MX2014004662A - Antagonistas de il17c para el tratamiento de trastornos inlflamatorios. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona antagonistas de IL17C para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

Description

ANTAGONISTAS DE IL17C PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS INFLAMATORIOS Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con el No. de serie 61/548,744, presentada el 19 de octubre de 2011, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

Campo de la invención La presente solicitud se refiere a antagonistas de IL17C para su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios como artritis. Los antagonistas de IL17C ejemplares son los anticuerpos específicos de IL17C o sus fragmentos, como los anticuerpos humanos anti-IL17C.

Antecedentes La IL17C es un homodímero secretado ligado a disulfuro de la familia de proteínas IL17. Se ha demostrado in vitro que la IL17C estimula la liberación de TNF-a e IL-Ib de la línea células monocítica THP-1 (Li et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 97, 773-8). La IL17C puede inducir la expresión de ARNm de las citocinas inflamatorias como IL-Ib, IL-6 e IL-23 en las células peritoneales exudadas (PECS) y la línea celular 3T3 (Yamaguchi et al . (2007) J. Immunol 179, 7128-36). Las células T CD4+ in vivo transducidas con artritis inducida con colágeno (CIA) exacerbado por IL17C en ratones y ratones reconstituidos con células de médula ósea transducidas con IL17C padecieron artritis severa inducida por colágeno. Se informó que la IL17C se unió al receptor E de IL-17 (IL17RE/Fc) y pareció activar el NF-kB (Calhoun (2007) Bachelor's Thesis: Generation of proof of concept molecules: Neutralizing monoclonal antibodies to IL17C; Oregon State University, University Honours College; Gaffen (2009) Nat Rev. Immunol 9, 556-67) y también se informó que afectó al miembro de la familia IkappaB nuclear, IkBc en la activación de células Thl7 en ratones con deficiencia de IL17C (Chang et al . (2011) Immunity 35, 1-11). La expresión de IL17C en el tejido normal parece restringirse al riñón adulto y fetal. La expresión de ARNm de IL17C en las patas artríticas de los ratones que padecen CIA es muy elevada. Hwang et al . describieron la expresión de IL17C en células mononucleares de líquido sinovial y sangre periférica de pacientes que padecen artritis reumatoidea (Hwang & Kim (2005) Mol Cells 19, 180-184).

En WO 99/060127 se describe la clonación de IL17C (PR01122). En WO 99/060127 se asoció de forma general ciertos trastornos con IL17C, incluida la artritis (por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoidea, artritis psoriática), sepsis, colitis ulcerativa, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, artritis de células gigantes, lupus sistémico eritematoso y síndrome de Sjogren. Asimismo se contempla que los compuestos de WO 99/060127 pueden utilizarse para tratar varias afecciones, incluidas las caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de los genes asociados con la enfermedad identificados en la presente. No obstante, no se ha proporcionado prueba experimental para esta función especulativa de IL17C. Lo mismo sucede para WO 2005/065711.

La presente invención demuestra por primera vez en experimentos in vivo que los antagonistas de IL17C son altamente eficaces en el tratamiento de trastornos inflamatorios.

Sumario de la invención La presente invención proporciona antagonistas de IL17C para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

El trastorno inflamatorio tratado con los antagonistas de la presente invención puede ser cualquier trastorno inflamatorio seleccionado de artritis, como artritis reumatoidea, asma, sepsis, una enfermedad autoinmune, como enfermedad intestinal inflamatoria, COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), lupus eritematoso sistémico (SLE) y sarcoidosis. En realizaciones particulares, dicho trastorno inflamatorio es artritis.

Los antagonistas de IL17C de la presente invención pueden ser cualquier antagonista. Preferentemente, dicho antagonista es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, como un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo o su fragmento especifico para IL17C o un anticuerpo o su fragmento especifico para el receptor de IL17C.

Lcyendas de las figuras La figura 1A muestra el ensayo configurado para el ensayo de interacción de receptores. Las proteínas de fusión ECD de los receptores de IL17 se recubrieron en una placa de 384 pocilios Multi-array®. Se aplicó el IL17C biotinilado de ratón y se detectó con estreptavidina.

La figura IB muestra los resultados del ensayo de interacción de receptores mostrado en la figura 1A. Se encontró claramente que la IL17C se unió al IL17RE/Fc de ratón pero no al IL-17RB de ratón u otro receptor irrelevante.

La figura 1C muestra los resultados del ensayo de interacción de receptores mostrado en la figura 1A. Ninguno de los tres anticuerpos de la téenica anterior inhibe la unión de la IL17C de ratón al IL17RE/Fc de ratón.

La figura 2 muestra los resultados del control de calidad con base en la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

La figura 3 muestra los resultados de la determinación de EC50 en ELISA. Todos los anticuerpos IgG2a quiméricos humanos/ de ratón purificados se valoraron sobre IL17C de ratón con una concentración de lOOnM.

La figura 4 muestra las afinidades monovalentes de los anticuerpos anti-IL17C. Las afinidades se determinaron mediante valoración de equilibrio de las soluciones (SET) mediante el uso de fragmentos de Fab.

La figura 5 muestra los valores de IC50 determinados en el ensayo de inhibición del receptor E de IL-17 descrito en el ejemplo 11.

La figura 6 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad de suero de ratón. 11 IgG purificadas mostraron rendimientos de producción aceptables y unión especifica a la IL17C de ratón después de 24 horas de incubación con suero de ratón.

La figura 7 muestra los resultados de la administración de MOR12743 y MOR12762 sobre el valor clínico en el protocolo de tratamiento del modelo de CIA de ratón en comparación con el vehículo Enbrel® (etanercept) y un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 8 muestra los resultados de la administración de MOR12743 y MOR12762 sobre el área debajo de la curva (AUC) en el protocolo de tratamiento del modelo de CIA de ratón en comparación con el vehículo Enbrel® (etanercept) y un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 9 muestra los resultados de la administración de MOR12762 en el valor de Larsen en el protocolo de profilaxis del modelo de CIA de ratón en comparación con un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 10 muestra los resultados de la administración de MOR12762 o OR12743 en el reclutamiento de células inflamatorias en BALF en un modelo de ratón de neutrofilia pulmonar aguda en comparación con un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 11 muestra los resultados del perfilado de la expresión de IL17C mediante el uso de qRT-PCR. Se detectaron niveles de expresión de IL17C superiores en las muestras de tejido de pulmón provenientes de donantes a los que se les diagnosticó enfermedades respiratorias inflamatorias en comparación con los niveles de expresión de IL17C en las muestras de control. Se analizaron muestras de 5 donantes individuales para cada grupo.

La figura 12 muestra el efecto de anticuerpos neutralizadores de MOR1243 sobre el espesor de la epidermis en el modelo de ratón similar a la psoriasis inducida por imiquimod (IMQ).

La figura 13A muestra los resultados del análisis cuantitativo de RT-PCR de la expresión de ARNm de IL17C en queratinocitis epidérmica humana tratada durante 2 horas, 6 horas, 24 horas o 48 horas con medio solo, IL-1 (10 ng/mL), TNF (10 ng/mL), IL-17A (250 ng/mL) o combinaciones de estos disparadores.

La figura 13B muestra los resultados del análisis cuantitativo de RT-PCR de la expresión de ARNm de IL17C en queratinocitis epidérmica humana tratada durante 2 horas, 6 horas o 24 horas con medio solo, o varios ligandos de TLR: ligando de TLR4, LPS (1 mg/mL), ligando de TLR5, flagelina (1 pg/mL), ligando de TLR7, guardiquimod (4 pg/mL), ligando de TLR7/8, CL097 (10 pg/mL) y ligando de TLR9, CpG ODN 2116 (10 pM).

Descripción detallada de la invención La presente invención demuestra que la IL17C es un objetivo válido para el tratamiento de trastornos inflamatorios. En este sentido, la invención proporciona, en un aspecto, métodos para utilizar un antagonista de IL17C para provocar un beneficio profiláctico o terapéutico en el tratamiento de trastornos inflamatorios.

La presente invención proporciona métodos terapéuticos que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de IL17C a un individuo que necesita dicho tratamiento. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad de un antagonista de IL17C necesario para provocar la respuesta biológica deseada. De conformidad con la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad de un antagonista de IL17C necesaria para tratar y/o prevenir un trastorno inflamatorio.

Los términos "trastorno inflamatorio" o "enfermedad inflamatoria" se utilizan de forma intercambiable y como se utiliza en la presente se refieren a cualquier anormalidad asociada con la inflamación. Los ejemplos de trastornos asociados con la inflamación incluyen aené común, artritis, como artritis reumatoidea, asma, enfermedades autoinmunes, prostatitis crónica, COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades intestinales inflamatorias, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, sarcoidosis, rechazo de transplante, vasculitis, cistitis intersticial y sepsis. Los trastornos inflamatorios pueden ser crónicos o agudos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, Diabetes mellitus tipo I, gastritis, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, Lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis psoriática, síndrome de las piernas inquietas, artritis reumatoidea, sarcoidosis, escleroderma, lupus eritematoso sistémico y colitis ulcerativa.

La artritis puede manifestarse por sí sola como la forma principal de la enfermedad. Este es por ejemplo el caso de la osteoartritis, artritis reumatoidea, artritis séptica, gota y pseudo-gota, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still y espondilitis anquilosante. Otras formas de artritis son secundarias a otras enfermedades, por ejemplo, síndrome de Ehlers-Danlos, sarcoidosis, púrpura de Henoch-Schonlein, artritis psoriática, artritis reactiva, hemocromatosis, hepatitis, granulomatosis de Wegener (y otros síndromes de vasculitis), enfermedad de Ly e, fiebre mediterránea familiar, hiperinmunoglobulinemia D con fiebre recurrente, receptor de TNF asociado con síndrome periódico y enfermedad intestinal inflamatoria (incluida la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa).

El término "inflamación pulmonar" abarca cualquier enfermedad pulmonar inflamatoria, bronquitis crónica aguda, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, síndrome de Goodpasture y cualquier afección pulmonar en la que los glóbulos blancos puedan jugar un papel que incluye, a modo no taxativo, la fibrosis pulmonar iodiopática y cualquier otra enfermedad pulmonar autoinmune.

El término "IL17C" se refiere a una proteína conocida como interleucina 17C (identificada en la Comisión de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) como ID 5983 y en la base de datos informática de genoma de ratón (MGI) como ID 2446486). En algunas publicaciones anteriores se hace referencia a la IL17C como CX2 o IL-21, no obstante, no debe confundirse con la cítosina IL-21, que se expresa de forma específica en las células T CD4+ activadas pero no en la mayoría de los demás tejidos (Parrish-Novak et al (2000). Nature 408 (6808): 57-63). La IL-21 humana se encuentra en el cromosoma 4 y se identifica en la base de datos de HGNC como ID 6005. La IL17C se encuentra en el cromosoma 16 y tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q9P0M4): MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQA LPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRYPQ KLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAEAFHTEFI HVPVGCTCVLPRSV (SEQ ID No.:181) El término "IL17RA" se refiere a una proteína conocida como receptor A de interleucina 17. La IL17RA humana tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q96F46): MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDS W1HPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTN ERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVP DCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHS CFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPE MPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLP AADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMT WVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILP DFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHR VGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPL LPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLA AEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSST PMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSD QGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGW DTMGSESEGPSA (SEQ ID No.:182) El término "IL17RE" se refiere a una proteina conocida como receptor E de interleucina 17. La IL17RE humana tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q8NFR9): MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDSAGIGFRHLPHWNTRCPLASHTDDSFTGSSAYIPCRTWW ALFSTKPWCVRVWHCSRCLCQHLLSGGSGLQRGLFHLLVQKSKKSSTFKFYRRHKMPAPAQ RKLLPRRHLSEKSHHISIPSPDISHKGLRSKRTQPSDPETWESLPRLDSQRHGGPEFSFDL LPEARAIRVTISSGPEVSVRLCHQWALECEELSSPYDVQKIVSGGHTVELPYEFLLPCLCI EASYLQEDTVRRKKCPFQSWPEAYGSDFWKSVHFTDYSQHTQMVMALTLRCPLKLEAALCQ RHDWHTLCKDLPNATARESDGWYVLEKVDLHPQLCFKFSFGNSSHVECPHQTGSLTSWNVS MDTQAQQLILHFSSRMHATFSAAWSLPGLGQDTLVPPVYTVSQARGSSPVSLDLIIPFLRP GCCVLVWRSDVQFAWKHLLCPDVSYRHLGLLILALLALLTLLGVVLALTCRRPQSGPGPAR PVLLLHAADSEAQRRLVGALAELLRAALGGGRDVIVDLWEGRHVARVGPLPWLWAARTRVA REQGTVLLLWSGADLRPVSGPDPRAAPLLALLHAAPRPLLLLAYFSRLCAKGDIPPPLRAL PRYRLLRDLPRLLRALDARPFAEATSWGRLGARQRRQSRLELCSRLEREAARLADLG (SEQ ID No.:183) El "antagonista de IL17C", como se utiliza en la presente, se refiere a antagonistas de IL17C en el sentido más amplio. Se incluye cualquier molécula que inhiba la actividad o función de IL17C o que de otra forma ejerza un efecto sobre la IL17C. El término antagonista de IL17C incluye, a modo no taxativo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a IL17C, ácidos nucleicos inhibidores específicos para IL17C o moléculas orgánicas pequeñas especificas para IL17C. Asimismo dentro del significado del término antagonista de IL17C se encuentran los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen de forma especifica al receptor de IL17C, los ácidos nucleicos inhibidores específicos para el receptor de IL17C o moléculas orgánicas pequeñas específicas para el receptor de IL17C. El término antagonista de IL17C también se refiere a moléculas de andamiaje que no son anticuerpos, como andamiajes de fibronectina, anquirinas, axicuerpos/avímeros, moléculas derivadas de proteína A, anticalinas, afilinas, moléculas miméticas de epítopos de proteína (PEM) o similares.

Los ácidos nucleicos inhibidores incluyen, a modo no taxativo, ADN antisentido, oligonucleótidos que forman triples, secuencias guía externas, ARNsi y micro ARN. Los ácidos nucleicos inhibidores útiles incluyen los que reducen la expresión de la IL17C que codifica ARN en al menos un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o un 95 por ciento en comparación con los controles. Los ácidos nucleicos inhibidores y los métodos para producirlos son bien conocidos en la téenica. El software de diseño de ARNsi se encuentra disponible.

Las moléculas orgánicas pequeñas (SMOL) específicas para IL17C o el receptor de IL17C puede identificarse mediante análisis de productos naturales o análisis de bibliotecas químicas. Típicamente, el peso molecular de SMOL se encuentra por debajo de los 500 daltones, más típicamente de 160 a 480 daltones. Otras propiedades típicas de las SMOL son una o más de las siguientes: • El coeficiente de partición log P se encuentra en el intervalo de -0.4 a +5.6 • La refractividad molar es de 40 a 130 • La cantidad de átomos es de 20 a 70 Por reseñas véase Ghose et al . (1999) J Combin Chem: 1, 55-68 y Lipinski et al (1997) Adv Drug Del Rev: 23, 3-25.

Preferentemente, el antagonista de IL17C para su uso en la presente invención es un anticuerpo específico para IL17C o específico para el receptor de IL17C. Dicho anticuerpo puede ser de cualquier tipo, como un anticuerpo murino, de rata, quimérico, humanizado o humano. Anticuerpo "humano" o fragmento de anticuerpo humano funcional se define en la presente como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no de una especie no humana (en su totalidad o en parte). El anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo funcional puede derivarse de un humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. El "anticuerpo humano sintético" se define en la presente como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, en su totalidad o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpos humanos conocidas. In silico puede lograrse el diseño de una secuencia de anticuerpos humanos o su fragmento, por ejemplo, mediante el análisis de una base de datos de secuencias de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos y el diseño de una secuencia de polipéptidos que utilice los datos obtenidos de ella. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo funcional es uno que es codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, dicha biblioteca se basa en anticuerpos tomados de una fuente natural humana).

El "anticuerpo humanizado" o fragmento de anticuerpo humanizado funcional se define en la presente como uno que (i) se deriva de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que presenta un sistema inmunitario heterólogo), donde dicho anticuerpo se basa en una secuencia de linea germinal humana; o (ii) quimérico, donde el dominio variable se deriva de un origen no humano y el dominio constante se deriva de un origen humano o (iii) se injerta en las CDR, donde las CDR del dominio variable tienen un origen no humano, mientras que uno o más marcos del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si lo hubiera) es de origen humano.

El término "anticuerpo quimérico" o fragmento de anticuerpo quimérico funcional se define en la presente como una molécula de anticuerpo que tiene regiones de anticuerpos constantes derivadas de o que corresponden a las secuencias encontradas en una especie y regiones de anticuerpos variables derivadas de otras especies. Preferentemente, las regiones de anticuerpos constantes se derivan o corresponden a las secuencias encontradas en humanos, por ejemplo, en la linea germinal humana o en las células somáticas y las regiones de anticuerpos variables (por ejemplo, regiones de VH, VL, CDR o FR) se derivan de las secuencias encontradas en un animal no humano, por ejemplo, ratón, rata, conejo o hámster.

En un aspecto, la unión a antigenos puede llevarse a cabo por "fragmentos" de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "fragmento de anticuerpo" de un anticuerpo incluyen un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHl; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un anticuerpo de dominio simple (dAb) (Ward et al . , (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante complementaria (CDR) aislada.

El "fragmento de cadena simple (scFv)" es una cadena de proteínas simple en la que las regiones VL y VH se disponen en parejas para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv (scFv) de cadena simple); véase, por ejemplo, Bird et al . , (1988) Science 242:423-426; y Huston et al . , (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . 85:5879-5883). A pesar de que los dos dominios VL y VH son codificados por genes diferentes, pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un enlazador peptidico artificial que les permite conformarse como una cadena de proteínas simple. Dichos anticuerpos de cadena simple incluyen una o más porciones de unión a antigenos. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de téenicas convencionales conocidas por los entendidos en la técnica y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad de la misma forma que los anticuerpos intactos.

El término "aislado" se refiere a un compuesto que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se encuentra sustancialmente libre de otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Además, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede encontrarse sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a la preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular simple. La composición de anticuerpos monoclonales muestra un sitio de unión único que tiene una especificidad de unión única y afinidad para epitopos particulares.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "se une específicamente a", "se une de forma específica a", es "específico para" o "reconoce específicamente" un antígeno (aquí, IL17C o, de forma alternativa, el receptor de IL17C) si dicho anticuerpo es capaz de diferenciar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, dado que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta sino relativa. El/los antígeno(s) de referencia puede ser uno o más antígeno(s) estrechamente relacionados, que se utilizan como puntos de referencia, por ejemplo, IL17A o IL17B. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo de diferenciar entre un antígeno de interés y un antígeno no relacionado, como se determina, por ejemplo, de conformidad con uno o más de los siguientes métodos. Dichos métodos comprenden, a modo no taxativo, inmunotransferencia Western, pruebas ELISA, RIA, ECL e IRMA y escaneos de péptidos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo ELISA estándar. La puntuación puede llevarse a cabo mediante desarrollo de color estándar (por ejemplo, anticuerpo secundario con peróxido de rábano picante y tetrametil bencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en ciertos pocilios se clasifica por su densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (=reacción negativa) puede ser 0.1 OD; la reacción positiva típica puede ser 1 OD. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser superior a 10 veces. Típicamente, la determinación de la especificidad de unión se realiza mediante el uso no de un único antígeno de referencia, sino de un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, como leche en polvo, BSA, transferrina o similar. Además, la "unión específica" puede relacionarse a la capacidad de un anticuerpo de diferenciar entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios o regiones de IL17C o el receptor de IL17C o entre uno o más residuos de aminoácidos clave o fragmentos de residuos de aminoácidos de IL17C o el receptor de IL17C.

"Inoculación cruzada" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otras porciones de unión a antígenos de interferir con la unión de otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o porciones de unión a anticuerpos para un antígeno específico en un ensayo de unión competitiva estándar. La capacidad o grado en que un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otras porciones de unión a antígenos pueden interferir con la unión de otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo o porciones de unión a antígenos a un antígeno específico y, por consiguiente si puede decirse que se inocula de forma cruzada de conformidad con la invención, puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión competitiva estándar. Un ensayo adecuado implica el uso de la teenología de Biacore (por ejemplo, mediante el uso del instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el grado de interacciones mediante el uso de tecnología de resonancia plasmónica de superficie. Otro ensayo para medir la inoculación cruzada utiliza un enfoque basado en ELISA. En la solicitud de patente internacional No. WO 2003/48731 se describe un proceso de alto rendimiento global para anticuerpos de "unión a epítopos" con base en su inoculación cruzada. La inoculación cruzada se encuentra presente si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se está investigando reduce la unión de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 a IL17C en un 60% o más, específicamente en un 70% o más y más específicamente en un 80% o más y si uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 reduce la unión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a IL17C en un 60% o más, específicamente en un 70% o más y más específicamente en un 80% o más.

El término "epítopo" incluye cualquier región proteinácea que es específicamente reconocida por una inmunoglubulina o receptor de células T o de otro modo interactúa con una molécula. Generalmente, los epítopos se componen de agrupaciones de moléculas químicamente tensioactivas como los aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcar y generalmente pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Como lo apreciará el entendido en la téenica, prácticamente cualquier cosa a la que un anticuerpo pueda unirse de forma específica puede ser un epítopo. Un epítopo puede comprender los residuos a los que el anticuerpo se une y pueden ser "lineales" o "conformacionales". El término "epítopo lineal" se refiere a un epítopo donde todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interactuante (como un anticuerpo) ocurren linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos principal de la proteína (continua). El término "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo en el que aminoácidos discontinuos se juntan en conformaciones tridimensionales. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción ocurren a lo largo de los residuos de aminoácidos sobre la proteína que se encuentran separados entre sí.

"Se une al mismo epítopo que" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra porción de unión a antígenos de unirse a un antígeno específico y de tener el mismo epítopo que el anticuerpo ejemplificado. Los epítopos del anticuerpo ejemplificado y otros anticuerpos pueden determinarse mediante el uso de técnicas de mapeo de epítopos. Las técnicas de mapeo de epítopos son bien conocidas en la téenica. Por ejemplo, los epitopos conformacionales pueden identificarse fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos como mediante, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional.

Asimismo, como se utiliza en la presente, la "inmunoglobulina (Ig) se define en la presente como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquiera de sus subclases) e incluye todos los anticuerpos conocidos convencionalmente y sus fragmentos funcionales. El "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define en la presente como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión a antígenos. La "región de unión a antígenos" de un anticuerpo típicamente se encuentra en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDK-1, -2, y/o -3; no obstante, las regiones de "marco" variable también pueden jugar un papel importante en la unión a antígenos, como mediante el suministro de andamiaje para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígenos" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena liviana (VL) variable y 5 a 109 de la cadena pesada (VH) variable, más preferentemente los residuos de aminoácidos 3 a 107 de la VL y 4 a 111 de la VH y son particularmente preferidas las cadenas VH y VL completas (posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de conformidad con WO 97/08320). Una clase preferida de inmunoglobulinas para su uso en la presente invención es IgG. Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv o construcciones que comprenden dominios variables de inmunoglobulina simple o polipéptidos de anticuerpos de dominio simple, por ejemplo, dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena liviana simple. El F(ab')2 o Fab puede diseñarse para minimizar o eliminar completamente las interacciones de disulfuro intermolecular que ocurren entre los dominios CH1 y CL.

Un anticuerpo de la invención puede derivarse de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en las secuencias de aminoácidos que fueron diseñadas in silico y codificadas por ácidos nucleicos creados sintéticamente. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpos se logra, por ejemplo, mediante el análisis de una base de datos de secuencias humanas y el suministro de una secuencia de polipéptidos que utiliza los datos obtenidos a partir de ella. Los métodos para diseñar y obtener secuencias creadas in silico se describen, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al . , J. Immunol. Methods. (2001) 254:67, Rothe et al . , J. Mol. Biol. (2008) 376:1182; y en la patente de Estados Unidos No. 6,300,064 expedida a favor de Knappik et al . , que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad.

Un anticuerpo especifico para IL17C puede utilizarse con la presente invención. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos de la téenica anterior tales como A: Anticuerpo de IL17C anti ratón monoclonal IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311522, # MAB23061), B: Anticuerpo de IL17C anti ratón monoclonal IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311523, # MAB2306), C: IL17C anti ratón de rata (US Biological; clon: 8B28, #I8439-20R3) (tomado del ejemplo 4).

Otros anticuerpos que pueden utilizarse para realizar la presente invención incluyen los anticuerpos anti- IL17C disponibles en Abnova (Walnut, CA, USA; catálogo #H00027189-B01P, #H00027189-D01 y #H00027189-D01P) y los anticuerpos anti-ILl7C disponibles en anticuerpos en linea GmbH (Aachen, Alemania; catálogo #ABIN525892, #ABIN327411, #ABIN525893, #ABIN221340, #ABIN221341, #ABIN221342 y #ABIN525891). Otros anticuerpos específicos para IL17C que pueden utilizarse con la presente invención son los aislados y descritos en la presente invención en sí, es decir, los listados en la tabla 1.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Por consiguiente, la invención incluye una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención (o un fragmento de anticuerpo funcional) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para ello. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar un trastorno inflamatorio. Dicho método comprende las etapas de administrar a un individuo que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención como se describe o contempla en la presente.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un individuo, dicho método comprende la etapa de administrar un antagonista de IL17C a dicho individuo. "Individuo", como se utiliza en este contexto se refiere a cualquier mamífero, incluidos los roedores, como ratón o rata y primates como mono cinomolgo ( Macaca fascicularis) , mono resus ( Macaca mulatta ) o humanos ( Homo sapiens) . Preferentemente, el individuo es un primate, más preferentemente un humano.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio, dicho método comprende la etapa de administrar a un individuo un antagonista de IL17C, donde dicho antagonista de IL17C puede unirse a IL17C con una afinidad de aproximadamente menos que 100 nM, más preferentemente menos que aproximadamente 60 nM y aún más preferentemente menos que aproximadamente 30 nM. Asimismo se prefieren los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a IL17C con una afinidad de menos que aproximadamente 10 nM y más preferentemente menos que aproximadamente 3 nM.

En ciertos aspectos dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C y dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo reacciona de forma cruzada con IL17C de otras especies como IL17C de ratón, rata, mono resus y/o mono cinomolgo. En ciertos aspectos dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado especifico para IL17C. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado especifico para IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal. En una realización adicional dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal aislado especifico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En una realización adicional dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal aislado especifico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En una realización adicional dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado reacciona de forma cruzada con la IL17C de otras especies, como IL17C de ratón, rata, mono resus y/o mono cinomolgo.

En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C es un anticuerpo sintético humano. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado especifico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado especifico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano sintético.

En un cierto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un antagonista de IL17C capaz de antagonizar la IL17C en un trastorno inflamatorio, dicha composición comprende además uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En ciertos aspectos, los antagonistas de IL17C, como anticuerpos específicos para IL17C, pueden antagonizar cualquiera de los roles de la IL17C en un trastorno inflamatorio.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis de un trastorno inflamatorio en un individuo, dicho método comprende administrar un antagonista de IL17C a dicho individuo. El término "profilaxis" como se utiliza en este contexto se refiere a métodos que se dirigen a prevenir el comienzo de una enfermedad o que retrasan el comienzo de una enfermedad.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona una composición que comprende un antagonista de IL17C útil en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, dicha composición comprende además uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona antagonistas de IL17C para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

En otros aspectos, la presente invención proporciona el uso de un antagonista de IL17C en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. En otros aspectos, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un individuo, que comprende administrar al individuo un antagonista de IL17C.

En aspectos particulares, los antagonistas de IL17C de la presente invención se administran subcutáneamente. En otros aspectos, los antagonistas de IL17C de la presente invención se administran de forma intravenosa, intraarticular o intraespinal.

Las composiciones de la presente invención son preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista de IL17C y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. Dichos vehículos, diluyentes y excipientes son bien conocidos en la téenica y el entendido en la técnica encontrará la formulación y vía de administración más adecuada para tratar a un individuo con los antagonistas de IL17C de la presente invención.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de un trastorno inflamatorio en un individuo, que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de IL17C. En ciertos aspectos, dicho individuo es un humano. En aspectos alternativos, dicho individuo es un roedor, como una rata o un ratón.

En ciertos aspectos, dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C. En ciertos aspectos, dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En aspectos alternativos, dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para el receptor de IL17C.

En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C bloquea la unión de IL17C a un receptor de IL17C. En aspectos alternativos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C al receptor de IL17C.

En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C bloquea la unión de IL17C al receptor de IL17, donde dicho receptor es IL17RE. En aspectos alternativos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para el receptor de IL17C bloquea la unión de H717C a IL17RE.

En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C bloquea la unión de IL17C a IL17RE con una concentración IC50 menor que IOOhM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, IOhM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, InM, IOOrM, 90pM, 80pM, 70pM, 60pM, 50pM, 40pM, 30pM, 20pM, IOrM, 9pM, 8pM, 7p , 6pM, 5pM, 4pM, 3pM, 2pM o lpM. En ciertos aspectos, la concentración IC5o puede determinarse mediante ELISA; SET, FACS o MSD (Meso Scale Discovery).

En ciertos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para IL17C bloquea la unión de IL17C a uno o más receptores de IL17C. En aspectos alternativos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C a receptores de IL17C, donde los receptores de IL17 incluyen IL17RE e IL17RA. En aspectos alternativos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C a IL17RE e IL17RA.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un antagonista de IL17C para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno inflamatorio. En ciertos aspectos, dicho tratamiento o profilaxis comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz del antagonista de IL17C. En ciertos aspectos, dicho individuo es un humano. En aspectos alternativos, dicho individuo es un roedor, como una rata o un ratón.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que se inocula de forma cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1. En una cierta realización, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que se inocula de forma cruzada con un anticuerpo que comprende 6 CDR de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1. En una cierta realización, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que se inocula de forma cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1 y reduce la unión especifica de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 en al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o un 90% en una inoculación cruzada a base de ELISA. En una cierta realización, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que se inocula de forma cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1 y reduce la unión especifica de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 a IL17C en al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o un 90% en una inoculación cruzada a base de ELISA.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que interactúa con (por ejemplo, mediante unión, estabilización, distribución espacial) el mismo epitopo que un anticuerpo descrito en la tabla 1.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que comprende 6 CDR definidas por Kabat de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que comprende 6 CDR definidas por Kabat de cada uno de los anticuerpos en la tabla 1.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que comprende una VH y una VL de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este, donde el ácido nucleico comprende una VH y una VL de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de este que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad secuencial con respecto a los ácidos nucleicos descritos en la tabla 1.

Los entendidos en la téenica apreciarán que la invención descrita en la presente es pasible de variaciones y modificaciones diferentes a aquellas descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas dichas variaciones y modificaciones. La invención incluye además todas las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en la presente memoria descriptiva, individualmente o colectivamente y todas y cada una de las combinaciones de cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

Tabla 1: Ejemplo 1: IL17C de ratón La IL17C de ratón se compró en R&D Systems (#2306-ML/CF; R&D Systems, Inc., Minneapolis, E.U.A.). La IL17C de ratón biotinilada se preparó mediante el uso del módulo de biotinilación ECLTM (GE Healthcare; #1061918). Después de la biotinilización el producto se purificó mediante el uso de columnas de rotación de desalación ZebaTM (Pierce; #89889).

El control de calidad de IL17C biotinilada se realizó mediante el uso de dispersión de luz dinámica (DLS), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SDS-PAGE. Como se esperaba, el SDS-PAGE reveló un peso molecular aparente de aproximadamente 22 kDa en condiciones de reducción y de aproximadamente 40 kDa en condiciones no de reducción. Además, no se pudieron detectar especies o agregados de peso molecular alto. El tamaño de antígeno predicho se confirmó en SEC, donde la IL17C biotinilada de ratón se encontraba visible como un pico con un peso molecular de aproximadamente 43 kDa. En DLS, no se pudieron detectar agregados. Adicionalmente, se confirmó que la IL17C de ratón se biotiniló cuantitativamente. Únicamente el material que pasó el control de calidad se utilizó para los ensayos panorámicos y de unión.

Ejemplo 2: Receptor E de IL17de ratón El dominio extracelular (ECD) del receptor E de IL-17 de ratón (GenID: 57890, isoforma 1) se clonó como una proteina de fusión FC de extremo C (denominada "IL17RE/Fc"). Una construcción que contiene un líder de VK seguido del ECD de IL17C de ratón se expresó transitoriamente en células HKB11 (Cho et al . (2002) J. Biomed Sci. Nov-Dic; 9(6 Pt 2):631—8)-Los productos se purificaron a través de cromatografía de afinidad a la proteína A. La pureza se analizó según desnaturalización, reducción y desnaturalización, sin condiciones de reducción en SDS-PAGE y en estado natural mediante SEC de alta presión y DLS.

Ejemplo 3: Ensayo de interacción del receptor E de IL17C - IL17 Se preparó un ensayo de interacción para analizar la unión de IL17 de ratón a su receptor putativo, receptor E de IL17. La configuración del ensayo se describe en la figura 1A. En resumen, los receptores B y E de IL17 se recubrieron en una placa estándar de 384 pocilios Multi-array® (Meso Scale Discovery; #L21XA-4) y se agregó IL17C de ratón biotinilado. La unión de IL17C de ratón a su receptor se midió a través de estreptavidina en un MSD Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA).

Los resultados se muestran en la figura IB. Se demostró claramente que la IL17C se une a la IL17RE/Fc de ratón, pero no a la IL-17RB de ratón u otro receptor irrelevante. Asimismo, el ligando biotinilado irrelevante no mostró unión a ninguno de los tres receptores analizados. Por lo tanto, el ensayo de interacción es altamente especifico y muy adecuado para el análisis de interacciones del receptor E de IL17C -IL17.

Ejemplo 4: Efecto de anticuerpos de la teenica anterior sobre la interacción del receptor E de IL17C - IL17.

Se analizaron tres anticuerpos de la técnica anterior para demostrar su capacidad de inhibir la unión de IL17C de ratón a IL17RE/Fc de ratón en el ensayo de interacción del ejemplo 3. Se analizaron los siguientes anticuerpos: A: anticuerpo de IL17C anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311522,# MAB23061) B: anticuerpo de IL17C de anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311523,# MAB2306) C: IL17C anti-ratón de rata (US Biological; clon: 8B28, #I8439-20R3) Los anticuerpos se incubaron previamente con IL17C de ratón biotinilado y el complejo formado previamente se agregó después a IL17RE/Fc de ratón recubierto.

Los resultados se muestran en la figura 1C. Ninguno de los anticuerpos de IL17C anti-ratón de la técnica anterior mostró efecto alguno sobre la unión de IL17C de ratón a su receptor de IL17RE/Fc.

Ejemplo 5: Estrategia de cribado Se utilizó la biblioteca de HuCAL PLATINUM® para seleccionar fragmentos Fab específicos contra la IL17C de ratón. Esta biblioteca de fagémidos está basada en el concepto de HuCAL® descrito en Knappik et al . (Knappik et al . (2000) J. Mol. Biol.296:57-86) y emplea la teenología de CysDisplay® para exponer el Fab en la superficie de fagos (Lohning et al . , W02001/05950).

Se llevaron a cabo diferentes estrategias de cribado, cribado de solución, incluidas varias estrategias de maduración, así como cribado de fase sólida convencional. Para el cribado de fase sólida se recubrió la IL17C de ratón directamente en placas MaxisorpTM Immuno (Nunc; #442404). Se realizaron un total de tres rondas de cribado para el cribado de fase sólida. Se realizaron tres rondas de selección con un aumento sucesivo de exigencias de lavado y reducción de concentración de antígenos de una ronda a otra. Para el cribado de solución se expuso el antígeno biotinilado a la biblioteca de fagos en solución con captura posterior de complejos de antígeno-fago en cuentas de estreptavidina. Nuevamente se realizaron tres rondas de selección con un aumento sucesivo de exigencias de lavado y reducción de concentración de antígenos de una ronda a otra. Los fagos se aislaron mediante el uso de cuentas magnéticas acopladas a estreptavidina (Invitrogen, #112-05D). Para seleccionar anticuerpos de alta afinidad, se generaron bibliotecas de HCDR2 y LCDR3 después de la segunda ronda de selección (tamaño de biblioteca promedio ~lxl08) seguida de dos rondas de selección adicionales con más exigencia aumentada y más concentraciones disminuidas de antigeno.

Ejemplo 6: Caracterización inicial de cribado de salida a través de ELISA Para facilitar la rápida expresión de fragmentos Fab solubles en U sados bacterianos brutos se prepararon extracciones periplasmáticas tal como se describió anteriormente (Rauchenberger et al . (2003) J. Mol. Chem. 278.40: 38194-205). Se utilizaron lisados de E. coli que contenían Fab para analizar mediante ELISA los objetivos iniciales.

La especificidad de los aglutinantes se investigó a través de análisis de ELISA sobre el antígeno directamente recubierto o sobre el antigeno biotinilado. Para analizar mediante ELISA el antígeno directamente recubierto se recubrieron placas de 384 pocilios Maxisorp™ (Nunc; #460518) con 2.5 mg/mL de IL17C de ratón en PBS. Después de bloquear las placas con un 5% de polvo de leche descremada en PBS, se agregaron lisados de E. coli que contenían Fab. Se detectó la unión de los Fab mediante IgG anti humana de cabra específica F(ab)2 conjugada a fosfatasa alcalina (dilución 1:5000) mediante el uso de sustrato de fluorescencia Attophos (Roche: #11681982001). La emisión de fluorescencia a 535 nm se registró con excitación a 430 nm. Para el análisis mediante ELISA sobre el antigeno biotinilado se recubrieron placas de 384 pocilios Maxisorp™ con IgG anti humana de oveja especifica de fragmentos Fd (sitio de unión, #PC075) dilución 1:1000 en PBS. Después de bloquear con un 5% de polvo de leche descremada en PBS, se agregaron U sados de E. coli que contenían Fab. Posteriormente, los fragmentos Fab HuCAL® se dejaron aglutinar a 1 mg/ml de IL17C de ratón biotinilado, lo que se detectó mediante incubación con estreptavidina conjugada a alcalina fosfatasa seguida de la adición de sustrato de fluoresencia AttoPhos (Roche: #11681982001). La emisión de fluorescencia a 535 nm se registró con excitación a 430 nm. Casi 9000 fragmentos Fab aislados del procedimiento de cribado se analizaron en estos ensayos ELISA y aproximadamente 2900 fueron positivos en todos los análisis ELISA.

Ejemplo 7: Caracterización de los aglutinantes a través del ensayo de interacción del receptor E de IL17C - IL17 Para analizar los U sados bacterianos brutos que contenían Fab para neutralizar la actividad en modo de análisis de alta producción se utilizó un ensayo ligeramente modificado tal como se describió en el ejemplo 3. Se recubrieron placas MSD de 384 pocilios Maxisorp™ (Nunc; #460518) con 30 mL de IL17RE/Fc de ratón a 0.6 mg/mL en PBS durante la noche a 4°C. Al día siguiente, se incubaron previamente 20 pL de U sados E. coli que contenían Fab durante 30 minutos a temperatura ambiente con un volumen igual de IL17C de ratón biotinilado a 2 nM. Después de bloquear las placas durante 1 hora con BSA al 5% en PBS, se agregaron complejos de anticuerpo-ligando preformados durante 1 hora a IL17RE/Fc recubierta y se detectó la unión del receptor a través de estreptavidina-ECL mediante el uso de MSD Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, E.U.A.).

Para determinar la actividad inhibitoria de IgG2a quimérica humana-ratón anti-IL17C purificada en un ensayo de interacción mIL-17 RE, se recubrieron placas MSD de 384 pocilios Maxisorp™ con 30 pL de IL17RE/Fc de ratón a 75 ng/mL en PBS a 4°C durante la noche. Al siguiente día se incubaron previamente 25 pL de una dilución de anticuerpo en serie (concentraciones de 0.001 a 100 nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente con un volumen igual a la IL17C de ratón biotinilado a 0.125 nM. Después de bloquear las placas durante 1 hora con BSA al 2.5% en PBST, se agregaron complejos de anticuerpo-ligando preformados durante 1 hora a IL17RE/FC recubierta y se detectó la unión del receptor a través de estreptavidina-ECL mediante el uso de MSD Sector Imager .

De todos los aglutinantes positivos de ELISA, el ensayo de interacción del receptor E de IL17C - IL17, seguido de secuenciamiento de los clones positivos, reveló meramente 141 clones de secuencia única que pertenecen a 33 familias diferentes de HCDR3. Esta cantidad se redujo nuevamente mediante análisis confirmatorio en ELISA y ensayo de inhibición de IL17RE/Fc de ratón. Para seleccionar candidatos con la mejor actividad inhibitoria, se diluyeron previamente U sados BEL hasta 1:500 para utilizar en el ensayo de inhibición de IL17RE/Fc. Finalmente, se podrían identificar 18 clones de secuencia única que pertenecen a 8 familias diferentes de HCDR3 que fueron positivos consistente y repetidamente en el ensayo de interacción del receptor E de IL17C - IL17.

Ejemplo 8: Conversión de IgG policlonal La conversión de los fragmentos Fab en un formato de IgG se llevó a cabo mediante clonación policlonal de los fragmentos Fab en el formato deseado de IgG. Se utilizó un formato de IgG quimérica humana-de ratón para evitar reacciones de inmunogenicidad dirigidas contra anticuerpos IL17C anti ratón administrados en la prueba in vivo del concepto de estudio con ratones de tipo salvaje. Se utilizaron dos regiones constantes diferentes - el isotipo de IgG2a y de IgGl. Se quitaron sitios de glucosilación ligados a N potenciales a través de mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Stratagene; #0200524). La diversidad de secuencia de todas las IgG recuperadas de este procedimiento se describe en la tabla 1.

Ejemplo 9: Producción de escala exploratoria de IgG Todas las IgG recuperadas del procedimiento descrito en el Ejemplo 8 se produjeron en escala exploratoria en células HKB11 (Cho et al . (2002) J. Biomed Sci. Nov-Dic; 9(6 Pt 2):631-8) en ambos formatos de isotipo de IgG2a humana/ratón quimérica e IgGl humana/ratón quimérica, con el fin de evaluar los rendimientos de producción y la porción monomérica de los anticuerpos con dos regiones constantes diferentes. Las mayores cantidades podrían producirse con anticuerpos del formato IgG2a humana/de ratón quimérica. Este formato también pasó exitosamente el control de calidad en SEC (> 90% de contenido de monómeros). Por lo tanto, se eligió el formato IgG2a humana/de ratón quimérica para análisis funcional adicional. El rendimiento de purificación y la porción de monómeros tal como se determinó en SEC se muestra en la figura 2.

Ejemplo 10: Determinación de afinidad Todos los anticuerpos de IgG2a humana-de ratón quimérica purificada se titularon en IL17C de ratón para la determinación de la EC50 en ELISA comenzando con una concentración de 100 nM. Los valores de EC5oen IL17C de ratón se determinaron en 1 a 3 experimentos independientes. Los resultados se muestran en la figura 3.

Los valores de EC50 oscilaron entre 200 y 1200 pM, la mayoría de los valores de EC50 estuvieron aproximadamente en 300 pM. La actividad de unión de 4 IgG (MOR12755, MOR12756, 12757, 12758) no pudo confirmarse con IgG2a purificada, por lo tanto, estas IgG no se sometieron a caracterización adicional. Ninguno de los anticuerpos mostró reactividad cruzada a IL17C humana (77% de identidad secuencial), a IL-17B de ratón (30% de identidad secuencial) o a la lisozima de antígeno de control negativo.

Las afinidades monovalentes de los anticuerpos anti-IL17C se determinaron mediante titulación de equilibrio de solución (SET) mediante el uso de fragmentos Fab. La determinación de la afinidad en solución se llevó a cabo básicamente tal como se describió en la literatura (Friquet et al . , (1985) J. Immunol. Meth.77: 305-19). Con el fin de mejorar la sensibilidad y precisión del método SET, se transfirió de ELISA clásico a teenología basada en ECL (Haenel et al . (2005) Anal Biochem. 339.1: 182-84). Los aglutinantes se expresaron y purificaron en formato Fab_FH. Algunos Fab no se unieron o no mostraron ninguna curva de unión sigmoide en SET, por lo tanto, las afinidades podrían determinarse únicamente para 10 candidatos. Las afinidades monovalentes oscilaron entre 48 y 4100 pM con la mayoría de los valores KD de los Fab en el intervalo de pM menor (£ 100 pM). Los resultados se muestran en la figura 4.

Ejemplo 11: El ensayo de interacción del receptor E de IL17C - IL17 con aglutinantes en formato IgG Para caracterizar los anticuerpos en formato de IgG2a humana/ de ratón con más detalle, se determinaron los valores de IC50 para cada candidato en el ensayo de inhibición del receptor E de IL-17 tal como se describió en la presente anteriormente hasta en 4 experimentos independientes.

Los resultados se describen en la figura 5. Once de doce IgG mostraron actividad inhibitoria con valores promedio de IC5o que oscilaron entre 9 y 8442 pM. Nueve de estas once IgG inhibitorias tuvieron valores de IC50 en el menor intervalo picomolar. Los mejores candidatos pertenecieron a familias diferentes de HCDR3 y eran de diferentes subtipos VL (kappa o lambda).

Ejemplo 12: Estabilidad en suero de ratón Con el fin de analizar si los anticuerpos de IL17C anti ratón seleccionados son adecuados para la administración in vivo en ratones, se determinó la estabilidad en suero de ratón para un subconjunto de 11 IgG purificadas que mostraron rendimientos de producción aceptables y unión especifica a la IL17C de ratón (véase anteriormente).

Se recubrieron placas de 96 pocilios Maxisorp (Nunc; #442404) con avidina a una concentración de 1 mg/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se incubaron IgG2a quiméricas anti-IL17 en suero de ratón durante 24 horas a 37°C a una concentración final de 100 mg/mL. Después de la etapa de incubación los anticuerpos se diluyeron 1:100 en amortiguador LowCross (Candor Bioscience; #100500). Como referencia, el mismo conjunto de anticuerpos se diluyó nuevamente en amortiguador LowCross + 1% de suero de ratón y estos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se incubaron placas recubiertas con avidina con amortiguador de bloqueo (amortiguador de bloqueo Superbloc de Pierce, #37515) y posteriormente, se agregaron 100 mL de O.lpg/mL de biotina-ILl7C en amortiguador LowCross a los pocilios bloqueados. Después de la etapa de lavado se agregó una dilución en serie de las IgG incubadas en suero y recién diluidas. Se detectó la unión de las IgG mediante anticuerpo de detección conjugado POD anti-ratón-IgG2a (diluido 1:5000 en amortiguador LowCross) mediante el uso de TMB One Component HRP como sustrato. Se detuvo la reacción mediante la adición de HCl 1M y la absorbancia se midió a 450 n .

Con la excepción de un candidato de IgG (MOR12760) que presentó únicamente estabilidad moderada en suero, los otros anticuerpos mostraron una muy buena estabilidad en suero de ratón (coeficiente de variación £ 20%) después de la incubación durante 24 horas a 37°C. Los resultados se describen en la figura 6.

In Vivo del concepto de estudio Con base en sus propiedades favorables con respecto a la productividad, estabilidad, unión y actividad funcional en el ensayo de inhibición del receptor de IL-17RE y en un ensayo de gen marcador NFkB basado en células, se seleccionaron MOR12743 y MOR12762 como candidatos para la prueba in vivo del concepto de estudio.

Ejemplo 14: modelo CIA in vivo 14.1 Materiales Se adquirieron adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA) de Difeo (MI, US). Se obtuvo colágeno bovino tipo II (CII), lipopolisacárido (LPS) y Enbrel de MD Biosciences (Alemania); Sigma (P4252, 1/ Isle d'Abeau, Francia), Whyett (25mg de jeringa inyectable, Francia), respectivamente. Los otros reactivos utilizados fueron de grado reactivo y todos los solventes fueron de grado analítico. 14.2 Animales Se obtuvieron ratones DBA1/J (macho, de 6 a 7 semanas, aproximadamente 20 gramos) de Centre d'Elevage Regional Janvier (Laval, Francia). Los ratones se mantuvieron en un ciclo claro/oscuro de 12 horas (0700 a 1900). La temperatura se mantuvo a 22°C y se proporcionó comida y agua ad libitum. 14.3 Artritis inducida por colágeno (CIA) Un día antes del experimento, se preparó solución de CII (2 mg/mL) con ácido acético 0.05 M y se almacenó a 4°C. Justo antes de la inmunización, se mezclaron volúmenes iguales de adyuvante (IFA) y CII mediante un homogeneizador en una botella de vidrio previamente enfriada en un baño de agua helada. Se puede exigir más adyuvante y homogeneización prolongada si no se forma una emulsión. Se inyectó intradérmicamente 0.1 mL de la emulsión en la base de la cola de cada ratón el día 1, se realizó una segunda inyección intradérmica de refuerzo (solución CII a 2 mg/mL en 0.1 mL de emulsión de CFA) el día 21. Este método de inmunización se modificó a partir de métodos publicados (Brand et al, 2007, Collagen-induced arthritis. Nature Protocols; volumen 2 (5): 1269- 1275; Lin et al., 2007, Anti-rheumatic activities of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in vivo in collagen-induced arthritis in rodents. Br J Pharmacol. Abr; 150 (7):829-31). 14. 4 Diseño del estudio 14.4.1 Protocolo terapéutico Los efectos terapéuticos de los anticuerpos se analizaron en el modelo CIA de ratón. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos iguales y cada grupo contuvo 10 ratones. Todos los ratones se inmunizaron el día 1 y se reforzaron el día 21. La dosificación terapéutica tuvo una duración del día 31 al día 46. El grupo de control negativo se trató con vehículo (PBS) y el grupo de control positivo con Enbrel (10 mg/kg, 3 veces por semana, i.p.)· Se analizó un anticuerpo de interés a 10 mg/kg, i.p.3 veces por semana. Por lo tanto, se utilizaron cinco grupos de tratamiento diferentes, donde cada grupo consistió en diez ratones.

Grupo 1: Vehículo (PBS) Grupo 2: Enbrel 10mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Grupo 3: MOR0320710mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Grupo 4: MOR1274310mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Grupo 5: MOR1276210mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Los anticuerpos anti-IL17C se administraron i.p. tres veces por semana a 10 mg/kg. Las muestras de sangre (aproximadamente 250 pL) se tomaron los días 31 y 46 para análisis farmacocinético. 14.4.2 Protocolo preventivo Los efectos preventivos de los anticuerpos se analizaron en el modelo CIA de ratón. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos iguales que contenían 20 ratones. Todos los ratones se inmunizaron el día 1 y se reforzaron el día 21. La dosificación profiláctica duró desde el día 21 al día 46. El grupo de control negativo se trató con anticuerpo negativo (MOR03207, 10 mg/kg, 3 veces por semana, i.p.). Se analizó un anticuerpo de interés (MOR12762) a 10 mg/kg, 3 veces por semana, i.p.

Por lo tanto, se utilizaron dos grupos de tratamiento diferentes, donde cada grupo consistió en veinte ratones. Grupo 1: MOR0320710mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Grupo 2: MOR1276210mg/kg/3 veces por semana, i.p.

Los anticuerpos anti-IL17C se administraron i.p. tres veces a la semana a 10 mg/kg. Las muestras de sangre (aproximadamente 250 pL) se tomaron los dias 21, 36 y 46 para análisis farmacocinético. 14.5 Evaluación clínica de artritis La artritis se clasificó de conformidad con el método de Khachigian 2006 (Collagen antibody-induced arthritis. (2006) Nature Protocols 1, 2512-6), Lin et al 2007 ( supra) ; Nishida et al . 2004 (Histone deacetylase inhibitor suppression of autoantibody-mediated arthritis in mice via regulation of pl6INK4a and p21(WAFl/Cipl) expression. Arthritis Rheum.10: 3365-76) y Brand et al . 2007 (anteriormente). La inflamación de cada una de las cuatro patas se clasificó con la clasificación artrítica de la siguiente manera: 0-sin síntomas; 1-leve, pero con enrojecimiento definido e inflamación de un tipo de articulación tal como tobillo o muñeca, o enrojecimiento aparente e inflamación limitados a dedos individuales, independientemente de la cantidad de dedos afectados; 2-enrojecimiento moderado e inflamación de dos o más tipos de articulación; 3-enrojecimiento grave e inflamación de toda la pata incluidos los dedos; 4-casi toda la extremidad inflamada con involucramiento de varias articulaciones (artritis clínica acumulativa con calificación de máxima 16 por animal) (Nishida et al . , 2004 (anteriormente)).

En caso de ser necesario, para permitir el meta-análisis de varios estudios terapéuticos, los valores de calificación clínica pueden normalizarse de la siguiente manera: AUC de calificación clínica (calificación de AUC) : Se calculó para cada animal individual el área debajo de la curva (AUC) desde el día 31 (21) al día 46. El AUC de cada animal se dividió entre el AUC promedio obtenido para el vehículo en el estudio desde el cual los datos en ese animal se obtuvieron y multiplicaron por 100 (es decir, el AUC se expresó como un porcentaje del AUC de vehículo promedio por estudio).

Aumento de calificación clínica desde el día 21 al día 46 (calificación del criterio de evaluación) : La diferencia de calificación clínica para cada animal se dividió entre la diferencia de calificación clínica promedio obtenida para el vehículo en el estudio desde el cual los datos en ese animal se obtuvieron y multiplicaron por 100 (es decir, el AUC se expresó como un porcentaje del AUC de vehículo promedio por estudio). 14. 6 Radiología (calificación de Larsen) Se obtuvieron fotos de rayos X de las patas posteriores de cada animal individual. Se asignó una cantidad de identidad ciega aleatoria a cada una de las fotos y se calificó la gravedad de erosión ósea mediante tres calificadores independientes con el sistema de calificación radiológico de Larsen de la siguiente manera: 0- normal con estructura ósea intacta y espacio normal de articulaciones; 1- anormalidad ligera con cualquier uno o dos de los huesos metatarsianos exteriores que muestran ligera erosión ósea; 2-anormalidad temprana definida con cualesquier tres a cinco de los huesos metatarsianos exteriores que muestran erosión ósea; 3-anormalidad destructiva media con todos los huesos metatarsianos exteriores asi como cualesquiera uno o dos de los huesos metatarsianos interiores que muestran erosión ósea definida; 4-anormalidad destructiva grave con todos los huesos metatarsianos que muestran erosión óseas definida y al menos una de las articulaciones metatarsianas interiores completamente erosionadas que dejan algunas estructuras de articulaciones óseas parcialmente conservadas; 5-anormalidad de mutilación sin estructuras óseas. Este sistema de calificación es una modificación de Salvemini et al . , 2001 (Amelioration of joint disease in a rat model of collagen-induced arthritis by M40403, a superoxide dismutase mimetic. Arthritis Rheum.44:2909-21); Bush et al. , 2002 (Reduction of joint inflammation and bone erosión in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgGl Fe fusión protein. Arthritis Rheum. 46: 802-5); Sims et al. , 2004 (Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum., 50: 2338-46) y Jou et al . , 2005 (Thrombospondin 1 as an effective gene therapeutic strategy in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum.52:339-44). 14. 7 Resultados En el modelo de tratamiento, el tratamiento se evaluó a través de la calificación clínica y la calificación de Larsen. Los resultados se describen en la figura 7 y en la figura 8. De manera sorprendente, ambos anticuerpos anti-IL17C analizados (MOR12743 y MOR12762) demostraron una inhibición significativa de la inflamación. El anticuerpo de control negativo, MOR03207, no inhibió la inflamación, mientras que el control positivo, Enbrel, sí inhibió el avance de la enfermedad.

En el modelo preventivo, el tratamiento se evaluó a través de la calificación clínica y la calificación de Larsen. Los resultados se describen en la figura 9. De manera sorprendente, el anticuerpo anti-IL17C analizado (MOR12762) demostró una inhibición significativa de la inflamación y la degradación ósea. El anticuerpo de control negativo, MOR03207, no inhibió la inflamación ni la erosión ósea. 14.8 PK en estado estable En una dosis previa, los días 31 y 46 (protocolo de tratamiento) o días 21, 36 y 46 (protocolo preventivo), se recogieron muestras de sangre en el seno retro-orbital con heparina de litio como anticoagulante. Todas las muestras de sangre se centrifugaron y las muestras de plasma resultantes se almacenaron a -20°C con análisis pendiente.

Ejemplo 15 - Modelo de humo de tabaco Exposiciones diarias de ratones (C57BL/6J, Charles River) a humo de tabaco (TS) durante 11 dias consecutivos dieron como resultado inflamación pulmonar, tal como se indicó mediante un aumento en la cantidad total de células recuperadas en el lavado broncoalveolar (BAL), en comparación con un grupo expuesto al aire tratado de forma similar, 24 horas después de la exposición final. La respuesta consistió en aumentos significativos en las cantidades de macrófagos, células epiteliales, neutrófilos y linfocitos recuperados en el BAL.

Se administró MOR12743 mediante vía intraperitoneal (i.p.), 1 hora antes de la exposición a TS los dias 1, 4, 7 y 10 de exposición. Esto dio como resultado una inhibición significativa de la cantidad total de células recuperadas en el BAL y específicamente de las cantidades de células epiteliales y neutrófilos.

Se administró MOR03207 mediante vía intraperitoneal (i.p.), 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10 de exposición. Esto no dio como resultado ninguna inhibición significativa de la cantidad de células totales o las cantidades de cualquier tipo de célula específicamente identificada recuperada en el BAL.

Se administró Roflumilast (ChemPharmaServe Ltd. Ref. 0010206) 5 mg/kg oralmente (p.o.), 1 hora antes de cada exposición a TS. Esto inhibió significativamente la cantidad total de células recuperadas en el BAL y específicamente las cantidades de células epiteliales, neutrófilos y linfocitos.

Todos los grupos expuestos a TS mostraron algo de pérdida de peso corporal pero no fue significativa en comparación con el grupo expuesto al aire que se sacrificaría el día 12. 15.1 Materiales Vehículo para administración i.p.: D-PBS pH7.4 (PAA Product Ref. H15-002, Lot. H00208-2353) Vehículo para administración p.o.: PEG 200/agua para inyección (60%/40% v/v) La solución salina tamponada con fosfato (PBS), para el lavado broncoalveolar (BAL), se obtuvo de Gibco. Se obtuvo eutatal (pentobarbitona sódica) de Merial Animal Health Ltd. El humo de tabaco se generó mediante el uso de cigarrillos 'Marlboro 100' adquiridos de un proveedor comercial. Formulaciones: MOR12743 y MOR03207 se congelaron, a lmg/mL. Ambas sustancias de análisis se dejaron descongelar a 4°C durante la noche antes de la administración.

Se formuló roflumilast mediante la colocación de una cantidad pesada previamente en un mortero y mediante molienda ligera mientras se agregó vehículo (PEG200/agua, 60%/40% v/v) gota a gota para formar una suspensión. Las suspensiones se sometieron a vórtice antes de la administración. 15.2 Metodos Estudios previos han establecido que las cantidades totales de células recuperadas en el BAL son significativamente elevadas 24 horas después de las últimas 11 exposiciones a TS diarias. En este estudio, se utilizó un intervalo de tiempo de 24 horas después del aire final o exposición a TS para análisis.

Vehículo (PBS), MOR12743 y MOR03207 se administraron i.p., 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Se administró roflumilast p.o., 1 hora antes de cada exposición a TS. 15.2.1 Exposición de animales a TS diariamente durante 11 días consecutivos En este protocolo de exposición, los ratones se expusieron en grupos de 5 en cámaras libres de policarbonato (27cm x 16cm x 12cm). Se permitió que el TS de los cigarrillos 'Marlboro 100' ingresara a las cámaras de exposición a una velocidad de flujo de lOOmL/min. Con el fin de minimizar cualquier problema potencial ocasionado por la exposición repetida a un alto nivel de TS, el período de exposición a TS aumentó inicialmente de 25 minutos al comienzo del estudio (dia 1) a un máximo de 45 minutos el día 3. El programa de exposición utilizado en este estudio fue de la siguiente manera: Día 1: 25 minutos de exposición (~ 5 cigarrillos).

Día 2: 35 minutos de exposición (~ 7 cigarrillos).

Días 3-11: 45 minutos de exposición (~ 9 cigarrillos).

Las cajas de exposición se ventilaron después de 10 minutos y cada 5 minutos luego de dicho tiempo.

Un grupo adicional de ratones se expuso al aire diariamente para intervalos equivalentes de tiempo como grupos de control (sin exposición a TS). 15.2.2 Lavado broncoalveolar y análisis de citospina El lavado broncoalveolar se realizó de la siguiente manera: Se canuló la tráquea mediante el uso de una cánula de acero inoxidable de Luer de una longitud de 10mm. Se utilizó solución salina tamponada con fosfato (PBS) como el fluido de lavado. Se instiló con cuidado un volumen de 0.4mL y se extrajo tres veces mediante el uso de una jeringa de lmL y después se colocó en un tubo Eppendorf y se mantuvo en hielo antes de determinaciones posteriores.

El conteo total de células se realizó de la siguiente manera: El fluido de lavado se separó de las células mediante centrifugación (6 minutos a 3400rpm, RCF = 3070 x g - 'Eppendorf Mini Spin') y el sobrenadante se decantó y congeló para un posible análisis posterior. El sedimento celular se volvió a suspender en un volumen conocido de PBS y se calculó la cantidad total de células mediante conteo de una alícuota teñida (tinte Turks) con un microscopio mediante el uso de un hemocitrómetro.

El conteo de células diferenciales se realizó de la siguiente manera: El sedimento de células residuales se diluyó hasta obtener aproximadamente 105 células por mL. Se colocó un volumen de 500m1 en el embudo de una lámina de citospina y se centrifugó durante 8 minutos a 800rpm, RCF = 72.26 x g (Shandon Cytospin 3). La lámina se secó al aire y se tiñó mediante el uso de tinte Wrights/Giemsa según las instrucciones patentadas. Una vez se seca y cubierta, se llevaron a cabo conteos de células diferenciales mediante el uso de microscopía óptica. Se contaron aproximadamente 400 células por cada lámina. Las células se identificaron mediante el uso de téenicas morfométricas estándar. 15.3 Regímenes de tratamiento En este estudio, 4 grupos de ratones se sometieron a exposición a TS diaria durante 11 días y se sacrificaron el día 12, 24 horas después de la exposición a TS final. Tres grupos recibieron otro vehículo (D-PBS), MOR12743 o MOR03207, i.p., 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Un grupo recibió roflumilast p.o., 1 hora antes de cada exposición a TS. Un grupo adicional se expuso al aire durante 11 dias consecutivos y se sacrificó el dia 12, 24 horas después de la exposición al aire final. Este grupo recibió vehículo (D-PBS), i.p., 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Para todos los grupos n = 10. 15. 4 Procedimientos de muestreo Todos los ratones se sacrificaron el día 12, mediante sobredosis de anestesia con barbiturato intraperitoneal, 24 horas después de la exposición final al aire o a TS. Se tomó una muestra de sangre sobre heparina de la vena subclavia y el plasma se separó mediante centrifugación y se almacenó a -40°C. Se realizó un BAL mediante el uso de 0.4mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células que se recuperaron del BAL se utilizaron para los conteos de células diferenciales y células totales. Los sobrenadantes de BAL y el sedimento celular remanente se almacenaron a -40°C y -80°C respectivamente para posibles análisis futuros. Después del BAL, se dejó la cánula ligada en el lugar. Se quitó el corazón y los pulmones después de abrir con cuidado el tórax y de cortar cada lado del esternón y las costillas. Se ató el lóbulo izquierdo, se quitó, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80°C. El lóbulo derecho se infló con formalina tamponada con fosfato (PBF) el 10% hasta una presión de 18cm de PBF durante 20 minutos. Después se ligó la tráquea debajo de la cánula y se quitó la cánula. El corazón, pulmón y tráquea se sumergieron en PBF. 15.5 Medición de datos y análisis estadístico Los resultados se presentan como puntos de datos individuales para cada animal y se calcula el valor medio para cada grupo.

Entonces los datos se someten inicialmente a un análisis de varianza de un factor (ANOVA), seguido de una corrección de Bonferroni para varias comparaciones con el fin de analizar las diferencias estadísticamente significativas entre grupos de tratamiento. Se consideró que un valor "p" de <0.05 es estadísticamente significativo.

Las inhibiciones porcentuales se calcularon mediante el uso de la fórmula a continuación: 15. 6 Resultados 15. 6.1 Inflamación pulmonar, según se indicó mediante el aumento de las cantidades celulares recuperadas en el BAL, inducido por exposiciones diarias a TS Un grupo se expuso a TS diariamente durante 11 dias y recibió vehículo (D-PBS), i.p., 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Cuando se compara con un grupo expuesto al aire tratado de manera similar, los ratones presentaron inflamación pulmonar presentada como un aumento significativo (p<0.001) en la cantidad total de células recuperadas en BAL que se sacrificaron el dia 12 (24 horas después de la última exposición a TS). Esta inflamación consistió en aumentos significativos en la cantidad de macrófagos, células epiteliales, neutrófilos y linfocitos (p<0.001 para todos), en comparación con los animales (de control) expuestos al aire (tabla 2).

Tabla 2: Resumen de los efectos de la exposición a TS durante 11 dias consecutivos en respuestas pulmonares inflamatorias en ratones.

*En comparación con el grupo de control expuesto a aire en el mismo intervalo de tiempo.

Los datos se sometieron a ANOVA. Se consideró que un valor "p" de <0.05 es estadísticamente significativo, ns = no estadísticamente significativo. 15. 6.2 Efecto de administración i .p. de MOR12743 en inflamación pulmonar, según se indicó mediante el aumento de las cantidades celulares recuperadas en el BAL, inducido por exposiciones diarias a TS MOR12743, 5mg/kg, administrado i.p., 1 hora antes de la exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10, inhibió significativamente las cantidades de células totales recuperadas en el BAL (26%, p<0.001) y células específicamente epiteliales (52%, p<0.001) y neutrófilos (48% , p<0.001). El grado e importancia de inhibición se resumen en la tabla 3. 15. 6.3 Efecto de la administración i .p. de MOR03207 en inflamación pulmonar, según se indicó mediante el aumento de las cantidades celulares recuperadas en el BAL, inducido por exposiciones diarias a TS MOR12743, 5mg/kg, administrado i.p., 1 hora antes de exposición a TS los días 1, 4, 7 y 10, no inhibió significativamente las cantidades de células totales en el BAL, o las cantidades de cualquier tipo de célula específicamente identificada tras la exposición a TS. Los resultados se resumen en la tabla 3. 15. 6. 4 Efecto de la administración oral de Roflumilast sobre la inflamación pulmonar,· según se indicó mediante el aumento de las cantidades celulares recuperadas en el BAL , inducido por exposiciones diarias a TS Roflumilast, 5mg/kg, administrado p.o., 1 hora antes de cada exposición a TS, inhibió significativamente las cantidades celulares totales recuperadas en el BAL (32% p<0.001) y células específicamente epiteliales (50% p<0.001), neutrófilos (56% p<0.001) y linfocitos (54% p<0.01). El grado e importancia de inhibición se resumen en la tabla 3. TABLA 3: Resumen de los efectos de MOR12743, MOR03207 y Roflumilast en las respuestas inflamatorias inducidas por la exposición a TS en ratones.

Todos los datos se sometieron a un análisis ANOVA para comparaciones con el fin de analizar diferencias significativas entre grupos de tratamiento. Se consideró que un valor "p" de <0.05 es estadísticamente significativo. ns = no estadísticamente significativo. 15. 6.5 Efecto del tratamiento en pesos corporales de ratones en las once exposiciones diarias a TS Con el fin de controlar la salud de los ratones durante la duración del protocolo de exposición, los ratones se pesaron al comienzo del estudio, en el día 6 y en el día 12 antes del sacrificio. Durante los 12 días del estudio, los ratones expuestos al control mostraron poco o ningún cambio en el peso corporal. Todos los grupos expuestos a TS mostraron poco peso corporal durante este período pero estas pérdidas no fueron estadísticamente significativas. 15. 7 Conclusión MOR12743 (5mg/kg), administrado i.p., los días 1, 4, 7 y 10, inhibió significativamente la cantidad total de células recuperadas en el BAL y células específicamente epiteliales y neutrófilos. MOR03207 (5mg/kg), administrado de la misma forma, no tuvo efecto sobre las cantidades celulares totales recuperadas en el BAL, o en las cantidades de cualquier tipo celular específicamente identificado.

El compuesto de referencia, Roflumilast (5mg/kg), administrado p.o., 1 hora antes de cada exposición a TS, inhibió significativamente la cantidad total de células recuperadas en el BAL y células específicamente epiteliales, neutrófilos y linfocitos. La respuesta fue similar a aquella observada en estudios previos.

Todos los grupos expuestos a TS mostraron algo de pérdida de peso corporal durante el período de estudio de 12 días pero no hubo diferencias significativas entre cualquiera de los grupos de tratamiento.

Ejemplo 16 - Instilación intranasal de LPS: un modelo de ratón de neutrofilia de pulmón aguda Se llevaron a cabo dos estudios independientes con un mAb negativo y dos mAb positivos en la instilación intranasal de modelo de ratón de lipopolisacárido (LPS) de neutrofilia de pulmón aguda, un modelo que imita algunos aspectos relevantes de COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica). Los efectos se midieron mediante conteo celular inflamatorio de lavado broncoalveolar (BAL). 16.1 Grupos de estudio Varios grupos de ratones se trataron con diferentes anticuerpos y dexametasona y se compararon con los ratones sometidos a LPS únicamente. El resumen de los grupos se proporciona en la tabla 4.

Tabla 4 16.2 Materiales • Lipopolisacárido (LPS) : de Escherichia coli 055:B5, ref.: L4524-25MG, purificado mediante lote de cromatografía de afinidad: 018K4077 - Sigma. LPS se preparó mediante volumen administrado mediante instilación intranasal: 50 pL/ratón (10 mg/50 pL) • Solución salina: cloruro de sodio al 0.9%, lote 9F0191 (libre de endotoxina, Lavoisier) • Cetamina: Imalgene MERIAL 1000, 10 mL • Xilazina: Rompun BAYER PHARMA al 2%, 25 mL • Isoflurano: Aerrano, lote 10E28A35 • Metilcelulosa (MC): VWR, ref. AX021233 lote M1395 • Preparación de dexametasona (DEX): 30 mg/kg, 10 mL/kg, 0.2 mL/ratón, p.o.

• Se congelaron los anticuerpos a 1 mg/mL. Las sustancias de análisis se dejaron descongelar a 4°C durante la noche antes de la administración. Todos los anticuerpos estaban listos para utilizar tras el descongelamiento (o se diluyeron extemporáneamente). 16.3 Animales Se utilizaron ratones hembra BALB/c de Harían (Francia) en el estudio. El peso de los ratones fue de aproximadamente 20g. 16. 4 Procedimientos experimentales Administración intranasal Los ratones se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano. Durante la respiración, se instiló LPS intranasalmente. Después de 24 horas, los ratones se anestesiaron intraperitonealmente (IP) y se llevó a cabo el procedimiento de lavado broncoalveolar. Los ratones se anestesiaron mediante inyección de solución anestésica de 0.1 mL por 10 g del peso del ratón. La solución anestésica se compuso de 18 mi de NaCl al 0.9%, 0.5 mL de xilazina (5 mg/Kg) y 1.5 mL de cetamina (75 mg/Kg).

Lavado broncoalveolar (BAL) La tráquea se expuso a través de incisión de media linea y se canuló (con un catéter de ratones). El BAL se llevó a cabo dos veces mediante el uso de 1 mL de amortiguador PBS estéril. El fluido del lavado se quitó y centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sedimento celular se volvió a suspender en 200pL de amortiguador PBS. Las células se contaron mediante el uso de un conteo celular (Vet abe, Francia). El sobrenadante del fluido de lavado se mantuvo a -20°C durante la dosificación de mediadores de inflamación. 16.5 Diseño del estudio Dexametasona: El tratamiento con dexametasona se llevó a cabo 24, 16 y 1 hora antes de instilación de LPS y 6 horas después de la administración de LPS.

Anticuerpos: 24 horas antes de la instilación de LPS los ratones se trataron con uno de los mAb (MOR03207, MOR12762 o MOR12743).

Para todos los grupos, se realizó el BAL 24 horas antes de la administración de LPS y se midieron los conteos celulares.

Resultados Los resultados se analizaron mediante el uso del análisis t de Student. Los conteos celulares de BAL de ratones tratados con anticuerpos o dexametasona se compararon con los conteos celulares en ratones sometidos únicamente a LPS. Se consideraron los sem +/- promedio de conteos celulares de ratones en cada grupo. Los resultados se presentan en la figura 10.

Conclusión El único tratamiento con anticuerpo MOR03207 (control negativo) a 5mg/kg no inhibió significativamente (tendencia ns) el reclutamiento de células inflamatorias en el BALF. Al mismo tiempo, un único tratamiento con OR12762 o MOR12743 a 5mg/kg inhibió significativamente el reclutamiento de células inflamatorias en el BALF. Esto indica que la IL17C regula la neutrofilia aguda y es una diana terapéutica para las enfermedades pulmonares tal como COPD.

Por lo tanto, se demuestra por primera vez que los antagonistas de IL17C, por ejemplo, los anticuerpos IL17C, son efectivos para el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios.

Ejemplo 17 - Perfil de expresión de IL17C en tejido respiratorio humano En este estudio, la expresión de IL17C se midió a través de PCR en tiempo real cuantitativo (qRT-PCR) en diferentes tipos de tejido respiratorio humano (bronquio terciario, bronquio cuaternario y arteria pulmonar) de muestras enfermas y de control. Las muestras de control derivaron de donantes fumadores y no fumadores mientras que las muestras enfermas derivaron de pacientes con COPD, pacientes con bronquitis aguda/crónica y pacientes que padecen enfisema pulmonar. 17.1. Purificación de ARN y QC El ARN total se aisló de los tejidos congelados mediante el uso de metodologías estándar de conformidad con los protocolos de proveedores o con adaptaciones internas.

Los criterios de QC cumplidos (no se muestran datos) fueron: Presencia de ARN ribosomal 18S Una cantidad mínima de copias de transcripciones de ARNm de genes de control se determinó mediante el uso qRT-PCR, de la siguiente manera: • b-actina (longitud de amplicón 295 bp) > 3,800 copias de transcripción/lOOng ARN total • gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, longitud de amplicón 71 bp) >10,000 copias de transcripción /100ng ARN total • sin contaminación de ADN 17.2 Tratamiento de muestras de ARN con DNasa El ARN total se trató con DNasa I libre de RNasa para quitar todo ADN genómico residual (ADNg). Para analizar la remoción exitosa de ADN de muestras de ARN, se realizó qPCR sin transcripción reversa anterior. La ausencia de una señal de amplificación confirmó que las muestras de ARN estaban libres de ADN. 17.3 Conjuntos de sonda de cebadores Los conjuntos de sonda de cebadores utilizados para qRT-PCR se muestran a continuación: Tamaño de amplicón de IL17C: 72bp Cebador directo: 5' - ATGAGGACCGCTATCCACAGA - 3' (SEQ ID No.:184) Cebador inverso: 5' - CCCGTCCGTGCATCGA - 3' (SEQ ID No.:185) Sonda: 5' - TGGCCTTCGCCGAGTGCCTG - 3' (SEQ ID No.:186) La sonda se marcó en el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (FAM) y en el extremo 3' con 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA). 17. 4 Síntesis de ADNc El ARN DNasa se incubó con los cebadores inversos para beta 1, beta 2, beta 3 y GAPDH en amortiguador de transcripción inversa, calentando las muestras hasta 72°C (para quitar la estructura secundaria) y luego se enfriaron hasta 55°C (para templar los cebadores). Se agregaron nucleótidos y transcriptasa inversa MuLV y las mezclas de la reacción se incubaron durante 30 minutos a 37°C para permitir que ocurriera la síntesis de ADNc. Luego se calentaron las muestras hasta 90°C durante 5 minutos para desnaturalizar la transcriptasa inversa. 17.5 qRT-PCR Se utilizó qRT-PCR que utiliza metodología de multiplexación para la medición simultánea de niveles de ARNm de los genes de interés y GAPDH. La medición simultánea de GAPDH en cada tubo de ensayo proporcionó una verificación QC para qRT-PCR y transcripción inversa exitosa. Las reacciones se llevaron a cabo con ADNc derivado de 50ng de ARN total. Las sondas y cebadores inversos y directos para cada diana y GAPDH se agregaron a la mezcla de reacción con nucleótidos, amortiguador y polimerasa AmpliTaq GoldTM Taq. Las condiciones de PCR fueron: 94°C durante 12 minutos (etapa de activación de enzimas), seguida de 40 ciclos de 94°C durante 15 minutos (etapa de desnaturalización) y 60°C durante 30 segundos (para templar y extender). Después del análisis de sensibilidad, la temperatura de PCR inicial para beta 3 aumentó hasta 97°C.

Resultados Los datos presentados aquí muestran que la IL17C, un miembro de la familia de interleucina 17 de citocinas proinflamatorias, se expresa constitutivamente en el pulmón humano. Además, se observaron niveles de expresión aumentados de IL17C en muestras de tejido pulmonar derivado de donantes con enfermedades respiratorias inflamatorias diagnosticadas como COPD, bronquitis o enfisema pulmonar en comparación con las muestras de control (figura 11).

Ejemplo 18 - Modelo de ratón tipo psoriasis (IMQ) con imiquimod La función pro-inflamatoria de IL17C en la piel se examinó en un modelo de ratón de inflamación cutánea sin infección de psoriasis donde el agonista de TLR7-TLR8 tópico Imiquimod induce lesiones dérmicas psoriáticas caracterizadas por la proliferación epidérmica e infiltración de leucocitos, que dependen de citocinas TH17 patogénicas (Van der Fits et al . , J of Immunol.1 de mayo de 2009;182(9):5836-45.). El rol de IL17C en este modelo particular se documentó recientemente (Ramirez-Carrozzi et al, Nat Immunol.2011 12 (12):1159-66) y se proporcionó una prueba genética convincente del rol de IL17C en el modelo de enfermedad con ratones de IL17C/_. El mismo modelo de tipo psoriasis se utilizó para estudiar adicionalmente la respuesta de IL17C a IMQ en la piel y para identificar las células que producen IL17C. 18. 1 Reactivos Se utilizó vaselina (Vaseline officinale, Cooper) y crema Imiquimod (Aldara, 5% de crema, MEDA). Los anticuerpos utilizados fueron IL17A/F anti-ratón (R&D System, clon 50104, ref. MAB421) e IL23p40 anti-ratón (eBioscience, clon C17.8, ref 16-7123-85) 18.2 Animales Se obtuvieron ratones Balb/c N (hembra, 18 a 20 gramos, aproximadamente 10 semanas) de CERJ o Halan (Francia). Los ratones se mantuvieron en un ciclo claro/oscuro de 12 horas (0700 -1900). La temperatura se mantuvo a 22°C y se proporcionó comida y agua ad libitum. 18.3 Procedimientos experimentales Con el fin de inducir una respuesta tipo psoriática, se aplicó una dosis tópica diaria de 62.5mg de crema Imiquimod en el lomo rasurado y la oreja derecha durante 5 días consecutivos (D0-D4), mediante traducción en una dosis diaria de 3.13 mg del compuesto activo. El grupo de control estaba compuesto por ratones que recibían la misma cantidad de crema vaselina. Se observó cada día la gravedad de la inflamación en la piel (eritema, escalamiento y engrosamiento). Se registró diariamente el peso corporal. En necropsia y en los días indicados, las orejas y los engrosamientos de la piel posterior se midieron mediante el uso de un micrómetro (Mitutoyo). Se recogieron las muestras de piel posterior y de orejas durante la expresión génica e histológica. Se midió el peso del bazo y timo. 18. 4 Diseño del estudio Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos iguales (n = 10). El grupo de IMQ recibió una dosis tópica diaria de 62.5mg de crema Imiquimod en el lomo rasurado y la oreja derecha durante 5 dias consecutivos (D0-D4), mediante traducción en una dosis diaria de 3.13 mg del compuesto activo. El grupo de control estaba compuesto por ratones de control que recibían la misma cantidad de vaselina. Los anticuerpos se formularon en PBS, se analizaron a 10mg/kg (200ug/ratones) y se administraron i.p., 3 días antes y al comienzo del experimento (DO), por lo tanto, se utilizaron 6 grupos de tratamiento diferentes: Control (Vaselina) IMQ (crema Aldara al 5%) IMQ + MOR03207_h/m 10mg/kg i.p. (Ab de control negativo) IMQ + MOR12743_h/m 10mg/kg i.p.

IL17A/F anti-ratón 10mg/kg i.p.

IL23p40 anti-ratón 10mg/kg i.p. 18.5 Resultados La expresión de la proteína de IL17C se detectó mediante el uso de anticuerpos MOR12743 biotinilados e IHC. Se expresó IL17C en los mastocitos de la dermis en los grupos de control y tratados con IMQ (no se muestran datos). En respuesta al IMQ, la expresión de IL17C aumentó en queratinocitos de la epidermis de D2 a D4- con una mayor expresión observada en D3- así como en algunas células inflamatorias más pequeñas de la dermis y del estrato. MOR03207 (isotipo de control) no mostró tinción independientemente de las condiciones.

Esta observación se encontraba en linea con la expresión génica de IL17C. Los niveles básales no fueron detectables para IL17C e IL17F y fueron bajos para IL17C e IL23pl9. IL17A, IL17F aumentaron máximamente mediante IMQ en la piel posterior después de 96 horas mientras que IL23pl9 e IL17C aumentaron más temprano con un máximo a 48 horas. IL17RA e IL17RE se encontraban bien expresadas con cada cambio de expresión muy moderado en respuesta al IMQ.

Los efectos de anticuerpos neutralizantes relevantes a la senda o específicos a IL17C se evaluaron en la psoriasis inducida por IMQ mediante una medición histológica del grosor epidérmico. Los anticuerpos de IL-17A e IL-23p40 mostraron efectos preventivos parciales en linea con el conocimiento común en la materia. El efecto de los anticuerpos neutralizantes de MOR1243 fue significativo lo que demuestra entonces que la neutralización de IL17C puede prevenir significativamente el grosor epidérmico inducido por IMQ en la piel de la oreja del ratón (figura 12).

Ejemplo 19 - expresión y función de IL17C en queratinocitos epidérmicos humanos primarios Para explorar adicionalmente la función de IL17C en psoriasis nos enfocamos en la expresión y función de IL17C en queratinocitos epidérmicos humanos primarios. 19. 1 Cultivos de queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK-Ad) Se obtuvieron queratinocitos epidérmicos humanos normales primarios crioconservados de adultos de Lonza y se cultivaron en medio de crecimiento de queratinocito gold (KGM-Gold™) que se preparó mediante suplemento del medio basal de queratinocitos (KBM-Gold™) con varios SingleQuots™ de complementos del factor de crecimiento incluidos extracto pituitario bovino, hidrocortisona, hEGF, epinefrina, transferrina, insulina y GA-1000 (medios y suplementos todos de Lonza). Las células que se expandieron por 2 pasajes más se sembraron en placas de 96 pocilios (25000 c/pocillo) en KGM-Gold™. Tras el cultivo nocturno, se quitó el medio y se cambió a KGM-Gold™ con hidrocortisona antes de la adición de varios desencadenantes de citocina. Se extrajo ARN total en varios intervalos de tiempo y se determinó la expresión de IL-17RE, IL17C y B-defensina-2 (DEF4B) mediante RT-PCR cuantitativo. El sobrenadante celular cosechado se mantuvo a -20°C hasta que se analizaron los niveles de B-defensina-2 (hBD2) secretada mediante el uso de ELISA. La IL17C humana recombinante era de Novus Biologicals. IL-Ib y TNF humanos recombinantes eran de PeproTech. Las IL-17A e IL-22 humanas recombinantes eran de R&D Systems. Los siguientes agonistas del receptor tipo Toll (TLR) se adquirieron de InvivoGen: flagelina (FLA) purificada de S. typhimurium (agonista TLR5), guardiquimod (agonista TLR7), CL097 (agonista TLR7/8) y CpG oligonucleótido ODN 2_611 (,a_go_nista T_LR9),. El lipopolisacárido del agonista TLR4 (LPS, de E. Coli serotipo 026:B6) se obtuvo de Sigma. 19.2 RT-PCR cuantitativo El ARN total se extrajo de células que utilizan el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se transcribieron inversamente mediante el uso de reactivos de transcripción inversos Taqman® (Applied Biosystems). Se prepararon veinticinco ml de reacciones de PCR mediante el uso de Taqman® universal PCR master mix/No AmpErase® UNG y conjuntos de sonda/cebador de expresión génica a demanda de ensayo prediseñado (todos de Applied Biosystems). El qPCR se llevó a cabo en ABI Prism® 7000 (Applied Biosystems). La expresión génica se normalizó hasta el gen housekeeping GAPDH y se expresó como valores ACt, con ACt = Ctgen-Ct(GAPDH) o se expresó como nivel de ARNm relativo de expresión génica especifica tal como se obtuvo mediante el uso del método 2-ACt. 19.3 hBD2 ELISA El siguiente protocolo se desarrolló y validó para medir los niveles de hBD2 mediante el uso de anticuerpos de detección y captura obtenidos de PeproTech (catno. 900-K172). Se recubrieron placas de 384 pocilios White Lumitrac 600 (Greiner) con 40 mL de solución de anticuerpo de captura anti-hBD2 (0.5 mg/mL en PBS). Después de la incubación durante la noche a 4°C, las placas se lavaron una vez con PBST (PBS + 0.05% Tween-20 (Sigma)) y una vez con PBS y se bloquearon mediante incubación de 4 horas a temperatura ambiente con 100 uL/amortiguador de bloqueo de pocilios (PBS + 1% de BSA + 1% de sacarosa + 0.05% de NaN3). Se quitó el amortiguador de bloqueo a través de la inversión de la placa y su colocación en un papel absorbente. La placa se lavó con 100 mL de PBST y 100 pL de PBS y se agregaron 35 uL de hBD2 estándar o de muestra. Tras la incubación durante la noche a 4°C, las placas se lavaron dos veces con PBST y una vez con PBS. Posteriormente, se agregaron 35 uL de solución de anticuerpo de detección anti-hBD2 biotinilado (0.1 mg/mL en PBS que contenia BSA al 1%). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron tal como se describió anteriormente y se incubaron con 35 pL de conjugado de estreptavidina-HRP (Invitrogen, catno. SNN2004) diluido 1/2000 en PBS + BSA al 1%. Después de 45 minutos, las placas se lavaron tal como se describió anteriormente durante 5 minutos a temperatura ambiente con 50 mL/pocillo de sustrato BM Chem ELISA (Roche). La lectura se llevó a cabo en el Luminómetro Luminoscan Ascent (Labsystems) con un tiempo de integración de 100 mseg. 19. 4 Resultados Mientras que la IL-17RA se expresa en todos lados, la expresión de IL-17RE es más restringida y su expresión es particularmente alta en células de origen epitelial.

Analizamos la expresión del ARNm de la IL-17RE en queratinocitos epidérmicos humanos primarios y observamos una alta expresión de IL-17RE en estas células con ACT (IL-17RE, GAPDH) ~ 4-6. La expresión de IL-17RE no se moduló mediante ninguno de los desencadenantes inflamatorios analizados (no se muestran datos).

Extendimos adicionalmente estos descubrimientos iniciales y también analizamos la regulación de la expresión de la IL17C en queratinocitos mediante IL-17A, una citocina producida mediante células Thl7 y que se sabe juega un papel importante en la psoriasis. Los datos obtenidos confirman la inducción del ARNm de la IL17C mediante IL-1 y mediante flagelina, un agonista de TLR5 (figuras 13A y 13B). El ligando de otros TLR (TLR4, TLR7, TLR8 o TLR9) no indujo significativamente el ARNm de la IL17C. El análisis cinético mostró que la inducción del ARNm de la IL17C mediante IL-1 o flagelina fue rápida y transitoria. De manera interesante, mientras que la IL-17A no indujo significativamente el ARNm de la IL17C en si mismo, que sostuvo y reforzó sinérgicamente la expresión de la IL17C en el tiempo al combinarse con las citocinas proinflamatorias TNF o IL-1 (figura 13A).

Dado que los queratinocitos expresan altos niveles de IL-17RE, se examinó adicionalmente la función de la IL17C en estas células. Aunque los queratinocitos primarios humanos no respondieron a la IL17C únicamente, la IL17C estimuló la expresión de b-?q£bh3?hb-2 en sinergia con otros genes proinflamatorios analizados, es decir, IL-Ib, TNFOÍ y IL-22. Se observó estimulación sinérgica de expresión de ARNm de b-defensina-2 en el nivel de ARNm y proteina. 19.5 Resumen En general, los datos indican que la IL17C producida mediante citocinas proinflamatorias en queratinocitos podría jugar un papel en un bucle directo de suministro positivo que amplifica y sostiene la expresión génica inflamatoria en queratinocitos que contribuyen a la inflamación en la piel con psoriasis.

Ejemplo 20: Ensayo de inoculación cruzada a base de ELISA La inoculación cruzada de un anticuerpo anti-IL17C u otro agente aglutinante de IL17C puede detectarse mediante el uso de un ensayo ELISA de conformidad con el siguiente procedimiento estándar. Del mismo modo, puede detectarse la inoculación cruzada de un anticuerpo anti-IL17C u otro agente aglutinante de IL17C.

El principio general del ensayo ELISA implica el recubrimiento de los pocilios de una placa de ELISA con un anticuerpo anti-IL17C. A continuación se agrega en solución una cantidad de un segundo anticuerpo anti-IL17C de potencial inoculación cruzada (es decir, no unido a la placa de ELISA). Posteriormente, se agrega una cantidad limitada de IL17C-Fc a los pocilios.

El anticuerpo con el que se recubren los pocilios y el anticuerpo en solución competirán por la unión de la cantidad limitada de moléculas de IL17C. A continuación la placa se lava para eliminar las moléculas de IL17C que no se unieron al anticuerpo recubierto y también para eliminar el segundo anticuerpo en fase de solución asi como cualesquiera complejos formados entre el segundo anticuerpo en fase de solución e IL17C. La cantidad de IL17C unida a continuación se midió mediante el uso de un reactivo de detección de IL17C adecuado. Por consiguiente, la IL17C puede fusionarse con un marcador, por ejemplo, Fe, Flag, etc. que puede detectarse con un anticuerpo adecuado especifico para el marcador.

El anticuerpo en solución que se inocula de forma cruzada con el anticuerpo recubierto podrá provocar una disminución en la cantidad de moléculas de IL17C que el anticuerpo recubierto puede unir con respecto a la cantidad de moléculas de IL17C que el anticuerpo recubierto puede unir en la ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.

Este ensayo se describe en más detalle a continuación para dos anticuerpos denominados Ab-X y Ab-Y. En la instancia donde Ab-X se selecciona para ser el anticuerpo inmovilizado, con este se recubren los pocilios de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución bloqueadora adecuada para minimizar la unión no especifica de los reactivos que se agregan posteriormente. A continuación se agrega una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa de ELISA de forma tal que los moles de Ab-Y en los sitios de unión de IL17C por pocilio sea al menos 10 veces superior a los moles de Ab-X en los sitios de unión de IL17C utilizados por pocilio durante el recubrimiento de la placa de ELISA. A continuación, la IL17C se agrega de forma tal que los moles de IL17C agregados por pocilio sean al menos 25 veces menores a los moles de Ab-X en los sitios de unión de IL17C que se utilizan para recubrir cada pocilio. Después de un periodo de incubación adecuado, la placa de ELISA se lava y se agrega un reactivo de detección de IL17C para medir la cantidad de moléculas de IL17C unidas específicamente por el anticuerpo anti-IL17C recubierto (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pocilios con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), tampón únicamente (es decir, sin IL17C) y reactivos de detección de IL17C. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pocilios con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución, tampón únicamente (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución) y reactivos de detección de IL17C. Es necesario que el ensayo ELISA se realice de forma tal de tener una señal de control positivo que sea al menos 6 veces la señal de fondo.

Para evitar cualquier accidente (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para IL17C) que resulte de la elección de cuál anticuerpo utilizar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál utilizar como el segundo anticuerpo (competidor), los ensayos de inoculación cruzada deben realizarse en dos formatos: 1) formato 1 donde Ab-X es el anticuerpo con el que se recubre la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que se encuentra en solución y 2) formato 2 donde Ab-Y es el anticuerpo con el que se recubre la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que se encuentra en solución.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado especifico para IL17C para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, donde dicho trastorno inflamatorio es inflamación pulmonar, psoriasis, artritis reumatoidea y/o COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica) y donde IL17C consiste en aminoácidos de SEQ. ID No 181.

2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de conformidad con las reivindicación 1, donde dicho anticuerpo bloquea la unión de IL17C a IL17RE.

3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se inocula de forma cruzada con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende 6 CDR definidas por Kabat, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una HCDR1 de Seq. ID: 1, una HCDR2 de Seq. ID: 2, una HCDR3 de Seq. ID: 3, una LCDR1 de Seq. ID: 4, una LCDR2 de Seq. ID: 5 y una LCDR3 de Seq. ID: 6 (OR12740), o una HCDR1 de Seq. ID: 31, una HCDR2 de Seq. ID: 32, una HCDR3 de Seq. ID: 33, una LCDR1 de Seq. ID: 34, una LCDR2 de Seq. ID: 35 y una LCDR3 de Seq. ID: 36 (MOR12743), o una HCDR1 de Seq. ID: 41, una HCDR2 de Seq. ID: 42, una HCDR3 de Seq. ID: 43, una LCDR1 de Seq. ID: 44, una LCDR2 de Seq. ID: 45 y una LCDR3 de Seq. ID: 46 (MOR12744), o una HCDR1 de Seq. ID: 51, una HCDR2 de Seq. ID: 52, una HCDR3 de Seq. ID: 53, una LCDR1 de Seq. ID: 54, una LCDR2 de Seq. ID: 55 y una LCDR3 de Seq. ID: 56 (MOR12745), o una HCDR1 de Seq. ID: 61, una HCDR2 de Seq. ID: 62, una HCDR3 de Seq. ID: 63, una LCDR1 de Seq. ID: 64, una LCDR2 de Seq. ID: 65 y una LCDR3 de Seq. ID: 66 (MOR12746), o una HCDRl de Seq. ID: 71, una HCDR2 de Seq. ID: 72, una HCDR3 de Seq. ID: 73, una LCDRl de Seq. ID: 74, una LCDR2 de Seq. ID: 75 y una LCDR3 de Seq. ID: 76 (MOR12751), o una HCDRl de Seq. ID: 91, una HCDR2 de Seq. ID: 92, una HCDR3 de Seq. ID: 93, una LCDRl de Seq. ID: 94, una LCDR2 de Seq. ID: 95 y una LCDR3 de Seq. ID: 96 (MOR12754), o una HCDRl de Seq. ID: 141, una HCDR2 de Seq. ID: 142, una HCDR3 de Seq. ID: 143, una LCDRl de Seq. ID: 144, una LCDR2 de Seq. ID: 145 y una LCDR3 de Seq. ID^ 146 (MOR12759), o una HCDRl de Seq. ID: 151, una HCDR2 de Seq. ID: 152, una HCDR3 de Seq. ID: 153, una LCDRl de Seq. ID: 154, una LCDR2 de Seq. ID: 155 y una LCDR3 de Seq. ID: 156 (MOR12760), o una HCDRl de Seq. ID: 161, una HCDR2 de Seq. ID: 162, una HCDR3 de Seq. ID: 163, una LCDRl de Seq. ID: 164, una LCDR2 de Seq. ID: 165 y una LCDR3 de Seq. ID: 166 (MOR12761), o una HCDRl de Seq. ID: 171, una HCDR2 de Seq. ID: 172, una HCDR3 de Seq. ID: 173, una LCDRl de Seq. ID: 174, una LCDR2 de Seq. ID: 175 y una LCDR3 de Seq. ID: 176 (MOR12762).

4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo o fragmento de este es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena liviana humana.

7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo es del isotipo IgG.

8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, donde dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab2)r, F(ab)2', scFV