KR100827348B1 - 비생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 ＣａＡＢＳ1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 CaABS1에 대한 것으로, 구체적으로 건조 스트레스 또는 고염 스트레스에 내성을 유도하는 신규한 고추 유전자 CaABS1에 관한 것이다. CaABS1는 고추 식물체에 건조 스트레스를 가했을 때 과발현되며, CaABS1를 도입한 형질전환 식물체는 내건성 및 내염성을 획득하였음으로, 비생물적 스트레스에 대한 내성을 획득한 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

CaABS1, 식물체 내건성, 식물체 내염성, 고추, 담배, 비생물적 스트레스.

Description

비생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 ＣａＡＢＳ1{A red pepper gene CaABS1 confers abiotic stress-tolerance to plants}

도 1은 서열번호 2로 기재되는 CaABS1을 포함하는 플라스미드 벡터 pBluescript Ⅱ SK(+)/CaABS1 벡터의 유전자 지도이다.

도 2는 고추 식물체에 건조 스트레스를 가한 후, CaABS1 유전자 발현 양상을 RNA 블롯을 통해 확인한 결과이다.

도 3은 본 발명의 비생물적 스트레스 내성 유도 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열이다.

도 4A는 CaABS1 유전자를 식물체에서 발현시키기 위해 사용된 식물 발현 벡터 pBKS1-1/CaABS1의 유전자 지도이다.

도 4B는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBKS1-1/CaABS1가 도입되어 형질전환된 담배 식물체에서 CaABS1이 발현됨을 확인하는 RNA 블롯 분석 결과이다.

도 5는 본 발명의 pBKS1-1/CaABS1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 건조 스트레스를 가한 후 비교한 생체 실험 결과이다.

도 6은 본 발명의 pBKS1-1/CaABS1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 고염 스트레스를 가한 후 비교한 생 체 실험 결과이다.

도 7은 본 발명의 pBKS1-1/CaABS1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 건조 및 고염 스트레스를 가한 후 무게를 비교한 그래프이다.

본 발명은 생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 CaABS1에 대한 것으로, 구체적으로 건조 스트레스 또는 고염 스트레스에 내성을 유도하는 신규한 고추 유전자 CaABS1에 관한 것이다.

식물은 건조, 고염도, 저온 등의 다양한 비생물적 환경 스트레스에 항시 노출되어 있다. 따라서 식물체의 일생은 비생물적 환경 스트레스에 대한 반응 및 적응 과정의 연속이라 해도 과언은 아니다. 비생물적 스트레스 중에서도 건조 스트레스와 저온 또는 고온에 의한 온도 스트레스는 특히 많은 피해를 식물체에 입히는 것으로 보고되어 있다(Boyer, 1982; Science 218: 443-448).

건조 스트레스 하의 식물은 다양한 생화학적 및 생리학적 반응 및 적응 과정을 나타낸다. 식물체가 건조 스트레스에 얼마나 효율적으로 반응하고 적응할 수 있느냐는 식물체가 건조 스트레스를 얼마나 잘 이겨낼 수 있는가를 결정하는 요소 이다. 스트레스 호르몬으로 잘 알려진 ABA(abscisic acid)는 건조 스트레스에 놓인 식물체에서 생성되어 식물체의 내건성에 관여함이 확인되어(Ingram and Bartels, Plant Physiol . Plant Mol . Biol. 47:377-403, 1996), ABA와 연관된 식물체의 건조 스트레스에 대한 반응 및 적응 과정에 대한 연구에 많은 진척을 이루었다. 이러한 과정에서 건조 스트레스에 의하여 특징적으로 발현이 유도되는 다수의 유전자들이 애기장대를 위시하여 여러 식물체로부터 클로닝되어 보고되고 있다(Fujita et al ., Curr . Opinion Plant Biol . 9:436-442, 2006; Mitler, Trends Plant Sci . 11: 15-19, 2006). 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질들은 하기와 같이 두개의 그룹으로 구분되어 지기도 한다. 첫 번째 그룹은 건조 스트레스와 관련하여 직접 기능을 하는 단백질군들로서 ① 내삼투압성(osmoprotectant: sugar, proline, betaine 등) 합성 대사경로(pathway)의 효소들; ② 다른 화합물을 보호하거나 생체막을 보호하는 단백질군(LEA, osmotin, chaperone 등); ③ 단백질의 재활용을 촉진하는 단백질 분해효소군(thio protease, Clp protease, ubiquitin); ④ 건조 스트레스 하의 식물체에서 생성되는 활성산소를 제거하는 단백질군(glutathione S-transferase, soluble epoxide hydrolase, catalase, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase 등) 및 ⑤ 물의 이동을 조절하는 포린(porin) 등의 수분 전달 통로 단백질(water channel protein)이 포함된다. 두 번째 그룹은 직접 건조 스트레스와의 반응 및 적응에는 관여하지 않으나 유전자 발현 조절이나 신호 전달을 주관함으로써 건조 스트레스에 대한 반응 및 적응을 주도하는 단백질군이다.

(1) 건조 스트레스와 관련하여 직접 기능을 하는 단백질군들: 건조 스트레스 하의 식물체는 다량의 수분을 잃게 되고, 그 결과로 세포질 내의 밀도를 대폭 증가시키는 결과를 가져온다. 이로 인하여 단백질 간의 접촉과 세포막 간의 접촉 빈도가 증가하게 되어 단백질과 세포막의 변성을 유발하게 된다. 식물체는 이에 대한 적응 메커니즘을 진화의 결과로 가지게 되었으며, 그 중에는 프롤린(proline), 글루탐산(glutamate), 글리신-베타인(glycine-betaine), 카르니틴(carnitine), 만니톨(mannitol), 소비톨(sorbitol), 프락탄(fructan), 폴리올(polyol), 트레할로스(trehalose), 수크로스(sucrose), 올리고사카라이드(oligosaccharide) 등을 건조 스트레스에 반응하여 다량 생성함으로써 세포질 내의 수분 장력(water potential)을 조정하는 것이 포함된다. 또한 대부분의 식물체는 건조 스트레스를 장기간 겪게 되면 일군의 단백질들(LEA, heat-shock protein 등)을 새로이 생성하며 이들 단백질은 세포의 구조와 기능을 보호하는 역할을 할 것으로 예측된다.

건조 스트레스 하에서, 식물체 내에서는 활성산소(reactive oxygen species: ROS)의 생성양이 대폭 증가함이 확인되었으며 활성산소는 매우 활성이 강해 세포의 많은 고분자 물질과 세포막의 파괴를 가져온다. 식물체는 활성산소를 제거하는 기능을 하는 APX(ascorbate peroxidase), 카탈라제(catalase), 글루타치온 환원요소(glutathione reductase) 및 SOD(superoxide dismutase) 등을 가지고 있으며, 이들은 건조 스트레스 내성에 간접적으로 커다란 영향을 미친다.

다양한 세포막에 존재하며 세포막을 통한 물의 이동을 조절하는 수분 전달 통로 단백질에 대한 연구도 내건성과 관련하여 관심의 대상이 되고 있다. 애기장 대(Arabidopsis thaliana)의 유전체 염기서열 분석 결과, 30여 개의 수분 전달 통로 단백질 유전자가 애기장대에 존재함이 보고되었다. 그 중 일부는 건조 스트레스에 의해 발현이 증가하는 등 건조 스트레스의 내성과 연관성을 나타내는 지표로서 확인되고 있다. 그러나 수분 전달 통로 단백질을 과발현시킨 담배의 경우 내건성의 증진이 확인되지 않아 보다 다양한 수분 전달 통로 단백질에 대한 분석이 요구되고 있다(Aharon et al., Plant Cell 15:439-447, 2003).

(2) 건조 스트레스와 관련하여 기능하는 전사 조절인자와 신호 전달 대사경로 구성요소(signal transduction pathway component): 애기장대 연구 결과, 건조 스트레스와 관련하여 적어도 4개의 신호 전달 대사경로의 존재 가능성이 언급되고 있다. 이 중 2개는 ABA-의존(dependent)으로 분석되었으며, 나머지 2개는 ABA-비의존(independent)인 것으로 분석되고 있다(Shinozaki et al ., Curr. Opin . Plant Biol . 6: 410-417, 2003). 건조 스트레스에 의해 발현이 시작되거나 증가하는 유전자의 프로모터(promoter) 부위를 분석한 결과, 여러 개의 시스-작용 요소(cis-acting element) 또는 트랜스-작용 요소(trans-acting element)들이 확인되었다. 이 중 ABA-의존 신호 전달 대사경로의 경우, 대개의 프로모터 부위에서 ABRE(ABA-responsive element, PyACGTGGC)가 확인되고 있다. 또한 ABRE에 결합하는 전사인자(transcription factor)가 분석되어 bZIP(basic domain/leucine zipper) 단백질임이 확인되었다(Immink and Angenent, 2002. Trends in Plant Science 7: 531-534).

ABA-비의존 신호 전달 대사경로의 경우, 9 bp의 잘 보존된 DRE (dehydration-response element, TACCGACAT)가 확인되고 있으며, EREBP/AP2 DNA-결합 도메인(binding domain)을 가지고 있는 DREB 결합 단백질이 확인되었다(Shinozaki et al ., Curr . Opin . Plant Biol . 6:410-417, 2003).

(3) 건조 스트레스와 관련한 신호 전달 대사경로 구성요소: 잘 알려진 신호 전달 대사경로의 구성요소들이 건조 스트레스에 의해 발현이 시작되거나 상승됨이 확인되었다. 칼모둘린(Calmodulin), G-단백질(G-protein), 단백질 키나제(protein kinase), 포스포리파제 C(phospholipase) C 등이 건조 스트레스에 의해 발현이 시작되거나 증가함이 여러 경우에서 확인되고 있다(Frank et al ., Plant Cell 12:111-123, 2000). 그러나 신호 전달 대사 경로 구성요소의 건조 스트레스에서의 역할에 대해서는 직접적인 연구 결과는 미비한 상태라 하겠다.

(4) 형질전환 조사(Transgenic approach)를 이용한 건조 스트레스에 대한 연구: 건조 스트레스에 대한 분자생물학적 접근은 자연적으로 내건성 작물의 개발 가능성을 확인하는 방향으로 연구가 진행하게 하였다. 건조 스트레스에 특징적으로 발현되는 유전자가 35S 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터(35S cauliflower mosaic virus promoter) 또는 시스-작용 요소(DRE, ABRE)에 접합되어 애기장대나 담배, 벼 등에 도입되었다. 그 결과, 대개의 경우는 내건성 증진이 뚜렷하게 관찰되지 않아 전사 인자가 제대로 기능을 하지 않거나 전사 인자에 턴-온(turn on)되는 다운스트림 유전자(downstream gene)가 너무 많은 관계로 내건성의 증진이 뚜렷이 나타나지 않는다. 그러나 국내 금호생명환경과학연구소의 김수영 박사팀에서 수행한 연구결과는 뚜렷한 내건성의 증진을 보여주고 있어 앞으로 연구의 진척이 크게 기대된다(Kang et al., Plant Cell 14:343-357, 2002).

이러한 연구과정에서 확인된 중요한 사실은 다양한 비생물적 스트레스에 대한 식물체의 반응 및 적응 과정이 상당 부분 상호 연계되어 있다는 것이다. 비생물적 스트레스의 인지 단계는 차별적이겠으나 비생물적 스트레스를 인지한 후, 식물체 내에서 일어나는 신호 전달 과정과 이에 따른 식물체의 반응 과정은 비생물적 스트레스 간에 동일한 요소들이 상당수 참여함이 확인되고 있다. 즉, 비생물적 스트레스에 따라 차별적인 신호 전달 과정과 식물체의 반응과정이 있고, 반면에 다양한 비생물적 스트레스 간에 신호 전달 과정과 식물체의 반응 과정에 있어 공통적인 요소도 많음이 확인되었다(Fujita et al ., Curr . Opinion Plant Biol. 12:111-123, 2006; Mitler, Trends Plant Sci . 11:15-19, 2006; Sakuma et al ., Plant Cell 18:1292-1309, 2006).

이에, 본 발명자들은 고추 식물체에 건조 스트레스를 주어 발현이 증가하는 신규 유전자를 선별하였고, 상기 신규 유전자를 도입하여 형질전환된 담배 식물체가 내건성 및 내염성을 획득함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고추에서 유래한 신규 비생물적 스트레스 내성 유전자인 CaABS1의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 CaABS1 유전자가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비생물적 스트레스 내성 단백질을 구성하는 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주에 도입하여 제조한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 비생물적 스트레스 내성 유도 후보 유전자 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 비생물적 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 식물체에 비생물적 스트레스 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 얻기 위하여, 먼저 고추에 건조 스트레스를 가하고 RNA를 추출하여 cDNA 라이브러리(library)를 제작하였다. 제작된 cDNA 라이브러리로부터 건조 스트레스에서 발현양이 증가하거나 특징적으로 발현된 cDNA 클론을 차별화 스크리닝(differential screening) 기법을 활용하여 선별하고 “CaABS1”이라 명명하였 다(도 1 참조). 선별된 cDNA 클론으로부터 플라스미드 DNA를 수거하여 건조 스트레스가 가해진 고추에 대한 RNA 블롯 분석을 수행하여 선별된 cDNA 클론이 고추에서 건조 스트레스에 의해 발현양이 증가함을 확인하였다(도 2 참조). RNA 블롯 분석으로 고추에서 건조 스트레스에 의해 발현이 증가됨이 확인된 cDNA 클론은 염기서열(서열번호 2)을 결정하였으며, 이로부터 가능한 ORF(open reading frame)를 결정하였다(도 3 참조). 결정된 ORF 주위의 염기서열을 따라 합성된 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 ORF만을 분리했고, 이를 식물체 형질전환벡터인 pBKS1-1(Suh et al., Mol.Cells 4:211-129, 1994)의 CaMV35S 프로모터(promoter) 다음의 BamHI 제한효소 위치에 삽입하였다(도 4A 참조). 목표한 ORF(단백질 기록부위)가 올바로 형질전환벡터에 삽입되었는지의 확인은 재조합된 형질전환벡터의 염기서열을 결정함으로써 이루어졌다. 그 결과, 목표한 ORF는 발현벡터에 포함된 CaMV35S 프로모터(promoter)와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위(terminator) 사이에 센스(sense) 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다(도 4B 참조). 상기 벡터가 형질도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 2006년 11월 17일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 내 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 11031BP).

본 발명자들은 분리된 유전자가 식물체에서 비생물적 스트레스 내성을 증진시킬 수 있음을 확인하기 위하여 분리된 ORF가 삽입된 상기 재조합 형질전환벡터를 담배에 형질전환시켜 담배의 비생물적 스트레스 내성 증진여부를 확인하는 생체분석(gain of function형 분석)을 수행하였다. 목표한 ORF가 도입되어 형질전환된 담배 식물체에 대한 비생물적 스트레스에 대한 내성 분석은 형질전환된 어린 담배식물체를 물로 세척하고 페트리 디쉬 내에 소량의 증류수가 적셔진 여과지 위에 놓고 방치하거나 400 mM NaCl 용액에 담금으로써 건조 스트레스와 고염 스트레스를 가하였고, 일정 시간 방치 후 생체량을 측정함으로써 이들 비생물적 스트레스에 대한 내성을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 CaABS1 유전자가 도입된 담배 형질전환체는 내건성과 내염성을 획득하였음을 확인할 수 있었다(도 5 내지 7 참조).

이후, 본 발명의 CaABS1 유전자가 도입되어 형질전환된 담배 식물체에서 특징적으로 발현이 유도되는 유전자군을 분석하기 위해 마이크로어레이 분석법을 사용하였다. CaABS1 유전자가 형질도입된 담배 식물체와 공벡터만이 형질전환된 담배 식물체로부터 각각 RNA를 추출하고 이로부터 cDNA를 합성하여 Arabidopsis 27k 70-mer oligonucleotide chip(GreenGene, 대한민국)을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 평균 2배 이상의 발현양이 증가한 183종의 유전자를 선별하였다(표 1 참조).

본 발명은 비생물적 스트레스 내성 단백질을 구성하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 하기의 폴리펩티드를 제공한다: (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열번호 1과 70% 이상 상동성을 가지며, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드; 및 (c) 서열번 호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지며, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 폴리펩티드.

상기 폴리펩티드는 고추 식물체로부터 유래되는 것이 바람직하다. 또한 상기 비생물적 스트레스는 건조 또는 고염 스트레스인 것이 바람직하다.

상기 (b)의 폴리펩티드는 70% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 바람직하며, 80% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 더욱 바람직하며, 90% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이하의 상동성을 가지나 (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 기능을 가지는 폴리펩티드라면 본 발명의 폴리펩티드에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 폴리뉴클레오티드를 제공한다: (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 2로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 서열번호 1로 기재되는 아미노산서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지며, (a)의 폴리뉴클레오티드와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

상기 폴리뉴클레오티드는 고추 식물체로부터 유래되는 것이 바람직하다. 또한 상기 비생물적 스트레스는 건조 또는 고염 스트레스인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 발현벡터에 포함되는 유전자는 본 발명의 CaABS1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 상기 유전자를 삽입하기 위하여 사용되는 벡터로는 pKBS1-1 벡터, pBI102 벡터, pCAMBIA 벡터 중 어느 하나를 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 일반적인 식물 형질전환용 발현벡터라면 어느 것을 이용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주에 도입하여 제조한 형질전환체를 제공한다.

상기 숙주는 대장균, 바실러스 등의 원핵세포, 효모, 곤충세포, 식물세포, 동물세포 등의 진핵 생물세포, 식물체 또는 인간을 제외한 동물체인 것이 바람직하다. 식물체로는 가지과인 것이 바람직하다. 상기 가지과로는 고추, 단고추, 담배, 토마토, 방울토마토, 가지, 감자, 구기자, 꽈리, 페튜니아인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 비생물적 스트레스 내성 유도 후보 유전자 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다: 1) 상기 형질전환체에 비생물적 스트레스를 가하는 단계; 2) 단계 1)의 형질전환체 상의 유전자 발현 변화를 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 유전자 발현 변화를 비생물적 스트레 스를 가하지 않은 형질전환체의 발현 변화를 비교하여 후보 유전자를 선별하는 단계.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 측정 방법은 RT-PCR 또는 마이크로어레이 방법을 이용한 대량 검색 방법(highthroughput screening)인 것이 바람직하며, 당해업계의 당업자에게 대량으로 유전자 발현 변화를 조사할 수 있는 방법이라면 어느 것을 이용하여도 무방하다. 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 선별한 유전자는 식물의 내건성 또는 내염성과 연관된 후보 유전자로서 이용될 수 있으므로, 상기 스크리닝 방법은 신규한 비생물적 스트레스 내성 유전자를 선별하는데 유용하다.

아울러, 본 발명은 비생물적 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 형질전환체 스크리닝 방법을 제공한다: 1) 상기 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 2)단계 1)의 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 3) 단계 2)의 아그로박테리움과 식물세포를 공동 배양하여 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 4) 단계 3)의 형질전환된 식물 세포를 조직 배양하여 재분화하는 단계.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고추로부터 비생물적 스트레스 내성 관련 유전자의 클로닝

<1-1> 건조 스트레스 특이적 고추 cDNA 라이브러리( library ) 제조와 비생물적 스트레스 내성 관련 cDNA 의 클로닝

어린 발달 단계의 고추(Capsicum annuum cv. Bu Gang)에 10 내지 20일 동안 단수하여 건조 스트레스를 가하고 이로부터 mRNA를 추출(Cho and Hong, J. Plant Biol. 47:149-159, 2004; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)하여 cDNA를 합성하고(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989), UNI-XR 벡터(Stratagene, USA)에 삽입하여 건조 스트레스 특이적 cDNA 라이브러리(library)를 제조하였다. 상기 제조된 cDNA 라이브러리를 대상으로 차별화 스크리닝(differential screening)을 하기의 방법과 같이 수행하였다. 스트레스 조건에서 추출한 mRNA를 주형으로 하여 제조된 ³²P로 표지된 cDNA(실험군 cDNA)와 스트레스가 가해지지 않은 정상적인 조건에서 생육하고 있는 고추에서 추출한 mRNA를 주형으로 하여 제조된 ³²P 로 표지된 cDNA(대조군 cDNA)를 탐침으로 하여 수행하였다. UniZAP-XR 벡터에 삽입된 고추 cDNA 라이브러리를 23 cm × 23 cm LB 바텀 아가 플레이트(bottom agar plate)에 배양한 대장균(Escherichia coli) KW251 위에 도말하였다. 플레이트 위에 약 1× 10⁵ 개의 플라크(plaque)가 형성된 후, 1 차 스크리닝을 위해 플레이트를 하이본드-N 나일론(Hybond-N nylon) 막에 블롯팅(blotting)하였다. 이후 실험군 cDNA를 탐침으로 하여 전형적인 DNA-DNA 혼성화 반응을 수행하였다. 또한 동일한 플레이트로부터 블롯팅된 하이본드-N 나일론막을 대조군 cDNA를 탐침으로 하여 DNA-DNA 혼성화반응을 수행하였다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과 실험군 cDNA 프루브에서는 양성반응을 보이는 반면 대조군 cDNA 프루브에서는 음성반응을 보이는 플라크로부터 Exassist helper phage(M13)를 이용한 절제(excision) 과정을 통해 pBluescript SK(-) plasmid 벡터에 들어있는 유전자 클론(도 1)을 분리하였고(Stratagene사의 매뉴얼 참조), 이를 “CaABS1"이라 명명하였다.

<1-2> CaABS1 유전자 클론에 대한 RNA 블롯 분석

상기 실시예 1-1의 스크리닝 결과로 분리된, 건조 스트레스 하에서 발현이 유도될 것으로 판단되는 CaABS1 cDNA 클론에 대해 건조 스트레스 하의 고추에서의 발현 양상을 RNA 블롯 분석법으로 검증하였다.

잎이 6-8장 난 어린 고추 식물체에 건조 스트레스를 처리하였다. 건조 스트레스 처리는 버미큘라이트-토양에서 자라는 어린 고추 식물체를 뿌리가 손상되지 않게 조심히 뽑아 물로 세척한 후 마른 여과지가 깔려 있는 페트리 디쉬 상으로 옮겨 수행하였다. 식물체가 들어있는 페트리 디쉬는 25℃, 16시간 광주기가 유지되 는 식물배양실에 위치하였다.

고추 식물체로부터의 RNA 추출은 Cho 및 Hong(Cho and Hong, J. Plant Biol . 47:149-159, 2004)의 방법을 참조하였으며 방법은 하기와 같다. 고추 식물체를 액체 질소로 냉동한 후, 막자사발로 갈아 분말로 제조하였다. 분말에 세포용해 완충액(lysis buffer: 25 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM LiCl, 35 mM EDTA, 35 mM EGTA, 0.5% SDS)을 첨가하고 강하게 교반하여 혼합하였다. 이후 동량의 페놀(phenol)을 첨가한 후 강하게 교반하였다. 이후 1/4 부피의 클로로포름(chloroform)을 추가적으로 첨가하고 강하게 교반하여 골고루 혼합시키고 20℃에서 6,000 g로 15분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상등액을 취하고 동량의 4 M LiCl 용액을 첨가하고 원심분리기(microcentrifuge)로 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전물로 수확하였다.

RNA를 포름알데히드-아가로스 젤(formaldehyde-agarose gel) 전기영동으로 크기에 따라 분리하고 하이본드-N 막으로 블롯팅하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989). RNA 블롯 막은 α-³²P-dCTP로 표지된 CaABS1으로 혼성화(hybridization) 되었다. 혼성화 방법은 Sambrook의 방법(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)을 참조하였으며, 방법은 하기와 같다. 막은 용액[0.5 M sodium phosphate, pH 7.2, 7%(w/v) SDS 및 1 mM EDTA(pH 7.0)]에서 전-혼성 화(prehybridization)되었고, 여기에 ³²P-dCTP로 표지된 CaABS1를 첨가하고 65℃에서 16-22 시간 동안 혼성화하였다. 혼성화된 막은 1X SSPE, 0.1% SDS 용액으로 65℃에서 세척하고 X-ray 필름에 감광시켰다(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과, 건조 스트레스를 받은 고추 식물체에서 CaABS1이 발현됨을 확인하였다(도 2).

<1-3> CaABS1 의 염기서열 결정

엑소뉴클리아제 Ⅲ(exonuclease Ⅲ)를 사용하는 시퀀싱 키트(deletion kit for kilo-sequencing, Takara, Japan)를 이용하여 한쪽 방향 삭제 시리즈(deletion series)를 제작하였으며, 서열 버전 2.0(Sequenase version 2.0, United States Biochemical Cooperation, U.S.A.)을 사용하여 생거(Sanger)의 다이디옥시 사슬 종결법(dideoxy chain termination, Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)으로 한쪽 방향으로 절삭된 클론들의 염기서열을 결정하였으며, 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역하였다(도 3). CaABS1는 서열번호 2로 기재되는 660개의 염기로 이루어진 ORF를 가지고 있었으며 서열번호 1의 아미노산 서열로 번역되었다. 상기 CaABS1 유전자가 형질감염된 아 그로박테리움 투메파시엔스를 2006년 11월 17일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 내 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 11031BP).

< 실시예 2> CaABS1 유전자로 형질전환된 형질전환 식물체에서의 비생물적 스트레스 내성 실험

본 발명의 CaABS1 유전자가 형질전환된 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 담배를 숙주 식물체로 사용하였다. 담배의 형질전환을 위하여 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.

<2-1> CaABS1 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현 벡터의 제조

CaABS1 유전자의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시키기 위하여, pBluescript SK(-)/CaABS1 벡터에서 CaABS1의 ORF의 양쪽 바깥 부위의 염기서열을 따라 제조된 정방향 프라이머(서열번호 3: 5'-GGGGATCC ATGGGGTCCGAA-3': 이텔릭체 부분은 BamHI 제한효소 자리, 밑줄은 CaABS1의 ORF 부위) 및 역방향 프라이머(서열번호 4: 5'-GGGGATCC TTAGTATAAAGTG-3': 이텔릭체 부분은 BamHI 제한효소 자리, 밑줄은 CaABS1의 ORF 부위)를 사용하여 CaABS1의 ORF를 증폭하였다. 제조된 프라이머에는 제한효소 BamHI 위치가 있어 PCR 증폭 후 BamHI로 절단하여 식물체 형질전환벡터의 BamHI 위치에 삽입이 가능하게 하였다. PCR 증폭된 DNA는 BamHI 처리하고 아가로즈 겔에 전기영동 하였고 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean Ⅱ 키트(Bio 101, USA)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수 분리하였다. 순수 분리한 DNA 절편을 식물체 형질전환용 벡터인 pBKS1-1(Suh M.C. et al ., Molecules and Cells , 4, 211-219, 1994)의 BamHI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 반응시켜 부착시킴으로써 CaABS1 유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/CaABS1를 제조하였다(도 4A)(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

상기 발현벡터 내에 CaABS1 유전자의 단백질 기록부위가 pBKS1-1이 가지고 있는 CaMV35S 프로모터와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위 사이에 올바르게 삽입된 것을 확인하기 위하여, pBKS1-1/CaABS1를 DNA 시료로 준비하고 CaMV35S 프로모터의 3' 말단 부위를 프라이머를 이용하여 샹거(Sanger) 등의 다이디옥시 사슬 종결법을 이용하는 DNA 서열 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit)를 사용하였다. 정제한 DNA에 2 ㎕의 시쿼나제(sequenase) 완충액(200 mM TrisHCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl)과 0.5 pmol 프라이머를 참가하여 65℃에서 2분간 반응한 뒤 상온에 30분간 방치하였다. 여기에 1 ㎕의 0.1 M DTT, 2 ㎕의 1/5로 희석한 표지 혼합액(labeling mix), 0.5 ㎕의 [α-³⁵S]dATP, 2 ㎕의 1/8로 희석한 시쿼나제를 순서대로 첨가하여 혼합한 뒤 상온에서 2 내지 3분간 반응시켰다. 4 개의 튜브에 ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP를 각각 2.5 ㎕씩 분주 하여 37℃에 두고 여기에 3.5 ㎕의 표지 혼합액을 넣고 원심분리하여 반응액을 혼합한 뒤 다시 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 4 ㎕의 반응 종료액을 각 튜브에 넣어 반응을 종료시킨 후 75 내지 80℃에서 2분 동안 가열한 다음 전기영동 겔에 2 내지 3 ㎕씩 로딩(loading)하여 전기영동 후 X-레이 필름에 감광시켜 염기서열을 분석하였다. 그 결과, CaABS1 유전자가 센스 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다(도 4B).

<2-2> pBKS1 -1/ CaABS1 발현벡터의 식물체로의 형질전환

pBKS1-1/CaABS1 발현벡터를 아그로박테리움투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하였다. 20 mM CaCl₂를 처리하여 제조한 형질전환 수용 세포(transformation competent cell)에 DNA를 첨가하여 얼음에서 30분간 반응시킨 후 액체 질소에 1분간 방치하였다. 이것을 37℃ 수조에서 5분간 처리하여 녹인 후 1 ㎖ YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 200 rpm으로 5시간 배양한 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시켰다. 침전된 아그로박테리움을 0.1 ㎖ YEP 배지에 재현탁하여 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB 고체 배지에 도말하여 28℃에서 배양하였다(An G., Methods in Enzymology , 153, 292-305, 1987). 카나마이신 배지에서 콜로니를 형성한 형질전환 균주를 이용하여 담배에 형질전환 과정을 수행하였다.

pBKS1-1/CaABS1 발현벡터가 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 현탁액 에 담배의 잎 절편을 암 상태에서 48시간 혼합시켜 배양한 후(Suh M.C., Hong C.B., et al ., Molecules and Cells, 4, 211-219. 1994), BAP 2.0 ㎎/ℓ, NAA 0.1 ㎎/ℓ, 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ 및 세포탁심(cefotaxim) 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 줄기 유도배지(Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant ., 15, 473-497, 1962)에서 4 내지 6주 동안 기내 배양하였다. 상기 기내배양에 의해 줄기가 유도되면 이를 다시 카나마이신이 200 ㎎/ℓ 함유된 MS 뿌리 유도배지(Murashige T. and Skoog F., Physiolia Plantarum ., 15, 473-497, 1962)로 옮겨 기내 배양하였다. 뿌리가 유도된 식물체를 토양으로 옮겨 심었으며, 자연광 하에서 온도가 25 ± 2℃로 유지되고 외부와 이중창에 의해서 차단된 온실에서 재배하여 성장과 개화 및 종자의 발달 과정을 분석하였다. 종자가 성숙되면 이를 수확하여 실온에서 2주일간 건조시킨 후 4℃에 보관하였다.

<2-3> pBKS1 -1/ CaABS1 발현 형질전환 식물체의 내건성 분석

형질전환 과정을 거쳐 생성된 담배는 RNA 블롯 분석을 수행하여 도입하고자 한 CaABS1의 발현이 목표한 바와 같이 이루어졌는지를 확인하였다. RNA 블롯 분석에 사용된 방법은 상기 실시예 1-2에 기술된 방법과 동일하게 이루어졌다.

그 결과 생성된 식물체 대부분이 CaABS1의 발현이 이루어진 형질전환 식물체임을 확인할 수 있었다.

CaABS1의 발현이 확인된 형질전환 식물체는 온실에서 유지되며 자가수분을 유도하여 종자를 수확하였다. 그리고 수확된 종자를 파종하여 식물체를 얻고 이를 대상으로 비생물적 스트레스 내성의 증가 여부를 확인하는 생체 분석 실험을 수행하였다.

비생물적 스트레스에 대한 내성의 증가를 확인하기 위한 생체 분석은 다음과 같이 수행되었다. 버미큘라이트-토양에서 자란 잎이 6-8개 난 어린 담배 식물체를 뿌리가 손상되지 않게 조심해서 뽑고 물로 잘 세척하였다. 그리고 지름 8.5 cm의 페트리 디쉬 안에 놓여진 여과지(Whatman #1 두겹)에 2 ㎖의 증류수 또는 3 ㎖의 증류수를 첨가하고 준비된 담배 식물체를 위치시켰다. 이렇게 준비된 페트리 디쉬는 25℃, 16 시간의 광주기가 유지되는 배양실에서 6일간 방치하였다. 방치 후 생체량을 측정하고 CaABS1가 도입된 형질전환 식물체와 pBKS1-1 벡터만이 도입된 형질전환체 간의 무게를 비교함으로써 형질전환 식물체의 내건성 증진 여부를 확인하였다(도 5 및 7).

그 결과 도 5 및 7에서 볼 수 있듯이 CaABS1가 도입되어 발현된 형질전환 식물체는 벡터만이 도입된 식물체에 비해 약 20%의 생체량 증가가 확인되어 내건성이 증진되었음을 확인하였다.

<2-4> pBKS1 -1/ CaABS1 발현 형질전환 식물체의 내염성 분석

상기 실시예 2-3과 동일하게 준비된 담배 식물체를 페트리 디쉬 내에 400 mM NaCl 용액을 첨가하고 식물체의 뿌리가 잠기게 한 후 동일한 배양실에서 5일간 방치하였다. 방치 후 CaABS1가 도입된 형질전환 식물체와 pBKS1-1 벡터만이 도입된 형질전환체 간의 무게를 비교함으로써 형질전환 식물체의 내염성 증진 여부를 확인 하였다.

그 결과, 도 6 및 7에서 볼 수 있듯이 CaABS1가 도입되어 발현된 형질전환 식물체에서 벡터만이 도입된 식물체에 비해 약 42%의 생체량 증가가 확인되어 내염성이 증진되었음을 확인하였다(도 6 및 7).

<2-5> pBKS1 -1/ CaABS1 발현 형질전환 식물체의 발현 유도 유전자 분석

아울러 도입된 CaABS1에 의해 특징적으로 형질전환 식물체에서 발현이 유도되는 유전자군을 확인하기 위해 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행하였다. 도입된 CaABS1에 의해 특징적으로 형질전환 식물체에서 발현이 유도되는 유전자군을 확인하기 위해 마이크로어레이(microarray) 분석은 하기와 같이 수행되었다. 형질전환 식물체임이 RNA 블롯 분석으로 재차 확인된 담배 식물체에 대한 DNA 마이크로어레이 분석은 GreenGene사(대한민국)에 위탁하여 Arabidopsis DNA microarray chip을 이용하여 수행되었다. 형질전환체 담배로부터 mRNA를 추출하고 Cy3-dCTP 또는 Cy5-dCTP를 첨가하여 역전사 반응(reverse transcription reaction)을 수행하여 마이크로어레이 혼성화(microarray hybridization)용 탐침을 제조하였다. 제조된 탐침으로 DNA 마이크로어레이 칩 상에서 혼성화를 실시하여 형광분석을 수행하였다. 본 발명자들은 현재 담배 마이크로어레이가 사용 불가능하므로 근인관계에 있고 상업적으로 이용 가능한 Arabidopsis DNA microarray chip(GreenGene, 대한민국)을 사용하기로 하였다. 확인된 EST의 염기서열 비교 결과로 애기장대와 담배 간에 높은 상동성을 나타냄으로 Arabidopsis chip이 훌륭하게 담배 식물체에서의 전사 분포를 대변해 줄 수 있을 것으로 판단되었다.

그 결과 183종의 유전자가 3번의 시도에서 CaABS1가 도입된 형질전환 식물체에서 평균 2배 이상 발현양이 증가함을 확인할 수 있었다(표 1). 이들 유전자는 CaABS1가 식물체에 내건성과 내염성을 증진시키는 과정에 관여할 것으로 판단되며, 유전자의 발현양이 증가한 183종의 유전자는 식물체에 내건성과 내염성을 증진시킬 목적으로 사용할 수 있는 후보 유전자군들로 판단된다.

본 발명의 신규한 고추 유전자 CaABS1은 식물체가 건조 스트레스 하에서 과발현되며, CaABS1가 형질도입된 형질전환체는 내건성 및 내염성을 획득함으로 비생물적 스트레스에 내성을 획득한 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 비생물적 스트레스 내성 단백질을 구성하는 폴리펩티드.
2. 제 1항에 있어서, 고추 식물체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 건조 또는 고염 스트레스인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 1항의 폴리펩티드를 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드:

   (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

   (b) 서열번호 2로 기재된 폴리뉴클레오티드.
5. 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
6. 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 숙주에 도입하여 제조한 형질전환체.
7. 제 6항에 있어서, 상기 숙주는 원핵세포, 진핵세포 및 가지과 식물체인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 제 7항에 있어서, 상기 가지과 식물체는 고추, 단고추, 담배, 토마토, 방울토마토, 감자, 구기자, 꽈리 및 페튜니아인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 삭제
10. 삭제
11. 1) 제 4항의 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

    2) 단계 1)의 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계;

    3) 단계 2)의 아그로박테리움과 식물 세포를 공동 배양하여 식물 세포를 형 질전환시키는 단계; 및

    4) 단계 3)의 형질전환된 식물 세포를 조직 배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비생물적 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법.

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