KR20140064943A - 다발성 경화증의 치료 - Google Patents

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메튜 다운햄
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모르포시스 아게
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Abstract

본 발명은 다발성 경화증(MS)의 치료 및/또는 예방에 대한 방법에 관한 것이다. GM-CSF에 특이적 항체 또는 GM-CSF 수용체와 같은 GM-CSF 길항제는 다발성 경화증의 치료 및/또는 예방에 효과적이다.

Description

다발성 경화증의 치료{TREATMENT FOR MULTIPLE SCLEROSIS}
본 발명은 일반적으로 다발성 경화증(MS)의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, GM-CSF 길항제는 다발성 경화증 치료에 효과적일 수 있다. GM-CSF 길항제는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 특이적 항체를 함유하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
다발 경화 또는 뇌척수염 근종이라고도 알려져 있는 다발성 경화증(MS)은 면역 체계가 중추 신경계(CNS)를 자극하는 자기 면역성 질환이다. 특히, MS는 미엘린을 손상시킴으로써 뇌와 척수 내의 신경 세포들의 상호 교류 능력에 영향을 미친다. 미엘린이 손상된 경우 축색돌기는 더 이상 효과적으로 신호를 보낼 수 없게 된다.
MS의 네 가지 주요 유형은 문헌 [Neurology(1996) 46; 901-911] (도 1 참조)에 설명되어 있다. 재발-완화 유형(relapsing-remitting subtype)은 수개월에서 수년의 기간 동안 비교적 조용한 (완화) 이후에 질환 활동의 새로운 신호가 없이 예측할 수 없는 재발에 그 특징이 있다. 2차 진행형 MS(secondary progressive MS)는, 초기에는 재발-완화 유형으로 시작한 다음, 뚜렷한 완화의 시기 없이 급성 발병들 사이에서 진행적인 신경의 손상을 갖기 시작한다. 1차 진행형 유형(primary progressive subtype)은, 최초 MS 증상 이후에, 완화와 개선 없이 또는 아주 가끔 미세한 완화와 개선만을 나타내며, 발병으로부터 불능으로 진행되는 점에 특징이 있다. 마지막으로 진행성 재발 MS(progressive relapsing MS)는 최초 발병으로부터 지속적인 신경 손상을 갖고 명백하게 중첩된 발병으로 고통받는다. 이것도 저것도 아닌 MS도 여러 개 존재한다.
MS 증상은 일반적으로 다면적이고 가끔씩 발생하는 급성 악화 기간(재발), 점차적이고 진행적인 신경 기능의 악화, 또는 이들이 복합적으로 나타난다. 감각, 시각, 소뇌 및 운동 증상이 일반적이다. MS 환자는 감각(지각 감퇴 및 지각 이상), 근육 약화, 근육 경련, 움직임 장애; 조직 및 균형 장애; 언어 능력 또는 삼킴 장애; 시각적 장애; 피로, 급성 또는 만성 고통 및 방광과 장 장애에 변화를 갖는 대부분의 신경학적인 증상 또는 신호로부터 고통받는다. 다양한 정도의 인지 장애 및 우울증 또는 불안정한 기분의 감정적 증상도 일반적이다.
MS는 일반적으로 30대 성인들뿐만 아니라 아이들에게도 발생하며 1차 진행적 유형은 30대인 사람들에게 더 일반적이다. 자기 면역 장애에 있어서, 상기 질환은 여성들에게 더 일반적이고 그 경향은 증가하는 추세이다.
MS에 있어서, 면역 체계는 신경계를 공격하는데, 이는 아마 그 자신의 구조와 비슷한 구조를 가진 분자에 노출의 결과이다. MS 병소는 가장 일반적으로 소뇌 심실, 뇌간, 기저핵 및 척수; 및 시신경에 가까운 백질 영역을 포함한다. 백질 세포의 기능은 프로세싱이 끝나는 회백질과 신체 나머지 사이에 신호를 전달하는 것이다. MS는 희돌기교세포, 전기 신호를 전달하는 뉴런을 돕는 미엘린 피복으로서 알려진 지방층을 생성하고 유지하는 세포를 파괴한다. MS는 질환이 발전됨에 따라 미엘린이 얇아지거나 완전히 손실되고 뉴런의 확장부 또는 축색 돌기를 절단(횡단)하는 결과를 야기한다. 재미엘린화라고 불리는 치료 과정은 상기 질환 초기에 발생하지만, 희돌기세포는 상기 세포의 미엘린 피복을 완전하게 재건할 수 없다. 흉터 같은 플라크가 손상된 축색 돌기 주변에 생길 때까지 반복 발작은 효과적인 재미엘린화를 성공적으로 유도하지 못한다.
탈미엘린화와는 별도로 상기 질환의 기타 병리학적 특징은 염증이다. T세포는 미엘린을 이물질로서 인식하고 마치 이것을 침투 바이러스로 여기고 공격한다. 이것은 사이토카인 및 항체와 같은 기타 면역 세포 및 용해성 있는 요소를 자극함으로써 염증 과정을 부추긴다.
다발성 경화증에 대한 다양한 치료법들이 존재하지만 알려진 치료법은 없다. 다른 치료법은 급성 발작을 관리하는데 사용되어 상기 질환을 억제하고 MS 효과를 관리한다. 급성 증상 발작을 관리하는데 있어서, 코스티코스테로이드의 정맥 내 투여 또는 경구 투여가 일반적인 치료법이다. 이러한 치료법은 단기간에 증상을 완화하는데 효과적이지만 환자의 장기간 회복에 상당한 영향을 미치지는 않는다. MS의 정확한 특성 및 유형에 따라서 질환 억제 치료에 대한 다양한 치료법이 사용되고 있다. 재발-완화 MS의 치료는 인터페론(인터페론 베타-1a 및 인터페론 베타-1b), 글라티라머아세테이트(코펙손; 이 자체를 면역 체계 공격의 목표물로 대체하여 미엘린 단백질을 보호하는 폴리펩타이드 혼합물), 미토산트론(암 화학 요법에도 사용되는 면역 억압약) 및 나탈리주마브(티사브리; 인간화된 단일 클론 항체 세포 부착 분자 α4-인테그린)를 함유한다. 2차 진행형 MS 및 진행성 재발 MS에 대한 처리는 미토산트론, 나탈리주마브 및 인터페론-베타-1b(베타페론)를 함유한다. 그 외에, 예비 치료도 주로 사용한다. MS는 진행적인 치료 및 장애를 야기하는 다양한 증상 및 기능적인 결함과 관련이 있다. MS의 다양한 치료법의 효과 관리가 알려져서 사용되고, 특정한 경우에 요구된다.
일부 사이토카인은 과립대식세포집락자극인자(Ponomarev 등; J Immunol(2007) 178; 39-48; McQualter 등; J Exp Med.(2001) 194; 873-82)를 함유하는 다발성 경화증에 포함되는 것으로 알려져 있다. 과립대식세포집락자극인자(GM-CSF)는 백혈세포 성장 인자로서의 기능을 하는 사이토카인이다. GM-CSF는 줄기 세포를 자극하여 과립성 백혈구(호중성 백혈구, 산호성 백혈구 및 호염기성 세포) 및 단핵 백혈구를 생산한다. 단핵 백혈구는 순환하여 빠져나가서 조직으로 이동하여 그 결과 대식 세포로 성장한다. 따라서, 자연 면역/염증 캐스캐이드의 부분에서 소수 대립 세포의 활성화는 그것의 급속한 수의 증가와 감염 억제에 결정적인 과정을 야기시킬 수 있다. GM-CSF의 활성형은 용해 가능한 단량체로서 세포 밖에서 발견된다. 특히, GM-CSF는 친염증성 사이토카인, 케모카인 및 프로테아제의 생성을 증가시키고 궁극적으로 관절 파괴를 야기하는 류마토이드아트리티스(RA)와 같은 자가 면역 장애에의 염증 매개체로서 확인되어 왔다.
본 발명은 GM-CSF 효과에 대한 길항 작용이 MS 치료에 대한 유효한 접근이라는 것을 증명한다. 특히, GM-CSF에 대한 항체 또는 그것의 수용체는 MS 치료에 있어서의 본 발명의 요점이다. 따라서, 본 발명은, 예를 들면 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 예방 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증 내에서 GM-CSF의 병리학적인 역할을 상쇄시킬 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증에 대한 치료에 유용한 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.
본 발명의 구체적인 양태에서, GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적 항체이다.
본 발명의 다른 양태에서, GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증 치료에 대한 약제 제조에 있어서의 GM-CSF 길항제 사용에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증 치료에 대한 GM-CSF 길항제를 제공한다.
본 명세서에서 다른 언급이 없는 이상 "포함하다", "가지다" 및 "함유하다"와 이들의 다른 형태인 "포함하는", "갖는" 및 "함유하는" 등은 언급한 성분이나 수 또는 그외 그룹을 포함하는 것으로 이해된 것이고 다른 성분이나 수를 배제하는 것이 아니다.
도 1은 MS의 네 가지 주요 유형의 진행 유형을 나타낸다.
도 2는 MS(예방 처리)의 MOG 유도된 EAE 모델 내의 GM-CSF 길항제의 효능을 보여준다. 제시된 것은 0~15일 동안의 누적된 EAE 점수이다. A: 비히클(PBS)로 처리된 동물; B: 10mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; C: 20mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; D: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; E: 0.5mg/kg의 덱사메사손으로 처리된 동물; F: 50mg/kg의 MOR-NOGM(동형 대조 항체(isotype control antibody))으로 처리된 동물; G: 14일에 최초 처치로 50mg/kg의 MOR-GM으로 처리된 동물(치료 처리). *: 동형 대조 항체에 비해서 P＜0.05. ＄: PBS 처리에 비해서 P＜0.05
도 3은 MOR-GM으로 처리된 치료에 대하여 질환의 시작의 지연을 보여준다. A: 비히클(PBS)로 처리된 동물; B: 10mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; C: 20mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; D: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물; E: 0.5mg/kg의 덱사메사손으로 처리된 동물; F: 50mg/kg의 MOR-NOGM(동형 대조 항체)으로 처리된 동물; G: 14일에 최초 처치로 50mg/kg의 MOR-GM으로 처리된 동물(치료 처리). *: 동형 대조 항체에 비해서 P＜0.05. ＄: PBS 처리에 비해서 P＜0.10
도 4는 본 발명의 화합물로 처리한 후 척수의 천골부 내의 염증 세포에 의한 침투를 보여준다. A: 50mg/kg의 MOR-NOGM으로 처리된 동물(동형 대조 항체; 예방 처리); B: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물(예방 처리); C: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물(치료 처리); D: 50mg/kg의 덱사메사손으로 처리된 동물(예방 처리). 각각의 데이타 포인트는 각 동물의 점수를 나타낸다. #: 동형 대조 항체에 비해서 P＜0.10. *: 동형 대조 항체에 비해서 P＜0.05
도 5는 척수의 천골부 내의 탈미엘린화의 정도를 보여준다. A: 50mg/kg의 MOR-NOGM으로 처리된 동물(동형 대조 항체; 예방 처리); B: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물(예방 처리); C: 50mg/kg의 MOR-GM로 처리된 동물(치료 처리); D: 50mg/kg의 덱사메사손으로 처리된 동물(예방 처리). 각각의 데이타 포인트는 각 동물의 점수를 나타낸다. *: 동형 대조 항체와 비교하여 P＜0.05
본 발명은 GM-CSF가 MS 치료에 유효한 목적물인 것을 증명한다. 이러한 관점에서, 본 발명은 한 가지 양태에서 GM-CSF 길항제를 사용하여 MS 분야에 예방 또는 치료상의 이점을 주는 방법을 제공한다.
본 발명은 치료적으로 유효량의 GM-CSF 길항제를 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 치료적 방법을 제공한다. 본원에서 사용하는 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 원하는 생물학적 반응을 끌어내는데 필요한 GM-CSF의 양을 의미한다. 본 발명에 의하면, 상기 치료적 유효량이란 다발성 경화증의 치료 및/또는 예방에 필요한 GM-CSF의 양이다.
본원에서 사용되는 "GM-CSF 길항제"는 넓은 의미에서 GM-CSF 길항제; GM-CSF의 활성 또는 기능을 억제하거나 임의의 다른 방법에 의해 GM-CSF에 대한 치료적 유효성을 내는 분자를 포함한다. 상기 용어 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적으로 결합하는 항체, GM-CSF에 특이적인 억제성 핵산, 또는 GM-CSF에 특이적인 작은 유기 분자를 포함하지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용어 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적인 억제성 핵산 또는 GM-CSF 수용체에 특이적인 작은 유기 분자에 특별하게 결합하는 항체이다. 또한, 용어 GM-CSF 항체란 파이브로넥틴 스캐폴드, 안키린, 멕시바디/애비머, 단백질 A-유도 분자, 안티칼린, 아피린, 단백질 에피토프 미메틱(PEMs) 등과 같은 비항체 스캐폴드 분자이다.
억제성 핵산은 안티센스 DNA, 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드, 외인성 가이드 시퀀스, siRNA 및 microRNA를 포함하지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 유용한 억제성 핵산은, 대조군에 비해서 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95퍼센트 이상으로 GM-CSF를 인코딩하는 RNA의 발현을 감소시키는 핵산을 포함한다. 억제성 핵산 및 그것을 생산하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. siRNA 디자인 소프트웨어가 이용가능하다.
GM-CSF에 특이적인 작은 유기 분자(SMOLs) 또는 GM-CSF 수용체는 천연물 또는 화학 라이브러리를 통해 알아볼 수 있다. 일반적으로 SMOLs의 분자량은 500달톤 미만이고, 더 일반적으로 160~480달톤이다. SMOLs의 기타 일반적인 하나 이상의 특성을 다음에 나타낸다.
분배 계수 log P는 -0.4~+5.6의 범위 내이다.
몰굴절도(molar refractivity)는 40~130이다.
원자수는 20~70이다.
문헌 [Ghose 등.(1999) J Combin Chem: 1, 55-68] 및 [Lipinski 등(1997) Adv Drug Del Rev:23, 3-25]를 참조한다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 특이적 항체이다. 이러한 항체는 쥣과 동물, 래트, 키메라성, 인간화되거나 또는 인간의 항체일 수 있다. 본원에서의 "인간" 항체 또는 기능적인 인간 항체 단편은 키메라성이 아니고(예를 들면, "인간화된 것"이 아니고), 비인간종(전체 또는 부분 모두)으로부터 유래된 것이 아닌 것으로 정의할 수 있다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 합성 인간 항체일 수 있다. 여기서 "합성 인간 항체"란 알려진 인간 항체 서열의 분석에 기초한 합성 서열로부터 인실리코 전체 또는 부분으로 유도된 서열을 갖는 항체로서 규정한다. 인간 항체 서열 또는 그 단편의 인실리코 디자인은 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이타베이스를 분석하고 그것으로부터 얻어진 데이터를 이용하는 폴리펩타이드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 기능적인 인간 항체 단편의 또 다른 예는 인간 본래의 항체 서열의 라이브러리로부터 격리된 핵산에 의해 인코딩된 것이다(즉, 인간 천연 원천에서 취해진 항체에 기초한 라이브러리).
본원에서 "인간화된 항체" 또는 기능적 인간화된 항체 단편은, (i) 비인간 원천(예를 들면, 이종 조직의 면역 체계를 견뎌내는 이식 유전자를 가진 생쥐)으로부터 유래하고, 상기 항체는 세포 서열에 기초하거나, 또는 (ii) 가변 도메인이 비인간 기원으로부터 유래되고 불변 도메인이 인간 기원에서 유래되는 키메라성이거나, 또는 (iii) CDR-이식된 것으로, 상기 CDR의 가변 도메인은 비인간 기원에서 유래되고 가변 도메인의 하나 이상의 프레임 워크는 인간 기원인 반면, 상기 불변 도메인(존재한다면)은 인간 기원인 CDR-이식된 것으로 정의된다.
상기 용어 "키메라 항체" 또는 기능적 키메라 항체 단편은, 본원에서 하나의 종에서 발견된 서열에 상응하거나 유래하는 불변 항체 영역, 그리고 다른 종으로부터 유래하는 가변 항체 영역을 갖는 항체 분자로서 정의된다. 바람직하게는 상기 불변 항체 영역은, 예를 들면 인간 생식 세포 또는 신체 세포에서 발견되는 서열로부터 유도되거나 상응하고, 가변 항체 영역은(예를 들면, VH, VL, CDR 또는 FR 영역) 생쥐, 래트, 토끼 또는 햄스터와 같은 비인간 동물에서 발견되는 서열로부터 유도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 결합 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이므로, 항체가 특정 항원 및 하나 이상의 기준 항원을 구별할 수 있다면, "특이적으로 결합하는" 항체는 "항원에 대해 특이적인" 또는 "항원을 특이적으로 인식하는" 것을 의미한다. 상기 기준 항원은 기준 포인트, 예를 들면 IL3, IL5, IL-4, IL13 또는 M-CSF로서 사용되는 하나 이상의 밀접하게 연관된 항원일 수 있다. 이것의 가장 일반적인 형태에 있어서(정의된 기준이 언급되지 않은 경우), "특이적 결합"이란 특정 항원과 관련이 없는 항원 사이를 구별하는 항체 능력을 말하고, 예를 들면 이하의 방법을 따라서 알아낼 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-테스트 및 펩타이드 스캔을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 표준 ELISA 분석을 시행할 수 있다. 점수는 표준 발색 정도(예를 들면, 고추 냉이 퍼옥사이드를 갖는 2차 항체, 및 하이드로젠퍼옥사이드를 갖는 테트라메틸벤지딘)를 따라 매겨진다. 상기 반응은, 예를 들면 450㎚의 광학 밀도로 측정된다. 일반적인 배경(=네거티브 반응)은 0.1 OD; 일반적인 포지티브 반응은 1 OD가 될 수 있다. 이는 포지티브/네거티브 차이가 10배 초과일 수 있다는 것을 의미한다. 일반적으로 결합 특이성은 하나의 기준 항원을 사용하지 않고 약 3 내지 5개의 비관련 항원(예를 들면, 분유, BSA, 트랜스페린 등) 세트를 사용함으로써 결정된다. 또한, "특이적 결합"은, 타겟 항원의 다른 부분(예를 들면 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체의 다른 도메인 또는 영역)들 사이를 구별하거나, 또는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체의 하나 이상의 중요한 아미노산 잔기들 또는 아미노산 잔기들의 스트레치들 사이를 구별하는 항체 능력에 관한 것이다.
또한, 본원에 사용된 바와 같이 상기 "면역 글로블린(Ig)"은 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD류(또는 이것의 아류)에 속하는 단백질로서 정의되고 종래에 알려진 이것의 항체 및 기능적 단편 모두를 포함한다. 상기 항체/면역 글로블린의 "기능적 단편"은 항원 결합 영역을 포함하는 항체/면역 글로블린의 단편(예를 들면, IgG의 가변 도메인)으로서 정의된다. 항체의 "항원 결합 영역"은 일반적으로 CDR-1, -2 및/또는 -3 영역과 같은 항체의 하나 이상의 초가변 도메인 내에서 발견되지만; 가변의 "프레임 워크" 영역은 CDR 용 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에 중요한 역할을 할 수도 있다. 바람직하게는 "항원 결합 영역"은 적어도 가변 경쇄(VL)의 4~103의 아미노산 잔기들 그리고 가변 중쇄(VH)의 5~109의 아미노산 잔기들, 더 바람직하게는 VL의 3~107의 아미노산 잔기들 그리고 VH의 4~111의 아미노산 잔기들을 포함하고, 완전한 VL 및 VH쇄가 특히 바람직하다(아미노산 위치 VL의 1~109 및 VH의 1~113; WO 97/08320을 따라 넘버링함). 본 발명에 사용되는 면역 글로블린의 바람직한 류는 IgG이다. 본 발명의 "기능적 단편"은 F(ab')2 단편, Fab 단편, scFv의 도메인 또는 단일 면역 글로블린 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩타이드(예를 들면, 단일 중쇄 가변 도메인 또는 단일 경쇄 가변 도메인)를 포함하는 구조체를 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인 사이에 생기는 분자 내의 디설파이드 상호 작용을 감소시키거나 완전히 제거하도록 제작된다.
본 발명의 항체는 인실리코 디자인된 아미노산 서열에 기초한 재조합형 항체 라이브러리로부터 유래되거나 합성하여 생성된 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들면, 인간의 서열 데이터 베이스를 분석하고 거기서 얻은 데이터를 이용하는 폴리펩타이드 서열을 고안함으로써 항체 서열의 인실리코 디자인이 달성된다. 인실리코 생성 서열을 디자인하고 얻는 방법은, 예를 들면 문헌 [Knappik 등, J. Mol. Biol.(2000) 296:57]; [Krebs 등, J. Immunol. Methods.(2000) 254:67], [Rothe 등, J. Mol. Biol.(2008) 376:1182]; 및 [Knappik 등에 의해 공고된 미국 특허 제 6,300,064호]에 기재되어 있고 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명에 있어서 GM-CSF에 특이적인 임의의 항체를 사용해도 좋다. 예시적 항체는 서열번호:1에 나타낸 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호:2에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 다른 예시적 항체는 서열번호:1에 나타낸 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호:2에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:1에 나타낸 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호:2에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 특이성을 갖고/또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:1에 나타낸 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:2에 나타낸 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.
서열번호:1:
Met Glu Leu Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His
Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp
Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu
Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
*Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
Cys Ala Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Arg Val Ser Ser Val Ser Gly Ser
서열번호:2:
Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Tyr Met Leu
Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Ile Gln Ser Gln
Lys Phe Val Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys
Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro
Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly
Arg Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile
Leu Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
Ser Ser Lys Gly Glu Phe
본 발명에 사용될 수 있는 다른 예시적 항체는 서열번호:3에 나타낸 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호:4에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 다른 예시적 항체는 서열번호:3에 나타낸 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호:4에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:3에 나타낸 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호:4에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 특이성을 갖고/또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:3에 나타낸 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:4에 나타낸 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.
서열번호:3:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGIENKYAGGA TYYAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFWGQGTLVTVSS
서열번호:4:
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSGSNS GNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGGTKLTVLGQ
본 발명에 사용될 수 있는 다른 예시적 항체는 이하에서 선택되는 H-CDR3 서열을 포함하는 항체이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
바람직하게는, 서열번호:5~16 중 어느 하나에서 선택된 H-CDR3 서열을 포함하는 상기 항체는 추가적으로 이하의 H-CDR1 서열을 포함한다.
Figure pat00003
및/또는 이하 H-CDR2 서열:
Figure pat00004
및/또는 이하 L-CDR1 서열:
Figure pat00005
및/또는 이하 L-CDR2 서열:
Figure pat00006
및/또는 이하 L-CDR3 서열:
Figure pat00007
본 발명에 사용될 수 있는 다른 예시적 항체는 이하 L-CDR1 서열을 포함하는 항체이다.
Figure pat00008
및/또는 이하 L-CDR2 서열:
Figure pat00009
및/또는 이하 L-CDR3 서열:
Figure pat00010
및/또는 이하 H-CDR1 서열:
Figure pat00011
및/또는 이하 H-CDR2 서열:
Figure pat00012
및/또는 이하 H-CDR3 서열:
Figure pat00013
상기 항체는 서열번호:21~26의 CRD 모두를 포함하는 것이 바람직하다.
GM-CSF 수용체는 헤마토포인틴(haematopoietin) 수용체 상과(superfamily) 중의 하나이다. 이것은 알파 및 베타 서브유닛으로 이루어지는 헤테로디메릭이다. 상기 알파 서브유닛은 GM-CSF에 고도로 특이적인 반면, 상기 베타 서브유닛은 IL3 및 IL5를 함유하는 다른 사이토카인 수용체와 공유된다. 이것은 상기 베타 수용체 서브유닛의 보다 넓은 조직 분배 내에 반영된다. 상기 알파 서브유닛, GM-CSFRα는 골수 세포와 호중성 백혈구, 대식 세포, 산호성 백혈구, 수지상 세포, 내피 세포 및 호흡 상피 세포와 같은 비헤마토포인틴 세포에 주로 나타난다. GM-CSFRα의 전체 길이는, I형 사이토카인 수용체 군에 속하는 400 아미노산 I형 세포막 글리코프로테인이고, 22 아미노산 시그널 펩타이드(1~22 위치), 298 아미노산 세포 외부 도메인(23~320 위치), 321~345 위치의 막관통영역 및 짧은 55 아미노산 세포 외부 도메인으로 이루어진다. 상기 시그널 펩타이드는 부착되어 378 아미노산 단백질로서의 GM-CSFRα의 성숙형을 제공한다. 인간 및 쥣과 GM-CSFRα의 cDNA 클론이 이용 가능하며 단백질 수준에서 상기 수용체 서브유닛은 36%와 동일성(identify)을 갖는다. GM-CSF는 α서브유닛과(Kd 1~5nM) 단독으로 비교적 낮은 친화도로 결합할 수 있지만, β서브유닛과는 단독으로 전혀 결합할 수 없다. 그러나, α 및 β 서브유닛 모두의 존재는 높은 친화도의 리간드 수용체 복합체(Kd≫100pM)를 야기한다. GM-CSF 시그널링은 GM-CSFR α쇄에 이것의 초기 결합을 한 후, 큰 서브유닛 일반 β쇄와 가교 결합을 통해 이루어짐으로써 고도의 친화도의 상호 작용을 발생시켜 JAK-STAT 경로를 인산화한다.
본 발명에서 GM-CSF 수용체에 특이적인 임의의 항체를 사용하여도 좋다. 예시적 항체는 서열번호:27~45 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 다른 예시적 항체는 서열번호:27~45 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:27~45 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 특이성을 갖고/또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:27~45 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 H-CDR3 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
본 발명에 사용될 수 있는 GM-CSF에 특이적인 또 다른 항체는 서열번호:46~56 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 다른 예시적 항체는 서열번호:46~56 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:46~56 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 특이성을 갖고/또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적 항체는 서열번호:46~56 중 어느 하나에 나타낸 H-CDR3 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 H-CDR3 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
Figure pat00017
Figure pat00018
본 발명의 조성물은 치료상 또는 예방상 적용으로 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 독창적인 항체(또는 기능적 항체 단편)를 포함하는 약학 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 설명되고 고려된 독창적인 항체를 포함하는 유효량의 약학 조성물이 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다. 이 문맥에서 사용된 "피험자"란 생쥐 또는 래트와 같은 설치류 및 사이노몰거스 원숭이(마카카 패시큘라리스), 레서스 원숭이(마카카 물루타) 또는 인간(호모 사피엔스)과 같은 영장류를 포함하는 임의의 포유류이다. 피험자는 영장류인 것이 바람직하고, 인간이 가장 바람직하다.
특정 양태에서, 본 발명은 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공하고, 상기 GM-CSF 길항제는 대략 100nM 미만, 보다 바람직하게는 대략 60nM 미만, 더욱 바람직하게는 대략 30nM의 친화도로 GM-CSF에 결합할 수 있다. 나아가, GM-CSF에 대략 10nM 미만, 보다 바람직하게는 대략 3nM 미만의 친화도로 결합하는 항체가 특히 바람직하다.
특정 양태에서, 본 발명은 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공하고, 상기 언급한 GM-CSF 길항제는 항체를 가진 GM-CSF에의 결합을 위해 경쟁하고 여기서의 상기 항체의 중쇄는 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 치료 방법을 제공하고 상기 GM-CSF는 항체를 가진 GM-CSF에의 결합을 위해 경쟁하고 여기서의 상기 항체의 경쇄는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 방법을 제공하고, 상기 언급한 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적 항체이고, 여기서 언급된 GM-CSF에 특이적 항체는 용액 평형 적정(SET) 및/또는 TF1 증식 분석으로 판단된 바와 같이 래트 및/또는 리서스(마카카) GM-CSF와 교차 반응한다.
*특정 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증에서의 GM-CSF의 병리적 역할에 대항할 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다. 본 발명의 반-GM-CSF 항체는 다발성 경화증 내에서 GM-CSF의 임의의 역할에 대해 길항 작용을 할 수도 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 미엘린 시트의 탈미엘린화를 감소시킬 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 척수에 염증 세포의 유입을 감소시킬 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 하나 이상의 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 투여는 다발성 경화증의 시작을 지연시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 피험자에게 GM-CSF 길항제를 투여하는 다발성 경화증의 예방 방법을 제공한다. 본 문맥에서 사용된 "예방"이란 질환의 시작을 방해하거나 지연시키는 것이 목적인 방법을 말한다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하여 T세포의 증식을 감소시키는 다발성 경화증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하여 T세포에 의한 IL17의 방출을 감소시키는 다발성 경화증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
T세포의 증식 및 IL17의 방출을 측정 및 정량화하는 분석은 당업계에 알려져 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함하고 다발성 경화증 치료에 유용한 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다
특정 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 대한 약제의 제조에 있어서 GM-CSF 길항제의 사용을 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 대해 GM-CSF 길항제를 제공한다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 GM-CSF 길항제를 피하에 투여한다. 다른 양태에서, 본 발명의 GM-CSF 길항제를 척수 내에 투여한다. GM-CSF 길항제는 피하 또는 척수 내에 투여되는 경우 다발성 경화증의 치료에 특별한 효과가 있다.
본 발명의 조성물은 다발성 경화증의 치료에 대해서 GM-CSF 길항제 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 바람직한 조성물이다. 이러한 담체, 희석제 및 부형제는 당업계에 잘 알려져 있으며 숙련된 통상의 기술자는 본 발명의 GM-CSF 길항제로 피험자를 치료하는데 최적인 제형 및 투여 경로를 찾을 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 피험자는 인간이다. 다른 양태에서, 상기 피험자는 래트 또는 생쥐와 같은 설치류이다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적 항체이다. 특정 양태에서, GM-CSF에 특이적인 상기 항체의 가변 중쇄는 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 양태에서, GM-CSF에 특이적인 상기 항체의 가변 경쇄는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적 항체이다.
특정 양태에서, GM-CSF 길항제의 투여는 미엘린 시트의 탈미엘린화를 감소시킨다.
다른 양태에서, GM-CSF 길항제의 투여는 염증 세포가 척수로 유입되는 것을 감소시킨다.
다른 양태에서, GM-CSF 길항제의 투여는 T세포의 증식을 감소시킨다.
다른 양태에서, GM-CSF 길항제의 투여는 T세포로 인한 IL17의 방출을 감소시킨다.
다른 양태에서, 투여는 다발성 경화증의 시작을 지연시킨다.
특정 양태에서, GM-CSF 길항제를 피하 또는 척수에 투여한다.
특정 양태에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 사용되는 GM-CSF 길항제를 제공한다. 특정 양태에서 상기 치료 또는 예방은 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 피험자는 인간이다. 다른 양태에서, 상기 피험자는 래트 또는 생쥐와 같은 설치류이다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적 항체이다. 특정 양태에서 GM-CSF에 특이적인 상기 항체의 가변 중쇄는 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, GM-CSF에 특이적인 상기 항체의 가변 경쇄는 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적 항체이다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 이용한 상기 치료 또는 예방은 상기 미엘린 시트의 탈미엘린화를 감소시킨다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 이용한 상기 치료 또는 예방은 염증 세포가 척수로 유입되는 것을 감소시킨다.
다른 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 이용한 상기 치료 또는 예방은 T세포의 증식을 감소시킨다.
다른 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 이용한 치료 또는 예방은 T세포로 인한 IL17의 방출을 감소시킨다.
다른 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 이용한 상기 치료 또는 예방은 다발성 경화증의 시작을 지연시킨다.
특정 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제를 피하 또는 척수 내에 투여한다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 사용되는 예시적 항체 및 동물
본 발명에 있어서의 표준 GM-CSF 길항제로서 MOR-GM을 사용했다. MOR-GM은 완전한 인간 GM-CSF-특이적 항체(WO 06/122797)이다. MOR-GM의 중쇄 가변 도메인은 서열번호:3에 제시되어 있고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호:4에 제시되어 있다.
항체 22E9, 반-생쥐 GM-CSF 항체는 다른 실험에서 사용했다(AbD Serotec, Matinsried/Germany; Cat.No.1023501).
분명한 것은 임의의 다른 GM-CSF 길항제, 예를 들어 서열번호:1~45에서 선택된 아미노산 스트레치를 포함하는 항체는 본 발명을 따라 분명하게 사용할 수 있다.
7~8주 생의 수컷 다크 아고티 수컷 래트(Harlan Laboratories, Inc., Indianapolis/IN)를 21±3℃, 상대 습도 40~70% 및 12시간의 명암 주기인 청결한 일반적인 조건 하에서 지내도록 했다. 래트는 쌍으로 두었고 설치류에게는 식이 제한을 하지 않았다(SSNIFF, Bio-Services, The Netherlands). 개개의 동물들의 꼬리에 표시를 하여 구별했다. 본 실험의 시작 전에 래트를 4주 동안 두었다. 본 실험의 시작 전에 래트를 무작위로 군에 배정했다. 본 실험을 시작할 때 래트는 11~12주 생이고 체중 200~250그램이었다.
실시예 2: MS의 MOG-유도 EAE 모델에의 GM-CSF 길항제의 치료적 유효성
실험용 자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해, 수컷 DA 래트를, Freund의 불완젼 아쥬반트(IFA) 및 10mM NaAc(pH 3.0)의 1:1 혼합물 200㎕에 유화시킨 재조합형 미엘린-히돌기교세포-당단백(rMOG) 15㎍을 피 내에 주입하여 꼬리의 등쪽 기저부의 2개의 측면 부위에 면역화시켰다. 면역화를 촉진시키기 위해서 래트를 산소와 N2O 혼합물 중의 2~4%의 이소플루레인을 흡입시켜 마취했다.
상기 테스트 화합물 MOR-GM의 복강 내 투여 효과를 비히클(PBS) 처리군과 비교하고 비특이적/관계없는 동형 대조 항체 MOR-NOGM(50mg/kg)으로 처리된 군과 비교해서 테스트했다. 화합물 MOR-GM를 이용한 예방 처리는 즉, 10, 20 및 50mg/kg으로 3회 복용시켜 테스트했다. 상기 화합물을 7, 10, 14, 17 및 21일째 날에 투여했다. 또한, 상기 화합물(50mg/kg)의 효능을 테스트 하고, 상기 첫 번째 처리는 질환이 시작한 후 식이요법에서 시작했다. 이러한 경우, 상기 화합물을 14, 17 및 21일째 날에 투여했다. 양성 대조군에는 복강 내에 덱사메사손(0.5mg/kg)을 9일째 날부터 매일 계속해서 투여하여 처리된 래트가 포함되었다.
각각의 시험군에는 12마리의 동물을 포함되었다. 혈액 샘플을 17 및 21일째 날(처리 전)과 종료 날에 꼬리 정맥에서 추출했다. 각 래트의 체중은 매일 측정했다.
래트의 EAE는 이하의 장애 점수 체계를 이용하여 매일 평가했다:
0: 질환 없음
0.5: 꼬리 마비 또는 부분 마비
1: 완전한 꼬리 마비
2: 뒷다리 허약 또는 부분 마비
2.5: 2와 동일 및 앞발의 추가적 연루
3: 뒷발 및/또는 하반신의 완전한 마비
3.5: 3과 동일 및 앞발의 추가적 연루
4: EAE로 인한 사망
공존 이환으로 연관된 EAE으로 인한 안락사가 요구되는 래트는 안락사 날에 3.5점 및 전체 남은 모니터 기간 동안 4점을 받은 것이었다.
"최대 임상 점수"란 실험기간 동안 각각의 쥐의 최고 EAE 점수를 말한다.
상기 "누적 점수"는 정의된 기간 동안의 래트의 EAE 점수 전체의 합계이다(커브 이하 영역). 상기 누적 점수는 전체 후속 기간, 제 1 질환 단계(0~15일째) 및 재발 단계(16일~종료) 동안의 누적 점수를 계산했다.
상기 "시작 일"이란 누적 점수가 적어도 3점이 되는 3일 연속일의 첫째 날을 말한다.
조직학적 분석: 포르말린 접착 조직을 파라핀에 끼워넣고 5㎛ 조직 절편을 헤마토실린/에오신으로 착색시켜서 염증 세포의 침투를 반정량 그레이딩할 수 있게 하거나 미엘린이 착색되는 동안 Kluver-Barrera를 따라 Luxol fast blue로 착색했다. 염증 세포의 침투 및 탈미엘린화의 정도는, 척수의 천골부에서부터 3개의 비연속적인(100㎛만큼 떨어져 있음) 부분에서 반정량법으로 평가했다. 조직학적 그레이딩은 하기 표에 제시한 바와 같은 점수 체계를 이용하여 행한다. 조직학적 그레이딩은 맹검법으로 시행했다.
척수 조직으로의 염증 세포 침투의 반정량 그레이딩에 대한 조직학적 점수 체계:
Figure pat00019
척수 조직의 탈미엘린화의 반정량 그레이딩에 대한 조직학적 점수 체계:
Figure pat00020
모든 통계 분석은 윈도우용 통계 소프트웨어 프로그램 SPSS 14(SPSS Inc., Chicago, IL, USA에서 입수 가능)를 사용하여 수행한다. 시작일의 다중 군 비교, 최고 EAE 점수, 누적 점수 및 최대 체중 감소에 대해서 Kruskal-Wallis 테스트를 이용하고 이어서 Mann-Whitney U-테스트를 하여 어느 군이 비히클 처리된 군과 현저하게 차이가 나는지 결정한다. 질환의 진척은 ANOVA에 의한 General Linear Method에 이어서 LSD-테스트를 하여 치료가 현저하게 달라진 날을 결정한다. Mantel Cox 테스트를 사용하는 Kaplan-Meier 분석을 다중 군의 생존율 및 차후의 분석에 사용한다.
비히클을 이용한 대조군 처리( PBS ; 음성 대조군)
동물들에게 7, 10, 14, 17 및 21일째 날에 PBS를 복강 내 투여했다. 모든 동물들에게 EAE가 생겼다. 질환의 첫 번째 신호는 9일째에 관찰되었다. 시작의 평균일은 10.1±0.7일째이었다. 첫 번째 절정(bout)은 대략 11~13일째이었고, 두 번째 절정일은 대략 21일째이었다. 이 군의 평균 최고 EAE 점수는 3.5±0.6점이었고, 0~24일의 평균 누적 EAE 점수는 38.7±9.8점이었다. 질환의 제 1 단계 동안(0~15일째)의 평균 누적 점수는 11.7±2.7점이었고, 재발 단계 동안에는 26.9±7.6점이었다. 모든 동물에서 마비 신호와 연관된 체중 감소를 보았다. 상기 체중 감소의 평균 최고 퍼센트는 21.1±5.7%이었다.
동형 대조 항체를 이용한 대조군 처리( MOR - NOGM ; 음성 대조군)
동물들에게 7, 10, 14, 17 및 21일째 날에 동형 대조 항체 50mg/kg의 MOR-NOGM을 투여했다. 이 군의 모든 동물들에게 EAE가 생겼다. 관찰한 변수 중 어떤 것도 비히클(PBS) 처리된 군을 관찰한 것과 통계적으로 현저하게 다르지 않았다. 평균 시작일은 9.8±0.8일이었다. 평균 최고 EAE 점수는 3.4±0.7점이었다. 누적 EAE 점수는 상기 비히클 처리된 군의 점수와 비슷했다. 전체 실험기간 동안 누적 EAE 점수는 36.7±10.9점이었다. 제 1 질환 단계의 누적 점수는 13.3±3.1점이었고 재발 단계에서는 23.5±8.0점이었다. 최대 체중 감소는 19.6±5.6%이었다. 동물에게서 광범위한 탈미엘린화에 따라 염증 세포가 척수의 천골부로 상당량 유입되는 것을 보았다.
덱사메사손을 이용한 대조군 처리(양성 대조군)
동물들을 9일 동안 매일 계속해서 덱사메사손 0.5mg/kg으로 복강 내 처리했다. 12마리 동물 중 9마리만 EAE가 생겼다. 처리는 질환 중증의 효과를 가졌다. 최대 EAE 점수는 1.7±1.0점(p=0.001)으로 현저하게 감소했다. 평균 누적 EAE 점수는 13.1±13.6점(p＜0.005)으로 감소했다. 제 1 질환 단계 동안의 누적 점수는 6.0±5.7점(p=0.010)으로 감소했고, 재발 단계에서는 7.1±9.3점(p＜0.0005)으로 감소했다. EAE 억제에도 불구하고 덱사메사손은 체중 감소에 영향을 미치지 않았다. 상기 척수의 천골부 내의 다량의 염증 세포의 침투의 확장은 동형 대조 항체 MOR-NOMG로 처리된 래트에 비해서 감소했다(p=0.003). 마찬가지로, 탈미엘린화의 정도는 현저하게 더 낮았다(p=0.002).
7일째부터의 계속적인 MOR - GM 을 이용한 처리(예방 처리)
동물들에게 7, 10, 14, 17 및 21일째 날에 MOR-GM을 10, 20 또는 50mg/kg 복강 내 투여했다. 모든 동물들에게 EAE가 생겼다. 동형 대조 항체(MOR-NOGM)를 이용한 처리에 비해서, 질환이 시작된 날은 MOR-GM 50mg/kg을 이용한 처리로 분명하게 2일 지연되었다(질환 시작: 11.8±3.0일; p=0.047). 또한, 상기 누적된 EAE 점수의 감소에 대한 명확한 동향이 있다. 0~24일의 누적 EAE 점수는 27.7±12.3점(p=0.094)이었다. 질환 초기 단계(0~15일) 동안의 누적 EAE 점수는 8.7±4.9점이었다. 이것은 동형 처리된 대조군에 비하여 현저하게 감소되었다(p=0.040). 처리는 최대 체중 감소에 영향을 미치지 않았다. MOR-GM 50mg/kg을 이용한 처리는 매일 평균 누적 점수를 감소시켰다(p=0.022). 상기 평균 누적 점수를 매일 매일을 기초로 하여 평가했을 때 평균 누적 점수는 11일째부터 현저하게 감소했다.
결과를 도 2에 나타낸다. MOR-GM(50mg/kg)을 이용한 예방 처리는 0~15일째에 상기 누적 EAE 점수의 결정적이고 현저한 감소를 보여준다. 결과는 첫 번째(0~15일째)에 대해 특히 현저했다.
14일째부터의 계속적인 MOR - GM 을 이용한 처리(치료 처리)
동물들에게 EAE의 시작 후 4일 후인 14일째에 50mg/kg의 MOR-GM을 이용한 첫 번째 처리(복강 내)를 했다. 처리를 17일째 및 21일째에 더 수행했다. 상기 처리 식이요법은 상기 최대 EAE 점수 또는 상기 누적 EAE 점수에 통계적으로 현저한 효과를 가지지 않았다. 그러나, 14일째 치료 처리를 시작함에 있어서, 시간에 따른 상기 누적 점수는 상기 동형 대조 항체와 비교하여, 더 적은 현저한 임상 점수 상승을 보여주었다. 체중의 최대 감소에 영향을 미치지 않았다.
도 3은 예방 처리에 있어서 농도 50mg/kg의 MOR-GM을 투여하는 것이 질환시작을 지연시키는 것을 보여준다(p＜0.10). 조직학적인 결과를 도 4(염증) 및 도 5(탈미엘린화)에 나타내었다. 결과는 GM-CSF 길항제가 상기 척수의 낮은 부분에서 염증 세포의 유입을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 또한, GM-CSF 길항제는 탈미엘린화를 감소시킬 수 있다. 두 변수에 대해서 대조군 처리 내에서 MOR-GM을 이용한 처리 효과를 나타내는 조직학적 점수가 2 이하인 것을 관찰할 수 없었다.
요약하자면, 이러한 결과는 다발성 경화증의 치료에서의 GM-CSF 길항제의 효과를 보여준다.
실시예 3: 서열번호:3 또는 서열번호:4를 포함하는 GM-CSF 특이적 항체의 치료적 유효성
실시예 2를 반복한다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호:1에 나타낸 중쇄 가변 도메인의 아미로산 서열을 포함하거나 서열번호:2에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체를 사용한다. 생쥐 이외에 다른 종을 사용해도 좋고, 본 실험에 사용된 항체는 특이 종 내에서 교차반응한다. 본 실험에서 사용하는 동물 종은 래트가 바람직하다.
동형 대조 항체로 처리된 래트와 같은 상기 동물은 서열번호:1에 나타낸 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호:2에 나타낸 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체를 수용하는 동물에 비해서 현저하게 증가한 EAE 신호를 보여준다.
실시예 4: 서열번호:5~20을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체의 치료적 유효성
실시예 2를 반복한다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호:5~16 중 어느 하나에서 선택된 H-CDR3 서열을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체를 사용한다. 상기 항체는 서열번호:16 및/또는 서열번호:17의 H-CDR2 및/또는 서열번호:18의 L-CDR1 및/또는 서열번호:19의 L-CDR2 서열 및/또는 서열번호:20의 L-CDR3 서열을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 생쥐 이외에 다른 종을 사용할 수 있고, 특히 본 실험에 사용된 항체가 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 본 실험에서 사용하는 동물 종은 래트가 바람직하다.
동형 대조 항체로 처리된 래트와 같은 상기 동물은 본 실시예를 따라 GM-CSF 특이적 항체를 수용하는 동물에 비해서 현저하게 증가한 EAE 신호를 보여준다. 이것은 EAE 및 MS의 처리 내에서의 상기 항체 효과를 보여준다.
실시예 5: 서열번호:21~26을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체의 치료적 유효성
실시예 2를 반복한다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호:21의 L-CDR1 서열 및/또는 서열번호:22의 L-CDR2 서열 및/또는 서열번호:23의 L-CDR3 및/또는 서열번호:24의 H-CDR1 서열 및/또는 서열번호:25의 H-CDR2 서열 및/또는 서열번호:26의 H-CDR3 서열을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체를 사용한다. 상기 항체는 서열번호:21~26의 CDR 모두를 포함하는 것이 바람직하다. 생쥐 이외에 다른 종, 특히 본 실험에 사용된 항체가 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 본 실험에서 사용하는 동물 종은 래트가 바람직하다.
동형 대조 항체로 처리된 래트와 같은 상기 동물은 본 실시예를 따라 GM-CSF 특이적 항체를 수용하는 동물에 비해서 현저하게 증가한 EAE 신호를 보여준다. 이것은 EAE 및 MS의 처리 내에서의 상기 항체 효과를 보여준다.
실시예 6: 서열번호:46~56을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체의 치료적 유효성
실시예 2를 반복한다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호:46~56 중 어느 하나에서 선택된 H-CDR3 서열을 포함하는 GM-CSF 특이적 항체를 사용한다. 생쥐 이외에 다른 종, 특히 본 실험에 사용된 항체가 교차반응하는 종을 사용할 수 있다.
동형 대조 항체로 처리된 동물(예를 들면, 레서스 또는 사이노몰거스 원숭이와 같은)은 본 실시예를 따라 GM-CSF 특이적 항체를 수용하는 동물에 비해서 현저하게 증가한 EAE 신호를 보여준다. 이것은 EAE 및 MS의 처리 내에서의 상기 항체 효과를 보여준다.
실시예 7: GM-CSF 수용체에 특이적 항체의 치료적 유효성
GM-CSF에 특이적인 단일 클론 항체 대신에 GM-CSF 수용체에 특이적인 단일 클론 항체를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 2를 반복한다.
GM-CSF 길항제로서 서열번호:27~45 중 어느 하나로 나타낸 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 GM-CSF 수용체 특이적 항체를 사용한다. 생쥐 이외에 다른 종, 특히 본 실험에 사용된 항체가 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 본 실험에서 사용하는 동물 종은 래트가 바람직하다.
동형 대조 항체로 처리된 래트와 같은 상기 동물은 본 실시예를 따라 GM-CSF 수용체 특이적 항체를 수용하는 동물에 비해서 현저하게 증가한 EAE 신호를 보여준다. 이것은 EAE 및 MS의 처리 내에서의 상기 항체 효과를 보여준다.
실시예 8: 임상 실험
본 발명의 화합물의 효능은 다발성 경화증의 재발-완화에 대한 임상 실험에서 테스트될 수 있다. 상기 연구 피험자는 다발성 경화증의 재발 및 완화형(RRMS)이 확인된 증상을 가진 환자(18세 이상부터 55세 미만의 남녀)를 포함한다. 화합물은 정맥 주사로 투여한다. 목적은 다중심, 이중 맹검, 플라시보 통제, 복용량 도메인 연구에서 RRMS가 있는 환자들 내에서 MOR-GM의 조기 효능을 평가하는 것이다.
환자들을 다른 처리 그룹들로 나눈다. 상기 다른 처리 그룹은 처음 두 번의 복용량에 대해서는 2주마다 플라시보, MOR-GM 0.75mg, 1.5mg 또는 3.0mg 중 어느 하나를 수용한 후 이어서 한 달에 한번 MOR-GM을 수용한다.
상기 임상 실험으로 본 발명의 GM-CSF 길항제의 효능을 더 확인한다. MOR-GM을 이용한 처리 후의 다발성 경화증의 시작은 플라시보를 이용한 처리에 비해서 분명하게 지연된다.
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Claims (9)

  1. 재발 및 완화성 다발성 경화증(relapsing-remitting multiple sclerosis, RRMS)을 갖는 환자에 있어서, 다발성 경화증의 개시를 지연시키기 위한 치료 또는 예방에 사용되는 약학적 조성물로서,
    GM-CSF에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 항체의 가변 중쇄가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 가변 경쇄가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방이 피험자에게 GM-CSF에 특이적인 항체를 유효량 투여하는 단계를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 피험자가 인간인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 피험자가 래트(rat) 또는 생쥐(mouse)를 포함하는 설치류인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방이 미엘린 시트의 탈미엘린화를 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방이 염증 세포가 척수로 유입되는 것을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방이 T세포의 증식을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방이 T세포에 의한 IL17의 분비를 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 GM-CSF에 특이적인 항체가 피하 또는 척수 내로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
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