CN114835796A - 一种***纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种***纯化方法，包括如下步骤：S1：将***粗品溶于醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；S2：将洗脱液A过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液；S3：将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，得到洗脱液B；S4：向洗脱液B中加入乙醇溶液进行沉淀、离心，取沉淀；S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。本发明不需要进行强酸、强碱或高温的处理，最大限度保存了***中的活性成分，而且本发明工艺条件容易控制、成本低、操作简单，纯化后的***中***和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，不破坏原料的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种***纯化方法，属于激素纯化技术领域。
背景技术
***是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和***(FSH)，人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜***(HCG)。其中，FSH和LH的主要作用是促进卵巢或睾丸生成和分泌甾体性激素，它们与HCG合用，可治疗性腺激素分泌不足所致的原发性或继发性闭经，无***性稀发月经所致的***症等。绝经期妇女由于***和孕激素缺乏，从而反馈调节垂体，分泌大量FSH和LH，由尿中排出。
HMG的纯化方法，主要有硅酸铝吸附层析、阴阳离子交换层析、疏水作用层析、多元作用层析、羟基磷灰石层析、染料/抗体亲和层析等。目前，国内外在临床上应用的HMG，普遍是采用3IU/mg以上的HMG粗品为原料，经过硅酸铝吸附层析、弱阴离子交换层析、除热原等工序得到精品HMG。但是采用上述方法得到的产品收率偏低(一般小于 50％)，成品效价在100iu/mg左右。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种***纯化方法。
为了实现第一目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：将***粗品溶于醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液 A；
S2：将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，得超滤浓缩液；
S3：将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入乙醇溶液进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
采用上述技术方案，将***粗品溶于醋酸钠中，然后通过亲和柱、超滤膜和阳离子交换层析柱除去杂质，从而得到有效成分，最后在经过乙醇进行沉淀，干燥，最终得到高纯度的***固体。
优选的，步骤S1中的醋酸钠溶液的pH＝4-5。
采用上述技术方案，采用亲和柱进行层析，通过亲和柱基质以选择性捕获期望的蛋白。
优选的，步骤S2中持续补充醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为 15-20℃。
优选的，步骤S2中的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液的pH＝7。
采用上述技术特征，将洗脱液A进行超滤，去除大分子物质，经实验证明，经过超滤处理得到的产品可以消除不良反应。
优选的，步骤S3中以pH＝5-6的0.05-0.1mol/L醋酸钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270-290nm处的洗脱液。
优选的，步骤S1-S3均在10-20℃下完成。
优选的，步骤S4中洗脱液B与乙醇的体积比为1:4-6。
优选的，步骤S4中，乙醇溶液的酒精度为80-85％，静置12-14h，离心取沉淀。
优选的，纯化后的***中卵泡激素生物效价为700-1000IU/mg，黄体生成激素的生物效价100-200IU/mg。
本发明的有益效果：
本发明不需要进行强酸、强碱或高温的处理，最大限度保存了***中的活性成分，而且本发明工艺条件容易控制、成本低、操作简单，纯化后的***中***和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，不破坏原料的生物活性。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：在10℃环境下，将***粗品溶于pH＝4的醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：在10℃环境下，将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，持续补充pH＝7的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为15℃，得超滤浓缩液；
S3：在10℃环境下，将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，以pH＝6的0.05mol/L 醋酸钠和0.2mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270nm处的洗脱液，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入5倍体积的乙醇溶液，乙醇溶液的酒精度为80％，静置12h进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
实施例2
一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：在10℃环境下，将***粗品溶于pH＝5的醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：在10℃环境下，将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，持续补充pH＝7的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为20℃，得超滤浓缩液；
S3：在10℃环境下，将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，以pH＝5的0.05mol/L 醋酸钠和0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集290nm处的洗脱液，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入5.5倍体积的乙醇溶液，乙醇溶液的酒精度为85％，静置12h进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
实施例3
一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：在15℃环境下，将***粗品溶于pH＝4.5的醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：在15℃环境下，将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，持续补充pH＝7的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为20℃，得超滤浓缩液；
S3：在15℃环境下，将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，以pH＝5.5的0.1mol/L 醋酸钠和0.2mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集280nm处的洗脱液，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入6倍体积的乙醇溶液，乙醇溶液的酒精度为80％，静置14h进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
实施例4
一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：在20℃环境下，将***粗品溶于pH＝4的醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：在20℃环境下，将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，持续补充pH＝7的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为15℃，得超滤浓缩液；
S3：在20℃环境下，将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，以pH＝6的0.08mol/L 醋酸钠和0.3mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集290nm处的洗脱液，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入5倍体积的乙醇溶液，乙醇溶液的酒精度为80％，静置14h进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
实施例5
一种***纯化方法，包括如下步骤：
S1：在20℃环境下，将***粗品溶于pH＝5的醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：在20℃环境下，将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，持续补充pH＝7的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为15℃，得超滤浓缩液；
S3：在20℃环境下，将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，以pH＝5.2的0.08mol/L 醋酸钠和0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集280nm处的洗脱液，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入5.5倍体积的乙醇溶液，乙醇溶液的酒精度为80％，静置14h进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
试验例1
试验组别：实施例1-实施例5；
试验方法：
卵泡激素生物效价测定：2010年版药典二部附录XIIM测定；
黄体生成激素生物效价测定：2010年版药典二部附录XIIN测定；
卵泡激素活性回收率测定：(纯化后的***中卵泡激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中卵泡激素的单位体积生物效价×原料液体积)×100％；
黄体生成激素活性回收率：(纯化后的***中黄体生成激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中黄体生成激素的单位体积生物效价×原料液体积) *100％。
试验结果：详见表1。
表1实施例1-实施例4产品效价和活性回收率
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 卵泡激素生物效价(IU/mg) | 700 | 800 | 1000 | 750 | 900 |
| 卵泡激素活性回收率(％) | 90 | 92 | 95 | 93 | 92 |
| 黄体生成激素生物效价(IU/mg) | 120 | 200 | 150 | 130 | 150 |
| 黄体生成激素活性回收率(％) | 93 | 92 | 93 | 96 | 95 |
参考表1，本申请的纯化方法得到的***中的***和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，不破坏原料的生物活性。
试验例2
试验组别：对比例1-对比例3、实施例1，对比例1-对比例3依次采用截留分子量为10000、50000、70000的超滤膜，其他同实施例1；
试验方法：
卵泡激素活性回收率测定：(纯化后的***中卵泡激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中卵泡激素的单位体积生物效价×原料液体积)×100％；
黄体生成激素活性回收率：(纯化后的***中黄体生成激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中黄体生成激素的单位体积生物效价×原料液体积) *100％。
试验结果：详见表2。
表2对比例1-对比例3、实施例1产品的活性回收率
| 对比例1 | 实施例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 超滤膜型号 | 10000 | 30000 | 50000 | 70000 |
| 卵泡激素活性回收率(％) | 63 | 90 | 96 | 98 |
| 黄体生成激素活性回收率(％) | 68 | 93 | 97 | 96 |
参考表2，10000分子量超滤膜超滤后的***原料收率较低；50000-70000分子量超滤膜超滤后的***原料收率高，但是，采用50000分子量超滤膜和70000分子量超滤膜超滤后得到的产品，其大分子物质没有得到非常有效的去除。综合考虑，本申请采用的是30000分子量的超滤膜。
试验例3
试验组别：对比例4-7、实施例1，对比例4-7采用的乙醇体积依次为1倍、3倍、6 倍、7倍，其他同实施例1。
试验方法：
卵泡激素生物效价测定：2010年版药典二部附录XIIM测定；
黄体生成激素生物效价测定：2010年版药典二部附录XIIN测定；
卵泡激素活性回收率测定：(纯化后的***中卵泡激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中卵泡激素的单位体积生物效价×原料液体积)×100％；
黄体生成激素活性回收率：(纯化后的***中黄体生成激素的单位质量生物效价×纯化后的***质量)/(原料液中黄体生成激素的单位体积生物效价×原料液体积) *100％。
试验结果：详见表3。
表3对比例4-7、实施例1产品效价和活性回收率
| 对比例4 | 对比例5 | 实施例1 | 对比例6 | 对比例7 | |
| 乙醇体积倍数 | 1 | 3 | 5 | 6 | 7 |
| 卵泡激素生物效价(IU/mg) | 620 | 630 | 700 | 750 | 650 |
| 卵泡激素活性回收率(％) | 71 | 73 | 90 | 92 | 80 |
| 黄体生成激素生物效价(IU/mg) | 80 | 80 | 120 | 140 | 90 |
| 黄体生成激素活性回收率(％) | 72 | 73 | 93 | 96 | 75 |
参考表3，随着乙醇体积倍数的增加，产品的生物效价和活性回收率均先增加后降低，本申请选取乙醇体积为5-6倍。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种***纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将***粗品溶于醋酸钠溶液中，然后经过亲和层析进行吸附，得到洗脱液A；
S2：将洗脱液A过截留分子量为30000的超滤膜，得超滤浓缩液；
S3：将超滤浓缩液过羧甲基阳离子交换层析柱，得到洗脱液B；
S4：向洗脱液B中加入乙醇溶液进行沉淀、离心，取沉淀；
S5：将沉淀真空干燥、粉碎、过筛得到纯化后的***。
2.如权利要求1所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S1中的醋酸钠溶液的pH＝4-5。
3.如权利要求2所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S2中持续补充醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液，维持浓缩液温度为15-20℃。
4.如权利要求3所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S2中的醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠缓冲液的pH＝7。
5.如权利要求4所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S3中以pH＝5-6的0.05-0.1mol/L醋酸钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270-290nm处的洗脱液。
6.如权利要求5所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S1-S3均在10-20℃下完成。
7.如权利要求6所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S4中洗脱液B与乙醇的体积比为1:4-6。
8.如权利要求7所述的一种***纯化方法，其特征在于，步骤S4中，乙醇溶液的酒精度为80-85％，静置12-14h，离心取沉淀。
9.如权利要求8所述的一种***纯化方法，其特征在于，纯化后的***中卵泡激素生物效价为700-1000IU/mg，黄体生成激素的生物效价100-200IU/mg，卵泡激素的收率为90％-95％，黄体生成激素的收率为92％-96％。
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