KR20140012147A - 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (pi3k) 억제제 및 mtor 억제제의 조합물 - Google Patents

포스파티딜이노시톨-3-키나제 (pi3k) 억제제 및 mtor 억제제의 조합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2-카르복사미드 시클로아미노 우레아 유도체인 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물; 이러한 조합물을 포함하는 제약 조성물; 및 증식성 질환, 보다 구체적으로는 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료에 있어서의 이러한 조합물의 용도에 관한 것이다.

Description

포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K) 억제제 및 MTOR 억제제의 조합물{COMBINATION OF A PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE (PI3K) INHIBITOR AND A MTOR INHIBITOR}
본 발명은 2-카르복사미드 시클로아미노 우레아 유도체인 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물; 이러한 조합물을 포함하는 제약 조성물; 및 증식성 질환, 보다 구체적으로는 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료에 있어서의 이러한 조합물의 용도에 관한 것이다.
포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 억제는 상류 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R) 신호전달을 유도하여 암 세포에서 AKT 활성화를 초래할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 mTOR 억제에 대한 세포 반응의 약화에 중요한 역할을 하는 것으로 시사되었고, mTOR 억제제의 임상 활성을 약화시킬 수 있다. 예를 들어, 진행된 고형 종양을 갖는 환자에 대한 제I상 연구에서, 모든 환자의 종양 중 대략 50%에서 pAKT가 증가하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Taberno et al., Journal of Clinical Oncology, 26 (2008), pp 1603-1610]).
증식성 질환 환자를 위한 다수의 치료 옵션에도 불구하고, 효과적이고 안전한 치료제에 대한 필요성 및 이들을 조합 요법에 우선적으로 사용하기 위한 필요성이 여전히 존재한다. 본원에 제시된 바와 같고 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-(4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일)-아미드를 포함하는 화학식 A의 화합물은, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)의 알파 이소폼(isoform)의 높은 선택적 억제제이다. 놀랍게도 유효량의 화학식 A의 알파-특이적 PI3K 억제제 화합물과 유효량의 1종 이상의 mTOR 억제제의 조합물은 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 의존성 질환, 특히 암의 치료에서 예기치 않은 상승작용적 개선을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 동시, 순차적 또는 개별로 투여시, 이러한 본 발명의 알파-특이적 PI3K 억제제 화합물 및 mTOR 억제제는 상호작용하여 세포 증식을 강하게 억제한다. 이러한 유익한 상호 작용으로 인해 각각의 화합물에 필요한 용량을 감소시키는 것이 가능해지고, 이로써 부작용이 감소되며 치료에서 장기 임상 효과가 있는 화합물이 향상되게 된다.
발명의 개요
본 발명에 의해서 이제 화학식 A의 알파-이소폼 특이적 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 mTOR 억제제에 의한 AKT의 인산화 및 활성화를 감소시키거나 차단시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 화학식 A의 화합물은 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I")이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 mTOR 억제제는 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 mTOR 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 mTOR 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.
추가 측면에서 본 발명은 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하여 mTOR 키나제 의존성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료에 있어 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 화학식 A의 화합물 및 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 mTOR 억제제 (여기서, 활성 성분은 각 경우에 유리 형태로 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 존재함), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체의 조합물을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, mTOR 억제제에 의한 AKT의 인산화 및 활성화를 감소 또는 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 치료 동안 획득된 AKT의 인산화 및 활성화에 의존성인 증식성 질환의 치료 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 치료에 내성을 갖게 되었거나 감소된 민감도를 갖는 증식성 질환의 치료 방법을 제공한다. 내성은 예를 들어 AKT의 인산화 및 활성화에 기인한다.
추가 측면에서 본 발명은 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조합물을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 증식성 질환의 치료 효능의 개선 방법을 제공한다.
한 측면에서 본 발명은 화학식 A의 PI3K 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
도 1은 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 바와 같은 BT474 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제(single agent), (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I") 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473); MAPK (T202/Y204); MEK1/2 (S217/S221)의 인산화 수준 및 액틴 수준을 나타낸다.
도 2는 역 단백질 어레이(Reverse Protein Array) 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 BT474 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473) 인산화 수준을 나타낸다.
도 3은 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 BT474 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (T308) 인산화 수준을 나타낸다.
도 4는 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 BT474 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 총 AKT 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473); MAPK (T202/Y204)의 인산화 수준 및 액틴 수준을 나타낸다.
도 6은 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473) 인산화 수준을 나타낸다.
도 7은 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (T308) 인산화 수준을 나타낸다.
도 8은 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 총 AKT 발현 수준을 나타낸다.
도 9는 웨스턴 블롯에 의해 검출되고 제2 세트의 실험으로 콴터티 원(Quantity One) 소프트웨어를 이용하여 추가로 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473)의 인산화 수준 (패널 A) 및 AKT의 총 수준 (패널 B)을 나타낸다.
도 10은 제2 세트의 실험으로 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473) 인산화 수준을 나타낸다.
도 11은 제2 세트의 실험으로 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (T308) 인산화 수준을 나타낸다.
도 12는 제2 세트의 실험으로 역 단백질 어레이 방법론에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 비히클 대조군과 비교하여 에베롤리무스 (RAD001) 단일 작용제, 화합물 I 단일 작용제, 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 총 AKT 발현 수준을 나타낸다.
도 13은 SKBR-3 인간 유방암 세포 모델에서의 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001) 및/또는 화합물 I 처리로부터의 전(full)용량 매트릭스 세포 증식 데이터를 나타낸다.
도 14는 BT-474 인간 유방암 세포 모델에서의 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001) 및/또는 화합물 I 처리로부터의 전용량 매트릭스 세포 증식 데이터를 나타낸다.
도 15는 T47-D 인간 유방암 세포 모델에서의 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001) 및/또는 화합물 I 처리로부터의 전용량 매트릭스 세포 증식 데이터를 나타낸다.
도 16은 ZR-75-1 인간 유방암 세포 모델에서의 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001) 및/또는 화합물 I 처리로부터의 전용량 매트릭스 세포 증식 데이터를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 (a) 본원에 정의된 바와 같은 화학식 A의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 (b) 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 하기 일반적 정의가 본 명세서에서 적용될 것이다:
달리 언급되지 않는 한, 용어 "포함하는" 및 "비롯한"은 본원에서 그의 개방적 및 비제한적 의미로 사용된다.
본 발명을 기술하는 맥락에서 (특히 하기 특허청구범위의 맥락에서) 용어 정관사("a" 및 "an") 및 부정관사("the") 및 유사 언급은 본원에서 달리 명시되거나 맥락에 의해 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 화합물, 염 등에 복수 형태가 사용되는 경우, 이는 또한 단일 화합물, 단일 염 등을 의미하는 것으로 여겨진다.
"조합물"은 하나의 투여 단위 형태인 고정 조합물을 지칭하거나, 화학식 A의 화합물 및 조합 파트너 (예를 들어, 이하 설명된 바와 같으며, "조합 파트너" 또는 "치료제"로도 칭해지는 또 다른 약물)를 독립적으로 동시에 투여하거나, 특히 시간 간격, 특히 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용 효과를 나타내게 하는 이들 시간 간격 이내에 개별적으로 투여할 수 있는 조합 투여용 부품의 키트를 지칭한다
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제약 조합물"은 1종 초과의 활성 성분을 혼합 또는 조합하여 얻은 생성물을 의미하며, 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물" 또는 "고정 용량"은 활성 성분, 예를 들어 화학식 A의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 개체(single entity) 또는 투여의 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 화학식 I의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 개별 개체로서 동시에, 병용하여, 또는 구체적 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서, 이러한 투여는 치료상 유효 수준의 두 화합물을 그를 필요로 하는 온혈 동물의 체내에 제공한다. 비-고정 조합물은 또한 칵테일(cocktail) 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에 적용된다.
용어 "포스파티딜이노시톨 3-키나제 억제제"는 본원에서 PI 3-키나제를 표적화하고, 감소시키거나 억제하는 화합물을 지칭하는 것으로 정의된다. PI 3-키나제 활성은 인슐린, 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 콜로니-자극 인자, 및 간세포 성장 인자를 비롯한, 다수의 호르몬 및 성장 인자 자극에 대해 증가하는 것으로 나타났고, 세포 성장 및 형질전환과 관련된 과정에 연루되어 왔다.
용어 "제약 조성물"은 본원에서 온혈 동물, 예를 들어 포유동물 또는 인간에게 발병하는 특정 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해, 상기 온혈 동물에게 투여될 1종 이상의 활성 성분 또는 치료제를 함유하는 혼합물 또는 용액을 지칭하는 것으로 정의된다.
용어 "제약상 허용되는"은 본원에서 현명한 의학적 판단의 범위 내에서, 타당한 손익 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 기타 문제가 되는 합병증 없이, 온혈 동물, 예를 들어, 포유동물 또는 인간의 조직과 접촉하기에 적합한 그러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하는 것으로 정의된다.
어구 "치료상 유효량"은 본원에서 그를 필요로 하는 온혈 동물의 활동, 기능 및 반응에서의 임상적으로 중요한 결함을 약 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 사용된다. 별법으로, 치료상 유효량은 그를 필요로 하는 온혈 동물에서 임상적으로 중요한 병태/증상의 개선을 초래하기에 충분하다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체의 적어도 한가지의 증상을 경감, 감소 또는 완화시키거나 질환 진행의 지연을 초래하는 치료를 포함한다. 예를 들어, 치료는 장애의 한가지 이상의 증상의 약화 또는 암과 같은 장애의 완전한 근절일 수 있다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 발병 (즉, 질환의 임상 징후 이전의 기간)을 정지, 지연시키고/거나 질환의 진전 또는 악화의 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 용어 "보호하다"는 본원에서 대상체에서 질환의 진전 또는 지속 또는 악화를 예방, 지연 또는 치료, 또는 적절한 경우 이들 모두를 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 예방될 상태, 질환 또는 장애와 연관되거나 그에 의해 유발된 적어도 한가지 증상의 예방을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "공동 치료 활성" 또는 "공동 치료 효과"는 치료제가 바람직하게는 치료될 온혈 동물, 특히 인간에서 여전히 (바람직하게는 상승작용적) 상호작용 (공동 치료 효과)을 나타내도록 하는 그러한 시간 간격으로 개벌적으로 (장기적인 교체적 방식, 특히 순서-특이적 방식으로) 제공될 수 있다는 것을 의미한다. 공동 치료 효과의 사실 여부는 그 중에서, 화합물 둘 다가 적어도 특정 시간 간격 동안에 치료될 인간의 혈액 중에 존재한다는 것을 보여주는 혈액 수준을 추적함으로써 결정될 수 있다.
WO2010/029082는 특이적 2-카르복사미드 시클로아미노 우레아 유도체를 기재하고, 이는 PI3-키나제 (포스파티딜이노시톨 3-키나제)에 대한 억제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 특이적 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 억제제는 유리한 약리학상 특성을 갖고 PI3-키나제 알파에 대해 베타 및/또는 델타 및/또는 감마 서브타입과 비교하여 개선된 선택성을 나타낸다. 본 발명에 적합한 특이적 2-카르복사미드 시클로아미노 우레아 유도체, 그의 제법 및 이를 함유하는 적합한 제제는 WO2010/029082에 기재되어 있고 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
<화학식 A>
Figure pct00001
상기 식에서,
A는
Figure pct00002
로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로아릴을 나타내고;
R1은 다음의 치환기: (1) 비치환 또는 치환된, 바람직하게는 치환된 C1-C7-알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 9개, 또는 다음의 모이어티 C3-C5-시클로알킬 중 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (2) 임의로 치환된 C3-C5-시클로알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C4-알킬 (바람직하게는 메틸), 플루오로, 시아노, 아미노카르보닐 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개로부터 독립적으로 선택됨); (3) 임의로 치환된 페닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 할로, 시아노, C1-C7-알킬, C1-C7-알킬아미노, 디(C1-C7-알킬)아미노, C1-C7-알킬아미노카르보닐, 디(C1-C7-알킬)아미노카르보닐, C1-C7-알콕시 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (4) 임의로 일치환 또는 이치환된 아민 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로, 클로로, 히드록시의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 페닐술포닐 (이는 비치환되거나 1개 이상, 바람직하게는 1개의, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시, 디(C1-C7-알킬)아미노-C1-C7-알콕시에 의해 치환됨)로부터 독립적으로 선택됨); (5) 치환된 술포닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 피롤리디노 (이는 비치환되거나 중수소, 히드록시, 옥소의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기; 특히 1개의 옥소에 의해 치환됨)로부터 선택됨); (6) 플루오로, 클로로 중 하나를 나타내고;
R2는 수소를 나타내고;
R3은 (1) 수소, (2) 플루오로, 클로로, (3) 임의로 치환된 메틸 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로, 클로로, 디메틸아미노 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 3개로부터 독립적으로 선택됨)을 나타내고,
단, (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({5-[2-(tert-부틸)-피리미딘-4-일]-4-메틸-티아졸-2-일}-아미드)는 제외한다.
화학식 A의 화합물의 정의에서 사용된 바와 같은 라디칼 및 기호는 WO2010/029082에 개시된 바와 같은 의미를 갖고, 이 공보의 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.
본 발명의 바람직한 화합물은 WO2010/029082에 구체적으로 기재된 화합물이다. 본 발명의 매우 바람직한 화합물은 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) (화합물 I) 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)의 합성은 WO2010/029082에 실시예 15로서 기재되어 있다.
본 발명의 제약 조합물은 세린/트레오닌 mTOR 키나제의 활성/기능을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 1종 이상의 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 "mTOR 억제제"로 지칭될 것이고, mTOR 키나제 군의 구성원의 활성/기능을 표적화/억제하는 화합물, 단백질 또는 항체, 예를 들어 RAD 라파마이신 (라파문(RAPAMUNE)이라는 명칭으로도 공지된 시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001, 노바티스(Novartis)) 또는 효소의 ATP-결합 클레프트(cleft)에 직접 결합함으로써 mTOR의 키나제 활성을 억제하는 화합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 에베롤리무스 (RAD001)는 또한 세르티칸(CERTICAN) 또는 아피니토르(AFINITOR)라는 명칭으로 공지되어 있다.
적합한 mTOR 억제제로는, 예를 들어 다음이 포함된다:
I. 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생성되는 면역억제성 락탐 마크롤라이드(macrolide)인 라파마이신.
II. 라파마이신 유도체, 예컨대
a. 치환된 라파마이신, 예를 들어 40-O-치환된 라파마이신 (예를 들어, US 5,258,389, WO 94/09010, WO 92/05179, US 5,118,677, US 5,118,678, US 5,100,883, US 5,151,413, US 5,120,842, WO 93/11130, WO 94/02136, WO 94/02485 및 WO 95/14023에 기재되어 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 포함됨);
b. 16-O-치환된 라파마이신 (예를 들어, WO 94/02136, WO 95/16691 및 WO 96/41807에 기재된 바와 같고, 이들의 내용은 본원에 참고로 포함됨);
c. 32-수소화된 라파마이신 (예를 들어, WO 96/41807 및 US 5,256,790에 기재된 바와 같고, 이들은 본원에 참고로 포함됨).
d. 바람직한 라파마이신 유도체는 하기 화학식 B의 화합물, 또는 R2가 -CH2-CH2-OH인 경우 그의 전구약물, 예를 들어 그의 생리학상 가수분해가능한 에테르이다.
<화학식 B>
Figure pct00003
상기 식에서,
R1은 CH3 또는 C3 - 6알키닐이고,
R2는　H 또는 -CH2-CH2-OH, 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸-프로파노일 또는 테트라졸릴이고, X는 =O, (H,H) 또는 (H,OH)이며,
단, X가 =O이고 R1이 CH3인 경우에, R2는　H 이외의 것이다.
화학식 B의 화합물은, 예를 들어 국제 PCT 출원 WO 94/09010, WO 95/16691 또는 WO 96/41807에 개시되어 있고, 이들은 본원에 참고로 포함된다.　 당해 화합물은 상기 공보에 개시된 바와 같이, 또는 상기 공보에 기재된 절차와 유사하게 제조될 수 있다.
바람직한 화합물은 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디히드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신이고, 더욱 바람직하게는 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신이고, 이는 국제 PCT 출원 WO 94/09010에 실시예 8로서 개시되어 있다.
특히 바람직한 화학식 B의 라파마이신 유도체는 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 (CCI779로도 명명됨), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신 (ABT578로도 명명됨), 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디히드로 라파마이신, 또는 TAFA-93이다.　
e.　또한, 라파마이신 유도체로는, 예를 들어 국제 PCT 출원 WO 98/02441 및 WO 01/14387에 개시된 바와 같은 소위 라팔로그, 예컨대 AP23573, AP23464, 또는 AP23841이 포함된다.
라파마이신 및 그의 유도체는, 예를 들어 국제 PCT 출원 WO 94/09010, WO 95/16691 또는 WO 96/41807에 기재된 바와 같은, 예를 들어 마크로필린-12 (FK-506 결합 단백질 또는 FKBP-12로도 공지됨)에 대해 관찰된 결합 활성도를 기초로 하여, 예를 들어 급성 동종이식 거부반응의 치료에서, 예를 들어 면역억제제로서 유용한 것으로 밝혀졌다.
III.　 FK506의 에틸 유사체인 아스코마이신.
IV.　 효소의 ATP-결합 클레프트에 직접 결합함으로써 mTOR의 키나제 활성을 억제하는 화합물인 AZD08055 (아스트라제네카(AstraZeneca)) 및 OSI-027 (OSI 파마슈티칼즈(Pharmaceuticals)).
V. SAR543, 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669, 아리아드(Ariad)/ 머크 앤드 캄퍼니(Merck & Co.)), AP23841 (아리아드), KU-0063794 (아스트라제네카)/ 쿠도스(Kudos)), INK-128 (인텔리카인(Intellikine)), EX2044, EX3855, EX7518, WYE-125132 (와이어쓰(Wyeth)), XL765 (엑셀리시스(Exelisis)), NV-128 (노보겐(Novogen)), WYE-125132 (와이어쓰), EM101/LY303511 (에밀리엠(Emiliem)).
본 발명에 바람직한 mTOR 억제제는 에베롤리무스 (RAD001)이다. 에베롤리무스 (RAD001)는 화학명 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸}-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자-트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜타온이다. 에베롤리무스 및 유사체는 미국 특허 번호 5,665,772, 1열 39행 내지 3열 11행에 기재되어 있다.
코드 번호, 속명 또는 상표명에 의해 확인되는 활성제의 구조는 표준 개요서 "더 머크 인덱스(The Merck Index)"의 현행판으로부터 또는 데이터베이스, 예를 들어, 패턴츠 인터네셔날 (Patents International) (예를 들어, IMS 월드 퍼블리케이션즈(World Publications))로부터 취할 수 있다. 그의 상응하는 내용은 본원에 참고로 포함된다.
마찬가지로, 그의 제약상 허용되는 염, 상응하는 라세메이트, 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 호변이성질체뿐만 아니라, 존재하는 경우 상기 개시된 화합물 (즉, 화학식 A의 화합물 및 mTOR 억제제)의 상응하는 결정 변형체, 예를 들어 본원에 개시된 용매화물, 수화물 및 다형체가 포함된다. 본 발명의 조합물에서 활성 성분으로 사용된 화합물은 각각 인용 문헌에 기재된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다. 상기 제시된 바와 같은 2종 초과의 개별 활성 성분의 조합물 또한 본 발명의 범위 내에 있으며, 즉 본 발명의 범위 내에 있는 제약 조합물은 3종 이상의 활성 성분을 포함할 수 있을 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I"), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I"), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 mTOR 억제제 에베롤리무스 (RAD001) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
본 발명의 제약 조합물은 그를 필요로 하는 온혈 동물에서 mTOR 키나제 의존성 질환을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 mTOR 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I"), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
용어 "mTOR 키나제 의존성 질환"으로는 하기 증상이 포함되지만 이로 제한되지 않는다:
ㆍ 예를 들어 심장, 폐, 복합 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식 수용자의 치료에 대한 기관 또는 조직 이식 거부반응; 예컨대, 골수 이식에 따른 이식편-대-숙주 질환;
ㆍ 재협착
ㆍ 과오종 증후군, 예컨대 결절성 경화증 또는 카우덴(Cowden) 질환
ㆍ 림프관평활근종증
ㆍ 색소성 망막염
ㆍ 뇌척수염, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 루푸스, 피부근염, 관절염 및 류마티스성 질환을 비롯한 자가면역 질환
ㆍ 스테로이드-내성 급성 림프아세포성 백혈병
ㆍ 피부경화증, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 낭성 섬유증을 비롯한 섬유증 질환
ㆍ 폐 고혈압증
ㆍ 면역조절
ㆍ 다발성 경화증
ㆍ VHL 증후군
ㆍ 카르니 콤플렉스(Carney complex)
ㆍ 가족성 선종성 용종증
ㆍ 연소성 용종증 증후군
ㆍ 버트-호그-두베 증후군
ㆍ 가족성 비후성 심근병증
ㆍ 볼프-파킨슨-화이트(Wolf-Parkinson-White) 증후군
ㆍ 퇴행성 신경 장애, 예컨대 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 치매 (tau 돌연변이에 의해 유발됨), 척수소뇌 운동실조 유형 3, SOD1 돌연변이에 의해 유발되는 운동성 뉴런 질환, 신경 세로이드 리포푸신증/바텐병 (소아과 신경퇴행)
ㆍ 습식 및 건식 황반 변성
ㆍ 근육 소모 (위축, 악액질) 및 근병증, 예컨대 다논병　　
ㆍ 결핵균(M. tuberculosis), A군 연쇄상구균, HSV 유형 I, HIV 감염을 비롯한 세균 및 바이러스 감염
ㆍ 신경섬유종증 유형 1을 비롯한 신경섬유종증
ㆍ 포이츠-예거스(Peutz-Jeghers) 증후군.
게다가, "mTOR 키나제 의존성 질환"으로는 암 및 기타 관련된 악성 종양이 포함된다.　 병리학적 mTOR 신호전달 캐스케이드와 연관된 암의 비제한적인 목록으로는 유방암, 신장 세포 암종, 위 종양, 신경내분비 종양, 림프종 및 전립선암이 포함된다.
증식성 질환의 예로는, 예를 들어 양성 또는 악성 종양, 뇌, 신장, 간, 부신, 방광, 유방, 위, 위 종양, 난소, 결장, 직장, 전립선, 췌장, 폐, 질 또는 갑상선의 암종, 육종, 교아세포종, 다발성 골수종 또는 위장 암, 특히 결장 암종 또는 결장직장 선종 또는 두경부의 종양, 표피 과증식, 건선, 전립선 비대증, 신생물, 상피 형질의 신생물, 림프종, 유방 암종 또는 백혈병이 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 mTOR 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) (화합물 I), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) (화합물 I), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하여 mTOR 키나제 의존성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료에 있어 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) (화합물 I), 및 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 mTOR 억제제 (여기서, 활성 성분은 각 경우에 유리 형태로 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 존재함), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체의 조합물을 제공한다.
본 발명은 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, mTOR 억제제에 의한 AKT의 인산화 및 활성화를 감소 또는 차단하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 치료 동안 획득된 AKT의 인산화 및 활성화에 의존성인 증식성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 치료에 내성을 갖게 되었거나 감소된 민감도를 갖는 증식성 질환의 치료 방법을 제공한다. 내성은 예를 들어 AKT의 인산화 및 활성화에 기인한다.
추가 측면에서 본 발명은 화학식 A의 화합물, 또는 구체적으로 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) (화합물 I), 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조합물을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용한 증식성 질환의 치료 효능의 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 사용되는 mTOR 억제제는 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따라서 특히 바람직한 mTOR 억제제는 시롤리무스 및/또는 에베롤리무스이다.
본 발명에 따른 제약 조성물 또는 조합물은 임상 연구로 시험될 수 있다.　 적합한 임상 연구는, 예를 들어, 증식성 질환을 가진 환자에서의 개방 라벨, 용량 상승 연구일 수 있다.　 이러한 연구는 특히 본 발명의 조합물 중 활성 성분의 상승작용을 입증한다.　 증식성 질환에 대한 유익한 효과는 당업자에게 그 자체로 공지된 이들 연구의 결과를 통해 직접 측정될 수 있다.　 이들 연구는, 특히, 본 발명의 조합물 및 활성 성분을 사용한 단일 요법의 효과를 비교하는 데 적합하다.　 바람직하게는, 작용제 (a)의 용량을 최대 허용 투여량에 도달될 때까지 상승시키고고, 작용제 (b)를 고정 용량으로 투여한다.　 별법으로, 작용제 (a)를 고정 용량으로 투여할 수 있고, 작용제 (b)의 용량을 상승시킬 수 있다.　 각 환자는 매일 또는 간헐적으로 작용제 (a)의 용량을 투여받을 수 있다.　 치료의 효능은 이러한 연구에서, 예를 들어 12주, 18주 또는 24주 후에 매 6주의 증상 점수를 평가하여 측정될 수 있다.　
본 발명의 제약 조합물의 투여는, 본 발명의 조합물에 사용되는 제약상 활성 성분 중 1종만을 적용한 단일 요법과 비교하여, 유익한 효과, 예를 들어 증상의 완화, 증상의 진행 지연 또는 증상 억제에 관한 상승작용적 치료 효과뿐만 아니라, 추가의 놀라운 유익한 효과, 예를 들어 더 적은 부작용, 개선된 삶의 질 또는 감소된 사망률도 초래할 수 있다.
추가의 이점은, 본 발명의 조합물 중 활성 성분을 보다 저용량으로 사용할 수 있다는 것, 예를 들어 종종 더 적은 투여량이 필요한다는 것뿐만 아니라 덜 빈번하게 적용할 수도 있다는 것이며, 이는 부작용의 발생률 또는 중증도를 저하시킬 수 있다. 이는 치료될 환자의 바람과 요구에 따른다.
그를 필요로 하는 온혈 동물에서 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 의존성 질환을 표적화 또는 예방하는 데 공동으로 치료상 유효한 양으로 (a) 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 (b) 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적 중 하나이다.　 이러한 조성물에서, 조합 파트너 (a) 및 (b)는 함께, 교대로 또는 조합된 하나의 단위 투여 형태로 또는 2개의 개별 단위 투여 형태로 개별적으로 투여될 수 있다.　 단위 투여 형태는 또한 고정 조합물일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 (b) 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 의존성 질환에 대해 공동으로 치료상 유효한 양으로 (a) 화학식 A의 화합물 및 (b) 1종 이상의 mTOR 억제제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, (a) 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 (b) 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조합물을 제공한다. 조합 파트너 (a) 및 (b)는 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따라서, 조합 파트너 (a) 및 조합 파트너 (b)의 개별 투여 또는 고정 조합물로의 투여를 위한 제약 조성물, 즉 적어도 2종의 조합 파트너 (a) 및 (b)를 포함하는 단일 생약 조성물은, 그 자체로 공지된 방식으로 제조될 수 있고, 치료상 유효량의 1종 이상의 약리학상 활성 조합 파트너를 예를 들어 상기에 기재된 바와 같이 단독으로, 또는 특히 경장 또는 비경구 적용에 적합한 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 포함하여, 인간을 비롯한 포유동물 (온혈 동물)에게 경장 (예컨대, 경구 또는 직장), 및 비경구 투여하기에 적합한 것이다.
용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 비롯한 오일일 수 있다. 물 또는 수용액, 염류 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 담체로서, 특히 주사용 용액으로서 바람직하게 사용된다. 적합한 제약 담체는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.
경장 또는 비경구 투여용 조합 요법을 위한 제약 제제는, 예를 들어, 단위 투여 형태의 제제, 예컨대 당의정, 정제, 캡슐 또는 좌제, 또는 앰풀이다. 달리 지시되지 않는 한, 이들은 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 통상의 혼합, 과립화, 당-코팅, 용해 또는 동결건조 방법을 이용하여 제조한다. 복수의 투여 단위를 투여함으로써 필요한 유효량을 달성할 수 있으므로 각각의 투여 형태의 개별 투여량에 함유된 조합 파트너의 단위 함량이 그 자체로 유효량을 구성할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다.
적합한 제약 조성물은, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 60%의 활성 성분(들)을 함유할 수 있다.　 본 발명에 따라서 투여되는 화학식 A의 화합물 및 mTOR 억제제의 실제량은 많은 인자, 예컨대 치료될 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적 건강, 사용된 화합물의 효능, 투여의 경로 및 형태, 및 기타 인자에 따라 달라질 것이다. 약물은 1일 1회 초과, 바람직하게는 1일 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 이들 인자 모두는 담당 임상의의 기술 내에 있다.
화학식 A의 화합물을 일일 수용자의 체중 kg당 약 0.05 내지 약 50 mg; 바람직하게는 약 0.1 내지 25 mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mg/kg/일 범위의 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 따라서, 70 kg 개인에게 투여하기 위해, 투여 범위는 가장 바람직하게는 일일 약 35 내지 700 mg일 것이다.
mTOR 억제제 에베롤리무스 (RAD001)는 0.5 내지 1000 mg의 일일 투여량 범위; 바람직하게는 0.5 mg 내지 15 mg의 범위; 가장 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg의 범위로 인간에게 투여될 수 있다.
특히, 치료상 유효량의, 본 발명의 조합물 중 조합 파트너 각각을 동시에 또는 순차적으로 그리고 임의의 순서로 투여할 수 있고, 성분들을 개별적으로 또는 고정 조합물로서 투여할 수 있다.　 예를 들어, 본 발명에 따른 증식성 질환의 예방 또는 치료 방법은, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 공동의 치료상 유효량으로, 바람직하게는 상승작용적 유효량으로, 예를 들어 본원에 기재된 양에 상응하는 매일 또는 간헐적 투여량으로, (i) 제1 작용제 (a)를 유리 형태로 또는 제약상 허용되는 염 형태로 투여하는 것 및 (ii) 작용제 (b)를 유리 형태로 또는 제약상 허용되는 염 형태로 투여하는 것을 포함할 수 있다.　 본 발명의 조합물 중 개별적 조합 파트너는 치료요법의 과정 동안 상이한 횟수로 개별 투여되거나, 분할된 또는 단일의 조합물 형태로 병용 투여될 수 있다.　 더욱이, 용어 "투여하는"은 또한 조합 파트너 그 자체로 생체내 전환되는 조합 파트너의 전구약물의 사용을 포함한다. 따라서, 본 발명은 동시적 또는 교대적 치료의 모든 이러한 섭생을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 용어 "투여하는"는 이에 따라 해석되어야 한다.
본 발명의 조합물에 사용되는 조합 파트너 각각의 효과적 투여량은, 사용되는 특정 화합물 또는 제약 조성물, 투여 방식, 치료될 병태, 치료될 병태의 중증도에 따라 달라질 수 있다.　 따라서, 본 발명의 조합물의 투여 섭생은, 투여 경로 및 환자의 신장 및 간 기능을 비롯한 다양한 인자에 따라 선택된다.　 통상의 기술을 가진 임상의 또는 전문의는 병태의 진행을 완화, 역행 또는 정지시키기 위해 필요한 유효량의 단일 활성 성분을 쉽게 결정하여 처방할 수 있다.　 독성 없이 효능을 초래하는 범위 내로 활성 성분의 농도를 달성하기 위한 최적의 정밀도는, 표적 부위에서 이용가능한 활성 성분의 반응속도론에 기초한 섭생을 요구한다.
본 발명은 추가로 하기 실시양태를 포함한다:
· (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)인 화학식 A의 화합물 및 1종 이상의 mTOR 억제제를 유리 형태로 또는 그의 염의 형태로, SKBR-3 유방암 세포 모델 또는 BT-474 유방암 세포 모델에서 각각 대략 330 nM 내지 3 μM 및 대략 1 nM 내지 27 nM의 상승작용적 조합 범위에 상응하는 조합 범위로 포함하는 인간에게 투여하기 위한 상승작용적 조합물.
· (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)인 화학식 A의 화합물 및 1종 이상의 mTOR 억제제를 유리 형태로 또는 그의 염의 형태로, T47-D 유방암 세포 모델에서 각각 대략 12 nM 내지 100 nM 및 대략 1 nM 내지 27 nM의 상승작용적 조합 범위에 상응하는 조합 범위로 포함하는 인간에게 투여하기 위한 상승작용적 조합물.
· (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)인 화학식 A의 화합물 및 1종 이상의 mTOR 억제제를 유리 형태로 또는 그의 염의 형태로, ZR-75-1 유방암 세포 모델에서 각각 대략 3 μM 및 대략 1 nM 내지 27 nM의 상승작용적 조합 범위에 상응하는 조합 범위로 포함하는 인간에게 투여하기 위한 상승작용적 조합물.
하기 실시예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 BT474 및 MDA - MB -231 유방 종양 세포에서의 화합물 I과 에베롤리무스 ( RAD001 )의 조합물의 효과.
물질 및 방법
화합물의 제법: 화합물 에베롤리무스 (RAD001)를 노바티스 파르마 아게(Novartis Pharma AG)에 의해 합성하였다.　 20 mM의 스톡 용액을　DMSO 중에서 제조하고 -20℃에서 보관하였다. (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I")의 10 mM의 스톡 용액을　DMSO 중에서 제조하고 -20℃에서 보관하였다.
세포 및 세포 배양 조건: 인간 유방 암종 BT474 세포 (ATCC HTB-26) 및 MDA-MB-231 (ATCC HTB-20)을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 미국 메릴랜드주 락빌)으로부터 구입하였다.
BT474 세포를 10% v/v 송아지 태아 혈청 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 하이브리-케어(Hybri-Care) 배지 (ATCC)에서 유지하였다.　 MDA-MB-231 세포를 10% v/v 송아지 태아 혈청 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지 (아미메드 (Amimed), 스위스 알쉬빌)에서 증식시켰다.　 모든 배지에 100 ㎍/mL의 페니실린/스트렙토마이신을 보충하고, 세포를 5% CO2에서 37℃로 유지하였다.
세포 처리 및 세포 추출: BT474 및 MDA-MB-231 세포를 각각 3.3 x 104개 세포/㎠ 및 1.6 X 104개 세포/㎠의 밀도로 시딩(seeding)하고, 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 24시간 동안 DMSO 비히클, 20 nM의 RAD001 및/또는 다양한 농도의 화합물 I로 처리하였다.
세포 용해물을 다음과 같이 제조하였다. 배양 플레이트를 1 mM의 PMSF를 함유한 빙냉 PBS로 1회, 그리고 빙냉 추출 완충제 [50 mM 헤페스(Hepes) (pH 7.4), 150 mM NaCl, 25 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM NaF, 5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 15 mM PPi, 2 mM 나트륨 오르토바나데이트, 10 mM 나트륨 몰리브데이트, 류펩틴 (10 ㎍/mL), 아프로티닌 (10 ㎍/mL), 1 mM DTT 및 1 mM PMSF]로 1회 세척하였다. 프로테아제 억제제를 시그마 케미컬(SIGMA Chemical) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하였다.　 세포를 1% NP-40 (시그마 케미컬즈(SIGMA Chemicals))을 함유한 동일한 완충제 중에서 추출하였다.　 추출물을 균질화시키고, 원심분리에 의해 맑게 하고, 분취하여 -80℃에서 동결시켰다.　 단백질 농도를 BCA 단백질 분석법 (피어스(Pierce), 미국 일리노이주 락포드)을 이용하여 측정하였다.
면역블롯팅법 : 20 마이크로그램의 세포 추출물을 12%의 변성 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 상에서 전기영동으로 분리하고, (250 mA에서 1시간 동안) 습윤-블롯팅에 의해 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터 (PVDF; 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 미국 메사추세츠주 베드포드)로 옮기고, 4℃에서 하기의 1차 항체로 밤새 프로빙하였다:
(a) 항-포스포-Akt (Ser473) (클론 14-05; 1:2000)는 DAKO (덴마크 글로스트루프)로부터 구입하여, PBS, 0.5% v/v 트윈(Tween), 0.5% w/v 밀크 중에 희석시킨것이다.
(b) 항-포스포-MAPK (T202/Y204) (클론 ECA297; 1:50)는 DAKO (덴마크 글로스트루프)로부터 구입하여, PBS, 0.5% v/v 트윈, 0.5% w/v 밀크 중에 희석시킨 것이다.
(c) 항-포스포-MEK 1/2 (S217/S221) (카탈로그 번호 9154; 1:1000)는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입하여, PBS, 0.1% v/v 트윈, 0.5% w/v 밀크 중에 희석시킨 것이다.
(d) 항-액틴 (카탈로그 번호 MAB1501; 1:20,000)은 케미콘(Chemicon) (미국 메사추세츠주 빌러리카)로부터 구입하여, PBS, 0.1% v/v 트윈 중에 희석시킨 것이다.
(상기한) 적절한 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 데코레이션된(decorated) 단백질이 호스래디시 퍼옥시다아제-접합된 항-마우스 또는 항-토끼 면역글로불린에 이어서 향상된 화학발광 (ECL 플러스(Plus) 키트; 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 영국 버킹엄셔)을 이용하여 드러났고, 이를 콴터티 원 소프트웨어 (바이오-래드(Bio-Rad), 독일 뮌헨)를 이용하여 정량화하였다.
각각의 세포 추출물을 하기와 같이 기재된 바와 같이 역 단백질 어레이 방법론에 의해 추가로 정량화하였다.
각각의 세포 추출물을 압전 미세분배-기재의 비-접촉 나노-플롯터(Nano-Plotter) 2.1 (GeSiM, 독일 그로써크만스도르프)을 갖춘 젭토마크(ZeptoMARK)® PWG 단백질 마이크로어레이 칩 (젭토센스(Zeptosens), 스위스 비터스빌) 상에 스폿팅하였다. 젭토마크® 단백질 마이크로어레이를 스폿팅한 후, 칩을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 균일한 차단 결과를 수용하기 위해, CeLyA 차단 완충제 BB1 (젭토센스, 카탈로그 번호 9040)을 초음파 네뷸라이저를 통해 투여하였다. 차단 30분 후, 칩을 탈이온수 (밀리(Milli)-Q 품질, 18㏁ x cm)로 광범위하게 세정하고, 질소 기류에서 건조시켰다.
샘플 스폿팅 및 차단 절차 이후, 젭토마크® 칩을 젭토캐리어(ZeptoCARRIER) (젭토센스, 카탈로그 번호 1100) (그의 6개의 유동 세포가 칩 상의 6개의 어레이로 개별적으로 보내짐)로 옮기고, 200 ㎕ CAB1 CeLyA 분석 완충제 (젭토센스, 카탈로그 번호 9032)로 2회 세척하였다. 이어서, 분석 완충제를 흡인시키고, 각각의 구획을 100 ㎕의 1차 표적 항체 (pAkt Ser473; CST#4060; pAkt Thr308: CST#2965, Akt1 pan: 에피토믹스(Epitomics) # 1085-1)와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 1차 항체를 제거하고, 어레이를 CAB1 완충제로 2회 세척하고, 100 ㎕의 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 647-표지된 항-토끼 IgG Fab 단편 (인비트로겐; #Z25305)과 함께 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 어레이를 200 ㎕의 CAB1 완충제로 2회 세척하였다. 표적-결합된 Fab 단편의 형광을 레이저 (여기 파장 635 nm) 및 CCD 카메라를 이용하여 젭토리더(ZeptoReader) (젭토센스, 스위스 비터스빌) 상에서 판독하였다. 형광 신호를 신호의 강도에 따라 1, 3, 5 및 10초의 노출 시간으로 평가하였다.
각각의 어레이의 형광 영상을 젭토뷰 프로(ZeptoVIEW Pro) 2.0 소프트웨어 (젭토센스, 스위스 비터스빌)에 의해 분석하고, 각각의 신호에 대한 RFI를 계산하였다. 본 실험에서 사용된 항체 및 항체 희석은 다음과 같다:
Figure pct00004
결과:
웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 BT474 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT(S473); MAPK (T202/Y204); MEK1/2 (S217/S221)의 인산화 수준 및 총 액틴 수준을 도 1에 나타냈다.
역 단백질 어레이에 의해 정량화된 바와 같은 BT474 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT(S473), AKT (T308)의 인산화 수준 및 총 AKT 수준을 도 2 내지 도 4에 각각 나타냈다.
웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT(S473); MAPK (T202/Y204)의 인산화 수준 및 총 액틴 수준을 도 5에 나타냈다.
역 단백질 어레이에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT(S473), AKT (T308)의 인산화 수준 및 총 AKT 수준을 도 6 내지 도 8에 각각 나타냈다.
웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되고 제2 세트의 실험으로 콴터티 원 소프트웨어를 이용하여 정량화된 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT (S473)의 인산화 수준 및 총 AKT 수준을 도 9에 나타냈다.
제2 세트의 실험으로 역 단백질 어레이에 의해 정량화된 바와 같은 MDA-MB231 유방 종양 세포에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I과 조합된 에베롤리무스 (RAD001)의 존재하에 AKT(S473), AKT (T308)의 인산화 수준 및 총 AKT 수준을 도 10 내지 도 12에 각각 나타냈다.
실시예 2: SKBR -3 인간 유방암 세포 모델에서의 화합물 I과 에베롤리무스 ( RAD001 )의 조합물의 효과
물질 및 방법
인간 유방암 세포주 SKBR-3을 아메리칸 타입 셀 컬렉션(American Type Cell Collection)으로부터 구매하였다. SKBR-3 인간 유방암 세포주를 HER2 증폭시켰다. SKBR-3 인간 유방암 세포주를 RPMI 1640 (ATCC #30-2001) 또는 10% 송아지 태아 혈청, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 나트륨 피루베이트로 보충된 다른 제시된 배지에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
세포 증식 검정: 제조사의 프로토콜에 따라 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존력 검정기 (프로메가(Promega) #G7573)를 이용하여, 세포 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 요컨대, 384 또는 96 웰 플레이트 상의 25 ㎕ (384 웰) 또는 100 ㎕ (96 웰) 성장 배지에서 1500-50000개의 세포를 플레이팅하고, 세포가 밤새 부착되도록 한 후, 다양한 농도의 약물 또는 약물 조합물과 함께 72시간 인큐베이션하고, 약물 처치의 종결시, 동일 부피의 셀타이터-글로 시약을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 용해시키고, 발광 신호를 엔비전(Envision) 플레이트 판독기에서 기록하였다.
조합물 효과의 계산 방법: 에베롤리무스 (RAD001) 및 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I") 조합물 효과를 평가하고 모든 가능한 농도에서 잠재적 상승작용 효과를 확인하기 위해, "용량 매트릭스"로 조합물 연구를 수행하였고, 여기서, 모든 조합물 검정에서 순차적으로 희석된 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I의 단일 작용제 용량의 모든 가능한 순열로 조합물을 시험하고, 화합물을 동시에 적용하였다. 찰리스 소프트웨어 (Chalice software) (콤비네이토Rx(CombinatoRx), 메사추세츠주 캠브리지)를 이용하여 단일 작용제 용량 반응 곡선, IC50, IC90, 및 상승작용을 모두 분석하였다. 약물 그 자체 용량의 상가적 표준물질 모델(drug-with-itself dose-additive reference model)에 대하여, 조합물의 반응을 그의 단일 작용제의 반응과 비교하여 상승작용을 계산하였다. 이소볼로그램(Isobologram) 상에서 시각화하여, 또는 조합 지수로 수치화하여 용량 상가작용(additivity)으로부터의 편차를 평가할 수 있었다. 또한, 상가작용과 비교한 초과 억제를 전용량-매트릭스 차트로서 플롯팅하여, 상승작용이 발생한 부분을 캡쳐할 수 있었다. 또한, 조합물 효과의 전체 강도를 정량화하기 위해, 데이터와 최고 단일 작용제 표면 사이에서 부피 점수 V HSA=ΣX,Y In f X In f Y ( I 데이터 - I HSA)를 계산하고, 단일 작용제 희석 인자 f X, f Y에 대해 정규화하였다.
결과:
세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 세포를 삼중의 384 웰 플레이트에서 3000개 세포/웰로 플레이팅하고, 측정 전 72시간 동안 화합물로 처리하였다 (도 13). 본 "용량 매트릭스" 연구에서, 27 nM의 고용량 및 1 nM의 저용량으로 순차적으로 3X 희석된 4개의 용량으로 에베롤리무스 (RAD001)를 적용하고, 3 μM의 고용량 및 약 4 nM의 저용량으로 순차적으로 3X 희석된 7개의 용량으로 화합물 I을 적용하였다.
본 연구의 결과를 도 13에 도시하였다. 화합물 I은 단독으로 세포 성장의 농도-의존성 억제를 야기하였고 (이때, Amax (억제의 최대 분율) = 0.40 (DMSO 대조군과 비교하여 40%의 성장 억제)임); 에베롤리무스 (RAD001)는 단일 작용제로서 세포 증식에 대해 유사한 수준의 적은 성장 억제 효과를 나타냈고, IC50, 및 Amax = 0.32를 달성하지 않았다. 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치는 단일 작용제 (에베롤리무스 (RAD001) Amax = 0.32, 및 화합물 I Amax = 0.40)와 비교하여 Amax = 0.63으로, 억제의 최대 수준을 유의하게 증대시켰다. 전체 용량 매트릭스에 걸쳐서, 모든 용량 (1 nM-27 nM)에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 보다 고용량 범위의 화합물 I 부분 (330 nM-3 μM)에 관해 향상된 상승 활성이 관찰되었다. 비교적 낮은 화합물 I 농도 (4 nM-37 nM)에서, 조합물은 본 실험에서 단일 작용제 처치로서 화합물 I 및 에베롤리무스 (RAD001)와 비교하여 추가의 이점을 나타내지 않는 것으로 보였다.
실시예 3: BT -474 유방 종양 세포에서의 화합물 I과 에베롤리무스 ( RAD001 )의 조합물의 효과
물질 및 방법
인간 유방암 세포주 BT-474를 아메리칸 타입 셀 컬렉션으로부터 구매하였다. BT-474 인간 유방암 세포주는 PIK3CA 돌연변이 및 HER2 증폭을 둘 다 포함하였다. BT-474 유방암 세포주를 RPMI 1640 (ATCC #30-2001) 또는 10% 송아지 태아 혈청, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 나트륨 피루베이트로 보충된 다른 제시된 배지에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
세포 증식 검정: 제조사의 프로토콜에 따라 셀타이터-글로® 발광 세포 생존력 검정기 (프로메가 #G7573)를 이용하여, 세포 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 요컨대, 384 또는 96 웰 플레이트 상의 25 ㎕ (384 웰) 또는 100 ㎕ (96 웰) 성장 배지에서 1500-50000개의 세포를 플레이팅하고, 세포가 밤새 부착되도록 한 후, 다양한 농도의 약물 또는 약물 조합물과 함께 72시간 인큐베이션하고, 약물 처치의 종결시, 동일 부피의 셀타이터-글로 시약을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 용해시키고, 발광 신호를 엔비전 플레이트 판독기에서 기록하였다.
조합물 효과의 계산 방법: 에베롤리무스 (RAD001) 및 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I") 조합물 효과를 평가하고 모든 가능한 농도에서 잠재적 상승작용 효과를 확인하기 위해, "용량 매트릭스"로 조합물 연구를 수행하였고, 여기서, 모든 조합물 검정에서 순차적으로 희석된 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I의 단일 작용제 용량의 모든 가능한 순열로 조합물을 시험하고, 화합물을 동시에 적용하였다. 찰리스 소프트웨어 (콤비네이토Rx, 메사추세츠주 캠브리지)를 이용하여 단일 작용제 용량 반응 곡선, IC50, IC90, 및 상승작용을 모두 분석하였다. 약물 그 자체 용량의 상가적 표준물질 모델에 대하여, 조합물의 반응을 그의 단일 작용제의 반응과 비교하여 상승작용을 계산하였다. 이소볼로그램 상에서 시각화하여, 또는 조합 지수로 수치화하여 용량 상가작용으로부터의 편차를 평가할 수 있었다. 또한, 상가작용과 비교한 초과 억제를 전용량-매트릭스 차트로서 플롯팅하여, 상승작용이 발생한 부분을 캡쳐할 수 있었다. 또한, 조합물 효과의 전체 강도를 정량화하기 위해, 데이터와 최고 단일 작용제 표면 사이에서 부피 점수 V HSA=ΣX,Y Inf X Inf Y (I 데이터 - I HSA)를 계산하고, 단일 작용제 희석 인자 f X,f Y에 대해 정규화하였다.
결과:
세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 실험 설정 단계는 SKBR-3 모델에 대해 상기 기재된 실험 절차와 동일하였다 (도 14). 그리고 동일한 "용량 매트릭스" (에베롤리무스 (RAD001): 4개의 용량, 3X, 1 nM 내지 27 nM, 화합물 I: 7개의 용량, 3X, 4 nM 내지 3 μM)를 적용하였다.
본 연구의 결과를 도 14에 도시하였다. 화합물 I은 단독으로 세포 성장의 농도-의존성 억제를 야기하였고 (이때, IC50은 대략 3μM이고 Amax는 대략 0.53 (DMSO 대조군과 비교하여 53%의 성장 억제)임); 에베롤리무스 (RAD001)는 단일 작용제로서 세포 증식에 대한 적은 성장 억제 효과를 나타냈고, IC50, 및 Amax = 0.36를 달성하지 않았다. 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치는 단일 작용제 (에베롤리무스 (RAD001) Amax = 0.36, 및 화합물 I Amax = 0.53)와 비교하여 Amax = 0.66으로, 억제의 최대 수준을 유의하게 증대시켰다. 전체 용량 매트릭스에 걸쳐서, 모든 용량 (1 nM-27 nM)에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 고용량 화합물 I (330 nM-3 μM)에 관해 향상된 상승 활성이 관찰되었다. 더 낮은 화합물 I 농도 (4 nM-37 nM)에서, 조합물은 본 실험에서 단일 작용제 처치로서 화합물 I 및 에베롤리무스 (RAD001)와 비교하여 추가의 이점을 나타내지 않는 것으로 보였다.
실시예 4: T47 -D 인간 유방암 세포 모델에서의 화합물 I과 에베롤리무스 ( RAD001 )의 조합물의 효과
물질 및 방법
인간 유방암 세포주 T47-D를 아메리칸 타입 셀 컬렉션으로부터 구매하였다. T47-D 인간 유방암 세포주는 PIK3CA 돌연변이를 포함하였다. T47-D 인간 유방암 세포주를 RPMI 1640 (ATCC #30-2001) 또는 10% 송아지 태아 혈청, 2 mmol/ L-글루타민 및 1% 나트륨 피루베이트로 보충된 다른 제시된 배지에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
세포 증식 검정: 제조사의 프로토콜에 따라 셀타이터-글로® 발광 세포 생존력 검정기 (프로메가 #G7573)를 이용하여, 세포 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 요컨대, 384 또는 96 웰 플레이트 상의 25 ㎕ (384 웰) 또는 100 ㎕ (96 웰) 성장 배지에서 1500-50000개의 세포를 플레이팅하고, 세포가 밤새 부착되도록 한 후, 다양한 농도의 약물 또는 약물 조합물과 함께 72시간 인큐베이션하고, 약물 처치의 종결시, 동일 부피의 셀타이터-글로 시약을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 용해시키고, 발광 신호를 엔비전 플레이트 판독기에서 기록하였다.
조합물 효과의 계산 방법: 에베롤리무스 (RAD001) 및 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I") 조합물 효과를 평가하고 모든 가능한 농도에서 잠재적 상승작용 효과를 확인하기 위해, "용량 매트릭스"로 조합물 연구를 수행하였고, 여기서, 모든 조합물 검정에서 순차적으로 희석된 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I의 단일 작용제 용량의 모든 가능한 순열로 조합물을 시험하고, 화합물을 동시에 적용하였다. 찰리스 소프트웨어 (콤비네이토Rx, 메사추세츠주 캠브리지)를 이용하여 단일 작용제 용량 반응 곡선, IC50, IC90, 및 상승작용을 모두 분석하였다. 약물 그 자체 용량의 상가적 표준물질 모델에 대하여, 조합물의 반응을 그의 단일 작용제의 반응과 비교하여 상승작용을 계산하였다. 이소볼로그램 상에서 시각화하여, 또는 조합 지수로 수치화하여 용량 상가작용으로부터의 편차를 평가할 수 있었다. 또한, 상가작용과 비교한 초과 억제를 전용량-매트릭스 차트로서 플롯팅하여, 상승작용이 발생한 부분을 캡쳐할 수 있었다. 또한, 조합물 효과의 전체 강도를 정량화하기 위해, 데이터와 최고 단일 작용제 표면 사이에서 부피 점수 V HSA=ΣX,Y Inf X Inf Y (I 데이터 - I HSA)를 계산하고, 단일 작용제 희석 인자 f X,f Y에 대해 정규화하였다.
결과:
세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 실험 설정 단계는 SKBR-3 모델에 대해 상기 기재된 실험 절차와 동일하였다 (도 15). 그리고 동일한 "용량 매트릭스" (에베롤리무스 (RAD001): 4개의 용량, 3X, 1 nM 내지 27 nM, 화합물 I: 7개의 용량, 3X, 4 nM 내지 3 μM)를 적용하였다.
본 연구의 결과를 도 15에 도시하였다. 화합물 I은 단독으로 세포 성장의 유의한 농도-의존성 억제를 야기하였고 (이때, IC50은 대략 330 nM이고 Amax는 대략 0.67 (DMSO 대조군과 비교하여 67%의 성장 억제)임); 에베롤리무스 (RAD001)는 단일 작용제로서 세포 증식에 대한 적은 성장 억제 효과를 나타냈고, IC50, 및 Amax = 0.37을 달성하지 않았다. 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치는 단일 작용제 화합물 I 처리 (Amax = 0.67)와 비교하여 Amax = 0.68로, 억제의 최대 수준을 증대시키지 않았다. 전체 용량 매트릭스에 걸쳐서, 모든 용량 (1 nM-27 nM)에서의 에베롤리무스 (RAD001) 및 비교적 용량 화합물 I (12 nM-100 nM)에 관해 약간 향상되고 약한 상승 활성이 관찰되었다. 상한 및 하한의 화합물 I의 농도 둘 다 (4 nM, 330 nM-3 μM)에서, 조합물은 본 실험에서 단일 작용제 처치로서 화합물 I 및 에베롤리무스 (RAD001)와 비교하여 추가의 이점을 나타내지 않는 것으로 보였다.
실시예 5: ZR -75-1 인간 유방암 세포 모델에서의 화합물 I과 에베롤리무스 (RAD001)의 조합물의 효과
물질 및 방법
인간 유방암 세포주 ZR-75-1을 아메리칸 타입 셀 컬렉션으로부터 구매하였다. ZR-75-1 인간 유방암 세포주는 PTEN 돌연변이를 포함하였다. ZR-75-1 인간 유방암 세포주를 RPMI 1640 (ATCC #30-2001) 또는 10% 송아지 태아 혈청, 2 mmol/ L-글루타민 및 1% 나트륨 피루베이트로 보충된 다른 제시된 배지에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
세포 증식 검정: 제조사의 프로토콜에 따라 셀타이터-글로® 발광 세포 생존력 검정기 (프로메가 #G7573)를 이용하여, 세포 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 요컨대, 384 또는 96 웰 플레이트 상의 25 ㎕ (384 웰) 또는 100 ㎕ (96 웰) 성장 배지에서 1500-50000개의 세포를 플레이팅하고, 세포가 밤새 부착되도록 한 후, 다양한 농도의 약물 또는 약물 조합물과 함께 72시간 인큐베이션하고, 약물 처치의 종결시, 동일 부피의 셀타이터-글로 시약을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 용해시키고, 발광 신호를 엔비전 플레이트 판독기에서 기록하였다.
조합물 효과의 계산 방법: 에베롤리무스 (RAD001) 및 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I") 조합물 효과를 평가하고 모든 가능한 농도에서 잠재적 상승작용 효과를 확인하기 위해, "용량 매트릭스"로 조합물 연구를 수행하였고, 여기서, 모든 조합물 검정에서 순차적으로 희석된 에베롤리무스 (RAD001) 및 화합물 I의 단일 작용제 용량의 모든 가능한 순열로 조합물을 시험하고, 화합물을 동시에 적용하였다. 찰리스 소프트웨어 (콤비네이토Rx, 메사추세츠주 캠브리지)를 이용하여 단일 작용제 용량 반응 곡선, IC50, IC90, 및 상승작용을 모두 분석하였다. 약물 그 자체 용량의 상가적 표준물질 모델에 대하여, 조합물의 반응을 그의 단일 작용제의 반응과 비교하여 상승작용을 계산하였다. 이소볼로그램 상에서 시각화하여, 또는 조합 지수로 수치화하여 용량 상가작용으로부터의 편차를 평가할 수 있었다. 또한, 상가작용과 비교한 초과 억제를 전용량-매트릭스 차트로서 플롯팅하여, 상승작용이 발생한 부분을 캡쳐할 수 있었다. 또한, 조합물 효과의 전체 강도를 정량화하기 위해, 데이터와 최고 단일 작용제 표면 사이에서 부피 점수 V HSA=ΣX,Y Inf X Inf Y (I 데이터 - I HSA)를 계산하고, 단일 작용제 희석 인자 f X,f Y에 대해 정규화하였다.
결과:
세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 세포 증식에 대한 단일 작용제 및 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치의 효과를 상기 기재된 셀 타이터 글로우 (CTG) 검정을 이용하여 평가하였다. 실험 설정 단계는 SKBR-3 모델에 대해 상기 기재된 실험 절차와 동일하였다 (도 16). 그리고 동일한 "용량 매트릭스" (에베롤리무스 (RAD001): 4개의 용량, 3X, 1 nM 내지 27 nM, 화합물 I: 7개의 용량, 3X, 4 nM 내지 3 μM)를 적용하였다.
본 연구의 결과를 도 16에 도시하였다. 화합물 I은 단독으로 세포 성장의 유의한 억제를 야기하지 않았고 (이때, Amax는 대략 0.16 (DMSO 대조군과 비교하여 16%의 성장 억제)임); 에베롤리무스 (RAD001)는 단일 작용제로서 세포 증식에 대해 보다 우수한 성장 억제 효과를 나타냈다 (이때, IC50은 대략 15 nM이고 Amax = 0.55임). 병용된 에베롤리무스 (RAD001)/화합물 I 처치는 단일 작용제 (에베롤리무스 (RAD001) Amax = 0.55, 및 화합물 I Amax = 0.16)와 비교하여 Amax = 0.67로, 억제의 최대 수준을 유의하게 증대시켰다. 그러나, 전체 용량 매트릭스에 걸쳐서, 유의하고 약한 상승작용 효과의 증대는 최고 용량의 화합물 1 (3μM)에서 관찰되었다. 보다 저용량 범위의 화합물 I (4 nM-1 μM)에서, 조합물은 본 실험에서 단일 작용제 처치로서 화합물 I 및 에베롤리무스 (RAD001)와 비교하여 추가의 이점을 나타내지 않는 것으로 보였다.
실시예 6: DU145 인간 전립선 암종 누드 마우스 이종이식 모델에서 화합물 I과 에 베롤리무스 ( RAD001 )의 조합물의 효과
방법 및 물질:
연구 제1일에 21.0 - 31.3 g의 체중 (BW) 범위를 갖는 8주령의 수컷 누드 마우스 (nu/nu, 하를란(Harlan))를 사용하였다. 동물에게 물 (역삼투, 1 ppm Cl)과 18.0% 조 단백질, 5.0% 조 지방, 및 5.0% 조 섬유질로 이루어진 NIH 31 변형 및 조사된(Modified and Irradiated) 랩 다이어트(lab Diet)(R)를 무제한 급식하였다. 마우스를 21-22℃ 및 40-60% 습도에서 12시간 광주기로 정적 마이크로아이솔레이터(static microisolator)에서 조사 인리치-오콥스(Enrich-o'cobs)(TM) 실험 동물 베딩(Laboratory Animal Bedding)에서 하우징하였다.
DU145 인간 전립선 암종 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 구입하였다. DU145 세포주를 10% 송아지 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 유닛/ mL 페니실린 G 나트륨, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 술페이트, 2 ㎍/mL 겐타마이신, 10 mM 헤페스, 및 0.075% 중탄산나트륨을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 기하급수적으로 성장하는 배양물에서 유지하였다. 종양 세포를 5% CO2 및 95% 공기의 대기에서 37℃에서 습식 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크에서 배양하였다.
DU145 전립선 암종 세포를 기하급수적 성장 동안 수확하고 50% 마트리겔(Matrigel)™ (BD 바이오사이언시즈(Biosciences))를 함유한 냉 PBS 중 5 x 107개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 0.2 mL 현탁액 (1 x 107개 세포)을 각각의 누드 마우스에 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 평균 부피가 목적하는 100-150 ㎣ 범위에 도달함에 따라 그들의 성장을 모니터링하기 위해 종양을 2차원적으로 캘리퍼스로 쟀다. 종양 크기 (㎣)를 종양 부피 = (폭2 x 길이)/2로부터 계산하였다. 종양 중량은 1 mg이 1 ㎣의 종양 부피에 해당한다는 가정하에 추산될 수 있다. 종양 이식 7일 후에, 연구 제1일에, 개별 종양 크기가 144-196 ㎣인 마우스를 군 평균 종양 부피가 181-184 ㎣인 10마리의 마우스의 11개의 군으로 나누었다.
(S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드) ("화합물 I")를 실온에서 용해될 때까지 N-메틸피롤리돈 (NMP; 최종 부피의 10%) 중에서 교반하였다. 폴리에틸렌 글리콜 300 (PEG300)을 첨가하고 (최종 부피의 30%), 이어서 솔루톨(Solutol)® HSS15 (최종 부피의 20%)를 첨가하고, 혼합물을 균질할 때까지 교반하였다. 최종 부피를 탈이온수 (최종 부피의 40%)를 첨가함으로써 달성하였다. 화합물 I 비히클, NMP: PEG300: 솔루톨® HS15: 탈이온수 (10:30:20:60)를, "비히클 1"로서 지정하였다. 비히클 1을 사용하여 고용량 용액을 희석함으로써 보다 저용량의 용액을 제조하였다. 신선한 투여 용액을 매주 제조하여 빛을 차단하면서 4℃에서 보관하였다.
에베롤리무스 (RAD001)를 2% (w/w) 활성 성분, 즉 20 mg RAD001/g을 함유한 마이크로에멀젼 중에서 제제화하였고; 마이크로에멀젼의 밀도는 0.995 g/㎤이었다. RAD001 마이크로에멀젼을 분취하여 처음에 -20℃에서 보관하였다. 스톡의 분취액을 해동하고, 중량을 잰 일일 분량으로 나누고, 4℃에서 보관하였다. 각각의 처리일에, RAD001 분취액을 실온으로 만들고 물 중 덱스트로스 (D5W)로 희석하여 최고 용량의 1 mg/mL 용액을 제공하였다. 이 스톡을 D5W로 희석하여 보다 저용량의 용액을 제조하였다. D5W로 희석된 위약 마이크로에멀젼을 "비히클 2"로서 지정하였다.
처리 계획:
화합물 I, RAD001, 및 그의 비히클을 각각 21일간 연속해서 (qd x 21) 1일 1회 경구 위관 영양법 (p.o.)으로 투여하였다. 조합 요법을 위해 제1일-제20일에, RAD001을 화합물 I 후에 30분 이내 투여하였다. 군 10에서 제21일 및 제7일에, RAD001 직후 화합물 I을 케이지 기준으로 케이지 상에 투여하였다. 파클리탁셀은 5회 용량 (qod x 5)의 경우 격일로 1일 1회 볼루스 꼬리 정맥 주사 (i.v.)에 의해 투여하였다. 투여 부피, 10 mL/kg ().2 mL/20 g 마우스)를, 금요일 BW를 이월하는 주말을 제외하고는, 투여일에 측정된 바와 같은 각각의 동물에게 중량에 따라 조정하였다.
11개 군의 누드 마우스 (n = 군당 10)를 다음과 같이 처리하였다: 군 1 마우스는 비히클 1 및 비히클 2를 투여받았고, 모든 분석을 위해 대조군으로서의 역할을 하였다. 군 2-4는 12.5, 25, 및 50 mg/kg 화합물 I 각각을 사용한 단일 요법을 투여받았다. 군 5-7은 2.5, 5, 및 10 mg/kg RAD001 각각을 사용한 단일 요법을 투여받았다. 군 8은 12.5 mg/kg 화합물 I을 10 mg/kg RAD001과 조합하여 투여받았다. 군 9는 25 mg/kg 화합물 I을 5 mg/kg RAD001과 조합하여 투여받았다. 군 10은 50 mg/kg 화합물 I을 2.5 mg/kg RAD001과 조합하여 투여받았고; 독성 때문에, 이러한 처치는 각각의 작용제의 7회 용량 (qd x 7) 후에 중지하였다. 군 11은 25 mg/kg 파클리탁셀을 투여받았다.
종양 성장 억제:
치료 효능을 제21일에 측정하였다. 통계 및 그래프 분석의 목적으로, ΔTV (제1일 (투여 시작)과 종점 일 사이의 종양 부피의 차이)를 제21일까지 생존하는 각각의 동물에 대해 측정하였다. 각 처리군에 대해, 종점 일에 대한 반응은 하기 관계식에 의해 계산하였다.
Figure pct00005
상기 식에서, ΔΤ = (종점 일에 처리군의 평균 종양 부피) - (제1일에 처리군의 평균 종양 부피)이고, ΔC = (종점 일에 대조군의 평균 종양 부피) - (제1일에 대조군의 평균 종양 부피)이다. 40% 미만의 T/C 값을 달성하는 처치는 잠재적인 치료 활성을 나타내는 것으로 분류될 수 있다.
퇴행 반응의 기준:
치료 효능은 또한 퇴행 반응의 수로부터 측정될 수 있다. 치료는 동물에서 종양의 부분 퇴행 (PR) 또는 완전 퇴행 (CR)을 유발할 수 있다. PR은 종양 부피가 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 그의 제1일 부피의 50% 이하이고, 이들 3회 측정 중 하나 이상에 대해 13.5 ㎣ 이상이었음을 나타낸다. CR은 종양 부피가 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 13.5 ㎣ 미만이었음을 나타낸다.
독성:
연구의 종료 때까지 제1일-제5일, 및 각각의 처리 일 (주말 제외)에 동물의 체중을 쟀다. 최대 관용 용량에 대한 허용되는 독성은 시험하는 동안 15% 미만의 군 평균 BW 손실 및 10마리의 동물 중 1마리 이하의 치료-관련(TR) 사망으로서 정의된다. 1회 측정에 대해 20%를 초과하는 BW 손실을 갖는 임의의 동물은 안락사시키고, 군에서 최초 사망이 아니라면 TR 사망으로 분류하였다. 치료 관련되지 않은 (NTR) 사망은 NTRa (사고 또는 실수로 인함), NTRu (원인 불명으로 인함), 또는 NTRm (침입 및/또는 전이에 의한 부검-확인된 종양 전파)으로서 분류하였다. 최대 정보를 제공하면서 동물을 보호하기 위해 군에서 최초 사망을 NTRu로서 분류하지만, 후속 군의 수행이 치료가 독성인 것으로 나타낼 경우 사망을 TR로서 재분류하였다.
샘플링:
제7일에, 군 10의 동물 #1-4를 CO2 마취하에 말단 심장 천자에 의해 투여 2시간 후 안락사시켰다. 제8일에, 투여 24시간 후에, 동물 #5를 마찬가지로 샘플링하였다. 각각의 동물로부터 전체 부피의 혈액을 수집하고 개별적으로 항응고제로서 K-EDTA를 사용하여 혈장에 대해 가공하였다. 혈장 샘플을 -80℃에서 동결시켰다. 종양을 절제하고 액체 N2에서 속히(snap) 동결시켰다. 제21일에 2시간 및 24시간 최종 투여 후에, 군 1, 4, 6 및 9에서 시점 당 4마리의 동물을 이전에 기재된 바와 같이 혈액 및 종양에 대해 샘플링하였다.
원(raw) 데이터에서, 군 4 동물 #2, 6 및 7은 연구를 TR 사망으로 종료하였고; 군 9 동물 #4 및 10은 각각 TR 및 NTR로 종료하였다. 이들 동물은 실제로 제21일까지 생존하였고 샘플링되었다.
통계 및 그래프 분석:
통계 및 그래프 분석을 윈도우용 프리즘(Prism) 3.03 (그래프 패드(Graph Pad))로 수행하였다. 처리군 대 대조군 마우스의 평균 ΔTV 값 사이의 차이의 유의성을 분산 분석 (ANOVA)에 의해, 바틀렛 검정(Bartlett's test), 및 사후 던네트(Dunnett's) 다중 비교 검정으로 결정하였다. 바틀렛 검정이 분산 중에서 유의한 차이 (P< 0.0001)를 나타낸 경우, 결과를 비모수(nonparametric) 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정으로 분석하였고, 이는 평균 부피 변화에서 유의한 차이 (P<0.0001)를 보였다. 군 사이의 차이를 던의 다중 비교 검정으로 사후 분석하였다. 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 이용하여 2개의 군에서의 평균 부피 변화를 비교하였다. 양측(two-tailed) 통계 검정을 P = 0.05에서 수행하였다. 프리즘은 검정 결과를 P > 0.05에서 유의하지 않은 (ns) 것으로, 0.01 < P ≤ 0.05에서 유의한 것 ("*"으로 기호화됨)으로, 0.001 < P ≤ 0.01에서 매우 유의한 것 ("**"으로 기호화됨)으로, 그리고 P ≤ 0.001에서 극히 유의한 것 ("***"으로 기호화됨)으로 요약하였다. 통계적 유의성의 검정은 군 사이의 차이의 규모의 추정치를 제공하지 않기 때문에, 모든 수준의 유의성은 유의하거나 유의하지 않은 것 중 둘 중 하나로 기재된다.
산점도(scatter plot)는 개별 동물에 대한 ΔTV 값을 군으로 나타낸 것으로 이해된다. 군 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM), 또는 평균 종양 부피를 시간의 선형 함수로서 플롯팅하였다. 연구의 과정에 걸쳐 군 평균 BW 변화를 제1일로부터 % 변화, ± SEM으로서 플롯팅하였다. TR 사망이 10%를 초과하는 경우 종양 성장 곡선을 절두하였다.
결과:
연구로부터 하기 데이터를 수득하였다:
Figure pct00006
연구 종료점 = 1000 ㎣; 진행일수 = 21.
n = 처리-관련, 사고, 또는 원인 불명, 또는 샘플링을 위한 안락사로 인해 죽지 않은 군에서의 동물의 수
평균 부피 변화 = 제1일과 제21일 사이의 군 평균 부피 변화
T/C = 100 x (ΔT/ ΔC) = 대조군 1에서의 변화 (ΔC)와 비교한 처리군 (ΔT)의 평균 종양 부피에서 제1일과 제21일 사이의 % 변화
통계적 유의성 (크러스칼-왈리스 및 사후 던 다중 비교 검정): ne = 평가 불가능함, ns = 유의하지 않음, * = P < 0.05; *** = p < 0.001 (명시된 군과 비교됨).
평균 BW 최저 = 제1일에서 제21일까지의 % 변화로서 최저의 군 평균 체중; --는 평균 체중의 감소가 관찰되지 않았음을 나타낸다.
ES = 샘플링을 위해 안락사됨.
본 연구에서, 비히클-처리군 1 마우스에 대한 ΔTV 값의 넓은 범위는 개별 동물 사이에서 9.9배 이하의 차이를 초래하였다. 모든 처리가 잠재적인 치료 활성을 의미하는 40% 역치 미만의 T/C 값을 초래하였기 때문에, 유의한 활성이 여전히 관찰되었다.
12.5: 10 및 25:5 mg/kg 용량 비 (군 8 및 군 9)에서의 화합물 I/ RAD001 조합물은 29% 및 15% T/C, 및 통계적으로 유의한 활성 (P < 0.05 및 P < 0.001)을 각각 초래하였다. 12.5:10 mg/kg 비 (군 8)에서의 조합 요법은 군 2 및 군 7 각각에서 화합물 I 및 RAD001 단일 요법을 개선시켰으나; 군 8에 대한 ΔTV 값은 군 2 및 군 7에 대한 값의 범위 내에 있고, 단일 요법에 비해 통계적으로 유의한 개선이 관찰되지 않았다.
25:5 mg/kg 비 (군 9)에서의 조합 요법은 15% T/C를 초래하였고, 따라서 군 3에서의 화합물 I 단일 요법 (16% T/C)을 약간 개선시켰다. 50:2.5 mg/kg 용량비에서 화합물 I/RAD001의 조합은 처리 중단시 제5일에 19.4% 군 평균 BW 손실; 및 제7일까지 50% 사망률을 초래하였다.

Claims (14)

  1. a) 화학식 A의 화합물 또는 그의 염
    <화학식 A>
    Figure pct00007

    [상기 식에서,
    A는
    Figure pct00008
    로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로아릴을 나타내고;
    R1은 다음의 치환기: (1) 비치환 또는 치환된, 바람직하게는 치환된 C1-C7-알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 9개, 또는 다음의 모이어티 C3-C5-시클로알킬 중 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (2) 임의로 치환된 C3-C5-시클로알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C4-알킬 (바람직하게는 메틸), 플루오로, 시아노, 아미노카르보닐 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개로부터 독립적으로 선택됨); (3) 임의로 치환된 페닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 할로, 시아노, C1-C7-알킬, C1-C7-알킬아미노, 디(C1-C7-알킬)아미노, C1-C7-알킬아미노카르보닐, 디(C1-C7-알킬)아미노카르보닐, C1-C7-알콕시 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (4) 임의로 일치환 또는 이치환된 아민 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로, 클로로, 히드록시의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 페닐술포닐 (이는 비치환되거나 1개 이상, 바람직하게는 1개의, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시, 디(C1-C7-알킬)아미노-C1-C7-알콕시에 의해 치환됨)로부터 독립적으로 선택됨); (5) 치환된 술포닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 피롤리디노 (이는 비치환되거나 중수소, 히드록시, 옥소의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기; 특히 1개의 옥소에 의해 치환됨)로부터 선택됨); (6) 플루오로, 클로로 중 하나를 나타내고;
    R2는 수소를 나타내고;
    R3은 (1) 수소, (2) 플루오로, 클로로, (3) 임의로 치환된 메틸 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로, 클로로, 디메틸아미노 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 3개로부터 독립적으로 선택됨)을 나타내고,
    단, (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({5-[2-(tert-부틸)-피리미딘-4-일]-4-메틸-티아졸-2-일}-아미드)는 제외함]
    및
    b) 1종 이상의 mTOR 억제제
    를 포함하는 제약 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 A의 화합물이 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)인 제약 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, mTOR 억제제가 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로부터 선택되는 것인 제약 조합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제약 조합물.
  5. 제1항에 따른 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 mTOR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
  6. 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한,
    화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염
    <화학식 A>
    Figure pct00009

    [상기 식에서,
    A는
    Figure pct00010
    로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로아릴을 나타내고;
    R1은 다음의 치환기: (1) 비치환 또는 치환된, 바람직하게는 치환된 C1-C7-알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 9개, 또는 다음의 모이어티 C3-C5-시클로알킬 중 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (2) 임의로 치환된 C3-C5-시클로알킬 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C4-알킬 (바람직하게는 메틸), 플루오로, 시아노, 아미노카르보닐 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 4개로부터 독립적으로 선택됨); (3) 임의로 치환된 페닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 할로, 시아노, C1-C7-알킬, C1-C7-알킬아미노, 디(C1-C7-알킬)아미노, C1-C7-알킬아미노카르보닐, 디(C1-C7-알킬)아미노카르보닐, C1-C7-알콕시 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 2개로부터 독립적으로 선택됨); (4) 임의로 일치환 또는 이치환된 아민 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로, 클로로, 히드록시의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 페닐술포닐 (이는 비치환되거나 1개 이상, 바람직하게는 1개의, C1-C7-알킬, C1-C7-알콕시, 디(C1-C7-알킬)아미노-C1-C7-알콕시에 의해 치환됨)로부터 독립적으로 선택됨); (5) 치환된 술포닐 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: C1-C7-알킬 (이는 비치환되거나 중수소, 플루오로의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기에 의해 치환됨), 피롤리디노 (이는 비치환되거나 중수소, 히드록시, 옥소의 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기; 특히 1개의 옥소에 의해 치환됨)로부터 선택됨); (6) 플루오로, 클로로 중 하나를 나타내고;
    R2는 수소를 나타내고;
    R3은 (1) 수소, (2) 플루오로, 클로로, (3) 임의로 치환된 메틸 (여기서, 상기 치환기는 다음의 모이어티: 중수소, 플루오로, 클로로, 디메틸아미노 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 3개로부터 독립적으로 선택됨)을 나타내고,
    단, (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({5-[2-(tert-부틸)-피리미딘-4-일]-4-메틸-티아졸-2-일}-아미드)는 제외함]; 및
    1종 이상의 mTOR 억제제의 용도.
  7. 제6항에 있어서, 화학식 A의 화합물이 (S)-피롤리딘-1,2-디카르복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)인 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, mTOR 억제제가 RAD 라파마이신 (시롤리무스) 및 그의 유도체/유사체, 예컨대 에베롤리무스 (RAD001), 템시롤리무스 (CCI-779), 조타롤리무스 (ABT578), SAR543, 아스코마이신 (FK506의 에틸 유사체), 데페롤리무스 (AP23573/ MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132, 및 EM101/LY303511로부터 선택되는 것인 용도.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 치료될 질환이 양성 또는 악성 종양; 뇌, 신장, 간, 부신, 방광, 유방, 신장 세포 암종, 신경내분비 종양, 전립선, 위, 위 종양, 난소, 결장, 직장, 전립선, 췌장, 폐, 질 또는 갑상선의 암종, 육종, 교아세포종, 다발성 골수종 또는 위장 암, 특히 결장 암종 또는 결장직장 선종 또는 두경부의 종양, 표피 과증식, 건선, 전립선 비대증, 신생물, 상피 형질의 신생물, 림프종, 유방 암종 또는 백혈병; 기관 또는 조직 이식 거부반응; 재협착; 결절성 경화증; 카우덴 질환; 림프관평활근종증; 색소성 망막염; 자가면역 질환; 스테로이드-내성 급성 림프아세포성 백혈병; 섬유증 질환; 폐 고혈압증; 면역조절; 다발성 경화증; VHL 증후군; 카르니 콤플렉스; 가족성 선종성 용종증; 연소성 용종증 증후군; 버트-호그-두베 증후군; 가족성 비후성 심근병증; 볼프-파킨슨-화이트 증후군; 퇴행성 신경 장애; 습식 및 건식 황반 변성; 근육 소모 (위축, 악액질) 또는 근병증; 세균 또는 바이러스 감염; 신경섬유종증 또는 포이츠-예거스 증후군인 용도.
    [청구항 9]
    제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 라파마이신 표적 (mTOR) 키나제 의존성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제약 조합물.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 라파마이신 표적 (mTOR) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하여 mTOR 키나제 의존성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  11. 치료상 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제를 이용한 치료에서 획득된 AKT의 인산화 및 활성화에 의존성인 증식성 질환의 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 치료될 질환이 양성 또는 악성 종양; 뇌, 신장, 간, 부신, 방광, 유방, 신장 세포 암종, 신경내분비 종양, 전립선, 위, 위 종양, 난소, 결장, 직장, 전립선, 췌장, 폐, 질 또는 갑상선의 암종, 육종, 교아세포종, 다발성 골수종 또는 위장 암, 특히 결장 암종 또는 결장직장 선종 또는 두경부의 종양, 표피 과증식, 건선, 전립선 비대증, 신생물, 상피 형질의 신생물, 림프종, 유방 암종 또는 백혈병; 기관 또는 조직 이식 거부반응; 재협착; 결절성 경화증; 카우덴 질환; 림프관평활근종증; 색소성 망막염; 자가면역 질환; 스테로이드-내성 급성 림프아세포성 백혈병; 섬유증 질환; 폐 고혈압증; 면역조절; 다발성 경화증; VHL 증후군; 카르니 콤플렉스; 가족성 선종성 용종증; 연소성 용종증 증후군; 버트-호그-두베 증후군; 가족성 비후성 심근병증; 볼프-파킨슨-화이트 증후군; 퇴행성 신경 장애; 습식 및 건식 황반 변성; 근육 소모 (위축, 악액질) 또는 근병증; 세균 또는 바이러스 감염; 신경섬유종증 또는 포이츠-예거스 증후군인 방법.
  13. 치료상 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 화학식 A의 화합물 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제를 이용한 치료에 내성을 갖게 되었거나 감소된 민감도를 갖는 증식성 질환의 치료 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 화학식 A의 화합물 및 1종 이상의 mTOR 억제제를 포함하는 조합물을 그를 필요로 하는 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 mTOR 억제제를 이용한 증식성 질환의 표적의 치료 효능의 개선 방법.
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