KR20140018970A

KR20140018970A - 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질 조성물 및 그 제조방법과 용도

Info

Publication number: KR20140018970A
Application number: KR1020137031113A
Authority: KR
Inventors: 용 리; 빈 지; 시아오밍 지
Original assignee: 샹하이 테크웰 바이오파마슈티컬 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2014-02-13
Also published as: WO2012142961A1; CN102743742A

Abstract

본 발명은 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 상기 당단백질 조성물 중의 유기용매 함량은 0.5%를 초과하지 않는다. 상기의 방법은 당단백질 조성물의 침전물과 수계를 0-25℃에서 함께 진공 건조시키는 단계(a)와; 수계를 제거한 다음 계속적으로 진공 건조시켜 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻는 단계(b)를 포함한다.

Description

저수준 잔류용매를 함유한 당단백질 조성물 및 그 제조방법과 용도{GLYCOPROTEIN COMPOSITION WITH LOW RESIDUAL SOLVENT LEVEL, AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}

본 발명은 단백질 약물의 정제분야에 관한 것이다. 특히는 불임증을 치료하는 당단백질을 함유하는 조성물의 건조방법에 관한 것이다.

불임증을 치료하는 당단백질은 구조가 근접한 물질로서, 융모성 생식선 자극호르몬(HCG), 폐경생식선자극호르몬(HMG), 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH)을 포함하고, 여기서 폐경생식선자극호르몬은 난포자극호르몬과 황체형성호르몬을 함유하고 양자가 일정한 비례(1: 0.1－1)를 이룬 혼합물이다.

HCG, FSH, LH는 모두 α사슬과 β사슬인 두개의 서브유닛(subunit)에 의해 비공유결합 형식으로 결합되고, 여기서 이들의 α서브유닛은 완전히 동일하고, 92개 아미노산을 가지며, 분자량은 약 14500D이고, 서열번호 52와 서열번호 78에 위치하는 아스파라긴(asparagine)은 N-글리코실화(N-glycosylation)가 발생하는 아미노산이다. HCG의 β서브유닛은 145-147개 아미노산을 갖고, 분자량은 22200-39000D이며, 여기서 서열번호 13, 30에 위치하는 아스파라긴 및 서열번호 121, 127, 132, 145는 글리코실화가 발생하는 부위이다. FSH의 β서브유닛은 111개 아미노산으로 구성되고, 분자량은 약 18000D이며, 여기서 서열번호7과 24에 위치하는 아스파라긴은 N-글리코실화가 발생하는 아미노산이다. LH의 β서브유닛은 121개 아미노산으로 구성되고, 분자량은 약 14800D이다.

임상적으로 HCG, HMG, FSH, LH는 주요하게 불임증 치료 및 체외보조생식에 사용된다. 이들은 특정된 부녀(임신기 또는 폐경기)의 요액에서 추출될 수 있고, DNA재조합기술을 통해 제조될 수도 있다.

불임증을 치료하는 당단백질의 제1대 제품은 상세기 60년대 세레노(Serono)회사의 프로파시(Profasi)(HCG), 퍼고날(Pergonal)(HMG)인 바, 이들의 순도는 모두 낮고, 대량의 잡질을 함유한다. 상세기 80년대이후, Serono회사에서는 잡질함량이 매우 낮은 고순도의 FSH제제인 메트로딘-HP(Metrodin-HP)을 개시하였고; 나중에 또 재조합기술을 이용하여 생산한 Gonal-F(rFSH), Luveris(rLH) 등을 개시하였고, 이밖에, 페링(Ferring)회사에서는 고순도 폐경생식선자극호르몬-메노푸어 (Menopur)도 개시하였다.

이로부터 알 수 있는 바와 같이, 현재 시중에서는 고순도 당단백질의 개발과 응용에 전력을 다하여, 일반 저순도제품을 대체함으로써, 일반 저순도제품 중의 잡종단백질(hybrid protein)로 인한 과민반응을 극복하도록 한다.

중국특허 CN1309567A에서는 FSH 또는 이의 변이체를 함유하는 액체제제에 대해 공개하였다. 그러나, 액체형식은 반드시 -20℃이하에서 보존해야 하고, 그렇지 않을 경우 당단백질은 쉽게 불활성화되기에, 액체형식은 보존과 운송이 어렵고; 액체형식은 동결건조-용해과정, 심지어는 반복되는 동결건조-용해과정을 거치게 되므로, 당단백질의 불활성화를 더욱 쉽게 초래할 수 있으며; 액체형식은 포장용기가 저온에서 취성점에 접근하여 쉽게 파열되는 위험 등에 노출될 수도 있다. 제제 완제품에 있어서, 액체형식은 쉽게 운송되지 못하는 것 외에, 액체형식의 당단백질 약물의 안정성이 비교적 차하기에, 반드시 방부제를 넣어야만 유효기간내에 미생물이 번식되는 것을 방지할 수 있으므로, 임상적 응용에 안전성 위험을 가져다 준다.

따라서, 고체형식의 당단백질 조성물은 산업화생산에 더욱 적합하다. 고체형식을 얻는 경로는 주요하게 냉동건조와 진공건조의 수단을 거치지만, 고순도의 당단백질은 냉동건조과정에서 쉽게 변성되어 불활성화를 초래하게 되고, 이의 변성적 불활성화의 주요한 표현으로는 완전한 분자가 α사슬과 β사슬 이 두개 서브유닛으로 분해되게 하고, 이러한 서브유닛도 잡질이기에, 이들은 치료효과가 없거나 또는 부작용의 이성질체를 생성할 수 있으므로, 투입시 10∼30%의 량을 더 많이 가하여, 냉동건조과정에서의 불활성화 과정을 상쇄시키고, 또한 완제품에는 일정량의 서보유닛이 생성될 수 있기에, 제품의 순도가 낮아진다. 중국특허 CN101347613A에서는 당단백질 조성물을 제조하는 냉동건조방법에 대해 공개하였는 바, 상기 방법은 고순도이고 서브유닛을 거의 함유하지 않는 당단백질 냉동건조 조성물을 제조할 수 있으나, 상기 방법을 사용하여 유기용매를 제거하는 효과는 그다지 이상적이지 못하다.

통상적으로, 진공 건조는 유기용매를 당단백질 용액과 충분히 혼합하여, 침전형성후 탈수시키고, 이어서 침전을 진공 건조시킨다. 이러한 방법은 당단백질의 변성 불활성화를 감소할 수 있지만, 건조 후의 당단백질 중의 유기용매 함량은 비교적 높고, 질량백분율은 1%를 초과한다. 유기용매는 대부분이 인체에 유해한 바, 2010년 중국약전에서는 약품중 에탄올의 함량을 0.5%로 한정한다고 명백히 규정하였다.

따라서, 본 기술분야에서는 당단백질 중 잔류하는 유기용매를 감소하는 진공 건조방법을 개발하는 것이 시급하다. 이로써 저수준 잔류유기용매를 함유한 당단백질 조성물을 얻도록 한다.

본 발명은 저수준 잔류유기용매를 함유한 당단백질 조성물, 및 상기 당단백질 조성물을 얻는 진공 건조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일측면에서, 저수준 유기용매함량의 당단백질 조성물을 제공하였는 바, 여기서 유기용매 질량백분율은 0.5%를 초과하지 않고, 바람직하게는 0.3%를 초과하지 않으며, 더욱 바람직하게는 0.1%를 초과하지 않는다.

여기서, 상기 유기용매는 에탄올, 아세톤 또는 메탄올이다.

여기서, 상기의 당단백질은 융모성 생식선 자극호르몬 , 폐경생식선자극호르몬, 난포자극호르몬, 황체형성호르몬, 또는 이들의 혼합으로부터 선택된다.

여기서, 상기 융모성 생식선 자극호르몬은 인뇨유래 및/또는 재조합 인간 융모성 생식선 자극호르몬, 또는 이의 변이체이고; 상기 폐경생식선자극호르몬은 인뇨유래 및/또는 재조합 인간 폐경생식선자극호르몬, 또는 이의 변이체이며; 상기 난포자극호르몬은 인뇨유래 및/또는 재조합 인간 난포자극호르몬, 또는 이의 변이체이고; 상기 황체형성호르몬은 인뇨유래 및/또는 재조합 인간 황체형성호르몬, 또는 이의 변이체이다.

본 발명의 일측면에서, 저수준 잔류용매를 함유하는 당단백질 조성물을 간편하게 제조하는 방법에 대해 제공하였다. 발명자는 심도깊은 연구를 거친 결과, 당단백질 조성물과 수계를 함께 진공 건조하면, 유기용매를 효과적으로 제거할 수 있어, 양호한 안정성을 갖는 저수준 잔류용매를 함유된 당단백질 조성물을 얻을 수 있다는 점을 발견하였다.

저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물의 건조원리

당단백질류 물질이 고온에서 쉽게 변성하여 불활성화되기 때문에, 분무건조 또는 기타 가열방식을 사용하여 건조하기에 적당하지 않고, 냉동건조방식도 일정한 불활성화 현생이 존재하며, 또한 냉동건조장치는 고가이고, 건조량이 적으며, 에너지 소모가 크다. 진공 건조법(수계를 첨가하지 않는 건조)을 사용한 제품은 분해 불활성화가 명확하지 않지만, 유기용매 잔류수준이 높다. 발명자는 이 용매의 잔류가 기준을 초과한 원인에 대해 심도깊은 분석을 하였는 바, 샘플 진공 건조 전기에, 유기용매와 물은 일정한 비례로 함께 휘발되나, 샘플 중의 유기용매 및 물 함량이 낮아짐에 따라, 휘발되는 량도 점차적으로 적어지고, 샘플 중의 물 함량이 더이상 낮아지지 않을 경우, 유기용매의 량도 더이상 낮아지지 않는다. 따라서 유기용매의 잔류량은 샘플 중의 물 함량과 연관된다. 발명자는 놀랍게도 진공 건조기에 수증기를 방출할 수 있는 물질을 넣으면, 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻을 수 있고, 샘플이 더이상 분해 불활성화 현장이 나타나지 않는 다는 점을 발견하였다.

발명자는 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻은 뒤, 이에 대해 심도깊은 연구를 진행하였다. 진공 건조기에 수증기를 방출할 수 있는 물질을 넣는 목적은 진공 건조과정에서 샘플 중의 유기용매와 물의 휘발비례를 제어하기 위함이다. 진공 건조과정에서 유기용매와 샘플 중의 물은 함께 휘발되고, 진공 건조오븐내에서, 유기용매와 수증기는 각각 일정한 비례를 차지하나, 건조가 진행됨에 따라, 수분함량은 제한되고, 이러한 평형을 유지하기 위하여, 건조계에 수증기를 방출할 수 있는 물질을 넣었는 바, 이렇게 하면 진공 건조오븐내의 증기압을 높히게 되어, 샘플 중의 속이 휘발되는 것을 억제할 수 있는 동시에 샘플 중의 유기용매의 휘발을 촉진할 수 있다. 이로써 샘플 중의 유기용매가 잔류되는 것을 효과적으로 저하시키고, 또한 샘플 중의 물 함량도 비교적 낮은 수준으로 유지함으로써, 샘플은 분해 불활성화 현상이 존재하지 않는다.

발명자는 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻은 뒤, 이의 건조과정에 대해 재차 심도깊은 연구를 진행하였는 바, 또 놀랍게도, 유기용매가 건조합격후, 수증기를 방출하는 물질을 제거하고, 계속적으로 일정한 시간 진공 건조시키면, 샘플 중의 수분을 합격범위내로 진공건조할 수있고, 또한 유기용매는 진일보로 감소되어, 샘플은 이러한 수분범위내에서 안정성이 양호하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 건조과정은 두가지 단계로 구분되는 바, 제1단계는 샘플과 수계를 함께 진공건조하여 유기용매를 제거하는 것이고, 제2단계는 수계를 제거하여 샘플수분함량이 합격될 때까지 진공건조시키는 것이다.

제조방법

본 발명은 유기용매를 당단백질의 조성물 원료를 함유하는 용액과 충분히 혼합하여 침전시켜서, 침전물(1)을 수집하고, 유기용매로 탈수한 후, 계속하여 당단백질의 조성물 침전을 수집하여, 당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)를 얻는 단계(a); 및

당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)과 수계를 함께 진공 건조하여, 본 발명에 제공된 저수준 잔류유기용매를 함유한 당단백질 조성물을 얻는 단계(b)를 포함하는 저수준 유기용매함량의 당단백질 조성물의 제조방법에 대해 제공하였다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(a)에서, 상기 유기용매의 온도는 -20 내지 25℃이고, 바람직하게는 -20 내지 0℃이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(a)에서, 상기 유기용매는 에탄올, 아세톤 또는 메탄올로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(a)에서, 상기 탈수용 유기용매량은 습한 침전물(1)중량의 0 내지 10배이고, 바람직하게는 1 내지 4배이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(b)에서, 상기 건조온도는 0 내지 25℃이고, 바람직하게는 0 내지 20℃이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(b)에서, 상기 수계는 고상, 액상 또는 기상의 수돗물, 탈이온수, 역삼투물, 정제수, 주사용수, 수증기를 방출할 수 있는 물체, 및 수용액을 포함하되, 정제수인 것이 바람직하다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(b)에서, 상기 건조시간은 1 내지 48시간이고, 바람직하게는 10 내지 24시간이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 당단백질 조성물을 함유하는 원료를 물 또는 완충액에 용해시켜 단계(a)에 따른 당단백질 조성물 원료를 함유하는 용액을 제조한다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기의 당단백질 조성물을 함유하는 원료는 고체이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기의 완충액은 pH값 완충범위가 3 내지 11인 완충액으로부터 선택되고; 바람직하게는 인산염 완충액, Tris완충액, 초산나트륨완충액으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 용해온도는 5 내지 20℃이고, 바람직하게는 10 내지 16℃이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 당단백질 조성물을 함유하는 원료의 pH값은 3 내지 11이고, 바람직하게는 4 내지 10이다.

다른 바람직한 실시예에 따르면, 단계(b)에 이어서,

수계를 제거한 후 계속하여 진공 건조시켜 본 발명에 제공된 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻는 단계(c)를 더 포함할 수 있다.

단계(c)에서, 상기 건조시간은 0 내지 48시간이고, 바람직하게는 5 내지 24시간이다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시예에 따르면, 저수준 유기용매함량의 당단백질 조성물을 제조하는 방법은,

-20∼0℃의 유기용매를 당단백질의 조성물 원료를 함유하는 용액과 충분히 혼합하여 침전시켜서, 침전물(1)을 수집하는 단계(a');

침전물(1)을 유기용매로 탈수시킨 후, 계속하여 당단백질의조성물 침전을 수집하여, 당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)을 얻는 단계(b');

당단백질의 조성물 침전물(2)과 수계를 0∼25℃에서 1~48시간 동안 함께 진공 건조시켜, 양호한 안정성을 갖는 저수준 용매를 함유한 당단백질의 조성물을 얻는 단계(c'); 및

단계(c')후, 수계를 제거하여, 단계(c')에서 제조된 저용매 당단백질의 조성물을 0∼25℃에서 계속하여 0∼48시간 동안 진공 건조시켜, 더욱 낮은 함량수준의 잔류용매를 함유된 당단백질의 조성물을 얻는 단계(d')를 포함한다.

본 발명에 따르면, "당단백질"은 융모성 생식선 자극호르몬(chorionic gonadotropin, CG), 난포자극호르몬(follicule-stimulating hormone, FSH), 황체형성호르몬(luteotropic hormone, LH), 폐경생식선자극호르몬(human menopausal gonadotropin, HMG)중의 한가지 또는 여러가지의 혼합으로부터 선택된다.

본 발명에 따르면, "당단백질 조성물 원료"는 당단백질을 함유하는 조성물을 의미하고, 여기서 당단백질을 포함하거나, 또는 당단백질 및 약학적/식품학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 기술분야의 당단백질 조성물을 제조하는 기존의 방법으로 제조된 당단백질 조성물을 원료로 할 수 있고, 고체 또는 액체일 수 있으며, 예를 들어, 중국특허 CN1246332C에 공개된 제조방법으로 얻은 고순도의 HMG; 중국특허 CN1958603B에 공개된 제조방법으로 얻은 HCG; 및 중국특허 CN101317103A에 공개된 방법으로 얻은 FSH일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 당단백질 조성물 원료를 얻는 것은 예시적인 것일 뿐, 본 발명에 따른 당단백질 조성물 원료는 이에 한정되지 않을 것이다.

본 발명에 제공된 저수준 잔류용매를 함유하는 당단백질 조성물을 얻는 방법에서, 상기의 "당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)과 수계를 함께 진공 건조한다"는 것은 당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)을 진공 건조기에 통상적으로 샘플을 넣는 곳에 투입하고, 진공 건조기 주위(예를 들어 밑부분)에 수증기를 방출할 수 있는 물질이 담긴 개방된 용기를 놓으며, 상기의 수증기를 방출할 수 있는 물질은 수돗물, 정제수, 또는 얼음물의 혼합물로부터 선택된다.

본 발명에 제공된 저수준 잔류용매를 함유하는 당단백질 조성물을 얻는 방법에서, 상기의"수계 제거"는 수증기를 방출할 수 있는 물질이 담긴 개방된 용기를 진공 건조의 환경 밖으로 옮긴다는 것을 의미한다.

본 발명의 주요한 우점은 하기와 같다.

1, 본 발명은 새로운 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물을 제공하였다.

2, 본 발명은 새로운 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질의 조성물의 제조방법을 제공하였다.

3, 본 발명은 조건이 온화하고, 조작과정이 간단하며, 분해불활성화 현상이 적고, 제품 안정성이 양호하며, 에너지 소비가 작고, 공법조작 난이도를 대폭적으로 감소하였으며, 생산원가를 낮추었다.

도1은 에탄올함량이 0.5%인 표준제품의 기체 크로마토그램(GC, gas chromatogram) 도면을 나타내고; 여기서 용매의 보류시간, 피크면적 및 질량함량은 하기 표와 같다.

도2는 대조예2의 HMG샘플 중의 에탄올함량 GC도면을 나타내고; 여기서 용매의 보류시간, 피크면적 및 질량함량은 하기 표와 같다.

도3은 실시예6의 HMG샘플 중의 에탄올함량 GC도면을 나타내고; 여기서 용매의 보류시간, 피크면적 및 질량함량은 하기 표와 같다.

당단백질의 조성물 유기용매 잔류 측정

본 발명의 실시방식에서, GC를 통해 본 발명의 방법으로 제조된 샘플의 잔류용매를 검출하되, 상기의 GC검출방법은 하기와 같다.

컬럼: Varian CP-Select 624 (94%시아노프로필페닐-6%디메틸폴리실록산(94%Cyanopropylphenyl-6%dimethylpolysiloxane))

컬럼규격: 30m×0.32mm×1.8μm

샘플링 포트 온도: 200℃

검출기 온도: 260℃

유속: 2.5ml/분, 정전류

오븐온도:

운반기체: 질소기체

분류비: 1:1(작업실), 실제분류비: 17:1(소프 필름 유량계 측정값)

검출기 기체: 공기유량: 400ml/분

수소기체 유량: 40ml/분

메이크업 가스(make-up gas) 유량: 25ml/분(질소기체)

헤드스페이스 샘플러(Headspace sampler) 조건

가열평형온도: 80℃; 정량환 온도: 85℃; 전송선 온도: 90℃; 평형시간: 20분; 가압시간: 0.5분; 샘플 충진시간: 0.2분; 정량환 평형시간: 0.10분; 샘플링 시간: 1분; 전체 운행시간: 30분; 샘플링 체적: 1ml; 진탕모드: 경미하게 진동.

이하 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 진일보로 설명하기로 하자. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이지 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아님을 이해해야 할 것이다. 하기 실시예에는 구체적인 조건의 실험방법에 대해 기재하지 않았고, 통상적으로 일반조건, 또는 제조상에서 건의하는 조건에 따르는 바, 별도의 설명이 없는 한, 백분율과 부수는 중량에 의해 계산된다.

별도로 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 전업용어와 과학용어는 본 기술분야의 당업자들이 숙지하고 있는 의미와 같다. 이밖에, 기재된 내용과 비슷하거나 균등한 어떠한 방법 및 재료든지 모두 본 발명의 방법에 적용된다. 본 발명에 따른 바람직한 실시방법과 재료는 단지 예시적인 것이다.

대조예 1 : FSH 의 냉동건조

45mL 0.01M 아인산 이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate)용액(NaOH으로 pH를 약 6.5으로 조절)을 조제하여, 5ml에탄올을 넣고, 2g유당을 넣어, 교반하여 용해한 후, 0.22μm여과기로 여과한다. 10mL 여약을 취하여, 10.0mg 상기 고순도FSH(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가: 8817국제단위/mg)를 넣고, 완전히 용해시킨 후, 접시에 담아 냉동건조기(버티스(Virtis)에서 구매)에 넣고, 중국특허CN101347613A의 실시예1의 방법에 따라 냉동건조시키고, 인출하여 391mg 동결건조분말을 얻었다.

측정에 따르면, FSH의 생물역가 결과는 하기와 같다.

대조예 2: 기존의 진공 건조법으로 HMG 제조

10ml 0.1mol/L의 초산나트륨용액을 조제하고, 초산으로 pH를 6.5로 조절하여, 10℃까지 냉각시키고, 250mg HMG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가는 FSH에 의해 계산되면 405IU/mg이다)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. -20℃의 에탄올 50ml를 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 931mg을 얻고, 3ml에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 HMG 습한 침전 901mg을 얻고, 20℃에서 96시간 진공 건조하여, 249mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량 결과는 하기와 같다.

실시예 3: 저수준 잔류용매를 함유한 HMG 제조

10ml 0.1mol/L의 초산나트륨용액을 조제하고, 초산으로 pH를 4.0로 조절하여, 16℃까지 냉각시키고, 250mg HMG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가는 FSH에 의해 계산되면 405IU/mg이다)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. -20℃의 에탄올 100ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 HMG 습한 침전936mg을 얻고, 20℃에서 얼음물 혼합물을 넣은 수계와 함께 10시간 진공 건조하여, 257mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 4: 저수준 잔류용매를 함유한 HMG 제조

10ml 0.1mol/L의 초산나트륨용액을 조제하고, 초산으로 pH를 6.5로 조절하여, 10℃까지 냉각시키고, 250mg HMG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가는 FSH에 의해 계산되면 405IU/mg이다)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. -20℃의 에탄올 50ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 956mg을 얻고, 10ml 에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 HMG 습한 침전 916mg을 얻고, 10℃에서 얼음물 혼합물을 넣은 수계와 함께 24시간 진공 건조하여, 252mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 5: 저수준 잔류용매를 함유한 HMG 제조

10ml 0.1mol/L의 초산나트륨용액을 조제하고, 초산으로 pH를 10으로 조절하여, 15℃까지 냉각시키고, 250mg HMG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가는 FSH에 의해 계산되면 405IU/mg이다)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. -10℃의 에탄올 100ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 HMG 습한 침전 953mg을 얻고, 0℃에서 정제수를 넣은 수계와 함께 24시간 진공 건조하고, 수계를 제거하며, 0℃에서 5시간 계속 건조하여, 246mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 6: 저수준 잔류용매를 함유한 HMG 제조

10ml 0.1mol/L의 아인산 이수소나트륨 용액을 조제하고, NaOH용액으로 pH를 7.0로 조절하여, 10℃까지 냉각시키고, 250mg HMG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가는 FSH에 의해 계산되면 405IU/mg이다)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. 0℃의 에탄올 50ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 952mg을 얻고, 3ml에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 HMG 습한 침전 932mg을 얻고, 0℃에서 정제수를 넣은 수계와 함께 24시간 진공 건조하고, 수계를 제거하며, 20℃에서 24시간 계속 건조하여, 244mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 7: 저수준 잔류용매를 함유한 HCG 제조

10ml 0.1mol/L의 Tris용액을 조제하고, 염산으로 pH를 7.5로 조절하여, 10℃까지 냉각시키고, 300mg HCG원료(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가5702 IU/mg)를 넣어, 교반하여 용해시킨다. 0℃의 에탄올 50ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 1172mg을 얻고, 11ml 에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 HCG 습한 침전 1022mg을 얻고, 10℃에서 얼음물 혼합물을 넣은 수계와 함께 24시간 진공 건조하고, 수계를 제거하며, 20℃에서 24시간 계속 건조하여, 295mg HCG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 8: 저수준 잔류용매를 함유한 FSH 제조

FSH원료를 함유한 10℃의 용액1000ml(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가 1958 IU/ml)을 취하여, -20℃의 에탄올 5000ml을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 15820mg을 얻고, 48ml에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 FSH 습한 침전 14958mg을 얻고, 0℃에서 정제수를 넣은 수계와 함께 24시간 진공 건조하고, 수계를 제거하며, 20℃에서 24시간 계속 건조하여, 3995mg FSH샘플을 얻었다. 측정에 따르면, FSH의 생물역가 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 9: 저수준 잔류용매를 함유한 HCG 제조

HCG원료를 함유한 16℃의 용액 10L(상해천위생물제약유한회사에서 제공, 생물역가 68319 IU/ml)을 취하여, -10℃의 에탄올 50L을 넣고, 교반, 혼합시켜, 원심분리하여 습한 침전 620g을 얻고, 4L 에탄올로 탈수하고, 원심분리하여 HCG 습한 침전 560g을 얻고, 20℃에서 정제수를 넣은 수계와 함께 20시간 진공 건조하고, 수계를 제거하며, 20℃에서 20시간 계속 건조하여, 122g의 HCG샘플을 얻었다.

측정에 따르면, HCG의 생물역가 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 10: 저수준 잔류용매를 함유한 HCG 제조

실시예 7의 단계에 따라 조작하되, 구별되는 것은 메탄올로 실시예7의 에탄올을 대체하여 원료 침전, 탈수를 거쳐, 습한 침전을 제조하여, 298mg HCG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가 및 용매함량결과는 하기와 같다.

실시예 11: 저수준 잔류용매를 함유한 HMG 제조

실시예 6의 단계에 따라 조작하되, 구별되는 것은 아세톤으로 실시예 6의 에탄올을 대체하여 원료 침전, 탈수를 거쳐 습한 침전을 제조하여, 240mg HMG샘플을 얻었다. 측정에 따르면, 생물역가(FSH으로 계산) 및 용매함량결과는 하기와 같다.

상기의 서술은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명의 실질적인기술내용범위를 한정하는 것이 아니고, 본 발명의 실질적인 기술내용은 출원의 특허청구범위에 광범위하게 정의되며, 어느 누군가가 실시한 기술실체 또는 방법에 있어서, 출원의 특허청구범위에 정의된 것과 완전히 동일하거나, 또는 등가적인 변경일 경우, 모두 특허청구범위에 포함된다고 간주한다.

Claims

유기용매 질량백분율은 0.5%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
제1항에 있어서,
유기용매 질량백분율은 0.3%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
제2항에 있어서,
유기용매 질량백분율은 0.1% 미만인 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유기용매는 에탄올(ethanol), 아세톤(acetone) 또는 메탄올(methanol)인 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기의 당단백질은 융모성생식선자극호르몬(chorionic gonadotropin), 폐경생식선자극호르몬(Menopausal Gonadotropin), 난포자극호르몬(follicule-stimulating hormone), 황체형성호르몬(luteinizing hormone), 또는 이의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
제5항에 있어서,
상기 융모성 생식선 자극호르몬은 인뇨 유래 및/또는 재조합 인간 융모성 생식선 자극호르몬, 또는 이의 변이체이고;
상기 폐경생식선자극호르몬은 인뇨 유래 및/또는 재조합 인간 폐경생식선자극호르몬, 또는 이의 변이체이며;
상기 난포자극호르몬은 인뇨 유래 및/또는 재조합 난포자극호르몬, 또는 이의 변이체이고;
상기 황체형성호르몬은 인뇨 유래 및/또는 재조합 황체형성호르몬, 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 하는 당단백질 조성물.
(a) 유기용매를 당단백질 조성물을 함유하는 원료 용액과 충분히 혼합하여 침전시켜서, 침전물(1)을 수집하고, 유기용매로 침전물을 탈수한 후, 추가로 당단백질 조성물의 침전물을 수집하여, 당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)를 얻는 단계; 및
(b) 당단백질 조성물을 함유하는 침전물(2)과 수계를 함께 진공 건조하여, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른, 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 당단백질 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(a)에서, 상기 탈수용 유기용매량은 습한 침전물(1) 중량의 0내지 10배이고, 바람직하게는 1 내지 4배인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(a)에서, 상기 유기용매는 에탄올, 아세톤 또는 메탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(a)에서, 상기 유기용매 온도는 -20 내지 25℃이고, 바람직하게는 -20 내지 0℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(b)에서, 상기 진공 건조 온도는 0 내지 25℃이고, 바람직하게는 0 내지 20℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(b)에서, 상기의 진공 건조시간은 1 내지 48h이고, 바람직하게는 10내지 24h인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(b)에서, 상기 수계 중의 물은 수돗물, 탈이온수, 역삼투물, 정제수, 또는 주사용수인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
단계(b)에서, 상기 수계 중의 물은 액상, 고상, 기상, 또는 혼합형태인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제14항에 있어서,
단계(b)에서, 상기 수계는 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제15항에 있어서,
단계(b)에서, 상기 수계는 수증기를 생산할 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계 (a)에서 당단백질 조성물을 함유하는 원료를 물 또는 완충액에 용해시켜 당단백질 조성물을 함유하는 원료 용액을 얻는 단계에 의해 단계(a)의 당단백질 조성물을 함유하는 원료 용액을 제조할 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 용해온도는 5 내지 20℃이고, 바람직하게는 10 내지 16℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제17항에 있어서,
상기의 완충액은 pH값 완충범위가 3 내지 11인 완충액으로부터 선택되고; 바람직하게는 인산염 완충액, Tris완충액, 초산나트륨완충액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 당단백질 조성물을 함유하는 원료 용액의 pH값은 3 내지 11로 제어되고, 바람직하게는 4 내지 10으로 제어되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
단계(b)에 이어서, (c) 수계를 제거한 후 계속하여 진공 건조시켜 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른, 저수준 잔류용매를 함유한 당단백질 조성물을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제21항에 있어서,
단계(c)에서, 상기의 진공 건조 시간은 0 내지 48h이고, 바람직하게는 5내지 24h인 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 조성물은 불임증후군을 치료하는 약물을 제조하기 위한 것임을 특징으로 하는 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 당단백질 조성물의 용도.