에 의해 포함된 폴리펩티드 도메인은 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 추정적인 링커들(linkers)을 포함하고, SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및/또는 58 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.

본 발명에 의해 포함된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 21, 25, 26, 27, 29 및/또는 32 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 더 바람직하게는, 본 발명에 의해 포함된 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 29 및/또는 32와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.

본 발명의 일실시예에서 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및/또는 19, 각각과, 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 구조물에 의해 암호화된 SEQ ID NO: 21, 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 및/또는 42 와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 더 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 9, 20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및/또는 19, 각각과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 구조물에 의해 암호화된 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및/또는 42 와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 최소 94, 95, 96, 100, 110 또는 120개 아미노산, 바람직하게는 127개 아미노산 및/또는 최대 1500, 1400, 1300 또는 1200개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 최소 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510 또는 520개 아미노산 및/또는 최대 1500, 1400, 1300 또는 1200개 아미노산의 길이를 갖는다. 최소 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710 또는 720개 아미노산 및/또는 최대 1500, 1400, 1300 또는 1200개 아미노산의 길이를 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 더 바람직하다.

본 발명에 의해 포함된, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은, 하나, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산, 각각을 추가, 결손, 삽입, 또는 치환하는 것에 의하여, 본원에 확인된 서열들 중 하나로부터 파생될 수 있다. 본 발명에 의해 포함된, 아미노산 서열은 안정성, 용해도 및 활성도를 증가시키기 위하여 화학적 모이어티들, 또는 추가적인 N- 이나 C- 말단 아미노산들을 추가하는 것에 의하여, 본원에 확인된 서열들 중의 하나로부터 파생될 수 있다.

본 발명의 실시예는 변형 폴리펩티드(variant polypeptide)를 포함한다. 변형 폴리펩티드는 비-자연적으로 발생하는, 폴리펩티드의 형태일 수 있다. 변형 폴리펩티드는, 이의 본래 출처로부터 분리된 폴리펩티드로부터 일부 조작된 방법에서 다를 수 있다. 변형은 SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20 의 뉴클레오티드 서열로부터 시작하는 위치-지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis)에 의해 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드 변형은 그 암호화된 폴리펩티드의 그 생물학적 기능을 변하게 하지 않는 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시예에 따르면, 폴리펩티드 변형은, SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도 및/또는 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성에 비교하여, 동일하거나 강화된 용해 활성도 및/또는 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드 변형은 바람직하게는 SEQ ID NO: 21, 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 및/또는 42 의 변형이다. 동일하거나 강화된 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성 및/또는 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드 변형은, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 펩티도글리칸 세포 벽-부착성 및/또는 용해 활성도를 나타내는 폴리펩티드이며, 이는 본원 초기에 확인된 분석에서 측정된 SEQ ID NO:1 에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신의 용해 활성도 및/또는 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성에 비교하여 동일하거나 증가된 것이다.

또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20 의 뉴클레오티드 서열의 변형이다. 뉴클레오티드 서열 변형들은 초기에 정의된 폴리펩티드 변형을 준비하는데 사용될 수 있다. 핵산 변형은 위에 정의된 뉴클레오티드 서열 중 어느 것의 조각일 수 있다. 핵산 변형은 또한, 유전적 코드의 축중(degeneracy)에 의하여, SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20와 다른 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 핵산 변형은 또한, SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20의 대립유전자의 변형(allelic variant)일 수 있다. 대립유전자의 변형은 동일한 염색체 위치(chromosome locus)를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 대체적인 형태 중 어느 것을 표현한다. 바람직한 핵산 변형은 잠재성 돌연변이(들)(silent mutation(s))을 포함하는, 뉴클레오티드 서열이다. 대체적으로 또는 조합 내에서, 핵산 변형은 또한, 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 얻어질 수 있으며, 이는 그 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 그 폴리펩티드의 또 다른 아미노산 서열을 초래하지 않고, 본 발명의 폴리펩티드의 생산을 위해 의도된 숙주 개체의 코돈 법(codon usage)에 부합한다. 바람직한 실시예에 따르면, 핵산 변형은 이의 생물학적 기능을 여전히 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. 더 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열 변형은 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성 및/또는 용해 활성도를 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. 훨씬 바람직하게는, 핵산 변형은 초기에 정의된 바와 같이 강화된 포도상구균 펩티도글리칸 세포 벽-부착성 및/또는 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 포도상구균 (S Stahpylococcus) 펩티도글리칸 세포 벽-부착성 및/또는 용해 활성도을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 어느 미생물로부터 분리될 수 있다.

이러한 모든 변형은, SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20 뉴클레오티드 서열 또는 탐침을 디자인 하는데 사용될 수 있는 이들의 변형으로 저-중-고 잡종화 상태에서 (under low to medium to high hybridization conditions) 잡종화에 의하여 라이브러리를 스크리닝(서던 블로팅 과정)하는 것과 같은, 기술자에게 알려진 기법을 사용하여 얻어질 수 있다. 저-중-고 엄격한 상태들 (Low to medium to high stringency conditions)은, 각각의 저-중-고 엄격한 상태를 위해 25%, 35% 또는 50% 포름아미드 중 어느 한 쪽, 잘리고 변성된 연어 정자 DNA 200pg/ml, 0.3% SDS 및 5X SSPE 내 42℃ 에서 잡종화 및 선잡종화(prehybridization)를 의미한다. 그 다음에, 상기 잡종화 반응은, 각각의 저-중-고 엄격한 상태를 위해 55℃, 65℃ 또는 75℃ 중 어느 한 쪽, 0.2%SDS 및 2XSSC를 사용하여 각각 30분 동안 3번 세척된다.

본원에 제시된 서열 정보는, 틀리게 확인된 베이스들(bases)의 포함을 요할 정도로 매우 좁게 해석되어선 안 된다. 기술자는 그러한 틀리게 확인된 베이스들을 확인할 수 있으며, 그러한 에러들을 어떻게 바로잡을지 알고 있다.

핵산 구조물

다른 측면에서, 이전 항목에서 확인된 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물이 제공된다. 이러한 핵산 구조물은 세포 벽-부착 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 더 가능하게는 이전 항목에서 정의된 제2 및 제3 및 임의적으로 제4 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이는 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어, 세포, 대상 또는 세포-프리 발현 시스템 내 암호화된 폴리펩티드의 발현 및 생산을 지휘한다.

발현 벡터는 재조합 발현 벡터로 보일 수 있다. 이러한 벡터는, 본 발명에 따른 핵산 분자를 도입하는 것에 의하여 형질전환 되는(transformed) 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 바이러스에 의해 구성될 수 있다. 형질전환 시키기 위한 숙주 개체에 따른 상기 형질전환 벡터는 당해 기술의 숙련된 자들에게 잘 알려져 있고 문헌에 널리 기술되어 있다.

본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 접목시키는 것에 의한 숙주 개체의 형질변환 과정이며, 전문 서적 내에서 및 특히 본 출원 내 인용된 참고문헌 내에서 어느 적합한 잘 알려진 수단에 의하여, 더 특별하게는 본 발명에 따른 벡터에 의하여, 형질 변환은 수행될 수 있다.

세포

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 본 발명의 발현 벡터 또는 핵산 구조물을 포함하는, 세포에 관한 것이다. 세포는 미생물의, 원핵의 또는 진핵의 세포 중 어느 것이 될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 세포는 E. Coli이다. 더 바람직한 실시예에서, 상기 세포는 E.Coli CL1blue MRF 이다.

방법

다른 측면에서, 이전 항목에서 정의된 폴리펩티드를 생산하고, 임의적으로 정제하고, 및 임의적으로 동결-건조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은:

i) 이전 항목에서 정의된 핵산 구조물을 포함하는 세포 내 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계, 임의적으로

ii) 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계, 및 임의적으로

iii) 상기 정제된 폴리펩티드를 동결-건조하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시예에서, E.Coli 은 재조합 기법을 사용하여 폴리펩티드를 생산하기 위해 단계 i)에서 사용된다. 더 바람직하게는, E.Coli XL1blueMRF 이 재조합 기법을 사용하여 폴리펩티드를 생산하기 위해 단계 i)에서 사용된다. 바람직하게는, 단계 ii)에서, 중력 유동으로 조합 내에서 5ml 낮은 밀도 니켈 킬레이팅 아가로스 비드(ABT beads)에 채워진 IMAC 및 에코노-팩 크로마토그래피 칼럼(Econo-Pac Chromatography columns)(Biorad)이 상기 6xHis-태그된 재조합물 (6xHis-tagged recombinant) 폴리펩티드를 정제하는데 사용된다. 추출된 폴리펩티드는 3 x 11 냉동건조 버퍼에 대해 2, 4, 및 12 시간 동안 투석될 수 있고, 상기 버퍼는 바람직하게는 50mM 인산염, 500mM 수크로오스, 200mM 마니톨, 0.005% 폴리소르베이트, pH7.4를 포함한다.

방법

다른 측면에서, 본 발명은 또한 이전 항목에서 정의된, 또는 위에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는, 폴리펩티드를 처리하여 강화된 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 처리는 처리되지 않은 폴리펩티드에 비교하여 용해 활성도를 증가시키기 위해 2가 금속 이온을 치환하는 것을 포함하며, 바람직하게는 상기 방법은:

i) 킬레이트 화합물(chelating compound)을 포함하는 버퍼에 대하여 상기 폴리펩티드를 투석하는 단계;

ii) 2가 금속 이온-포함 버퍼에 대하여 상기 폴리펩티드를 투석하는 단계로서, 바람직하게는 상기 2가 금속 이온은 Mn²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, 및 Zn²⁺ 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 단계를 포함한다.

본원에 정의된 "킬레이트 화합물" 은 금속 이온을 부착한다. 잘 알려진 킬레이트 화합물은 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diammine tetraacetic acid; EDTA) 및 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA) 이다. 바람직하게는 본 발명의 방법의 단계 i)에서 EDTA 가 사용된다.

바람직하게는, 단계 ii)의 상기 2가 금속 이온은 Mn²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ 로 구성된 군으로부터 선택되며, 더 바람직하게는, 상기 2가 금속 이온은 Mn²⁺ 및 Co²⁺로 구성된 군으로부터 선택되며, 훨씬 바람직하게는, 상기 2가 금속 이온은 Mn²⁺ 이다.

위에 정의된 어느 것에 의한 2가 금속 이온을 치환하는 것은 2 ~ 2.5 배의Ply2638 의 용해 활성도 증가를 초래한다. 용해 활성도는 본원에 정의된 분광광도적으로 평가된다. 바람직하게는, 상기 방법은 처리되지 않은 폴리펩티드에 비교하여 최소 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 배의 용해 활성도에 있어서 증가를 이끈다. 훨씬 바람직하게는, 상기 방법은 적어도 2.5 배의 용해 활성도에 있어서 증가를 이끈다. 바람직하게는 상기 처리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1에 의해 암호화된 처리되지 않은 폴리펩티드에 비교하여 용해 활성도에 있어서, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 내지 2 배 증가를 나타낸다.

조성물

다른 측면에서, 본원에 확인되거나 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는, 핵산 분자 또는 핵산 구조물 또는 폴리펩티드 또는 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 본 발명은 본원에 정의된 용해 활성도를 나타내는 조성물에 관한 것이다. 더 바람직하게는 상기 조성물은 약물용이다. 이러한 약물은 바람직하게는 감염성 질병을 치료하고, 예방하고 및/또는 지연시키기 위한 것이다. 본 발명은 또한 약제학적이거나 의학적인 조성물에 관한 것이다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은 감염성 질병의 치료를 위한 약제학적이거나 의학적인 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 박테리아, 바람직하게는 포도상구균 속(genus Staphylococcus)의 박테리아, 더 바람직하게는 황색포도상구균 종 (species S. aureus)의 박테리아에 의해 유발되는 감염성 질병의 치료를 위한 약제학적이거나 의학적인 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 감염성 질병은 피부 감염, 유선염(mastitis), 폐렴(pneumonia), 뇌수막염(meningitis), 심내막염(endocarditis), 독성 쇼크 증후군(Toxic Shock Syndrome; TSS), 패혈증(sepsis), 패혈증(septicemia), 균혈증(bacteremia), 또는 골수염(osteomyelitis)이다. 바람직하게는, 상기 피부 감염은 여드름(pimples), 농가진(impetigo), 종기(boils), 종기(furuncles), 봉와직염(cellulitis) 모낭염(folliculitis), 종창(carbuncles), 스케일 피부 증후군(scaled skin syndrome) 및 농양(abscesses)의 군으로부터 선택된다.

본원에 정의된 조성물은 본원에 확인되거나 또는 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 다른 핵산 분자, 및/또는 핵산 구조물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 벡터 및/또는 세포의 혼합물을 포함할 수 있다.

본원에 정의된 조성물은 하나 또는 그 이상의 추가적인 활성 성분들을 포함할 수 있다. 활성 성분들(active)는 본원에 정의된 용해 활성도를 나타내는 것으로 본원에 정의된다. 바람직하게는, 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 활성 성분들은 박테리오파지 또는 파지(phage) 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 포함된 파지는 문헌에서 알려진 어느 파지가 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 포함된 파지는 미오비리데(Myoviridae), 시포비리데(Siphoviridae) 및 포도비리데(Podoviridae) 로 이루어진 리스트의 패밀리에 속할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 포함된 파지는 또한 테크티비리데(Tectiviridae), 코르티코비리데(Corticoviridae), 리포스릭비리데(Lipothrixviridae), 플라스마비리데(Plasmaviridae), 루디비리데(Rudiviridae), 푸셀로비리데(Fuselloviridae), 이노비리데(Inoviridae), 마이크로비리데(Microviridae), 레비비리데(Leviviridae) 및 시스토비리데(Cystoviridae) 로 이루어진 리스트의 패밀리에 속할 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 하나 또는 그 이상의 활성 성분들은 리소스타핀, 바람직하게는 SEQ ID NO: 34 와 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% 서열 동일성을 갖는 포도알구균 리소스타핀 (S. Simulans lysostaphin), 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 34의 포도알구균 리소스타핀으로 구성되거나 및/또는 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 하나 또는 그 이상의 활성 성분들은, 하나 또는 그 이상의 다른 박테리오파지 및 리소스타핀 둘 다로, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 다른 파지들 및 포도알구균 리소스타핀 (SEQ ID NO: 34), 구성되거나 및/또는 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 본원에 정의된 활성 성분들의 조합은 순차적이거나 및/또는 동시에 투여될 수 있다.

본원에 정의된 조성물은 약제학적으로 수용 가능한 담체(carrier)를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 약용 또는 약물용으로 바람직하다. 바람직하게는 상기 약물은 감염성 질병의 치료에 사용된다. 조성물은 액상, 고체 또는 반-액상이거나 반-고체 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 황색포도상구균 에 감염된, 인간을 포함하여, 동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 투여의 어떠한 적합한 경로가 상기 조성물을 투여하는데 사용될 수 있으며: 폐까지 전달을 위한 경구의, 에어로졸 또는 다른 장치, 비강 스프레이, 정맥 내(intravenous), 근육 내(intramuscular), 복강(intraperitoneal), 막 내(intrathecal), 질(vaginal), 직장(rectal), 국소(topical), 요추 천자(lumbar puncture), 막 내(intrathecal), 및 뇌 및/또는 수막(meninges)에 직접 적용하는, 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는다

본원에 확인되거나 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 구조물 또는 폴리펩티드 또는 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물은 바람직하게는, 환자 내부 또는 이러한 환자의 세포 내 또는 세포주 내 또는 생체 외(in vitro) 시스템 세포 프리 내에 존재하는 포도상구균 속의 양을 감소시킬 때, 활성적, 기능적 또는 약제학적으로 활성적이거나 감염성 질병을 치료하고 예방하고 및/또는 지연시킬 수 있는 것으로 언급되며, 바람직하게는 포도상구균 속의 초기 양보다 적거나 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이 여전히 검출 가능한 것을 의미한다. 바람직하게는 포도상구균 속을 검출할 수 없는 것이다. 이 단락에서, "포도상구균 속의 양" 표현은 바람직하게는 살아있는 포도상구균 속을 의미한다. 포도상구균 속은, 포도상구균 특이적 항체를 사용하여 면역조직화학(immunohistochemical) 기법, 포도송이응고효소 (staphylocoagulase)를 검출하는 튜브 응고효소 테스트(tube coagulase tests) 또는 응고인자(clumping factor)(슬라이드 응고효소 테스트)나 및/또는 단백질 A(통상적인 라텍스 테스트) 와 같은 표면 단백질의 "유리응고효소(free coagulase)" 검출과 같은, 당업자에게 알려진 표준적인 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 살아있는 포도상구균 속은, 박테리아의 mRNA를 분석 하기 위하여 미생물의 박테리아의 배양 기법 및/또는 실시간 양적 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)과 같은 당업자에게 알려진 표준적인 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 감소는 바람직하게는, 본 발명의 상기 조성물 또는 폴리펩티드로 치료전 개인 또는 환자 내부에 존재하는 양에 비교하여 개인 또는 환자의 세포 내 또는 조직 내에서 평가된다. 대체적으로(Alternatively), 상기 비교는, 이러한 치료가 국부적일 경우에는 상기 조성물 또는 폴리펩타이드로 아직 치료되지 않은 개인 또는 환자의 세포나 조직으로 행하여질 수 있다.

본원에 확인되었거나 또는 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 구조물 또는 폴리펩티드 또는 벡터 또는 세포는, 환자에 또는 상기 환자의 세포, 조직 또는 기관에 적어도 1주, 1달, 6달, 1년 또는 그 이상 투여될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 정의된 용해 활성도 및/또는 부착성을 나타내는 비-의학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 항생제(antimicrobial)에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 박테리아, 바람직하게는 포도상구균 속의 박테리아, 더 바람직하게는 황색포도상구균 종의 박테리아를 용해하기 위한 항생제에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 음식 방부제 또는 소독약에 관한 것이다.

용도

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 제1, 제2, 제3 및 임의적으로 제4 핵산 서열에 의해 암호화된 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 구조물, 상기 구조물을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 및/또는 위의 것들 중 어느 것을 포함하는 조성물의 용도, 바람직하게는 항생제로서의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 박테리아, 바람직하게는 포도상구균 속의 박테리아, 더 바람직하게는 황색포도상구균 종의 박테리아를 용해하기 위한 항생제로서의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 음식 방부제 또는 소독약으로서의 항생제에 관한 것이다. 가능한, 상기 음식 방부제 또는 소독약들은 다른 항생제제와 함께 사용된다. 바람직하게는 상기 음식 방부제 또는 소독약들은 본원에 정의된 하나 또는 그 이상의 부가적인 활성 성분들과 함께 조합되어 사용된다. 바람직하게는, 상기 하나 또는 그 이상의 부가적인 활성 성분들은 본원에 정의된 박테리오파지 또는 파지 및 항생 물질로 이루어진 군으로부터 선택된다.

위에-참조된 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터, 세포 및/또는 조성물은 음식물 안이나 위에, 및/또는 소독될 수 있는 다양한 물리적 위치에 적용될 수 있으며, 음식물 내에 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 세포 및/또는 폴리펩티드를 섞거나, 소독될 수 있는 물리적 위치나 식료품 상에 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 세포 및/또는 폴리펩티드를 스프레이 하는 것을 포함하는, 수많은 수단에 의할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폴리펩티드는 세포로부터 분리될 수 있거나 또는 본 발명의 상기 폴리펩티드를 함유하는 세포는 직접적으로, 상기 폴리펩티드의 분리 없이 투여되거나 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 세포가 대상(인간 또는 동물)에 투여되거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드가 음식 내로 분비되는 표면에, 표면 상에 또는 대상의 위 내에 적용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 그 다음에 부착하고, 이러한 환경 내에 존재하는, 임의적으로 박테리아 세포, 바람직하게는 포도상구균 속의 박테리아, 더 바람직하게는 황색포도상구균 종의 박테리아를 용해시킨다.

본원에 정의된 제1 핵산 서열에 의하여 암호화된 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 구조물, 상기 구조물을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 및/또는 위의 것들 중 어느 것을 포함하는 조성물, 바람직하게는 박테리아를 검출하는, 더 바람직하게는 포도상구균 속의 박테리아를 검출하는, 더 바람직하게는 황색포도상구균 종의 박테리아를 검출하는 용도가 더 포함된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터, 세포 및/또는 조성물은 진단용으로 사용된다. 가능한 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 구조물, 벡터, 세포 및/또는 조성물은 다른 검출 제제와 함께 사용된다.

방법

본 발명은 다른 측면에서, 본원에서 초기에 정의된 조성물을 투여하여 감염성 질병을 치료하고 지연시키고 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 모든 특성들은 이미 본원에 정의되어 있다.

정의

서열 동일성

"서열 동일성"은 둘이나 그 이상의 아미노산(펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질) 서열, 또는 둘이나 그 이상의 핵산(뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드) 서열 사이에서 그 서열들을 비교하는 것에 의해 결정되는 관계로서, 본원에 정의된다. 당해 기술에서 "동일성"은 또한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하며, 경우에 따라서, 상기 서열들의 일련들 사이에 매치(match)에 의해 결정된다. 두 아미노산 서열 사이에서 "유사성"은, 하나의 펩티드나 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환기들을 제2 펩티드나 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정된다. 바람직한 실시예에서, 동일성이나 유사성은 본원에 확인된 전체 SEQ ID NO 에 걸쳐서 계산된다. "동일성" 및 "유사성"은 잘 알려진 방법으로 쉽게 계산될 수 있으며, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)에 기술된 것들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

동일성을 판단하는 바람직한 방법들은 테스트된 서열들 사이에서 가장 많은 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 판단하는 방법들은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램 내에서 코드화된다(codified). 두 서열 사이에서 동일성 및 유사성을 판단하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법들은, 예를 들면 the GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)를 포함한다. 상기 BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 소스들(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))로부터 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterma 알고리즘 또한 동일성을 판단하는데 이용될 수 있다.

폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터들은 다음을 포함한다: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); Gap Penalty: 12; 및 Gap Length Penalty: 4. 이들 파라미터들과 함께 유용한 프로그램은 Genetics Computer Group, located in Madison, WI의 "Ogap" 프로그램으로서 공개적으로 이용 가능하다. 전술한 파라미터들은 아미노산 비교(종료 갭(end gaps)을 위한 패널티가 수반되지 않는)를 위한 디폴트 파라미터들이다.

폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터들은 다음을 포함한다: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix: matches=+10, mismatch=0; Gap Penalty: 50; Gap Length Penalty: 3. Available as the Gap program from Genetics Computer Group, located in Madison, Wis. 위에 주어진 것들은 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터들이다.

임의적으로, 아미노산 유사성의 정도를 결정함에 있어서, 숙련된 자는 소위 "보존적인" 아미노산 치환기들이, 숙련된 자에게 명백할 것이기 때문에, 이를 참작할 수 있다. 보존적인 아미노산 치환기들은 유사한 곁사슬을 갖는 잔기들의 호환성을 말한다. 예를 들면, 지방족 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 글리신, 아닐린, 발린, 루신, 및 이소루신이며; 지방족-히드록실기 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-포함 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 아스파라진 및 글루타민이며; 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 기본 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 및 황-포함 곁사슬을 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적인 아미노산 치환 그룹들은: 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라진-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환기의 변형들은 제거되고, 그 자리에 다른 잔기가 삽입된다. 바람직하게는, 상기 아미노산 변화는 보존적이다. 자연스럽게 발생하는 아미노산들의 각각의 바람직한 보존적인 치기들은 다음과 같다; Ala 에서 ser; Arg 에서 lys; Asn 에서 gln 또는 his; Asp 에서 glu; Cys 에서 ser 또는 ala; Gln 에서 asn; Glu 에서 asp; Gly 에서 pro; His 에서 asn 또는 gln; Ile 에서 leu 또는 val; Leu 에서 ile 또는 val; Lys 에서 arg; gln 또는 glu; Met 에서 leu 또는 ile; Phe 에서 met, leu 또는 tyr; Ser 에서 thr; Thr 에서 ser; Trp 에서 tyr; Tyr 에서 trp 또는 phe; and, Val 에서 ile 또는 leu.

핵산 구조물, 형질변환, 발현 벡터, 작동 가능하게 연결된, 발현, 조절 서열, 펩티드

구조물

핵산 분자는 뉴클레오티드 서열에 의해 표현된다. 폴리펩티드는 아미노산 서열에 의해 표현된다. 자연에 존재하지 않는 방법으로 병렬되거나 결합된 핵산 부분들을 포함하도록 수정되거나 자연적으로 발생하지 않는 유전자로부터 분리된 핵산 분자로, 핵산 구조물은 정의된다. 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열에 의해 표현된다. 임의적으로, 핵산 구조물 내 존재하는 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되며, 세포 내 또는 대상 내의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 생산을 지휘한다.

"작동 가능하게 연결된"은, 조절 서열이 세포 내 및/또는 대상 내에서 본 발명의 폴리펩티드나 펩티드의 생산/발현을 지휘하도록, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 위치에 조절 서열이 적절하게 위치된 배치상태로서, 본원에 정의된다.

"작동 가능하게 연결된"은 또한, 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)가 세포 내 및/또는 대상 내에서 암호화되도록, 기능적인 도메인을 암호화하는 또 다른 서열에 관한 위치에 서열이 적절하게 위치된 배치상태를 정의하는 것으로 사용될 수 있다. 발현은, 전사, 후-전사 수정, 번역, 후-번역 수정 및 분비를 포함하는 폴리펩티드나 펩티드의 생산을 포함하는 어떠한 단계도 포함하는 것으로 이해될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조절 서열은 폴리펩티드의 발현에 이롭거나 필요한 모든 구성요소들을 포함하는 것으로 본원에 정의된다. 최소한으로, 상기 조절 서열은 프로모터 및 전사적이고 번역적인 정지 신호를 포함한다. 임의적으로, 핵산 구조물에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 의해 나타난 프로모터는 본원에 확인된 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 또 다른 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.

상기 용어 "형질변환"은 새로운 DNA의 병합(즉, 외인적인 DNA 가 세포로)에 따른 세포 내 유발되는 일시적이거나 영구적인 유전적 변화를 말한다. 상기 세포가 박테리아의 세포일 때, 본 발명에 의도된 바와 같이, 상기 용어는 일반적으로, 선택적으로 항생제 내성을 잠복시킨 자기-복제 벡터, 염색체 이외의 것을 말한다.

발현 벡터는, 편리하게 재조합 DNA 절차를 진행하기 쉬울 수 있고 세포 내 및/또는 대상 내 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 일으킬 수 있는 어떠한 벡터도 될 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "프로모터"는 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 핵산의 전사를 조절하는 기능을 수행하는 핵산 조각을 말하며, 유전자의 전사 시작 부위의 전사의 방향에 관하여 업스트림에 위치된다. 이는, DNA-의존 RNA 폴리머라제의 부착 부위, 전사 시작 부위, 및 상기 프로모터로부터 전사의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하도록 작동시키기 위하여 해당 기술의 숙련자에게 알려진 뉴클레오티드의 어느 다른 서열들 및 작동자와 억제자 단백질 부착 부위, 전사 인자 부착부위를 포함하지만, 한정적이지는 않은, 어느 다른 DNA 서열의 존재에 의해 확인되는 부착 위치와 관련된다. 본 발명의 문맥 내에서, 프로모터는 전사 시작 부위(TSS)의 -1 뉴클레오티드에서 바람직하게는 끝난다.

본원에 사용된 "폴리펩티드" 는 어떠한 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 유전자 생성물, 발현 생성물 또는 단백질을 말한다. 폴리펩티드는 연속적인 아미노산으로 구성된다. 용어 "폴리펩티드"는 자연적으로 발생하거나 합성의 분자들을 포함한다.

본 명세서 내 및 본 청구범위 내에서, 동사 "포함하는" 및 이의 활용은, 다음의 단어들이 포함된 항목들을 의미하지만, 특별히 언급되지 않은 항목들이 배제되는 것은 아닌, 비-한정적인 의미로 사용된다. 동사 "~으로 구성되는" 은, 본원에 정의된 핵산 구조물 또는 벡터 또는 세포의 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 핵산 분자 또는 구성물 또는 생성물이 특별하게 확인된 것들보다 추가적인 구성요소(들)을 포함할 수 있는 것을 의미하는, "반드시 ~으로 구성되는" 에 의해 대체될 수 있으며; 상기 추가적인 구성요소(들)은 본 발명의 특유한 특성을 변화시키지는 않는다. 게다가, 애매한 문구에 의해 구성요소에 대한 언급 "a" 또는 "an"은, 문맥이 상기 구성요소들 중에서 오직 하나이고 한 개가 있다고 분명하게 요구하지 않는 한, 상기 구성요소들의 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 애매한 문구 "a" 또는 "an"은 그러므로 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다. 본 출원 내 인용된 모든 특허 및 참고문헌은, 이들 전체에서 참고로서 이에 의하여 포함된다. 다음의 실시예들은 오직 실질적인 예시적 목적에서 제공되며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.

도면의 설명

도 1은, 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포에 대한 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)활성도의 엔돌리신 농도에 의존하는 선형 관계. 분석은 표준 상태 (PBS 버퍼 pH 7.4, 120 mM 염화나트륨)에서 측광학적 용해 분석(photometric lysis assays)으로 수행되었다. 최대 활성도는, SigmaPlot 소프트웨어로 계산된 S자형 용해 곡선으로부터 회귀 적합도(regression fits)의 일차 도함수로부터 측정되었다. 에러 바들은 기술적인 3번의 실험으로부터 계산된 표준 편차를 나타낸다.

도 2. Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)의 용해 활성도 상에서 2가 양이온의 영향력. 효소는, MgCl₂, CaCl₂, ZnCl₂, CuCl₂, CoCl₂, 또는 MnSO₄를 함유하는 MOPS 버퍼에 대한 투석에 의해 금속 이온의 잇따른 치환으로 처리된 EDTA였다. EDTA 처리를 생략한 MOPS 버퍼에 대해 투석된 Ply2638는 레퍼런스 역할을 한다. 에러 바들은 기술적인 3번의 실험으로부터 계산된 표준 편차를 나타낸다.

도 3. 냉동건조 및 재구성 이후에 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포 상에서 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21) 50 nM 의 용해 활성도. 활성도는 표준 상태에서 혼탁도 환원 분석(turbidity reduction assay)으로 측정되었다. 냉동건조 버퍼가 대조군으로 쓰였다. 트리플 도메인 효소는 동결-건조 후에 완전한 용해 활성도를 회복한다.

도 4. 냉동건조 및 재구성(동결건조된 것으로 바람직한) 이후에, 새로 준비된 M23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 48 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 29) 및 Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21)에 비교하여, 황색포도상구균 (S. aureus) SA2638/2854 세포 상에서 M23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 48 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 29) 50 nM의 용해 활성도. 냉동건조 버퍼가 대조군으로 쓰였다. 활성도는 표준 상태에서 혼탁도 환원 분석으로 측정되었다. 트리플 도메인 효소는 동결-건조 후에 완전한 용해 활성도를 회복한다.

도 5. 리소스타핀(LST; SEQ ID NO: 33 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 34) 및 Ply2638 유도체 (SEQ ID NO: 11, 10, 48, 44 및 4에 의해 각각 암호화 되는 SEQ ID NO: 31, 30, 29, 21 및 24)의 농도에 의존하는 상대적 활성도. 50 nM 에서 LST의 활성도는 레퍼런스로서 설정되었다. 모든 분석들은 표준 상태(37℃, pH 7.4 및 120 mM 염화나트륨 농도)에서 프로즌 스톡(frozen stock) 으로부터 황색포도상구균 SA2638/2854 기질 세포를 사용하여 이뤄졌다.

도 6. 혼탁도 환원 분석에서 측정된, 끝이 절단되고 (PlyTw 도메인과 함께) 개량된 Ply2638 변형들의 염화나트륨 농도(오른쪽 도표) 및 다양한 pH 값들(왼쪽 도표) 에서 상대적인 활성도. 두 개의 촉매적인 도메인 중 하나에 의한 효소의 절단은 약화된 활성도를 초래했다. CBD (M23_Ami_SH3b_SH3b; SEQ ID NO; 49 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 32)의 복제는 기본적인 pH 값들 및 증가된 염 농도에서 용해를 가속화시킨다. CHAP11 도메인과 함께 Ply2638 의 개량은 그 결과, 포도상구균의 펩티도글리칸 층에서 3개의 다른 결합을 공격하는 것으로 보이는 효소가 된다. 이는 pH 최적조건들을 약간의 산성 상태로 변화시키고, 항균 활성도를 향상시킨다. 하지만 키메라 효소의 단백질 안정도는 도전과제로 남는다. 표준 상태 (pH 7.4 및 120 mM 염화나트륨 농도)에서 Ply2638의 최대 용해 속도가 레퍼런스로 설정되었다. 바들은 3번의 분석의 수단으로 나타나며, 표준 편차는 나타내지 않는다(CHAP_M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 45 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 25; Ami_M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 46 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 26; M23_Ami_SH3b_SH3b = SEQ ID NO: 49 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 32; M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21; Ami_SH3b = SEQ ID NO: 2 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 22; M23_SH3b = SEQ ID NO: 3 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 23).

도 7. 표준 상태에서 황색포도상구균 SA2638/2854 기질 세포들을 사용하는 것에 대하여 50 nM 쿼드러플 도메인 효소(quadruple domain enzymes) (SEQ ID NO: 47 및 8 에 의해, 각각 암호화 되는 SEQ ID NO: 27 및 28), Ply2638 (SEQ ID NO: 44 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 21), 및 리소스타핀 (SEQ ID NO: 33 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 34)의 활성도. 냉동건조 버퍼가 대조군으로 쓰였다. 쿼드러플 도메인 효소들은 Ply2638, PlyTw, 및 리소스타핀 도메인들을 결합하는 것에 의해 구조화된다.

실시예

재료 및 방법

박테리아 균주, 배양 상태, 파지 및 플라스미드

E. coli XL1BlueMRF` 및 E. coli Sure 가 6x-His-tagged (SEQ ID NO: 43) 융합단백질의 과-발현을 위해 사용되었다. 두 균주는 플라스미드 선정을 위해 30℃에서 LB-PE 배지에서 100 ㎍/ml 엠피실린 및 30 ㎍/ml 테트라실린과 함께 배양되었다. 파지 2638A 용해물은 Ply2638A 유전자 또는 이의 암호 부위 도메인의 증폭을 위한 주형으로 사용되었다. CHAPTw 도메인 (SEQ ID NO: 19)는 파지 트워트 용해물로부터 증폭되었다. 파지 11 (각각 SEQ ID NO 18 및 17; Donovan, et al., 2006 and 2008; Navarre et al., 1999; Sass and Bierbaum 2007)로부터 아미다제 도메인 및 시스테인-히스티딘 의존 아미다제/ 펩티다제 (CHAP) 도메인은 Donovan, D.M. 으로부터의 친절한 선물인, phi11 자기분해 유전자(autolysin gene)를 포함하는 pet21a 벡터로부터 증폭되었다. 숙성 리소스타핀(SEQ ID NO: 33)의 서열을 포함하는 플라스미드 LT1215는 도메인 증폭 M23-LST (SEQ ID NO: 15) 및 CWT-LST (SEQ ID NO: 13)를 위한 주형으로 사용되었다.

pQE-30 벡터(카탈로그 숫자: 32915, Qiagen, Hilden, Germany; SEQ ID NO: 50)가, E. coli XL1BlueMRF` 또는 E. coli Sure 각각 내에서, 6x-His tagged 재조합 융합 단백질의 클로닝 및 발현 벡터로서 사용되었다.

DNA 기술들 및 클로닝 과정

Sambrook, Maniatis et al.(1989)에 따른 표준 기법들은 단일 유전자의 클로닝 및 융합 단백질의 창작에 채용된다. High Fidelity PCR Enzyme mix (Fermentas)가 PCR 반응에 사용된다. DNA 농도는 분광광도계 (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer)로 측정된다.

pHPl2638 는 pQE30 (SEQ ID NO: 50) BamHI - SalI 부위 안으로 서열 Met1 - Lys486 를 암호화하는 Ply2638 (SEQ ID NO: 1)의 삽입에 의해 구조화 된다. pHPl2638-Pl2638 구조물은 BamHI-SacI-SalI 부위 안으로 연속적으로 삽입된 동일한 서열을 갖는다. CHAP11 (SEQ ID NO: 18), Ami11 (SEQ ID NO: 17) 및 CHAP_Ami11 는 소화된 pHPL2638A BamHI(BamHI digested pHPL2638A) 안으로 도입된 N-말단이다. 연결 반응 이전에, 상기 벡터는 쉬림프 알칼리 포스파타제(shrimp alkaline phosphatase; SAP, Fermentas) 를 사용하여 탈인산화된다. pHM23_CBD2638 (SEQ ID NO: 3), 및 pHM23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 49)는, BamHI 및 SacI 제한 부위를 사용한 각각의 삽입으로 pHGFP_CBD2638A_c 벡터 (SEQ ID NO: 59)로부터 GFP 암호화 부위의 대체에 의해 구조화된다. pHM23-LST_Ami2638_CBD2638 (SEQ ID NO: 48)는, SacI 및 SalI 부위 내에 Leu138 - Lys486 를 암호화하는 Ply2638 부분적인 서열 및 BamHI 및 SacI 내로 삽입된 서열 Ala1 - Gly154 를 암호화하는 숙성 리소스타핀 (SEQ ID NO: 33)과 함께 pQE-30 백본을 갖는다. pHM23-LST_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID NO: 11)는, pQE30의 SacI 및 SalI 부위로 Ala1 - Lys246, 및 BamHI 와 SacI 로 삽입된 Ala1 - Gly154 서열 숙성 리소스타핀 (SEQ ID NO: 33)을 갖는다. pHLST-LST (SEQ ID NO: 10) 는, BamHI - SacI 및 SacI - SalI 부위 내 반복적으로 Ala1 - Lys246 를 갖는 같은 방식으로 구조화된다. 쿼드러플 도메인 구조물 pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CBD2638 (SEQ ID NO: 47) 및 pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID NO: 8)를 암호화하는 플라스미드 내에서 상기 도메인들은 직접적으로 스플라이싱 오버랩 확장 PCR (splicing overlap extension PCR; SOE)을 통해서 융합되고 pQE30 BamHI 및 SalI 부위로 삽입된다. 두 구조물 전부에서, 개별적인 도메인 (CHAPTw, SEQ ID NO: 19: Met1 -Ile140, Ami2638, SEQ ID NO: 16: Lys141-Gly358 of SEQ ID NO: 1, CBD2638, SEQ ID NO: 12 : Trp393- Lys486 of SEQ ID NO: 1, M23-LST, SEQ ID NO: 15: Ala1 - Gly154 of SEQ ID NO: 33, CWT-LST, SEQ ID NO: 13: Trp155 -Lys246 of SEQ ID NO: 33)의 보더 부위(boarder regions)들은 생물정보학 (미발표 데이터)로 결정된다. 반복적인 서열들을 갖는 플라스미드들은 E. coli Sure 균주 내로, 모든 다른 플라스미들은 E. coli XL1BlueMRF 내로 도입된다(transferred).

재조합 융합 단백질의 발현 및 정제

단백질 과발현 및 부분적인 정제는, 이전에 다른 곳에서(Loessner et al., 1996, Schmelcher et al., 2010) 기술된 바와 같이 필수적으로 행하여진다. 요약하면, E. coli 가 갖는 플라스미드는 수정된 LB 배지 (15 g/l 트립토스, 8 g/l 이스트 추출물, 5 g/l NaCl, pH 7.8) 250ml 에서, 600nm에서의 광학농도(OD600nm) 0.4 내지 0.6까지 키워지고, 1 mM IPTG 와 함께 유도된다. 세포들은 30℃에서 4시간 동안, 또는 20℃에서 18시간 동안 더 배양되고, 원심분리기로 수확된다. 세포 펠렛(Cell pellets)은 5ml 고정 버퍼 (50 mM NaH₂PO₄, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 0.1% 폴리소르베이트20, pH 7.4) 내에서 부유된다. 가용성 재조합 단백질을 포함하는 시토졸(Cytosolic) E. coli 내용물은 1200 psi 에서 작동되는 French Pressure Cell Press (1200 psi, SLM Aminco, Urbana, IL, U.S.)를 통과하는 이중 통로에 의해 해방된다. 다른 다운스트림 가공 단계들은, 원심분리, 여과 살균(0.2㎛ PES membrane, Millipore) 및 낮은 밀도의 Ni-NTA Superflow resin (Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland)를 갖는 MicroBiospin (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.) 칼럼 다발을 사용하는 고정된 금속 친화 크로마토그래피 (Immobilized Metal Affinity Chromatography; IMAC) 정제에 의해 불용성 세포 잔해물의 제거를 포함하였다. 칼럼-상에 있는 Ni-NTA 고정된 단백질들은 중력유동으로 5-10 칼럼 부피 고정 버퍼로 씻긴다. 단백질 조각들은 그 다음에, 용출 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 125 mM imidazole, 0.1% polysorbate20, pH 7.4)로 용출되고, 투석 버퍼(50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, 0.1% polysorbate20, pH 7.4)를 2번 바꾸어 투석된다. 단백질 농도는 NanoDrop ND-1000 spectrophotmeter 에서 정의되며, Vector NTI software (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.)로 1차 아미노산 서열로부터 계산된 280nm 에서 특이적인 흡광도를 교정하고, SDS-PAGE 에 의해 순도가 측정된다. 분취량(Aliquots)은 50% 글리세롤에 혼합되어 -20℃ 에서 보관된다.

재조합 단백질의 냉동건조

IMAC 정제된 단백질들은 300 ml 냉동건조 버퍼 (50 mM 포스페이트 또는 트리스, 500 mM 수크로스, 200 mM 마니톨, pH 7.4)에 대하여 3번 투석하고, 액화 질소의 기체 상태 내에서 동결된다. 상기 동결-건조하는 것은 60 분 동안 75 mTorr 진공상태 및 -40℃ 에서 행하여 지고, 이어서 5시간 동안 -10℃로 온도를 상승시키고, 및 동일한 진공레벨에서 -10℃ 에서 또 다른 60분이 따른다. 마지막 단계로서, 온도는 10시간 동안 25℃로 상승된다. 샘플들은 물의 첨가에 의하여 용해 분석 내에서 테스트되기 전에 재구성된다.

세포 벽-부착 분석

세포 벽 리간드에 밀착 결합(tight binding)을 조정하고 박테리아의 표면에 GFP 융합을 지휘하는 CBD의 능력을 측정하기 위한 표준 분석으로서, 다음의 상태가 사용된다: 늦은 지수증식기(late log phase)로부터의 박테리아, 바람직하게는 황색포도상구균 BB255이 원심분리기로 수확되고, PBS-T (50 mM NaH₂PO₄, 120 mM NaCl [pH 8.0], 0.01% 폴리소르베이트 20)의 1/10th 부피에서 재부유되며, 얼음 상에 보관된다. GFP-CBD 단백질, 바람직하게는 SEQ ID NO: 60 에 의하여 암호화되는 SEQ ID NO: 64 는 같은 버퍼 내에 400 nM (2x GFP-CBD) 의 농도로 희석되고, 또한 얼음 상에 보관된다. 1.5 ml 미량원심분리기 컵 안에서, 세포들 100㎕ 및 2x GFP-CBD 100㎕ 가 혼합되고 5분 동안 실온에서 배양된다. 세포들은 그 다음에 원심분리기 (16000 g, 60 s)내에서 원심분리로 상청액으로부터 제거된다. 상기 상청액은 버려지고 세포들은 PBS-T 버퍼 500㎕ 에서 2번 세척된다. 형광현미경검사를 위하여, 상기 펠렛은 마지막으로 버퍼 50㎕ 내에 재부유된다. 형광강도 분석을 위하여, 상기 펠렛은 마지막으로 PBS-T 200㎕ 내에 재부유되고 마이크로플레이트 웰에 옮겨진다. 정량적 형광발광 분석은, 살균한, 미처리된, 블랙 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(black 96-well polystyrene microplates; Nunc, Roskilde, Denmark)로, 멀티 라벨 카운터 기기(Victor3, Perkin Elmer, Massachusetts, U.S.)를 사용하여 수행된다. 음성 대조군 GFP가 사용될 수 있다.

정량적 형광발광 분석 (Quantitative fluorescence assays)

황색포도상구균 BB255 세포 표면 리간드 상호작용에 대한 CBD2638 에의 pH 및 염의 의존도는, SEQ ID NO: 60 에 의하여 암호화되는 SEQ ID NO: 64, 7.5 ㎍ GFP-CBDS2638 융합 단백질으로, OD_600nm 1 +/- 0.05 (~4 x 10⁹ 세포)로 설정하여 1ml 부피로부터 세포들의 배양에 의해 조사되었다. 단백질에 대한 이러한 세포 비율은 이전 실험에서 측정된 바와 같은 포화점에 가까우며, 부착 효율에 있어서 변형들을 탐지를 할 수 있다. 변화하는 pH는 시트르산 버퍼 pH 4.5 내지 6.5 및 포스파이트 버퍼 pH 6 내지 9 를 사용하여 테스트된다. pH 버퍼 내 GFP-CBD2638 단백질과 함께 배양한 후에, 세포들은 각각 pH 버퍼로 세척되며, 이어서 표준 PBS-T (pH 8) 세척이 이어진다. 마지막으로, 세포들은, Victor³ 멀티 라벨 카운터로 이들의 200㎕ 부유물로부터 형광을 검출하기 위하여 OD_595nm = 0.3 에 맞추어진다. 유사한 실험들이, 염화나트륨 농도를 증가시켜서 준비된 버퍼를 사용하여 수행된다(10 mM NaH₂PO₄, 0 - 1000 mM NaCl, 0.1% 폴리소르베이트 20, pH 6).

변경된 세포 표면 특성을 갖는 포도상구균 균주의 CBD 부착 능력의 정량화는, 초과적인 GFP-CBD2638 단백질과 함께 미리 배양된, 세척되고 가열살균된 세포들의 상대적 형광발광 단위(relative fluorescence units; RFU)를 기록하는 것에 의해 테스트된다. OD_595nm = 0.3에 맞추어진, GFP-CBD2638 표지된 세포들의 동일한 부피 (200㎕)의 형광발광은, 멀티 라벨 카운터 기기에서 적절한 필터 세트를 사용하여 측정된다. 황색포도상구균 BB255 세포들 및 SDS 처리된 세포들 상에서 GFP-CBD2638 (SEQ ID NO: 60 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 64), GFP-CBD2638-CBD2638 (SEQ ID NO: 61 and 62 에 의해 각각 암호화 되는 SEQ ID NO 65 및/또는 66) 및 GFP-CBD2638-CBD2638-CBD2638 (SEQ ID NO: 63 에 의해 암호화 되는 SEQ ID NO: 67)의 흡광도 수준의 정량화 및 비교는 상기 동일한 방법으로 행하여진다.

용해 분석

용해 활성도 분석을 위한 기질 세포는, 600nm (OD600)에서 0.4 광학 밀도까지 키워지고, PBST pH 7.4 로 두 번 세척되며, 및 동일 시간에 100 배 농축하는 PBS 버퍼 pH7.4 를 포함하는 15% 글리세롤 내에서 재-부유되었다. 상기 세포들은 -20℃ 에서 보관되었다. 부착 또는 용해 활성도 분석에 있어서 다른 용도를 위하여 상기 세포들은 해빙되고, PBS pH 7.4로 세척되고, 및 1 ± 0.05 의 OD600로 희석된다. 표준 용해 활성도 분석에 있어서 단백질 샘플들은 등몰의 양으로 희석되고, 투명한 96-웰 조직 배양 테스트 플레이트(96-well tissue culture test plates; SPL life sciences, Pocheon, Korea) 내로 분포되었다. 기질 세포들은 마지막 부피로 추가되었고, 595nm (OD595nm)의 광학 밀도 내에서 소량은 37℃ 에서 약 1시간 동안 기록되었다.

Ply2638의 구조물 결실 및 개량의 용해 활성도는, 프로즌 스톡으로부터 파지 2638A 확장 균주 황색포도상구균 SA2638/2854 에 대하여 용해 분석 내에서 테스트되었다. 다양한 버퍼 상태에서 상기 활성도를 테스트하였다. 0.4 인크리먼트로 4,6 내지 9 의 pH 값들이 시트르산/ 포스파이트 버퍼(25 mM 시트르산, 25 mM 포스파이트, 120 mM NaCl, pH 4.6 - 6.6) 및 트리스/ 포스파이트 버퍼(25 mM 트리스, 25 mM 포스파이트, 120 mM NaCl)를 사용하여 테스트되었다. 0 내지 1000 mM 염화나트륨 범위의 염 농도(10 mM 포스파이트 버퍼 pH 7.4 내)에서 Ply2638A 유도체들의 활성도가 테스트 되었다. 상기 Ply2638A 유도체들은 용해 분석 내 이의 적용 이전에 MQ 와 함께 10 μM 최종 농도로 희석된다. 여기에서, 10 μM Ply2638A 유도체의 4㎕ 는 196㎕ 기질 세포 부유물로 멀티채널 파이펫을 사용하여 적용되며, 그 결과 200 nM 단백질의 분석 농도가 된다. 상기 기질 세포 부유물은 프로즌 스톡으로부터 준비되며, 이를 pH 또는 염 버퍼로 희석하며, 이를 분광광도적으로 1 ± 0.05 의 초기 OD600로 표준화한다. 595 nm (OD595)의 광학 밀도에서의 감소는 Victor3 1420 멀티 라벨 카운터 기구(Perkin Elmer)를 한 시간 동안 사용하여 측정되었다. 플레이트들은, 모든 단일 판독출력 후에, 1초 동안 힘차게 흔들어졌다(double orbit, 0.1mm 직경). 양성 대조군으로 N-말단 6xHis tagged 리소스타핀 (HLST), 상업적으로 이용 가능한 리소스타핀(재조합, E. coli 유래된, Sigma)이 제공되었다. 음성 대조군으로 MilliQ water 를 적용하였다.

Ply2638 의 활성도에서 2가 금속 이온의 영향

부분적으로 정제된 Ply2638 (SEQ ID NO: 21)은 2시간 동안 버퍼(50 mM MOPS, 100 mM 염화나트륨, 0.005% 폴리소르베이트20, 10 mM EDTA)를 포함하는 EDTA 에 대하여 투석되었고, 이어서 각각의 2가 금속 이온을 포함하는 버퍼(50 mM MOPS, 100 mM 염화나트륨, 0.005% 폴리소르베이트20, 및 각각의 10 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂, 1 mM CoCl₂, 1 mM CuCl₂, 1 mM MnSO₄, 또는 1 mM ZnCl₂)에 대한 투석이 이어졌다. 기질로서 사용된 세포들은, 표준 용해 분석에 있어서 이의 적용이전에, SDS 처리되었고 EDTA 세척되었다.

SEQUENCE LISTING <110> EBI Food Safety B.V. <120> A polypeptide <130> P6035159PCT <160> 67 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1461 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus bacteriophage 2638a <400> 1 atgctaactg ctattgacta tcttacgaaa aaaggttgga aaatatcatc tgaccctcgc 60 acttacgatg gttaccctaa aaactacggc tacagaaatt accatgaaaa cggcattaat 120 tatgatgagt tttgtggtgg ttatcataga gcttttgatg tttacagtaa cgaaactaac 180 gacgtgcctg ctgttactag cggaacagtt attgaagcaa acgattacgg taattttggt 240 ggtacattcg ttattagaga cgctaacgat aacgattgga tatatgggca tctacaacgt 300 ggctcaatgc gatttgttgt aggcgacaaa gtcaatcaag gtgacattat tggtttacaa 360 ggtaatagca actattacga caatcctatg agtgtacatt tacatttaca attacgccct 420 aaagacgcaa agaaagatga aaaatcacaa gtatgtagtg gtttggctat ggaaaaatat 480 gacattacaa atttaaatgc taaacaagat aaatcaaaga atgggagcgt gaaagagttg 540 aaacatatct attcaaacca tattaaaggt aacaagatta cagcaccaaa acctagtatt 600 caaggtgtgg tcatccacaa tgattatggt agtatgacac ctagtcaata cttaccatgg 660 ttatatgcac gtgagaataa 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ttattatgac ggtggaaagc tagaagtaag caaagcagca 1140 actatcaaac aatctgacgt taagcaagaa gttaaaaagc aagaagcaaa acaaattgtg 1200 aaagcaacag attggaaaca gaataaagat ggcatttggt ataaagctga acatgcttcg 1260 ttcacagtga cagcaccaga gggaattatc acaagataca aaggtccttg gactggtcac 1320 ccacaagctg gtgtattaca aaaaggtcaa acgattaaat atgatgaggt tcaaaaattt 1380 gacggtcatg tttgggtatc gtgggaaacg tttgagggcg aaactgtata catgccggta 1440 cgcacatggg acgctaaaac tggtaaagtt ggtaagttgt ggggcgaaat taaagagctc 1500 atgctaactg ctattgacta tcttacgaaa aaaggttgga aaatatcatc tgaccctcgc 1560 acttacgatg gttaccctaa aaactacggc tacagaaatt accatgaaaa cggcattaat 1620 tatgatgagt tttgtggtgg ttatcataga gcttttgatg tttacagtaa cgaaactaac 1680 gacgtgcctg ctgttactag cggaacagtt attgaagcaa acgattacgg taattttggt 1740 ggtacattcg ttattagaga cgctaacgat aacgattgga tatatgggca tctacaacgt 1800 ggctcaatgc gatttgttgt aggcgacaaa gtcaatcaag gtgacattat tggtttacaa 1860 ggtaatagca actattacga caatcctatg agtgtacatt tacatttaca attacgccct 1920 aaagacgcaa agaaagatga 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cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt 420 gattttaaag aagatggaaa cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac 480 aatgtataca tcatggcaga caaacaaaag aatggaatca aagttaactt caaaattaga 540 cacaacattg aagatggaag cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt 600 ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt ccacacaatc tgccctttcg 660 aaagatccca acgaaaagag agaccacatg gtccttcttg agtttgtaac agctgctggg 720 attacacatg gcatggatga actatacaaa gagctcggtg gaaagctaga agtaagcaaa 780 gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa 840 attgtgaaag caacagattg gaaacagaat aaagatggca tttggtataa agctgaacat 900 gcttcgttca cagtgacagc accagaggga attatcacaa gatacaaagg tccttggact 960 ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa 1020 aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg 1080 ccggtacgca catgggacgc taaaactggt aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa 1140 taa 1143 <210> 61 <211> 1539 <212> DNA <213> artificial <220> <223> His-tagged 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agcaaaacaa 840 attgtgaaag caacagattg gaaacagaat aaagatggca tttggtataa agctgaacat 900 gcttcgttca cagtgacagc accagaggga attatcacaa gatacaaagg tccttggact 960 ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa 1020 aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg 1080 ccggtacgca catgggacgc taaaactggt aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa 1140 gagctcggtg gaaagctaga agtaagcaaa gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag 1200 caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa attgtgaaag caacagattg gaaacagaat 1260 aaagatggca tttggtataa agctgaacat gcttcgttca cagtgacagc accagaggga 1320 attatcacaa gatacaaagg tccttggact ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa 1380 ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg 1440 gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg ccggtacgca catgggacgc taaaactggt 1500 aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa taagtcgac 1539 <210> 62 <211> 1560 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Hist-tagged GFP_CBD2638_CBD2638 var. 2 <400> 62 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga gtaaaggaga agaacttttc 60 actggagttg tcccaattct tgttgaatta gatggtgatg ttaatgggca caaattttct 120 gtcagtggag agggtgaagg tgatgcaaca tacggaaaac ttacccttaa atttatttgc 180 actactggaa aactacctgt tccatggcca acacttgtca ctactttcgc gtatggtctt 240 caatgctttg cgagataccc agatcatatg aaacagcatg actttttcaa gagtgccatg 300 cccgaaggtt atgtacagga aagaactata tttttcaaag atgacgggaa ctacaagaca 360 cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt 420 gattttaaag aagatggaaa cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac 480 aatgtataca tcatggcaga caaacaaaag aatggaatca aagttaactt caaaattaga 540 cacaacattg aagatggaag cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt 600 ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt ccacacaatc tgccctttcg 660 aaagatccca acgaaaagag agaccacatg gtccttcttg agtttgtaac agctgctggg 720 attacacatg gcatggatga actatacaaa gagctcggtg gaaagctaga agtaagcaaa 780 gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa 840 attgtgaaag caacagattg gaaacagaat aaagatggca tttggtataa agctgaacat 900 gcttcgttca cagtgacagc accagaggga attatcacaa gatacaaagg tccttggact 960 ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa 1020 aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg 1080 ccggtacgca catgggacgc taaaactggt aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa 1140 ggtaccggtg gaaagctaga agtaagcaaa gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag 1200 caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa attgtgaaag caacagattg gaaacagaat 1260 aaagatggca tttggtataa agctgaacat gcttcgttca cagtgacagc accagaggga 1320 attatcacaa gatacaaagg tccttggact ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa 1380 ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg 1440 gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg ccggtacgca catgggacgc taaaactggt 1500 aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa gtcgacctgc agccaagctt aattagctga 1560 <210> 63 <211> 1944 <212> DNA <213> artificial <220> <223> His-tagged GFP_CBD2638_CBD2638_CBD2638 <400> 63 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga gtaaaggaga agaacttttc 60 actggagttg tcccaattct tgttgaatta gatggtgatg ttaatgggca caaattttct 120 gtcagtggag agggtgaagg tgatgcaaca tacggaaaac ttacccttaa atttatttgc 180 actactggaa aactacctgt tccatggcca acacttgtca ctactttcgc gtatggtctt 240 caatgctttg cgagataccc agatcatatg aaacagcatg actttttcaa gagtgccatg 300 cccgaaggtt atgtacagga aagaactata tttttcaaag atgacgggaa ctacaagaca 360 cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt 420 gattttaaag aagatggaaa cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac 480 aatgtataca tcatggcaga caaacaaaag aatggaatca aagttaactt caaaattaga 540 cacaacattg aagatggaag cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt 600 ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt ccacacaatc tgccctttcg 660 aaagatccca acgaaaagag agaccacatg gtccttcttg agtttgtaac agctgctggg 720 attacacatg gcatggatga actatacaaa gagctcggtg gaaagctaga agtaagcaaa 780 gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa 840 attgtgaaag caacagattg gaaacagaat aaagatggca tttggtataa agctgaacat 900 gcttcgttca cagtgacagc accagaggga attatcacaa gatacaaagg tccttggact 960 ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa 1020 aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg 1080 ccggtacgca catgggacgc taaaactggt aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa 1140 ggtaccggtg gaaagctaga agtaagcaaa gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag 1200 caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa attgtgaaag caacagattg gaaacagaat 1260 aaagatggca tttggtataa agctgaacat gcttcgttca cagtgacagc accagaggga 1320 attatcacaa gatacaaagg tccttggact ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa 1380 ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg 1440 gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg ccggtacgca catgggacgc taaaactggt 1500 aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa gtcgacggtg gaaagctaga agtaagcaaa 1560 gcagcaacta tcaaacaatc tgacgttaag caagaagtta aaaagcaaga agcaaaacaa 1620 attgtgaaag caacagattg gaaacagaat aaagatggca tttggtataa agctgaacat 1680 gcttcgttca cagtgacagc accagaggga attatcacaa gatacaaagg tccttggact 1740 ggtcacccac aagctggtgt attacaaaaa ggtcaaacga ttaaatatga tgaggttcaa 1800 aaatttgacg gtcatgtttg ggtatcgtgg gaaacgtttg agggcgaaac tgtatacatg 1860 ccggtacgca catgggacgc taaaactggt aaagttggta agttgtgggg cgaaattaaa 1920 ctgcagccaa gcttaattag ctga 1944 <210> 64 <211> 380 <212> PRT <213> artificial <220> <223> His-tagged GFP_CBD2638 <400> 64 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Ser Lys Gly 1 5 10 15 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 20 25 30 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 35 40 45 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 50 55 60 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe 85 90 95 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 100 105 110 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 115 120 125 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 130 135 140 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu 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Val Thr Ala Pro Glu Gly Ile Ile Thr Arg Tyr Lys 565 570 575 Gly Pro Trp Thr Gly His Pro Gln Ala Gly Val Leu Gln Lys Gly Gln 580 585 590 Thr Ile Lys Tyr Asp Glu Val Gln Lys Phe Asp Gly His Val Trp Val 595 600 605 Ser Trp Glu Thr Phe Glu Gly Glu Thr Val Tyr Met Pro Val Arg Thr 610 615 620 Trp Asp Ala Lys Thr Gly Lys Val Gly Lys Leu Trp Gly Glu Ile Lys 625 630 635 640 Leu Gln Pro Ser Leu Ile Ser 645

Claims

SEQ ID NO: 12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 있어서,
상기 제1 뉴클레오티드 서열은, 포도상구균 속의 펩티도글리칸 세포벽에 부착하는 세포벽-부착 도메인을 암호화하는 것인, 핵산 분자.
제1항 및/또는 제2항에 있어서,
상기 제1 뉴클레오티드 서열은 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신으로부터 유래한 것인, 핵산 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1와 적어도 80% 서열 동일성을 갖거나, 또는 상기 핵산 분자는 용해 도메인을 암호화하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인, 핵산 분자.
제1항 내지 제3항에 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 용해 도메인을 암호화하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, 상기 용해 도메인은 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열이고, 및 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 M23 엔도펩티다제 도메인을 암호화하며, 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 아미다제 도메인을 암호화하는 것인, 핵산 분자.
제5항에 있어서,
상기 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열은, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф11 엔돌리신, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф트워트 엔돌리신 및 포도알구균 리소스타핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 암호화 하는 유전자로부터 유래하는 것인, 핵산 분자.
제6항에 있어서,
상기 제2 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID:14 또는 15와 적어도 80% 서열 동일성을 가지고, 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID:16 또는 17과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것인, 핵산 분자.
제7항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 분자는 SEQ ID NO: 9 와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것인, 핵산 분자.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
CHAP(시스테인, 히스티딘-의존 아미도하이드로라제/펩티다제) 도메인을 암호화하는 제4 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인, 핵산 분자.
제9항에 있어서,
상기 제4 뉴클레오티드 서열은, 황색포도상구균 박테리오파지 Ф11 엔돌리신 또는 황색포도상구균 박테리오파지 Ф트워트 엔돌리신으로부터 유래한 것인, 핵산 분자.
제10항에 있어서,
상기 제4 뉴클레오티드 서열은, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19 와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것인, 핵산 분자.
제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 1에 의해 암호화된 황색포도상구균 박테리오파지 Ф2638a 엔돌리신과 비교하여, 동일하거나 감소된 pH 최적조건 및/또는 동일하거나 증가된 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 핵산 분자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 확인된 바와 같은 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 확인된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물.
세포, 개체 또는 세포-프리 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩티드의 발현 또는 생산을 지휘하는, 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 작용 가능하도록 연결된 제14항에서 정의된 바와 같은 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터.
제14항에서 확인된 바와 같은 핵산 구조물 또는 제15항에서 확인된 바와 같은 발현 벡터를 포함하고, 미생물의, 단핵의 또는 진핵의 세포인, 세포.
제13항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 생산하고, 임의적으로 정제하고 및 임의적으로 냉동-건조하는 방법으로서,
i) 제14항에 정의된 바와 같은 핵산 구조물을 포함하는 제16항에 확인된 바와 같은 세포 내 상기 폴리펩티드를 생산하는 단계; 임의적으로,
ii) 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계; 및 임의적으로,
iii) 상기 정제된 폴리펩티드를 냉동-건조하는 단계;를 포함하는 방법.
제13항에 확인된 바와 같은 폴리펩티드 및/또는 제17항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 폴리펩티드를 처리하는 것에 의하여 강화된 용해 활성도를 갖는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
i) 킬레이팅 화합물을 포함하는 버퍼에 대하여 상기 폴리펩티드를 투석하는 단계;
ii) 2가의 금속 이온-함유 버퍼에 대하여, 바람직하게는 상기 2가의 금속이온은 Co²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺ 및 Zn²⁺로 구성된 군에서 선택되고, 상기 폴리펩티드를 투석하는 단계;를 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 확인된 바와 같은 핵산 분자, 제13항에서 확인된 바와 같은, 및/또는 제17항 및/또는 제18항에서 확인된 바와 같은 방법에 의하여 얻어질 수 있는 바와 같은 폴리펩티드, 및/또는 제14항에서 확인된 바와 같은 핵산 구조물 및/또는 제15항에서 확인된 바와 같은 벡터 및/또는 제16항에서 확인된 바와 같은 세포를 포함하는 조성물.
제19항에 있어서,
바람직하게는 박테리오파지 및 항생물질로 구성된 군으로부터 선택되는, 하나 또는 그 이상의 추가적인 활성 성분을 포함하는, 조성물.
제19항 및/또는 제20항에 있어서,
약물로서 사용되는, 조성물.
제21항에 있어서,
감염성 질병의 치료에서 약물로서 사용되는, 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제13항에 따른 및/또는 제17항 및/또는 제18항에서 확인된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 폴리펩티드, 제14항에 따른 핵산 구조물, 제15항에서 확인된 바와 같은 벡터, 제16항에서 확인된 바와 같은 세포 및/또는 제19항 및/또는 제20항에 따른 조성물의, 항균성, 바람직하게는 식품 첨가물 또는 소독약으로서의, 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 상기 핵산 분자, 핵산 구조물 및/또는 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드, 및/또는 상기 핵산 구조물을 포함하는 세포 또는 상기 폴리펩티드, 핵산 분자, 핵산, 벡터 및/또는 세포 중 어느 것을 포함하는 조성물의, 포도상구균을 검출하기 위한, 바람직하게는 진단용인, 용도.
제19항 및/또는 제20항에서 정의된 바와 같은 조성물을 투여하여 감염성 질병을 치료하고, 지연시키고 및/또는 예방하는 방법.