KR20140032694A - 내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＭＬＤ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＭＬＤ 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 OsMLD (Oryza sativa MYB-like domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다.

Description

내염성을 증가시키는 벼 유래의 ＯｓＭＬＤ 유전자 및 이의 용도 {OsMLD gene increasing tolerance to salt stress from rice and uses thereof}
본 발명은 내염성을 증가시키는 벼 유래의 OsMLD 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 (Oryza sativa) 유래의 OsMLD (Oryza sativa MYB-like domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물에 관한 것이다.
벼는 경제적으로 가장 중요한 식량작물 중 하나이다. 벼 재배에 있어서 건조 및 염 스트레스 등의 비생물적 스트레스는 큰 경제적 손실을 야기하기 때문에 이러한 스트레스에 저항성을 나타내는 벼 품종의 개발이 중요하게 여겨지고 있다. 현재 몇몇의 전사 인자가 다양한 스트레스에 대한 저항성을 나타내는데 연관성을 갖는다는 것이 보고되고 있다. 그 중 MYB 전사 인자는 동물의 종양유전자로 처음 정의되었고, 세포 주기를 조절하는데 연관된다. MYB 단백질은 인접한 반복 (adjacent repeat) (R1, R2, R3, 및 R4)의 수에 따라 다양한 그룹으로 구분된다. 벼의 MYB-유사 도메인 (OsMLD)은 R2 - R3 - MYB 유전자에서 유래된 단일 또는 부분적인 MYB 반복을 포함하는 세 번째 이종 클래스 (heterogeneous class)에 속하며, 세포의 형태 발생을 조절하고 2차 대사에 관여한다 (Dubos et al., Trends in Plant Sci 15:573-581, 2010).
많은 MYB 전사 인자는 생리적 작용과 다양한 발달 과정에 관여한다고 보고되고 있으며, 특히 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 반응한다고 알려져 있다. 실제로 OsMYB3R -2가 과발현된 애기장대 형질전환체의 경우 내냉성, 내건성 및 내염성이 증가하였고, 이러한 저항성 증가는 형질전환체의 프롤린 축적 증가에 따른 것으로 보고되었다. OsMYB4 유전자가 과발현된 애기장대 또한 내동성 및 내한성이 증가되는 것이 확인되었다 (Dubos et al ., Trends in Plant Sci 15:573-581, 2010). 벼에서 OsMYB2는 염 스트레스 처리시 가용성 당, 유리-프롤린 및 LEA (late embryogenesis abundance) 단백질과 같은 다양한 삼투물질을 축적시키고, MDA (malondialdehyde) 및 H2O2의 축적을 억제하는 기능을 한다. 또한, 애기장대의 AtMYB44, AtMYB96 유전자가 식물의 내염성과 내건성을 증가시킨다는 연구가 보고되었다 (Yang et al., J Exp Bot 63:2541-2556, 2012).
현재까지 애기장대, 옥수수, 벼, 페튜니아, 금어초, 포도, 포플러 및 사과 등 여러 작물에서 MYB 단백질의 기능에 대한 많은 연구가 진행되었으나, MYB-유사 단백질의 기능에 대한 연구는 미약하다.
한편, 한국공개특허 제2012-0061518호에는 '애기장대 유래의 MYB96 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0695072호에는 '비생물성 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 스트레스-유도성 OsAsr1 유전자 및 단백질'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 내염성을 증가시키는 벼 유래의 OsMLD 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 벼 식물체를 제조하였고, 형질전환된 벼 식물체가 염 스트레스 처리시 야생형 식물체보다 내염성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 OsMLD (Oryza sativa MYB-like domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsMLD 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가하므로, 이를 이용하면 간척지 및 염 피해지에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적일 것으로 기대된다.
도 1은 벼 유래의 OsMLD 전장 cDNA를 포함하는 바이너리 Ti 플라스미드 pART 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 OsMLD 유전자의 전장 cDNA 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. (A) OsMLD의 전장 cDNA는 428 아미노산의 폴리펩티드 (46.7 kDa)를 코딩하는 1,287 bp이다. Myb-CC 타입 전사 인자는 직선으로, 결합 도메인은 점선으로 표시되었다. (B) 유전자의 유연관계도는 neighbor-joining 알고리즘에 의해 구축되었다. 다른 MYB 단백질에 대한 등록 번호는 하기와 같다: 밀 MYB-연관 단백질 (JF951950); 피마자 (Ricinus communis) 전사인자 (XM 002526513); MYB-CC 전사 인자에 대한 루핀 (Lupinus albus) LaMYB-CC5 mRNA (AB573724); 애기장대 myb 패밀리 전사 인자 (NM 001202877); 옥수수에서 분리된 PHR1 (phosphate starvation protein) (JF831533); 보리 인산염 결핍 조절 단백질-유사 단배질 (GQ337895); 담배 WERBP-1 (AB017693).
도 3은 OsMLD 유전자가 과발현 (OsMLD-OX)된 형질전환체 및 동진벼 (야생형)의 게놈 및 발현 분석을 나타낸다. (A) 1% 아가로스 겔에서 MLD 및 nptII 프라이머를 사용하여 T0 형질전환 식물의 외래 유전자의 PCR 확인. (B) 재분화된 T1 형질전환 벼 식물체의 어린잎에서 OsMLD 유전자 발현 확인. 위쪽 패널은 도입된 OsMLD의 발현 수준을 나타내며, 아래쪽 패널은 내부 대조구로 사용된 액틴을 나타낸다. WT, 야생형; 1-23, 독립적인 과발현 계통들.
도 4는 250 mM NaCl 처리 48시간 후의 야생형 (동진벼) 및 OsMLD-OX 식물체의 OsMLD mRNA 발현 수준을 나타낸다. 내부 대조구로 액틴이 사용되었으며, 데이터는 세 번 반복의 평균±표준편차로 나타내었다.
도 5는 비생물학적 스트레스 처리시 형질전환 벼 식물체 잎에서의 OsMLD 유전자 발현 수준을 나타낸다. (A) 250 mM NaCl, (B) 100 μM ABA, (C) 3% H2O2 및 (D) 20% PEG6000을 처리한 후 0, 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 36시간 간격으로 샘플링하여 실시간 RT-PCR로 전사체의 수준을 측정하였다 (대조 품종으로 동진벼 사용). 내부 대조구로 액틴이 사용되었으며, 데이터는 세 번 반복의 평균±표준편차로 나타내었다.
도 6은 2주 된 형질전환 벼 유묘에 250 mM NaCl 스트레스 처리 10일 후의 반응을 나타낸다. (A) MDA 함량, (B) 프롤린 함량, (C) 엽록소 함량, (D) 표현형적인 차이.
도 7은 정상 조건하의 경작지에서 키운 OsMLD-OX 벼 식물체의 농업 형질을 나타낸다. (A) 농업 특성을 보여주는 스파이더 플롯 (Spider plot). 각 형질전환 계통의 데이터는 세 반복으로부터 합산되었다. (B) OsMLD-OX 벼 식물체 및 야생형 동진벼의 표현형.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 OsMLD (Oryza sativa MYB-like domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 OsMLD 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
OsMLD 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsMLD 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsMLD 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae) 또는 난초과 (Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료 및 생육 조건
OsMLD 유전자 과발현 형질전환 벼를 육성하기 위해 동진벼 품종이 사용되었다. 육성된 형질전환 벼는 토양에 이식하여 온실에서 2주간 생육하였고, 어린잎을 수집하여 게놈 DNA를 추출한 후 OsMLD 특이 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR 분석 후 OsMLD 유전자 도입이 확인된 식물체를 이용하여 종자를 수확하였고 T1 종자로 사용하였다. 형질전환 벼는 야생형 벼 품종과 함께 파종하여 온실에서 3주간 재배한 후 충북대학교 GMO 포장에 이식하였다. 벼는 표준재배방법에 의해 관리 재배되었고, 생육량 및 농업 형질이 조사되었다 (Sun et al., PLoS ONE 6: e18385, 2011).
비생물학적 스트레스 저항성 테스트를 위해서, T1 종자는 플라스틱 육묘상자에 파종한 후 MS 배지를 이용하여 영양분을 지속적으로 공급하였다. 온실 재배 온도는 낮 기온 30~32℃, 밤 기온 22~24℃로 유지하였다.
2. 재조합 벡터 구축 및 식물 형질전환
벡터 구축을 위해 벼에서 OsMLD의 전장 cDNA (Accession No. NM_001056541)를 5'-CCGCTCGAGATGTCATCCTCCTTGCCTATT-3' (XhoI 자리 밑줄)(서열번호 2) 및 5'-CGGGGTACCTCAAGATTCATGCACTCTACG-3' (KpnI 자리 밑줄) (서열번호 3) 프라이머를 사용하여 분리하였고, pART 벡터에 결합시켰다. OsMLD 유전자가 삽입된 재조합 벡터는 도 1에서 나타낸 것처럼 CaMV 35S 프로모터와 OCS 터미네이터에 의해 조절된다. pART::OsMLD 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404에 형질전환한 후 Lee 등이 고안한 벼 발아 초기종자를 이용한 단기 형질전환 방법을 이용하여 동진벼에 형질전환하였다 (J Plant Biotechnol 38:251-257, 2011).
3. DNA 추출 및 PCR 분석
게놈 DNA 추출은 Cho 등이 보고한 방법을 변형하여 이용하였다 (Crop Sci 47:2403-2417, 2007). DNA 추출 후 DNA의 순도와 농도는 NanoDrop-1000 분광광도계 (NanoDrop Technologies, Inc. USA)를 이용하여 측정하였다. PCR 분석은 T0와 T1 식물체에서 npt (neomycin phosphotransferase) 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 NPT-Fw (5'-TGAATGAACTGCAGGACGAG-3': 서열번호 4) 및 NPT-Rv (5'-AATATCACGGGTAGCCAACG-3': 서열번호 5) 프라이머를 이용하여 수행되었고, OsMLD 유전자 삽입을 확인하기 위해 MLD-Fw (5'-ATGTCATCCTCCTTGCCTATT-3': 서열번호 6) 및 MLD-Rv (5'-TCAAGATTCATGCACTCTACG-3': 서열번호 7) 프라이머를 이용하여 수행되었다.
4. 비생물학적 스트레스 처리
PCR 분석에 의해 유전자 도입이 확인된 형질전환 벼 T2 세대를 이용하여 스트레스 검정을 수행하였다. 2주된 야생형 벼 및 OsMLD 유전자 과발현 형질전환체는 1/2 MS 액체 배지에서 수경재배한 후 250 mM NaCl, 20% PEG6000, 100 μM ABA 및 3% H2O2 처리하였다. 스트레스 처리 0, 0.5, 1, 3, 6, 12, 24 및 36 시간 후에 각각의 잎을 샘플링하였고 분자적 및 생화학적 분석을 수행하였다.
5. RT - PCR 분석
CaMV35S::OsMLD 형질전환 벼와 야생형 벼의 잎 조직 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Maryland, USA)를 이용하여 추출하였다. 이 과정은 스트레스 처리 후 샘플에서도 동일하게 수행되었다. 추출된 RNA의 순도와 농도는 NanoDrop-1000 분광광도계를 이용하여 측정하였고, -80℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다. 총 RNA는 DNaseI 처리 후 first-strand cDNA 합성을 위해 사용되었다. cDNA 합성은 Oligo (dT)20 프라이머와 SuperScriptTMⅢ 역전사 효소를 이용하여 수행되었다. 반정량 RT-PCR은 MLD-rt-Fw (5'-TGGCGATATTTGTCCTGTCA-3': 서열번호 8) 및 MLD-rt-Rv (5'-TCGCTTTCAGGTCCAAAGAC-3': 서열번호 9) 프라이머를 사용하여 수행되었다. 액틴 유전자는 정량 RT-PCR 반응의 표준화를 위해 사용되었다.
실시간 PCR은 50 ng의 cDNA로 SYBR Green Master mix 및 CFX connect real-time system (Bio-rad, USA)을 사용하여 3번 반복 수행되었다. 상대정량 방법 (Delta-Delta CT)을 통해 반복 간의 수치를 구하였고, 액틴 유전자가 표준화를 위해 사용되었다.
6. 지질 과산화, 유리-프롤린 및 엽록소 함량 측정
지질 과산화 정도의 지표인 MDA (malondialdehyde) 함량을 확인하기 위한 지질 과산화 (lipid peroxidation) 측정은 TBA (thiobarbituric acid) 반응에 의해 결정된 TBARS의 양을 측정하는 Heath 및 Packer의 방법을 이용하였다 (Arch Biochem Biophysics 125:189-198, 1968). 잎 조직 0.1 g을 1 ml의 20% (w/v) TCA (trichloroacetic acid)를 이용해서 분쇄한 후 13,000 rpm으로 20 분간 원심분리하였다. 상등액 0.5 ml을 취해 0.5% (w/v) TBA가 포함된 20% (w/v) TCA 2.0 ml과 혼합하여 95℃에서 30분 동안 중탕한 후 빠르게 냉각시켰다. 다시 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리한 후 상등액을 취해 532nm에서 파장을 측정하였고, 600nm에서 측정된 비특이적 파장은 제거하였다. TBARS 함량은 155 mM-1 cm-1의 흡광 계수를 사용하여 계산되었다.
유리-프롤린 함량은 Troll 및 Lindsley에 의해 고안된 방법으로 측정되었다 (J Biol Chem 215: 655-660, 1955). 잎 조직 100 mg에 3% (w/v) 설포살리실산 (sulfosalicylic acid) 1ml을 첨가하여 추출한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15 분간 원심분리하였다. 추출물 상등액 200 ml을 취해 산성 닌하이드린 (acid ninhydrin)(2.4 ml의 빙초산 및 1.6 ml의 6-오쏘-인산 (6-ortho-phosphoric acid)에 용해된 0.1 g의 닌하이드린) 200 ml과 아세트산 200 ml을 첨가한 후 100℃에서 30분간 중탕하였다. 중탕한 혼합물은 4℃에서 30분간 식힌 후 400 ml의 톨루엔 (toluene)을 첨가하여 완전히 혼합하였다. 그 후 120 ml의 상등액을 취해 분광광도계 Optizen Series (Model 2120UV)를 이용하여 520nm에서 파장을 측정하였다.
엽록소 함량은 Lichtenthaler 방법을 이용하여 엽록소를 추출한 후 644.8nm와 661.6nm에서 파장을 측정하여 확인하였다 (Method Enzymol 148:350-382, 1987).
7. 통계 분석
모든 서열 분석은 NCBI 서열 데이터베이스의 BLAST 프로그램을 이용하였다. ORF (open reading frame)와 보존된 도메인은 NCBI BLASTN 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 이용하여 분석하였다. 서열 정렬, ORF 번역, 추정된 단백질의 분자량 계산 및 구조 분석은 DNAStar's Lasergene 서열 분석 소프트웨어 (www.dnastar.com)를 이용하였다.
데이터의 통계 분석은 Statistix version 8 (www.statistix.com)을 이용하여 이루어졌으며, 데이터는 야생형 동진벼를 비교 대상으로 하여 Dunnett's 다중 비교 (Dunnett's multiple comparison)로 분석되었다.
실시예 1. OsMLD 유전자 특성
벼에서 유래된 MYB-유사 도메인 유전자 (OsMLD, NM_001056541) 분석은 428개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 (46.7 kDa)를 코딩하는 1,287 bp의 ORF를 보여준다. 아미노산 서열을 이용하여 BLASTX 분석한 결과, C-말단 영역에 관다발 식물과 단세포 조류의 인산염 결핍 신호전달에 연관된 Myb_CC_LHEQLE 수퍼패밀리가 위치하는 것으로 나타났다 (Rubio et al., Genes Dev 15:2122-2133, 2001)(도 2A). 벼의 OsMLD 유전자는 밀 (Accession No, JF951950)과 96%, 보리 (Accession No. GQ337895)와 92%, 애기장대와 (Accession No. NM 001202877) 91.5% 및 옥수수 (Accession No. JF831533)와 75.8%의 상동성을 보였으며, 추정된 OsMLD 아미노산을 사용하여 유연관계 분석 결과 밀 및 보리와 가장 높은 유사성을 갖는 것으로 나타났다 (도 2B).
실시예 2. OsMLD 형질전환 벼의 세대 증식 및 발현 분석
OsMLD 유전자가 과발현된 벡터를 이용하여 형질전환을 통해 총 23개의 형질전환 T0 세대를 육성하였고 PCR로 형질전환 여부를 확인하였다. 모든 형질전환 개체에서 npt 유전자가 확인되었고, 그 중 13개 형질전환체에서 목적 유전자인 OsMLD의 도입이 확인되었다 (도 3A). 유전자 도입이 확인된 개체에서 mRNA를 추출하여 OsMLD 유전자 발현 수준을 분석한 결과 야생형 동진벼에 비해 OsMLD 유전자의 발현 증가가 확인되었다 (도 3B). 모든 형질전환체에서 야생형에 비해 OsMLD의 발현이 증가하였으나, 증가 수준은 다르게 나타났다. 그 중 발현이 가장 높은 4개의 계통을 선발하여 OsMLD-OX1, 2, 3, 4로 명명하였고, 그 후 실험을 진행하였다.
실시예 3. 비생물학적 스트레스 하에서 형질전환 벼의 유전자 발현분석
OsMLD 유전자가 형질전환된 벼에서 스트레스 후에 나타나는 OsMLD mRNA의발현 수준을 알아보기 위해, 2주 된 유묘에 250 mM NaCl, 100 μM ABA, 20% PEG6000 및 3% H2O2를 각각 처리하여 발현 분석을 수행하였다. 염 스트레스 하에서 형질전환체는 야생형 동진벼에 비해 OsMLD 발현량이 증가하였으며 (도 4), 염 스트레스 처리 30분 후부터 발현량이 유의하게 증가하여 6시간 후에 최대로 발현되는 것이 확인되었다 (도 5A).
다른 비생물학적 스트레스를 처리했을 때에도 염 처리시에 나타나는 반응과 유사하게 OsMLD 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ABA 및 PEG6000을 처리시에는 처리 3시간 후에 OsMLD 발현량이 최대치에 도달하는 것으로 나타났고 (도 5B 및 5D), H2O2 처리시에는 처리 24시간 후에 최대로 발현되는 것으로 나타났다 (도 5C).
실시예 4. 염 스트레스 하에서 형질전환 식물체의 생리적 반응 분석
OsMLD 유전자가 과발현된 형질전환체를 이용하여 염 처리시에 나타날 수 있는 생리적인 반응을 분석하기 위해, 염 스트레스 처리 후에 지질 과산화 정도의 지표인 MDA (malondialdehyde) 함량을 야생형 동진벼 및 형질전환체에서 측정하였다. 250 mM NaCl을 처리한 후 야생형과 형질전환체 모두에서 MDA 함량이 급격히 증가하였다. 그러나 형질전환 벼에서 나타나는 MDA 증가 수준은 야생형에 비해 유의하게 낮게 나타났다. 형질전환체 간의 MDA 함량을 비교하면, OsMLD-OX2에서 가장 적은 MDA 함량이 나타났고, OsMLD-OX4에서 가장 많은 MDA 축적량이 나타났다 (도 6A).
MDA 함량 변화와 함께, 식물에서 다양한 비생물학적 스트레스 내성에 관련된 삼투물질인 프롤린의 축적을 측정한 결과, OsMLD-OX1를 제외한 모든 형질전환 식물체에서 야생형에 비해 프롤린 함량이 증가하는 것으로 확인되었다. OsMLD-OX2 계통은 염 스트레스 처리에 의해 프롤린 함량이 가장 많이 증가했다 (도 6B). 일반적인 재배 조건에서는 야생형과 형질전환체 간의 MDA 및 프롤린 함량 차이가 나타나지 않았다 (도 6A 및 6B). 이 결과를 종합해 볼 때, 염 스트레스 하에서 OsMLD 유전자의 발현 수준에 따라 MDA 및 프롤린 함량 변화가 나타나며, OsMLD 유전자는 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 생각된다.
염 스트레스 처리에 따른 엽록소 함량을 측정한 결과, 일반적인 재배 조건에서는 야생형과 형질전환 벼 간에 차이가 나타나지 않았다. 그러나 염 스트레스 처리시에는 야생형과 형질전환체 모두 엽록소 함량 감소가 나타났으며, 야생형 벼에서 더 많이 감소하는 것이 확인되었다 (도 6C).
염 스트레스를 처리 후에 식물체의 표현형을 살펴본 결과, 도 6D에서 나타나는 것과 같이 야생형 벼의 잎은 완전히 고사된 것에 비해 형질전환 벼는 염 스트레스 처리 10일 후에도 건전한 상태를 유지하였다.
실시예 5. 농업 형질
야생형 벼와 OsMLD 유전자가 과발현된 형질전환 벼의 농업 형질을 조사한 결과, 포장에서 수량 및 수량 구성 요소가 야생형에 비해 증가하는 것이 확인되었다. 야생형 벼와 형질전환체 간에 초장 차이는 나타나지 않았으나, 형질전환 벼의 수장 및 등숙률이 증가하였으며, 수량, 분얼수 및 천립중 등 다양한 형질의 경우 형질전환체 간에 차이를 보이는 것으로 나타났다 (도 7).
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsMLD gene increasing tolerance to salt stress from rice and uses thereof <130> PN12212 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1287 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtcatcct ccttgcctat tctaccgaaa tctttgaaag atatcccaag atcccataat 60 acccagaata ttctgatgcc agggcaactg ccaaatgatt ctatgccttt gcaccagagt 120 gcaactcaat cttctatttc gcacccaaga gccagtgttg tcagatcatc atattcagca 180 atgttaggat atgctgctaa cccaattgat tctgtgtcta gccatgaggg gcattttatg 240 gctgctccct ttatttctca gtcgtcgaat gctgaaatgc tccagtattt atgtaataat 300 aatacccatg ggggacacac tgtgccaacc tttttcccag ctcctgcctg tggcgcgcca 360 gattacatgg atactataac tgtccctgat aatcacaccc agagcggctc ctctactgtt 420 acatctgatg ctgctaaaca aaatgaatgg tgggcagata taatgaatga tgactggaaa 480 gatattctag atgcaacagc tactgattct cagtcaaagt ccatggccca accttccaat 540 tctgctgcat cacagcctgc tttcaatcag tcaacttcat cccatagtgg cgatatttgt 600 cctgtcacaa gtcctcctcc caacaacagc aatgcctctg caagtaaaca acggatgaga 660 tggaccccgg aattgcatga atcttttgtc catgctgtaa ataagcttgg tggtagtgaa 720 aaagctactc caaaaggtgt gctcaagctt atgaaagttg atggtttgac aatctatcat 780 gttaagagtc atctgcagaa gtaccgcaca gctcgctaca agccagacct atcagaaggt 840 aaaacacaag aagggaaaac taccgatgag ttgtctttgg acctgaaagc gagcatggat 900 cttactgaag cactgcgcct tcagatggaa gttcagaagc gccttcatga acaactcgag 960 attcagagga aattgcagct tcgaattgaa gaacaaggga aatatctgca gaagatgttt 1020 gaaaagcaat gtaaatccag cacacagagt gtgcaggatc catcgtctgg agatacagca 1080 actccatctg agccaagcaa ttctgtagac aaggacagtg aggctgcctt ggacccaaac 1140 agaataggag acaaccaccc taaaaattct accaatgtag gtgccaacct gaaaactgca 1200 gcaaccgagt cccctgattc cccagtaatt gcaactgatg gatcggagct cccccaagag 1260 aagcgtcgta gagtgcatga atcttga 1287 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ccgctcgaga tgtcatcctc cttgcctatt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cggggtacct caagattcat gcactctacg 30 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tgaatgaact gcaggacgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aatatcacgg gtagccaacg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atgtcatcct ccttgcctat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tcaagattca tgcactctac g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tggcgatatt tgtcctgtca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 tcgctttcag gtccaaagac 20

Claims (8)

  1. 벼 (Oryza sativa) 유래의 OsMLD (Oryza sativa MYB-like domain) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 OsMLD 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMLD 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 벼 유래의 OsMLD 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  7. 제5항에 따른 식물체의 종자.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsMLD 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물.
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CN112225790A (zh) * 2020-10-14 2021-01-15 厦门大学 水稻抗盐胁迫相关基因onac103及编码蛋白与应用

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