JP2014519815A - ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ポリペプチド、対応する核酸分子、このような核酸分子を含む構築物及び/若しくはベクター及び/若しくは細胞、並びに/又は前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、及び/若しくは細胞を含む組成物に関する。本発明はさらに、医学的用途のための、好ましくは感染性疾患を治療するのに使用するための、このような組成物に関する。さらに本発明は、抗菌剤として、好ましくは食品添加剤又は消毒剤として、又は細菌を検出するため、好ましくは診断用途における、前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、細胞、及び/又は組成物の使用に関する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ポリペプチド、対応する核酸分子、このような核酸分子を含む構築物及び/若しくはベクター及び/若しくは細胞、並びに/又は前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、及び/若しくは細胞を含む組成物に関する。本発明はさらに、医学的使用のための、好ましくは感染性疾患を治療するのに使用するための、このようなポリペプチド、対応する核酸分子、このような核酸分子を含む構築物及び/若しくはベクター及び/若しくは細胞、並びに/又は組成物に関する。さらに本発明は、抗菌剤として、好ましくは食品添加剤又は消毒剤として、或いは細菌を検出するため、好ましくは診断用途においての、前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、細胞、及び/又は組成物の使用に関する。
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)は、数種の重篤な感染性疾患及び食中毒にたびたび関与する主要なヒト病原体である。その治療は、抗生物質耐性株の出現のためにますます難しくなる。スタフィロコッカス・アウレウスに感染するファージ由来のエンドリシンは、これらの病原体を制御する可能性があることが示されており、これらの病原体の特異的検出に使用することができる。ほとんどの場合、エンドリシンのスタフィロコッカス種を標的とする用途における主な障害は、低い酵素活性、難しい大量生産、及び/又はタンパク質の安定性である。
例えば抗菌活性及び/又は安定性に関して改善された特徴を有する新しい抗菌剤が常に求められている。
ここで、新規に特徴付けられたPly2638、すなわちS.アウレウス(S.aureus)バクテリオファージΦ2638aのエンドリシンを報告する。E.コリ(E.Coli)で酵素及び数種の改変誘導体を可溶化により発現させたところ、再構成後のそれらの溶解活性により証明されたように、凍結乾燥後に驚くべき安定性を示した。スタフィロコッカス(Staphylococcus)属の細胞壁に結合する細胞壁結合ドメインに加えて、我々は、2種の機能性ドメイン、すなわちM23エンドペプチダーゼドメイン及びアミダーゼドメインが、最適な溶解活性にとって重要であることを示した。
我々は、触媒ドメイン、並びに/又はS.アウレウスΦ11エンドリシン、ΦTwortエンドリシン、及びリソスタフィン由来の細胞壁結合ドメインの重複によって酵素を改良することにより、強化された溶解活性、及び/又は変化した最適pH、及び/又は凍結乾燥及び再溶解後の増加した安定性を示す異種ポリペプチド融合産物がもたらされることを示した。
S.アウレウスSA2638/2854細胞に対するPly2638(配列番号44によってコードされた配列番号21)活性のエンドリシン濃度依存性の直線関係を示すグラフである。分析は、標準条件(pH7.4のPBS緩衝液、120mMの塩化ナトリウム)下で、光度測定による溶解分析で行われた。最大活性は、SigmaPlotソフトウェアを用いて計算されたS字状の溶解曲線からの回帰フィッティングの一次導関数から決定された。エラーバーは、技術的な3連の実験から計算された標準偏差を示す。 Ply2638(配列番号44によってコードされた配列番号21)の溶解活性に対する二価カチオンの影響を示すグラフである。酵素をEDTA処理し、続いて、MgCl、CaCl、ZnCl、CuCl、CoCl又はMnSOを含有するMOPS緩衝液で透析することによって金属イオンを置換した。参照として、EDTA処理を省略してMOPS緩衝液で透析したPly2638を利用した。エラーバーは、技術的な3連の実験から計算された標準偏差を示す。 S.アウレウスSA2638/2854細胞に対する、50nMのPly2638(配列番号44によってコードされた配列番号21)の凍結乾燥及び再溶解後の溶解活性を示すグラフである。活性は、標準条件下で、濁度減少分析で測定された。対照として、凍結乾燥緩衝液を用いた。3つのドメインを有する酵素は、凍結乾燥後に完全な溶解活性を取り戻す。 S.アウレウスSA2638/2854細胞に対する、50nMのM23−LST_Ami2638_CBD2638(配列番号48によってコードされた配列番号29)の凍結乾燥及び再溶解後の溶解活性(凍結乾燥した、と示される)を、新たに調製されたM23−LST_Ami2638_CBD2638(配列番号48によってコードされた配列番号29)、及びPly2638(配列番号44によってコードされた配列番号21)と比較して示したグラフである。対照として、凍結乾燥緩衝液を用いた。活性は、標準条件下で濁度減少分析で測定された。3つのドメインを有する酵素は、凍結乾燥後に完全な溶解活性を取り戻す。 リソスタフィン(LST;配列番号33によってコードされた配列番号34)、及びPly2638誘導体(それぞれ配列番号11、10、48、44、及び4によってコードされた配列番号31、30、29、21、及び24)の濃度依存性の相対活性を示すグラフである。50nMにおけるLSTの活性を参照に設定した。全ての分析は、凍結ストックからのS.アウレウスSA2638/2854基質細胞を用いて、標準条件下(37℃、pH7.4、及び120mMの塩化ナトリウム濃度)で行われた。 濁度減少分析で決定された、切除された、及び(PlyTwドメインで)改良されたPly2638変異体の、様々なpH値(左のグラフ)及び塩化ナトリウム濃度(右のグラフ)における相対活性を示すグラフである。酵素の2つの触媒ドメインのうち一方を切除することにより、活性が低下した。CBD(M23_Ami_SH3b_SH3b;配列番号49によってコードされた配列番号32)の重複により、塩基性pH値及び高い塩濃度における溶解が促進される。CHAP11ドメインでのPly2638の改良により、スタフィロコッカスのペプチドグリカン層における3つの異なる結合を攻撃すると推測される酵素が生じる。それにより、最適pHがわずかに酸性の状態に変化し、抗菌活性が改善された。しかしながら、キメラ酵素のタンパク質の安定性は未だ難題である。標準条件(pH7.4、及び120mMの塩化ナトリウム濃度)におけるPly2638の最大の溶解速度を参照に設定した。バーは、3連の分析の平均を示しており、標準偏差は示していない。(CHAP_M23_Ami_SH3b=配列番号45によってコードされた配列番号25;Ami_M23_Ami_SH3b=配列番号46によってコードされた配列番号26;M23_Ami_SH3b_SH3b=配列番号49によってコードされた配列番号32;M23_Ami_SH3b=配列番号44によってコードされた配列番号21;Ami_SH3b=配列番号2によってコードされた配列番号22;M23_SH3b=配列番号3によってコードされた配列番号23)。 標準条件下で、S.アウレウスSA2638/2854基質細胞を用いた、50nMの4つのドメインを有する酵素(それぞれ配列番号47及び8によってコードされた配列番号27及び28)、Ply2638(配列番号44によってコードされた配列番号21)、及びリソスタフィン(配列番号33によってコードされた配列番号34)の活性を示すグラフである。対照として、凍結乾燥緩衝液を用いた。4つのドメインを有する酵素を、Ply2638、PlyTw、及びリソスタフィンのドメインを組み合わせることによって構築した。
核酸分子
第1の態様において、第1のヌクレオチド配列を含む、又は第1のヌクレオチド配列からなる核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号12(本明細書で用いられる全ての配列番号の大要については、表1を参照されたい)と80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する、核酸分子を提供する。好ましくは、前記第1のヌクレオチド配列は、少なくとも282、285、290、300、310、320、330、340、350、360又は370個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも381個のヌクレオチドの長さ、及び/又は最大で510、480、450、420又は390個のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記核酸分子は、少なくとも282、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも381個のヌクレオチドの長さ、及び/又は最大で4500、4200、3900、及び/又は3600個のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記核酸分子は、少なくとも1200、1230、1260、1290、1320、1350、1380、1410、1440、1470、1500、1530又は1560個のヌクレオチドの長さ、及び/又は最大で4500、4200、3900、及び/又は3600個のヌクレオチドの長さを有する。また、少なくとも1890、1920、1950、1980、2010、2040、2070、2100、2130又は2160個のヌクレオチドの長さ、及び/又は最大で4500、4200、3900、及び/又は3600個のヌクレオチドの長さを有する本発明に係る核酸分子も好ましい。前記第1のヌクレオチド配列は、スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁と結合する細胞壁結合ドメインをコードするのが好ましい。前記第1のヌクレオチド配列は、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンに由来するのが好ましい。
ALE−1のC末端の92残基の結晶構造とのアライメントから推測したところ(Luら、J.Biol.Chem.、2006、281(1):549〜58)、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンに由来する細胞壁結合ドメインからの最小で94個のアミノ酸が、酵素をスタフィロコッカス属の細胞壁に向かわせるのに十分であり得ると推測された。
スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁へのドメインの結合は、当業者周知の分析を用いて評価することが可能である。好ましい実施形態では、スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁へのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の特異的な結合を評価するために、標識された構築物が得られる免疫組織化学的技術及び/又は遺伝子融合技術が用いられる。上述した免疫組織化学的又は融合技術で用いられるシグナルの定量化方法は当技術分野において周知である。
一実施形態では、スタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合は、第1のヌクレオチド配列によってコードされたドメインを含むポリペプチドを含む蛍光性融合構築物を用いて定量することができる。このような細胞壁結合分析は、Loessnerら(Molecular Microbiology 2002、44(2):335〜349)及び実施例1で詳細に説明されている。この分析では、前記蛍光性融合構築物、又は陰性対照、好ましくは緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む溶液を、指定された期間、スタフィロコッカス細胞、好ましくはS.アウレウス細胞、より好ましくはS.アウレウスBB255の影響下に置き、その後、これらの細胞を、遠心分離によって結合した蛍光性融合構築物と共に沈殿させる。陰性対照、好ましくはGPFに晒されたスタフィロコッカス細胞の蛍光シグナルを差し引いた、蛍光性融合構築物に晒されたスタフィロコッカス細胞の蛍光シグナルが、この開示において意味する細胞結合の基準である。
好ましくは、本発明に関して、この分析を用いて、沈殿した細胞の蛍光シグナルの増加が、本明細書で定義される陰性対照よりも増加したことが検出される場合、核酸分子が、スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁と結合するポリペプチドドメインをコードするという。このような結合は、好ましくは、特異的であるという。好ましくは、本発明は、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシン(Ply2638)のペプチドグリカン細胞壁への結合の少なくとも50、60、70、80、90若しくは100、150又は200%の本明細書で定義される結合を示すポリペプチド又はドメインをコードする核酸分子に関する。
実施形態では、本発明は、S.アウレウスバクテリオファージФ2638エンドリシンをコードする配列番号1と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する核酸分子に関する。
本発明はさらに、前記第1のヌクレオチド配列に加えて、溶解ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、前記溶解ドメインは、本明細書で後に定義されるペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を示す。異種ヌクレオチド配列を含む前記核酸分子は、本明細書において「改良された構築物」として定義される。
用語「異種配列」又は「異種核酸」は、本明細書で用いられる場合、前記第1のヌクレオチド配列の近接する配列として作動可能に連結した、天然では見出されないものである。本明細書で用いられる用語「異種」は、「組換え」を意味する場合がある。「組換え」は、一般的に自然に見出されるものとは異なる遺伝学的な存在物を指す。「組換え」は、ヌクレオチド配列又は核酸分子に適用される場合、前記ヌクレオチド配列又は核酸分子が、自然に見出される配列又は分子とは異なる構築物が産生されるクローニング、制限、及び/又はライゲーションステップ、並びにその他の手順の様々な組み合わせによる産物であることを意味する。
「ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性」は、本明細書では「溶解活性」とも定義され、技術者によく知られている方法によって評価することができる。実施形態では、溶解活性は、分光光度法で、基質細胞懸濁液の濁度の低下を測定することによって評価することができる。溶解活性は、分光光度法で、S.アウレウス懸濁液の濁度の低下を測定して評価することが好ましく、濁度は分光光度法(Libra S22、Biochrom)でOD595を測定することにより定量される。より好ましくは、本明細書で特定される核酸分子によってコードされた200nMのポリペプチドは、分光光度法で評価した場合に(Libra S22、Biochrom)、最初のOD600値が1±0.05のS.アウレウス懸濁液と共に、pH7.4のPBS緩衝液、120mMの塩化ナトリウム中で、30分間、37℃でインキュベートされる。濁度の低下は、30分インキュベートした後のOD595値を、30分インキュベートする前のOD595値から引くことにより計算される。本発明に関して、この分析を用いて、少なくとも10、20、30、40、50又は60%の濁度の低下が検出される場合、核酸分子は、溶解ドメインをコードする核酸配列を含むという。少なくとも70%の低下が検出されるのが好ましい。好ましくは、本発明は、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシン(Ply2638)の溶解活性の少なくとも50、60、70、80、90、100、150又は200%以上の溶解活性を示すポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号1を含んでいなくてもよいか、又は配列番号1からなっていなくてもよい。配列番号1は、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638エンドリシンをコードする。
好ましい実施形態は、本明細書で特定される前記第1のヌクレオチド配列を含み、溶解ドメインとして第2及び第3のヌクレオチド配列をさらに含む核酸分子を包含し、前記第2の配列が、エンドペプチダーゼドメインをコードし、第3のヌクレオチド配列が、アミダーゼドメインをコードする。したがって、本発明は、前記第1のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号1と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するか、或いは前記核酸分子が、溶解ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、核酸分子に関する。
本明細書で用いられるエンドペプチダーゼドメインは、好ましくは、スタフィロコッカス属の細胞壁に、好ましくはS.アウレウス、S.シミュランス(S.simulans)、及びS.カルノーサス(S.carnosus)の細胞壁に見出されるペンタグリシン架橋を切断する(Trayer,H.R.及びBuckley,C.E.(1970)「Molecular properties of lysostaphin,a bacteriolytic agent specific for Staphylococcus aureus」、J.Biol.Chem.245、4842〜4846)。本明細書で用いられるアミダーゼドメインは、好ましくは、γ−グルタミルを含有する基質を加水分解する。ポリペプチドにおけるこれらのドメインの官能性及び活性は、これらのドメインのいずれかを含有する前記ポリペプチドを、精製したペプチドグリカンとインキュベートした際の切断産物を特徴付けることによって確認することができる。第2又は第3のドメインをコードするヌクレオチド配列それぞれが、細菌又はバクテリオファージ由来であるのが好ましい。好ましい実施形態では、前記第2及び第3のヌクレオチド配列は、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシン、S.アウレウスバクテリオファージΦ11エンドリシン、S.アウレウスバクテリオファージΦTwortエンドリシン、及びS.シミュランスのリソスタフィンからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子に由来する。前記第2のヌクレオチド配列は、配列番号14又は15と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有し、前記第3のヌクレオチド配列は、配列番号17又は18と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有することが好ましい。
本発明は、構築物内の考えられるあらゆる位置に本発明において意味する機能性ドメインを含有する、本明細書で定義される全ての構築物を包含する。好ましい実施形態では、本明細書で定義される核酸分子は、本明細書で特定される第1の核酸配列によってコードされたC末端ドメインを有するポリペプチドをコードし、この第1の核酸配列は、本明細書において、スタフィロコッカス属を標的とすることができる機能的なポリペプチドをコードすることが示されている。配列番号9と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する核酸分子を含む本明細書で定義される核酸分子が、さらにより好ましい。配列番号9は、C末端のSH3b相同細胞壁結合ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(両方のドメインとも、配列番号1によってコードされたPly2638由来である:Leu138〜Lys486)と、N末端のM23グリシル−グリシンエンドペプチダーゼ相同ドメインを含むポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列(配列番号33によってコードされた成熟リソスタフィン:Ala1〜Gly154)と、中央のアミダーゼ−2相同ドメインをコードする第3のヌクレオチド配列とを含む。その理論上のサイズは、58.266kDaである。配列番号9によってコードされたポリペプチドは、N末端のM23エンドペプチダーゼドメインが、S.シミュランスのリソスタフィン由来のM23エンドペプチダーゼドメインで置換されているという点でS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンとは異なる。ここで我々は、配列番号9によってコードされたポリペプチドは、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンと比較して少なくとも20%増加した溶解活性を示し、同時に、凍結乾燥及び再溶解後に溶解活性が維持されることを示した。好ましい実施形態では、前記第1、第2、及び第3のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して少なくとも0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9又は2倍の溶解活性を示すポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、前記第1、第2、及び第3のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本明細書で定義された凍結乾燥及び再溶解後に、新たに調製されたポリペプチドと比較して最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10%の溶解活性の減少を示すポリペプチドをコードし、「新たに調製された」とは、本明細書では、好ましくは、−20℃で、1.63mg/mLの凍結乾燥緩衝液(50mMのトリス、500mMのスクロース、200mMのマンニトール、0.05%ポリソルベート20、及び50%グリセロール)中で最大で2日貯蔵され、本明細書で特定される分析で溶解活性を評価する直前に融解させることと定義される。
凍結乾燥及び再溶解は、本明細書では、凍結乾燥による脱水、及びそれに続く水の添加によるサンプルの再溶解と定義される。実施形態では、凍結乾燥及び再溶解は、300mlの凍結乾燥緩衝液(50mMのリン酸塩又はトリス、500mMのスクロース、200mMのマンニトール、pH7.4)のアリコートを3回交換して透析し、液体窒素の気相中で凍結させることによって行うことができる。凍結乾燥は、標準条件下で、好ましくは−40℃及び真空75mTorrで60分間、続いて同じ真空レベルで5時間にわたり−10℃に温度を高め、さらに60分、−10℃にすることによって行うことができる。最終ステップとして、好ましくは10時間で温度を25℃に高める。サンプルは、水の添加により再溶解される。
別の好ましい実施形態では、本明細書で定義される核酸分子は、上記で特定された第1、第2、及び第3のヌクレオチド配列に加えて、少なくとも1つの重複した同一又は異種の第1、第2、及び/又は第3のヌクレオチド配列を含む。本明細書で定義される核酸分子は、前記第1、第2、及び第3のヌクレオチド配列に加えて、重複した同一の第1のヌクレオチド配列を含むのが好ましい。我々はここで、細胞壁結合ドメインをコードする本明細書で定義される第1のヌクレオチド配列の重複により、好ましくは配列番号20によってコードされたポリペプチドが得られ、このポリペプチドは、このような重複した第1ドメインが欠失した核酸分子によってコードされた参照ポリペプチドの溶解活性と比較して、或いは本明細書で特定される分析で(より具体的には等モル量のポリペプチド、及び200、300、400、又は1000nMのNaClを含有する改変PBS緩衝液を用いて)評価した配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、少なくとも5、10、20、30、20又は40%増加した溶解活性を顕示することを示した。この実施形態はまた、前記第1、第2、及び第3のヌクレオチド配列が、同じ源、すなわちS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aに由来する異種核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号1と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する配列と、追加の重複した同一若しくは異種の第1、第2、及び/又は第3のヌクレオチド配列とを含む、異種核酸分子も包含する。また、配列番号6及び20と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む本明細書で定義される核酸分子も好ましい。
別の好ましい実施形態では、本明細書で定義される核酸分子は、CHAP(システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ/ペプチダーゼ)ドメインをコードする第4のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、前記第4のヌクレオチド配列は、S.アウレウスバクテリオファージΦ11又はS.アウレウスバクテリオファージΦTwortエンドリシンに由来する。さらにより好ましくは、前記第4のヌクレオチド配列は、配列番号18又は配列番号19と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する。本明細書で定義される核酸分子は、配列番号5又は7と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むのが好ましい。我々はここで、配列番号5で定義される前記第1、第2、第3、及び第4のヌクレオチド配列を含む分子は、前記第4のドメインが欠失した構築物によってコードされたポリペプチドと比較して、及び/又は配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンと比較して、増加した溶解活性、及び/又は変化した、好ましくは減少した最適pHを示すポリペプチドをコードすることを示した。溶解活性は、分光光度法により、本明細書の上記で定義された条件下で評価された。前記ポリペプチドは、前記第4のドメインだけが欠失した前記ポリペプチドとは異なる参照ポリペプチドによってコードされたポリペプチドの溶解活性と比較して、或いは配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、少なくとも0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9又は2倍の溶解活性の増加を示すことが好ましい。さらにより好ましくは、前記ポリペプチドは、定義された参照ポリペプチド又は配列番号1によってコードされたポリペプチドと比較して、少なくとも2.5倍の溶解活性の増加を示す。
変化した又は減少した最適pHは、本明細書では、イオン強度を一定に維持した場合、最適な溶解活性においてより低いpH値に変化又は減少することと定義される。溶解活性は、好ましくは、本明細書で定義される分光光度法で評価される。溶解活性の最適pHは、前記第4のドメインだけが欠失した前記ポリペプチドとは異なる参照ポリペプチドによってコードされたポリペプチドの溶解活性と比較して、或いは配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、0.5〜1pH単位減少することが好ましい。
本発明は、好ましくは、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、同じ溶解活性及び/又は同じ最適pHを有するか、或いは増加した溶解活性及び/又は減少した最適pHを有するポリペプチドをコードする、本明細書で特定される第1、第2、第3及び任意選択で第4のヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。同じとは、本明細書では、本明細書で特定される分析、又は技術者がよく知っている方法を用いる場合に検出可能な差がないと特定される。本発明はまた、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、同じ溶解活性及び/又は同じ最適pHを有するか、或いは増加した溶解活性及び/又は減少した最適pHを有するポリペプチドをコードする、本明細書で特定される第1、第2、及び第4のヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。本発明はまた、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンの溶解活性と比較して、同じ溶解活性及び/又は同じ最適pHを有するか、或いは増加した溶解活性及び/又は減少した最適pHを有するポリペプチドをコードする、本明細書で特定される第1、第3、及び第4のヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。本明細書で特定されたそれぞれのヌクレオチド配列、すなわち本明細書で定義されたポリペプチドの個々のドメインをコードする第1、第2、第3、第4のヌクレオチド配列は、当業者周知であり、文献(Sambrook、Maniatisら(1989)で広く説明されており、その開示の実験の部で例示されている、核酸断片の構築及び組み立てに関して知られているあらゆる一般的な方法によって組み立てることができる。好ましい実施形態では、第1、第2、第3、及び/又は第4のヌクレオチド配列は、一体的に作動可能に連結している。
したがって、本発明の核酸分子は、本明細書で定義される第1のヌクレオチド配列によってコードされた細胞壁結合ドメインを介してスタフィロコッカス属に結合することができ、及び/又は本明細書で定義される第2、第3、及び第4のヌクレオチド配列それぞれによってコードされた、エンドペプチダーゼ及び/又はアミダーゼドメイン、並びに任意選択でCHAPドメインを介して前記細菌を溶解させることができるポリペプチド、好ましくは本明細書で特定されるポリペプチドをコードする。
好ましい実施形態では、本明細書で定義される本発明の核酸分子は、任意選択で、精製を簡易化するためのタグをコードする配列を含んでいる。前記タグは、これらに限定されないが、FLAGタグ、ポリ(His)タグ、HAタグ、及びMycタグからなる群より選択されるのが好ましい。より好ましくは前記タグは、6xHisタグである。さらにより好ましくは、前記タグは、配列番号43と同一なN末端の6xHisタグである。
ポリペプチド
さらなる態様において、本明細書の上記で特定された核酸分子によってコードされたポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、前の章で定義された、細胞壁結合ドメイン、好ましくはエンドペプチダーゼドメイン、及び/又はアミダーゼドメインを含む。
本発明に包含されるポリペプチドドメインは、好ましくは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、及び/又は42と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する。本発明に包含されるポリペプチドドメインは、好ましくは、1つ又は複数の推定リンカーを含み、配列番号51、52、53、54、55、56、57、及び/又は58と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有することが好ましい。
本発明に包含されるポリペプチドは、好ましくは、配列番号21、25、26、27、29、及び/又は32と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する。より好ましくは、本発明に包含されるポリペプチドは、好ましくは、配列番号25、26、27、29、及び/又は32と、配列番号25、26、27、29、及び/又は32と、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する。
本発明の実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、配列番号1、5、6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18、及び/又は19それぞれと少なくとも80%の同一性を有する核酸構築物によってコードされた配列番号21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、及び/又は42と少なくとも80%の配列同一性を有する。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号5、6、7、9、20、12、13、14、15、16、17、18、及び/又は19それぞれと少なくとも80%の同一性を有する核酸構築物によってコードされた配列番号25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、及び/又は42と少なくとも80%の配列同一性を有する。
本発明に係るポリペプチドは、少なくとも94、95、96、100、110又は120個のアミノ酸、好ましくは127個のアミノ酸、及び/又は最大で1500、1400、1300又は1200個のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記ポリペプチドは、少なくとも400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510又は520個のアミノ酸、及び/又は最大で1500、1400、1300又は1200個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。また、少なくとも630、640、650、660、670、680、690、700、710又は720個のアミノ酸、及び/又は最大で1500、1400、1300又は1200個のアミノ酸の長さを有する本発明に係るポリペプチドも好ましい。
本発明に包含されるアミノ酸又はヌクレオチド配列は、それぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20個又はそれより多くのヌクレオチド又はアミノ酸を置換すること、挿入すること、欠失させること、又は付加することにより、本明細書で特定される配列の1種から誘導されてもよい。本発明に包含されるアミノ酸配列は、安定性、溶解性、及び活性を高めるために追加のN若しくはC末端アミノ酸又は化学部分を付加することによって、本明細書で特定される配列の1種から誘導されてもよい。
本発明の実施形態は、変異ポリペプチドを包含する。変異ポリペプチドは、ポリペプチドの自然に存在しない形態であり得る。ポリペプチド変異体は、何らかの加工により、その天然源から単離したポリペプチドとは異なっていてもよい。変異体は、部位特異的変異誘発によって、配列番号1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19、及び/又は20のヌクレオチド配列から開始して作製されてもよい。ポリペプチド変異体は、コードされたポリペプチドの生物学的機能を変更しない突然変異を含有するのが好ましい。好ましい実施形態によれば、ポリペプチド変異体は、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンのスタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性と比較して、同じ又は強化されたスタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を示す。本発明のポリペプチド変異体は、好ましくは、配列番号21、25、26、27、29、32、35、36、37、38、39、40、41、及び/又は42の変異体である。同じ又は強化されたスタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を有するポリペプチド変異体は、本明細書の上記で特定された分析で測定したところ、配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンのスタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性と比較して、同じ又は増加したスタフィロコッカス・アウレウスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を示すポリペプチドである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19、及び/又は20のヌクレオチド配列の変異体である。ヌクレオチド配列の変異体は、上記で定義されたポリペプチド変異体の調製に用いることができる。核酸変異体は、上記で定義されたヌクレオチド配列のいずれかの断片であってもよい。核酸変異体はまた、配列番号1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19、及び/又は20とは、遺伝子コードの縮重に基づき異なるヌクレオチド配列であってもよい。核酸変異体はまた、配列番号1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19、及び/又は20の対立遺伝子変異体であってもよい。対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の2つ以上の代替形態のいずれかを意味する。好ましい核酸変異体は、サイレント突然変異(複数可)を含有するヌクレオチド配列である。その代わりに、又はそれと組み合わせて、核酸変異体はまた、そのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、本発明のポリペプチドを生産するための宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換を導入することにより得てもよい。好ましい実施形態によれば、核酸変異体は、変異後もその生物学的機能を示すポリペプチドをコードする。より好ましくは、ヌクレオチド配列の変異体は、スタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を示すポリペプチドをコードする。さらにより好ましくは、核酸変異体は、上記で定義された強化されたスタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を有するポリペプチドをコードする。スタフィロコッカスのペプチドグリカン細胞壁への結合及び/又は溶解活性を示すポリペプチドをコードする核酸は、あらゆる微生物から単離することができる。
全てのこれらの変異体は、当業者公知の技術、例えば、配列番号1、5、6、7、9、12、13、14、15、16、17、18、19、及び/若しくは20のヌクレオチド配列又はそれらの変異体について低から中から高ハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによるライブラリーのスクリーニング(サザンブロッティング法)を用いて、得ることができ、これらはプローブの設計に用いることができる。低から中から高ストリンジェンシー条件とは、42℃で、5×SSPE、0.3%SDS、200pg/mlの剪断して変性させたサケ***DNA、及び低から中から高ストリンジェンシーそれぞれに応じて25%、35%又は50%ホルムアミドのいずれかにおける、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。その後、ハイブリダイゼーション反応物を、2×SSC、0.2%SDS、及び低から中から高ストリンジェンシーに対して55℃、65℃又は75℃のいずれかを用いて、3回、それぞれ30分間、洗浄する。
本明細書で示される配列情報は、誤って同定された塩基が包含されることが不可避であると狭く解釈されないこととする。当業者であれば、このような誤って同定された塩基を同定することができ、このような誤りを修正する方法を知っている。
核酸構築物
さらなる態様において、前の章で特定された核酸分子を含む核酸構築物が提供される。この核酸構築物は、細胞壁結合ドメインを含む、場合によっては前の章で定義された第2及び第3及び任意選択で第4の核酸配列をさらに含むポリペプチドをコードする第1の核酸配列を含んでもよい。
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含む発現ベクターにも関する。発現ベクターは、細胞、対象又は無細胞発現系においてコードされたポリペプチドの産生又は発現を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結している本発明のヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
発現ベクターは、組換え発現ベクターと解釈されてもよい。このベクターは、本発明に係る核酸分子を導入することにより形質転換されるプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスで構成することができる。形質転換しようとする宿主生物に応じたこのような形質転換ベクターは、当業者周知であり、文献でも広く説明されている。
本発明のさらなる主題は、少なくとも1つの本発明の核酸分子を統合することにより宿主生物を形質転換する方法であり、上記形質転換は、専門家の文献で、特に本願で引用された参考文献で広く説明されているあらゆる適切な公知手段によって、より具体的には本発明に係るベクターによって行ってもよい。
細胞
さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義される本発明の核酸構築物又は発現ベクターを含む細胞に関する。細胞は、本発明のポリペプチドの発現に適したあらゆる微生物細胞、原核細胞又は真核細胞であってもよい。好ましい実施形態では、前記細胞は、E.コリである。さらにより好ましい実施形態では、前記細胞は、E.コリCL1blueMRFである。
方法
さらなる態様において、前の章で定義されたポリペプチドを生産し、任意選択で精製し、及び任意選択で凍結乾燥する方法が提供される。前記方法は、
i)前の章で定義された核酸構築物を含む細胞中で、前記ポリペプチドを生産するステップ、任意選択で
ii)前記ポリペプチドを精製するステップ、及び任意選択で
iii)前記精製したポリペプチドを凍結乾燥するステップ
を含む。
好ましい実施形態では、ステップi)において組換え技術を用いてポリペプチドを生産するために、E.コリが用いられる。より好ましくは、ステップi)において組換え技術を用いてポリペプチドを生産するために、E.コリXL1blueMRFが用いられる。ステップii)において、前記(6xHisでタグ付けした組換え)ポリペプチドを精製するために、5mLの低密度ニッケルキレートアガロースビーズ(ABTビーズ)を充填したIMAC及びEcono−Pacクロマトグラフィーカラム(Biorad)が、重力流と組み合わせて用いられるのが好ましい。溶出したポリペプチドは、3×1リットルの凍結乾燥緩衝液に対して2、4、及び12時間透析してもよく、前記緩衝液は、好ましくは、50mMのリン酸塩、500mMのスクロース、200mMのマンニトール、0.005%ポリソルベート20(pH7.4)を含む。
方法
さらなる態様において、本発明はまた、前の章で定義された、又は上述の方法によって入手できるポリペプチドを処理することによって、強化された溶解活性を有するポリペプチドを生産する方法にも関する。前記処理は、未処理ポリペプチドと比較して溶解活性を増加させるために、二価金属イオンを置換することを含み、好ましくは前記方法は、
i)前記ポリペプチドを、キレート化合物を含む緩衝液で透析するステップ、
ii)前記ポリペプチドを、二価金属イオンを含有する緩衝液で透析するステップであって、好ましくは前記二価金属イオンが、Mn2+、Co2+、Cu2+、及びZn2+からなる群より選択されるステップ
を含む。
「キレート化合物」は、本明細書では、金属イオンと結合する化合物と定義される。周知のキレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、及びエチレングリコール四酢酸(EGTA)である。本発明の方法のステップi)では、EDTAを用いるのが好ましい。
好ましくは、ステップii)の二価金属イオンは、Mn2+、Co2+、Cu2+からなる群より選択され、より好ましくは、前記二価金属イオンは、Mn2+及びCo2+からなる群より選択され、さらにより好ましくは前記2価金属イオンは、Mn2+である。
我々は、上記で定義されたもののいずれかで二価金属イオンを置換することにより、Ply2638の溶解活性が2〜2.5倍増加することを示した。溶解活性は、本明細書で定義されるように分光光度法により評価された。好ましくは、前記方法により、未処理ポリペプチドと比較して、溶解活性が、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9又は2倍増加する。さらにより好ましくは、本方法により、溶解活性が少なくとも2.5倍増加する。処理されたポリペプチドは、配列番号1によってコードされた未処理ポリペプチドと比較して、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9〜2倍の溶解活性の増加を示すことが好ましい。
組成物
さらなる態様において、本明細書で特定される、或いは本明細書において説明される方法によって入手できる、核酸分子又は核酸構築物又はポリペプチド又はベクター又は細胞を含む組成物が提供される。好ましくは、本発明は、本明細書で定義される溶解活性を示す組成物に関する。より好ましくは、前記組成物は、薬剤として使用するためである。この薬剤は、好ましくは感染性疾患を治療する、予防する、及び/又は遅延させるためである。本発明はまた、医薬又は医療用組成物にも関する。さらにより好ましくは、本発明は、感染性疾患を治療するための医薬又は医療用組成物に関する。好ましくは、本発明は、細菌、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはS.アウレウス種の細菌によって引き起こされる感染性疾患を治療するための医薬又は医療用組成物に関する。好ましくは、前記感染性疾患は、経膚感染、乳腺炎、肺炎、髄膜炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群(TSS)、敗血症、毒血症、菌血症、又は骨髄炎である。好ましくは、前記経膚感染は、丘疹、膿痂疹、腫れ物、フルンケル、蜂巣炎、毛嚢炎、カルブンケル、熱傷様皮膚症候群、及び膿瘍からなる群より選択される。
本明細書で定義される組成物は、本明細書で特定される、或いは本明細書において説明される方法によって入手できる様々な核酸分子、及び/又は核酸構築物、及び/又はポリペプチド、及び/又はベクター、及び/又は細胞の混合物を含んでもよい。
本明細書で定義される組成物は、1種又は複数の追加の活性成分を含んでもよい。活性成分は、好ましくは、本明細書では、本明細書で定義される溶解活性を示すものと定義される。前記1種又は複数の追加の活性成分は、バクテリオファージ又はファージ、及び抗生物質からなる群より選択されるのが好ましい。本明細書に包含されるファージは、文献公知のいずれのファージであってもよい。好ましくは、本発明に包含されるファージは、これらに限定されないが、ミオウイルス科(Myoviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)、及びポドウイルス科(Podoviridae)からなるリストのファミリーに属する。また本発明に包含されるファージは、テクティウイルス科(Tectiviridae)、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)、フセロウイルス科(Fuselloviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、レヴィウイルス科(Leviviridae)、及びシストウイルス科(Cystoviridae)からなる群のファミリーに属していてもよい。より好ましくは、前記1種又は複数の活性成分は、配列番号34、より好ましくは配列番号34のS.シミュランスのリソスタフィンと、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有する、リソスタフィン、好ましくはS.シミュランスのリソスタフィンを含む、及び/又はからなる。)。さらにより好ましくは、前記1種又は複数の活性成分は、1種又は複数の異なるバクテリオファージ及びリソスタフィンの両方、好ましくは1種又は複数の異なるファージ及びS.シミュランスのリソスタフィン(配列番号34)を含む、及び/又はからなる。本発明に関して、本明細書で定義される活性成分の組み合わせは、連続的及び/又は同時に投与することができる。
本明細書で定義される組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。このような組成物は、好ましくは、医薬として、又は薬剤として使用するためである。好ましくは、感染性疾患治療には薬剤が用いられる。組成物は、液体、固体、又は半流動体若しくは半固体の形態であってもよい。
本発明の組成物は、S.アウレウスに感染したヒトなどの動物を治療するのに用いることができる。前記組成物を投与するのにあらゆる適切な投与経路を用いることができ、これらに限定されないが、経口、肺、鼻内噴霧、静脈内、筋肉内、腹膜内、髄腔内、膣、直腸、局所、腰椎穿刺、髄腔内へのエアゾール又はその他の送達装置、並びに脳及び/又は髄膜への直接の適用が挙げられる。
本明細書で特定される、或いは本明細書において説明される方法によって入手できる核酸分子又は核酸構築物又はポリペプチド又はベクター又は細胞を含む組成物は、好ましくは、その組成物が、患者中、又は前記患者の細胞中、又は細胞株中、又は無細胞のインビトロの系中に存在するスタフィロコッカス属の量を減少させ、好ましくは、スタフィロコッカス属の元の量の99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%又はそれ未満が依然として検出可能であることを示す場合、活性な、機能的な又は治療的に活性である、或いは感染性疾患の治療、予防、及び/又は遅延が可能であるという。スタフィロコッカス属は検出不可能であるのが好ましい。この段落において、「スタフィロコッカス属の量」という表現は、好ましくは、生きたスタフィロコッカス属を意味する。スタフィロコッカス属は、スタフィロコッカスに特異的な抗体を用いた免疫組織化学的技術、スタフィロコアグラーゼ又は「遊離型コアグラーゼ」を検出する試験管コアグラーゼ試験、クランピング因子などの表面タンパク質の検出(スライドコアグラーゼ試験)、及び/又はプロテインA(市販のラテックス試験)などの技術者公知の標準的な技術を用いて検出することができる。生きたスタフィロコッカス属は、微生物学的な細菌培養技術、及び/又は細菌のmRNAを分析するためのリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応などの技術者公知の標準的な技術を用いて検出することができる。
前記減少は、好ましくは、本発明の前記組成物又はポリペプチドで治療する前の個体若しくは患者に存在する量と比較することによって、前記個体若しくは患者の組織において、又は細胞において評価される。或いは、治療が局所的である場合、前記組成物又はポリペプチドでまだ治療されていない前記個体若しくは患者の組織又は細胞と比較することもできる。
本明細書で特定される、或いは本明細書において説明される方法によって入手できる核酸分子又は核酸構築物又はポリペプチド又はベクター又は細胞を含む組成物は、患者、又は前記患者の細胞、組織若しくは臓器に、少なくとも1週間、1ヶ月、6ヶ月、1年又はそれより長く投与してもよい。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で定義される結合及び/又は溶解活性を示す、医療用ではない組成物に関する。好ましくは、本発明は、抗菌剤に関する。好ましくは、本発明は、細菌、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはS.アウレウス種の細菌を溶解させるための抗菌剤に関する。好ましくは、本発明は、食品保存剤又は消毒剤としての抗菌剤に関する。
使用
さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義される第1、第2、第3及び任意選択で第4の核酸配列によってコードされたドメインを含むポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸分子、このような核酸分子を含む構築物、このような構築物を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、及び/又は上記のいずれかを含む組成物の、好ましくは抗菌剤としての使用に関する。好ましくは、本発明は、細菌、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはS.アウレウス種の細菌を溶解させるための、抗菌剤としての使用に関する。好ましくは、本発明は、食品保存剤又は消毒剤としての抗菌剤に関する。場合によっては、このような食品保存剤又は消毒剤は、他の抗菌剤と共に用いられる。このような食品保存剤又は消毒剤は、本明細書で定義される1種又は複数の追加の活性成分と組み合わせて用いられるのが好ましい。前記1種又は複数の追加の活性成分は、本明細書で定義されるバクテリオファージ又はファージ、及び抗生物質からなる群より選択されるのが好ましい。
上述したポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、細胞、及び/又は組成物は、これらに限定されないが、前記ポリペプチド及び/又は本発明のポリペプチドを含有する細胞を食品に混ぜること、消毒しようとする食材又は体の部位上に前記ポリペプチド及び/又は本発明のポリペプチドを含有する細胞を噴霧することなどのいくつかの手段によって、消毒しようとする食品上若しくは食品中に、及び/又は様々な体の部位に適用することができる。
本発明のポリペプチドは、細胞から単離してもよいし、或いは本発明の前記ポリペプチドを含有する細胞を、前記ポリペプチドを単離しないで、直接適用又は投与してもよい。例えば、本発明のポリペプチドを産生する細胞は、対象(ヒト又は動物)に投与してもよいし、或いは食物中に、表面上に、又は対象の消化管中に本発明のポリペプチドが分泌されると予想される表面に適用してもよい。続いて本発明のポリペプチドは、この環境に存在する細菌細胞、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはS.アウレウス種の細菌に結合することができ、任意選択でそれを溶解させることができる。
さらに、好ましくは細菌を検出するための、より好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはS.アウレウス種の細菌を検出するための、本明細書で定義される第1の核酸配列によってコードされたドメインを含むポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸分子、このような核酸分子を含む構築物、このような構築物を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、及び/又は上記のいずれかを含む組成物の使用も包含される。好ましくは、前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、細胞、及び/又は組成物は、診断用途で用いられる。場合によっては、前記ポリペプチド、核酸分子、構築物、ベクター、細胞、及び/又は組成物は、その他の検出試薬と共に用いられる。
方法
さらなる態様において、本発明はさらに、本明細書の上記で定義された組成物を投与することによる、感染性疾患の治療、遅延、及び/又は予防方法に関する。この方法の全ての特徴は、すでに本明細書で定義されている。
定義
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、2つ以上のアミノ酸(ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質)又は2つ以上の核酸(ヌクレオチド、ポリヌクレオチド)配列間の関係と定義される。当技術分野において、場合によっては「同一性」も、アミノ酸又はヌクレオチド配列の一続きの鎖同士のマッチングによって決定される配列間の配列関連性の程度を意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換を、第二のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することによって決定される。好ましい実施形態では、同一性又は類似性は、本明細書で特定される配列番号全体で計算される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993;Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin,A.M.及びGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heine,G.、Academic Press、1987;及びSequence Analysis Primer、Gribskov,M.及びDevereux,J.編、M Stockton Press、New York、1991;及びCarillo,H.及びLipman,D.、SIAM J.Applied Math.、48:1073(1988)で説明されている方法などがある。
同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最も大きいマッチングが得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公共的に利用可能であるコンピュータープログラムで体系化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、例えばGCGプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、及びFASTA(Altschul,S.F.ら、J.Mol.Biol.215:403〜410(1990)が挙げられる。BLAST Xプログラムは、NCBI及びその他のソース(BLASTマニュアル、Altschul,S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、MD20894;Altschul,S.ら、J.Mol.Biol.215:403〜410(1990)から公共的に利用可能である。また周知のSmith Watermanアルゴリズムを用いて、同一性を決定してもよい。
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる。アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J.Mol.Biol.48:443〜453(1970);比較マトリックス:Hentikoff及びHentikoffからのBLOSSUM62、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915〜10919(1992);ギャップペナルティー:12;及びギャップの伸長ペナルティー:4。これらのパラメーターを用いた有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンにあるGenetics Computer Groupの「Ogap」プログラムとして公共的に利用可能である。上述のパラメーターは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである(末端ギャップに対してペナルティーなし)。
核酸を比較するための好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる。アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J.Mol.Biol.48:443〜453(1970);比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0;ギャップペナルティー:50;ギャップの伸長ペナルティー:3。ウィスコンシン州マディソンにあるGenetics Computer Groupのギャッププログラムも利用することができる。上記で示したものは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
任意選択で、アミノ酸の類似性の程度を決定することにおいて、当業者であれば当然のことと予想されるが、当業者はさらに、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり;脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン、及びトレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン、及びグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり;並びに硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン、及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示されたアミノ酸配列の置換による変異体は、開示された配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている変異体である。アミノ酸の変化は、保存的であるのが好ましい。自然に存在するアミノ酸それぞれの好ましい保存的置換は、以下の通りである。Alaからser;Argからlys;Asnからgln又はhis;Aspからglu;Cysからser又はala;Glnからasn;Gluからasp;Glyからpro;Hisからasn又はgln;Ileからleu又はval;Leuからile又はval;Lysからarg;gln又はglu;Metからleu又はile;Pheからmet、leu又はtyr;Serからthr;Thrからser;Trpからtyr;Tyrからtrp又はphe;及びValからile又はleu。
核酸構築物、形質転換、発現ベクター、作動可能に連結した、発現、制御配列、ポリペプチド
構築物
核酸分子は、ヌクレオチド配列で示される。ポリペプチドは、アミノ酸配列で示される。核酸構築物は、自然に存在する遺伝子から単離される核酸分子、或いは自然には存在しないような様式で連結又は並置された核酸セグメントを含有するように改変された核酸分子と定義される。核酸分子は、ヌクレオチド配列で示される。任意選択で、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列は、細胞中で、又は対象中で前記ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結している。
「作動可能に連結した」は、本明細書では、細胞中で、及び/又は対象中で制御配列が本発明のペプチド又はポリペプチドの産生/発現を指示するように、制御配列が本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と関連する位置に適切に配置されている配置と定義される。
「作動可能に連結した」はまた、細胞中で、及び/又は対象中でキメラポリペプチドがコードされるように、配列が、機能性ドメインをコードする別の配列と関連する位置に適切に配置されている配置を定義するのに用いられる場合もある。
発現は、これらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌などのペプチド又はポリペプチドの生産に関与するあらゆるステップを含むものと理解される。
制御配列は、本明細書では、ポリペプチドの発現に必要な又は有利なあらゆる構成要素を含むと定義される。少なくとも、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。任意選択で、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列で示されるプロモーターは、本明細書で特定されるペプチド又はポリペプチドをコードする別のヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
用語「形質転換」は、新しいDNA(すなわち細胞にとって外因性のDNA)を取り込んだ後の、細胞中で誘導された永続的な又は一過性の遺伝学的変化を指す。細胞が細菌細胞である場合、本発明での目的に従って、この用語は通常、選択可能な抗生物質耐性を有する染色体外の自己増殖ベクターを指す。
発現ベクターは、組換えDNA法でうまく処理することが可能であり、さらに細胞中で、及び/又は対象中で本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることができるあらゆるベクターであってもよい。用語「プロモーター」は、本明細書で用いられる場合、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する、1つ又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御するように機能する核酸断片を指す。発現ベクターは、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位の存在によって同定された結合部位、転写開始部位、及びその他のあらゆるDNA配列、例えば、これらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー、及び活性化タンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写量を調節するように直接的又は間接的に作用する当業者公知のヌクレオチドのその他のあらゆる配列と関連している。本発明に関して、プロモーターは、転写開始部位(TSS)のヌクレオチド−1で好ましくは停止する。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」は、あらゆるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を指す。ポリペプチドは、連続したアミノ酸で構成される。用語「ポリペプチド」は、自然に存在する分子又は合成分子を包含する。
本明細書において、及びその特許請求の範囲において、「含む(to comprise)」という動詞及びその活用形は、その非限定的な意味で用いられ、この言葉の後に続く事柄が包含されることを意味するが、具体的に述べられていない事柄が排除されることはない。加えて、「からなる(to consist)」という動詞は、「実質的に〜からなる(to consist essentially of)」で置き換えることが可能であり、「実質的に〜からなる」とは、本明細書で定義される核酸構築物又はベクター又は細胞の、生成物又は組成物又は核酸分子又はペプチド若しくはポリペプチドが、具体的に特定されたもの以外の追加の構成要素(複数可)を含んでいてもよいが、前記追加の構成要素(複数可)が本発明固有の特徴を変更しないことを意味する。加えて、ある要素が不定冠詞「a」又は「an」で記述される場合、文脈上明らかに要素が1つしか存在しないことを示していない限り、1つより多くの要素が存在する可能性が排除されることはない。したがって不定冠詞「a」又は「an」は通常、「少なくとも1つの」を意味する。
本明細書で引用された全ての特許及び参考文献は、参照によりその全体が本発明に組み入れられる。
以下の実施例は、単に例示のためだけに示され、本発明の範囲を決して限定しないものとする。
材料及び方法
菌株、培養条件、ファージ、及びプラスミド
6x−Hisでタグ付けした(配列番号43)融合タンパク質の過剰発現のために、E.コリXL1BlueMRF’、及びE.コリSureを使用した。両方の株を、LB−PE培地中で、30℃で、プラスミド選択のための100μg/mlアンピシリン及び30μg/mlテトラサイクリンと共に培養した。Ply2638A遺伝子又はそのドメインコード領域を増幅させるためのテンプレートとして、ファージ2638A溶解産物を用いた。ファージTwort溶解産物からCHAPTwドメイン(配列番号19)を増幅した。ファージ11由来のシステイン−ヒスチジン依存性アミダーゼ/ペプチダーゼ(CHAP)ドメイン、及びアミダーゼドメイン(配列番号18及び17、それぞれ;Donovanら、2006及び2008;Navarreら、1999;Sass及びBierbaum 2007)を、Donovan,D.M.氏から進呈されたphi11自己溶解酵素遺伝子を含有するpet21aベクターから増幅した。M23−LST(配列番号15)及びCWT−LST(配列番号13)ドメインを増幅するためのテンプレートとして成熟リソスタフィンの配列(配列番号33)を含有するプラスミドLT1215を使用した。
E.コリXL1BlueMRF’又はE.コリSureそれぞれで6x−Hisでタグ付けした組換え融合タンパク質を生産するためのクローニング及び発現ベクターとして、pQE−30ベクター(カタログ番号:32915、Qiagen、Hilden、Germany;配列番号50)を使用した。
DNA技術及びクローニングの手順
単一の遺伝子のクローニング及び融合タンパク質の作製のために、Sambrook、Maniatisら(1989)による標準的な技術を用いた。PCR反応に、高忠実度PCR酵素ミックス(Fermentas)を使用した。分光光度計(NanoDrop ND−1000分光光度計)を用いてDNA濃度を決定した。
pQE30(配列番号50)のBamHI−SalI部位にPly2638(配列番号1)をコードする配列Met1〜Lys486を挿入することによって、pHPl2638を構築する。pHPl2638−Pl2638構築物は、BamHI−SacI−SalI部位に連続して挿入された同じ配列を有する。CHAP11(配列番号18)、Ami11(配列番号17)、及びCHAP_Ami11をBamHIで消化したpHPL2638AのN末端に導入した。ライゲーション反応の前に、このベクターを、エビのアルカリホスファターゼ(SAP、Fermentas)を用いて脱リン酸化した。BamHI及びSacI制限部位を用いて、pHGFP_CBD2638A_cベクター由来のGFPコード領域(配列番号59)をそれぞれのインサートで置換することにより、pHM23_CBD2638(配列番号3)及びpHM23−2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638(配列番号49)を構築した。pHM23−LST_Ami2638_CBD2638(配列番号48)は、pQE−30の主鎖を有し、BamHI及びSacIに成熟リソスタフィン(配列番号33)コード配列のAla1〜Gly154が挿入されており、SacI及びSalI部位にLeu138〜Lys486をコードするPly2638の部分配列を有する。pHM23−LST_M23−LST_CWT−LST(配列番号11)では、BamHI及びSacIに成熟リソスタフィン(配列番号33)配列のAla1〜Gly154が挿入され、pQE30のSacI及びSalI部位にAla1〜Lys246が挿入されている。BamHI−SacI及びSacI−SalI部位に繰り返してAla1〜Lys246を有するpHLST−LST(配列番号10)を同じ方法で構築する。4つのドメイン構築物pHCHAPTw_Ami2638_M23−LST_CBD2638(配列番号47)及びpHCHAPTw_Ami2638_M23−LST_CWT−LST(配列番号8)をコードするプラスミドにおいて、これらのドメインを、オーバーラップ伸長PCR(SOE)をスプライシングすることにより直接融合させて、pQE30のBamHI及びSalI部位に挿入する。両方の構築物において、個々のドメインの境界領域(CHAPTw、配列番号19:Met1〜Ile140、Ami2638、配列番号16:配列番号1のLys141〜Gly358、CBD2638、配列番号12:配列番号1のTrp393〜Lys486、M23−LST、配列番号15:配列番号33のAla1〜Gly154、CWT−LST、配列番号13:配列番号33のTrp155〜Lys246)をバイオインフォマティクスで決定した(未発表のデータ)。繰り返しの配列を有するプラスミドをE.コリSure株に移入し、全てのその他のプラスミドをE.コリXL1BlueMRF’に移入した。
組換え融合タンパク質の発現及び精製
タンパク質の過剰発現及び部分的な精製を、これまでに他者(Loessnerら、1996、Schmelcherら、2010)によって説明されたようにして実質的に行った。簡単に言えば、プラスミドを有するE.コリを、250mlの改変LB培地(15g/lのトリプトース、8g/lの酵母抽出物、5g/lのNaCl、pH7.8)中で600nm(OD600nm)の光学密度が0.4〜0.6になるまで増殖させ、1mMのIPTGで誘導した。細胞を、30℃で4時間又は20℃で18時間、さらにインキュベートし、4℃に冷却し、遠心分離で回収した。細胞ペレットを5mlの固定緩衝液(50mMのNaHPO、500mMのNaCl、5mMのイミダゾール、0.1%ポリソルベート20、pH7.4)に懸濁した。可溶性組換えタンパク質を含有するE.コリを1200psiで稼働させたフレンチプレッシャーセルプレス(French Pressure Cell Press)(1200psi、SLM Aminco、Urbana、IL、U.S.)に2回通すことによりその細胞質の中身を放出させた。その他の下流プロセシングステップとして、遠心分離による不溶性の死細胞片の除去、フィルター滅菌(0.2μmのPESメンブレン、Millipore)、及び低密度Ni−NTAスーパーフロー(Superflow)樹脂(Chemie Brunschwig AG、Basel、Switzerland)を含むマイクロバイオスピン(MicroBiospin)(Bio−Rad、Hercules、CA、U.S.)カラムパケットを用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)精製を行った。Ni−NTAに固定したタンパク質を、カラム体積の5〜10倍の固定緩衝液を用いてカラムで重力流により洗浄した。次にタンパク質分画を溶出緩衝液(50mMのNaHPO、500mMのNaCl、125mMのイミダゾール、0.1%ポリソルベート20、pH7.4)で溶出させ、透析緩衝液(50mMのNaHPO、100mMのNaCl、0.1%ポリソルベート20、pH7.4)を2回交換して透析した。ベクターNTIソフトウェア(Invitrogen、Carlsbad、CA、U.S.)を用いて一次アミノ酸配列から計算された280nmにおける比吸光度で補正したNanoDrop ND−1000分光光度計でタンパク質濃度を明らかにし、SDS−PAGEで純度を推測した。50%グリセロールと混合したアリコートを−20℃で保存した。
組換えタンパク質の凍結乾燥
IMACで精製したタンパク質を、300mlの凍結乾燥緩衝液(50mMのリン酸塩又はトリス、500mMのスクロース、200mMのマンニトール、pH7.4)のアリコートを3回交換して透析し、液体窒素の気相中で凍結した。−40℃及び真空75mTorrで60分間凍結乾燥し、続いて5時間で温度を−10℃に高め、同じ真空レベルでさらに60分、−10℃にした。最終ステップとして、温度を10時間で25℃に高めた。溶解分析で試験する前に、サンプルを水の添加により再溶解した。
細胞壁結合分析
GFP融合物を細菌表面に向かわせて、細胞壁リガンドへのしっかりとした結合を仲介するCBDの能力を決定するための標準的な分析として、以下の条件を用いた。対数期後期からの細菌、好ましくはS.アウレウスBB255を遠心分離で回収し、10分の1の体積のPBS−T(50mMのNaHPO、120mMのNaCl[pH8.0]、0.01%ポリソルベート20)に再懸濁し、氷上で保存する。GFP−CBDタンパク質、好ましくは配列番号60によってコードされた配列番号64を同じ緩衝液で400nMの濃度に希釈し(2×GFP−CBD)、これも氷上で保存する。1.5mlのマイクロ遠心分離機カップ中で、100μlの細胞と100μlの2×GFP−CBDとを混合し、室温で5分間インキュベートする。次に微量遠心機で遠心分離することによって(16000g、60秒)上清から細胞を除去する。上清を捨て、細胞を500μlのPBS−T緩衝液で2回洗浄した。蛍光顕微鏡検査法のために、最後にペレットを50μlの緩衝液に再懸濁した。蛍光測定器での分析のために、最後にペレットを200μlのPBS−Tに再懸濁し、マイクロプレートウェルに移す。定量的な蛍光分析は、滅菌された、未処理の、黒色の96ウェルポリスチレンマイクロプレート(Nunc、Roskilde、Denmark)を備えたマルチラベルカウンター装置(Victor、Perkin Elmer、Massachusetts、U.S.)を用いて行うことができる。陰性対照として、GFPを用いることができる。
定量的な蛍光分析
S.アウレウスBB255細胞表面リガンドの相互作用に対する、CBD2638のpH及び塩の依存性は、OD600nmが1+/−0.05に設定された体積1mlの細胞(約4×10個の細胞)を、7.5μgのGFP−CBDS2638融合タンパク質(配列番号60によってコードされた配列番号64)とインキュベートすることによって調査される。この細胞とタンパク質との比率は、事前の実験で決定された飽和点に近く、結合効率の変動の検出を可能にする。クエン酸緩衝液(pH4.5〜6.5)及びリン酸緩衝液(pH6〜9)を用いて様々なpHが試験される。細胞を、pH緩衝液中でGFP−CBD2638タンパク質とインキュベートした後、それぞれのpH緩衝液で洗浄し、標準的なPBS−T(pH8)で洗浄する。最後に細胞をOD595nm=0.3に調節して、その懸濁液200μlからVictorマルチラベルカウンターで蛍光を検出する。塩化ナトリウム濃度を増加させて調製された緩衝液(10mMのNaHPO、0〜1000mMのNaCl、0.1%ポリソルベート20、pH6)を用いて類似の実験を行う。
改変された細胞表面特性を有するスタフィロコッカス株のCBD結合能力の定量化を、過量のGFP−CBD2638タンパク質と予めインキュベートした、洗浄及び加熱殺菌した細胞の相対的な蛍光単位(RFU)を記録することにより試験する。OD595nm=0.3に調節された等量(200μl)のGFP−CBD2638標識細胞の蛍光を、マルチラベルカウンター装置で適切なフィルターセットを用いて測定する。同じようにして、S.アウレウスBB255細胞及びSDS処理した細胞における、GFP−CBD2638(配列番号60によってコードされた配列番号64)、GFP−CBD2638−CBD2638(それぞれ配列番号61及び62によってコードされた配列番号65及び/又は66)、及びGFP−CBD2638−CBD2638−CBD2638(配列番号63によってコードされた配列番号67)の吸収レベルの比較及び定量化を行う。
溶解分析
溶解活性分析のための基質細胞を、光学密度が600nm(OD600)で0.4になるまで増殖させ、PBST(pH7.4)で2回洗浄し、15%グリセロールを含有するPBS緩衝液(pH7.4)に再懸濁して同時に100倍に濃縮した。細胞を−20℃で保存した。結合又は溶解活性分析でさらに使用するために、細胞を解凍し、PBS(pH7.4)で洗浄し、1±0.05のOD600になるように希釈した。標準的な溶解活性分析で、タンパク質サンプルを等モル量に希釈し、透明な96ウェルの組織培養試験プレート(SPL life sciences、Pocheon、Korea)に分配した。基質細胞を添加して最終体積にし、595nmにおける光学密度(OD595nm)の低下を、37℃で約1時間、記録した。
溶解分析において、Ply2638の改良及び欠失構築物の溶解活性を、凍結ストックからのファージ2638A継代株のS.アウレウスSA2638/2854について試験した。我々は、様々な緩衝液条件での活性を試験した。クエン酸/リン酸緩衝液(25mMのクエン酸塩、25mMのリン酸塩、120mMのNaCl、pH4.6〜6.6)、及びトリス/リン酸緩衝液(25mMのトリス、25mMのリン酸塩、120mMのNaCl)を用いて、4.6〜9のpH値を増分0.4として試験した。0〜1000mMの塩化ナトリウム(pH7.4の10mMのリン酸緩衝液中)の範囲の塩濃度におけるPly2638A誘導体の活性を試験した。Ply2638A誘導体を、溶解分析に適用する前にMQで10μMの最終濃度に希釈した。ここで10μMのPly2638A誘導体4μlをマルチチャンネルピペットを用いて基質細胞懸濁液196μlに適用することにより、タンパク質の分析濃度が200nMになった。凍結ストックをpH又は塩緩衝液で希釈し、分光光度法で(Libra S22、Biochrom)最初のOD600を1±0.05に標準化することにより、凍結ストックから基質細胞懸濁液を調製した。Victor3 1420マルチラベルカウンター(Multilabel Counter)機器(Perkin Elmer)を用いて、595nmにおける光学密度(OD595)の減少を1時間測定した。1回の読み出しの後に毎回、プレートを1秒間強く振盪した(二重軌道、直径0.1mm)。陽性対照として、N末端に6xHisでタグ付けしたリソスタフィン(HLST)、市販のリソスタフィン(組換え、E.コリ由来、Sigma)を使用した。陰性対照として、我々はMilliQ水を適用した。
二価金属イオンのPly2638の活性への影響
一部精製したPly2638(配列番号21)を、EDTAを含有する緩衝液(50mMのMOPS、100mMの塩化ナトリウム、0.005%ポリソルベート20、10mMのEDTA)で2時間透析し、続いてそれぞれの二価金属イオン(50mMのMOPS、100mMの塩化ナトリウム、0.005%ポリソルベート20、及び10mMのCaCl2、10mMのMgCl、1mMのCoCl、1mMのCuCl、1mMのMnSO、又は1mMのZnClそれぞれ)を含有する緩衝液で透析した。基質として用いられる細胞を、標準的な溶解分析に適用する前にSDS処理し、EDTAで洗浄した。
Figure 2014519815
配列番号1(Ply2638)
ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号2(Ami2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号3(M23−2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号4(Ply2638−Ply2638+6xHis及びクローニング部位))
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号5(CHAP11_M23−2638_Ami2638_CBD2638)
ATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCTGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号6(Ami11_M23−2638_Ami2638_CBD2638)
AAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCAGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号7(CHAPTw_Ami2638_M23−LST_CBD2638)
ATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号8(CHAPTw_Ami2638_M23−LST_CWT−LST+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTAA
配列番号9(M23−LST_Ami2638_CBD2638)
GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号10(LST_LST+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGGAGCTCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA
配列番号11(M23−LST_M23−LST_CWT−LST+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA
配列番号12(CBD−2638)
TGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号13(CWT−LST)
TGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA
配列番号14(M23−2638)
ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGAT
配列番号15(M23−LST)
GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATAT
配列番号16(Ami−2638)
GGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGT
配列番号17(Ami−□11)
AAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCA
配列番号18(CHAP−□11)
ATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCT
配列番号19(CHAP−□Twort)
ATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATT
配列番号20(M23−2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638)
ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号21(Ply2638)
MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号22(Ami2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号23(M23−2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号24(Ply2638−Ply2638)
MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号25(CHAP11_M23−2638_Ami2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号26(Ami11_M23−2638_Ami2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号27(CHAPTw_Ami2638_M23−LST_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSMKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVVVWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号28(CHAPTw_Ami2638_M23−LST_CWT−LST)
MRGSHHHHHHGSMKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVVVWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号29(M23−LST_Ami2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGELLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号30(LST_LST)
MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIKELAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号31(M23−LST_M23−LST_CWT−LST)
MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGELAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号32(M23−2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638)
MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号33(LST)
GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA
配列番号34(LST aa)
AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号35(CBD−2638)
WKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号36(CWT−LST)
WKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号37(M23−2638)
MLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKD
配列番号38(M23−LST)
AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGY
配列番号39(Ami−2638)
NKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDG
配列番号40(Ami−□11)
NPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMD
配列番号41(CHAP−□11)
MSIIMEVATMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRP
配列番号42(CHAP−□Twort)
MKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVVVWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFI
配列番号43(6xHisタグN末端)
MRGSHHHHHHGS
配列番号44(Ply2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号45(CHAP11_M23−2638_Ami2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCTGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号46(Ami11_M23−2638_Ami2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCAAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCAGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号47(CHAPTw_Ami2638_M23−LST_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号48(M23−LST_Ami2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号49(M23−2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638+6xHis及びクローニング部位)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号50(pQE−30ベクター、ドイツHildenのQiagenのカタログ番号32915で入手可能)
CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
配列番号51(推定リンカーを太字で示したCBD−2638)
GKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号52(推定リンカーを太字で示したCWT−LST)
GKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK
配列番号53(推定リンカーを太字で示したM23−2638)
MLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKG
配列番号54(推定リンカーを太字で示したM23−LST)
AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTG
配列番号55(推定リンカーを太字で示したAmi−2638)
EKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATD
配列番号56(推定リンカーを太字で示したAmi−□11)
PKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASA
配列番号57(推定リンカーを太字で示したCHAP−□11)
MSIIMEVATMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRG
配列番号58(推定リンカーを太字で示したCHAP−□Twort)
MKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVVVWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIRPNFATESSVKKKDTKKKPKPSNRDGINKDKIVYDRTNINYNMVKRG
配列番号59(pHGFP_CBD2638_cベクター)
CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
配列番号60(GFP_CBD2638)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA
配列番号61(GFP_CBD2638_CBD2638変異体1。次の構築に使用した制限酵素部位:BamHI−SacI−SacI−SalI。第2CBD2638由来のTAA停止コドン)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAAGTCGAC
配列番号62(GFP_CBD2638_CBD2638変異体2。次の構築に使用した制限酵素部位:BamHI−SacI−KpnI−SalI。停止コドンがベクターによりコードされている)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGGTACCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGA
配列番号63(GFP_CBD2638_CBD2638_CBD2638。次の構築に使用した制限酵素部位:BamHI−SacI−KpnI−SalI−PstI。停止コドンがベクターによりコードされている)
ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGGTACCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGTCGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAACTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGA
配列番号64(GFP_CBD2638 aa)
MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号65(GFP_CBD2638_CBD2638変異体1 aa)
MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK
配列番号66(GFP_CBD2638_CBD2638変異体2 aa)
MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKGTGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKVDLQPSLIS
配列番号67(GFP_CBD2638_CBD2638_CBD2638 aa)
MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKGTGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKVDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKLQPSLIS

Claims (25)

  1. 第1のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号12と少なくとも80%の配列同一性を有する、核酸分子。
  2. 前記第1のヌクレオチド配列が、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属のペプチドグリカン細胞壁と結合する細胞壁結合ドメインをコードする、請求項1に記載の核酸分子。
  3. 前記第1のヌクレオチド配列が、S.アウレウス(S.aureus)バクテリオファージΦ2638aエンドリシンに由来する、請求項1又は2に記載の核酸分子。
  4. 前記核酸分子が、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するか、或いは前記核酸分子が、溶解ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記核酸分子が、溶解ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含み、前記溶解ドメインが、第2及び第3のヌクレオチド配列であり、前記第2のヌクレオチド配列が、M23エンドペプチダーゼドメインをコードし、前記第3のヌクレオチド配列が、アミダーゼドメインをコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記第2及び第3のヌクレオチド配列が、S.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシン、S.アウレウスバクテリオファージΦ11エンドリシン、S.アウレウスバクテリオファージΦTwortエンドリシン、及びS.シミュランス(S.simulans)のリソスタフィンからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子に由来する、請求項5に記載の核酸分子。
  7. 前記第2のヌクレオチド配列が、配列番号14又は15と少なくとも80%の配列同一性を有し、前記第3のヌクレオチド配列が、配列番号16又は17と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項6に記載の核酸分子。
  8. 前記ヌクレオチド分子が、配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項7に記載の核酸分子。
  9. CHAP(システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ/ペプチダーゼ)ドメインをコードする第4のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記第4のヌクレオチド配列が、S.アウレウスバクテリオファージΦ11又はS.アウレウスバクテリオファージΦTwortエンドリシンに由来する、請求項9に記載の核酸分子。
  11. 前記第4のヌクレオチド配列が、配列番号18又は配列番号19と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項10に記載の核酸分子。
  12. 配列番号1によってコードされたS.アウレウスバクテリオファージΦ2638aエンドリシンと比較して、同じ若しくは増加した溶解活性、及び/又は同じ若しくは低い最適pHを有するポリペプチドをコードする、請求項4〜11のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。
  14. 請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
  15. 細胞、対象、又は無細胞発現系においてコードされたポリペプチドの産生又は発現を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結した、請求項14に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
  16. 請求項14に記載の核酸構築物又は請求項15に記載の発現ベクターを含む細胞であって、前記細胞が、微生物細胞、原核細胞又は真核細胞である、細胞。
  17. 請求項13に記載のポリペプチドを生産し、任意選択で精製し、及び任意選択で凍結乾燥する方法であって、
    i)前記ポリペプチドを、請求項14に記載の核酸構築物を含む請求項16に記載の細胞中で生産するステップ、任意選択で
    ii)前記ポリペプチドを精製するステップ、及び任意選択で
    iii)前記精製したポリペプチドを凍結乾燥するステップ
    を含む、方法。
  18. 請求項13に記載のポリペプチド及び/又は請求項17に記載の方法によって入手できるポリペプチドを処理することにより、強化された溶解活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、
    i)前記ポリペプチドを、キレート化合物を含む緩衝液で透析するステップ、
    ii)前記ポリペプチドを、二価金属イオンを含有する緩衝液で透析するステップであり、好ましくは前記二価金属イオンが、Co2+、Cu2+、Mn2+、及びZn2+からなる群より選択される、ステップ
    を含む、方法。
  19. 請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項13に記載のポリペプチド及び/又は請求項17若しくは18に記載の方法によって入手できるポリペプチド、及び/又は請求項14に記載の核酸構築物、及び/又は請求項15に記載のベクター、及び/又は請求項16に記載の細胞を含む組成物。
  20. 好ましくはバクテリオファージ及び抗生物質からなる群より選択される、1種又は複数の追加の活性成分を含む、請求項19に記載の組成物。
  21. 薬剤として使用するための、請求項19又は20に記載の組成物。
  22. 感染性疾患の治療における薬剤として使用するための、請求項21に記載の組成物。
  23. 抗菌剤として、好ましくは食品添加剤又は消毒剤としての、請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項13に記載のポリペプチド及び/又は請求項17若しくは18に記載の方法によって入手できるポリペプチド、請求項14に記載の核酸構築物、請求項15に記載のベクター、請求項16に記載の細胞、並びに/又は請求項19若しくは20に記載の組成物の使用。
  24. スタフィロコッカスを検出するための、好ましくは診断用途における、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子、このような核酸分子によってコードされたポリペプチド、このような核酸構築物を含む核酸構築物及び/若しくはベクター及び/若しくは細胞、又はこのようなポリペプチド、核酸分子、核酸、ベクター、及び/若しくは細胞のいずれかを含む組成物の使用。
  25. 請求項19又は20に記載の組成物を投与することによる、感染性疾患の治療、遅延、及び/又は予防方法。
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