KR102173875B1

KR102173875B1 - 식물의 제초제 저항성 증진용 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법

Info

Publication number: KR102173875B1
Application number: KR1020190021733A
Authority: KR
Inventors: 이옥란; 장진훈
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-11-04
Also published as: KR20200103363A

Abstract

본 발명은 식물의 제초제 저항성 증진용 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 식물체에서 PgCYP76B93 또는 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 과발현시키면 식물의 제초제 저항성을 증진시킬 수 있다.

Description

식물의 제초제 저항성 증진용 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법{Composition for enhancing herbicide resistance of plants and method for enhancing herbicide resistance of plants using the same}

본 발명은 식물의 제초제 저항성 증진용 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물체에서 PgCYP76B93 또는 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 과발현시킴으로써 식물의 페닐우레아 제초제에 대한 저항성을 증진시키는 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성 증진 방법에 관한 것이다.

식물 시토크롬(cytochrome) P450 효소(CYPs)는 일차 및 이차 대사에서 다양한 형태의 일산화탄소화/수산화 반응을 촉매하는 데 관여한다. 모든 알려진 CYP 효소의 3분의 1은 식물에서 유래한 것이며, 효소의 수는 알려진 식물 종의 총 수의 1%로 추정된다. 이것은 CYPs의 다양화가 육상 식물의 진화를 통한 새로운 대사 경로의 출현으로 이어진다는 것을 의미한다.

인삼(Panax ginseng Meyer)에서 새로 다양화된 종 특이적 2차 대사 경로는 진세노사이드(ginsenosides)라 하는 인삼 사포닌을 포함한다. 진세노사이드의 의약적 효능을 고려할 때, 인삼 식물에 대한 연구는 주로 진세노사이드 생합성에 중점을 두었다. 보고된 116개의 P450 유전자 중 두 개의 CYP 유전자가 담마레인(dammarane) 형태의 진세노사이드 생합성에 관여한다고 보고되었으며, β-아미린 28-옥시데이즈(β-amyrin 28-oxidase)라 불리는 하나의 CYP는 올레아난(oleanane) - 진세노사이드 생합성에 관여한다.

그러나 이차 대사에서 생리적인 역할 외에도 CYPs의 다른 중요한 특징은 제초제에 대한 해독 작용이다. 증가된 제초제 대사를 얻는 메커니즘은 아직 충분하게 증명되지 않았다. 인삼과 같은 다년생 식물은 수년에 걸쳐 제초제에 노출된다. 따라서 개념을 한 단계 더 발전시키면, 인삼의 다른 CYP 패밀리 구성원의 기능적 특성이 제초제 대사에 영향을 줄 수 있다.

제초제 저항성은 현대 농업에서 중요한 과제이다. 고등 식물에서 제초제 해독 유전자는 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈(glutathione S-transferase) 또는 글루코실트랜스퍼레이즈(glycosyl transferase) 및 시토크롬 P450 효소 패밀리(cytochrome P450 enzyme family)와 같은 복합 유전자(multigene) 계열의 진화를 통해 축적되어 왔다. CYP는 제초제를 포함한 생체 내 화학 물질의 산화 분해를 매개하는 가장 큰 계열의 효소이다. 식물성 P450이 제초제 모노루론(monuron)의 대사에 관여한다는 첫 증거는 1969 년 Frear에 의해 면화 모종의 미세소체 분획에서 보고되었다.

지금까지 여러 CYP 패밀리 구성원이 제초제 대사에 관여한다고 특징 지어졌다. CYP76B1은 예루살렘 아티초크(Helianthus tuberosus)로부터 분리되어 페닐우레아(phenylurea) 계열에 속하는 제초제를 대사하는 것으로 밝혀졌다. CYP71A10은 대두에서 분리되어 CYP76B1보다 10배는 덜 효율적이지만 효모에서 발현되어 페닐우레아 제초제인 클로르톨루론(chlortoluron)의 대사를 결정하였다. CYP76C1, CYP76C2 및 CYP76C4 유전자는 또한 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 제초제 내성에 대한 적절한 증거를 제공하였다.

본 연구에서는 인삼 유래 CYP 유전자를 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12으로 표기하였으며, 2년생 인삼 모종(plantlets)의 모든 기관에서 발현되었다. PgCYP76B93 및 PgCYP736A12을 과발현하는 모종은 대조군 모종에 비해 제초제 내성을 보였다. PgCYP76B93 및 PgCYP736A12은 그 확인된 기능으로 인해 농약 및 환경 오염 물질을 해독할 수 있는 다기능 작물의 유전 공학을 위한 선별 마커로 사용할 수 있다.

이에 본 발명자들은 인삼(Panax ginseng Meyer) 유래의 PgCYP76B93 또는 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 과발현시킨 결과 페닐우레아(phenylurea) 제초제에 대한 저항성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질 또는 상기 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제초제 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP736A12 단백질 또는 상기 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제초제 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물에서의 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 단백질의 제초제 저항성 증진 용도에 관한 것이다.

본 발명은 식물의 제초제 저항성 증진용 조성물 및 이를 이용한 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물체에서 PgCYP76B93 또는 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 과발현시킴으로써 식물의 페닐우레아 제초제에 대한 저항성을 증진시키는 조성물 및 이를 이용한 식물의 저항성 증진 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질 또는 상기 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제초제 저항성 증진용 조성물이다.

상기 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.

상기 제초제 저항성은 페닐우레아(phenylurea) 제초제에 대한 저항성인 것일 수 있고, 예를 들어, 클로로톨루론(chlorotoluron)에 대한 저항성인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP736A12 단백질 또는 상기 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제초제 저항성 증진용 조성물이다.

상기 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 또는 4로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.

"발현 벡터"는 목적단백질을 코딩하는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 상기 단백질을 코딩하는 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 염기서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

공지된 벡터로는 pBI121, pBIG, pOCA18, pJJ1881, pGreen 및 pCAMBIA가 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.

본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 제미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 또한 상기 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당 업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 또는 4로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체이다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법이다.

상기 조절 단계는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질 전환시켜 수행되는 것일 수 있다.

상기 조절 단계는 식물에 살리실산을 처리하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP736A12 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법이다.

상기 조절 단계는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질 전환시켜 수행되는 것일 수 있다.

도 1A는 인삼 유래 시토크롬 P450(cytochrome P450; 이하 CYP) 단백질 PgCYP76B93의 다른 CYP 계열 단백질과의 계통수를 나타낸 모식도이다.
도 1B는 PgCYP76B93과 다른 가장 가까운 동족체의 서열을 정렬한 결과이다.
도 1c는 인삼 유래 CYP 단백질 PgCYP736A12의 다른 CYP 계열 단백질과의 계통수를 나타낸 모식도이다.
도 1d는 PgCYP736A12와 다른 가장 가까운 동족체의 서열을 정렬한 결과이다.
도 2a는 2년생 인삼 작물에서의 부위별 PgCYP76B93의 mRNA 전사 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 2년생 인삼 작물에서의 부위별 PgCYP736A12의 mRNA 전사 수준을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 비생물적 스트레스에 대한 자극원에 따른 PgCYP76B93의 일시적인 유전자 발현 패턴 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 비생물적 스트레스에 대한 자극원에 따른 PgCYP736A12의 일시적인 유전자 발현 패턴 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 PgCYP76B93의 두 가지 형질전환 라인(#3, #9)의 제작을 확인한 그래프이다.
도 4a는 PgCYP736A12의 두 가지 형질전환 라인(#2, #3)의 제작을 확인한 그래프이다.
도 5a는 PgCYP76B93 유전자가 과발현된 애기장대에 3 uM의 클로로톨루론을 처리하였을 경우 제초제 내성이 나타나는 것을 확인한 사진이다.
도 5b는 PgCYP736A12 유전자가 과발현된 애기장대에 3 uM의 클로로톨루론을 처리하였을 경우 제초제 내성이 나타나는 것을 확인한 사진이다.
도 5c는 PgCYP76B93 유전자가 과발현된 애기장대에 4 uM 및 7 uM의 클로로톨루론을 처리하였을 경우 제초제 내성이 나타나는 것을 확인한 사진이다.
도 5d는 PgCYP736A12 유전자가 과발현된 애기장대에 4 uM의 클로로톨루론을 처리하였을 경우 제초제 내성이 나타나는 것을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: 유전자의 분리 및 동정

1-1. 인삼 PgCYP76B93 유전자의 분리 및 동정

시토크롬 P450(cytochrome P450; 이하 CYP) 패밀리(family) 유전자와 상동성이 있는 모든 CYP 유전자는 배아 발생 캘러스(embryogenic calli), 4년생 및 14년생의 뿌리, 잎, 새싹, 메틸 자스몬산(methyl jasmonic acid; 이하 MeJA)처리된 우발적 뿌리(adventitious roots)로 구성된 발현된 서열 태그(expressed sequence tag; EST) 라이브러리에서 유래하였다.

인삼 EST 클론은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 특수 시토크롬 P450 데이터베이스 (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)에 대하여 분석하였다. 아미노산 서열은 온라인 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 및 ProtParam 도구(https://web.expasy.org/protparam/)을 사용하여 분석하였다. 아미노산 서열은 BioEdit 프로그램(버전 7.1.9)을 사용하여 정렬되었다. 계통 발생 수는 MEGA6 (버전 6.06) 프로그램의 이웃-결합(neighbor-joining) 방법을 이용하였다.

CYP76B 패밀리와의 유사성을 나타내는 하나의 EST 클론을 추가로 선택하고 cDNA 단편 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR)의 신속한 증폭(rapid amplification of cDNA ends; RACE)으로 전체 길이 cDNA의 회수를 확인하였다. CYP 명명위원회와 상의한 후에 CYP76B의 전장 cDNA를 PgCYP76B93(P. ginseng의 CYP76B93)으로 다시 표시하였다.

서열번호	명칭	서열
1	PgCYP76B93의 아미노산 서열	MDILTMLFSLLFAFTIFKALIWLARFAGTKAKKLPPGPVPLPVIGNLHKLRRPPPQVPVHPGQNIRPNHTSKIGPHKYNSVISSSDTAKQVLQKQDLTFSTRSVPDALHVHNHFKYSVVWLPVASRWRSLRKIMNSNIFSGNKLDAGQHLRSKKVDELIGYCRRCSQTGEAVDMGQAVLRTSLNLLSNTILSKDLTDSYEDTGKEFKDLVWNIMVEAGKPNLVDFFPVLEKIDPQGIRRRMTLHFEKLLEMFSDLISERLELRKLGKSVGNGDVIDELLNISEENSDEIDRTHIEHMLMDLDEIDRTHIEHMLMDLFVAGTDTTSSSVEWAMAELLKNSEAMVKAKAELNQVIGKGKVVEEADVSQLPYLRSIVKETLRIHPPAPFLIPRKVEEETEVCGYTIPKGSQILVNAWAIGRDPVLWDNPLSFQPKRFLASEIDVKGRDFELIPFGAGRRICPGLPLAMRMVPMMLGSLLNLFDWKIEGGIAPKELDMEEKFGITLQKFHSLRAVPTPVMI
2	PgCYP76B93를 코딩하는 핵산 서열	ATGGATATCTTAACCATGCTATTCTCTCTATTGTTCGCGTTTACCATTTTCAAGGCTCTCATTTGGCTAGCCAGATTTGCAGGAACCAAAGCCAAGAAACTTCCACCGGGACCGGTCCCCTTACCGGTCATCGGGAACTTACACAAACTCCGGCGACCACCCCCACAAGTCCCTGTCCACCCTGGCCAAAATATACGGCCCAATCATACATCTAAAATTGGGCCGCATAAGTACAATAGTGTCATATCTTCATCTGACACAGCCAAACAAGTCCTCCAAAAGCAAGATCTGACTTTCTCTACCCGATCCGTGCCCGACGCTCTCCACGTCCACAACCACTTTAAATACTCCGTTGTTTGGTTACCAGTTGCCAGCCGGTGGAGAAGTCTCAGAAAAATAATGAATTCCAATATTTTTTCAGGTAACAAACTCGATGCAGGTCAACATTTACGGAGTAAGAAAGTGGATGAATTGATTGGATACTGTCGCAGGTGTAGCCAAACTGGTGAGGCCGTGGATATGGGCCAAGCTGTGTTAAGGACTTCTCTCAATCTTTTATCCAACACTATTTTATCGAAGGATTTGACGGACTCTTATGAGGATACGGGAAAAGAGTTCAAGGACTTGGTGTGGAATATTATGGTCGAGGCAGGTAAGCCTAATCTAGTCGATTTCTTTCCGGTACTTGAGAAAATCGACCCACAAGGAATAAGGAGACGAATGACTCTTCATTTTGAGAAGCTACTAGAGATGTTTAGTGACTTGATTAGCGAGCGACTAGAGTTGAGGAAGTTGGGCAAGTCTGTGGGGAATGGTGACGTGATTGATGAACTTCTCAATATCAGTGAAGAGAATTCCGATGAAATTGATAGAACACATATTGAACATATGCTCATGGATCTAGATGAAATTGATAGAACACATATTGAACATATGCTCATGGATCTATTCGTTGCGGGAACGGACACAACTTCAAGCTCAGTGGAATGGGCAATGGCGGAACTACTAAAAAATTCAGAGGCAATGGTGAAGGCTAAAGCTGAGCTCAACCAAGTGATTGGAAAAGGGAAGGTGGTAGAAGAGGCAGACGTATCTCAACTACCATACTTGCGATCTATAGTGAAAGAAACTTTAAGAATACATCCACCAGCTCCATTCTTAATTCCTCGCAAAGTAGAAGAGGAAACTGAAGTCTGCGGCTATACTATTCCAAAGGGATCACAAATTTTGGTTAATGCATGGGCAATCGGCCGTGATCCGGTTCTTTGGGACAACCCATTGTCATTTCAACCCAAGAGGTTCCTAGCTTCGGAAATTGATGTCAAAGGCCGAGATTTTGAGCTAATTCCATTTGGTGCGGGTCGAAGAATATGTCCCGGGTTGCCATTGGCAATGAGGATGGTGCCAATGATGTTGGGTTCGCTCTTAAATTTGTTTGATTGGAAAATTGAAGGTGGGATTGCACCAAAGGAGTTGGACATGGAGGAAAAGTTTGGGATCACTTTACAAAAGTTTCATTCCCTTCGTGCAGTACCAACTCCAGTTATGATTTAA

PgCYP76B93을 코딩하는 최초의 EST 클론은 MeJA로 처리한 우발적인 뿌리로부터 얻어졌으며, 이는 ELISA에 의해 유도될 수 있고 정상적인 조건에서는 약하게 발현된다. PgCYP76B93은 길이가 1551 bp이며 517 개의 아미노산이 생성된다. 식물의 특성화 된 CYP의 다른 아미노산 서열을 다양한 유전자 은행에서 수집하여 도 1a와 같이 계통수를 생성하는 데 사용하였다. 막대는 아미노산 위치 당 0.1 치환을 나타냈다.

도 1a에서 확인할 수 있듯이, PgCYP76B93은 테르페노이드 생합성과 관련된 CYP76B 패밀리 효소와 페닐우레아 제초제 저항성에 관여한다고 공지된 CYP76B와 CYP76C 패밀리 효소 사이에 모여 있다. CYP76 패밀리 효소의 A-타입 서브패밀리(subfamily)에 속하는 효소는 보다 멀리에 모여 있었고, 진세노사이드 생합성에 관여하는 3개의 인삼 CYP 효소는 훨씬 더 먼 곳에 모여 있었다. 이는 PgCYP76B93이 제초제 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

PgCYP76B93 효소는 ProtParam 프로그램을 사용한 결과 58,390 kDa의 분자량과 7.74의 등전점(Isoelectric point; 이하 pI)를 가질 것으로 예측되었다. CYP 패밀리 효소는 3차 구조와 효소 기능에 필요한 여러 보존된 영역을 제외하고는 아미노산 서열에서 낮은 유사성을 공유한다고 보고되었다. 가장 잘 보존된 모티프는 헴(heme) 결합 영역 FxxGxRxCxG(CxG 모티프로도 알려짐)이며, 여기서 C(cysteine; 이하 시스테인)는 헴 그룹에 결합한다.

ExxR과 PER 모티프는 E-R-R 트라이어드를 형성하고 헴 포켓의 구조를 잠그는 데 중요한 역할을 한다. CYP 계열에서 가장 보존된 아미노산은 ExxR 모티프의 글루타민산(glutamic acid; E)과 아르기닌(arginine; R)과 CxG 모티프의 시스테인이며 이 아미노산은 PgCYP76B93에서도 발견된다.

PgCYP76B93과 다른 가장 가까운 동족체의 서열을 정렬하였다. 검은색 상자는 동일한 잔기를 나타내며 유사한 잔기는 회색으로 음영 처리하였다. 네 개의 빨간색 박스 모티프는 산소 결합 도메인 (A/G)GX(D/E)T(T/S), K-나선 영역(EXXR), 도메인 C(PER) 및 헴 결합 영역(FXXGXRXCXG)이다. 상동성을 최대화하기 위해 갭을 삽입하였다.

도 1b에서 확인할 수 있듯이, 가장 보존되지 않은 모티프, (A/G Gx(D/E)T(T/S) (AGxDTT라고도 함)는 산소 결합 및 활성화에 기여한다. AGxDTT 모티프는 PgCYP76B93에서도 잘 보존되어 있지만 PER 모티프는 PKR 모티프로 대체된다.

1-2. 인삼 PgCYP736A12 유전자의 분리 및 동정

인삼(Panax ginseng Meyer, 'Chun-Poong')의 9개의 완전한 사이토크롬 P450 (CYP) 유전자 서열이 진세노사이드 생합성과 관련된 CYP 유전자를 확인하기 위해 공지된 바 있다. 그 중에서는 PgCYP736A12가 주요 진세노사이드 유도인자인 MeJA에 반응하지 않았다. 따라서 더 이상의 특성 분석을 위해 선택되지 않았다.

제초제 해독과 같은 생체 이물 대사가 P450 계열의 주요 표적 중 하나이기 때문에, 인삼 천풍 품종을 사용하여 상동성 기반 PCR 증폭에 의해 전장 cDNA를 얻었다.

서열번호	명칭	서열
3	PgCYP736A12의 아미노산 서열	MFPLAYPLLFVLLGALSWWILPIISPLKRHHKLPPGPRGLPIIGSLHTLGALPHRTLQTLAKKYGPIMSMRLGSVPTIVVSSPQAAELFLKTHDNIFASRPKLQAAEYMSYGTKGMSFTAYGPHWRNIRKFVVLELLTPAKINSFVGMRREELGMVVKSIKEASAANEVVDLSAKVANIIENMTYRLLLGRTKDDRYDLKGIMNEALTLAGRFNIADFVPFLGPLDIQGLTRQFKDTGKRLDKILEFIIDEHEQNSSNGNASGDFIDDMLSLKNKPSNTHDELSKVIDRSVIKAIMIDIISAAIDTSDTSIEWILTELIKHPRAMKKCQEEIDAVVGVDRMVEETDLPNLEYVYMVVKEGLRLHPVAPLLGPHESMEDITINGYFIPKQSRVIVNSWALGRDPNVWSEDADEFLPERFEGSNIDVRGRDFQLLPFGSGRRGCPGMQLGLITVQLVVARLVHCFDWNLPNGITPDNLDMTEKFGLTTPRVKHLLAVPKYRL
4	PgCYP736A12를 코딩하는 핵산 서열	ATGTTCCCCTTAGCATATCCCCTTCTTTTCGTCCTCCTTGGAGCTCTCTCATGGTGGATACTCCCCATCATATCTCCACTAAAACGCCACCATAAACTACCACCAGGTCCCCGAGGTTTACCAATTATCGGTAGCCTCCACACGCTAGGCGCCCTCCCCCACCGCACCTTGCAGACCCTAGCCAAAAAGTACGGTCCTATCATGTCCATGCGGCTAGGCTCTGTGCCAACTATTGTAGTCTCTTCACCTCAAGCTGCCGAGCTTTTCCTCAAGACTCATGACAATATTTTCGCTAGCCGCCCTAAGCTCCAAGCGGCAGAGTACATGTCCTATGGTACTAAGGGCATGTCCTTCACCGCATACGGTCCACATTGGCGCAACATAAGAAAATTTGTTGTGCTTGAACTTCTTACTCCTGCAAAAATTAATTCCTTTGTGGGGATGAGAAGGGAGGAGCTTGGCATGGTGGTGAAGAGTATTAAGGAAGCTTCGGCGGCGAATGAGGTGGTGGATCTTAGTGCAAAGGTGGCGAATATTATTGAGAACATGACTTATCGTTTACTTTTGGGACGCACAAAAGATGATAGGTATGATCTTAAGGGGATTATGAATGAGGCTTTGACTTTGGCTGGAAGGTTTAATATTGCAGACTTTGTACCCTTCCTAGGACCACTTGACATTCAGGGCTTGACTCGCCAGTTCAAGGATACCGGCAAGAGACTTGACAAAATCTTGGAGTTCATTATTGATGAGCATGAACAAAATTCAAGCAATGGAAATGCAAGCGGTGACTTTATTGATGATATGCTGTCGTTAAAGAATAAGCCTTCAAACACCCATGATGAGCTATCAAAAGTAATTGATAGATCAGTGATTAAAGCTATCATGATAGATATTATCTCTGCTGCTATTGATACTTCAGATACTTCAATTGAATGGATTTTAACAGAACTTATTAAACATCCAAGGGCCATGAAAAAGTGCCAAGAAGAGATAGATGCCGTTGTCGGAGTTGATCGAATGGTGGAGGAGACAGATTTGCCCAACTTAGAATATGTGTACATGGTGGTTAAGGAAGGTTTAAGGCTACACCCTGTTGCGCCATTACTGGGTCCTCACGAGTCTATGGAGGATATTACTATTAATGGATATTTTATACCTAAGCAGTCAAGAGTAATCGTAAATTCCTGGGCACTGGGACGAGATCCCAATGTGTGGTCTGAAGATGCTGACGAGTTTCTTCCAGAGAGGTTTGAAGGAAGCAATATAGATGTTCGTGGACGTGATTTCCAGCTCTTACCATTTGGATCAGGTAGAAGAGGATGTCCTGGAATGCAGCTAGGATTAATAACTGTTCAACTAGTGGTAGCTCGGTTGGTACATTGCTTTGACTGGAACCTACCTAATGGGATCACACCTGATAACTTGGATATGACTGAGAAATTTGGACTGACGACACCACGAGTCAAGCACTTGCTTGCCGTGCCTAAATATCGCCTTTGA

도 1c에서 확인할 수 있듯이, 새로 증폭된 PgCYP736A12(PgCYP736A12 New, 이하 PgCYP736A12)의 아미노산 서열은 공지된 서열(PgCYP736A12 Orig.)과 98.8%의 동일성 및 99.4%의 유사성을 보였으며, 여기서 3개의 아미노산이 변화되었다. PgCYP736A12의 전장 cDNA는 500 아미노산을 코딩하고 길이는 1,500 bp이다. PgCYP736A12 효소는 ProtParam 프로그램을 사용하여 56 kDa의 분자량과 7.23의 pI를 가질 것으로 예측된다.

도 1d에서 확인할 수 있듯이, 가장 잘 보존된 모티프는 도메인 C 및 헴 결합 영역이다. 시스테인이 헴 그룹에 결합하는 CxG 모티프로도 알려진 헴 결합 도메인 (FxxGxRxCxG)은 잘 보존되어 있다. ExxR(K-헬릭스 영역)과 C 도메인(PER)과 같은 두 가지 모티프는 E-R-R 트라이어드를 형성하고 헴 포켓의 구조를 잠그는 데 중요한 역할을 한다. 산소 결합 도메인으로도 알려진 마지막 보존 모티프 (A/G)Gx(D/E)T(T/S)는 PgCYP736A12에서 (A/G)Ax(D/E)T(T/S)로 변환된다. 밀접하게 관련된 여러 CYP도 G로부터 A로의 변환을 가지고 있다. 그러나 이들 모티프의 생화학적 중요성을 명확히 할 필요가 있다.

실시예 2: 2년생의 인삼 모종에서 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 의 전사 수준

인삼은 재배년수에 따라 다른 형태학적 및 해부학적 구조를 나타낸다. 2년 된 인삼은 5개의 잎을 가지고 있으며, 잎 및 줄기의 수는 도 2에서와 같이 재배년수에 따라 증가한다. PgCYP76B93 및 PgCYP736A12의 유전자 발현 양상을 알아보기 위해 완전히 발달된 해부학적 구조를 가진 2년생의 인삼 작물을 사용하였다.

인삼(Panax ginseng Meyer, 'Chun-Poong')은 본 연구에서 식물 재료로 사용되었다. 인삼 식물의 다른 장기를 얻기 위해 2년생의 인삼 뿌리를 25℃에서 16시간 명 / 8시간 암의 광주기로 토양에 심었다.

제조사의 지침에 따라 키트(RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. DNase I(Takara, Japan) 처리는 RNase 억제제 1 uL를 포함하는 100 uL 반응 부피에서 세척 단계 전에 1시간 동안 추가로 수행되었다. 추출된 RNA의 농도는 분광 광도계(Nano-MD UV-Vis, Scinco, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. cDNA의 첫 번째 가닥을 합성하기 위해, 총 RNA(최대 5 ug까지)를 역전사 효소(RevertAid, Thermo, USA)를 이용하여 역전사하였다. 실시간 PCR 시스템(Thermal Cycle Dice, Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 qPCR을 수행하였다.

PgCYP76B93에 대한 qPCR은 다음 열 순환 조건을 사용하여 20 uL 반응 부피에서 수행되었다: 95℃에서 30초 동안의 초기 변성, 이어서 95℃에서 5초 동안 및 60℃에서 30초 동안 40 사이클, 15초 동안 95℃, 30초 동안 60℃, 15초 동안 95℃에서 최종 해리 단계. qPCR의 끝에서 해리 곡선을 생성하여 부산물이 생성을 평가하였다.

PgCYP736A12에 대한 qPCR은 다음 열 순환 조건을 사용하여 20 uL 반응 부피에서 수행되었다: 95℃에서 30초 동안의 초기 변성, 이어서 95℃에서 5초 동안 및 50℃에서 30초 동안 40 사이클, 15초 동안 95℃, 30초 동안 60℃, 15초 동안 95℃에서 최종 해리 단계. qPCR의 끝에서 해리 곡선을 생성하여 부산물이 생성을 평가하였다.

모든 시료 중에서 유전자 발현 수준의 절대 배수 차이를 결정하기 위해, 각 시료의 역치 사이클(threshold cycle; Ct) 값은 β-액틴(actin)의 표준화 사이클 (Ct) 값으로 정규화되었으며, 2-^△△Ct 방법을 사용하여 상대적인 유전자 발현 수준을 계산하였다. 적어도 세 번의 독립적인 실험이 수행되었다. 전사된 mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 정량화되었고, 데이터는 세 번의 독립적인 반복을 통해 평균±표준편차로 표시하였다.

PgCYP76B93 및 PgCYP736A12의 유전자 특이적 프라이머 및 인삼 β-액틴(DC03005B05)의 대조군 프라이머의 핵산 서열은 하기 표 2와 같다.

서열번호	명칭	서열
5	PgCYP76B93 특이적 정방향 프라이머	CACAAGTCCCTGTCCACC
6	PgCYP76B93 특이적 역방향 프라이머	GTGGTTGTGGACGTGGAG
7	인삼 β-액틴 (DC03005B05)의 대조군 정방향 프라이머	AGAGATTCCGCTGTCCAGAA
8	인삼 β-액틴 (DC03005B05)의 대조군 역방향 프라이머	ATCAGCGATACCAGGGAACA
9	PgCYP736A12 특이적 정방향 프라이머	TCTTAGTGCAAAGGTGGCGA
10	PgCYP736A12 특이적 역방향 프라이머	TTGTCAAGTCTCTTGCCGGT

도 2a에서 확인할 수 있듯이, PgCYP76B93의 전사체 수준은 분석된 모든 기관에서 관찰되었으며 뿌리줄기(rhizome)와 낮은 뿌리(lower root)에서 가장 높았다. 전반적인 mRNA 수준은 극도로 낮았으며, PgCYP76B93이 본래 인삼의 MeJA 처리 뿌리에서 파생되었다는 개념을 뒷받침하였다. 이는 PgCYP76B93이 모든 2년생 개체의 기관에서 약하게 발현되고 MeJA와 같은 유도인자에 의해 유도될 수 있음을 나타낸다.

도 2b에서 확인할 수 있듯이, 나머지 조직과 비교하여 평균적으로 잎에서 3배 이상의 전사체 수준이 관찰되었다. 뿌리에서는 상부보다 하부에서 PgCYP736A12가 9배 더 높게 나타났다.

실시예 3: 비생물적 스트레스에 반응하는 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 의 전사체 수준

인삼은 다년생 한방 약초로 6년 동안 재배되는 천천히 자라는 식물로서, 여러가지 생물적 및 비생물적 스트레스 요인에 노출될 기회가 더 많다. 저항성 관련 유전자의 발현을 차별적으로 향상시킴으로써 다양한 환경적 스트레스 상황에 대응한다. 아브시스산(abscisic acid; ABA), 살리실산(salicylic acid; SA), 자스몬산(jasmonic acid; JA)와 같은 호르몬은 차별적으로 스트레스 관련 유전자의 발현을 활성화시킨다.

따라서, 4℃로의 냉각, 화학 물질 및 식물 호르몬에 대한 노출과 같은 몇 가지 비생물적 스트레스에 대한 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12의 기능을 확인하기 위해 H₂O₂(10 mM), NaCl(100 mM), ABA(100 uM), SA(5 mM) 및 JA(0.2 mM)를 처리하였을 경우에 대하여 qPCR로 분석하였다.

구체적으로, 3주 된 인삼 모종을 다양한 비생물적 스트레스 요인에 노출시켰다. 인삼 모종을 5 mM SA, 0.2 mM JA, 100 uM ABA, 10 mM H₂O₂ 및 100 mM NaCl을 각각 함유하는 60 mL 용액에 침지시켰다. ABA, SA, NaCl, H₂O₂의 용매로는 증류수, JA의 용매로는 메탄올을 사용하였다. 4℃에서 젖은 종이 타월에 뿌리를 두어 저온 스트레스를 유도하였다. 처리된 모종 및 그들의 대응 대조구를 상이한 시간 간격(0시간, 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 48시간)으로 수집하였다.

데이터는 세 번의 독립적인 반복을 통해 평균±표준편차로 표시하였다. 처리 된 시료에 대한 결과는 P <0.05(*) 및 P <0.01(**)에서 대조군과 유의하게 달랐다.

도 3a 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, JA, H₂O₂ 및 4℃ 처리한 경우 노출 시간이 증가함에 따라 PgCYP76B93 mRNA 발현 수준이 2 내지 3배까지 약간 증가하였다. NaCl을 처리한 경우 처리 후 48시간에 최대 48배까지 유의하게 증가하였다. 특히 SA를 처리한 경우 PgCYP76B93의 전사 수준이 처리 후 4시간에 10배, 12시간에 25배, 48시간 후에 162배로 극적으로 변화하였다. 그러나, ABA 처리는 PgCYP76B93의 전사 수준을 상당히 감소시켰다.

스트레스요인	0h	1h	4h	12h	24h	48h
JA	1.00	1.07	0.80	1.01	1.52	1.82
H₂O₂	1.00	0.87	1.97	2.28	2.67	2.18
ABA	1.00	0.14	0.10	0.29	0.15	0.18
4℃	1.00	1.81	2.37	2.26	3.26	3.15
NaCl	1.00	2.65	3.77	4.83	9.28	48.00
SA	1.00	0.27	10.53	24.95	28.84	162.00

식물 호르몬 SA 및 JA는 식물 방어 및 저항에 관련된 신호 전달 경로의 잘 알려진 길항적 핵심 구성 요소이다. 관찰된 자료에 의해 PgCYP76B93의 기능이 SA- 매개 비생물적 신호와 더욱 연관될 수 있음을 나타낸다.

도 3b 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 저온 스트레스는 처리 후 4 시간째에서만 발현을 감소시켰고 나머지 테스트 시점에서는 유의하지 않았다. 그러나 SA 처리 후 PgCYP736A12 mRNA는 처음에는 40% 감소했지만 처리 후 4, 12 및 24 시간에는 평균 1.7배 증가했다. SA 처리 후 48시간째에, PgCYP736A12의 전사체는 대조군보다 6.5배 더 높은, 가장 높은 발현 수준에 도달하였다. 종합하면, 다양한 스트레스에 대한 유전자 발현 연구는 PgCYP736A12가 SA 관련 신호 전달 경로에 관여할 수 있음을 나타낸다.

스트레스요인	0h	1h	4h	12h	24h	48h
ABA	1.00	0.87	0.73	1.84	2.87	2.01
4℃	1.00	0.55	0.48	0.67	0.81	1.08
H₂O₂	1.00	0.83	0.44	2.07	2.41	2.18
SA	1.00	0.66	2.01	1.78	1.24	6.50
JA	1.00	0.74	0.84	0.72	0.97	0.36
NaCl	1.00	1.07	1.11	1.85	2.46	2.20

실시예 4: PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 의 과발현 식물체 제작

식물의 성장 및 발달에서 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12의 기능적 특성을 이해하기 위해 전장 코딩 서열이 과발현된 이종 애기장대(Arabidopsis) 식물체를 제작하였다.

PgCYP76B93의 전장 cDNA(1,551 bp) 및 PgCYP736A12의 전장 cDNA(1,500 bp)는 애기장대 이종 시스템에서 기능적으로 특성화되도록 증폭되었다. CFP(Cyan Fluorescent Protein)코딩 서열을 SalI 및 EcoRI 부위에 삽입함으로써 변형된 구성요소인 35S 프로모터-구동 pCAMBIA1390 벡터를 사용하여 식물 내(in-planta) 유전자 전이를 수행하였다. PgCYP76B93 및 PgCYP736A12은 하기 표 6과 같이 제한 효소 부위(SalI 및 EcoRI)가 첨가된 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 정제된 PCR 산물을 pCAMBIA1390의 CFP 유전자 앞에 삽입하였다.

서열번호	명칭	서열
11	제한효소 부위 포함 PgCYP76B93 특이적 정방향 프라이머	AA GTC GAC ATG GATATC TTA ACC ATG(SalI 제한효소 부위를 밑줄로 표시)
12	제한효소 부위 포함 PgCYP76B93 특이적 역방향 프라이머	CG CAA TTG AAT CAT AAC TGG AGT TG(EcoRI 제한효소 부위를 밑줄로 표시)
13	제한효소 부위 포함 PgCYP736A12 특이적 정방향 프라이머	GC GTC GAC ATG TTC CCC TTA GCA TAT(SalI 제한효소 부위를 밑줄로 표시)
14	제한효소 부위 포함 PgCYP736A12 특이적 역방향 프라이머	CG GAA TTC AAG GCG ATA TTT AGG CAC(EcoRI 제한효소 부위를 밑줄로 표시)

16℃에서 하룻밤(overnight) 동안 연결을 수행하여. PgCYP76C9-연결 컨스트럭트는 서열 시퀀싱으로 확인하였고, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58C1(pMP90)을 사용하여 애기장대로 형질전환시켰다. 트랜스 제닉 형질전환체는 하이그로마이신 함유 배지(50 ug/mL)에서 선별되었으며, 15개 이상의 T1 독립적인 계통이 선택되었다. 동형 접합체 형질전환 라인은 인서트를 한 카피 담고 있으며 멘델(Mendelian) 분리 비율에 따라 추가로 특성화하였다. 추가 데이터 분석을 위해, Col-0 및 빈 벡터 라인을 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 과발현 라인의 대조군으로 사용하였다.

애기장대(Arabidopsis thaliana, 유전자형 Col-0)는 이종 시스템으로 사용되었다. 성숙한 애기장대 종자를 70%(v/v) 에탄올에서 5분 동안 표면 살균한 다음 멸균된 물로 3회 헹구었다. 애기장대의 종자를 0.5 g/L MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산, 1% 수크로스 및 0.8% 피토아가(phytoagar))를 함유하는 1/2 MS 배지 (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)에 뿌렸다. KOH를 사용하여 pH를 5.7로 조정하였다. 상기 종자가 뿌려진 페트리 플레이트를 2일 동안 저온 처리한 다음, 23℃의 성장 챔버에서 장일 광주기 조건 - 16시간 명 및 8시간 암 - 하에 배양하였다.

도 4a 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, 항생제가 함유된 배지에서 선별된 여러 가지 T1 형질 전환 라인 중 두 가지가 더 특징지어졌다. Col-0 및 빈 벡터 라인에서는 거의 발현이 없었고, PgCYP76B93의 두 가지 형질전환 라인(#3, #9)에서만 평균 3.2 또는 4배 과발현되었다.

	PgCYP76B93의 발현량
Col-0	0.009
Vector Cont.	0.011
PgCYP76B93-OE#3	3.160
PgCYP76B93-OE#9	4.120

도 4b 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, PgCYP736A12의 두 가지 형질전환 라인(#2, #3)은 2개 대조군에서 발현량이 거의 없는 것에 비하여 차등적인 이종 과발현을 나타내었다.

	PgCYP736A12의 발현량
Col-0	1.0
Vector Cont.	0.5
PgCYP736A12-OE#3	2321.0
PgCYP736A12-OE#9	107.0

실시예 5: PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 의 구성적 과발현으로 인한 제초제 저항성

PgCYP76B93 및 PgCYP736A12은 제초제 대사에 관여한다고 보고된 효소의 CYP76B 계열과 밀접하게 밀집되어 있다. 따라서, PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 과발현 라인은 페닐우레아(phenylurea) 제초제인 클로로톨루론(chlorotoluron)에 대한 내성을 나타내는 능력이 있는 것으로 평가되었다.

구체적으로, 표면 멸균된 PgCYP76B93 및 PgCYP736A12의 과발현 라인 종자를 클로로톨루론(CAS Registry No. 15545-48-9, Cayman, USA)을 함유한 1/2 MS 배지에 뿌렸다. 4℃에서 차가운 층화 2일 후, 모종은 23℃의 장시간 광주기 조건에서(16시간 명 / 8시간 암) 성장시켰다. 클로로톨루론을 예비 시험을 위해 다양한 농도로 배지에 첨가하였고, 저항성에서 명확한 차이를 보이는 생리적인 농도가 선택되었다.

도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 클로로톨루론의 3가지 최종 농도(0.5, 1 및 3 uM) 조건하에서 PgCYP76B93 과발현 라인 종자(#3, #9) 및 PgCYP736A12 과발현 라인 종자(#2, #3)의 발아를 분석한 결과, 3 uM의 클로로톨루론에 노출된 모종은 대조군 식물과 비교하여 명백한 클로로톨루론 저항성 표현형을 보였다.

도 5c 및 5d에서 확인할 수 있듯이, 이미 발아된 모종의 저항성을 평가하기 위해, PgCYP76B93 및 PgCYP736A12 과발현 라인(OE 라인)의 4일 된 모종을 클로로톨루론의 4 uM 및 7 uM의 상이한 농도 존재 및 부재하에 분석하였고, OE 라인에서는 육안으로 확인 가능한 성장 표현형이 나타났다(눈금 막대 = 1cm).

<110> Industry-University Cooperation Foundation Chonnam University <120> Composition for enhancing herbicide resistance of plants and method for enhancing herbicide resistance of plants using the same <130> PN180429 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 517 <212> PRT <213> Panax ginseng <400> 1 Met Asp Ile Leu Thr Met Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ala Phe Thr Ile 1 5 10 15 Phe Lys Ala Leu Ile Trp Leu Ala Arg Phe Ala Gly Thr Lys Ala Lys 20 25 30 Lys Leu Pro Pro Gly Pro Val Pro Leu Pro Val Ile Gly Asn Leu His 35 40 45 Lys Leu Arg Arg Pro Pro Pro Gln Val Pro Val His Pro Gly Gln Asn 50 55 60 Ile Arg Pro Asn His Thr Ser Lys Ile Gly Pro His Lys Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Val Ile Ser Ser Ser Asp Thr Ala Lys Gln Val Leu Gln Lys Gln Asp 85 90 95 Leu Thr Phe Ser Thr Arg Ser Val Pro Asp Ala Leu His Val His Asn 100 105 110 His Phe Lys Tyr Ser Val Val Trp Leu Pro Val Ala Ser Arg Trp Arg 115 120 125 Ser Leu Arg Lys Ile Met Asn Ser Asn Ile Phe Ser Gly Asn Lys Leu 130 135 140 Asp Ala Gly Gln His Leu Arg Ser Lys Lys Val Asp Glu Leu Ile Gly 145 150 155 160 Tyr Cys Arg Arg Cys Ser Gln Thr Gly Glu Ala Val Asp Met Gly Gln 165 170 175 Ala Val Leu Arg Thr Ser Leu Asn Leu Leu Ser Asn Thr Ile Leu Ser 180 185 190 Lys Asp Leu Thr Asp Ser Tyr Glu Asp Thr Gly Lys Glu Phe Lys Asp 195 200 205 Leu Val Trp Asn Ile Met Val Glu Ala Gly Lys Pro Asn Leu Val Asp 210 215 220 Phe Phe Pro Val Leu Glu Lys Ile Asp Pro Gln Gly Ile Arg Arg Arg 225 230 235 240 Met Thr Leu His Phe Glu Lys Leu Leu Glu Met Phe Ser Asp Leu Ile 245 250 255 Ser Glu Arg Leu Glu Leu Arg Lys Leu Gly Lys Ser Val Gly Asn Gly 260 265 270 Asp Val Ile Asp Glu Leu Leu Asn Ile Ser Glu Glu Asn Ser Asp Glu 275 280 285 Ile Asp Arg Thr His Ile Glu His Met Leu Met Asp Leu Asp Glu Ile 290 295 300 Asp Arg Thr His Ile Glu His Met Leu Met Asp Leu Phe Val Ala Gly 305 310 315 320 Thr Asp Thr Thr Ser Ser Ser Val Glu Trp Ala Met Ala Glu Leu Leu 325 330 335 Lys Asn Ser Glu Ala Met Val Lys Ala Lys Ala Glu Leu Asn Gln Val 340 345 350 Ile Gly Lys Gly Lys Val Val Glu Glu Ala Asp Val Ser Gln Leu Pro 355 360 365 Tyr Leu Arg Ser Ile Val Lys Glu Thr Leu Arg Ile His Pro Pro Ala 370 375 380 Pro Phe Leu Ile Pro Arg Lys Val Glu Glu Glu Thr Glu Val Cys Gly 385 390 395 400 Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Ser Gln Ile Leu Val Asn Ala Trp Ala Ile 405 410 415 Gly Arg Asp Pro Val Leu Trp Asp Asn Pro Leu Ser Phe Gln Pro Lys 420 425 430 Arg Phe Leu Ala Ser Glu Ile Asp Val Lys Gly Arg Asp Phe Glu Leu 435 440 445 Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Pro Leu Ala 450 455 460 Met Arg Met Val Pro Met Met Leu Gly Ser Leu Leu Asn Leu Phe Asp 465 470 475 480 Trp Lys Ile Glu Gly Gly Ile Ala Pro Lys Glu Leu Asp Met Glu Glu 485 490 495 Lys Phe Gly Ile Thr Leu Gln Lys Phe His Ser Leu Arg Ala Val Pro 500 505 510 Thr Pro Val Met Ile 515 <210> 2 <211> 1554 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 2 atggatatct taaccatgct attctctcta ttgttcgcgt ttaccatttt caaggctctc 60 atttggctag ccagatttgc aggaaccaaa gccaagaaac ttccaccggg accggtcccc 120 ttaccggtca tcgggaactt acacaaactc cggcgaccac ccccacaagt ccctgtccac 180 cctggccaaa atatacggcc caatcataca tctaaaattg ggccgcataa gtacaatagt 240 gtcatatctt catctgacac agccaaacaa gtcctccaaa agcaagatct gactttctct 300 acccgatccg tgcccgacgc tctccacgtc cacaaccact ttaaatactc cgttgtttgg 360 ttaccagttg ccagccggtg gagaagtctc agaaaaataa tgaattccaa tattttttca 420 ggtaacaaac tcgatgcagg tcaacattta cggagtaaga aagtggatga attgattgga 480 tactgtcgca ggtgtagcca aactggtgag gccgtggata tgggccaagc tgtgttaagg 540 acttctctca atcttttatc caacactatt ttatcgaagg atttgacgga ctcttatgag 600 gatacgggaa aagagttcaa ggacttggtg tggaatatta tggtcgaggc aggtaagcct 660 aatctagtcg atttctttcc ggtacttgag aaaatcgacc cacaaggaat aaggagacga 720 atgactcttc attttgagaa gctactagag atgtttagtg acttgattag cgagcgacta 780 gagttgagga agttgggcaa gtctgtgggg aatggtgacg tgattgatga acttctcaat 840 atcagtgaag agaattccga tgaaattgat agaacacata ttgaacatat gctcatggat 900 ctagatgaaa ttgatagaac acatattgaa catatgctca tggatctatt cgttgcggga 960 acggacacaa cttcaagctc agtggaatgg gcaatggcgg aactactaaa aaattcagag 1020 gcaatggtga aggctaaagc tgagctcaac caagtgattg gaaaagggaa ggtggtagaa 1080 gaggcagacg tatctcaact accatacttg cgatctatag tgaaagaaac tttaagaata 1140 catccaccag ctccattctt aattcctcgc aaagtagaag aggaaactga agtctgcggc 1200 tatactattc caaagggatc acaaattttg gttaatgcat gggcaatcgg ccgtgatccg 1260 gttctttggg acaacccatt gtcatttcaa cccaagaggt tcctagcttc ggaaattgat 1320 gtcaaaggcc gagattttga gctaattcca tttggtgcgg gtcgaagaat atgtcccggg 1380 ttgccattgg caatgaggat ggtgccaatg atgttgggtt cgctcttaaa tttgtttgat 1440 tggaaaattg aaggtgggat tgcaccaaag gagttggaca tggaggaaaa gtttgggatc 1500 actttacaaa agtttcattc ccttcgtgca gtaccaactc cagttatgat ttaa 1554 <210> 3 <211> 500 <212> PRT <213> Panax ginseng <400> 3 Met Phe Pro Leu Ala Tyr Pro Leu Leu Phe Val Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Trp Trp Ile Leu Pro Ile Ile Ser Pro Leu Lys Arg His His Lys 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Ile Ile Gly Ser Leu His Thr 35 40 45 Leu Gly Ala Leu Pro His Arg Thr Leu Gln Thr Leu Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Pro Ile Met Ser Met Arg Leu Gly Ser Val Pro Thr Ile Val Val 65 70 75 80 Ser Ser Pro Gln Ala Ala Glu Leu Phe Leu Lys Thr His Asp Asn Ile 85 90 95 Phe Ala Ser Arg Pro Lys Leu Gln Ala Ala Glu Tyr Met Ser Tyr Gly 100 105 110 Thr Lys Gly Met Ser Phe Thr Ala Tyr Gly Pro His Trp Arg Asn Ile 115 120 125 Arg Lys Phe Val Val Leu Glu Leu Leu Thr Pro Ala Lys Ile Asn Ser 130 135 140 Phe Val Gly Met Arg Arg Glu Glu Leu Gly Met Val Val Lys Ser Ile 145 150 155 160 Lys Glu Ala Ser Ala Ala Asn Glu Val Val Asp Leu Ser Ala Lys Val 165 170 175 Ala Asn Ile Ile Glu Asn Met Thr Tyr Arg Leu Leu Leu Gly Arg Thr 180 185 190 Lys Asp Asp Arg Tyr Asp Leu Lys Gly Ile Met Asn Glu Ala Leu Thr 195 200 205 Leu Ala Gly Arg Phe Asn Ile Ala Asp Phe Val Pro Phe Leu Gly Pro 210 215 220 Leu Asp Ile Gln Gly Leu Thr Arg Gln Phe Lys Asp Thr Gly Lys Arg 225 230 235 240 Leu Asp Lys Ile Leu Glu Phe Ile Ile Asp Glu His Glu Gln Asn Ser 245 250 255 Ser Asn Gly Asn Ala Ser Gly Asp Phe Ile Asp Asp Met Leu Ser Leu 260 265 270 Lys Asn Lys Pro Ser Asn Thr His Asp Glu Leu Ser Lys Val Ile Asp 275 280 285 Arg Ser Val Ile Lys Ala Ile Met Ile Asp Ile Ile Ser Ala Ala Ile 290 295 300 Asp Thr Ser Asp Thr Ser Ile Glu Trp Ile Leu Thr Glu Leu Ile Lys 305 310 315 320 His Pro Arg Ala Met Lys Lys Cys Gln Glu Glu Ile Asp Ala Val Val 325 330 335 Gly Val Asp Arg Met Val Glu Glu Thr Asp Leu Pro Asn Leu Glu Tyr 340 345 350 Val Tyr Met Val Val Lys Glu Gly Leu Arg Leu His Pro Val Ala Pro 355 360 365 Leu Leu Gly Pro His Glu Ser Met Glu Asp Ile Thr Ile Asn Gly Tyr 370 375 380 Phe Ile Pro Lys Gln Ser Arg Val Ile Val Asn Ser Trp Ala Leu Gly 385 390 395 400 Arg Asp Pro Asn Val Trp Ser Glu Asp Ala Asp Glu Phe Leu Pro Glu 405 410 415 Arg Phe Glu Gly Ser Asn Ile Asp Val Arg Gly Arg Asp Phe Gln Leu 420 425 430 Leu Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Gln Leu Gly 435 440 445 Leu Ile Thr Val Gln Leu Val Val Ala Arg Leu Val His Cys Phe Asp 450 455 460 Trp Asn Leu Pro Asn Gly Ile Thr Pro Asp Asn Leu Asp Met Thr Glu 465 470 475 480 Lys Phe Gly Leu Thr Thr Pro Arg Val Lys His Leu Leu Ala Val Pro 485 490 495 Lys Tyr Arg Leu 500 <210> 4 <211> 1503 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 4 atgttcccct tagcatatcc ccttcttttc gtcctccttg gagctctctc atggtggata 60 ctccccatca tatctccact aaaacgccac cataaactac caccaggtcc ccgaggttta 120 ccaattatcg gtagcctcca cacgctaggc gccctccccc accgcacctt gcagacccta 180 gccaaaaagt acggtcctat catgtccatg cggctaggct ctgtgccaac tattgtagtc 240 tcttcacctc aagctgccga gcttttcctc aagactcatg acaatatttt cgctagccgc 300 cctaagctcc aagcggcaga gtacatgtcc tatggtacta agggcatgtc cttcaccgca 360 tacggtccac attggcgcaa cataagaaaa tttgttgtgc ttgaacttct tactcctgca 420 aaaattaatt cctttgtggg gatgagaagg gaggagcttg gcatggtggt gaagagtatt 480 aaggaagctt cggcggcgaa tgaggtggtg gatcttagtg caaaggtggc gaatattatt 540 gagaacatga cttatcgttt acttttggga cgcacaaaag atgataggta tgatcttaag 600 gggattatga atgaggcttt gactttggct ggaaggttta atattgcaga ctttgtaccc 660 ttcctaggac cacttgacat tcagggcttg actcgccagt tcaaggatac cggcaagaga 720 cttgacaaaa tcttggagtt cattattgat gagcatgaac aaaattcaag caatggaaat 780 gcaagcggtg actttattga tgatatgctg tcgttaaaga ataagccttc aaacacccat 840 gatgagctat caaaagtaat tgatagatca gtgattaaag ctatcatgat agatattatc 900 tctgctgcta ttgatacttc agatacttca attgaatgga ttttaacaga acttattaaa 960 catccaaggg ccatgaaaaa gtgccaagaa gagatagatg ccgttgtcgg agttgatcga 1020 atggtggagg agacagattt gcccaactta gaatatgtgt acatggtggt taaggaaggt 1080 ttaaggctac accctgttgc gccattactg ggtcctcacg agtctatgga ggatattact 1140 attaatggat attttatacc taagcagtca agagtaatcg taaattcctg ggcactggga 1200 cgagatccca atgtgtggtc tgaagatgct gacgagtttc ttccagagag gtttgaagga 1260 agcaatatag atgttcgtgg acgtgatttc cagctcttac catttggatc aggtagaaga 1320 ggatgtcctg gaatgcagct aggattaata actgttcaac tagtggtagc tcggttggta 1380 cattgctttg actggaacct acctaatggg atcacacctg ataacttgga tatgactgag 1440 aaatttggac tgacgacacc acgagtcaag cacttgcttg ccgtgcctaa atatcgcctt 1500 tga 1503 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP76B93 forward primer <400> 5 cacaagtccc tgtccacc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP76B93 reverse primer <400> 6 gtggttgtgg acgtggag 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panax ginseng beta actin forward primer <400> 7 agagattccg ctgtccagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panax ginseng beta actin reverse primer <400> 8 agagattccg ctgtccagaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP736A12 forward primer <400> 9 tcttagtgca aaggtggcga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP736A12 reverse primer <400> 10 ttgtcaagtc tcttgccggt 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP76B93 forward primer <400> 11 aagtcgacat ggatatctta accatg 26 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP76B93 reverse primer <400> 12 cgcaattgaa tcataactgg agttg 25 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP736A12 forward primer <400> 13 gcgtcgacat gttcccctta gcatat 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgCYP736A12 reverse primer <400> 14 cggaattcaa ggcgatattt aggcac 26

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질 또는 상기 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제초제 저항성 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 것인, 제초제 저항성 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제초제 저항성은 페닐우레아(phenylurea) 제초제에 대한 저항성인 것인, 제초제 저항성 증진용 조성물.
삭제
삭제
삭제
서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PgCYP76B93 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 조절 단계는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질 전환시켜 수행되는 것인, 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 조절 단계는 식물에 살리실산을 처리하여 수행되는 것인, 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 제초제 저항성은 페닐우레아(phenylurea) 제초제에 대한 저항성인 것인, 식물의 제초제 저항성을 증진시키는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제