BR112013028251B1

BR112013028251B1 - Polipeptídeos, nucleotídeos que codificam os mesmos, composições, métodos de produção e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112013028251B1
Application number: BR112013028251-7A
Authority: BR
Inventors: Martin Johannes Loessner; Fritz Eichenseher
Original assignee: Micreos Human Health B.V.
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2021-04-06
Also published as: EP3085777A1; CN108192902A; JP2014519815A; DK3085777T3; ES2768777T3; WO2012150858A1; CN103703127A; PL3085777T3; EP2705144B1; US20160369255A1; IL229247A0; EP2705144A1; US10174300B2; KR20140066976A; HK1195791A1; IL229247B; ES2589784T5; EP2705144B2; CA2834924C; DK2705144T3

Abstract

polipeptídeo. a invenção refere-se a um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico correspondente, um constructo e/ou vetor e/ou célula que compreende tal molécula de ácido nucleico e/ou 5 uma composição que compreende o dito polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, construção, vetor e/ou célula. a invenção refere-se ainda a tal composição para uso médico, preferencialmente para uso no tratamento de uma doença infecciosa. além disso, a invenção refere-se ao uso do dito 10 polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor, célula e/ou composição como um antimicrobiana, preferencialmente como um aditivo alimentar ou desinfetante, ou para a detecção de bactérias, preferencialmente em uma aplicação de diagnóstico.

Description

POLIPEPTÍDEOS, NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM OS MESMOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USOS DOS MESMOS

Campo da invenção

A invenção refere-se a um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico correspondente, um constructo e/ou vetor e/ou célula que compreende tal molécula de ácido nucleico e/ou uma composição que compreende o dito polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor e/ou célula. A invenção refere-se ainda a tal polipeptídeo, molécula de ácido nucleico correspondente, constructo e/ou vetor e/ou célula compreendendo tal molécula de ácido nucleico e/ou composição para uso médico, preferencialmente para uso no tratamento de uma doença infecciosa. Além disso, a invenção refere-se ao uso do dito polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor, célula e/ou composição como um antimicrobiano, preferencialmente como um aditivo alimentar ou desinfetante, ou para a detecção de bactérias, preferencialmente em uma aplicação de diagnóstico.

Antecedentes da invenção

Staphylococcus aureus é um importante patógeno humano frequentemente implicado em várias doenças infecciosas graves e intoxicação alimentar. Seu tratamento torna-se cada vez mais difícil devido a cepas emergentes resistentes aos antibióticos. Endolisinas de Staphylococcus aureus que infectam fagos demonstraram controlar potencialmente estes patógenos e podem ser usadas para a detecção específica dos mesmos. Na maioria dos casos, grandes obstáculos na aplicação de espécies de Staphylococcus que que almejam endolisinas têm baixa atividade enzimática, difícil produção em grandes quantidades e/ou estabilidade da proteína.

Há sempre uma necessidade de novos agentes antimicrobianos com características melhoradas relacionadas, por exemplo, com a atividade antimicrobiana e/ou estabilidade.

Descrição da Invenção

É relatado neste documento o Ply2638 recém- caracterizado, a endolisina do bacteriófago de S. aureus Φ2638a. A enzima e vários derivados manipulados foram expressos em uma forma solúvel em E. coli e demonstraram surpreendente estabilidade depois da liofilização, como comprovado por sua atividades líticas após a reconstituição. Além de um domínio de ligação à parede celular que se liga à parede celular do gênero Staphylococcus, foi demonstrado que dois domínios funcionais, ou seja, um domínio de endopeptidase M23 e um domínio amidase, são cruciais para a atividade lítica ideal.

Foi demonstrado que o retroajuste da enzima com domínios catalíticos e/ou duplicação do domínio de ligação à parede celular originário da endolisina Φ11 de S. aureus, endolisina ΦTwort e lisostafina resultou em um produto de fusão de polipeptídeo heterólogo com atividade lítica aumentada e/ou pH ideal deslocado, e/ou maior estabilidade após a liofilização e reconstituição.

Molécula de ácido nucleico

Em um primeiro aspecto, é fornecida uma molécula de ácido nucléico que compreende ou consiste em uma primeira sequência de nucleotídeos, a dita sequência nucleotídica com 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 12 (referência à Tabela 1 para uma visão geral de todas as SEQ ID Nos. usadas neste documento). Preferencialmente, a dita primeira sequência de nucleotídeos tem um comprimento de pelo menos, 282, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360 ou 370 nucleotídeos, mais preferencialmente de pelo menos 381 nucleotídeos e/ou um comprimento de no máximo 510, 480, 450, 420 ou 390 nucleotídeos. Preferencialmente, a dita molécula de ácido nucleico tem um comprimento de pelo menos, 282, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360 ou 370 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 381 nucleotídeos e/ou um comprimento de no máximo 4500, 4200, 3900 e/ou 3600 nucleotídeos. Preferencialmente, a dita molécula de ácido nucleico tem um comprimento de pelo menos 1200, 1230, 1260, 1290, 1320, 1350, 1380, 1410, 1440, 1470, 1500, 1530 ou 1560 nucleotídeos, e/ou um comprimento de no máximo 4500, 4200, 3900 ou 3600 nucleotídeos. É também preferida uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção com um comprimento de pelo menos 1890, 1920, 1950, 1980, 2010, 2040, 2070, 2100, 2130 ou 2160 nucleotídeos e/ou um comprimento de no máximo 4500, 4200, 3900 ou 3600 nucleotídeos. Preferencialmente, a dita primeira sequência de nucleotídeos codifica um domínio de ligação à parede celular que se liga ao peptidoglicano da parede celular do gênero Staphylococcus. Preferencialmente, a dita primeira sequência de nucleotídeos é originária da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus.

Conforme estimado a partir dos alinhamentos com a estrutura cristalina dos 92 resíduos C-terminais de ALE -1 (Lu et al, J. Biol. Chem., 2006, 281 (1) :549-58), foi estimado que um mínimo de 94 aminoácidos do domínio de ligação à parede celular proveniente da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus pode ser suficiente para direcionar a enzima para a parede celular do gênero Staphylococcus.

A ligação de um domínio ao peptidoglicano da parede celular do gênero Staphylococcus pode ser avaliada utilizando ensaios bem conhecidos para a pessoa versada na técnica. Em uma modalidade preferencial, uma técnica imunohistoquímica e/ou uma técnica de fusão de gene resultando em constructos marcados são utilizadas para avaliar a ligação específica dos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas ao peptidoglicano da parede celular do gênero Staphylococcus. Métodos de quantificação dos sinais usados nas técnicas imuno-histoquímicas ou de fusão mencionadas acima são conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus pode ser quantificada utilizando um construeto de fusão fluorescente que compreende um polipeptídeo que compreende um domínio codificado por uma primeira sequência de nucleotídeos. Tal ensaio de ligação à parede celular é descrito em detalhes por Loessner et al (Molecular Microbiology 2002, 44(2): 335-349) e no Exemplo 1. Neste ensaio, uma solução que compreende o dito constructo de fusão fluorescente ou um controle negativo, de preferência proteína fluorescente verde (GFP), é submetida às células de sujeita às células do Staphylococcus, de preferência células de S. aureus, mais preferencialmente BB255 de S. aureus por um período de tempo indicado onde, após o mesmo, as células são sedimentadas por centrifugação, juntamente com os constructos de fusão fluorescentes ligados. O sinal fluorescente das células de Staphylococcus expostas a um constructo de fusão fluorescente subtraído pelo sinal de fluorescência das células de Staphylococcus expostas a um controle negativo, preferencialmente GPF, é uma medida para a ligação celular, conforme sugerido nesta divulgação.

Preferencialmente, dentro do contexto da invenção, uma molécula de ácido nucleico será considerada codificante de um domínio de polipeptídeo que se liga ao peptidoglicano da parede celular do gênero Staphylococcus quando, usando esse ensaio, um aumento no sinal fluorescente das células sedimentadas acima do controle negativo, conforme definido neste termo, for detectado. A ligação é preferencialmente dita ser específica. Preferenciálmente, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou um domínio que exibe ligação, conforme definido neste documento, de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 100, 150 ou 200% de ligação ao peptidoglicano da parede celular da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus (Ply2638) codificada pela SEQ ID NO: 1.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 1 que codifica a endolisina Φ2638 do bacteriófago de S. aureus.

A presente invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico que compreende, além da primeira sequência de nucleotídeos, uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codificação um domínio lítico. Preferencialmente, o dito domínio lítico exibe atividade peptidoglicano hidrolase, conforme definido mais adiante neste documento. A dita molécula de ácido nucleico compreende as sequências nucleotídicas heterólogas sendo definidas neste documento como um "construeto retroajustado".

Conforme usado neste documento, o termo "sequência heteróloga" ou "ácido nucleico heterólogo" é aquele que não é encontrado naturalmente operavelmente ligado como uma sequência vizinha da dita primeira sequência de nucleotídeos. Conforme usado neste documento, o termo "heterólogo" pode significar "recombinante". "Recombinante" refere-se a uma entidade genética distinta daquela geralmente encontrada na natureza. Conforme aplicado a uma sequência nucleotídica ou molécula de ácido nucleico, isto significa que a dita sequência nucleotídica ou molécula de ácido nucleico é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação, e outros procedimentos que resultam na produção de um constructo que é diferente de uma sequência ou molécula encontrada na natureza.

Uma "atividade peptidoglicano hidrolase" neste documento, também definida como uma "atividade lítica", pode ser avaliada por métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, a atividade lítica pode ser avaliada espectrometricamente, medindo-se a diminuição da turbidez em suspensões celulares de substrato. Preferencialmente, a atividade lítica pode ser avaliada por espectrometria, medindo a queda de turbidez de uma suspensão de S. aureus, em que a turbidez é quantificada pela medição da OD595 espectrofotometricamente (Libra S22, Biochrom). Mais preferencialmente, 200 nM de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico conforme identificado neste documento são incubados juntamente com uma suspensão de S. aureus com uma OD600 inicial de 1 ± 0,05, conforme avaliado espectrofotometricamente (Libra S22, Biochrom) em tampão de PBS pH 7,4, cloreto de sódio 120 mM durante 30 min a 37 °C. A queda na turbidez é calculada subtraindo-se a OD595 após 30 min de incubação da OD595 antes de 3 0 min de incubação. Dentro do contexto da invenção, será considerado que uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio lítico quando, ao usar este ensaio, detecta-se uma diminuição na turbidez de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60%. Preferencialmente, uma queda de pelo menos 70% é detectada. Preferencialmente, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe uma atividade lítica de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200% ou mais de uma atividade lítica da endolisina Φ2 638a do bacteriófago de S. aureus.

Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode não compreender ou consistir na SEQ ID No: 1. A SEQ ID No: 1 codifica a endolisina Φ2638 do bacteriófago de S. aureus.

Uma modalidade preferencial engloba uma molécula de ácido nucleico que compreende a dita primeira sequência de nucleotídeos como identificada na presente invenção e compreende ainda, como um domínio lítico, uma segunda e terceira sequências nucleotídicas, em que a dita segunda sequência codifica um domínio endopeptidase e a terceira sequência nucleotídica codifica um domínio amidase. Portanto, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico que compreende a dita primeira sequência de nucleotídeos, em que a dita molécula de ácido nucleico tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 1, ou em que a dita molécula de ácido nucleico compreende ainda uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um domínio lítico.

Um domínio da endopeptidase, como usado neste documento, preferencialmente cliva as pontes cruzadas de pentaglicina (Trayer, H. R. e Buckley, C. E. (1970) Molecular properties of lysostaphin, a bacteriolytic agent specific for Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 245, 4842-4846) que são encontradas na parede celular do gênero Staphylococcus, de preferência na parede celular de S. aureus, S. simulans e S. carnosus. Um domínio amidase, como usado neste documento, preferencialmente hidrolisa substratos contendo gama-glutamila. A funcionalidade e a atividade desses domínios em um polipeptídeo podem ser confirmadas por caracterização dos produtos de divagem após incubação dos ditos polipeptídeos contendo qualquer um desses domínios com peptidoglicano purificado. Preferencialmente, cada uma das sequências nucleotídicas que codificam o segundo ou terceiro domínio é de origem bacteriana ou bacteriófaga. Em uma modalidade preferencial, as ditas segunda e terceira sequências nucleotídicas se originam de um gene que codifica uma enzima selecionada do grupo consistindo em endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus, endolisina Φ11 do bacteriófago de S. aureus, endolisina ΦTwort do bacteriófago de S. aureus e lisostafina de S. simulans. Preferencialmente, a dita segunda sequência nucleotídica tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 14 ou 15 e a dita terceira sequência nucleotídica tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 18.

A invenção engloba todos os constructos, conforme definido neste documento, contendo os domínios funcionais de acordo com o significado na invenção em qualquer local possível dentro do constructo. Em uma modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, codifica um polipeptídeo com um domínio C-terminal codificado por uma primeira sequência de ácidos nucleicos, conforme identificado neste documento, que é demonstrada neste documento como codificando polipeptídeos funcionais capazes de alvejar o gênero Staphylococcus. É ainda mais preferencial uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, que compreende uma molécula de ácido nucleico que tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 9. A SEQ ID No: 9 compreende uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de ligação à parede celular homólogo ao SH3b C-terminal (ambos os domínios de Ply2638 codificados pela SEQ ID No: 1: Leul38 - Lys4 86) , uma segunda sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio homólogo da M23 glicil-glicina endopeptidase N-terminal (lisostafina madura codificada pela SEQ ID No: 33: Alai - Glyl54) e uma terceira sequência nucleotídica que codifica um domínio homólogo da amidase 2 central. Ele tem um tamanho teórico de 58,266 KDa. Um polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 9 difere da endolisina ó2638a do bacteriófago de S. aureus pelo fato de que o domínio M23 endopeptidase N-terminal é substituído por um domínio M23 endopeptidase de lisostafina de S. simulans. Foi demonstrado na presente invenção que um polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 9 demonstrou um aumento de pelo menos 20% de atividade lítica em comparação com a endolisina G>2 638a do bacteriófago de S. aureus, enquanto que a atividade lítica é mantida após liofilização e reconstituição. Em uma modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a dita primeira, segunda e terceira sequências nucleotídicas codifica um polipeptídeo que exibe uma atividade lítica de pelo menos 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2 vezes em comparação com uma atividade lítica da endolisina ó2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucléico que compreende a dita primeira, segunda e terceira sequências nucleotídicas codifica um polipeptídeo que exibe uma diminuição da atividade lítica de no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% após liofilização e reconstituição, conforme definido neste documento em comparação com o polipeptídeo recémpreparado, em que "recém-preparado" é definido neste documento como no máximo 2 dias de armazenamento em tampão de liofilização 1,63 mg/mL (Tris 50 mM, sacarose 500 mM, manitol 200 mM, polissorbato 20 0,05% + glicerol 50%) a -20 °C e descongelada imediatamente antes da avaliação da atividade lítica em um ensaio, conforme identificado neste documento.

A liofilização e a reconstituição é definida neste documento como a desidratação por liofilização e posterior reconstituição da amostra, pela adição de água. Em uma modalidade, a liofilização e reconstituição podem ser feitas por diãlise contra 3 trocas de alíquotas de 300 mL de tampão de liofilização (fosfato ou Tris 50 mM, sacarose 500 mM, manitol 200 mM, pH 7,4) e congelamento em fase gasosa de nitrogênio líquido. A liofilização pode ser feita ainda sob condições padrão, preferencialmente a -40 °C e sob vácuo a 75 mTorr durante 60 minutos, seguido por aumento da temperatura durante 5 horas até -10 °C e mais 60 minutos a -10 °C aos mesmos níveis de vácuo. Como etapa final, a temperatura é preferencialmente aumentada até 25 °C durante 10 horas. As amostras são reconstituídas por adição de água.

Em outra modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucleico, conforme definida neste documento, compreende, além da primeira, segunda e terceira sequências nucleotídicas acima identificadas, pelo menos uma duplicata idêntica ou heteróloga à primeira, segunda ou terceira sequência nucleotídica. Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, compreende, além da primeira, segunda e terceira sequências nucleotídicas, uma primeira sequência de nucleotídeos duplicata idêntica. Foi aqui demonstrado que a duplicação da primeira sequência de nucleotídeos, conforme definido neste documento, resulta em um polipeptídeo preferencialmente conforme codificado pela SEQ ID No: 20 que expõe pelo menos 5, 10, 20, 30, 20 ou 40% de atividade lítica aumentada em comparação com uma atividade lítica de um polipeptídeo de referência codificado por uma molécula de ácido nucleico sem tal primeiro domínio duplicado, ou em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID No: 1, conforme avaliado em um ensaio conforme identificado neste documento, mais especificamente usando üma quantidade equimolar de um polipeptídeo e um tampão PBS modificado contendo NaCl 200, 300, 400 ou 1000 nM. Esta modalidade também engloba uma molécula de ácido nucleico heterólogo em que a dita primeira, segunda e terceira sequências nucleotídicas se originam da mesma fonte sendo o bacteriófago Φ2638a de S. aureus, a dita molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência que tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 10"% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e uma primeira duplicata idêntica ou heteróloga adicional. É também preferível uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, que compreende uma sequência nucleotídica que tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 6 e 20.

Em outra modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, compreende uma quarta sequência nucleotídica que codifica um domínio CHAP (amido-hidrolases/peptidases dependentes de cisteína e histidina). Mais preferencialmente, a dita quarta sequência nucleotídica se origina da endolisina do bacteriófago Φ11 de S. aureus ou do bacteriófago 4>Twort de S. aureus. Ainda mais preferencialmente, a dita quarta sequência nucleotídica tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 18 ou com a SEQ ID No: 19. Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico, conforme definido neste documento, compreende uma sequência nucleotídica que tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos: 5 ou 7. Foi demonstrado neste documento que uma molécula que compreende as ditas primeira, segunda, terceira e quarta sequências nucleotídicas, conforme definido pela SEQ ID No: 5, codifica um polipeptideo exibindo uma atividade lítica maior e/ou deslocada, preferencialmente um menor pH ideal em comparação com um polipeptideo codificado por um constructo sem o dito quarto domínio e/ou em comparação com a endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID No: 1. A atividade lítica foi avaliada espectrofotometricamente e sob as condições anteriormente definidas neste documento. Preferencialmente, o dito polipeptideo apresenta um aumento na atividade lítica de pelo menos 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2 vezes em comparação com uma atividade lítica de um polipeptideo codificado por um polipeptideo de referência, diferindo do dito polipeptideo apenas em relação à falta do dito quarto domínio ou em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID NO: 1. Ainda mais preferencialmente, o dito polipeptideo apresenta um aumento na atividade lítica de pelo menos 2,5 vezes em comparação com o polipeptideo de referência definido ou com um polipeptideo codificado pela SEQ ID No: 1.

Um pH ótimo deslocado ou reduzido é definido neste documento como um deslocamento ou diminuição da atividade lítica ideal para um valor de pH mais baixo, onde a força iônica é mantida constante. A atividade lítica é preferencialmente avaliada espectrofotometricamente, conforme definido neste documento. Preferencialmente, o pH ideal de uma atividade lítica é reduzido de 0,5 a 1 unidade de pH em comparação com uma atividade lítica de um polipeptídeo codificado por um polipeptídeo de referência diferindo do dito polipeptídeo somente em relação à falta do dito quarto domínio ou em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID NO: 1.

A invenção refere-se preferencialmente a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma primeira, segunda, terceira e, opcionalmente, quarta sequências nucleotídicas conforme identificadas neste documento que codificam um polipeptídeo que tem a mesma atividade lítica e/ou o mesmo pH ideal ou que tem uma maior atividade lítica e/ou um menor pH ideal em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificado pela SEQ ID NO: 1. O mesmo sendo identificado neste documento como nenhuma diferença detectável ao usar o ensaio, conforme identificado neste documento, ou um método conhecido para a pessoa versada na técnica. A presente invenção também refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma primeira, segunda e quarta sequências nucleotídicas conforme identificadas neste documento, que codificam um polipeptídeo que tem a mesma atividade lítica e/ou o mesmo pH ideal ou que tem uma maior atividade lítica e/ou um menor pH ideal em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificado pela SEQ ID NO: 1. A presente invenção também refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma primeira, terceira e quarta sequências nucleotídicas conforme identificadas neste documento, que codificam um polipeptídeo que tem a mesma atividade lítica e/ou o mesmo pH ideal ou que tem uma maior atividade lítica e/ou um menor pH ideal em comparação com uma atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificado pela SEQ ID NO: 1. Cada uma das sequências nucleotídicas identificadas neste documento, ou seja, a primeira, segunda, terceira e quarta sequências nucleotídicas que codificam o domínio individual de um polipeptídeo definido neste documento, pode ser montada por qualquer método usual conhecido para construção e montagem de fragmentos de ácidos nucleicos que são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e amplamente descritos na literatura (Sambrook, Maniatis et al. (1989) e na parte experimental ilustrada da divulgação. Em uma modalidade preferencial, uma primeira, segunda, terceira e/ou quarta sequências nucleotídicas são operavelmente ligadas entre si.

Portanto, uma molécula de ácido nucleico da invenção codifica um polipeptídeo, preferencialmente um polipeptídeo como identificado neste documento, que é capaz de se ligar ao gênero Staphylococcus por meio do domínio de ligação à parede celular codificado por uma primeira sequência de nucleotídeos, conforme definida neste documento, e/ou lisar a dita bactéria através de um domínio endopeptidase e/ou amidase e, opcionalmente, um domínio CHAP codificado por uma segunda, terceira e quarta sequência nucleotídica, respectivamente, conforme definido neste documento.

Em uma modalidade preferencial, uma molécula de ácido nucleico da invenção, conforme definida neste documento, compreende opcionalmente uma sequência que codifica uma etiqueta para facilidade de purificação. Preferencialmente, a dita etiqueta é selecionada, mas não se limita, ao grupo consistindo em uma etiqueta-FLAG, etiqueta poli(His), etiqueta HA e etiqueta Myc. Mais preferencialmente, a dita etiqueta é uma etiqueta 6xHis. Ainda mais preferencialmente, a dita etiqueta é uma etiqueta 6xHis N-terminal idêntica à SEQ ID No: 43.

Polipeptídeo

Em um outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucleico, como anteriormente identificado neste documento. Este polipeptídeo compreende um domínio de ligação à parede celular e, preferencialmente, um domínio endopeptidase e/ou um domínio amidase, conforme definido na seção anterior.

Um domínio polipeptídeo compreendido pela presente invenção tem, preferencialmente, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 OU 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 ou 42. Preferencialmente, um domínio de polipeptídeo englobado pela presente invenção compreende preferencialmente um ou mais ligantes putativos e tem 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e/ou 58.

Um polipeptídeo compreendido pela presente invenção tem, preferencialmente, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 21, 25, 26, 27, 29 e/ou 32. Mais preferencialmente, um polipeptídeo compreendido pela presente invenção tem, preferencialmente, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 25, 26, 27, 29 e/ou 32 com a SEQ ID NO: 25, 26, 27, 29 e/ou 32.

Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo tem preferencialmente pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 21, 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e/ou 42 codificada por um constructo de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No: 1, 5, 6, 7, 9, 20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectivamente. Mais preferencialmente, um polipeptídeo da presente invenção tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e/ou 42 codificada por um constructo de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID No: 5, 6, 7, 9, 20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e/ou 19, respectivamente.

Um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ter um comprimento de pelo menos 94, 95, 96, 100, 120 ou 110 aminoácidos, de preferência 127 aminoácidos e/ou no máximo 1500, 1400, 1300 ou 1200 aminoácidos. Preferencialmente, o dito polipeptídeo tem um comprimento de pelo menos 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510 ou 520 aminoácidos e/ou no máximo 1500, 1400, 1300 ou 1200 aminoácidos. É também preferencial um polipeptídeo de acordo com a invenção com um comprimento de pelo menos 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710 ou 720 aminoácidos e/ou no máximo 1500, 1400, 1300 ou 1200 aminoácidos.

Uma sequência de aminoácido ou nucleotídica, englobada pela presente invenção, pode ser derivada de uma das sequências conforme identificadas neste documento por substituição, inserção, eliminação ou adição de um, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, respectivamente. Uma sequência de aminoácidos englobada pela presente invenção pode ser derivada de uma das sequências conforme identificadas neste documento, pela adição de mais aminoácidos N ou C-terminais ou porções químicas para aumentar a estabilidade, solubilidade e atividade.

Uma modalidade da invenção compreende um polipeptídeo variante. Um polipeptídeo variante pode ser uma forma de ocorrência não natural do polipeptídeo. Uma variante de polipeptídeo pode ser diferente em alguma forma manipulada do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa. Uma variante pode ser feita por mutagênese direcionada a sítio a partir da sequência nucleotídica da SEQ ID No: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e/ou 20. Preferencialmente, um variante de polipeptídeo contém mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. De acordo com uma modalidade preferencial, uma variante de polipeptídeo exibe ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou uma atividade lítica que é igual ou melhor em comparação com a ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou a atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID NO: 1. Uma variante de polipeptídeo da invenção é preferencialmente uma variante da SEQ ID No: 21, 25, 26, 27, 29, 32, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e/ou 42. Uma variante de polipeptídeo com ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou atividade lítica melhorada é um polipeptídeo que exibe uma ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus aureus e/ou atividade lítica igual ou melhor em comparação com a ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou atividade lítica da endolisina Φ2638a do bacteriófago de S. aureus codificada pela SEQ ID NO: 1 medido em um ensaio conforme anteriormente identificado neste documento.

De acordo com outra modalidade preferencial, uma sequência nucleotídica da invenção é uma variante das sequências nucleotídicas da SEQ ID No: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. As variantes da sequência nucleotídica podem ser utilizadas para a preparação de uma variante de polipeptídeo, conforme definido anteriormente.
Uma variante do ácido nucleico pode ser um fragmento de qualquer uma das sequências de nucleotldeos, como definido acima. Uma variante de ácido nucleico também pode ser sequência nucleotídica que difere da SEQ ID No: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, em virtude da degeneração do código genético. Uma variante de ácido nucleico pode também ser uma variante alélica da SEQ ID No: 1, 5, 6, 7, 9, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e/ou 20. Uma variante alélica denota qualquer uma das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. Uma variante de ácido nucleico preferencial é uma sequência nucleotídica que contém mutação/mutações silenciosas. Alternativamente ou em combinação, uma variante de ácido nucleico pode ser também obtida pela introdução de substituições nucleotídicas que não geram outra sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela sequência nucleotídica, mas que corresponde ao uso do códon do organismo hospedeiro destinado à produção do polipeptídeo da invenção. De acordo com uma modalidade preferencial, uma variante de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que ainda exibe a sua função biológica. Mais preferencialmente, uma variante de sequência nucleotídica codifica um polipeptídeo que exibe ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou uma atividade lítica. Ainda mais preferencialmente, uma variante de ácido nucleico codifica um polipeptídeo com ligação ao peptidoglicano da parede celular de Stahpylococcus e/ou atividade lítica aumentada, conforme definido anteriormente. Ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo exibindo ligação ao peptidoglicano da parede celular de Staphylococcus e/ou atividade lítica aumentada podem ser isolados de qualquer microrganismo.

Todas essas variantes podem ser obtidas usando técnicas conhecidas pela pessoa versada na técnica, como a varredura da biblioteca por hibridização (procedimentos de southern blotting) sob condições de hibridização de baixa a média a alta para a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e/ou 20, ou uma variante da mesma que pode ser usada para projetar uma sonda. Condições de estringência baixa a média a alta significa pré-hibridização e hibridização a 42 °C em 5 X SSPE, SDS a 0,3% e DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, 200 pg/mL. Subsequentemente, a reação de hibridização é lavada três vezes durante 30 minutos cada, usando 2 x SSC, SDS a 0,2% e 55 °C, 65 °C ou 75 °C para estringências de baixa a média ou alta.

As informações da sequência, como fornecido neste documento, não devem ser interpretadas de maneira tão restrita em relação à necessidade de inclusão de bases erroneamente identificadas. A pessoa versada na técnica é capaz de identificar tais bases erroneamente identificadas e sabe como corrigir tais erros.

Constructo de ácido nucleico

Em um outro aspecto, é fornecido um constructo de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucléico, como identificada na seção anterior. Esse constructo de ácido nucleico pode compreender uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação à parede celular, possivelmente compreendendo ainda uma segunda, terceira e, opcionalmente, quarta sequência, conforme definido na seção anterior.

A invenção refere-se também a um vetor de expressão que compreende um constructo de ácido nucleico da invenção. Preferencialmente, um vetor de expressão compreende uma sequência nucleotídica da invenção, que é operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle, que direcionam a produção ou a expressão do polipeptídeo codificado em uma célula, um indivíduo ou um sistema de expressão isento de células.

Um vetor de expressão pode ser considerado um vetor de expressão recombinante. Esse vetor pode ser constituído por um plasmídeo, um cosmídeo, um bacteriófago ou um vírus que é transformado pela introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção. Tais vetores de transformação de acordo com o organismo hospedeiro a ser transformado, são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e são amplamente descritos na literatura.

Um outro assunto da invenção é um processo para a transformação de organismos hospedeiros, pela integração de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, cuja transformação pode ser realizada por qualquer meio conhecido adequado que tenha sido amplamente descrito na literatura especializada e, em particular, nas referências citadas no presente pedido, mais particularmente pelo vetor de acordo com a invenção.

Célula

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula que compreende um constructo de ácido nucleico ou um vetor de expressão da invenção, conforme definido neste documento. Uma célula pode ser qualquer célula microbiana, procariota ou eucariota que é adequada para a expressão do polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade preferencial, a dita célula é uma E. coli. Em uma modalidade ainda mais preferencial, a dita célula é E. coli CLlblue MRF.

Método

Em um outro aspecto, é fornecido um método para produzir, opcionalmente purificar e opcionalmente liofilizar um polipeptídeo, conforme definido na seção anterior. O dito método compreendendo as etapas de:

i) produzir o dito polipeptídeo em uma célula que compreende um constructo de ácido nucleico conforme definido na seção anterior, opcionalmente
ii) purificar o dito polipeptídeo e, opcionalmente,
iii) liofilizar o dito polipeptídeo purificado.

Em uma modalidade preferencial, uma E. coli é usada na etapa i) para produzir um polipeptídeo usando tecnologias recombinantes. Mais preferencialmente, uma E. coli XLblueMRF é usada na etapa i) para produzir um polipeptídeo usando tecnologias recombinantes. De preferência, na etapa ii) , colunas de cromatografia IMAC e Econo-Pac (Biorad) empacotadas com 5 mL de pérolas de agarose quelantes de níquel de baixa densidade (pérolas ABT) em combinação com fluxo de gravidade é usada para purificar os ditos polipeptídeos (recombinantes etiquetados com 6xHis). O polipeptídeo eluído pode ser dialisado durante 2, 4 e 12 horas contra 3 x 1L de tampão de liofilização, o dito tampão compreendendo preferencialmente fosfato 50 mM, sacarose 500 mM, manitol 200 mM, polissorbato 20 0,005%, pH 7,4.

Método

Em um outro aspecto, a invenção refere-se também a um método para produzir um polipeptídeo com maior atividade lítica pelo tratamento de um polipeptídeo, conforme definido na seção anterior, ou conforme é obtido pelo método descrito acima. O dito tratamento compreende substituir um íon metálico divalente para aumentar uma atividade lítica em comparação com um polipeptídeo não tratado, de preferência o dito método compreendendo as etapas de:

i) dialisar o dito polipeptídeo contra um buffer que compreende um composto quelante;
ii) dialisar o dito polipeptídeo contra um tampão contendo íon metálico divalente, preferencialmente o dito íon metálico divalente sendo selecionado do grupo consistindo em Co2+, Cu2+, Mn2+ e Zn2+.

Um "composto quelante" é aqui definido como um composto que se liga a um íon metálico. Compostos quelantes bem conhecidos são o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o ácido etilenoglicoltetracético (EGTA). Preferencialmente, o EDTA é usado na etapa i) do método da invenção.

Preferencialmente, o íon metálico divalente de etapa ii) é selecionado do grupo consistindo em Mn2+, Co2+ e Cu2, mais preferencialmente o dito íon metálico divalente é selecionado do grupo consistindo em Mn2+ e Co2+, ainda mais preferencialmente o dito íon metálico divalente é Mn2+.

Foi demonstrado que a substituição de um íon metálico divalente por qualquer um dos acima definidos resultou em um aumento de uma atividade lítica de Ply2638 de 2 a 2,5 vezes. A atividade lítica foi avaliada espectrofotometricamente, conforme definido neste documento. Preferencialmente, o dito método leva a um aumento em uma atividade lítica pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2 vezes em comparação com um polipeptídeo não tratado. Ainda mais preferencialmente, o método leva a um aumento em uma atividade lítica de pelo menos 2,5 vezes. Preferencialmente, o polipeptídeo tratado exibe um aumento de 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 vez na atividade lítica em comparação com o polipeptídeo não tratado codificado pela SEQ ID No: 1.

Composição

Em um outro aspecto, é fornecida uma composição que compreende uma molécula de ácido nucleico, um constructo de ácido nucleico ou um polipeptídeo, vetor ou célula, conforme identificado neste documento, ou que pode ser obtida por um método descrito neste documento. Preferencialmente, a invenção refere-se a uma composição exibindo uma atividade lítica, conforme definido neste documento. Mais preferencialmente, a dita composição é para uso como um medicamento. Este medicamento é preferencialmente utilizado para o tratamento, prevenção e/ou retardo de uma doença infecciosa. A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica ou clínica. Ainda mais preferencialmente, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou clínica para o tratamento de uma doença infecciosa. Preferencialmente, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou clínica para o tratamento de uma doença infecciosa causada por uma bactéria, preferencialmente uma bactéria do gênero Staphylococcus, mais preferencialmente uma bactéria da espécie S. aureus. Preferencialmente, a dita doença infecciosa é uma infecção de pele, mastite, pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico (TSS), sepsia, septicemia, bacteremia ou osteomielite. Preferencialmente, a dita infecção de pele é selecionada a partir do grupo de espinhas, impetigo, furúnculos (boils), furúnculos (furuncles), celulite, foliculite, carbúnculos, síndrome da pele escamosa dimensionado e abcessos.

Uma composição, conforme definido neste documento, pode incluir uma mistura de diferentes moléculas de ácidos nucleicos, constructos de ácido nucleico, polipeptídeos, vetores e/ou células, como identificados neste documento, ou podem ser obtidos por um método descrito neste documento.

Uma composição, conforme definido neste documento, pode incluir um ou mais ingredientes ativos adicionais. Ativo sendo preferencialmente definido neste documento como apresentando uma atividade lítica, conforme definido neste documento. Preferencialmente, o dito um ou mais ingredientes ativos adicionais são selecionados do grupo consistindo em um bacteriófago ou fago e antibiótico. Um fago englobado neste documento pode ser qualquer fago conhecido na literatura. Preferencialmente, um fago englobado pela presente invenção pertence, mas não se limita, a uma família da lista que compreende Myoviridae, Siphoviridae e Podoviridae. Um fago englobado pela presente invenção também pode pertencer a uma família da lista consistindo em Tectiviridae, Corticoviridae, Lipothrixviridae, Plasmaviridae, identificado, Fuselloviridaé, Inoviridae, Mimiviridae, Leviviridae e Cystoviridae. Mais preferencialmente, o dito um ou mais ingredientes ativos compreende e/ou consiste de lisostafina, preferencialmente de lisostafina de S. simulans com 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 34, mais preferencialmente lisostafina de S. simulans da SEQ ID No: 34.). Ainda mais preferencialmente, o dito um ou mais ingredientes ativos compreendem e/ou consistem em um ou mais diferentes bacteriófagos e lisostafina, preferencialmente, um ou mais diferentes fagos e lisostafina de S. simulans (SEQ ID NO: 34) . Dentro do contexto da presente invenção, uma combinação de ingredientes ativos, conforme definido neste documento, pode ser administrada sequencialmente e/ou simultaneamente.

Uma composição, conforme definido neste documento, pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição é preferencialmente para uso como um medicamento ou como um de preferência para o uso como um fãrmaco ou um medicamento. Preferencialmente, o medicamento é usado no tratamento de doenças infecciosas. Uma composição pode estar sob a forma líquida, sólida, semilíquida ou semissólida.

Uma composição da invenção pode ser usada para tratar animais, incluindo humanos, infectados com S. aureus. Qualquer via de administração adequada pode ser utilizada para administrar a dita composição, incluindo, mas sem se limitar, a: oral,, aerossol ou outro dispositivo para administração aos pulmões, spray nasal, vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, vaginal, retal, tópica, por punção lombar, intratecal e por aplicação direta no cérebro e/ou meninges.

Uma composição que compreende uma molécula de ácido nucleico, um constructo de ácido nucleico, um polipeptídeo, um vetor ou uma célula, conforme identificado neste documento ou obtenível por um método descrito neste documento é preferencialmente considerado como sendo ativo, funcional ou terapeuticamente ativo, ou capaz de tratar, prevenir e/ou retardar uma doença infecciosa quando ela diminui a quantidade de um gênero de Staphylococcus presente em um paciente ou em uma célula do dito paciente, ou em uma linhagem celular ou em um sistema in vitro de células livres e, de preferência, isso significa que 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos da quantidade inicial de um gêneros Staphylococcus é ainda detectável. Preferencialmente, nenhum gênero Staphylococcus é detectável. Neste parágrafo, a expressão "quantidade de gênero de Staphylococcus" significa preferencialmente gênero de Staphylococcus vivo. O gêneros Staphylococcus pode ser detectado usando técnicas padrão conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, como técnicas imuno-histoquímicas utilizando anticorpos específicos contra Staphylococcus, testes de coagulase em tubo de ensaio que detectam a estafilocoagulase ou "coagulase livre", detecção de proteínas de superfície, tais como o fator de aglutinação (teste de coagulase de lâmina) e/ou proteína A (testes de látex comercial) . Os gêneros de Staphylococcus vivos podem ser detectados usando técnicas padrão conhecidas pela pessoa versada na técnica, como técnicas microbiológicas de cultura bacteriana e/ou reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real quantitativa para avaliar o mRNA bacteriano.

A dita diminuição é preferencialmente avaliada em um tecido ou em uma célula de um indivíduo ou paciente em comparação à quantidade presente no dito indivíduo ou paciente antes do tratamento com a dita composição ou polipeptídeo da invenção. Alternativamente, a comparação pode ser feita com um tecido ou célula do dito indivíduo ou paciente que ainda não foi tratado com a dita composição ou polipeptídeo no caso do tratamento local.

Uma composição que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um constructo de ácido nucleico, conforme identificada neste documento, ou que pode ser obtida por um método descrito neste documento pode ser administrada a um paciente ou de uma célula, tecido ou órgão do dito paciente por pelo menos uma semana, um mês, seis meses, um ano ou mais.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição não clínica que apresenta uma atividade de ligação e/ou lítica conforme definido neste documento. Preferencialmente, a invenção refere-se a um antimicrobiano. Preferencialmente, a invenção refere-se a um antimicrobiano para lisar uma bactéria, de preferência uma bactéria do gênero Staphylococcus, mais preferencialmente uma bactéria da espécie S. aureus. Preferencialmente, a invenção refere-se a um antimicrobiano como conservante de alimento ou desinfetante.

Uso

Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo que compreende domínios codificados por uma primeira, segunda, terceira e, opcionalmente, quarta sequência de ácidos nucleicos, conforme definido neste documento, uma molécula de ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo, um construeto que compreende tal molécula de ácido nucleico, um vetor que compreende tal constructo, uma célula que compreende tal vetor e/ou uma composição que compreende qualquer um dos itens acima, preferencialmente como antimicrobiano. Preferencialmente, a invenção refere-se a um antimicrobiano para lisar uma bactéria, preferencialmente uma bactéria do gênero Staphylococcus, mais preferencialmente uma bactéria da espécie S. aureus. Preferencialmente, a invenção refere-se a um antimicrobiano como conservante de alimento ou desinfetante. Possivelmente, tais conservantes de alimentos ou desinfetantes são usados em conjunto com outros agentes antimicrõbianos. Preferencialmente, tais conservantes de alimentos ou desinfetantes são usados juntamente com um ou mais ingredientes ativos adicionais, conforme definido neste documento. Preferencialmente, o dito um ou mais ingredientes ativos adicionais são selecionados do grupo consistindo em um bacteriófago ou fago e antibiótico, conforme definido neste documento.

O polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor, célula e/ou composição acima referenciado pode ser aplicado sobre ou em produtos alimentícios e/ou em vários locais físicos a serem desinfectados, por uma série de meios incluindo, mas sem se limitar, a mistura do dito polipeptídeo ou célula contendo polipeptídeo da invenção nos produtos alimentícios, pulverização do dito polipeptídeo e/ou célula contendo o polipeptídeo da invenção sobre os gêneros alimentícios ou locais físicos a serem desinfectados.

Um polipeptídeo da invenção pode ser isolado de uma célula ou uma célula contendo o dito polipeptídeo da invenção pode ser diretamente aplicada ou administrada sem isolamento do dito polipeptídeo. Por exemplo, uma célula que produz um polipeptídeo da invenção poderia ser administrada a um indivíduo (ser humano ou animal) ou aplicada a uma superfície onde o polipeptídeo da invenção poderia ser secretado no alimento, sobre uma superfície ou no intestino do indivíduo. O polipeptídeo da invenção pode, então, se ligar e, opcionalmente, lisar células bacterianas, de preferência uma bactéria do gênero Staphylococcus, mais preferencialmente uma bactéria da espécie S. aureus, presente neste ambiente.

É adicionalmente englobado o uso de um polipeptídeo que compreende um domínio codificado por uma primeira sequência de ácidos nucleicos, conforme definido neste documento, uma molécula de ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo, um constructo que compreende tal molécula de ácido nucléico, um vetor que compreende tal constructo, uma célula que compreende tal vetor e/ou uma composição que compreende qualquer um destes, preferencialmente para detectar bactérias, mais preferencialmente para detectar bactérias do gênero Staphylococcus, mais preferencialmente uma bactéria da espécie S. aureus. Preferencialmente, o dito polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor, celular e/ou composição é usado em uma aplicação de diagnóstico. Possivelmente, o dito polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, constructo, vetor, célula e/ou composição é usado em conjunto com outros agentes da detecção.

Método

A invenção refere-se ainda a um outro aspecto para um método para tratar, retardar e/ou prevenir uma doença infecciosa através da administração de uma composição, como definido anteriormente neste documento. Todas as características deste método já foram definidas neste documento.

Definições Identidade de sequência

"Identidade de sequência" é definido neste documento como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (peptídeo, polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos (nucleotídeo, polinucleotídeo), conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequências entre as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, conforme for o caso, conforme determinado pelo emparelhamento entre as fitas de tais sequências. A "similaridade" entre duas sequências de aminoácidos é determinada comparando-se a sequência de aminoácidos e seus substitutos de aminoácidos conservados de um peptídeo ou polipeptídeo com a sequência de um segundo peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade preferencial, a identidade ou similaridade é calculada em relação a toda a SEQ ID NO, conforme identificado neste documento. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculados por métodos conhecidos, incluindo, mas sem se limitar, a aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. , Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed. , Academic Press, Nova iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G. , eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988) .

Métodos preferenciais para determinar a identidade são concebidos para fornecer a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo,. o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al. Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al. , J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O programa BLAST X é publicamente disponível junto à NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O algoritmo de Smith-Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.

Parâmetros preferenciais para comparação de sequências de polipeptídeo incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSSUM62, de Hentikoff e Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); Penalidade de Lacuna: 12; e Penalidade de Extensão de Lacuna: 89 Um programa útil com estes parâmetros é publicamente disponível como o programa "Ogap" de Genetics Computer Group localizado em Madison, WI. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros predefinidos para comparações de aminoácidos (juntamente com ausência de penalidade para lacunas da extremidade).

Parâmetros preferenciais para comparação de ácidos nucleicos incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: Correspondências = +10, Não correspondências = 0; Penalidade de Intervalo: 50; Penalidade de Comprimento de Intervalo: 48 Disponível como o programa Gap de Genetics Computer Group, localizada em Madison, Wis. Acima são fornecidos os parâmetros predefinidos para as comparações de ácidos nucleicos.

Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade dos aminoácidos, a pessoa versada na técnica pode também levar em consideração as chamadas substituições de aminoácidos "conservadoras", como será evidente para uma pessoa versada na técnica. Substituições de aminoácidos conservadoras referem-se à permutabilidade dos resíduos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas compreende glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais com hidroxila alifáticas compreende serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais .contendo mida compreende asparagina e glutamina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas compreende fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas é formado por lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupo de substituição de aminoácidos conservadores preferenciais são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Variantes de substituição da sequência de aminoácidos divulgada neste documento são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências divulgadas foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Preferencialmente, a mudança de aminoácido é conservadora. Substituições conservadoras preferenciais para cada um dos aminoácidos de ocorrência natural são as seguintes: Ala por ser; Arg por lys; Asn por gln ou his; Asp por glu; Cys por ser ou ala; Gln por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn ou gln; Ile por leu ou val; Leu por ile ou val; Lys por arg; gln ou glu; Met por leu ou ile; Phe por met, leu ou tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp ou phe; e Val por Ile ou Leu.

Constructo de ácido nucleico, transformação, vetor de expressão, sequências operacionalmente ligadas, de expressão e controle, polipeptideo Constructo

Uma molécula de ácido nucleico é representada por uma sequência nucleotídica. Um polipeptideo é representado por uma sequência de aminoácidos. Um constructo de ácido nucleico é definido como uma molécula de ácido nucleico que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que foi modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos que são combinados ou justapostos de forma que não existiria, de outra forma, na natureza. Uma molécula de ácido nucleico é representada por uma sequência nucleotídica. Opcionalmente, uma sequência nucleotídica presente em um constructo de ácido nucleico é operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle, que direcionam a produção ou a expressão dos ditos peptídeos disse ou polipeptídeos em uma célula ou em um indivíduo.

"Operavelmente ligado" é definido neste documento como uma configuração na qual uma sequência de controle é adequadamente colocada em uma posição em relação à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da invenção, de modo que a sequência de controle direciona a produção/expressão do peptídeo ou polipeptídeo da invenção em uma célula e/ou em um indivíduo.

"Operavelmente ligado" também pode ser utilizado para definir uma configuração na qual uma sequência é apropriadamente colocada em uma posição em relação à outra sequência que codifica um domínio funcional, de modo que um polipeptídeo quimérico é codificado em uma célula e/ou em um indivíduo.

Será compreendido que expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção do peptídeo ou polipeptídeo incluindo, mas sem se limitar, a transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.

A sequência de controle é definida neste documento como incluindo todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada de transcrição e tradução. Opcionalmente, um promotor, representado por uma sequência nucleotídica presente em um constructo de ácido nucleico é operavelmente ligados a outra sequência nucleotídica que codifica um peptídeo ou polipeptídeo, conforme identificado neste documento.

O termo "transformação", refere-se a uma mudança genética transitória ou permanente induzida em uma célula após a incorporação do novo DNA (ou seja, DNA exógeno à célula). Quando a célula é uma célula bacteriana, como é o caso da presente invenção, o termo geralmente se refere a um vetor extracromossômico autorreplicante que abriga uma resistência a antibiótico selecionável.

Um vetor de expressão pode ser qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido a processos de DNA recombinante e que pode causar a expressão de uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo da invenção em uma célula e/ou em um indivíduo. Para uso na presente invenção, o termo "promotor" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes ou ácidos nucleicos, localizados à montante em relação à direção de transcrição do sítio iniciador de transcrição do gene. Ele está relacionado com o sítio de ligação identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação da transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, mas sem se limitar, aos sítios de ligação do fator de transcrição, sítios de ligação da proteína ativadora e repressora e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas para uma pessoa versada na técnica para atuar diretamente ou indiretamente na regulação da quantidade de transcrição do promotor. Dentro do contexto da invenção, um promotor preferencialmente termina no nucleotídeo -1 do sítio de início da transcrição (TSS).

"Polipeptídeo" conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer peptídeo, oligopeptídeo, polipeptídeo, produto de gene, produto de expressão ou proteína. Um polipeptídeo consiste em aminoácidos consecutivos. O termo "polipeptídeo" compreende moléculas de ocorrência natural ou sintética.

Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações é usado no seu sentido não limitador para significar que os itens escritos após a palavra estão incluídos, mas os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, o verbo "consistir" pode ser substituído por "para consistir essencialmente de", significando que um produto, uma composição, uma molécula de ácido nucleico ou um peptídeo ou polipeptídeo de um constructo de ácido nucleico, vetor ou célula, conforme definido neste documento, pode compreender componente(s) adicional/adicionais além daqueles especificamente identificados: o(s) dito(s) componente(s) adicional/adicionais não alterando a característica única da invenção. Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um dos elementos está presente, a menos que o contexto claramente diga que existe um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma", portanto, geralmente significa "pelo menos um".

Todas as patentes e referências na literatura citadas no presente relatório descritivo são por meio deste documento incorporadas por referência na totalidade.

Os exemplos a seguir são dados apenas para fins ilustrativos e não devem se destinar a limitar o escopo da presente invenção sob qualquer aspecto.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1. Relação linear da atividade da Ply2638 (SEQ ID No: 21 codificada pelo SEQ ID No: 44) contra células SA2638/2854 de S. aureus dependente da concentração de endolisina. Os ensaios foram realizados sob condições padrão (tampão PBS pH 7,4, cloreto de sódio 12 0 mM) em ensaios de lise fotométricos. A atividade máxima foi determinada a partir da primeira derivada dos ajustes de regressão das curvas de lise sigmoidais, calculadas com o software SigmaPlot. As barras de erro representam o desvio padrão calculado a partir de experimentos técnicos em triplicata.

A Figura 2. Influência dos cátions divalentes sobre a atividade lítica de Ply2638 (SEQ ID No: 21, codificado pela SEQ ID No: 44) . A enzima foi tratada com subsequente substituição dos ions metálicos por diálise contra tampão MOPS contendo MgCl2, CaCl2, ZnCl2, CUCl2, COCl2 ou MnSO4. Ply2638 dialisado contra tampão MOPS omitindo o tratamento com EDTA serviu como referência. As barras de erro representam o desvio padrão calculado a partir de experimentos técnicos em triplicata.

A Figura 3. Atividade lítica de Ply2638 50 nM (SEQ ID No: 21, codificado pela SEQ ID No: 44) em células SA2638/2854 de S. aureus após a liofilização e reconstituição. A atividade foi medida em um ensaio de redução de turbidez sob condições padrão. O tampão de liofilização foi utilizado como controle. A enzima com triplo dominio recupera a atividade lítica completa após a liofilização.

A Figura 4. Atividade lítica de M23-LST_Ami2638_CBD2638 50 nM (SEQ ID No: 29, codificada pela SEQ ID No: 48) em células SA2638/2854 de S. aureus após a liofilização e reconstituição (indicado como liofilizado) em comparação com M23-LST_Ami2638_CBD2638 recém-preparada (SEQ ID No: 29, codificada pela SEQ ID No: 48) e Ply2638 (SEQ ID No: 21, codificada pela SEQ ID No: 44). O tampão de liofilização foi utilizado como controle. A atividade foi medida em um ensaio de redução de turbidez sob condições padrão. A enzima com triplo domínio recupera a atividade lítica completa após a liofilização.

A Figura 5. Atividade relativa de lisostafina (LST; SEQ ID No: 34, codificada pela SEQ ID No: 33) e derivados de Ply2638 (SEQ ID No: 31, 30, 29, 21 e 24, codificada pela SEQ ID No: 11, 10, 48, 44 e 4, respectivamente) na dependência da concentração. A atividade de LST em 50 nM foi definida como referência. Todos os ensaios foram realizados sob condições padrão (37 °C, pH 7,4 e concentração de cloreto de sódio de 120 mM) usando células de substrato de S. aureus SA2638/2854 de estoque congelado.

A Figura 6. Atividades relativas em vários valores de pH (diagrama à esquerda) e concentrações de cloreto de sódio (diagrama à direita) das variantes truncada e retroajustada (com domínios PlyTw) determinado em ensaios de redução de turbidez. O truncamento da enzima por um dos dois domínios catalíticos resultou em atividades prejudicadas. A duplicação da CBD (M23_Ami_SH3b_SH3b; SEQ ID No: 32, codificada pela SEQ ID No: 49) acelera a lise em valores de pH básicos e concentrações salinas elevadas. O retroajuste de Ply2638 com o domínio CHAP11 resulta em uma enzima que presume-se atacar três ligações diferentes na camada de peptidoglicanos do Staphylococcus. Isto deslocou o pH ótimo para condições ligeiramente ácidas e melhorou a atividade antibacteriana. No entanto, a estabilidade da proteína das enzimas quiméricas permanece um desafio. A velocidade máxima da lise de Ply2638 em condições padrão (concentração de cloreto de sódio de 12 0 mM, pH 7,4) foi definida como referência. As barras representam a média dos ensaios em triplicta, o desvio-padrão não é mostrado: (CHAP_M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 25, codificado pela SEQ ID NO: 45; Ami_M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 26, codificado pela SEQ ID NO: 46; M23_Ami_SH3b_SH3b = SEQ ID NO: 32, codificado pela SEQ ID NO: 49; M23_Ami_SH3b = SEQ ID NO: 21, codificado pela SEQ ID NO: 44; Ami_SH3b = SEQ ID NO: 22, codificado pela SEQ ID NO: 2; M23_SH3b = SEQ ID NO: 23, codificado pela SEQ ID NO: 3).

A Figura 7: Atividade das enzimas de domínio quádruplo de 50 nM (SEQ ID Nos: 27 e 28, codificadas pelas SEQ IDs Nos: 47 e 8, respectivamente) , Ply2638 (SEQ ID No: 21, codificada pela SEQ ID No: 44) e liosotafina (SEQ ID No: 34, codificada pela SEQ ID No: 33) contra o uso de células do substrato de S. aureus SA2638/2854 sob condições padrão. O tampão de liofilização foi utilizado como controle. As enzimas do domínio quádruplo foram construídas pela combinação dos domínios de Ply2638, PlyTw e lisostafina.

Exemplos Materiais e métodos

Cepas bacterianas, condições de cultura, fagos e plasmídeos
E. coli XLlBlueMRF' e E. coli Sure foi usado para a superexpressão das proteínas de fusão 6x-His-tagged (SEQ ID No: 43). Ambas as cepas foram cultivadas em meio LB-PE a 30 °C com 100 pg/mL de ampicilina e 30 pg/mL de tetraciclina para a seleção do plasmídeo.

O lisado 2638A de fago foram usados como modelo para a amplificação do gene Ply2638A ou regiões que codificam os seus domínios. O domínio CHAPTw (SEQ ID No: 19) foi amplificado do lisado do fago Twort. O domínio da amidase/peptidase dependente de cisteína-histidina (CHAP) e o domínio amidase do fago 11 (SEQ ID NO: 18 e 17, respectivamente: Donovan, et al., 2006 e 2008/ Navarre et al. , 1999; Sass e Bierbaum 2007) foram ampliados de um vetor pet21a contendo o gene da autolisina phill, um presente de Donovan, D.M.. O plasmídeo LT1215 contendo a sequência de lisostafina madura (SEQ ID No: 33) foi usado como molde para a amplificação do domínio M23-LST (SEQ ID No: 15) e CWT-LST (SEQ ID No: 13).

O vetor pQE-30 (número de catálogos: 32915, Qiagen, Hilden, Alemanha; SEQ ID NO: 50) foi usado como vetor de clonagem e expressão para a produção de proteínas de fusão recombinantes marcadas com 6x-His em E. coli XLlBlueMRF' ou E. coli Sure, respectivamente.

Técnicas de DNA e procedimentos de clonagem

Técnicas padrão, de acordo com Sambrook, Maniatis et al. (1989) foram utilizadas para clonagem de genes individuais e para a criação de proteínas da fusão, a mistura de enzimas de PCR de alta fidelidade (Fermentas) foi utilizada nas reações de PCR. As concentrações de DNA foram determinadas com um espectrofotômetro (espectrofotômetro NanoDrop ND-1000).

O pHP12638 é construído pela inserção da sequência que codifica Ply2638 (SEQ ID No: 1) Meti - Lys486 nos sítios BamHI - Sail de pQE30 (SEQ ID No: 50) . O constructo pHP12638-P12638 tem a mesma sequência consecutivamente inserida nos sítios BamHI - Saci - Sail. CHAPll (SEQ ID No: 18), Amill (SEQ ID No: 17) e CHAP_Amill foram introduzidos no N-terminal em pHPL2638A digerida com BamHI. Antes da reação de ligação, o vetor foi desfosforilado usando fosfatase alcalina de camarão (SAP, Fermentas) . pHM23_CBD2638 (SEQ ID No: 3) e pHM2 3-263 8_Ami263 8_CBD2638_CBD2638 (SEQ ID No: 49) foram construídos por uma substituição da região codificadora de GFP do vetor pHGFP_CBD2638A_c (SEQ ID No: 59) com as respectivas inserções usando os sítios de restrição BamHI e SacI. pHM23-LST_Ami263 8_CBD2638 (SEQ ID No: 48) tem uma estrutura pQE-30 com a sequência codificante de lisostafina madura (SEQ ID No: 33) Alai - Glyl54 inserida em BamHI e SacI e a sequência parcial Ply2638 que codifica Leu138 - Lys486 nos sítios SacI e SalI. pHM23-LST_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID No: 11) tem as sequências de lisostafina madura (SEQ ID No: 33) Ala1 - Gly154 inseridas em BamHI e SacI e Ala1 -Lys246 nos sítios SacI e SalI de pQE30. pHLST-LST (SEQ ID No: 10) é construído da mesma forma com Ala1 - Lys246 repetidamente nos sítios BamHI - SacI e SacI - SalI. Nos plasmídeos que codificam os constructos de domínio quádruplo pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CBD2638 (SEQ ID No: 47) e pHCHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT-LST (SEQ ID No: 8), os domínios são diretamente fundidos através de PCR de extensão de sobreposição de união (SOE) e inseridos em nos sítios BamHI e SalI de pQE30. Em ambos os constructos, as regiões de fronteira dos domínios individuais (CHAPTw, SEQ ID NO: 19: Met1 - Ile140, Ami2638, SEQ ID NO: 16: Lys141-Gly358 da SEQ ID NO: 1, CBD2638, SEQ ID NO: 12 : Trp393- Lys486 de SEQ ID NO: 1, M23-LST, SEQ ID NO: 15: Ala1 - Gly154 de SEQ ID NO: 33, CWT-LST, SEQ ID NO: 13: Trp155 - Lys246 de SEQ ID NO: 33) foram determinadas com bioinformática (dados não publicados). Os plasmídeos com sequências repetitivas foram transferidos para a cepa de E.coli Sure, com todos os outros plasmídeos na E. coli XLIBlueMRF".

Expressão e purificação de proteínas de fusão recombinantes

A superexpressão de proteínas e a purificação parcial foi essencialmente feita como descrito anteriormente por terceiros (Loessner et al., 1996, Schmelcher et al, 2010). Em resumo, E. coli com plasmídeo foram cultivadas em 250 mL de meio LB modificado (triptose 15 g/L, extrato de levedura 8 g/L, NaCl 5g/L, pH 7,8) a uma densidade óptica a 600 nm (OD600nm) de 0,4 a 0,6 e induzidos com IPTG 1 mM. As células foram adicionalmente incubadas durante 4 horas a 30 °C, ou 18 horas a 20 °C, resfriadas até 4 °C e coletadas por centrifugação. Os péletes celulares foram suspensos em 5 mL de tampão de imobilização (NaH2PO4 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM, polissorbato 20 0,1%, pH 7,4). O conteúdo citosólico da E. coli contendo proteínas recombinantes solúveis foi liberado por uma dupla passagem através de uma Prensa de Células Francesa (1200 psi, SLM Aminco, Urbana, IL, EUA) operada a 1200 psi. Outras etapas de processamento à jusante incluem a remoção de fragmentos celulares insolúveis por centrifugação, esterilização por filtração (membrana PES 0,2 pm, Millipore) e purificação por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) usando pacote de colunas MicroBiospin (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) com resina Ni-NTA Superflow de baixa densidade (Chemie Brunschwig AG, Basel, Suíça). As proteínas imobilizadas em NI-NTA foram lavadas por fluxo de gravidade na coluna com 5 a 10 volumes de coluna de tampão de imobilização. As frações proteicas foram em seguida eluídas com tampão de eluição (NaH2PO4 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 125 mM, polissorbato 20 0,1%, pH 7,4) e dialisadas contra duas mudanças de tampão de diálise (NaH2PO4 50 mM, NaCl 100 mM, polissorbato 2 0 0,1%, pH 7,4) . As concentrações de proteína foram definidas em um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000, corrigida para absorbância específica a 280 nm, conforme calculado a partir da sequência de aminoácido primária com software Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e estimadas para a pureza por SDS-PAGE. As alíquotas foram armazenadas a -20 °C, misturadas com 50% de glicerol.

Liofilização das proteínas recombinantes

Proteínas purificadas por IMAC foram dialisadas contra 3 alterações de alíquota de tampão de liofilização de 300 mL (fosfato 50 mM ou Tris, sacarose 500 mM, manitol 200 mM, pH 7,4) e congeladas em fase gasosa de nitrogênio líquido. A liofilização foi realizada a -40 °C e sob vácuo de 75 mTorr durante 60 minutos, seguido por aumento da temperatura durante 5 horas até -10 °C e mais 60 minutos a -10 °C, nos mesmos níveis de vácuo. Como etapa final, a temperatura foi aumentada até 25 °C durante 10 horas. As amostras foram reconstituídas antes de serem testadas em ensaios de lise pela adição de água.

Ensaio de ligação à parede celular

Como um ensaio padrão para determinar a capacidade de um CDB para direcionar uma fusão de GFP à superfície bacteriana e mediar a ligação firme ao ligante da parede celular, as seguintes condições são usadas: bactérias, de preferência S. aureus BB255, do final da fase log, são coletados por centrifugação, ressuspensos em 1/10 do volume de PBS-T (NaH2PO4 50 mM, NaCl 120 mM [pH 8,0], polissorbato 20 0,01%) e armazenados em gelo. Proteínas GFP-CBD, preferencialmente SEQ ID No: 64, codificadas pela SEQ ID No: 60, são diluídas no mesmo tampão até uma concentração de 400 nM (2 x GFP-CBD) e também armazenadas em gelo. Em um copo de microcentrífuga de 1,5 mL, 100 µL de células e 100 µL de GFP-CBD 2x são misturados e incubados em temperatura ambiente durante 5 min. As células são, em seguida, removias do sobrenadante por centrifugação em uma microcentrífuga (16000 g, 60 s). O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas duas vezes em 500 µL de tampão PBS-T. Para microscopia de fluorescência, o pélete foi finalmente ressuspenso em 50 µL de tampão. Para os ensaios com fluorômetro, o pélete é finalmente ressuspenso em 200 µL de PBS-T e transferido para um microplaca poço de microplaca. Ensaios quantitativos de fluorescência podem ser realizados usando um dispositivo de contador de múltiplos marcadores (Victor3, Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos) com microplacas estéreis, não tratadas e pretas, de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Como controle negativo, GFP pode ser usado.

Ensaios de fluorescência quantitativos

A dependência do pH e da salinidade em CBD2638 para a interação com ligante na superfície celular de S. aureus BB255 é investigada pela incubação de células a partir de um volume de 1 mL ajustado para uma ΟD600nm de 1 +/- 0,05 (~ 4 x 109 células) com 7,5 µg de proteína de fusão CBDS2638-GFP, SEQ ID No: 64, codificada pela SEQ ID No: 60. Esta razão de célula para proteína está próxima do ponto de saturação, conforme determinado em experimentos anteriores, e permite a detecção de variações na eficiência de ligação. A variação do pH é testada usando tampões citrato de pH 4,5 a 6,5 e tampões fosfato pH 6 a 9. Após incubação com a proteína GFP-CBD263 8 em tampão de pH, as células são lavadas com os respectivos tampões de pH, seguido por lavagem com PBS-T padrão (pH 8) . Por fim, as células são ajustadas até uma OD595nm = 0,3 para detectar a fluorescência de suspensões de 200 µL das mesmas com um contador de múltiplos marcadores Victor3. Experimentos semelhantes são realizados usando tampões preparados com concentrações crescentes de cloreto de sódio (NaH2P04, NaCl 0 a 1000 mM, polissorbato 20 0,1%, pH 6) .

A quantificação da capacidade de ligação de CBD de cepas de Staphylococcus com propriedades de superfície de célula modificadas é testada pelo registro de unidades de fluorescência relativas (RFU) de células mortas lavadas e aquecidas previamente incubadas com excesso de proteína GFP-CBD2638. A fluorescência de volumes iguais (200 µL) de células marcadas com GFP-CBD2638, ajustada até uma OD595nm = 0,3, é medida usando conjuntos de filtros apropriados em um dispositivo contador de múltiplos marcadores. A comparação e quantificação dos níveis de absorção de GFP-CBD2638 (SEQ ID No: 64, codificado pela SEQ ID No: 60), GFP-CBD2638-CBD2638 (SEQ ID NO 65 e/ou 66, codificados pela SEQ ID NO: 61 e 62, respectivamente), e GFP-CBD2638-CBD2638-CBD2638 (SEQ ID NO: 67, codificado pela SEQ ID NO: 63) em células BB255 de S. aureus e células tratadas com SDS é feita da mesma maneira.

Ensaios de lise

As células do substrato para ensaios de atividade lítica foram cultivadas até uma densidade óptica, a 600 nm (OD600) de 0,4, lavadas duas vezes com PBST pH 7,4 e ressuspensas em glicerol 15% contendo tampão PBS, pH 7,4, concentrando isto ao mesmo tempo 100 vezes. As células foram armazenadas a -20 °C. Para uso posterior em ensaios de ligação ou de atividade lítica, as células foram descongeladas, lavadas com PBS em pH 7,4 e diluídas até uma OD600 de 1 ± 0,05. Em ensaios de atividade lítica padrão, amostras de proteína foram diluídas até quantidades equimolares e distribuídas em placas de teste de cultura de tecido transparente com 96 poços (SPL life sciences, Pocheon, Coreia) . As células de substrato foram adicionadas até um volume final e a queda na densidade óptica, a 595nm (OD595nm), foi registrada durante cerca de 1 hora a 37 °C.

A atividade lítica de constructos retroajustados e de deleção de Ply2638 foi testada contra a cepa de propagação de fago 2638A de S. aureus SA2638/2854 de estoque congelado em ensaios de lise. Nós testamos a atividade em várias condições de tampão. Valores de pH de 4,6 a 9 em incrementos de 0,4 foram testados usando tampões citrato/fosfato (citrato 25 mM, fosfato 25 mM, NaCl 120 mM, pH 4,6 - 6,6) e tampões Tris/fosfato (Tris 25 mM, fosfato 25 mM, NaCl 120 mM). A atividade dos derivados de Ply2638A em concentrações salinas variando de 0 a 1000 mM de cloreto de sódio (em tampão fosfato 10 mM, pH 7,4) . Os derivados de Ply2638A foram diluídos até uma concentração final de 10 μΜ com MQ antes da sua aplicação em ensaios de Lise. Aqui, 4 µL de derivados de Ply263 8A 10 μΜ foram aplicados a 196 µL de suspensões de células de substrato usando uma pipeta multicanal, resultando em uma concentração de ensaio de 200 nM de proteína. As suspensões celulares de substrato foram preparadas a partir de estoques congelados, diluindo isto com pH ou tampões salinos e padronização espectrofotometricamente (Libra S22, Biochrom) até uma OD600 inicial de 1 ± 0,05. A diminuição da densidade óptica a 595 nm (OD595) foi medida usando um instrumento contador de múltiplos marcadores Victor3 1420 (Perkin Elmer) durante 1 hora. As placas foram agitadas vigorosamente durante 1 segundo (órbita dupla, 0,1 mm de diâmetro) após cada leitura individual. Foi usado como controle positivo a lisostafina marcada com 6xHis N-terminal (HLST), lisostafina comercialmente disponível (E. coli recombinante originada, Sigma). Como controle negativo, aplicamos água MilliQ.

Influência de ions metálicos divalentes sobre a atividade de Ply2638

Ply2638 parcialmente purificado (SEQ ID No: 21) foi dialisado durante 2 horas contra tampão contendo EDTA (MOPS 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, polissorbato 20 0,005%, EDTA 10 mM) seguido por diálise contra um tampão que contém os respectivos íons metálicos divalentes (MOPS 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, polissorbato 20 0,005% e CaCl2 10 mM, MgCl2 10 mM, COCl2 1 mM, CuCl2 1 mM, MnSO4 1 mM ou ZnCl2 1 mM, respectivamente). As células utilizadas como substrato foram tratadas com SDS e lavadas com EDTA antes de uma aplicação em ensaios de lise padrão.

SEQ ID NO: 1 (Ply2638)

ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 2 (Ami2638_CBD2638 + 6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGGACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 3 (M23-2638_CBD2638 + 6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 4 (Ply2638-Ply2638 + 6x His e sítios de clonagem) )

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 5 (CHAP11_M23-2638_Ami2638_CBD2638)

ATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCTGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 6 (Ami11_M23-2638_Ami2638_CBD2638)

AAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCAGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 7 (CHAPTw_Ami2638_M23-LST-_BD2638)

ATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAAGACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 8 (CHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT-LST +6xHis e sítio de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGGATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTAA

SEQ ID NO: 9 (M23-LST_Ami2638_CBD2638)

GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 10 (LST_LST + 6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGGAGCTCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA

SEQ ID NO: 11 (M23-LST_M23-LST_CWT-LST +6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA

SEQ ID NO: 12 (CBD-2638)

TGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 13 (CWT-LST)

TGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA

SEQ ID NO: 14 (M23-2638)

ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGAT

SEQ ID NO: 15 (M23-LST)

GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATAT

SEQ ID NO: 16 ( Ami-2638)

GGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGT

SEQ ID NO: 17 (Ami- 11)

AAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCA

SEQ ID NO:18 (CHAP- 11)

ATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCT

SEQ ID NO:19 (CHAP- Twort)

ATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTATGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATT

SEQ ID NO:20 (M23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638)

ATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 21 (Ply2638)

MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 22 (Ami2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 23 (M23-2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 24 (Ply2638-Ply2638)

MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFWGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGVVIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 25 (CHAP11_M23-2638_Ami2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMWFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFWGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 26 (Ami11_M23-2638_Ami2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSKPQPKAVELKIIKDWKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFWGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 27 (CHAPTw_Ami2638_M23-LST_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSMKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVWWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 28 (CHAPTw_Ami2638_M23-LST_CWT-LST)

MRGSHHHHHHGSMKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVWWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ IP NO: 29 (M23-LST Ami2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGELLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 30 (LST_LST)

MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIKELAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ ID NO: 31 (M23-LST_M23-LST_CWT-LST)

MRGSHHHHHHGSAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGELAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ ID NO: 32 (M23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638)

MRGSHHHHHHGSMLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFVVGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 33 (LST)

GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAAACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGTCCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGACGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTACTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGA

SEQ ID NO: 34 (LST aa)

AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ ID NO: 35 (CBD-2638)

WKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 36 (CWT-LST)

WKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ ID NO: 37 (M23-2638)

MLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFWGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKD

SEQ ID NO: 38 (M23-LST)

AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGY

SEQ ID NO: 39 ( Ami-2638)

NKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDG

SEQ ID NO: 40 (Ami- 11)

NPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMD

SEQ ID NO: 41 (CHAP- 11)

MSIIMEVATMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMWFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRP

SEQ ID NO: 42(CHAP- Twort)

MKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDWVWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFI

SEQ ID NO 43 (Marcador 6xHis N-terminal)

MRGSHHHHHHGS

SEQ ID NO: 44 (Ply2638 + 6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 45 (CHAP11_M23-2638_Ami2638_CBD2638+6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCAAGCAAAATTAACTAAAAATGAGTTTATAGAGTGGTTGAAAACTTCTGAGGGAAAACAATTCAATGTGGACTTATGGTATGGATTTCAATGCTTTGATTATGCCAATGCTGGTTGGAAAGTTTTGTTTGGATTACTTCTAAAAGGTTTAGGTGCAAAAGATATTCCGTTCGCTAACAACTTCGACGGATTAGCTACTGTATACCAAAATACACCGGACTTCTTAGCACAACCTGGCGACATGGTGGTATTCGGTAGCAACTACGGTGCTGGATATGGTCACGTTGCATGGGTAATTGAAGCAACTTTAGATTACATCATTGTATATGAGCAGAATTGGCTAGGCGGTGGCTGGACTGACGGAATCGAACAACCCGGCTGGGGTTGGGAAAAAGTTACAAGACGACAACATGCTTATGATTTCCCTATGTGGTTTATCCGTCCGAATTTTAAAAGTGAGACAGCGCCACGATCAGTTCAATCTCCTACACAAGCACCTAAAAAAGAAACAGCTGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 46 (Ami11_M23-2638_Ami2638_CBD2638+6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCAAGCCACAACCTAAAGCAGTAGAACTTAAAATCATCAAAGATGTGGTTAAAGGTTATGACCTACCTAAGCGTGGTAGTAACCCTAAAGGTATAGTTATACACAACGACGCAGGGAGCAAAGGGGCGACTGCTGAAGCATATCGTAACGGATTAGTAAATGCACCTTTATCAAGATTAGAAGCGGGCATTGCGCATAGTTACGTATCAGGCAACACAGTTTGGCAAGCCTTAGATGAATCACAAGTAGGTTGGCATACCGCTAATCAAATAGGTAATAAATATTATTACGGTATTGAAGTATGTCAATCAATGGGCGCAGATAACGCGACATTCTTAAAAAATGAACAGGCAACTTTCCAAGAATGCGCTAGATTGTTGAAAAAATGGGGATTACCAGCAAACAGAAATACAATCAGATTGCACAATGAATTTACTTCAACATCATGCCCTCATAGAAGTTCGGTTTTACACACTGGTTTTGACCCAGTAACTCGCGGTCTATTGCCAGAAGACAAGCGGTTGCAACTTAAAGACTACTTTATCAAGCAGATTAGGGCGTACATGGATGGTAAAATACCGGTTGCCACTGTCTCTAATGAGTCAAGCGCTTCAAGTAATACAGTTAAACCAGTTGCAAGTGCAGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAÀCGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 47 (CHAPTw_Ami2638_M23-LST CBD2638 +6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAAAACCCTGAAACAAGCAGAGTCCTACATTAAGAGTAAAGTAAATACAGGAACTGATTTTGATGGTTTATATGGGTATCAGTGTATGGACTTAGCAGTAGATTATATTTACCATGTAACAGATGGTAAAATAAGAATGTGGGGTAATGCTAAGGATGCGATAAATAACTCTTTTGGTGGTACTGCTACGGTATATAAAAACTACCCTGCTTTTAGACCTAAGTACGGTGATGTAGTCGTAGGACTACTGGTAATTTTGCAACTTATGGTCATATCGCAATAGTTACTAACCCTGACCCTTATGGAGACCTTCAATATGTTACAGTTCTTGAACAAAACTGGAACGGTAACGGGATTTATAAAACCGAGTTAGCTACAATCAGAACACACGATTACACAGGAATTACACATTTTATTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 48 (M23-LST_Ami2638_CBD2638 + 6xHis e sitios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 49 (M23-2638_Ami2638_CBD2638_CBD2638 + 6xHis e sítios de clonagem)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGCTAACTGCTATTGACTATCTTACGAAAAAAGGTTGGAAAATATCATCTGACCCTCGCACTTACGATGGTTACCCTAAAAACTACGGCTACAGAAATTACCATGAAAACGGCATTAATTATGATGAGTTTTGTGGTGGTTATCATAGAGCTTTTGATGTTTACAGTAACGAAACTAACGACGTGCCTGCTGTTACTAGCGGAACAGTTATTGAAGCAAACGATTACGGTAATTTTGGTGGTACATTCGTTATTAGAGACGCTAACGATAACGATTGGATATATGGGCATCTACAACGTGGCTCAATGCGATTTGTTGTAGGCGACAAAGTCAATCAAGGTGACATTATTGGTTTACAAGGTAATAGCAACTATTACGACAATCCTATGAGTGTACATTTACATTTACAATTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID NO: 50 (vetor pQE-30, disponível sob o No. cat: 32915 em Oiagen - Hilden, Alemanha)

CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCÂATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAAGCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC

SEQ ID NO: 51 (CBD-2638 com ligante putativo indicado em negrito)

GKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 52 (CWT-LST com ligante putativo indicado em negrito)

GKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQ ID não: 53 (M23-2638 com ligante putativo indicado em negrito)

MLTAIDYLTKKGWKISSDPRTYDGYPKNYGYRNYHENGINYDEFCGGYHRAFDVYSNETNDVPAVTSGTVIEANDYGNFGGTFVIRDANDNDWIYGHLQRGSMRFWGDKVNQGDIIGLQGNSNYYDNPMSVHLHLQLRPKDAKKDEKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKG

SEQ ID No; 54 (M23-LST, com ligante putativo indicado em negrito)

AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTG

SEQ ID No: 55 (Ami-2638, com ligante putativo indicado em negrito)

EKSQVCSGLAMEKYDITNLNAKQDKSKNGSVKELKHIYSNHIKGNKITAPKPSIQGWIHNDYGSMTPSQYLPWLYARENNGTHVNGWASVYANRNEVLWYHPTDYVEWHCGNQWANANLIGFEVCESYPGRISDKLFLENEEATLKVAADVMKSYGLPVNRNTVRLHNEFFGTSCPHRSWDLHVGKGEPYTTTNINKMKDYFIKRIKHYYDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATD

SEQ ID No: 56 (Ami-Φ11, com ligante putativo indicado em negrito)

PKKETAKPQPKAVELKIIKDWKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASA

SEQ ID No: 57 (CHAP-Φ11, com ligante putativo indicado em negrito)

MSIIMEVATMQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMWFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAKPQPKAVELKIIKDWKGYDLPKRG

SEQ ID NO: 58 (CHAP-ΦTwort, com ligante putativo indicado em negrito)

MKTLKQAESYIKSKVNTGTDFDGLYGYQCMDLAVDYIYHVTDGKIRMWGNAKDAINNSFGGTATVYKNYPAFRPKYGDVWWTTGNFATYGHIAIVTNPDPYGDLQYVTVLEQNWNGNGIYKTELATIRTHDYTGITHFIRPNFATESSVKKKDTKKKPKPSNRDGINKDKIVYDRTNINYNMVKRG

SEQ ID No: 59 (vetor_pHGFP_CBD2638_c)

CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC

SEQ ID NO: 60 (GFP_CBD2638)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA

SEQ ID No: 61 (GFP_CBD2638_CBD2638, variante 1. Sítios de restrição utilizados para a construção de: BamHI - SacI - SacI - SalI. Códon de parada TAA derivado do 2° CBD2638)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAAGTCGAC

SEQ ID No: 62 (GFP_CBD2638_CBD2638 variante 2. Sítios de restrição utilizados para construção de: BamHI - SacI - KpnI - SalI. O códon de parada é codificado pelo vetor)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGGTACCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGA

SEQ ID NO: 63 (GFP_CBD2638_CBD2638_CBD2638. Sítios de restrição utilizados para a construção de : BamHI - SacI -KpnI - SalI - PstI. O códon de parada é codificado pelo vetor)

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGCGTATGGTCTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGAGCTCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGGTACCGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAAGTCGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAACTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGA

SEQ ID NO: 64 (GFP_CBD2638 aa)

MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 65 (GFP_CBD2638_CBD2638 Variante 1 aa)

MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIK

SEQ ID NO: 66 (GFP_CBD2638_CBD2638 Variante 2 aa)

MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKGTGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKVDLQPSLIS

SEQ ID NO: 67 (GFP_CBD2638_CBD2638_CBD2638 aa)

MRGSHHHHHHGSMSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKELGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHAFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKGTGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKVDGGKLEVSKAATIKQSDVKQEVKKQEAKQIVKATDWKQNKDGIWYKAEHASFTVTAPEGIITRYKGPWTGHPQAGVLQKGQTIKYDEVQKFDGHVWVSWETFEGETVYMPVRTWDAKTGKVGKLWGEIKLQPSLIS

Claims

Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de compreender uma primeira sequência de nucleotídeos, em que a dita sequência de nucleotídeos compreende a SEQ ID NO: 12, em que a dita primeira sequência de nucleotídeos codifica um domínio de ligação da parede celular que se liga ao peptidoglicano da parede celular do gênero Staphylococcus, e em que a dita molécula de ácido nucleico compreende ainda uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um domínio lítico.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito domínio lítico é uma segunda sequência e uma terceira sequência de nucleotídeos, e em que a dita segunda sequência de nucleotídeos codifica um domínio endopeptidase M23 e a dita terceira sequência de nucleotídeos codifica um domínio amidase.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que as ditas segunda e terceira sequências nucleotídicas se originam de um gene que codifica uma enzima selecionada do grupo consistindo na endolisina F2638a do bacteriófago de S.aureus, endolisina Φ11 do bacteriófago de S. aureus, endolisina ΦTwort do bacteriófago de S. aureus e lisostafina de S. Simulans.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a dita segunda sequência de nucleotídeos compreende a SEQ ID NO: 14 ou 15 e a dita terceira sequência nucleotídica compreende a SEQ ID NO: 16 ou 17.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de nucleotídeo compreende a SEQ ID NO: 9.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma quarta sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de CHAP (amidohidrolase/peptidase dependente de cisteína e histidina).
Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita quarta sequência de nucleotídeos se origina da endolisina FTwort do bacteriófago de S. aureus ou Φ11 do bacteriófago de S. aureus.
Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita quarta sequência de nucleotídeos compreende a SEQ ID NO: 18 ou a SEQ ID NO: 19.
Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29 ou 32, compreendendo:
- - um domínio de ligação à parede celular, e
- - um domínio de endopeptidase e/ou um domínio de amidase.
Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender um constructo de ácido nucleico compreendendo a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle, que direcionam a produção ou expressão do polipeptídeo codificado em uma célula, um indivíduo ou um sistema de expressão isento de células.
Célula caracterizada pelo fato de compreender um constructo de ácido nucleico compreendendo a molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 10, em que a dita célula é uma célula microbiana ou procariótica.
Método para produzir, opcionalmente purificar e opcionalmente liofilizar um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 9, o dito método sendo caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
- i) produzir o dito polipeptídeo em uma célula conforme definida na reivindicação 11, compreendendo um constructo de ácido nucleico que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, opcionalmente
- ii) purificar o dito polipeptídeo e, opcionalmente,
- iii) liofilizar o dito polipeptídeo purificado.
Composição caracterizada pelo fato de compreender uma molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 9 e/ou conforme pode ser obtido por um método conforme definido na reivindicação 12, e/ou um vetor conforme definido na reivindicação 10 e/ou uma célula conforme definida na reivindicação 11.
Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de compreender um ou mais ingredientes ativos adicionais, preferencialmente selecionados do grupo consistindo em um bacteriófago e um antibiótico.
Uso de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 13 ou 14 caracterizada pelo fato de ser para produzir um medicamento para o tratamento de uma doença infecciosa.
Uso de uma molécula de ácido nucleico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 9 e/ou como pode ser obtido por um método conforme definido na reivindicação 12, um vetor conforme definido na reivindicação 10, uma célula conforme definida na reivindicação 11 e/ou uma composição conforme definida na reivindicação 13 e/ou 14, caracterizado pelo fato de ser como um antimicrobiano, preferencialmente como um aditivo alimentício ou um desinfetante.
Uso de uma molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 1, um polipeptídeo codificado por tal molécula de ácido nucleico, um constructo de ácido nucleico e/ou vetor e/ou célula que compreende tal constructo de ácido nucleico ou uma composição que compreende qualquer um dentre o tal polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, ácido nucleico, vetor e/ou célula caracterizado pelo fato de ser para detectar um Staphylococcus, preferencialmente em uma aplicação de diagnóstico.