KR20140058532A - Ｔ-세포 활성화 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제를 제공한다.

Description

Ｔ-세포 활성화 억제제{INHIBITORS OF T-CELL ACTIVATION}
관련출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 6월 30일에 출원된 다음의 미국 가출원 제61/503,282호의 이익을 주장하고, 그 전체 내용이 여기에서 참조로서 포함된다.
자가면역 질환의 모델들 또는 기관 이식편에서 생체 분리되거나, 생체 외(ex vivo) 증식 또는 시험관 내 유도된 Treg를 이용하는 세포 치료법은, Treg의 적응 이식(adoptive transfer)이 Treg 대 효과기 T 세포(effector T cell)의 균형을 회복시킬 수 있고, 이에 따라 이들 질환에 관련된 자가 면역을 조절할 수 있다고 나타났다(Allan et al., (2008) Immunol . Rev . 223:391-421; Jiang et al., (2006) Expert review of clinical immunology 2:387-392; Riley et al., (2009) Immunity 30:656-665; Tang et al., (2012) Journal of molecular cell biology 4:11-21). 그러나 치료 전략으로서의 적응 이식의 사용은 임상에 적용하는데 몇몇 문제점들이 있다. 인간 대상의 말초 혈액에서 분리될 수 있는 자가조직 Treg의 수는 제한적이고 Treg의 대규모 생체외 증식은 그들의 기능성 및/또는 순도를 변경시킬 수 있다. 분리된 Treg는 다클론성(polyclonal)이기 때문에, 그들은 비-타겟 효과기 T-세포들에 대하여 광범위한 면역 억제 작용(pan-immune suppressive function)을 가할 수 있다. 중요하게, 적응 이식된 Treg들은 Foxp3 발현능을 상실할 수 있고, 자가면역 또는 염증을 악화시킬 위험성을 발생시키는 Th17 세포들(Koenen et al., (2008) Blood 112:2340-2352.) 또는 병원성 기억 T 세포들(Zhou et al., (2009b) Nat Immunol 10:1000-1007)로 재분화할 수 있기 때문에, Treg의 가소성(plasticity)은 중요한 문제들을 제기한다(Bluestone et al., (2009) Nat Rev Immunol 9:811-816; Zhou et al., (2009a) Curr Opin Immunol 21:281-285).
인 시튜(in situ) 항원 특이적 방식으로 Treg의 생성을 유도하는 치료는 양자 Treg 세포 치료법 보다 이점을 가질 수 있다. 세포 독성 T 림프구 연관 항원-4(CTLA-4; CD 152)은 잘 확립된 T-세포 반응의 네거티브 조절제이고, T-세포 항상성 및 자가-내성(self-tolerance)의 유지를 위해 중요하다. CTLA-4는 공자극 분자(co- stimulatory molecule) CD28과 상동성이고, 항원 제시 세포들(antigen presenting cells, APC) 상에서 발현되는, 동일한 리간드들인, CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)을 공유한다. 그러나, APC 상의 CD80/CD86과 효과기 T-세포 상의 CD28 및 CTLA-4의 상이한 결합은 상반되는 결과를 초래하는데, CD28은 T 세포 활성화를 유발하고 CTLA-4는 T 세포 억제를 야기한다.
CD28이 T 세포 상에서 구조적으로 발현되고 CTLA-4의 발현이 T 세포 활성화에 이어서만 유도되고, 2~3일 후에 최고 점에 이르기 때문에(Jago et al., (2004) Clinical & Experimental Immunology, 136: 463-471), 대규모의 T 세포 활성화가 CTLA-4 결합(engagement) 이전에 발생한다. 따라서, CTLA-4의 주요 역할은 T 세포 활성화를 억제하는 것이라기보다는 대규모의 T세포 반응에 대한 보호장치(safeguard)로서 작용하는 것이다. 그러나, 그 리간드에 의한 CTLA-4의 조기 결합 및 T 세포 수용체(TCR)와의 차후 가교결합은 TCR 신호화를 너무 일찍 약화시켜서, T 세포 억제 및 반응성 저하(hyporesponsiveness), 또는 아네르기(anergy)를 초래한다. 이러한 개념은 다음을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 실험적으로 증명되었다: (i) 비즈 상의 공-고정(co-immobilization)에 의하여 또는 2차 항체를 통해, 경쟁적(agonistic) 항-CTLA-4 항체를 이용하여 T 세포 활성화 항체들(항-CD3/항-CD28)을 가교결합 하는 것(Blair et al., (1998) J. Immunol . 160: 12-15; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 183:2533-2540; Walunas et al., (1996) J. Exp . Med . 183:2541-2550); (ii) APC 상의 CTLA-4에 대하여 표면 연결 경쟁적(agonistic) scFv을 분자적으로 가공하는 것(Fife et al., (2006) J. Clin . Invest . 116(8):2252- 61; Griffin et al., (2001) J. Immunol . Methods . 248(1-2):77-90; Griffin et al., (2000) J. Immunol . 164(9):4433-42); 및 (iii) APC 상의 특이적 항원을 인식하는 항체들을 경쟁적 항-CTLA-4 항체에 대해 화학적으로 가교결합하는 것(Li et al., (2007). J. Immunol . 179(8):5191-203; Rao et al., (2001) Clin . Immunol. 101(2):136-45; Vasu et al., (2004) J. Immunol . 173(4):2866-76).
Treg 대 효과기 T 세포들의 균형을 회복하는 것은 자가면역 질환을 치료하는 유망한 수단이다. 그러나, Treg의 이입(transfer)을 포함하는 세포 치료법은 특정 한계들을 갖는다. 따라서, 자가면역 질환의 치료를 위하여 항원-특이적 방식으로 Treg의 발생을 유도할 수 있는 치료법(예, CTLA-4)이 긴급하게 요구된다.
본 발명은 T 세포 활성화의 초기 상(phase) 동안 리간드-연결 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4)와 T 세포 수용체(TCR)를 가교결합시키고, 이에 따라 TCR 신호화를 감소시켜, T 세포 억제를 유도하는 리간드에 관한 것이다. T 세포 활성화를 억제할 수 있는 작용제를 개발하기 위하여, CTLA-4를 선택적으로 결합 및 활성화시키고 이를 TCR에 공결합(co-ligate)시키는 모이어티를 포함하는 이중특이성 융합 단백질(bispecific fusion protein)을 생성시켰다. 선행 기술의 접근방식과 대조하여, 이중특이성 융합 단백질은 MHC와 CTLA-4를 가교결합하도록 가공되었다; 이어서 이들 양자는 TCR로 접근하여, 면역 시냅스들 내에 CTLA-4/MHCⅡ/TCR 삼분자 복합체(tri-molecular complex)를 생성한다.
동종이계 MLR에서 돌연변이 마우스 CD80 및 림프구 활성화 항원-3을 포함하는 이중특이성 융합 단백질(BsB)로 TCR에 리간드-연결 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4)을 가교결합시키는 것은, TCR 신호화를 감소시키고 T-세포 분화를 Foxp3+ 조절 T 세포들(Treg)로 향하게 한다. 여기에서 기술된 바, 항원-특이적 Treg는 항원-특이적 구성(setting)에서 또한 유도될 수 있다. 비비만성 당뇨병(NOD) 마우스를 단기간(short course) BsB로 치료하는 것은 혈액내 Treg의 일시적인 증가와 함께 자가면역 제1형 당뇨병(T1D)의 발병을 적당히 지연시켰다. 그러나, NOD 동물을 장기간(longer course) BsB로 치료하는 것은 당뇨병을 나타내는 동물의 발생율을 감소시킬 뿐만 아니라 질병의 발병을 유의적으로 지연시켰다. 비-당뇨병으로 남아있는 BsB 처리 마우스의 췌장에 대한 조직병리학적 분석은 췌도(islet) 주변에서 다른 CD3+ T 세포들 및 비-T 세포 백혈구들과 혼합된 Treg가 존재한다는 것을 나타냈다. 이러한 페리-인슐린염(peri-insulitis)은 최소한의 침습성 인슐린염과 관련되었고 인슐린-생산 β-세포들의 주목할만한 파괴와는 관련이 없다. 따라서, CTLA-4 및 MHCⅡ를 연결할 수 있고, TCR과 간접적으로 공결합(co-ligate)할 수 있는 이중작용성(bifunctional) 단백질들은 생체 내 항원-특이적 Treg를 유도하여 마우스를 T1D 또는 다른 자가면역 질환들로부터 보호할 수 있다.
특히, 본 발명은 CTLA-4과 pMHCⅡ 복합체를 가교 결합시키는 이중특이성 융합 단백질들을 개시한다. 예를 들어, 돌연변이 마우스 CD80(CD80w88a)와 림프구 활성화 항원-3(LAG-3)를 포함하고 CTLA-4와 동시에 결합하고 pMHCⅡ를 통해 TCR과 가교결합하도록 가공된 이중특이성 융합 단백질을 개시한다. 그러므로, 제1 양상은 CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제(biologic)를 제공하는 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제를 제공한다. 본 발명에 따른 이중특이성 생물제제는, T-세포 상에 존재하는 CTLA-4와 항원 제시 세포(APC) 상의 펩타이드 MHC(pMHC) 복합체의 가교결합을 가능하게 한다. 펩타이드 MHC 복합체는 T-세포 상의 동종(cognate) T-세포 수용체(TCR)에 의해 결합되고, 이는 본 발명에 따른 이중특이성 생물제제가 삼자(tripartite) CTLA-4/MHC/TCR 복합체를 생성한다는 것을 의미한다.
여기에서 설명된 양상들의 다양한 실시형태들에서, CTLA-4에 특이적인 리간드는 CTLA-4에 특이적인 항체, 및 CD80(B7-1) 또는 CD86(B7-2)에서 선택된다. 특정 실시형태에서, CTLA-4에 특이적인 항체, 및 CD80(B7-1) 또는 CD86(B7-2)는 경쟁적(agonistic) 항체이다. CTLA-4에 특이적인 항체들은 가공될 수 있고, CD80 및 CD86 양자는 CTLA-4에 대한 천연 리간드들이다. 일 양상에서, CD80이 CD28보다 CTLA-4에 우선적으로 결합되기 때문에, CD80 또는 이의 돌연변이체가 사용되고, 그 결과 활성화가 아니라 T 세포 불활성화를 촉진한다.
여기에서 설명된 양상들의 다양한 실시형태들에서, pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 항-MHC 항체 및 LAG-3에서 선택될 수 있다. LAG-3 폴리펩타이드는 MHCⅡ 단백질에 대한 천연 리간드이다. 일 실시형태에서, MHC는 MHC-Ⅱ(CD4+ T 세포들과 상호작용함)이다. 다른 실시형태에서 MHC는 MHC-Ⅰ이고, 이는 CD8+ T 세포들과 상호작용한다.
본 발명에 따른 이중특이성 생물제제에서, CTLA-4에 특이적인 리간드와 pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 바람직하게는 링커에 의해 떨어져 있다. 링커는 폴리아미노산 서열 및 항체 Fc 도메인 중 하나 이상의 형태를 취할 수 있다. 적절한 폴리아미노산 서열은 G9(Gly-9)이다.
여기에서 기술된 양상들의 다양한 실시형태들에서, CTLA-4에 특이적인 리간드는 CD80, 또는 CD28보다 CTLA-4에 특이성이 증가하도록 돌연변이된 그의 돌연변이체이다. 일 실시형태에서, 돌연변이된 CD80은 W88A, K75G, K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A, 및 S204A에서 선택된 하나 이상의 돌연변이들을 포함하고, 이들은 마우스 CD80 전구체 또는 이들의 인간 CD80 카운터파트들(W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, 및 S201A) 및 추가로 R63A, M81A, N97A, E196A에서 번호화된 서열을 사용한다.
일 실시형태에서, 이중특이성 생물제제는 CD80을 포함하고, 이는 돌연변이 W84A(인간) 또는 W88A(마우스)를 포함한다.
특정 실시형태에서, MHCⅡ 복합체에 특이적인 리간드는 LAG-3이다. 유리하게, LAG-3는 pMHCⅡ에 대한 특이성이 증가되도록 돌연변이된다. 예를 들어, LAG-3는 R73E, R75A, R75E 및 R76E에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(Huard et al., (1997) Proc . Natl . Acad. Sci . USA . 94(11): 5744-5749). 일 실시형태에서 LAG-3는 돌연변이 R75E를 포함한다.
CD28보다 CTLA-4와 이중특이성 융합 단백질의 우선적인 결합은 돌연변이체 CD80(CD80w88a)를 사용하여 얻어지고, 이는 리간드로서, 아미노산 88(마우스 CD80에서 번호화됨)에서 트립토판 대신에 알라닌을 포함한다. CD80w88a는 CTLA-4와 결합하지만, CD28에 대해서는 최소 친화성을 나타낸다(Wu et al., (1997), J. Exp . Med . 185:1327-1335).
MHCⅡ의 천연 리간드인 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)는, 이중특이성 융합 단백질의 다른 결합 성분으로서 선택되었다(Baixeras et al., (1992) J. Exp . Med . 176:327- 337; Triebel et al., (1990) J. Exp . Med . 171:1393-1405). 우리는 이러한 이중작용성을 갖는 융합 단백질이 효과적으로 T 세포 활성화를 억제하고 항-염증성 사이토카인 IL-10 및 TGF-β 생산을 자극한다는 것을 보여준다. 보다 중요하게, 이 이중특이성 융합 단백질은 또한 T-세포 분화를 높은 억제성 Foxp3+ Tresg로 향하게 한다. 이는 잘 확립된 공-자극성 억제제 CTLA-4Ig가 대신 사용되었을 때에는 발생하지 않았다(Bluestone et al., (2006) Immunity 24:233-238; Linsley and Nadler (2009) Immunol . Rev . 229:307-321). 그러므로, CTLA-4의 초기 결합(engagement) 및 T 세포 활성화 동안의 CTLA-4와 TCR의 가교결합은 T 세포 분화에 활발하게 영향을 미칠 수 있다. 따라서 이러한 이중특이성 융합 단백질들은 자가면역 질환들에서 과도한 T 세포 반응을 조절하는데 사용될 수 있는 새로운 부류의 생물 제제를 대표할 수 있다.
본 발명의 제2 양상에서, MHC 분자 및 이중특이성 생물 제제와 복합화된 항원에서 유래된 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와 T 세포를 접촉시켜 T 세포의 자기내성화(tolerisation)를 위한, 본 발명의 제1 양상에 따른 CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물 제제의 사용을 제공한다.
제3 양상에서, 자가면역 질환 및 이식 거부에서 선택된 질병의 치료에서의, 본 발명의 제1 양상에 따른 pMHC 복합체에 특이적인 리간드 및 CTLA-4에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제의 사용을 제공한다.
예를 들면, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D), 전신 홍반성 루프스 (Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 류마티스성 관절염(Rheumatoid Arthritis, RA) 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)(궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 및 크론병(Crohn? disease, CD)을 포함함), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 경피증(scleroderma), 및 기타 질환들 및 장애들, 예를 들어 PV(심상성천포창(pemphigus vulgaris)), 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 셀리악병(celiac disease), 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Lung disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 그레이브스병(Graves's disease)(갑상선), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 굳파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 에디슨병(Addison's disease), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 원발성 담도 경화증(primary biliary sclerosis), 경화성 담관염(sclerosing cholangitis), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica). 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 측두 동맥염(temporal arteritis), 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 악성 빈혈(pernicious anemia), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 베체트병(Behcet? disease), 원발성 담즙성 간경변(primary bilary cirrhosis), 포도막염(uvetitis), 심근염(myocarditis), 류마티스성 열(rheumatic fever), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 사구체신염(glomerulenephritis), 유육종증(sarcoidosis), 피부근염(dermatomyositis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 다발성근염(polymyositis), 원형탈모증(alopecia areata), 및 백반증(vitilgo) 이다.
제4 양상에서, 본 발명의 제1 양상에 따른 이중특이성 생물 제제 및 MHC 분자와 복합화된 항원으로부터 유도된 펩타이드를 제시하는 항원-제시 세포를 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 대하여 T-세포를 내성화(tolerise)시키는 방법을 제공한다.
제5 양상에서, 자가면역 질환 및 이식 거부에서 선택된 질병을 앓는 대상을 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 제1 양상에 따른 pMHC 복합체에 특이적인 리간드 및 CTLA-4에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
예를 들면, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D)이다.
도 1. BsB 및 BsB △의 설계. (A) BsB(이중특이성 생물제제) 및 BsB△ 융합 단백질들의 개략도. (B) 면역 시냅스에서의 pMHCⅡ, TCR 및 공-자극성 분자들의 개략도, 및 CTLA-4/MHC 11/TCR 삼분자 복합체를 통한 CTLA-4와 TCR의 BsB-매개 가교결합에 대한 제안된 도식. 융합 단백질은 CTLA-4을 결합시키고(engage) 면역 시냅스에서 MHCⅡ과의 결합을 통해 TCR을 간접적으로 묶는다(ligate). 삼각형의 두 개의 실선은 MHCⅡ와 TCR뿐만 아니라 MHCⅡ와 CTLA-4의 가교결합을 가리킨다; 파선은 TCR과 CTLA-4의 결합(ligation)을 나타낸다. 점선은 BsB 결합 CTLA-4에 의한 TCR 신호화의 억제를 가리킨다. 개략도는 BsB△의 작용이 TCR을 묶을 수 없다는 것 이외에는 BsB의 작용과 유사하다는 것을 보여줌.
도 2. 혼합 림프구 반응에서 BsB 에 의한 동종이계 T 세포 활성화의 억제. C57BL/6 마우스 및 LPS 처리되고 방사선 조사된 BALB/c APC 유래 미접촉(naive) T 세포들을 2일 동안 시험 구조체와 혼합하였다. 이어서 배양 배지들을 채취하고 IL-2에 대해 분석하였다. 배지에서 IL-2의 감소된 양이 나타내는 것처럼, BsB 및 CTLA-4Ig만이 T 세포 활성화를 억제하였다. 도면은 6개 이상의 독립적이지만 유사한 연구를 대표한다.
도 3. BsB 에 의한 Foxp3 + Treg 의 유도 및 IL -10 및 TGF -β 생산. (A) 동종이계 혼합 림프구 반응들은 시험 구조체 존재하에서 Foxp3-EGFP 넉-인 마우스(Foxp3-EGFP knock-in mice)에서 분리된 미접촉 CD4+CD62LhiCD25-GFP" 세포들을 이용하여, 도 2에 대한 설명에서 기술된 것처럼 구성되었다. 활성화 5일 후에, 유동 세포 분석법에 의하여 GFP 발현에 대하여 CD4+ T 세포를 분석하였다. Treg는 GFP+ 및 CD25+ 세포들로서 게이트된다(gated). BsB 처리만이 GFP 발현을 유도하였고, 이는 Foxp3+ Treg의 유도를 가리킨다(중간 왼쪽 패널). 배양 배지를 사이토카인 분석을 위해 수집하였고(오른쪽 패널), 이는 BsB 존재하에서 높은 IL-10 및 TGF-β 수준을 나타내었다. 데이터는 독립적이지만 유사한 많은 연구들을 대표한다. (B) TGF-β에 대한 차단 항체의 존재하에서 Treg 유도가 완전히 차단된다는 것은 Treg 유도를 위하여 자가분비(autocrine) TGF-β가 요구된다는 것을 나타내고, 반면에 대조군 Ab는 Treg 유도에 주목할만한 영향을 주지 않았다.
도 4. 시험관 내에서 항원-특이적 Treg 의 BsB -매개 유도. (A) 시험관내 Ova233 -339-특이적 Treg의 유도. 미접촉 OT-Ⅱ T 세포들을 0.5 ?/ml Ova233 -239 펩타이드 존재하에서 LPS-활성화 및 방사선 조사된 공통유전자(syngeneic) APC와 혼합하였다. 이어서, 대조군 mIgG2a, BsB, 및 BsB 플러스(plus) 항-TGF-β 항체(αTGF-β)를 추가하였고 지시된 대로 시험하였다(왼쪽 패널들). 세포들을 5일 동안 배양하고, 이어서 유동 세포 분석법으로 분석하기 전에 항-CD25, 항-Foxp3 항체들로 표지하였다. 배양 배지 중의 IL-2, IL-10 및 TGF-β 수준을 ELISA로 분석하였다(오른쪽 패널들). (B) 유도된 Treg 증식의 모니터링. APC와 혼합하기 전에 미접촉 OT-Ⅱ T 세포들을 CFSE로 사전에 표지한 것 이외에는 (A)에서 기술한 것과 같이 연구들을 실시하였다. 세포들은 Foxp3 및 CFSE 형광 채널 상에서 게이트되었다.
도 5. BsB -유도 Treg 의 억제 작용. (A) BsB- 또는 TGF-β 유도 Treg를 유동 세포 분석법에 의해 정제하였고 트랜스웰들(채워진 컬럼들)또는 일반 배양 웰들(해치된 컬럼들)에서 지시된 비율들로 C57BL/6 마우스로부터 제조된 CFSE-표지된 미접촉 응답자 T 세포들과 혼합하였다. T 세포 활성화를 자극하기 위하여 LPS-처리된 동종이계 BALB/c APC를 첨가하였다. 결과들(평균값+표준 편차)은, 100%로 설정된 Tresg 없는(Tresp+APC만) CFSE 희석액에 기초한, 증식 응답자 T 세포들(Tresp)의 퍼센트를 나타낸다. (B) T 세포 증식에 대한 사이토카인의 기여도를 측정하기 위하여, 항-IL-10 및 항-TGF-β 항체들을 1:1의 Tresp:Treg 비율에서 일반 배양 웰 중의 세포들에 첨가하였다. 항-TGF-β 항체는 TGF-β-유도 Treg의 억제 작용을 부분적으로 억제하였지만(왼쪽 패널), BsB-유도 Treg에는 영향을 미치지 않았다(오른쪽 패널). 도면은 독립적이지만 유사한 4개 이상의 연구들을 대표한다.
도 6. BsB 에 의한 AKT 및 mTOR 인산화의 하향 조절. 미접촉 T 세포들을 항-CD3, 항-CD28 및 BsB, 마우스 IgG(mIgG) 또는 마우스 PD-L1(mPD-L1)로 공-코팅된 둥근 바닥 96 웰 플레이트들에서 18 시간 동안 배양하였다. 활성화되지 않은 것으로 간주된 세포들은 IgG 만으로 코팅된 웰에서 배양하였다. 이어서 AKT 및 mTOR의 인산화 상태를 인산화된 AKT 및 mTOR에 대해 형광 표지된 항체들로 염색한 후 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. MFI 표시는 형광 강도를 의미한다. 이 도면은 3개의 독립적인 실험들 중 하나를 나타낸다.
도 7. BsB 연속 자극에 대한 반응으로 Treg 에서의 지속적인 Foxp3 발현. 둥근 바닥 96 웰 플레이트들을 항-CD3, 항-CD28 및 BsB 또는 마우스 IgG로 공-코팅하였다. Foxp3-EGFP 넉-인 마우스 유래 미접촉 T 세포들을 5시간 동안 배양하여 Treg를 유도하였고(왼쪽 패널들), 이어서 이들을 BsB-처리 세포들로부터 정제하였고(붉은 사각형), GFP+ 세포들에 대한 유동 세포 분석법에 의한 분석 전에, 상기한 것처럼, 5일 동안, 공-코팅된 웰들 중의 또 다른 배양 라운드에서 재-자극하였다. 5일 동안 마우스 IgG 대조군으로 정제된 Treg를 재-배양하는 것은 세포들 중 약 60%에서 Foxp3+ 발현의 손실을 초래하였고(상부 오른쪽 패널의 상부 오른쪽 사분면), 반면에 BsB로 재-배양된 7% 미만의 Treg는 Foxp3+ 발현능을 상실하였다(하부 오른쪽 패널의 상부 오른쪽 사분면). 이 도면은 3개의 독립적인 실험들 중 하나를 나타낸다.
도 8. 생체내 BsB 의 약물 동력학 및 생화학적 분석. (A) 마우스에서의 BsB의 약물 동력학 프로파일. 정상 C57BL/6 마우스들(n=5)에게 20 mg/kg의 BsB를 복강내 주입하였다. 혈액 샘플들을 지시된 상이한 시점에 수집하였고, BsB 수치의 수준을 ELISA를 사용하여 측정하였다. (B) BsB 및 마우스 IG2a와 FcRn의 결합(binding) 비교. FcRn을 바이아코어 칩(biacore chip)에 고정시켰다. BsB 또는 대조군 마우스 IgG2a는 다양한 농도로 칩 상에 적재되었고, 이어서 신호들을 기록하였다.
도 9. BsB 상의 아스파라긴-연결 글리코실화의 분석. Asn-연결 글리코실화 자리의 예측을 위하여 BsB의 아미노산 서열을 NetNGlyc 1.0 서버에 제출하였다. 총 10개의 Asn-연결 글리코실화 자리들(N으로 표시함)를 예측하였다; 다른 아미노산들은 점으로 나타내었다. BsB의 단당류 조성물은 또한 글리칸 푸코즈(Fuc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 갈락토즈(Gal), 만노즈(Man), 시알산(N-아세틸뉴라민산)의 조성물을 측정하였다. 시알산:갈락토즈의 0.68 비율은 갈락토즈 잔기들의 1/3이 아시알로당단백질 수용체와 결합할 수 있다는 것을 가리킨다.
도 10. 후기 예방 치료 패러다임에서 비-당뇨병( NOD ) 마우스들의 BsB 치료는 제1형 당뇨병( T1D )의 발병을 지연시켰다. (A) BsB-처리된 NOD 마우스들(폐쇄 원들, n=15) 및 식염수-처리된 대조군 NOD 마우스들(폐쇄 삼각형들, n=14)의 혈액에서의 Foxp3+ Treg의 수준. 대조군 동물들에서 기록된 것보다 BsB-처리된 동물들에서의 Treg 수는 중간이지만(moderate) 유의적으로 증가하였다. (B) BsB(채워진 원들) 또는 식염수(채워진 삼각형들)으로 처리된 NOD 동물들에서 현성 당뇨병의 누적 발생률.
도 11. 초기 예방 치료 패러다임에서 NOD 마우스들의 BsB 처리는 T1D 의 발병을 지연시켰다. (A) BsB(폐쇄 원들, n=10), 식염수(폐쇄 삼각형들, n=10), CTLA-4Ig(폐쇄 사각형들, n=10) 및 마우스 IgG2a(개방 사각형들, n=10)으로 처리된 마우스들의 혈액에서의 Foxp3+ Treg의 수준. BsB 처리 2주 후에 Foxp3+ Treg의 수는 식염수 또는 mIgG2a-처리된 대조군들과 비교하여 증가하지 않았다. 그러나 CTLA-4Ig로 처리한 것은 혈액 중 Foxp3+ Treg의 수가 통계상 유의적으로 감소하였다. (B) BsB로 처리된 동물들 또는 대조군에서 현성 당뇨병의 누적 발생률. 24 주령 전에 식염수 또는 마우스 IgG2a-처리된 대조군 그룹들과 비교하여, BsB 처리는 T1D의 발병을 유의적으로 지연시켰다(p=0.04). 그러나, 연구 종료 시에 그룹들 사이에서 유의적이 차이는 나타나지 않았다. 데이터는 각 그룹에서 총 26마리의 NOD 마우스들로, 유사 결과들을 갖는 2개의 개별 연구들 중 하나를 나타낸다.
도 12. NOD 마우스들의 BsB 장기간 처리는 NOD 마우스들에서 T1D 의 발병을 유의적으로 지연시켰다. (A) BsB 처리 마우스들(n=16) 및 미처리 마우스들(n=16)에서의 현성 당뇨병의 누적 발생율. BsB 처리는 식염수로 처리된 것과 비교하여 T1D의 발생을 유의적으로 감소시켰다(p<0.01). (B) 식염수 또는 BsB로 처리된 동물들의 췌장 조직의 조직 병리학적 분석. 패널들 a~c는 H&E, 인슐린에 대한 항체, 또는 항-CD3 및 포크헤드 박스 P3(Foxp3)를 각각 갖는 비-당뇨병으로 남아있는 식염수-처리 마우스들의 부분들(section)을 나타낸다. 질병이 없는 상태인 BsB-처리 NOD 마우스들에서 유사한 관찰들이 기록되었다. 부분들 중 어느 것도 침윤(infiltration)이나 인슐린염(insulitis)의 증거를 나타내지 않았다; 몇몇 Foxp3+ Treg가 존재할 수 있다(패널 c의 화살표). 패널들 d-f는 당뇨병 NOD 동물들 유래 췌장 부분들을 나타낸다. 침습성 인슐린염은 명확하게 나타났고 인슐린-생산 β 세포들은 완전히 파괴되었다(e). 일부 CD3+ T 세포 침윤이 또한 검출되었고, Treg가 거의 없고 푸른 핵을 갖는 비-T 세포 백혈구들 다수가 함께 있었다(f). 패널들 g-i는 비-당뇨병으로 남아 있는 BsB 처리 동물들의 췌도(islet)들이 특징적인 페리-인슐린염을 나타내는 것을 보여준다. 백혈구 침윤이 나타났지만, 췌도 주변부로 제한되었다. 더욱이, 인슐린-생산 β-세포들의 주목할 만한 파괴는 없었다. 주변부의 대부분의 백혈구들은 비-T 세포들(푸른 핵)이었다. 확대된 삽입도(패널 j, i의 붉은 사각형을 나타냄)는 Foxp3+ Treg(노란색 화살표 머리)가 췌도 주변부에서 다른 CD3+ T 세포들 및 비-T 세포 백혈구들(푸른 핵)과 섞여 있다는 것을 나타내었다. 이미지들은 40x 대물렌즈로 얻었고; 삽입도는 60x 대물렌즈로 얻었고, 이어서 추가로 디지털 방식으로 3x 확대하였다.
달리 언급되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에서 기술된 것과 유사하거나 동일한 기능을 갖는 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 및 시험에 사용될 수 있다. 이러한 용도에 적절한 방법들, 장치들, 및 재료들이 이제 기술된다. 여기에서 인용된 모든 공개 문헌들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공개 문헌들에 보고된 방법론들, 시약들, 및 도구들을 기술하고 설명할 목적으로 전체가 참조로서 여기에 포함된다.
본 출원의 방법들 및 기술들은 일반적으로 당업자들에게 잘 알려져 있는 종래 방법들에 따라서, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 문헌들에 기술된 것처럼 일반적으로 수행되었다. 이러한 기술들은 문헌들에 충분히 설명된다(예, Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J. G., Limbird, L. E., and Gilman, A. G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D. M. , and Blackwell, C. C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C. R., and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag 참조).
용어 ?倫?는, 달리 지시되지 않는 한, 전체 항체들 및 이러한 항체들의 항원-결합 단편들을 가리키는데 사용된다. 예를 들어, 상기 용어는 4-쇄 IgG 분자들, 및 항체 단편들을 포함한다.
여기에서 사용된 바, 용어 "항체 단편들"은 완전한 전체길이 항체의 부분들, 예를 들어 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 가리킨다. 항체 단편들의 예시는 Fab, Fab' F(ab')2, 및 Fv 단편들; 이중체들(diabodies); 선형 항체들; 단일-쇄 항체 분자들(예, scFv); 다중특이성 항체 단편들, 예를 들어 이중특이성, 삼중특이성, 및 다중특이성 항체들(예, 이중체들(diabodies), 삼중체들(triabodies), 사중체들(tetrabodies)); 결합-도메인 면역 글로불린 융합 단백질들; 카멜화된 항체들(camelized antibodies); 미니바디들(minibodies); 킬레이팅 재조합 항체들(chelating recombinant antibodies); 트리바디들(tribodies) 또는 바이바디들(bibodies); 인트라바디들(intrabodies); 나노바디들(nanobodies); 작은 모듈 면역약물들(small modular immunopharmaceuticals (SMIP), VHH 함유 항체들; 및 항체 단편들에서 형성된 임의의 다른 폴리펩타이드들, 예를 들어 아래에서 추가로 기술된 것을 포함한다.
항체들은 임의의 분류, 예를 들어 IgG, IgA, 또는 IgM; 및 임의의 하위 분류, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4일 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 분류들 및 하위 분류들은 상이한 특성들을 가지며, 이는 상이한 적용들에서 유리할 수 있다.
특이성은, 본 발명과 관련하여, 청구된 항체들이 한정된 동종 항원(CTLA-4 또는 pMHC 복합체 중 어느 하나)와 선택적으로 결합할 수 있을 것을 요구한다.
천연 발생 면역 글로불린들은 공통 코어 구조를 가지며, 여기에서 2개의 동일한 경쇄들(약 24 kD) 및 2개의 동일한 중쇄들(약 55 내지 70 kDa)가 사량체(tetramer)를 형성한다. 각 쇄의 아미노 말단부는 가변(V) 영역으로 알려져 있고, 각 쇄의 잔부 중 보다 보존된 불변(C) 영역과 구별될 수 있다. J 영역으로 알려진 C-말단부는 경쇄의 가변 영역(VL 도메인이라고도 함) 내에 있다. 중쇄의 가변 영역(VH 도메인이라고도 함) 내에, J 영역에 더하여 D 영역이 있다. 면역 글로불린의 아미노산 서열 변형(variation) 대부분은 고가변 영역들로 알려진 V 영역들 또는 항원 결합에 직접 포함되는 상보적 결정 영역들(CDRs) 중에서 3 개의 개별 위치들로 제한된다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역들을 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3라고 한다. CDR들은 보다 보존된 골격 영역들(FRs)에 대해 제자리에 위치한다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역들은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4라고 한다. CDR 및 FR 영역들의 위치 및 번호화 체계는 카바트 등(Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, and updates thereof which may be found online)에 의해 정의되었다.
여기에서 사용된 바, 인간화 단일클론 항체는 인간 항체 골격(framework)으로 구성되고, 비-인간 항체로부터 CDR들이 그래프트된 항체이다. 인간화 항체들의 설계 및 생산 과정들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌들[Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제0 125 023호; Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호; Boss et al., 유럽 특허 출원 제0 120 694호; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., 유럽 특허 출원 제0 194 276 Bl호; Winter, U.S. Patent No. 5,225,539; Winter, 유럽 특허 출원 제0 239 400호; Padlan, E.A. et al., 유럽 특허 출원 제0 519 596호]에 기술되어 있다. 항체들, 인간화 항체들, 인공 항체들, 및 이들의 제조 방법들에 대한 추가적인 세부사항들은 문헌[Kontermann, R. and Dubel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering , 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY, 2001]에서 찾을 수 있다.
불변 영역들은 임의의 인간 항체 불변 영역들에서 얻을 수 있다. 일반적으로, 가변 영역 유전자들은 불변 영역 유전자들을 갖는 프레임에서 발현 벡터들로 클로닝되어 중쇄 면역 글로불린 및 경쇄 면역 글로불린을 발현한다. 이러한 발현 벡터들은 항체 합성을 위하여 숙주 세포들을 생산하는 항체들로 형질감염될 수 있다.
요구되는 항체 가변 및 불변 영역들은 서열 데이터베이스에서 구할 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린 서열들은 IMGT/LIGM 데이터베이스(Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) 또는 VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk)에서 이용할 수 있다.
여기에서 사용된 바 "핵산들"은 일반적으로 본 발명의 항체들을 인코딩하는 DNA 분자들을 포함한다. 숙주 세포에서 항체 유전자들을 발현하기에 적절한 발현 벡터들이 바람직하다. 항체 유전자 발현을 위한 발현 벡터들 및 숙주 세포들은 본 기술분야에서 공지되어 있다; 예를 들어, Morrow, K.J. (2008) Genetic Engineering & Biotechnology News . (June 15, 2008) 28(12), 및 Backliwal, G., et al. (2008) Nucleic Acids Res . 36(15): e96-e96 참조.
여기에서 사용된 바, "CD80"은 포유 동물 CD80 항원과, CTLA-4에 대한 특이성 또는 결합능을 증가시킨 그의 돌연변이체를 가리킨다(여기에 참고문헌으로 포함되는, Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, and Wu et al., (1997) J. Exp . Med . 185(7):1327-1335 참조). 포유 동물 CD80은 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 인간 CD80에서 선택될 수 있다.
여기에서 사용된 바, "CD86"은 포유 동물 CD86 항원과, CTLA-4에 대한 특이성 또는 결합능을 증가시킨 그의 돌연변이체를 가리킨다(여기에 참고문헌으로 포함되는, Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801 참조). 포유 동물 CD86은 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 인간 CD86에서 선택될 수 있다.
여기에서 사용된 바, "CTLA-4"는 포유 동물 세포독성 림프구-연관 항원-4(CTLA-4)를 가리킨다. 인간 CTLA-4의 서열은 GenBank, Accession number AAH74893.1, GI:49904741에서 찾을 수 있다. 포유 동물 CTLA-4는 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 인간 CTLA-4에서 선택될 수 있다.
여기에서 사용된 바, "LAG-3"는 포유 동물 림프구 활성화 항원-3(LAG-3)를 가리킨다. 인간 LAG-3의 서열은 여기에 참조로 포함되는 문헌[Huard et al., (1997) Proc . Natl . Acad . Sci , USA 94:5744-5749]에서 찾을 수 있다. 포유 동물 LAG-3는 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 인간 LAG-3에서 선택될 수 있다.
"MHC"는 TCR에 의해 인식되는 항원-제시 세포들에 의하여 항원 유도 펩타이드들의 제시(presentation)에 의해 포함되는 복합체이다. 특정 양상에서, MHC는 MHCⅡ이고, 이는 CD4+ 헬퍼 T-세포들에 대한 항원을 나타낸다(예를 들어, Wucherpfennig et al., CSH Perspect . Biol . 2(4): a005140, epub 2010 Mar 17 참조). 이중특이성 리간드로 나타낼 수 있는, 이중특이성 생물제제는 2개의 타켓들에 동시에 결합하거나 결합될 수 있는 리간드이다. 이중특이성 항체들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 아래에서 추가로 설명된다. 본 발명과 관련하여, 2개의 타겟들은 T-세포 상의 CTLA-4 분자와 APC 상의 MHC 펩타이드 복합체이다. 본 발명에 따른 이중특이성 생물제제는 2개의 타겟들을 가교결합시킬 수 있고; 면역 시냅스에서 pMHC가 TCR가 결합함으로써, 이에 따라, CTLA-4 분자를 TCR과 가교결합시킨다. ?薰걍┒?는 일반적으로 생물학적 치료제 또는 약제이고, 그 중에서도, 치료, 진단 및/또는 연구 목적으로 유용할 수 있다.
링커는 단백질에서 2개의 폴리펩타이드 도메인들을 결합시키거나 분리시키는 임의의 아미노산 서열이다. 본 발명의 이중특이성 리간드와 관련하여, 링커는 CTLA-4 리간드를 MHC 리간드에 결합시키는 서열이다. 예시적인 링커들은 아미노산, 예를 들어 폴리글리신, 예로서 Gly-9의 서열이다. 대체 링커는 항체 Fc 영역이다. 이러한 링커는 2개의 리간드 도메인들을 약 120 Å으로 떨어지게 한다.
본 발명에 따른 리간드는 임의의 조합으로 항체 및 비-항체 리간드들을 포함할 수 있다. 예를 들어, CTLA-4 리간드는 항-CTLA-4 항체일 수 있고, MHC 리간드는 LAG-3일 수 있다. 대안으로, CD80은, LAG-3 또는 항-MHC 항체와 조합하여, CTLA-4 리간드로서 사용될 수 있다. 양 리간드들은 항체들이거나, 양자는 천연 리간드들, CD80 또는 LAG-3일 수 있다.
세포독성 림프구-연관 항원-4( CTLA -4)
CD152로도 알려져 있는, 세포독성 T 림프구-연관 항원-4(CTLA-4)는 T 세포 반응의 네거티브 조절제이고, T 세포 항상성 유지 및 자가-내성(self-tolerance)의 유도에서 중요한 역할을 한다(Karandikar et al., (1996) J Exp Med 184:783-788; Krummel and Allison, (1995) J Exp Med 182:459-465; Linsley and Golstein, (1996) Curr Biol 6:398-400; Walunas and Bluestone, (1998) J Immunol 160:3855-3860; Walunas et al., (1994) J Immunol 160:3855-3860). CTLA-4 결핍 마우스는 다중-기관 자가면역 질환이 발생하고 일반적으로 4 주령에 가벼운 질병(ailment)으로 쓰러진다(Tivol et al., (1995) Immunity 3:541-547; Waterhouse et al., (1995) Science 270:985-988). CTLA-4가 T 세포 활성을 조절하는 분자 메커니즘은 다면적이고, 종래 T 세포들상에서 본질적으로 또는 조절 T 세포들(Treg)을 통해 비본질적으로 발생하는 것으로 생각된다(Ise et al., (2010) Nat Immunol 11:129-135; Jain et al., (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:1524-1528; Paterson and Sharpe, (2010) Nat Immunol 11:109-111).
이들 메커니즘은 리간드 결합에서 CD28과 경쟁하는 것(Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801), APC에서 관용 효소(tolerogenic enzyme) 인돌아민 2,3 디옥시게나제의 생산을 유도하는 것(Grohmann et al., (2002) Nat Immunol 3:1097-1101; Onodera et al., (2009) J Immunol 183:5608-5614) 및 면역 시냅스로부터 CD28을 이동하는 것(displace)(Pentcheva-Hoang et al., (2004) Immunity 21:401-413)을 포함한다. CTLA-4는 공-자극 분자 CD28과 상동성이고 동일한 리간드들인, CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)을 공유하고, 이 리간드들은 항원 제시 세포들(APC)의 표면상에서 발현된다. 그러나 효과기 T 세포들 상에서의 CD28 및 CTLA-4와 APC 상에서의 CD80/CD86와의 차등 결합은, CD28 촉진 T 세포 활성화 및 CTLA-4 유발 T 세포 억제라는, 상반되는 결과를 가져온다. APC 상에서의 그의 리간드(CD80/86)에 의한 CTLA-4의 결합(engagement)은 또한 활성화를 거치는 T 세포들의 TCR의 부근(vicinity)으로 포스포타아제 SHP-1(Guntermann and Alexander, (2002) J Immunol 168:4420-4429) 및 PP2A(Baroja et al., (2002) J Immunol 168:5070-5078; Chuang et al., (2000) Immunity 13:313-322)의 보충(recruitment)을 자극한다. TCR과 관련된 핵심 신호화 분자들의 결과적인 탈인산화는 T 세포 활성화의 종료를 가져온다(Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442). 더욱이, 그 리간드와 CTLA-4의 초기 결합 및 TCR과의 가교결합을 촉진하는 개입들은 핵심 신호화 서명들의 미성숙 축임(premature dampening)과 결과적으로 T 세포 활성화의 억제를 가져오고, T 세포 반응성저하(hyporesponsiveness) 또는 아네르기(anergy)를 초래한다(Blair et al., (1998) Immunol 160:12-15; Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 182:459-465; Walunas et al., (1996) J Exp Med 183:2541-2550).
T 세포 활성화의 초기 상(phase) 동안에 CTLA-4와 TCR의 가교반응을 촉진하기 위하여, 돌연변이체 CD80(CD80w88a) 및 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)를 포함하는 이중특이성 융합 단백질("BsB"라고 함)을 생성하였다. BsB는 면역 시냅스에서 CTLA-4와 MHCⅡ를 동시에 결합하도록 설계되었고, 이에 따라 TCR과 MHCⅡ의 동종 페어링(paring)을 통해, 이를 TCR과 간접적으로 가교결합시킨다(Karman et al., (2012) J Biol Chem epub 2012 Feb 15). 동종이계 MLR에서, BsB는 T 세포 활성화의 억제에 효과적인 것으로 나타났다. 놀랍게도, BsB는 또한 IL-10 및 TGF-β의 생산을 유도하였고, Treg로의 활성화를 겪는 T 세포의 분화를 촉진하였다. IL-10은 자가-조절 Th1 세포들(Ohata et al., (2007) Arthritis Rheum 56:2947-2956)뿐만 아니라, 대식세포들 및 수지상 세포들(DC)의 활성화를 조절하는 능력을 통하여 광범위한 면역 억제 특성들을 가질 수 있다. TGF-β는 T 세포 분화(Kehrl et al., (1986) J Exp Med 163:1037-1050), 대식세포 활성화(Tsunawaki et al., (1988) Nature 334:260-262; Wahl et al., (1990) Ann N Y Acad Sci 593:188-196) 및 수지상 세포 성숙(Steinman et al., (2003) Annu Rev Immunol 21:685-711)의 억제제로서 작용할 수 있다. 그들의 항-염증 작용들에 더하여, IL-10 및 TGF-β는 또한 알려진 대로 Treg 작용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, IL-10은 IL-10 생산 Tr1 세포들을 유도하고(Roncarolo et al., (2006) Immunol Rev 212:28-50), Foxp3+ Treg에 작용하여 Foxp3의 발현을 유지하고, 이에 따라 그들의 억제 작용을 증식시킨다고(Murai et al., (2009) Nat Immunol 10:1178-1184) 알려져 있다. 유사하게, TGF-β는 Treg의 유도에 필요하고(Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189), Foxp3 발현을 촉진하여 그들의 억제 작용을 유지하는데 필요하다고(Marie et al., (2005) J Exp Med 201:1061-1067) 보고되었다.
조절 T 세포들( Treg )
Treg는 자기 및 비-자기 항원에 대한 면역 반응을 조절할 수 있는 T 세포들의 기능적으로 구별되는 소집단(subpopulation)이다. Treg 결핍은 강화된 면역 반응 및 자가면역 질환의 발현을 가져온다(Sakaguchi et al., (1995) J Immunol 155:1151-1164). 대규모 연구는 면역 반응들의 모든 양상을 조절하는데 있어서, 특히 자가-내성을 일으키는데 있어서 이들 특화된 T 세포들의 역할을 확립하였다. 특정 이론에 구속되지 않고, 이 발견들은 인 시튜 Treg의 생산 또는 Treg의 적응 이식(adoptive transfer)을 증가시킬 수 있는 작용제들이 자가면역 질환들을 치료하기 위하여 배치될 수 있다는 것을 가리킨다. 실제로, 생체 분리된 또는 생체 외 증식된 Treg를 사용하는 Treg 세포 기반 치료들은 제1형 당뇨병(T1D)(Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201) 및 대숙주이식편병(Anderson et al., (2004) ; Taylor et al., (2002) Blood 99:3493-3499; Zhao et al., (2008) Blood 112:2129-2138)의 동물 모델들을 치료하는데 효과적이라는 것이 알려져 있다. 말초 혈액 및 림프절로부터의 Foxp3+CD4+CD25+ Treg(종종 천연 Treg 또는 nTreg로 나타냄)의 분리 또는 증식 대신에, Treg는 TCR 활성화와 관련하여 및 TGF-β의 병존에서 미접촉 CD4+CD25- T 세포들로부터 유도될 수 있다. 이들 Treg는 종종 적응(adaptive) Treg(aTreg) 또는 유도(induced) Treg(iTreg)라고 한다. 이들은 또한 Foxp3+ 이고 알려진 대로 nTreg로서 동일하고 강력한 억제 작용을 나타낸다(Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Yamagiwa et al., (2001) J Immunol 166:7282-7289; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189). aTreg 또는 iTreg의 양자 이입은 콜라겐 유도 관절염의 동물 모델에서 자가면역 질환의 보호에 효과적이라는 것이 알려져 있다(Gonzalez-Rey et al., (2006) Arthritis Rheum 54:864-876). 그러나, 항원-특이적 Treg가 광범위한 TCR 목록을 갖는 다클론성 Treg보다 유의적으로 높은 치료 지수를 제공하고(Masteller et al., (2005) J Immunol 175:3053-3059; Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201), 광범위한 면역 억제에 대한 잠재적인 부작용이 적다는 것이 보다 분명하게 되었다. 이러한 이유로, 우리는 생체 외에서 항원 특이적 T 세포 활성화 구성에서 항원-특이적 Treg를 생산하는 것에서 BsB의 상대적 가치를 평가하고자 한다. 더욱이, 우리는 비 비만성 당뇨병(NOD) 마우스의 자가면역 당뇨병의 치료에서 그 잠재력을 시험하였다.
제1형 당뇨병
제1형 당뇨병(T1D)은 고혈당 발전의 결과로 인슐린-생산 췌장 β 세포들의 조직 특이적인 파괴에 의해 야기된 자가면역 질환이다. 비 비만성 당뇨병(NOD) 마우스들(특히 암컷 마우스들)은 췌도-특이적(islet-specific) 자가 항원(예, 인슐린 및 글루탐산 데카르복실라아제 65)에 대하여 자연 발생적으로 자가반응성 T 세포들을 생성한다. 다른 림프구들과 협력하여, 이 자가반응성 T 세포들은 3 및 4 주령 사이에 페리-인슐린염 이어서 9 주령에 침습성 인슐린염 및 12 및 35 주령 사이에 자연발생적 현성당뇨병을 발생시킨다(Anderson and Bluestone, (2005) Annu Rev Immunol 23:447-485). NOD 마우스들은 인간 대상의 질환과 많은 유사점들을 공유하는데, 예를 들어 췌장-특이적 자가 항체들의 생산 및 자가반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 활성화가 그러하다. 인간과 같이, 이들 마우스들의 자가면역에 대한 민감성은 독특한 주요 조직적합 복합체(Major histocompatibility complex, MHC), CTLA-4, 및 LAG-3에 대한 유전자들에 의해 영향을 받는다. NOD 마우스들은 주요 조직적합 복합체(MHC) 일배체형(H-2g7)을 가지는데(harbor), 이는 질병 민감성에 대해 높은 위험성을 부여하는 것으로 알려져 있다(McDevitt et al., (1996) Hormone and metabolic research 28:287-288; Wicker et al., (1995) Annu Rev Immunol 13:179-200). CTLA-4 다형성(polymorphism)이 NOD 마우스들(Ueda et al., (2003) Nature 423:506-511), 및 인간들(Qu et al., (2009) Genes and immunity 10 Suppl 1:S27-32)에서 역시 알려져 있고, NOD 환경 상의 LAG-3의 결핍은 100% 침투로 T1D 발병을 촉진한다(Bettini et al., (2011) J Immunol 187:3493-3498). BsB가 모든 타켓들과 결합하기 때문에, BsB의 치료학적 이점들은 이 T1D의 쥣과 모델에서 시험되었다.
항체들
본 발명은 청구항들에서 청구된 항체들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 여기에서 사용된 바, 용어 "단편들"은 온전한 전체 길이 항체의 부분들, 예를 들어 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 가리킨다. 항체 단편들의 예시는 상기에서 제시되었다.
여기에서 사용된 바, 용어 "단편들"은 특정된 타켓들인, CTLA-4 분자 또는 pMHC 복합체와 결합할 수 있는 단편들을 가리킨다. 이 단편들은 온전한 항체의 Fc 단편이 없을 수 있고, 순환에서 신속하게 제거될 수 있고, 온전한 항체보다 비특이성 조직 결합을 덜 가질수 있다. 이 단편들은 공지의 방법, 예를 들어, 파파인(papain)(Fab 단편들을 제조하기 위하여) 또는 펩신(F(ab)2 단편들을 제조하기 위하여)과 같은 효소를 이용한 단백질 분해 절단, 또는 재조합 기술에 의한 이러한 단편의 발현을 이용하여 온전한 항체들로부터 제조될 수 있다.
항체들 및 단편들은 CTLA-4 분자 또는 pMHC 복합체와 결합하는 단일쇄 항체 단편들(scFv)을 또한 포함한다. scFv는 항체 경쇄 가변 영역(VL)과 작동적으로 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은, 함께 또는 개별적으로, CTLA-4 분자 또는 pMHC 복합체와 결합하는 결합 자리를 형성한다. scFv는 아미노 말단부에 VH 영역과 카복시 말단부에 VL 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로는, scFv는 아미노 말단부에 VL 영역과 카복시 말단부에 VH 영역을 포함할 수 있다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인들인 VL 및 VH이 별개의 유전자들에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가의 분자들(단일 쇄 Fv(scFv)로 알려짐)을 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. scFv는 임의로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
항체들 및 단편들은 또한 문헌(Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546)에 설명된 것처럼, VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb) 단편들을 포함한다.
항체들 및 단편들은 또한 중쇄 항체들(HCAb)을 포함한다. 이 항체들은, 이 작용성 항체들은 중쇄들만의 다이머(dimer)들이라는 점에서, 중쇄 가변 영역만을 사용하여, 명확하게 항원 결합 영역들을 형성할 수 있다("중쇄 항체들" 또는 "HCAb"라고 함). 따라서, 항체들 및 단편들은 CTLA-4 또는 pMHC 타겟들과 특이적으로 결합하는 중쇄 항체들(HCAb)일 수 있다.
항체들 및 단편들은 또한 SMIPs인 항체들 또는 CTLA-4 또는 pMHC 타겟들에 특이적인 결합 도메인 면역 글로불린 융합 단백질들을 포함한다. 이 구조체들은 항체 효과기 작용들을 수행하는 데 필요한 면역 글로불린 도메인들과 융합된 항원 결합 도메인들을 포함하는 단일 쇄 폴리펩타이드들이다(WO 2005/017148 참조).
항체들 및 단편들은 또한 이중체(diabody)들을 포함한다. 이들은 VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되는 이가 항체들이지만, 너무 짧아서 동일 쇄 상에서 2개의 도메인들 사이에서 짝을 이룰 수 없는 링커를 사용한다. 이는 도메인들이 또다른 쇄의 상보적인 도메인들과 짝을 이루게 하고, 이에 따라 2개의 항원-결합 자리들을 형성한다(예를 들어 WO 93/11161 참조). 이중체들은 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 항체 단편은 목적으로 하는 CTLA-4 또는 pMHC 타겟들 이외의 임의의 타겟과는 상호작용하지 않는다.
항체들 또는 그의 단편들은 그 자체가 이중특이성일 수 있다. 예를 들면, 이중특이성 항체들은 단일 항체들(또는 항체 단편들)과 유사할 수 있지만, 2개의 상이한 항원 결합 자리들(가변 영역들)을 갖는다. 이중특이성 항체들은 다양한 방법들(예를 들어 화학적 기술들, "폴리도마(polydoma)" 기술들 또는 재조합 DNA 기술들)로 제조될 수 있다. 이중특이성 항체들은 적어도 2개의 상이한 에피토프(epitope)들, 예를 들어 CTLA-4 또는 pMHC 타겟들 각각에 대한 하나의 에피토프에 대하여 결합 특이성을 가질 수 있다.
VH 및 VL 영역들의 상보적인 쌍들을 포함하는 이중특이성 항체들은 공지되어 있다. 이 이중특이성 항체들은 VH 및 VL 의 두개의 쌍들을 포함하고, 각 VH VL 쌍은 단일 항원 또는 에피토프와 결합한다. 이러한 이중특이성 항체들은 하이브리드 하이브리도마들(Milstein, C. and Cuello, A.C., (1983) Nature 305 (5934): 537-40), 미니바디들(Hu et al., (1996) Cancer Res . 56:.3055-3061), 이중체들(Holliger et al., (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:6444-6448; WO 94/13804), 킬레이팅 재조합 항체들(CRAb)(Neri et al., (1995) J. Mol . Biol . 246,367-373), biscFv(예, Atwell et al., (1996) Mol . lmmunol . 33:1301-1312), "knobs in holes" 안정화된 항체들(stabilised antibodies)(Carter et al., (1997) Protein Sci . 6:781-788)을 포함한다. 각각의 경우에, 각 항체 종들은 2개의 항원-결합 부위들을 포함하고, 각각은 VH 및 VL 도메인들의 상보적인 쌍으로 만들어진다. 따라서, 각 항체는 동시에 2개의 상이한 항원들 또는 에피토프들과 결합할 수 있고, 항원 및 에피토프 각각과의 결합은 VH 및 그의 상보적인 VL 도메인에 의해 매개된다.
천연 자가항체들은 다중반응성(polyreactive)(Casali and Notkins (1989) Ann . Rev. Immunol. 7: 515-531)이고, 구조적으로 관련되지 않은 적어도 2개(대개 그 이상)의 상이한 항원들 및 에피토프들과 반응한다고 기술되어 있다. 단일클론 항체 상의 파아지 디스플레이 기술을 이용하는 랜덤 펩타이드 목록의 선택들은 항원 결합 자리와 맞는 펩타이드 서열들의 범위를 동정할 것이라는 것이 이미 알려져 있다. 서열 중 일부는 고도로 관련되고, 컨센서스 서열과 맞지만, 반면에 다른 것들은 매우 상이하고 미니토프(mimptoe)들이라고 칭해진다(Lane and Stephen (1993) Current Opinion in Immunology 5:268-271). 그러므로, 연관되고 상보적인 VH 및 VL 도메인들을 포함하는, 항체의 결합 자리는 광범위한 공지 항원들 유래의 다수의 상이한 항원들과 결합할 가능성이 있다는 것이 분명하다.
WO 03/002609(Domantis)는, VHVL 쌍 각각이 이중특이성을 갖는, 즉, 동일하거나 상이한 항원들 상에서 2개의 에피토프들과 결합할 수 있는, 이중특이성 항체들의 제조를 기술한다. 구조는 개방되거나 또는 폐쇄될 수 있다; 개방 구조에서, 2개의 에피토프들은 동시에 결합할 수 있지만, 폐쇄 구조에서는, 제1 에피토프와의 결합이 제2 에피토프와의 결합을 방해하거나 막는다.
다중 결합 특이성들을 갖는 비-면역 글로불린 단백질들은 사실상 공지되어 있다; 예를 들어, 다수의 전사 인자들은 DNA 및 다른 단백질 분자들과 결합한다. 그러나 선행 문헌에서 결합 펩타이드들을 선택하는 방법들은 이중 또는 다중 특이성이 아니라, 단일 특이성을 갖는 펩타이드만을 선택한다.
상이한 연구 팀들이 시스테인 잔기들을 갖는 폴리펩타이드들을 합성 분자 구조와 이미 묶었다(Kemp, D. S. and McNamara, P. E., (1985) J. Org . Chem . Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem . 6(5):821-4). 몰런(Meleon)과 공동 연구자들은 단백질 표면들의 구조적 흉내(mimicry)를 위하여 합성 스캐폴드 상의 다중 펩타이드 루프의 신속하고 정량적인 사이클리제이션(cyclisation)을 위하여 트리스(브로모메틸)벤젠 및 관련 분자들을 사용하였다(Timmerman, P. et al., (2005) ibid). WO 2004/077062 및 WO 2006/078161은 후보 약물 화합물들의 생산 방법들을 개시하는데, 상기 화합물들은 예를 들어 트리스(브로모메틸)벤젠과 같은 분자 스캐폴드에 시스테인 함유 폴리펩타이드들을 결합시켜서 생성된다. WO 2009/098450은 디스플레이 기술을 이용한 상기 분자들의 선택을 개시한다. WO 2010/089117은 이중특이성 실시형태들을 추가로 개시한다.
리간드, 예를 들어 항체 또는 그의 단편은 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들어 반감기를 증가시키기 위한 다당류 고분자들을 포함하는, 분자들(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 고분자들)을 첨가하여 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 Fc 영역은 본 발명에 따른 이중특이성 링커에 첨가되어, 순환 반감기(circulating half-life)를 증가시킬 수 있다.
항체 생산
항체 생산은 형질전환 유기체들, 예를 들어 염소(Pollock et al. (1999) J. lmmunol. Methods 231:147- 157 참조), 닭(Morrow, KJJ (2000) Genet . Eng . News 20:1-55 참조), 마우스(Pollock et al. ibid 참조)또는 식물(Doran PM (2000) Curr. Opinion Biotechnol . 11:199-204; Ma, JK-C (1998) Nat . Med . 4:601-606; Baez, J. et al. (2000) BioPharm .13:50-54; Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol . Biol. 42:583-590 참조)에서를 포함하는, 공지된 임의의 기술로 수행할 수 있다. 항체들은 또한 화학적 합성에 의하여 생산될 수 있다; 그러나 숙주 세포들에서 항체들을 인코딩하는 유전자들을 발현시키는 것이 바람직하다.
항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서의 추가 증식이나 발현을 위하여, 분리하여 복제가능한 구조체 또는 벡터 예를 들어 플라스미드에 삽입된다. 본 발명에 따른 인간화 면역 글로불린의 발현에 적절한 구조체들 또는 벡터들(예, 발현 벡터들)은 본 기술분야에서 입수가능하다. 다양한 벡터들을 구할 수 있으며, 숙주 세포에서 단일 복제(single copy) 또는 다중 복제(multiple copy)를 유지하거나 숙주세포의 염색체(들)에 통합되는 벡터들을 포함한다. 구조체들 또는 벡터들은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 인간화 면역 글로불린을 발현하는 세포들은 생산되어 배양에서 유지될 수 있다. 단일 벡터 또는 다중 벡터들은 인간화 면역 글로불린을 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 종래 과정들(예, 올리고뉴클레오타이드 프로브들)을 이용하여 쉽게 분리되고 서열화된다. 사용될 수 있는 벡터들은 플라스미드, 바이러스, 파아지, 트랜스포존들, 플라스미드들이 일반적인 실시형태인 미니염색체들을 포함한다. 일반적으로 이러한 벡터들은 추가로 단일 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자들, 인핸서 요소, 프로모터 및 발현을 용이하게 하기 위하여 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결된 전사 종결 서열을 포함한다. 경쇄들 및 중쇄들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 개별 벡터들에 삽입되어 동일한 숙주세포에 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있고(예, 형질전환, 형질감염, 전기영동 또는 형질도입), 또는 바람직하다면 이러한 도입 이전에 중쇄 및 경쇄 모두가 동일한 벡터에 삽입될 수 있다.
프로모터는 적절한 숙주 세포에서의 발현을 위하여 제공될 수 있다. 프로모터들은 구성요소이거나 유도될 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 인코딩된 폴리펩타이드의 발현을 지시하도록(direct), 프로모터가 인간화 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 쇄를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주들을 위하여 다양하고 적절한 프로모터들이 이용가능하다. 원핵생물 프로모터들은 lac, tac, E. coil의 T3. T7 프로모터들; 3-포스포글리세라이트 키나아제(3-phosphoglycerate kinase) 또는 기타 글리콜 효소(glycolytic enzyme)들, 예컨대, 에놀라아제(enolase), 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나아제(glyceralderhyde 3-phosphate dehydrogenase), 헥소키아나제(hexokinase), 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase), 포스포프럭토키나아제(phosphofructokinase), 글루코즈 6 포스페이트 아이소머라아제(glucose 6 phosphate isomerase), 3-포스포글리세레이트 뮤타아제(3-phosphoglycerate mutase) 및 글루코키나아제(glucokinase)를 포함한다. 진핵생물 프로모터들은 유도가능한 이스트 프로모터들, 예를 들어 알코올 데하이드로게나아제 2(dehydrogenase 2), 이소사이토크롬 C(isocytochrome C), 산 포스포타아제(acid phosphatase), 메탈로티오네인(metallothionein) 및 질소 대사 및 말토즈/갈락토즈 이용에 관련있는 효소들(enzymes responsible for nitrogen metabolism or maltose/galactose utilization); 바이러스 프로모터들, 예를 들어 폴리오마(polyoma), 계두(fowlpox) 및 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 2), 소유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(특히, 즉각적인 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 악틴(actin), 라우스육종 바이러스(rous sarcoma virus, RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 시미안 바이러스 40(Simian virus 40) 및 비-바이러스성 프로모터들, 예를 들어 EF-1 알파(Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322)를 포함하는, RNA 폴리머라아제 Ⅱ 프로모터들을 포함한다. 당업자들은 본 발명의 인간화 항체 또는 그 일부분을 발현하기 위한 적절한 프로모터를 선택할 것이다.
적절한 경우, 예를 들어 고차원 진핵생물들의 세포들에서의 발현을 위하여, 추가 인핸서 요소들이 상기에서 기술된 프로모터들에 위치하는 것으로 발견된 것들과 함께 또는 대신에 포함될 수 있다. 적절한 포유동물 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아단백질, 메탈로티오네인 및 인슐린 유래 인핸서 요소들을 포함한다. 대안적으로는, 원핵 세포 바이러스 유래 인핸서 요소, 예를 들어 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서(cytomegalovirus early promoter enhancer), 폴리오마 인핸서(polyoma enhancer), 바큐로바이러스 인핸서(baculoviral enhancer) 또는 쥣과 IgG2a 로커스(WO 04/009823 참조)를 사용할 수 있다. 이러한 인핸서들은 일반적으로 프로모터에 대한 업스트림 자리에서 벡터상에 위치하지만, 이들은 또한 임의의 위치, 예컨대 비번역 영역 또는 폴리아데닐화 신호의 다운스트림 내에 위치할 수 있다. 인핸서의 선택 및 위치 선정은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다.
또한, 벡터들(예, 발현 벡터들)은 일반적으로 벡터를 수송하는 숙주 세포들을 선택하기 위하여 선택가능한 마커를 포함하고, 복제가능 벡터의 경우에는, 복제 근원을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 산물을 인코딩하는 유전자들은 통상 선택가능한 마커들이고 원핵 생물에서 사용될 수 있다(예, β-락타마아제 유전자(암피실린 내성), Tet 유전자(테트라사이클린 내성) 및 진핵 세포들(예, 네오마이신(G418 또는 게네티신), gpt(마이코페놀산), 암피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자들). 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자들은 다양한 숙주들에서 메토트렉세이트로 선택할 수 있다. 숙주의 영양요구성(auxotrophic) 마커들의 유전자 산물을 인코딩하는 유전자들(예, LEU2 , URA3 , HIS3 )은 종종 이스트에서 선택가능한 마커들로 사용된다. 바이러스(예, 바큐로바이러스) 또는 파아지 벡터들 및 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 벡터들, 예를 들어 레트로바이러스 벡터들의 사용이 또한 고려된다.
진핵생물계에서, 폴리아데닐화 및 종결 신호들은 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결된다. 이러한 신호들은 일반적으로 개방 리딩 프레임의 3'에 위치한다. 포유동물계에서, 폴리아데닐화/종결 신호들의 비 제한적인 예들은 성장 호르몬들, 신장 인자-1 알파 및 바이러스(예, SV40) 유전자들 또는 레트로바이러스 긴 말단 반복들에서 유래된 것들을 포함한다. 이스트계에서, 폴리아데닐화/종결 신호의 비 제한적인 예들은 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 및 알코올 데하이드로게나아제 1(ADH) 유전자들에서 유래된 것들을 포함한다. 원핵생물계에서, 폴리아데닐화 신호들은 일반적으로 요구되지 않고, 대신에 더 짧고 더 한정된 종결 서열을 채택하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열들의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다. 상기에 더하여, 수율을 상승시키기 위하여 채택될 수 있는 다른 특징들은 염색질 리모델링 요소들, 인트론들 및 숙주 세포 특이적 코돈 변형을 포함한다. 본 발명의 항체의 코돈 사용은 전사 및/또는 산물 수율을 증가시키기 위해 숙주 세포의 코돈 편향(bias)을 수용하도록 변형될 수 있다(예, Hoekema, A. et al. (1987) Mol cell Biol. 7(8):2914-24). 코돈들의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 인간화 면역 글로불린들, 또는 그의 경쇄들 또는 중쇄들을 인코딩하는 분리된 핵산 분자들과 관련된다. 본 발명은 또한 면역 글로불린들의 항원 결합 부분 및 그 쇄들을 인코딩하는 분리된 핵산 분자들과 관련된다.
본 발명에 따른 항체들은 예를 들어, 적절한 숙주 세포에서 항체를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산들의 발현에 의하여 생산될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 적절한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 여기에서 기술된 발현 구조체들(예, 하나 이상의 벡터들, 예, 포유동물 세포 발현 벡터)은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 최종 세포는 구조체(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적절한 조건하에서(예컨대, 배양물에서, 동물에서, 식물에서) 유지될 수 있다. 적절한 숙주 세포들은 E. coli와 같은 박테리아 세포들을 포함하는 원핵생물(예, 스트레인 DH5aTM(Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 세포들(Crucell, Leiden, NL), B. subtilis 및/또는 다른 적절한 박테리아; 진핵생물 세포들, 예를 들어 균류 또는 이스트 세포들(예, Pichia pastoris , Aspergillus sp ., Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Neurospora crassa ), 또는 다른 저차원 진핵생물 세포들, 및 고차원 진핵생물들의 세포들 예컨대, 곤충유래 세포들(예, Drosophila Schnieder S2 세포들, Sf9 곤충 세포들(WO 94/126087(O?onnor), TN5BI-4(HIGH FIVETM), 곤충 세포들(Invitrogen), 포유류(예, COS 세포들, 예를 들어 COS-I(ATCC Accession No. CRL-1650) 및 COS-7(ATCC Accession No. CRL-1651), CHO(예, ATCC Accession No. CRL-9096), CHO DG44(Urlaub, G. and Chasin, LA., (1980) Proc . Natl. Acac . Sci . USA , 77(7):4216-4220), 293(ATCC Accession No. CRL- 1573), HeLa(ATCC Accession No. CCL-2), CVI(ATCC Accession No. CCL-70), WOP(Dailey, L., et al ., (1985) J. Virol ., 54:739-749), 3T3, 293T(Pear, W. S., et al ., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 90:8392-8396), NSO 세포들, SP2/0 세포들, HuT 78 세포들 등, 또는 식물들(예, 담배, 렘나(개구리밥), 및 조류)(예를 들어, Ausubel, F.M. et al ., eds. Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993) 참조)일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 숙주 세포는 다세포 유기체(예, 식물 또는 동물)의 일부가 아니고, 예컨대 분리된 숙주 세포 또는 세포 배양물의 일부이다.
숙주 세포들은 스피너 플라스크들, 세이크 플라스크들, 롤러 병들, 웨이브생물반응기(예, wavebiotech.com의 System 1000) 또는 중공섬유 시스템들에서 배양될 수 있지만, 대량 생산을 위하여 교반 탱크 생물반응기들 또는 백(bag) 생물반응기들(예, 웨이브바이오텍사의 소머레스트, 뉴져지, 미국)이 특히 현탁 배양용으로 사용되는 것이 바람직하다. 일반적으로 교반 탱크 생물반응기들은 예컨대 스퍼저들(spargers), 배플들(baffles) 또는 로우 시어 임펠러들(low shear impellers)을 이용한 폭기를 채택한다. 버블 컬럼들 및 에어리프트 생물반응기들에서, 공기 또는 산소 버블을 이용한 직접 폭기가 사용될 수 있다. 숙주 세포들이 혈청이 없는 배양 배지에서 배양되는 경우, 배지에 세포 보호제, 예를 들어 플루로닉(pluronic) F-68을 보충하여 폭기 공정의 결과인 세포 손상을 방지하는데 도움이 될 수 있다. 숙주 세포의 특성들에 따라서, 마이크로캐리어들이 고정 의존성 세포주(anchorage dependent cell line)들을 위한 성장 기판들로서 사용될 수 있거나, 세포들이 현탁 배양으로 조정될 수 있다. 숙주 세포들, 특히 척추동물 숙주 세포들의 배양은 다양한 작동 모드들 예를 들어 배치(batch), 페드-배치(fed-batch), 반복 배치 공정(Drapeau et al (1994) Cytotechnology 15: 103-109 참조), 증식 배치 공정 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합 형질전환 포유동물 숙주 세포들은 혈청 함유 배지 예를 들어 소태아 혈청(fetal calf serum, FCS)을 함유하는 배지에서 배양될 수 있지만, 이러한 숙주 세포들은 문헌[Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 기재된 것과 같은 혈청이 없는 배지, 또는 상업적으로 이용가능한 배지 예를 들어, ProCHO-CDM 또는 UltraCHOTM(Cambrex NJ, USA)에서 배양되고, 필요한 경우, 에너지원 예를 들어, 글루코즈 및 합성 성장 인자들 예를 들어 재조합 인슐린으로 보충되는 것이 바람직하다. 숙주 세포들을 혈청 없이 배양하는 것은 이 세포들이 혈청이 없는 환경에서 성장하도록 적응하는 것을 요구할 수 있다. 한 가지 적응을 위한 접근은 이러한 숙주 세포들을 혈청 함유 배지에서 배양하고 반복적으로 혈청이 없는 배지로 배양 배지의 80%를 교환하여 숙주 세포들이 혈청이 없는 조건에 적응하도록 학습시키는 것이다(예, Scharfenberg K. et al (1995) in Animal cell Technology Developments Towards the 21st Century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers 참조).
본 발명에 따른 항체들은 배지로 분비될 수 있고 다양한 기술들을 사용하여 회수하고 정제하여 의도된 용도에 적절한 순도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간 환자들을 치료하기 위한 본 발명의 치료 항체들의 사용은, 치료 항체들을 포함하는 배양 배지들과 비교하여, 일반적으로 환원 SDS-PAGE로 측정하여 적어도 95%의 순도, 보다 일반적으로는 98% 또는 99%의 순도를 요구한다. 제1 경우에, 배양 배지들의 세포 잔해는 일반적으로 원심분리를 이용하여 제거되고, 이어서 예를 들어 미세여과, 한외여과 및/또는 심층여과를 사용하여 상청액의 정제 단계가 실시된다. 대안적으로는, 항체는 사전 원심분리 없이 미세여과, 한외여과 또는 심층여과만으로 채취될 수 있다. 다양한 다른 기술들, 예를 들어 투석 및 겔 전기영동법 및 크로마토그래피 기술들, 예를 들어 하이드록시아파타이트(HA), 친화성 크로마토그래피(임의로 친화성 태깅 시스템 예를 들어 폴리히스티딘을 포함함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)(미국특허 제5,429,746호 참조)을 이용할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체들은 다양한 정제 단계들 후에, 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 포집되고 이어서 추가 크로마토그래피 단계들 예를 들어, 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 암모늄 설페이트 침전이 이루어진다. 일반적으로 다양한 바이러스 제거 단계들이 또한 사용된다(예, 예컨대 DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이 다양한 단계들 후에, 적어도 10 mg/ml 이상, 예컨대 100 mg/ml 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 정제된 제제(preparation)가 제공되고 따라서 본 발명의 실시형태를 형성한다. 100 mg/ml 이상의 농도는 초원심분리에 의해 생성된다. 이러한 제제들은 실질적으로 본 발명의 항체들의 응집된 형태들이 없다.
박테리아계는 항체 단편의 발현에 특히 적합하다. 이러한 단편들은 세포간(intracellularly)에 또는 주변세포질 내에 위치한다. 불용성 주변세포질 단백질들은 추출될 수 있고 당업자에게 공지된 방법들에 따라서 다시 접혀서 활성 단백질들을 형성할 수 있다(Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol . 72:13-20; Cupit, PM et al. (1999) Lett . Appl . Microbiol . 29:273-277 참조).
본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 예컨대 벡터(예, 발현 벡터)를 포함하는 세포에 관련된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간화 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산(즉, 하나 이상의 핵산들) 또는 이러한 핵산(들)을 포함하는 구조체(즉, 하나 이상의 구조체들, 예컨대 하나 이상의 벡터들)은 선택된 숙주 세포에 적절한 방법(예, 형질변환, 형질감염, 전기 천공, 감염)으로, 하나 이상의 발현 제어 요소들(예, 벡터에서, 세포에서 가공에 의해 형성된 구조체, 숙주 세포 게놈에 통합됨)과 작동가능하게 결합하거나, 발현제어 요소들이 되거나, 또는 발현 제어 요소들인 핵산(들)과 함께 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포들은 발현에 적절한 조건들 하에서 유지될 수 있고(예, 유도물, 적절한 염으로 보충된 적절한 배지들, 성장 인자들, 항생제, 영양 보충제들 등의 존재 하에서), 이어서 인코딩된 폴리펩타이드(들)이 생산된다. 원한다면, 인코딩된 인간화 항체는 예를 들어, 숙주세포들, 배양 배지, 또는 우유로부터 분리될 수 있다. 이 공정은 형질전환 동물 또는 식물(예, 담배)의 숙주세포(예, 유선 세포)에서의 발현을 포함한다(예, WO 92/03918 참조).
CD80 리간드들
CD80 리간드들의 설계 및 구조는 CD28보다 CTLA-4에 대한 리간드의 특이성을 극대화하기 위하여 고려된다. CD80의 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 문헌[Wu et al., 1997]에서 예가 언급된다. CD80은 세포외 Ig-V 가변-유사 도메인, 및 세포내 IgC 불변-유사 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, CD80의 세포외 도메인은 리간드로서 사용된다. 예를 들어 서열번호 15, 특히 잔기 1-241을 참조한다.
돌연변이들은 인간 CD80에서 만들어져서 결합 친화도를 개선하고, CD28 보다 CTLA-4에 대한 선택도를 개선한다(예를 들어, Wu et al., 1997 참조).
WA84A 이외의 돌연변이체들이 만들어질 수 있고, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A, E196A을 포함한다(Peach et al., JBC 1995. 270(6): 21181-21187 참조). CTLA-4과 CD28 양자에 대한 돌연변이체들의 결합 친화도 분석은 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)와 이어지는 돌연변이 폴리펩타이드들의 발현, 및 CTLA-4과 CD28 바이오코어 칩들을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의한 Kd 측정에 의해 영향을 받을 수 있다(예를 들어, Guo et al., (1995) J. Exp . Med . 181:1345-55 참조).
유리한 결합 및 선택도 프로파일을 갖는 돌연변이체들이 선택될 수 있고, 세포 기반 분석에서 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 유동 세포 분석법은 야생형 또는 세포들에 형질감염된 돌연변이체 CD80의 효과를 분석하는데 사용될 수 있다.
LAG -3 리간드들
LAG-3는 선행기술에 기술되어 있고, MHCⅡ 단백질에 대한 결합 자리를 특징으로 한다(Huard et al., (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94(11):5744-9 참조). LAG-3는 4개의 세포외 Ig-유사 도메인들을 갖고, 돌연변이들은 MHCⅡ에 대한 결합을 최적화하기 위하여 이 도메인들에 도입될 수 있다.
돌연변이들의 유효성은 CD80 리간드들에 대하여 상기에서 설명한 바와 같이 분석될 수 있다.
일 양상에서, LAG-3의 4개의 Ig-유사 도메인들 중 도메인 1 및 도메인 2(D1 및 D2)만이 본 발명에 따른 리간드에 사용된다. 이 도메인들은 MHCⅡ 단백질과의 상호작용과 관련이 있는 것으로 믿어진다.
이중특이성 리간드 구조체들
이중특이성 리간드의 구조는 일반식 "리간드-링커-리간드"를 따른다. 이중특이성 항체들은 본 기술분야에서 공지되어 있고, 상기에서 기술된다.
이중특이성 리간드들의 구조는 바람직하게는 원하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 적절한 유전자의 구조 및 발현을 포함한다. 공유결합, 이온결합 또는 소수성 결합을 허용하는 조건 하에서 2개의 폴리펩타이들을 혼합하여 구성하는 다른 방법들. 바람직한 실시형태에서, 이는 폴리펩타이드들의 공유결합을 포함한다. 3개의 구성요소들을 포함하는 이중특이성 분자는, 예를 들어 CTLA-4 리간드, 링커 및 MHC 리간드로 구성되고, 3개 중 2개는 서로 결합하여, 조합될 수 있고, 세 번째 폴리펩타이드는 나중에 융합 산물에 추가되고, 결합되어 이 3개의 폴리펩타이드들 모두를 포함하는 융합 산물을 형성한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드들은, 화학적 합성, 생물학적 샘플로부터의 분리 및 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 발현을 포함하는, 임의의 원하는 기술로 생산될 수 있다. 핵산들은 순서대로, 합성되거나 생물학적 근원들로부터 분리될 수 있고, 원한다면, 위치 지정 돌연변이로 변형될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이성 리간드를 인코딩하는 벡터들, 그의 단편에 관한 것이다. 벡터는 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 숙주에서의 증식을 위하여 선택할 수 있는 마커를 함유하는 벡터의 일부일 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물에, 예를 들어 칼슘 포스페이트 침전물에, 또는 하전된 지질을 갖는 복합체에 도입된다.
벡터가 바이러스라면, 적절한 포장 세포주를 이용하여 시험관 내에서 포장될 수 있고 이어서 숙주 세포들에 형질도입된다.
핵산 삽입은 적절한 프로모터, 예를 들어 파아지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, trp, phoA 및 tac 프로모터들, SV40 초기 및 후기 프로모터들 및 레트로바이러스 LTRs의 프로모터들에 작용적으로 연결된다. 다른 적절한 프로모터들이 당업자들에게 알려져 있다. 발현 구조체는 추가로 전사 개시, 종결을 위한 자리들, 및, 전사된 영역에, 번역을 위한 리보좀 결합 자리를 함유한다. 구조체에 의해 발현되는 전사체의 코딩부는 바람직하게는 시작시의 번역 개시 코돈 및 번역되는 폴리펩타이드의 말단부에 적절하게 위치하는 종결 코돈(UAA, UGA, 또는 UAG)에 번역 개시 코돈을 포함한다.
지시된 것처럼, 발현 벡터들은 바람직하게는 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함한다. 이러한 마커들은 디하이드로폴레이트 환원효소인 G418 또는 진핵세포에 대하여 내성인 네오마이신을 포함한다.
E. coil 및 다른 박테리아를 배양하기 위한, 배양물 및 테트라사이클린, 카나마이신 또는 암피실린 저항 유전자들. 적절한 숙주들의 대표적인 예들은, 제한되지 않지만, 박테리아 세포, 예를 들어, E. coil, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무륨 세포들(Salmonella typhimurium cells); 균류 세포들, 예를 들어 이스트 세포들(예, 사카로마이세스 세레비시아 또는 피치아 파스토리스); 곤충 세포들, 예를 들어 초파리 S2 및 스포도프테라 Sf9 세포들; 동물 세포들, 예를 들어 CHO. COS, HEK293, 및 바우스 흑색종 세포들; 식물 세포들을 포함한다.
상기에서 기술한 숙주 세포들을 위한 적절한 배양 배지들 및 조건들은 본 기술분야에서 공지되어 있고 상업적으로 이용가능한다.
박테리아에서 바람직하게 사용되는 벡터들 중에는, 퀴아젠사(QIAGEN, Inc)에서 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진 클로닝 시스템사(Stratagene Cloning Systems, Inc.)에서 입수가능한 pBluescript 벡터들, Phagescript 벡터들, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아 바이오텍사(Pharmacia Biotech, Inc.)에서 입수가능한 ptrc99a, pKK2233, pKK233-3, pDR540, pRIT5을 포함한다. 바람직한 진핵생물 벡터들 중에는 스트라타진에서 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXTI 및 pSG; 및 파마시아사에서 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 있다. 포유동물 세포 발현에 바람직하게 사용되는 벡터들 중에는 pSG5 벡터, pCMV SPORT6, pcDNA, pCEP4, pREP4, pCI, pSI 및 pBICEP-CMV를 포함한다. 이스트계에서 사용되는 바람직한 발현 벡터들은, 제한되지 않지만, pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K, 및 PA0815(이들 모두는 인비트로겐, 갈스버드, CA에서 입수가능함)를 포함한다.
숙주 세포에 구조체를 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해 효과적일 수 있다. DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온 지질-매개 형질감염, 전기 천공, 형질도입, 감염, 또는 기타 방법들. 이러한 방법들은 상기에서 참조된 많은 표준 실험실 매뉴얼들, 예를 들어 Sambrook 등에 기술된다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지의 방법들에 의하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"가 정제를 위해 사용된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드들은 또한 체액들, 조직들 및 세포들, 특히 대상의 종양 조직 또는 종양 의심 조직에서 유래된 세포들을 포함하는, 생물학적 근원으로부터 회수될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드들은 본 기술분야에서 공지된 기술들을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(예를 들어, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y. , and Hunkapiller et al., (1984) Nature, 310:105-111 참조). 예를 들어, 본 발명에 따른 이중특이성 리간드의 전부 또는 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이성 리간드들은 여기에 첨부된 서열번호들에 상세하게 기술된다. 서열번호 1 및 2는 마우스 대리(surrogate) DNA 및 이중특이성 리간드들의 단백질 서열들로서, CTLA-4 리간드 CD80w88는 MHC 리간드 LAG-3와 짝을 이루고, IGg2a Fc 영역 및 Gly-9 (G9) 서열에 의해 분리된다. 말단 His tag (H6) 서열은 C-말단에 제공된다. 서열번호 3 및 4는 IGg2a Fc 영역이 LAG-3 폴리펩타이드의 C-말단에 위치하는 것을 제외하고는 서열번호 1 및 2와 동일한 구조의 마우스 대리 DNA 및 단백질 서열들이고, CD80 및 LAG-3 펩타이드들은 G9에 의해서만 분리된다. 리간드들과 그의 C-말단 사이에 Fc 영역을 갖는, 2개의 배열들은 각각 유전자 1 구조체 및 유전자 2 구조체를 가리킨다.
서열번호 5 및 6은 인간 DNA 및 단백질 서열들로서 그 안에 야생형 서열이 보존되어 있다. 돌연변이들은 CD80 또는 LAG-3에 대해 이루어지지 않는다.
서열번호 7 및 8에서, W84A 돌연변이가 인간 CD80(마우스의 W88A의 등가물)에 대해 이루어졌고 R75E 돌연변이는 LAG-3에서 이루어졌다. 나머지 서열들(서열번호 7 내지 14)은 CD80 및 LAG-3 서열들 중의 다른 돌연변이들을 기술한다.
치료 적용들
T 세포 활성을 억제하는 것은 면역 억제가 보장되고/보장되거나 자가면역 질환이 발생하는 많은 상황들에서 바람직하다. 따라서, CTLA-4/MHC 상호작용을 목표로 하는 것이 부적절한 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들어 염증, 자가면역을 포함하는 질환들, 및 이러한 메커니즘을 포함하는 질병들의 치료에서 지시된다. 일 실시형태에서, 이러한 질병 또는 장애는 자가면역 및/또는 염증성 질환이다. 이러한 자가면역 및/또는 염증성 질환의 예시는 상기에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, 이러한 질환 또는 장애는 제1 형 당뇨병(T1D)이다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 리간드들은 대상의 면역반응을 억제하여 이식에 도움을 주기 위해 사용된다. 이러한 사용은 대숙주이식편병(graft-versus-host disease)을 완화시킨다. 대숙주이식편병의 치료를 위한 설명은 문헌[Svennilson, (2005) Bone Marrow Transplantation 35:S65?67] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌들을 참조한다. 유리하게, 본 발명의 항체들은 다른 이용가능한 치료법들과 조합하여 사용될 수 있다.
자가면역 질환들의 치료와 관련하여, 조합 치료는 본 발명의 리간드와 약물(medicament)을 함께 투여하는 것을 포함할 수 있고, 리간드와 함께 투여되는 약물은 이러한 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 유효량을 포함한다. 상기 자가면역 질환이 제1 형 당뇨병인 경우, 조합 치료는 췌장 베타-세포들의 성장을 촉진하거나 베타-세포 이식을 증진하는 하나 이상의 작용제(agent), 예를 들어 베타 세포 성장 또는 생존 인자들 또는 면역조절 항체들을 포함할 수 있다. 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 경우, 상기 조합 치료는 하나 이상의 메토트렉세이트, 항-TNF-α 항체, TNF-α 수용체-Ig 융합 단백질, 항-IL-6, 또는 항-IL17, 또는 항-IL-15, 또는 항-IL-21 항체, 비스테로이드성 항-염증 항물(NSAID), 또는 질병 변형 항-류마티스 약물(disease modifying anti rheumatic drug, DMARD)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 작용제는 생물학적 작용제, 예를 들어, 항-TNF제(예, 엔브렐(Enbrel)® 인플릭시맵(infliximab)(레미사이드(Remicade)® 및 아달리무맵(adalimumab)(휴미라(Humira)®) 또는 리툭시맵(rituximab)(리툭산(Rituxan)®)일 수 있다. 상기 자가면역 질환이 조혈이식거부(hematopoietic transplant rejection)인 경우, 조혈 성장 인자(들)(예를 들어, 에리스로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, 트롬보포이에틴 등) 또는 항미생물제(들)(예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항균제)가 투여될 수 있다. 상기 자가면역 질환이 건선인 경우, 추가 작용제는 하나 이상의 타르(tar) 및 그 유도체들, 광선 요법, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린 A, 비타민 D 유사체, 메토트렉세이트, p38 미토겐-활성 단백질 키나아제(MAPK) 억제제들, 및 항-TNF-α제 및 리툭산®과 같은 생물학적 작용제들일 수 있다. 상기 자가면역 질환이 염증성 장 질환(IBD), 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염인 경우, 추가 작용제는 하나 이상의 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제들, 항생제들, 또는 레미사이드® 또는 휴미라®과 같은 생물학적 작용제일 수 있다.
조합 치료는 본 명세서의 목적을 위하여 당업자가 필요하거나 편리하다고 생각하는 임의의 방법으로 수행될 수 있고, 조합 치료에 사용되는 화합물들의 순서, 양, 반복 또는 상대적인 양에 대한 제한은 없다. 따라서, 치료에 사용되는 본 발명에 따른 항체들은 약학적 조성물들로 제형화될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩타이드들을 포함하는 약학적 조성물들에 관한 것이다.
약학적 조성물들
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 리간드, 또는 본 발명의 이전 양상들에서 정의된 분석방법으로 동정될 수 있는 리간드 또는 리간드들을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 리간드들은 여기에서 기술된 바, 면역 글로불린들, 펩타이드들, 핵산들 또는 소분자들일 수 있다. 이들은 다음의 논의에서 "화합물들"이라 한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 활성 성분으로서 T 세포 활성을 조절할 수 있는 화합물 또는 화합물들을 포함하는 대상 조성물이다. 일반적으로, 화합물은 임의의 약학적으로 허용가능한 염의 형태이고, 또는 예컨대, 적절한 경우, 유사체, 유리염기형태(free base form), 호변체, 거울상 라세미체(enantiomer racemate), 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 경우에 따른 양이 투여될 때, 본 발명에 따른 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 활성 성분들은 예를 들어, 대숙주이식편병의 치료에서 우수한 치료 활성을 나타내는 것으로 설명된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물들은 상기 언급된 질병들 중 임의의 질병의 치료에서 특정 증상을 치료하는데 적절한 것으로 알려진 임의의 기술 인식 화합물(art recognized compound)과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 편리한, 단일 조성물이 대상에게 투여될 수 있도록, 본 발명의 하나 이상의 화합물들은 상기 증상들을 치료하는데 적절한 것으로 알려진 하나 이상의 기술 인식 화합물들과 조합될 수 있다. 투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다.
예를 들어, 수개의 분할 투여량은 매일 투여될 수 있고, 투여량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되면 비례하여 감소될 수 있다.
활성 성분은 편리한 방식으로 예를 들어 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비강내, 피내 또는 좌약 경로 또는 이식(예, 서방출 분자들을 이용함)으로 투여될 수 있다.
투여 경로에 따라서, 활성 성분은 효소들, 산들 및 상기 성분을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건들로부터 상기 성분들을 보호하기 위하여 물질로 코팅되는 것이 요구될 수 있다.
비경구 투여 이외의 다른 방식을 활성 성분을 투여하기 위하여, 그의 불활성화를 방지할 수 있는 물질로 코팅되거나 상기 물질이 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은 보조제로 투여되거나, 효소 억제제들과 병용 투여되거나 리포좀들로 투여될 수 있다. 보조제는 가장 넓은 의미에서 사용될 수 있고, 임의의 면역 자극 화합물 예를 들어 인터페론을 포함한다. 여기에서 설명된 보조제들은 레조르시놀, 비 이온성 계면활성제들, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 억제제들은 췌장 트립신을 포함한다.
리포좀들은 종래 리포좀들 뿐만 아니라 워터-인-오일-인-워터 CGF 에멀젼들을 포함한다.
활성 성분은 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액들은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물들에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 환경들 하에서, 이들 제제들은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다.
주입가능한 사용에 적절한 약학적 형태들은 멸균 수용액들(수용성인 경우) 또는 분산액들 및 멸균 주입가능 용액들 또는 분산액들의 즉시 조제를 위한 멸균 파우더들을 포함한다. 모든 경우에, 형태들은 멸균이어야 하고 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유체이어야 한다. 제조 및 저장 환경들에서 안정하여야 하고 박테리아나 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 폴리프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리프로필렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은 유지될 수 있는데, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제들의 사용에 의해 유지될 있다.
미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항균제, 예를 들어 파라벤들, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살(thirmerosal) 등에 의해 달성될 수 있다. 특정 경우들에, 등장제(isotonic agent)들, 예를 들어 당들, 염화나트륨을 바람직하게 포함할 수 있다. 주입가능 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제들, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물들을 사용하여 달성될 수 있다.
멸균 주입가능 용액들은 상기에서 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 중에 요구되는 양으로 활성 성분을 포함시켜서 제조되고, 필요하다면, 이어서 여과 멸균을 한다. 일반적으로 분산액들은 기본 분산 배지 및 상기에서 열거된 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 멸균된 활성 성분을 포함시켜서 제조된다. 멸균 주입가능 용액들의 제조를 위한 멸균 파우더들의 경우에, 바람직한 제조방법은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는, 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
여기에서 사용된 바, "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 용매들, 분산 배지들, 코팅들, 항박테리아 및 항균제, 등장 및 흡수 지연제들 등을 포함한다. 약학적 활성 성분들을 위한 이러한 배지들 및 작용제들의 사용은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 임의의 종래 배지들 및 작용제가 활성 성분에 적합하지 않은 경우를 제외하고는, 치료 조성물들에서 이를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 보충 활성 성분들이 또한 조성물들에 포함될 수 있다.
투여의 편의 및 투여량의 균일성을 위하여 투여량 단위 형태에서 비경구 조성물로 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 여기에서 기술된 투여량 단위 형태는 치료받을 포유동물 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적인 개별 단위들을 가리킨다; 요구되는 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 산출하기 위하여 계산된 활성 물질의 미리 정해진 양을 함유하는 각 단위. 본 발명의 신규한 투여량 단위 형태들의 상세설명은 (a) 활성 물질의 특이한 특성들 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체 건강이 손상되어 질병화된 장애를 갖는 살아있는 대상에서 질환의 치료를 위한 활성 물질과 같은 조제 기술에 내재하는 제한들에 의하여 및 직접 이들에 따라서 기술된다.
주요 활성 성분들은 투여량 단위 형태에서 적절하고 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 유효량으로 편리하고 효과적으로 투여하기 위하여 조제된다. 보충 활성 성분들을 함유하는 조성물의 경우에는 상기 성분들의 통상적인 투여량 및 투여 방식을 참조하여 투여량이 결정된다.
항체들을 포함하는, 펩타이드 화합물들의 세포들로의 전달을 용이하게 하기 위하여, 펩타이드들은 세포 막을 가로지르는 그의 능력을 개선하기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,149,782호에서는 세포막을 가로지르는 단백질 수송을 증가시키기 위하여 융해성(fusogenic) 펩타이드들, 이온-채널 형성 펩타이드들, 막 펩타이드들, 장쇄 지방산들 및 기타 막 혼합제의 사용을 개시한다. 이들 및 다른 방법들은 또한 WO 97/37016 및 미국특허 제5,108,921호에 기술되어 있고 참조 문헌으로서 여기에 포함된다.
추가 양상에서, 특정 증상을 치료하기에 적절한 것으로 기술 인식된 화합물들과 조합하여 또는 단독으로 질병의 치료에 사용할 용도로 상기에서 정의된 것처럼 본 발명의 활성 성분이 제공된다. 결론적으로, 이상 면역 반응과 관련된 질병의 치료를 위한 약품의 제조를 위한 본 발명의 활성 성분의 용도가 제공된다.
더욱이, 이상 면역 반응과 관련된 질환의 치료 방법이 제공되고, 이는 상기에서 기술된 분석 방법을 이용하여 동정할 수 있는 리간드의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음의 실시예들에서 설명만을 목적으로 하여, 추가로 기술된다.
실시예
실시예 1
CTLA -4와 결합하고 이를 MHC Ⅱ를 통해 TCR 에 가교결합시키는 이중특이성 융합 단백질의 설계
선택적으로 및 경쟁적으로 CTLA-4와 결합하고 동시에 이를 TCR에 묶는 이중특이성 융합 단백질을 생성하기 위하여, CTLA-4와 결합하지만 CD28에 최소한의 친화성을 갖는(Wu et al., 1997) 돌연변이 CD80(CD80w88a, 이하 "CD80wa"라 함)을 MHCⅡ의 천연 리간드인 LAG-3(Baixeras et al., 1992; Triebel et al., 1990)와 융합하였다. 9개의 글리신들로 이루어진 링커를 이용하여 CD80wa를 LAG-3와 결합시켰고, 알려진 대로 그 순환 반감기를 증가시키기 위하여 차례로 마우스 IgG2a의 Fc 부분에 부착되었다(도 1A). 이러한 구조의 리간드에 대한 반응으로서, CTLA-4 결합 및 TCR에 대한 결속(ligation)이, 초기 T 세포 활성화 동안 면역 시냅스에서 삼분자 복합체(CTLA-4/MHCⅡ/TTCR)의 형성을 통하여, 간접적으로 발생할 것으로 기대되었다(도 1B). 개념적으로, 면역 시냅스와 관련없이, 이중특이성 융합 단백질과, CTLA-4 또는 MHCⅡ 단독 중 어느 하나 또는 CTLA-4 및 MHCⅡ 모두와의 결합은 T 세포 활성화를 저해해서는 안 된다. CD80wa에 의한 CTLA-4의 결합은, CTLA-4의 세포질 말단(tail)에 포스포타아제를 보충하는 것을 통해 CTLA-4 신호화를 촉발하도록 설계되었다. 한편, LAG-3와 MHCⅡ의 결합은 동종 TCR 부근에 CTLA-4를 가져오게 하였고, 동종 TCR은 면역 시냅스에서 pMHCⅡ 복합체와 결합한다(도 1B). 이들 2개의 결합 이벤트들의 조합은 억제 신호를 TCR로 전달할 것으로 기대되었다. CD80wa 및 IgG2a Fc를 포함하는 대조군 융합 단백질이 또한 구성되었고(도 1A), 이는 LAG-3가 없기 때문에 CTLA-4를 TCR에 가교결합시킬 수 없다(도 1C).
시험 융합 단백질 및 대조군 융합 단백질을 중국 햄스터 난소 세포들에서 발현시켰고, 단백질 G 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 응집물들(aggregates)은 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. 시험 이중특이성 융합 단백질(CD80wa-LAG-3-Fc)는 BsB(뉴클레오타이드 서열: 서열번호 3; 아미노산 서열: 서열번호 4)라고 하고, 대조군 구조체(CD80wa-Fc)는 BsB△(뉴클레오타이드 서열: 서열번호 16; 아미노산 서열: 서열번호 17)로 하였다. 예상대로, 2개의 융합 단백질들은 비환원 SDS-PAGE 겔에서 다이머들(BsB, 200 kDa; BsB△ 140 kDa)로 나타났고, 환원 SDS-PAGE 겔에서는 모노머들(BsB, 100 kDa; BsB△ 70 kDa)로 나타났다. LAG-3 및 CD80에 대한 항체들을 사용하여, 웨스턴 블랏으로 이들의 동일성을 추가로 확인하였다.
실시예 2
BsB 는 동종이계 혼합 림프구 반응에서 T 세포 활성화를 억제한다.
T 세포 활성화를 억제하는 BsB 및 BsB△의 상대적인 능력은, IL-2의 생산을 측정하는 것에 의하여 동종이계 혼합 림프구에서 분석되었다. BALB/c 마우스들에서 정제된 미접촉 CD4+CD25- CD62LhighCD441ow T 세포들을 BsB 및 BsB△의 존재 또는 부재하에서 C57BL/6 마우스에서 분리된 APC와 혼합하였다. CD80/86과 결합하고 CD28과의 결합을 차단하는 병용 투여 억제제인, 쥣과 IgG2a 및 CTLA-4Ig가 네가티브 대조군 및 포지티브 대조군으로서 각각 포함되었다. 혼합 림프구 반응에서 BsB△가 아닌 BsB를 포함하는 것은 비록 CTLA-4Ig에 의해 달성되는 것과 동일한 정도는 아닐지라도 IL-2 생산을 억제하였다(도 2). 이러한 차이는 CTLA-4Ig 매개 억제 이후에 발생하는 BsB-매개 T 세포 억제의 결과와 유사하였다. 보다 구체적으로는, BsB의 경우, CTLA-4 이후에 발생된 억제만 이어지는 T 세포 활성화를 상향조절하였다. BsB△가 IL-2 생산을 감소시키지 못하는 것은, TCR에 대한 공존하는 가교결합이 요구되기 때문에 CTLA-4만의 결합이 T 세포 활성화를 저해하기에는 충분하지 않다는 것을 강하게 암시한다. BsB의 LAG-3 부분이 T 세포 억제에서 역할을 할 가능성을 배제하기 위하여, LAG-3Ig가 이 분석에서 시험되었고 T 세포 활성화를 억제하지 못한다는 것이 증명되었다.
실시예 3
BsB 는 Treg 로의 T 세포 분화를 안내한다.
항원 자극의 철회에 의한 TCR 신호화의 초기 종결, mTOR 신호화의 억제, 낮은 친화성 항원에 기한 차선의 TCR 자극, 또는 T 세포 활성화 동안의 약한 공자극은 Foxp3+ 발현을 유도하고 Treg 표현형으로 T 세포 분화를 왜곡하는 것이 밝혀졌다(Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832-844; Haxhinasto et al., (2008) J. Exp. Med . 205:565-574; Sauer et al., (2008) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 105:7797-7802). TCR 신호화를 결과적으로 감쇄시키는 활성화-유도 CTLA-4에 의하여 BsB가 TCR의 초기 결합을 강화시키기 때문에, Foxp3+ Treg를 생성하는 능력이 또한 평가되었다. BsB 또는 BsB△의 존재하에서, Foxp3-EGFP 낙-인 마우스들에서 제조된 미접촉 CD4+CD62LhighGFP" T 세포들(Haribhai et al., (2007) J. Immunol 178:2961-2972)을 LPS-처리된 동종이계 APC와 혼합하였다. 배양 5일 후 세포들의 유동 세포 분석은 다수의 CD4+CD25+GFP+ T 세포들이 BsB 처리된 세포들 중에서 있지만(도 3A, 중간 왼쪽 패널), 마우스 IgG2a로 처리된 세포들(도 3A, 상부 왼쪽 패널)과 BsB△ 대조군으로 처리된 세포들(도 3A, 하부 왼쪽 패널) 중에는 없다는 것을 보여주었고, 이는 이 CD4+CD25+GFP+ T 세포들이 Foxp3+ Treg라는 것을 암시한다. 이러한 발견을 확인하기 위하여, 세포 배양 배지들을 수집하고, 특정 Treg 사이토카인들인, IL-10 및 TGF-β에 대하여 분석하였다(Cools et al., (2008) J. 세포 Mo /. Med . 12:690-700). 다량의 IL-10 및 TGF-β가 BsB 처리된 세포들의 배지에서는 검출되었지만(도 3A, 왼쪽 패널들), BsB△ 또는 mIgG2a로 처리된 세포들의 배지에서는 검출되지 않았다. 놀랍게도, CTLA-4Ig는 GFP+ Treg의 발생이나 IL-10 및 TGF-β 생산을 유도하지 못하였다. 특정 이론에 구속되지 않고, CTLA-4Ig가 T 세포 반응을 축소하는 메커니즘은 BsB의 메카니즘과 다르다. LAG-3Ig 단독 또는 BsB△와 조합하는 것 역시 GFP+ Treg의 발생을 유도하지 못하였고, 이는 TCR과 CTLA-4의 BsB 매개 가교결합이 Treg 유도를 위해 필요하다는 것을 암시한다.
실시예 4
BsB 에 의한 Tresg 의 유도는 자기-자극 TGF -β를 요구한다.
BsB 처리에 이어서 IL-10 및 TGF-β의 높은 수준의 동시 검출은 사이토카인들, 특히 TGF-β가 Treg 발생을 용이하게 하는데 역할을 할 가능성을 높여주었다(도 3A). 이를 설명하기 위하여, 배양 배지를 5일의 주기에 걸쳐 수집하였고, 사이토카인 및 Foxp3+ Treg 함량을 분석하였다. 높은 IL-10 및 TGF-β 수준이 처리 후 2일 정도에 일찍 검출되었고, Foxp3+ Treg는 3일 후에 검출되었다. 특정 이론에 구속되지 않고, 아마도 BsB에 의해 자극받은 TGF-β의 내생(endogenous) 생산이 Treg 분화에 포함된다. 아이소타입 대조군 IgG(클론 13C4)는 아니지만, 항-TGF-β 항체(클론 1D11)를 Treg 유도에 부가하는 것은 Foxp3+ Treg의 출현을 완전히 차단하였다(도 3B). 특정 이론에 구속되지 않고, CTLA-4의 초기 결합 및 BsB에 의한 TCR과의 이어지는 가교결합은 내생 TGF-β 생산을 자극하였고, 차례로 Treg 분화를 조장하였다. Treg 분화가 본 연구에서는 분석되지 않았지만, CTLA-4와 TCR의 가교결합은 TGF-β 생산을 유도하는 것이 이미 보고되었다(Chen et al., (1998) J. Exp . Med. 188:1849-1857).
Treg는 자가면역 질환의 몇몇 동물 모델들에서 질병 징후를 조절하는데 있어 상당한 치료 잠재력을 나타내었다. 그러나, 관련 항원에 대한 유도된 Treg의 특이성이 중요하다는 것이 강조되었다. 자가항원-특이적 반응성 T 세포들과 관련하여 특정 자가항원에 대하여는 활성화되지 않는 비-항원 특이적 Treg는 아마도 기능적으로 자가면역 억제성이 없다. 따라서, 항원-특이적 Treg의 대량 생성을 용이하게 하려는 접근들은 이들 질병을 치료하기에 매우 바람직하다. 더욱이 인 시튜 항원-특이적 Treg의 새로운(de novo) 유도를 용이하게 하는 전략들(예를 들어, T1D에 대하여 췌장 췌도에서 또는 궤양성 대장염 또는 크론병에 대하여 고유판(lamina propria))이 시험관 내에서 분화 또는 증식된 Treg의 적응 이식의 사용보다 더 바람직하다.
실시예 5
BsB 유도 Treg 는 세포-세포 접촉-의존 방식으로 기능적으로 억제성이다 .
BsB 유도 Treg가 기능적으로 억제성인지 분석하기 위하여, 대조군으로 제공되는, BsB 유도 Treg 및 TGF-β 유도 Treg를 형광-활성 세포 분류기(FACS)를 이용하여 정제하였고, CFSE 표지 공통유전자 반응자(syngeneic responder) T 세포들과 동종이계 APC를 상이한 비율로 혼합하였다. 세포들을 트랜스웰들 또는 통상의 배양 웰들 중 어느 하나에서 3일 동안 공-배양하였고, 이후 반응자 T 세포들의 증식을 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 도 5A에 요약된 것처럼, 통상의 배양 웰들 중에서 배양된 BsB- 및 TGF-β 유도 Treg 모두는 거의 완전하게 반응자 T 세포들의 증식을 억제하였다. BsB 유도 Treg의 억제 능력을 TGF-β 유도 Treg의 억제능력과 비교하였다. 대조적으로, BsB 또는 TGF-β 중 어느 하나에 의해 생성된 Treg는 T 세포가 트랜스웰에서 분리되었을 때 반응자 T 세포들의 증식을 유의적으로 억제하지 않았다. 특정 이론에 구속되지 않고, Treg 억제 활성은 세포-세포 접촉에 의존하고, 분비된 사이토카인 또는 기타 인자들에 의해 매개되지 않았다. 정상 배양 웰에서 항체를 IL-10(클론 JES5-2A5)에 포함시키는 것이 BsB- 또는 TGF-β 유도 Treg 중 어느 하나의 억제 활성에 영향을 미치지 않았다는 것은, 이러한 사상을 뒷받침한다(도 5B). 비록 TGF-β 유도 Treg에 의해 억제가 부분적으로 감소하였다고 할지라도, 항체를 TGF-βD11에 첨가하는 것은 BsB-유도 Treg의 억제 활성에 영향을 미치지 않았다(도 5B).
실시예 6
BsB 는 OT -Ⅱ T 세포들이 항원-특이적 Treg 로 분화하는 것을 안내한다.
CTLA-4와 TCR를 가교결합(MHCⅡ를 통하여)시키는 LAG3(BsB) 및 CD80wa를 포함하는 이중특이성 융합 단백질이 동종이계 MLR에서 Foxp3+ Treg의 생산을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌기 때문에, 항원-특이적 Treg의 생산을 이끌어내는 BsB의 잠재능력이 측정되었다. 이러한 예상을 조사하기 위하여, 닭 난백알부민 펩타이드(323-339)(Barnden et al., 1998)에 특이적인 TCR(α- 및 β- 서브유닛들)을 인코딩하는 이식유전자를 품고 있는 형질전환 마우스들로부터 미접촉 OT-Ⅱ T 세포들을 정제하였고, Ova323-339의 존재하에서 공통유전자 APC와 혼합하였다. 배양 5일 후, mIgG 대조군(도 4A, 상부 왼쪽 패널) 또는 CTLA-4Ig(데이터 미도시)로 처리한 것보다 BsB로 처리된(도 4A, 중간 왼쪽 패널) OT-Ⅱ T 세포들에서 유의적으로 다량의 Foxp3+ Treg가 검출되었다. 이러한 Treg의 유도는 배양물에 항-TGF-β 항체를 포함시켜서 억제하였다(도 4A, 하부 왼쪽 패널). 특정 이론에 구속되지 않고, 분화는 자가분비 또는 인접분지 방식의 내생 생산 TGF-β에 의해 매개되었다. IL-2 수준이 감소되었지만, 반면에 IL-10 및 TGF-β의 수준은 BsB-처리 세포들의 배지에서 증가하였다(도 4A, 오른쪽 패널들).
유도 Treg의 증식 활성을 모니터링하기 위하여, OT-Ⅱ 세포들은 형광 추적자, CFSE를 미리 적재하였다. 도 4B에 나타난 것처럼, BsB-유도 Foxp3+ Treg는 CFSE 신호의 희석에 의해 나타난 것처럼 증식성이라는 것이 측정되었다. 예상대로, 공-자극 차단제인 CTLA-4Ig는 T 세포 증식을 감소시켰다. 따라서 BsB는 T 세포 활성화를 억제할 수 있었고 동종이계 MLR 및 항원 특이적 구성 모두에서 Treg의 생산을 유도하였다.
실시예 7
BsB 에 의한 Treg 의 유도는 AKT / mTOR 신호화 경로의 감소를 포함할 수 있다.
최근 보고들은 AKT 및 mTOR 신호화 경로가 T 세포 운명에 중요한 역할을 한다는 것을 알려주었다. T 세포들 중의 구조적 활성 AKT의 존재는 라파마이신-감응성 방식으로 Treg 분화를 감소시키고(Haxhinasto et al., 2008), 이는 AKT 및 mTOR 신호화 경로가 교차하여 Tres 운명에 영향을 미친다는 것을 암시한다. 더욱이, mTOR 중의 T 세포들 결핍은 정상 대조군 T 세포들보다 더 쉽게 Treg로 분화시킨다(Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832-844). 길항적 AKT/mTORdp 의한 조절 적응 Treg 발생에서 공-억제 분자들 PD-1/PD-L1의 의무적인 역할은 이미 보고되어 있다(Francisco et al., (2009) J. Exp . Med . 206:3015-3029). 이들 경로가 또한 Treg의 BsB 매개 유도에 포함되는지 측정하기 위하여 항-CD3 및 항-CD28 항체들을 96 웰 플레이들 상의 BsB, mIgG, 또는 PD-L1과 함께 고정시켰고, 그 위에 미접촉 T 세포들을 심었다. 활성화 18 시간 후에, 세포들은 인산화된 AKT 및 mTOR에 대하여 형광 표지 항체들로 염색하였고 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. AKT 및 mTOR 모두의 인산화는 BsB 및 PD-L1 공-고정(co-immobilization)에 의해 감소하였다(도 6). 특정 이론에 구속되지 않고, CTLA-4 및 PD-L1 억제성 분자들에 의해 매개된 신호화 이벤트들은 Treg 분화를 조절하기 위하여 T 세포 활성 동안 AKT/mTOR 신호화 경로를 따라서 특정 시점에 집중되었다.
실시예 8
BsB 에의 노출은 유도된 Treg 에서 Foxp3 + 발현을 지속시킨다.
시험관 내-유도된 Treg는, 완전히 고정된(committed) 천연 Treg와는 달리, 덜 안정적인 것으로 보고되고, 초기 유도물질(예, TGF-β 또는 레티노산) 이 없는 증식된 배양물에서 Foxp3+ 발현능을 상실할 수 있다(Selvaraj and Geiger, (2007) J. lmmunol . 178:7667-7677). 최근 연구에서, BsB-유도 Treg는 유사한 불안정성을 보여주었고, 일부 세포들은 이어지는 반복 배양에서 Foxp3 발현능을 상실하였다(도 7). BsB에 의한 재-자극이 Foxp3 발현을 연장할 수 있는지 측정하기 위하여, Treg는 항-CD3/항-CD28 항체들 및 BsB 양자로 코팅 96-웰 플레이트에서 먼저 유도되었다. 정제된 Treg는 이어서 BsB의 존재 또는 부재하에서 추가 배양을 하였다. 정제된 Treg를 BsB로 재-자극하는 것은, IgG 대조군에 대한 반응에서 ~40% Foxp3+ 발현(도 7, 상부 오른쪽 패널)과 비교하여, Foxp3+ Treg의 대량 집단(총 Treg의 ~93%)을 유지하였다(도 7, 하부 오른쪽 패널).
실시예 9
마우스에서의 BsB 의 약물 동력학
자가면역 질환의 동물 모델들에서 BsB의 치료 능력을 시험하기 전에, 생체 내 투여 계획 설계를 돕기 위하여 그의 약물 동력학을 측정하였다. C57BL/6 마우스에 BsB를 복강내 주입하는 것은 순환 수치들을 측정가능하게 상승시켰고 이어서 ~12h의 추정 혈장 반감기(t1 /2)로 빠르게 제거되었다(도 8A). Fc 함유 융합 단백질들 또는 항체들의 약물동력학이 일반적으로 더 연장되기 때문에, 이 프로파일은 예상하지 못했다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 항체들의 결합이 주로 그들의 연장된 반감기에 책임이 있기 때문에(Roopenian and Akilesh, 2007), FcRn과 결합하는 BsB와 대조군 마우스 IgG2a의 상대적인 능력을 비교하였다. 도 8B는 FcRn에 대한 양 단백질의 결합 특성들이 매우 유사하며, 이는 FcRn에 대한 BsB의 결합시 흠결이 순환계에서 빠른 제거의 원인과 유사하지 않다는 것을 나타낸다는 것을 보여준다.
BsB의 빠른 제거에 대한 또 다른 가능한 설명은 비-타겟 세포들 상의 탄수화물 수용체에 의한 그 흡수 때문일 수 있다. 이러한 수용체들의 예시들은 간 세포들 상의 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)(Weigel, 1994)와 대식세포들 및 세망내피계의 내피 세포들(Pontow et al., 1992) 상의 만노즈 수용체를 포함한다. NetNGlyc 서버를 이용한 BsB의 분석은, 모노머당 10 개까지의 아스파라긴-연결 올리고당 측쇄를 고정할 잠재력을 갖는다는 것을 암시한다(도 9). 단당류 조성물 분석은 BsB가 약 37개의 만노즈 잔기들을 함유하고, 이들 아스파라긴-연결 올리코당 글리칸들이 3개의 만노즈 잔기들을 갖는 코어-만노즈 구조를 함유하기 때문에(총 30개의 만노즈 잔기들), 모든 예상되는 아스파라긴-연결 글리코실화 자리가 사용될 수 있다는 것을 알려준다. 또한, 소량의 고 만노즈형 올리고당들이 또한 추가 만노즈 잔기들을 처리하기 위해 존재할 수 있다. 실제로, 일부 고-만노즈형 올리고당들에 더하여 하위-시알화(under-sialylated) 트리- 및 테트라-분지(antennary) 아스파라긴-연결의 유의적인 양이 단백질에서 방출된 퍼메틸화된 글리칸의 질량 분석기로 동정되었다. 이 대상은 또한 SDS-PAGE 분석으로 나타난, BsB의 분자량 100 kDa과 일치하고, BsB의 계산된 중량 80 kDa와는 다르다. 올리고당의 추가 존재가 분자량에서 이러한 차이(20 kDa)가 있었다. 더욱이, BsB는 0.68의 시알산 대 갈락토즈의 비율을 나타내었고(도 9), 이는 글리칸들이 불완전하게 시알화된 것을 의미한다. 특정 이론에 구속되지 않고, ASGPR에 의한 BsB의 탄수화물-매개 제거는 순환에서 이의 신속한 제거에 기여하였다.
실시예 10
BsB 로의 단기간 치료는 NOD 마우스에서 자가면역 당뇨병의 발병을 지연시켰다.
시험관 내 Treg 유도에 대한 BsB의 EC50이 약 100 nM로 측정되었고, 그 순환 반감기가 짧았기 때문에(~12h에서 t1 /2), BsB는 후기 예방 패러다임에서 NOD 마우스에서 시험되었다. NOD 마우스는 9 및 12 주령 사이일 때 짧은 간격(4주 동안 2일 마다)에 걸쳐 BsB를 투여받았다. 이 연령에서, 자가반응 T 세포들 및 인슐린염이 이미 분명하였지만 마우스는 아직 현성 당뇨병이 발생하지 않았다. 도 10A에 나타난 것처럼, 2주 동안 BsB로 처리된 NOD 마우스는 혈액 중 Foxp3+ Treg의 수가 완만하지만 통계학적으로 유의한 증가(25%)를 나타내었다. 그러나 치료 4주 후 또는 이후 시점들에서 Treg의 수의 차이가 검출되지 않았기 때문에, Treg에서의 이러한 증가는 일시적이었다. 항-CD3 항체로 NOD 마우스를 처리한 이후에 림프 기관들 중의 Treg에서 유사한 일시적 증가가 있다는 것이 이미 알려졌다(Nishio et al., 2010). 특정 이론에 구속되지 않고, BsB-유도 Treg는 치료 중단 후에 Foxp3- T 세포들로 복귀될 수 있다. 그들은 또한 그 기능을 수행하기 위하여 특정 타겟 조직들(예, 췌장)에 의해 보충될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 후기 예방 치료 패러다임에서 이러한 단기간의 BsB 치료는 질병의 발병을 조금 지연시키고 현성 T1D를 나타내는 마우스의 수를 감소시킨다는 것을 보여준다(도 10B).
나타난 약한 반응은 치료 시작 이전에 9 주령의 NOD 마우스에서 활성 인슐린염이 있었기 때문일 수 있다. 염증 환경은 활성 T 세포들이 Th17로 전환되는 것을 돕고 그들이 Treg로 전환되는 것은 억제한다는 것이 밝혀졌다. 염증성 사이토카인들 예를 들어 IL-6 또는 IL-4는 또한 Treg 전환을 억제하고 Treg에서 Foxp3+ 발현의 손실을 촉진한다는 것 역시 밝혀졌다(Caretto et al., 2010; Kastner et al., 2010; Koenen et al., 2008). 이러한 문제들을 피하기 위하여, NOD 마우스는 자가-반응 T 세포들 및 인슐린염의 명백한 유도 이전인 초기 연령(4 주령)에서 치료를 시작하였다. CTLA-4Ig는 또한 본 연구에서 양성 대조군으로 포함되었고, 블루스톤과 그 동료들(Lenschow et al., 1995)은 이 모델에서 이 작용제를 사용한 이점을 설명하였다; mIgG2a는 식염수에 대한 추가 음성 대조군으로 사용되었다. 나이든 마우스의 결과와는 대조적으로(도 10A), 2주 동안 BsB로 처리된 젊은 NOD 마우스의 말초 혈액 중의 Foxp3+ Treg의 수는 식염수 또는 mIgG가 투여된 것들과 비교하여 증가하지 않았다(도 11A). 특정 이론에 구속되지 않고, 이것은 4주령 NOD 마우스(초기 연구에 사용된 9-12 주령 마우스와 대조적으로)의 자가-반응 T 세포들의 수는 매우 낮았기 때문일 수 있다. 유도 항원-특이적 Treg의 수는 너무 적어서 동물들에서 존재하는 기본 수준을 초과하여 쉽게 나타날 수 없다. 24 주령 이전에 식염수로 치료된 대조군들과 비교할 때 T1D의 유의적으로 낮은 발생율이 BsB가 투여된 NOD 마우스에서 발견되었다(도 11B). 그러나 이 이점은 후기 시점에서는 감소하엿다.
CTLA-4Ig가 투여된 NOD 마우스에 대한 보고와 일치하게(Salomon et al., 2000), 혈액 중 Treg의 수준(도 11A)은 유의적으로 감소되었는데, 이는 CD28/B7 신호화에 대한 CTLA-4Ig의 영향 때문일 것이다(Tang et al., 2003). CTLA-4Ig 처리는 또한 질병의 초기 발병(도 11B) 및 식염수- 또는 mIgG-처리 대조군들과 비교할 때 더 높은 질병 비율(도 11B)을 나타내는 마우스의 질병을 악화시켰다. 이러한 발견들과 블루스톤과 그 동료들(Lenschow et al., 1995)에 의해 보고된 것들이 불일치하는 이유는, 명확하진 않지만 사용된 CTLA-4Ig의 차이 또는 사용된 투여 계획의 차이 때문일 수 있다. 본 연구에서, 10 mg/kg의 인간 CTLA-4Ig 투여량을 블루스톤과 그 동료들의 2.5 mg/kg의 마우스 CTLA-4Ig 투여량 대신에 사용하였다. 더욱이 BsB 처리는 7 주를 넘기지 않았다. 특정 이론에 구속되지 않고, CTLA-4Ig의 높은 투여량의 사용은 Treg 항상성을 위해 요구되는 공-자극 신호의 보다 완전한 차단을 제공한다.
실시예 11
BsB 의 장기간 치료는 NOD 마우스에서 자가면역 당뇨병의 발병을 지연시키고 발생율을 감소시킨다.
초기 연구들에서, NOD 마우스에 있는 질병에서 관찰된 BsB의 보통의 이점들에 대한 잠재적인 이유들은 상대적으로 짧은 치료기간의 배치, Treg의 생산을 유도하는 BsB의 적당한 효능(> 100 nM 에서 EC50), 및 노출을 제한할 수 있는 BsB의 짧은 순환 반감기를 포함한다. BsB의 효능 및 순환 반감기는 분자에 내재된 것이어서 용이하게 변화시킬 수 없기 때문에, 장기간 치료가 시험되었다. 결국, NOD 마우스는 4 주령일 때 4주 대신에 10주 동안 BsB로 처리되었다. 도 12A에 나타난 것처럼, BsB로 10주 동안 처리된 NOD 마우스는 T1D 발병이 유의적으로 지연되는 것을 나타내었다. 중요하게, 35 주령까지, 식염수 처리된 대조군은 70%를 초과한 것과 비교하여, BsB 처리된 NOD 마우스는 ~13% 만이 T1D가 발생하였다. 따라서, NOD 마우스를 BsB로 더 길게 치료하는 것은 자가면역 당뇨병 발생으로부터 동물들을 보호한다는 것이 밝혀졌다.
연구의 결론에서(마우스가 35 주령일 때), 동물들을 희생시켰고 그들의 췌장은 조직병리학적 분석을 위해 채취하였다. 췌도(islets)의 일반 분석을 위하여 인접한 연속 단편들을 H&E로 염색하였고, β-세포들 중에 존재하는 인슐린을 검출하기 위하여 항-인슐린 항체로 탐침하였고, T 세포들과 Treg를 위치시키기 위하여 항-CD3 및 항-Foxp3 항체들로 이중 염색하였다. NOD 마우스의 유전적 이질성 때문에, 소수의 미처리 동물들이 35 주령에 발병하지 않았다. 이들 비-당뇨병 동물들(식염수 처리된 집단에서)의 췌도 분석은 β-세포들이 림프구 침윤 또는 인슐린염의 명확한 증거 없이 온전하다는 것을 보여주었다(도 12B, 패널 a-c). 몇몇 Foxp3+ Treg 세포들이 이들 마우스의 췌도에 존재하였다(패널 c의 화살표들). 대조적으로, 당뇨병 NOD 마우스 유래 췌도(식염수-처리 집단에서)는 침습성 인슐린염의 존재(도 12B, 패널 d) 및 β-세포의 완전한 파괴(패널 e)를 나타냈다. CD3+ T 세포들 및 Foxp3+ Treg에 더하여, 다수의 비-T 세포 림프구들이 또한 발견되었다(도 12B, 패널 f). 유사한 조직병리학적 발견들이 연구 종료시 질병이 없는 상태이거나 연구 동안에 T1D가 발생한, 상응하는 BsB- 처리 마우스에서 발견되었다. 흥미롭게도, 비-당뇨병으로 남은 BsB-처리 NOD 마우스의 췌도 중 ~50%에서, 페리-인슐린염이 발견되었다(도 12B, 패널 g); 그러나, β-세포들은 잘 보존되었다(도 12B, 패널 h). 항체들로 염색하는 것은 췌도 주변에 있는 세포들이 주로 CD3+ T 세포들 및 Treg를 포함한다는 것을 나타내었다(도 12B, 패널 i). 이미지 중 확대 부분(도 12B의 붉은 사각형, 패널 i)은 수많은 Foxp3+ Treg의 존재(도 12B, 패널 j)를 보여주었고, 이것은 CD3+ T 세포들이 아니라 비-Foxp3+(도 12B, 패널 j의 검은색 화살표 머리)와 비-T 세포 모노뉴클레오사이트(푸른색 핵산)로 배치되어 있었다. 페리-인슐린염의 발생은 젊은(4~10 주령) NOD 마우스(Anderson and Bluestone, 2005)에서, 그리고 NOD 마우스에서 T1D의 신규 발병을 지연시키거나 뒤바꾸는 다른 효과적인 치료제로 처리된 나이든 마우스(Chatenoud et al., 1994; Daniel et al., 2011; Simon et al., 2008; Vergani et al., 2010)에서 발견되었다. 따라서, NOD 마우스를 BsB로 장기 과정으로 치료하는 것은 침습성 인슐린염이나 현성 T1D의 발생으로부터 동물들을 보호하였다. 특정 이론에 구속되지 않고, 이것을 적어도 부분적으로 처음부터 또는 가능한 췌도 항원-특이적 Treg의 인 시튜 유도에 의해 매개되었다.
신규한 이중특이성 융합단백질(BsB)를 이용하여 MHCⅡ를 통한 CTLA-4와 TCR의 가교결합은 항염증 사이토카인들, IL-10 및 TGF-β에 더하여 항원-특이적 Treg의 생산을 효과적으로 유도하였다. 이전 연구들은 Treg가 면역 내성을 부여하는데 매우 중요하고 항원-특이적 Treg는 자가면역 질환을 갖는 동물 모델들에서 보다 효과적이라는 것을 보여주었다. BsB는 T1D와 같은 자가면역 질환을 갖는 동물 모델들에서 추가로 평가되었다. 특정 이론에 구속되지 않고, BsB가 NOD 마우스의 자가반응 T 세포들의 활성화의 초기 상 동안 항원-특이적 Treg의 유도를 촉진한다면, BsB는 Treg로의 활성화를 거치는 자가반응 T 세포들을 변환시켜서 질병의 발병을 지연시키거나 질병의 진행을 중지시킬 수 있다는 가설을 세웠다.
BsB가 보통의 능력(MHCⅡ 및 TCR에 대한 보통의 친화도에 기함) 및 짧은 순환 반감기(그의 노출을 제한함)에도 불구하고, 단기간 치료는 초기 연령(4-6 주령 사이) 및 그들이 더 나이가 들었을 때(9-12 주령 상)에 치료된 NOD 마우스에서의 T1D의 발병을 재현가능하게 지연시켰다. 그러나 관찰된 이점들은 중간이고 지속되지 않았다. NOD 마우스(4 및 13 주령 사이)를 BsB로 장기간(10주) 치료하는 것은 질병의 발병 및 T1D로 진행하는 동물의 발생율을 유의적으로 지연시켰다. 특정 이론에 구속되지 않고, 이 이점은 국소적으로(예, 췌장 또는 췌장 배액 림프절) 또는 말초적으로 생산된 유도 Treg의 새로운 생성에 의해 주어졌고, 이는 이어서 췌장으로 보충되어 자가반응 T 세포들 및 기타 비-T 세포 백혈구에 의한 파괴로부터 췌도를 보호하였다. 비-당뇨병으로 남아있는 35 주령 BsB 처리 마우스의 췌장 조직의 단편들의 면역조직화학적 염색은 췌도의 주변에서 Foxp3+ Treg 수가 증가한 것을 명확하게 보여주었다. 시각적으로, 그들은 CD3+ T 세포들 및 비-T 세포 림프구들이 췌도에 들어가는 방해한다는 것이 명확하였다. 이러한 현상은 연구 종료시 비-당뇨병으로 남아있는 BsB-처리 NOD 마우스의 췌도의 ~50%에서 관찰되었지만, 대조군 그룹의 당뇨병 동물들의 췌도에서는 발견되지 않았다. 대조군 그룹의 몇몇 비-당뇨병 마우스의 췌도는 림프구 침입이 전혀 없는 상태였고 인슐린염이 없었다. NOD 마우스들의 유전적 이질성 때문에, 이 크기의 집단에서 몇몇 동물들은 이 기간내에 당뇨병이 발생하지 않았다고 알려져 있다. BsB-처리 그룹에서 비-당뇨병 동물들 중 남아있는 ~50%는 또한 림프구 칩임이 전혀 없고 인슐린염이 없었다. 이들 마우스들의 질병이 없는 상태의 가능성은 BsB 처리 및 유전적 배경을 포함한다.
조직병리학적 발견들과 일치하게, 미처리 대조군들과 비교하였을 때, Foxp3+ Treg의 수에서 작지만 통계적으로 유의적인 증가가 BsB-처리 동물들(9-19 주령에 처리됨)의 혈액에서 검출되었다. 이 증가는 더 어린 연령(4 주령)에서 처리를 시작한 마우스들에서는 명확하지 않았다. 특정 이론이 구속되지 않고, 이것은 더 많은 자가반응 T 세포들이 4 주령의 마우스들보다 9 주령의 마우스들에 활성화를 거치고 있었기 때문일 것이다. 4 주령 마우스들에서의 자가반응 T 세포들의 낮은 수치는 기존 환경에서의 Treg의 수치 이상으로는 유도된 Treg의 검출을 못하게 하였다. Treg의 증가는 또한 자연에서는 일시적이었다. 유사한 관찰이 항-CD3 치료법을 받은 동물들에서 발견되었고(Nishio et al., 2010), 유도된 Treg가 불안정하였고 Foxp3 발현능을 상실하였을 가능성이 있다. Treg가 영향을 받은 타겟 조직들에 순환에 의해 보충되었다고 추가로 가정할 수 있다. 반대로, CTLA-4Ig로 처리된 NOD 마우스들은 순환 Treg의 수에서 유의적인 감소를 나타내었다. 신속한 질환의 발병 및 현성 질병을 나타내는 동물들의 높은 발생율에 의해 증명되는 것처럼, 치료는 또한 질병을 악화시켰다. 이것은 공-자극 경로가 Treg 항상성에 포함되고 공-자극의 결핍이 Treg의 생산을 감소시킨다는 이전의 보고들과 일치한다. NOD 마우스들에서의 CD80 또는 CD86의 차단 또는 넉-아웃 은 또한 T1D의 초기 발병을 가져온다(Salomon et al., 2000; Tang et al., 2003).
페리-인슐린염의 출현은 일반적으로 4 및 9 주령 사이의 NOD 마우스들의 췌장에서 관찰된다. 조절되지 않는다면, 침습성 인슐린염은 β-세포의 완전한 파괴와 12 및 35 주령 사이에서 현성 당뇨병의 발생이 반드시 일어나게 한다. BsB로 10주 동안 처리되고 35 주령에 분석된 비-당뇨병 마우스들의 췌장은 그 진행이 저지되는 것이 명확하게 나타난 페리-인슐린염의 증거를 나타내었다. 침습성 인슐린염 또는 인슐린 생산 β-세포들의 과도한 파괴가 전혀 나타나지 않았다. NOD 마우스들에서 유사하게 질병을 지연시키거나 예방하는 다른 치료학적 개입들에 대한 다른 보고들이 있다(Shoda et al., 200). 여기의 결과들은 리 등(Lee et al. (2010))이 보고한 것과 가장 유사하고, 리 등은 CD4+CD25+ Treg가 고갈된 당뇨병 유발 CD4+CD25- BDC2.5 T 세포들을 암컷 NOD/SCID 마우스들에 이송시키는 것이, CD4+CD25+ Treg를 포함하는 전체 CD4+ T 세포들을 투여한 마우스들과 비교하여 침습성 인슐린염의 발생을 촉진시킨다는 것을 보여주었다. 침습성 인슐린염은 BDC2.5T 세포들 그 자체에 의한 것보다 수지상 세포들(DC)의 침입에 의해 대개 우세해졌다. 저자들은, 췌도에서 분비된 케모카인(chemokines) CCL19 및 CCL21에 대한 반응으로 DC들의 주화성을 적어도 부분적으로 조절함으로써, Treg가 DC들의 췌도로의 침습을 조절하였다고 요약하였다. Foxp3+ Treg, CD3+ T 세포들 및 비-T 세포 백혈구들에 대한 면역조직화학적 염색 패턴들은 BsB 처리된 췌장 부분들에서, 비-당뇨병 마우스들이 그들의 발견들과 일치하다는 것을 나타내었다(도 12B). 특정 이론에 구속되지 않고, BsB에 대한 반응으로 NOD 마우스에서 생산된 Treg는 자가반응 T 세포들 및 비-T 세포 림프구들의 췌도로의 이주를 정지시키는 작용을 하였다. BsB로 장기간 치료하는 것은 더 효과적이었는데, 이는 이것이 더 양호하고 지속적인 Treg의 유도를 생성하기 때문이다. 세포 배양물에서 BsB로 유도 Treg를 연속적으로 자극하는 것이 Treg에서 Foxp3+ 발현을 연장시켰다는 것은 이러한 사상을 지지한다(Karman et al., 2012).
자가면역 질환의 동물 모델들 또는 기관 이식편에서 생체 분리되거나, 생체 외(ex vivo) 증식 또는 시험관 내 유도된 Treg를 이용하는 세포 치료법은, Treg의 적응 이식이 Treg 대 효과기 T 세포들의 균형을 회복시킬 수 있고, 이에 따라 이들 질환들과 관련된 활발한 자가면역성을 제어할 수 있다고 설명되었다(Allan et al., 2008; Jiang et al., 2006; Riley et al., 2009; Tang et al., 2012). 그러나 치료 전락으로서 적응 이식(adoptive transfer)의 사용은 임상에 적용하는데 몇몇 문제점들이 있다. 첫째로, 인간 대상의 말초 혈액에서 분리될 수 있는 자가조직 Treg의 수가 제한적이다. 따라서, Treg의 과도한 생체외 증식이 종종 요구되는데, 이는 그들의 기능성 및 순도를 변경시킬 수 있다. 두 번째로, 분리된 Treg이 다클론성인 경우, 그들은 비-타겟 효과기 T 세포들에 대하여 광범위한(pan) 면역 억제 작용을 가할 수 있다. 세 번째로, 그리고 가장 중요하게, Treg의 가소성이 중요한 문제들을 제기한다(Bluestone et al., 2009; Zhou et al., 2009a). 적응 이식된 Treg가 Foxp3 발현능을 상실할 수 있고, 자가면역성 또는 염증을 악화시킬 위험성을 발생시키는 Th17 세포들(Koenen et al., 2008) 또는 병원성 기억 T 세포들(Zhou et al., 2009b)로 재분화할 수 있다는 점을 보여주었다. 따라서, 인 시튜 항원 특이적 방식에서 Treg의 발생을 유도하는 치료법이 적응(adoptive) Treg 세포 치료법보다 더 유리하다. 여기에서 나타난 결과들은 T1D의 마우스 모델과 관련하여 CTLA-4를 MHCⅡ에 가교결합시키는 이러한 작용제의 유용성 및 효과를 보여준다. T1D의 NOD 마우스 모델에서의 효능뿐만 아니라 BsB 처리에 대한 반응으로 IL-10, TGFβ 및 Treg의 생산에 대한 조합된 설명은 신규한 치료 개념을 제공하는 잠재력을 갖는다. 주변부에서의 CD4+ T 세포들 및 CD19+ B 세포들의 수 및 퍼센트는 우리의 NOD 연구들 모두에서 동일하게 유지하였다. 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 접근은 질병의 진행을 지연시키거나 중단시키는데 효과적이다. 보다 강력하고 보다 바람직한 약물 동력학 프로파일을 갖는 BsB 변이체들의 개발이 이들 연구들에서 확인하여야 한다. 따라서 이 개념은 또한 다른 면역-매개 질환들의 처리에도 적용될 수 있다.
여기에서 보고된 결과들은 달리 지시되지 않는 한, 다음의 방법들 및 물질들을 이용하여 얻어졌다.
동물들, 암컷 야생형 C57BL/6(H-2b), BALB/c(H-2d), C57BL/6 유전적 배경에서 닭 난백알부민 323-339(Ova323 -339)에 특이적인 마우스 α-쇄 및 β-쇄 T 세포 수용체를 발현하는 형질전환 OT-Ⅱ 마우스들, 및 암컷 비-비만성 당뇨병(NOD/LtJ) 마우스들을 잭슨 실험실(The Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 동물들은 병원균 없는 시설에 두었고, 연구들은 미국 보건 사회 복지보(U.S. Department of Health and Human Services)(NIH Publication No 86-23) 및 젠자임의 동물 실험 윤리위원회(Genzyme's Institutional Animal Care and Use committee)에서 발행된 가이드라인에 따라 이루어졌다.
항체들 및 시약들. 작용 등급들 또는 형광 표지 항-마우스 CD3(클론 145-2C11), CD25, 인슐린 및 Foxp3+ 항체들은 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)에서 구입하였다. 쥣과 CTLA-4-Fc 및 인간 CTLA-4Ig(Orencia)는 R&D 시스템사(R&D Systems, Inc.) 및 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)으로부터 각각 구입하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입 대조근은 바이오엑스셀사(BioXcell Inc.)에서 입수하였다. CFSE, ultralow Ig 소태아혈성(FBS), 및 기타 세포 배양 배지들은 인비트로겐(Invitrogen)에서 입수하였다. 닭 Ova323 -339 펩타이드들은 뉴잉글랜드 펩타이드(New England Peptide)에서 입수하였다.
이중특이성 융합 단백질 BsB 의 구성 및 생산. 마우스 IgG2a 의 Fc(CD80wa-LAG-3-Fc, BsB) 뿐만 아니라 CD80w88a 및 LAG-3의 세포외 도메인들을 포함하는 이중특이성 융합 단백질 (BsB)의 구성 및 생산은 이미 기술되어 있다(Karman et al., 2012).
바이오코어 분석 및 단당류 조성물 분석. 바이오코어는 BsB 및 mIgG2a와 마우스 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 결합을 비교하기 위하여 사용하였다. 요약하면, CM5 칩을 아민 화학을 사용하여 ~1430 RU의 마우스 FcRn-HPC4에 고정시켰다. 각 샘플은 PBSP(0.005% 계면활성제 P-20을 갖는 PBS), pH 6.0 중에 200 및 6.25 nM 사이의 최종 농도로 연속적으로 1:2로 희석되었고, 2회 3분간 주입되었고, 이어서 해리 버퍼로 3분 동안 세척되었다. 표면은 10 mM 나트륨 붕산염 및 1M NaCl, pH 8.5로 재생되었다. BsB의 탄수화물 단당류 조성물은 조 등(Zhou et al., 2011)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 분석되었다.
미접촉 T 세포들의 분리. 8-12 주령 암컷 BALB/c 또는 OT-Ⅱ 마우스의 비장 및 림프절 유래 미접촉 T 세포들은 자성 분리 및 이어지는 형광-활성화 세포 분류에 의해 정제되었다. 세포들을 먼저 자성 세포 분리(Miltenyi Biotech)에 의해 음성적으로 선택하였고, 이어서 98% 초과의 순도까지 CD4+CD25-CD62LhiCD44low 세포들을 분류하였다.
항원-특이적 Treg 유도 분석. 동종이계 MLR 구성(setting)에서 분석이 이미 보고된 바와 같이 이루어졌다(Karman et al., 2012). 항원-특이적 T 세포 활성화에 대하여, 105개의 미접촉 OT-Ⅱ 세포들이 0.5 ㎍/ml 및 1 ㎍/ml 용해성 항-CD28(클론 37.51, eBioscience)에서의 Ova323 -329 존재하에서 105개의 방사선 조사된 공통유전자 APC와 함께 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 혼합되었다. 시험 구조체들인 마우스 IgG2a, 또는 마우스 CTLA-4Ig를 100 ㎍/ml의 포화농도에서 배양된 세포들에 첨가하였다. 세포들을 5일 동안 배양하여, Treg 생산을 유도하였고 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트들을 이용하여 IL-2, IL-10 및 TGF-β를 분석하기 위하여 배지들을 수집하였다. T 세포 증식을 평가하기 위하여, 정제된 미접촉 OT-Ⅱ 세포들을 37℃에서 5분 동안 5μM CFSE로 표지하였다. 이후 비결합 CFSE를 제거하기 위하여 그들을 세척하였고 상기에서 설명된 Treg 유도 분석에서 사용하였다. 세포들을 5일 동안 배양하여 유동 세포 분석법으로 분석되기 전에 분할되게 하였다. T 세포들 중의 Foxp3+를 검출하기 위하여 세포들을 상기에서 기술한 것처럼 표면 마커들로 염색하였고, 이어서 Fix/Perm 버퍼(eBioscience)로 투과성으로 만들고 PE-Cy7 접합 항-Foxp3 항체(클론 FJK-16s, eBioscience)으로 염색하였다.
마우스들 중의 BsB 의 약물 동력학 측정. BsB의 약물 동력학을 8 주령 C57BL/6 마우스들에서 측정하였다. 20 mg/k의 BsB를 복강내 주입으로 마우스에 투여하였다. 투여 후 1 시간, 5 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72시간에 복재정맥 채혈로 혈액을 수집하였다. 각 시점에서 BsB의 수준을 ELISA 분석을 사용하여 측정하였다. 요약하면, PBS 중의 항-CD80 마우스 항체 100μl를 96웰 플레이트 상에 코팅하였고, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트들을 5% 소태아혈청으로 1 시간 동안 차단하고, 이후 그들을 PBS로 4회 세척하였다. 이후 다양한 희석도를 갖는 100μl의 혈액 샘플들을 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 실온에서 부드럽게 흔들면서 2 시간 동안 배양하였고, PBS로 4회 세척하였다. 비오틴화 항-마우스 LAG-3 항체(1 μg/ml)를 추가하였고 2 시간 동안 배양하엿다. 플레이드들을 PBS로 4 회 세척하였고, 이후 스트렙타비딘-HRP를 첨가하였다. 30분 후, 플레이트들을 BPS로 6회 세척하였고 비색 측정을 진행하였다. 다양한 농도의 분석 희석물들에서 희석된 정제 BsB을 표준으로 사용하였다.
BsB 로 NOD 마우스들의 처리. 단기간 치료에서, 4 주령 암컷 NOD 마우스들은 식염수, 20 mg/kg BsB, 20 mg/kg 마우스 IgG2a, 또는 10 mg/kg 인간 CTLA-4Ig(Orencia)으로 1주에 3회 복강내 주입으로 2.5 주의 기간에 걸쳐 처리되었다. 후기 예방 모델에서, 9-12 주령 NOD 마우스들은 상기한 바와 같이 식염수 및 20 mg/kg BsB로 4주 동안 처리되었다. 장기간 치료에서, NOD 마우스는 상기한 바와 같이 BsB 또는 식염수로 10주 동안 4 주령부터 13 주령까지 처리되었다. 8 주령에서 시작하여 비-단식 혈당 수준(Non-fasting blood glucose level)을 매주 모니터링하였다. 마우스들은 3번의 연속 판독에서 그들의 당 수치가 300 mg/dL를 초과하는 경우 당뇨병으로 간주되었다. 처리 2주 후에 유동 세포 분석법으로 말초 혈액 중의 Foxp3+ Treg를 검사하였다. 요약하면, 비표지 항-FcγIIb 및 FcgRIII(클론 93, eBioscience)를 이용하여 5 분간 전혈 50 μl를 용해시켰다. 이어서 세포들을 형광 표지 항-CD4 항체로 30분 동안 염색하였고 이어서 세척하였다. FACS 용해 용액((BD Biosciences)를 이용하여 5분 동안 적혈구 세포들을 용해시켰다. 세척 후, 세포들을 고정하고 투과성으로 만들고 FITC-표지 항-Foxp3 항체로 상기에서 기술된 것처럼 30분 동안 염색하였다. 췌장을 반으로 절단하고 그중 하나는 중성 버퍼 포르말린에 고정하였고, 나머지 하나는 OCT 화합물에 놓아두고 이어서 드라이아이스로 동결시켰다.
통계학적 분석. BsB 또는 대조군들로 처리한 후 T1D 및 고혈당을 나타내는 NOD 마우스들의 누적 발생률을 프리즘 5 (Graphpad, city and state)에서 로그-랭그(Cox-Mantel) 시험을 사용하여 비교하였다. p<0.05의 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
조직병리학적 분석. 자동화된 공정을 이용하여 중성 버퍼 포르말린-고정 췌장을 CD3, Foxp3+ 세포들에 대하여 염색하였다. 조직 단편들을 자일렌-에탄올을 사용하여 밀랍을 제거하였고, 항원들을 시트레이트 버퍼에서 25분간 배양하여 회수하였고 이어서 혈청으로 차단하였다. 슬라이드들을 45분 동안 항-CD3 항체와 함께 배양하였고, 이어서 염소 항-토끼 서양고추냉이 과산화효소 고분자와 20분간 배양하였다. 3,3'-디아미노벤즈이딘 테트로하이드로클로라이드와 함께 2~4분 동안 배양하여 CD3의 크로모겐 가시화(Chromogen visualization)를 얻었다. Foxp3+를 검출하기 위하여, 단편들을 혈청으로 차단하였고, 이어서 45분 동안 항-Foxp3 항체에 노출시켰다. 이어서 슬라이드들을 토끼 항-랫트 IgG 항체와 함께 30분 동안 배양하였고, 이어서 염소 항-토끼 알칼리성 포스파타아제 고분자에서 배양하였다. 크로모겐 가시화는 Fast Red를 10분간 사용하여 달성하였다. 조직 부분들을 헤마톡실린을 사용하여 2분 동안 대비염색하였고, 0.05% 트윈-20/트리스 완충된 식염수로 단계들 사이에 3회 세척하였다. 인접하는 연속 단편들을 항-인슐린 항체들을 사용하여 상기 기술한 것처럼 염색하였다. 디아그노스틱사(Diagnostic Inc.)의 부착 디지털 카메라를 장착한 Nikon Eclipse E800 형광 현미경을 사용하여 사진들을 찍었고 스팟 어드밴스드 소프트웨어(Spot Advanced software)를 사용하여 이미지들을 얻었다.
서열들
기호
CD80w88a = CTLA-4 리간드
IgG2a = IgG2 Fc 영역
G9 = Gly 9
Lag-3 = MHC 리간드
H6 = His 6
서열번호 1:
CTLA -4 BsB (유전자 1) = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- IgG2a ( aa241 -474)- G9 -Lag-3(aa25-260)- H6
마우스 대리 구조체의 뉴클레오타이드 서열 (유전자 1):
GGACCTGGGGCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCACGTACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACCATCATCACTGA
서열번호 2:
CTLA -4 BsB ( 유전자1 ) = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- IgG2a ( aa241 -474)-G9-Lag-3(aa25-260)- H6
마우스 대리 구조체의 번역된 단백질 서열(유전자 1):
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAHHHHHH
서열번호 3:
CTLA -4 BsB (유전자 2) = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- G9 - Lag -3( aa25 -260)- IgG2a ( aa241 -474)
마우스 대리 구조체의 뉴클레오타이드 서열(유전자 2):
AAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA
서열번호 4:
CTLA -4 BsB (유전자 2) = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- G9 - Lag -3( aa25 -260)- IgG2a ( aa241 -474)
마우스 대리 구조체의 번역된 단백질 서열(유전자 2):
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWGGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
서열번호 5:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 야생형 뉴클레오타이드 서열 = (인간 CD80 ( aa1 -234)- G9 - Lag -3(aa27-262-IgGla(aa240-471 )
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 6:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 야생형 번역된 단백질 서열 = (인간 CD80 ( aa1 - 234)-G9-Lag-3(aa27-262-IgGla(aa240-471 )
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPWWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 7:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 뉴클레오타이드 서열 1 = (인간 CD80W84A / S190A ( aa1 -234)- G9 - Lag -3 R316 /75E( aa27 -262- IgGlaN596 /297Q( aa240 -471)
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 8:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 번역된 단백질 서열 1 = (인간 CD80W84A / S190A ( aa1 -234)- G9 - Lag -3 R316 /75E( aa27 -262- IgGlaN596 /297Q( aa240 -471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 9:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 뉴클레오타이드 서열 2 = (인간 CD80W84A / S190AS201A ( aal -234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgGlaN596/297Q(aa240- 471)
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 10:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 번역된 단백질 서열 2 = (인간 CD80W84A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN596/297Q(aa240- 471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVASKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 11:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 뉴클레오타이드 서열 3 = (인간 CD80E196A /5190A( aa1 -234)- G9 - Lag -3 R316 /75E( aa27 -262- IgG1aN596 /297Q( aa240 -471)
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 12:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 번역된 단백질 서열 3 = (인간 CD80E196A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1 aN596 /297Q( aa240 -471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 13:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 뉴클레오타이드 서열 4 = (인간 CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1a N596 /297Q( aa240 - 471)
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 14:
CTLA -4 BsB 인간 구조체 변형 번역된 단백질 서열 4 = (인간 CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN596/297Q(aa240- 471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVASKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTINQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 15
인간 CD80
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV
서열번호 16
BsB△ ( CD80wa - Fc ) DNA = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- IgG2a ( aa241 -474)
마우스 대리 구조체의 뉴클레오타이드 서열 ( BsB △ CD80wa - Fc ) :
ggtcaacaacaaagccctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgctcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaaggcggtggcggcggaggcggtggcggtgggcctgggaaagagctgggtctggagcccgtagcccaccatcaccatcatcactga
서열번호 17
BsB △( CD80wa - Fc ) 단백질 = 마우스 CD80w88a ( aa1 -235)- IgG2a ( aa241 -474)
마우스 대리 구조체의 번역된 단백질 서열( BsB △ CD80wa - Fc ):
macncqlmqdtpllkfpcprlillfvllirlsqvssdvdeqlsksvkdkvllpcrynsphedesedriywqkhdkvvlsviagklkvapeyknrtlydnttysliilglvlsdrgtyscvvqkkergtyevkhlalvklsikadfstpnitesgnpsadtkritcfasggfpkprfswlengrelpginttisqdpeselytissqldfnttrnhtikclikygdahvsedftweprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspmvtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevltaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkalpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgkggggggggggpgkelglepvahhhhhh
기타 실시형태들
상기한 기재에서, 변형들 및 변경들이 다양한 용도 및 조건들에 채택하기 위하여 여기에서 기술된 발명들에 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들은 또한 다음의 청구항들의 범위 내에 있다.
여기에서 임의의 변수 한정으로 열거된 요소들에 대한 설명은 열거된 요소들의 임의의 단독 요소 또는 조합(또는 서브조합)으로서 변형가능한 한정들을 포함한다. 여기에서 실시형태들의 설명은 임의의 단독 실시형태 또는 임의의 다른 실시형태들 또는 그 일부와의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허들 및 문헌들은 마치 독립된 특허 각각과 문헌이 참조로서 포함되는 것으로 특별하고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 여기에 참조로서 포함된다.
참조문헌들
아래의 문헌들이 여기에서 인용된다.
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tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1800 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1860 tacaccctgc ccccatctcg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1920 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1980 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctatacagc 2040 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 2100 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 2160 <210> 14 <211> 719 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 BsB human construct variant translated protein sequence 4 <400> 14 Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30 Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45 Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile 50 55 60 Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 65 70 75 80 Met Asn Ile Trp Pro Glu 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aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc 420 atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact 480 aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa 540 aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg 600 tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc 660 attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggagcccag agggcccaca 720 atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 780 ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catggtcaca 840 tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gttcgtgaac 900 aacgtggaag tactcacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 960 cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020 tgcaaggtca acaacaaagc cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 1080 gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 1140 aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 1200 tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 1260 gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 1320 aatagctact cctgctcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1380 ttctcccgga ctccgggtaa aggcggtggc ggcggaggcg gtggcggtgg gcctgggaaa 1440 gagctgggtc tggagcccgt agcccaccat caccatcatc actga 1485 <210> 17 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BsBdelta (CD80wa-Fc) Protein <400> 17 Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe 1 5 10 15 Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser 20 25 30 Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp 35 40 45 Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser 50 55 60 Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val 65 70 75 80 Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Ala Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu 85 90 95 Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser 100 105 110 Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr 115 120 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Claims (34)

  1. MHC 분자 및 이중특이성 생물제제와 복합화된 항원에서 유래된 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포와 T 세포를 접촉시켜 T-세포의 자기내성화를 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제의 사용.
  2. 자가면역 질환과 이식 거부에서 선택된 질병의 치료에서의, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 pMHC 복합체에 특이적인 리간드 및 CTLA-4에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제의 사용.
  3. 제2항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D)인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드는 CTLA-4에 특이적인 항체, 및 CD80(B7-1) 또는 CD86(B7-2)에서 선택되는, 이중특이성 생물제제의 사용.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 항-MHC 항체 및 LAG-3에서 선택되는, 이중특이성 생물제제의 사용.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드와 상기 pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 링커에 의해 떨어져 있는, 이중특이성 생물제제의 사용.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커는 폴리아미노산 서열 및 항체 Fc 도메인 중 하나 이상인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리아미노산 서열은 G9(Gly-9)인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  9. 제4항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드는 CD80인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  10. 제9항에 있어서, CD80은 CTLA-4에 대한 특이성이 증가하도록 돌연변이된 것인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  11. 제10항에 있어서, CD80은 돌연변이 W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A 및 E196A 중 적어도 하나를 포함하는 인간 CD80인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  12. 제11항에 있어서, CD80은 인간 CD80의 돌연변이 W84A 또는 E196A를 포함하는, 이중특이성 생물제제의 사용.
  13. 제5항에 있어서, 상기 MHC 복합체에 특이적인 리간드는 LAG-3인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  14. 제13항에 있어서, LAG-3는 pMHCⅡ에 대한 특이성이 증가되도록 돌연변이된 것인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  15. 제14항에 있어서, LAG-3는 돌연변이 R73E, R75A, R75E 및 R76E 중 적어도 하나를 포함하는 인간 LAG-3인, 이중특이성 생물제제의 사용.
  16. 제15항에 있어서, LAG-3는 돌연변이 R75A 또는 R75E를 포함하는, 이중특이성 생물제제의 사용.
  17. CTLA-4에 특이적인 리간드 및 pMHC 복합체에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드는 CTLA-4에 특이적인 항체, 및 CD80(B7-1) 또는 CD86(B7-2)에서 선택되는, 이중특이성 생물제제.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 항-MHC 항체 및 LAG-3에서 선택되는, 이중특이성 생물제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드와 상기 pMHC 복합체에 특이적인 리간드는 링커에 의해 떨어져 있는, 이중특이성 생물제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 링커는 폴리아미노산 서열 및 항체 Fc 도메인 중 하나 이상인, 이중특이성 생물제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리아미노산 서열은 G9(Gly-9)인, 이중특이성 생물제제.
  23. 제18항에 있어서, 상기 CTLA-4에 특이적인 리간드는 CD80인, 이중특이성 생물제제.
  24. 제23항에 있어서, CD80은 CTLA-4에 대한 특이성이 증가하도록 돌연변이된 것인, 이중특이성 생물제제.
  25. 제24항에 있어서, CD80은 돌연변이 W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A 및 E196A 중 하나 이상을 포함하는 인간 CD80인, 이중특이성 생물제제.
  26. 제25항에 있어서, CD80은 인간 CD80의 돌연변이 W84A 또는 E196A를 포함하는, 이중특이성 생물제제.
  27. 제19항에 있어서, 상기 MHC 복합체에 특이적인 리간드는 LAG-3인, 이중특이성 생물제제.
  28. 제27항에 있어서, LAG-3는 pMHCⅡ에 대한 특이성이 증가되도록 돌연변이된 것인, 이중특이성 생물제제.
  29. 제28항에 있어서, LAG-3는 돌연변이 R73E, R75A, R75E 및 R76E 중 적어도 하나를 포함하는 인간 LAG-3인, 이중특이성 생물제제.
  30. 제29항에 있어서, LAG-3는 돌연변이 R75A 또는 R75E를 포함하는, 이중특이성 생물제제.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 생물 제제 및 MHC 분자와 복합화된 항원으로부터 유도된 펩타이드를 제시하는 항원-제시 세포를 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 대하여 T-세포를 내성화시키는 방법.
  32. 자가면역 질환 및 이식 거부에서 선택된 질병을 앓는 대상을 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 대상에게 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 pMHC 복합체에 특이적인 리간드 및 CTLA-4에 특이적인 리간드를 포함하는 이중특이성 생물제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 이중특이성 생물제제는 추가 면역 억제제 또는 조절제와 조합하여 투여되는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D), 전신 홍반성 루프스(SLE), 류마티스성 관절염(RA), 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염(UC), 크론병(CD), 다발성 경화증(MS), 경피증, 심사성천포창(PV), 건선, 아토피성 피부염, 셀리악병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병(갑상선), 쇼그렌증후군, 귈랑-바레 증후군, 굳파스튜어 증후군, 에디슨병, 베게너육아종증, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 다발성 근육통, 레이노 현상, 측두 동맥염, 거대 세포 동맥염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 결절성 다발성 동맥염, 베체트병, 원발성 담즙성 간경변, 포도막염, 심근염, 류마티스성 열, 강직성 척추염, 사구체신염, 유육종증, 피부근염, 중증 근무력증, 다발성근염, 원형탈모증, 및 백반증에서 선택되는, 방법.
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