KR20130100277A - Ｖｌ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스 - Google Patents

Abstract

하나 이상의 경쇄 V 유전자 절편 및 하나 이상의 경쇄 J 유전자 절편으로의 모든 또는 실질적으로 모든 면역글로불린 중쇄 V 유전자 절편, D 유전자 절편 및 J 유전자 절편의 대체를 포함하는 유전자 변형 마우스 및 이를 사용한 이의 제조 방법이 제공된다. 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제조하는 마우스가 제공된다. 중쇄 불변 영역과 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(체세포 초돌연변이 경쇄 가변 도메인을 포함)을 함유하는 결합 단백질이 제공된다. 상기 결합 단백질을 제조하기 위한 서열을 암호화하는 변형 세포, 배아 및 마우스가 제공된다.

Description

ＶＬ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스{MICE THAT MAKE BINDING PROTEINS COMPRISING VL DOMAINS}

면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 융합된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린-유사 결합 단백질뿐만 아니라,, 경쇄 불변 도메인과 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 도메인과 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 갖는 결합 단백질도 제공된다. 또한, 이와 같은 결합 단백질을 발현하는 세포, 이들 결합 단백질을 생성하는 마우스 및 관련된 방법 및 조성물도 제공된다.

전형적으로 항체는 2개의 동일한 중쇄를 갖는 4량체 구조를 포함하며, 각 중쇄는 경쇄 가변 도메인(V_L)과 융합된 경쇄 불변 영역(C_L)과 관련된 중쇄 가변 도메인(V_H)와 융합된 중쇄 불변 영역(C_H)을 포함한다. 전형적인 사람 IgG의 경우, 항체 분자의 크기는 IgG의 아류(예, IgG1, IgG3, IgG4) 및 가변 영역의 (다양한) 길이에 따라 약 150kDa 내지 약 170kDa (예를 들어, IgG3의 경우, 좀 더 긴 힌지 영역을 포함한다)이다.

전형적인 항체에서, V_H와 V_L 도메인은 결합하여 표적 항원과 결합하는 결합 부위를 형성한다. 따라서, 친화성 및 특이성의 관점에서 항체의 특징은 V_H와 V_L 도메인의 특징에 의해 크게 의존할 수 있다. 사람 및 마우스의 전형적인 항체에서, V_H 도메인은 λ 또는 κ V_L 도메인과 커플링한다. 그러나, 동족 V_H 도메인(예, 항체와 관련하여 천연적으로 발현하고 특정 V_L 도메인과 결합하는 V_H 도메인)의 부재하에 표적 항원에 특이적으로 결합하는 V_L 도메인을 제조할 수 있고 동족 V_L 도메인의 부재하에 표적 항원에 특이적으로 결합하는 V_H 도메인을 분리할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 면역글로불린-기반 결합 단백질의 유용한 다양성은 일반적으로 특정 V_H 또는 V_L을 유도하는 재조합(및 발생 가능 정도의 체세포 초돌연변이)뿐만 아니라, 동족 V_H/V_L 쌍의 조합에 의해 부여된다. 다양성의 다른 근원을 이용하는 조성물 및 방법을 개발하는 것은 유용할 수 있다.

본 분야에서는 경쇄 가변 영역과 같은 면역글로불린 가변 영역, 및 전통적인 항체에 비하여 증가된 다양성을 나타내는 결합 단백질을 포함하는, 면역글로불린 구조를 기본으로 하는 결합 단백질이 요구된다. 또한, 다양한 경쇄 면역글로불린 가변 영역 서열을 포함하는 결합 단백질을 포함한 유용한 결합 단백질을 제조하는 추가의 방법 및 동물도 필요하다. 또한, 예를 들면, 사람 치료제의 제조시의 용도를 위해서 체세포적으로 돌연변이되고 클론에 의해 선택된 면역글로불린 가변 도메인을 생성하기 위한 조성물 및 방법을 포함하는, 그로부터 선택되는 결합 단백질의 증가된 다양성 및 면역글로불린 가변 도메인의 증가된 다양성을 제공하는 면역글로불린-기반 결합 단백질에 유용한 포맷이 필요하다.

한 양상에서, 전장(full-length) 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 유래가 아니고 경쇄(즉, 카파(κ) 및/또는 람다(λ)) 면역글로불린 가변 도메인으로부터 유도된 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질이 기술된다. 유전자 변형 마우스를 포함한 결합 단백질을 제조하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다.

한 양상에서, 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 도메인 및 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 포함하는, 하나 이상의 κ 및/또는 λ 경쇄 가변 영역 면역글로불린 서열과 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 제조하기 위한 핵산 작제물, 세포, 배아, 마우스, 및 방법이 제공된다.

한 양상에서, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 가변 영역(V_H) 유전자 절편, 중쇄 다양성 (D_H) 유전자 절편 및 중쇄 결합(J_H) 유전자 절편의 하나 이상의 경쇄 가변 영역(V_L) 유전자 절편과 하나 이상의 경쇄 연결 영역(J_L) 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다.

한 양상에서, 모든 또는 실질적으로 모든 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편의 하나 이상의 V_L 유전자 절편 및 하나 이상의 J_L 유전자 절편으로의 대체를 포함하여, 내인성 마우스 C_H 유전자와 재조합하여 V_L 유전자 절편, J_L 유전자 절편, 및 내인성 마우스 C_H 유전자로부터 유도된 재배열 유전자를 형성할 수 있는 내인성 중쇄 유전자좌(VL_H 유전자좌)에 V_L 유전자 절편 서열을 형성하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 V_L이다. 한 실시형태에서, J_L 절편은 사람 J_L이다. 특정 실시형태에서, V_L 및 J_L 절편은 사람 V_L 및 사람 J_L 절편이다.

한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편은 6개 이상의 사람 Vκ 유전자 절편 및 1개 이상의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편은 16개 이상의 사람 Vκ 유전자 절편(사람 Vκ) 및 1개 이상의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편은 30개 이상의 사람 Vκ 유전자 절편 및 1개 이상의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편은 40개 이상의 사람 Vκ 유전자 절편 및 1개 이상의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 1개 이상의 Jκ 유전자 절편은 2개, 3개, 4개 또는 5개의 사람 Jκ 유전자 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 Vκ 절편이다. 한 실시형태에서, 사람 Vκ 절편은 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 및 1-6을 포함한다. 한 실시형태에서, κ V_L 절편은 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 및 1-16을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 Vκ 절편은 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, 및 2-30을 포함한다. 한가지 양태로서, 사람 Vκ 절편은 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 및 2-40을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 Vκ 절편이고 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 및 1-16을 포함한다. 한 실시형태에서, Vκ 절편은 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 및 2-30을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, Vκ 절편은 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 및 2-40을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 Vλ 절편이고 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A의 단편은 hVλ3-27 내지 hVλ3-1을 포괄한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52 내지 hVλ1-40의 영역에 해당한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 클러스터 A의 게놈 단편과 클러스터 B의 게놈 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 1개 이상의 유전자 절편과 클러스터 B의 1개 이상의 유전자 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 클러스터 B의 1개 이상의 유전자 절편과 클러스터 C의 1개 이상의 유전자 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 특정 실시형태에서, V_L 절편은 Vλ3-12 내지 Vλ3-1에 걸친 사람 λ 경쇄 유전자좌의 연속 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 연속 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 이상의 hVλ를 포함한다. 특정 실시형태에서, hVλ는 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 특정 실시형태에서, hVλ는 Vλ3-12 내지 Vλ3-1에 걸친 사람 λ 유전자좌의 연속 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, hVλ는 13 내지 28개 또는 그 이상의 hVλ를 포함한다. 특정 실시형태에서, hVλ는 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 및 3-27을 포함한다. 특정 실시형태에서, hVλ는 Vλ3-27 내지 Vλ3-1에 걸친 사람 λ 유전자좌의 연속 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 29 내지 40개의 hVλ를 포함한다. 특정 실시형태에서, V_L 절편은 Vλ3-29 내지 Vλ3-1에 걸친 사람 λ 유전자좌의 연속 서열 및 Vλ5-52 내지 Vλ1-40에 걸친 사람 λ 유전자좌의 연속 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자 변형 마우스에서 hVλ1-40과 hVλ3-29 사이의 모든 서열 또는 실질적으로 모든 서열은 hVλ1-40 유전자 절편의 천연(예, 사람 집단내) 하류(3' 비해독 부분의 하류)에서 발견되는 약 959bp의 사람 λ 서열, 제한 효소 부위(예, PI-Scel), 및 이어서 천연에서 발견되는 hVλ3-29 유전자 절편의 약 3,431 bp 상류의 사람 λ 서열로 필수적으로 구성된다.

한 실시형태에서, Jκ는 사람이고 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, Jκ는 Jκ1 내지 Jκ5를 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편은 사람 Vλ 절편이고, Jκ 유전자 절편은 12-량체 스페이서를 갖는 RSS를 포함하며, 여기서 RSS는 Jκ 유전자 절편의 상류 말단에 병치된다. 한 실시형태에서, V_L 유전자 절편은 사람 Vλ이고, VL_H 유전자좌는 2개 이상의 Jκ 유전자 절편을 포함하며 각각의 Jκ 유전자 절편은 12-량체 스페이서를 갖고, 여기서 RSS는 각 Jκ 유전자 절편의 상류 말단에 병치된다.

특정 실시형태에서, V_L 절편은 Vκ4-1 내지 Vκ2-40의 사람 κ 유전자좌에 걸친 연속 사람 κ 유전자 절편을 포함하고, J_L 절편은 Jκ1 내지 Jκ5의 사람 κ 유전자좌에 걸친 연속 사람 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편이 Vλ 절편이고 V_L 절편과 J 절편 사이에 어떠한 D_H 절편도 존재하지 않는 경우, V_L 절편은 하류에서 23-량체 RSS의 옆에 위치(flanking: 플랭킹)되고(즉, 하류측에서 병치된다), Jκ 절편 또는 Jλ 절편은 존재하는 경우 상류에서 12-량체 RSS의 옆에 배치된다(즉, 상류측에서 병치된다).

한 실시형태에서, V 유전자 절편이 Vκ 유전자 절편이고 V 유전자 절편과 J 유전자 절편 사이에 어떠한 D_H 유전자 절편도 존재하지 않는 경우, Vκ 유전자 절편 각각은 하류측에서 12-량체 RSS와 병치되고, Jκ 절편 또는 Jλ 절편은 존재하는 경우 상류측에서 23-량체 RSS와 병치된다.

한 실시형태에서, 마우스는 V_L 유전자 절편, J_L 유전자 절편 및 내인성 마우스 C_H 유전자로부터 유도된 재배열 유전자를 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 유전자는 체세포적으로 돌연변이된다. 한 실시형태에서, 재배열 유전자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한다. 한 실시형태에서, V_L 절편 및 J_L 절편으로부터 유도된 재배열 유전자에서 관찰되는 N 부가 및/또는 체세포 돌연변이는 내인성 경쇄 유전자좌에서 재배열되는 재배열 경쇄 가변 도메인(동일한 V_L 유전자 절편 및 동일한 J_L 유전자 절편으로부터 유도됨)에서 관찰된 N 부가 및/또는 체세포 돌연변이의 수보다 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배 이상 더 많다. 한 실시형태에서, 재배열 유전자는 목적 항원에 특이적으로 결합하는 B 세포 내에 존재하고, 여기서, B 세포는 낮은 나모몰 범위 또는 그 이하의 K_D(예, 10 나노몰 이하의 K_D)로 목적 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, V_L 절편, J_L 절편 또는 둘 다는 사람 유전자 절편이다. 특정 실시형태에서, V_L 및 J_L 절편은 사람 κ 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 마우스 C_H 유전자는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 마우스 IgG는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C 및 IgG3으로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 마우스 IgG는 IgG1이다.

한 실시형태에서, 마우스는 B 세포를 포함하며, 여기서 B 세포는 B 세포의 염색체 상의 유전자좌로부터 4개의 폴리펩타이드 쇄로 필수적으로 구성된 결합 단백질을 제조하고, 여기서 4개의 폴리펩타이드 쇄는 (a) V_L과 융합된 내인성 마우스 C_H 영역을 포함하는 2개의 동일한 폴리펩타이드; 및 (b) 마우스 C_H 영역과 융합되고 한 실시형태에서 사람(예, 사람 κ) V_L 영역인 V_L 영역과 관련하여 동족인 V_L 영역과 융합된 내인성 마우스 C_L 영역을 포함하는 2개의 동일한 폴리펩타이드로 필수적으로 구성된다. 한 실시형태에서, 내인성 마우스 C_H 영역과 융합된 V_L 영역은 사람 V_L 영역이다. 특정 실시형태에서, 마우스 C_H 영역과 융합된 사람 V_L 영역은 Vκ 영역이다. 특정 실시형태에서, 마우스 C_H 영역과 융합된 사람 V_L 영역은 재배열된 사람 생식선 경쇄 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 V 영역과 동일하다. 특정 실시형태에서, 마우스 C_H 영역에 융합된 사람 V_L 영역은 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스 C_H 영역에 융합된 사람 V_L 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 재배열 유전자에 의해 암호화된다.

한 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 분자 중 50% 이상은 IgG 이소형 C_H 영역 및 V_L 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 길이는 535, 530, 525, 520 또는 515개의 아미노산보다 길지 않다. 한 실시형태에서, 모든 IgG 분자의 75% 이상은 본 단락에 정의된 폴리펩타이드를 포함한다. 한 실시형태에서, 모든 IgG 분자 중 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상은 본 단락에 정의된 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 분자는 본 단락에 정의된 폴리펩타이드의 길이보다 길지 않은 폴리펩타이드를 포함한다.

한 실시형태에서, 마우스는 재배열 사람 V 유전자 절편 및 J 유전자 절편에 의해 암호화되지만 D_H 유전자 절편에 의해 암호화되지 않는 가변 도메인과 융합된 내인성 마우스 C_H 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 재배열 사람 V 유전자 절편 및 J 유전자 절편에 의해 암호화되지만 D_H 유전자 절편에 의해 암호화되지 않는 V 도메인과 융합된 내인성 마우스 C_L 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질을 생성하고, 이 결합 단백질은 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 친화성으로 항원과 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, J 절편은 사람 J 절편(예, 사람 κ 유전자 절편)이다. 한 실시형태에서, 사람 V 절편은 사람 Vκ 절편이다. 한 실시형태에서, 내인성 마우스 C_H 영역과 융합되는 가변 도메인은 내인성 마우스 C_L 영역과 융합되는 가변 영역보다 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함하고; 특정 실시형태에서, 내인성 마우스 C_H 영역과 융합되는 가변 영역은 내인성 마우스 C_L 영역과 융합되는 V 영역보다 약 1.5, 2, 3, 4, 5배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 포함하며; 특정 실시형태에서, 마우스 C_H 영역과 융합되는 V 영역은 마우스 C_L 영역과 융합되는 V 영역보다 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스 C_H 영역과 융합된 V 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 재배열 유전자에 의해 암호화된다.

한 실시형태에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 융합된 제1 경쇄 가변 도메인(V_L1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역과 융합된 제2 경쇄 가변 도메인(V_L2)을 발현하며, 여기서 V_L1은 V_L2에 존재하는 체세포 초돌연변이의 수보다 약 1.5배 내지 약 5배 또는 그 이상 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, V_L1에서의 체세포 초돌연변이 수는 V_L2보다 약 2 내지 약 4배 더 많다. 한 실시형태에서, V_L1의 체세포 초돌연변이 수는 V_L2보다 약 2 내지 약 3배 더 많다. 한 실시형태에서, V_L1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 서열에 의해 암호화된다.

한 양상에서, 다음의 폴리펩타이드: 각각이 V_L 유전자 절편과 J_L 유전자 절편으로 필수적으로 구성된 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인과 융합된 C_H 영역으로 필수적으로 구성된 2개의 동일한 제1 폴리펩타이드, 및 각각이 V_L 절편과 J_L 절편으로 필수적으로 구성된 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인과 융합된 C_L 영역으로 필수적으로 구성된 2개의 동일한 제2 폴리펩타이드로 필수적으로 구성된 면역글로불린을 발현하는 유전자 변형 마우스가 제공된다.

특정 실시형태에서, C_H 영역을 갖는 2개의 동일한 폴리펩타이드는 마우스 C_H 영역을 갖는다.

특정 실시형태에서, C_L 영역을 갖는 2개의 동일한 폴리펩타이드는 마우스 C_L 영역을 갖는다.

한 실시형태에서, C_L 영역과 융합된 가변 도메인은 C_H 영역과 융합된 가변 도메인과 동족인 가변 도메인이다.

한 실시형태에서, 내인성 마우스 C_H 영역과 융합된 가변 도메인은 내인성 마우스 C_L 영역과 융합된 가변 도메인보다 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함하고; 특정 실시형태에서, 내인성 마우스 C_H 영역과 융합된 가변 도메인은 내인성 마우스 C_L 영역과 융합된 가변 도메인보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5 배, 5배 또는 그 이상 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 내인성 마우스 C_L 영역과 융합된 가변 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.

한 실시형태에서, V 절편 및 J 절편 중 하나 이상은 사람 유전자 절편이다. 특정 실시형태에서, V 절편 및 J 절편 둘 다는 사람 κ 유전자 절편이다. 다른 특정 실시형태에서, V 절편과 J 절편 둘 다는 사람 λ 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, V 절편과 J 절편은 사람 κ 및 사람 λ 유전자 절편으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, V 절편은 Vκ 절편이고 J 절편은 Jλ 절편이다. 다른 특정 실시형태에서, V 절편은 Vλ 절편이고 J 절편은 Jκ 절편이다.

한 실시형태에서, C_L 영역과 융합된 가변 도메인과 C_H 영역과 융합된 가변 도메인 중 하나 이상은 사람 가변 도메인이다. 특정 실시형태에서, 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이다. 다른 특정 실시형태에서, 사람 가변 도메인은 Vλ 도메인이다. 한 실시형태에서, 사람 도메인은 사람 Vκ와 사람 Vλ 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, C_L 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vλ 도메인이고, C_H 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이다. 다른 실시형태에서, C_L 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이고, C_H 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vλ 도메인이다.

한 실시형태에서, 2개의 동일한 제1 폴리펩타이드의 V_L 유전자 절편은 사람 Vλ 절편과 사람 Vκ 절편으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 2개의 동일한 제2 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vλ 절편과 사람 Vκ 절편으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 2개의 동일한 제1 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vκ 절편이고 2개의 동일한 제2 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vκ 절편 및 사람 Vλ 절편으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 2개의 동일한 제1 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vλ 절편이고 2개의 동일한 제2 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vλ 절편 및 사람 Vκ 절편으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 2개의 동일한 제1 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vκ 절편이고 2개의 동일한 제2 폴리펩타이드의 V_L 절편은 사람 Vκ 절편이다.

한 실시형태에서, 마우스의 IgG는 항원에 반응하여 생성된 결합 단백질을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 가변 도메인과 C_H 영역으로 필수적으로 구성된 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 가변 도메인은 재배열 V_L 절편과 재배열 J 절편으로 필수적으로 구성된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고, 여기서 결합 도메인은 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 K_D로 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

한 양상에서, 항원에 반응하여 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 또는 실질적으로 모든 IgG가 가변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기서 가변 도메인은 V 유전자 절편과 J 유전자 절편으로 필수적으로 구성된 유전자 절편으로부터 유도된 재배열 유전자에 의해 암호화되는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 재배열 유전자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한다.

한 실시형태에서, V 절편은 경쇄의 V 절편이다. 한 실시형태에서, 경쇄는 κ 경쇄와 λ 경쇄로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 경쇄는 κ 경쇄이다. 특정 실시형태에서, V 절편은 사람 V 절편이다. 특정 실시형태에서, V 절편은 사람 Vκ 절편이고 J 절편은 사람 Jκ 절편이다.

한 실시형태에서, J 절편은 경쇄의 J 절편이다. 한 실시형태에서, 경쇄는 κ 경쇄와 λ 경쇄로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 경쇄는 κ 경쇄이다. 특정 실시형태에서, J 절편은 사람 J 절편이다. 다른 실시형태에서, J 절편은 중쇄의 J 절편(즉, J_H)이다. 특정 실시형태에서, 중쇄는 마우스 기원이다. 다른 특정 실시형태에서, 중쇄는 사람 기원이다.

한 실시형태에서, 단지 V 절편과 J 절편으로부터 제조된 중쇄의 가변 도메인은 체세포적으로 돌연변이된 가변 도메인이다.

한 실시형태에서, 단지 V 절편과 J 절편으로부터 제조된 중쇄의 가변 도메인은 마우스 C_H 영역에 융합된다.

특정 실시형태에서, 항원에 반응하여 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 또는 실질적으로 모든 IgG는 단지 하나의 사람 V 절편 및 단지 하나의 사람 J 절편으로부터 유도된 가변 도메인을 포함하고, 가변 도메인은 마우스 IgG 불변 영역에 융합되고, IgG는 마우스 C_L 영역과 융합된 사람 V_L 도메인을 포함하는 경쇄를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스 C_L 영역과 융합된 V_L 도메인은 사람 Vκ 절편 및 사람 Jκ 절편으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 마우스 C_L 영역과 융합된 V_L 도메인은 사람 Vλ 절편 및 사람 Jλ 절편으로부터 유도된다.

한 양상에서, C_H 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 제1 CDR3과 C_L 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 제2 CDR3을 포함하는 IgG를 생성하는 마우스가 제공되고, 여기서 상기 제1 CDR3과 제2 CDR3 둘 다는 각각 독립적으로 단지 2개의 유전자 절편으로부터 유도되고, 여기서 2개 유전자 절편은 V_L 유전자 절편과 J_L 유전자 절편으로 필수적으로 구성된다. 한 실시형태에서, C_H 영역을 포함한 폴리펩타이드 상의 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한 CDR3 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, V_L 절편 및 J_L 절편은 사람 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, V_L 절편 및 J_L 절편은 κ 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, V_L 절편 및 J_L 절편은 λ 유전자 절편이다.

한 양상에서, C_H 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드 상의 제1 CDR3 및 C_L 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드의 제2 CDR3을 포함하는 IgG를 생성하는 마우스가 제공되고, 제1 CDR3 및 제2 CDR3 둘 다는 각각 75% 이상의 아미노산이 V 유전자 절편으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, C_H 영역을 포함한 폴리펩타이드 상의 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한 CDR3 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 CDR3의 아미노산 중 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 및 제2 CDR3의 아미노산 중 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상은 경쇄 V 절편으로부터 유도된다.

한 실시형태에서, 제1 CDR3의 단지 2개 아미노산이 경쇄 V 절편 이외의 다른 유전자 절편으로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 제2 CDR3의 단지 2개 아미노산이 경쇄 V 절편 이외의 다른 유전자 절편으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 제1 CDR3의 단지 2개 아미노산 및 제2 CDR3의 단지 2개 아미노산이 경쇄 V 절편 이외의 다른 유전자 절편으로부터 유도된다. 한 실시형태에서, IgG의 CDR3은 D 유전자 절편으로부터 유도된 아미노산 서열을 전혀 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드의 CDR3은 D 절편으로부터 유도된 서열을 포함하지 않는다.

한 실시형태에서, V 절편은 사람 V 유전자 절편이다. 특정 실시형태에서, V 절편은 사람 Vκ 유전자 절편이다.

한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 한 실시형태에서, 제1 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.

한 실시형태에서, 제1 CDR3은 사람 경쇄 V 유전자 절편 및 사람 경쇄 J 유전자 절편으로부터 유도된 아미노산으로 필수적으로 구성되고, 제2 CDR3은 사람 경쇄 V 유전자 절편 및 사람 경쇄 J 유전자 절편으로부터 유도된 아미노산으로 필수적으로 구성된다. 한 실시형태에서, 제1 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 핵산 서열로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 제1 CDR3은 단지 2개의 유전자 절편으로부터 유도되며, 여기서 단지 2개의 유전자 절편은 사람 Vκ 유전자 절편 및 사람 Jκ 유전자 절편이고; 제2 CDR3은 단지 2개의 유전자 절편으로부터 유도되며, 여기서 단지 2개의 유전자 절편은 사람 Vκ 유전자 절편, 및 사람 Jκ 절편, 사람 Jλ 절편 및 J_H 절편으로부터 선택된 J 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 제1 CDR3은 단지 2개의 유전자 절편으로부터 유도되며, 여기서 단지 2개의 유전자 절편은 사람 Vλ 절편, 및 사람 Jκ 절편, 사람 Jλ 절편 및 사람 J_H 절편으로부터 선택된 J 절편이다.

한 양상에서, D_H 유전자 절편으로부터 유도된 아미노산 서열을 함유하지 않는 IgG를 생성하는 마우스가 제공되며, 여기서 IgG는 마우스 C_L 영역과 융합된 제1 V_L 도메인을 갖는 제1 폴리펩타이드 및 마우스 C_H 영역과 융합된 제2 V_L 도메인을 갖는 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 제1 V_L 도메인과 제2 V_L 도메인은 동일하지 않다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 V_L 도메인은 상이한 V 절편으로부터 유도된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 V_L 도메인은 상이한 J 절편으로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 V_L 도메인은 동일한 V 및 J 절편으로부터 유도되고, 여기서 제2 V_L 도메인은 제1 V_L 도메인과 비교하여 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 및 제2 V_L 도메인은 사람 및 마우스 V_L 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 V_L도메인은 Vκ 및 Vλ 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, 제1 V_L 도메인은 Vκ 도메인 및 Vλ 도메인으로부터 선택되고, 제2 V_L 도메인은 Vκ 도메인이다. 다른 특정 실시형태에서, Vκ 도메인은 사람 Vκ 도메인이다.

한 양상에서, 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 또는 실질적으로 모든 IgG가 마우스 C_L 도메인과 융합된 제1 사람 V_L 도메인을 갖는 경쇄 및 마우스 C_H 도메인과 융합된 제2 사람 V_L 도메인을 갖는 중쇄로 필수적으로 구성된다.

한 실시형태에서, 마우스 C_H 도메인과 융합된 사람 V_L 도메인은 사람 Vκ 도메인이다.

한 실시형태에서, 제1 및 제2 사람 V_L 도메인은 동일하지 않다.

한 양상에서, 마우스에 의해 생성된 면역글로불린 G 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 약 100%가 (a) 면역글로불린 V_L 도메인과 면역글로불린 C_L 영역으로 필수적으로 구성된 제1 폴리펩타이드; 및 (b) C_H 영역과 D_H 유전자 절편으로부터 유도된 서열이 결여된 V 도메인으로 필수적으로 구성된 길이가 535개 이하의 아미노산의 제2 폴리펩타이드의 이량체로 필수적으로 구성된 마우스가 제공된다.

한 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 길이 약 435-535개의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 길이 약 435-530개의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 길이 약 435-525개의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 길이 약 435-520개의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 길이 약 435-515개의 아미노산이다.

한 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 IgG 중 약 90% 이상에서 제2 폴리펩타이드는 길이 약 535개 이하의 아미노산이다.

한 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 IgG 중 약 50% 이상에서 제2 폴리펩타이드는 길이 약 535개 이하의 아미노산이다. 한 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 IgG 중 약 50% 이상에서 제2 폴리펩타이드는 길이 약 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455 또는 450개 이하의 아미노산이다. 한 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 IgG 중 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 길이가 상기된 바와 같다. 특정 실시형태에서, 마우스에 의해 생성된 모든 IgG 또는 실질적으로 모든 IgG는 길이가 상기된 바와 같다.

한 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드의 V 도메인은 V_L 도메인이다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드의 V 도메인은 Vκ와 Vλ 도메인으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드의 V 도메인은 사람 Vκ또는 Vλ 도메인이다.

한 양상에서, 경쇄 가변 서열(예, V 및/또는 J 서열), D_H 서열 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생식선의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현하는 마우스가 제공된다.

한 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자좌 유전자 절편의 다수의 사람 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 내인성 마우스 중쇄 유전자좌로부터 폴리펩타이드를 발현한다.

한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 Vλ 또는 Vκ 유전자 절편으로부터 유도된 V_L 서열을 포함하고, 폴리펩타이드는 D_H 유전자 절편으로부터 유도된 CDR3을 포함하며, 폴리펩타이드는 J_H 또는 Jλ 또는 Jκ 유전자 절편으로부터 유도된 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 마우스는 모든 작용성 V_H 유전자 절편의 하나 이상의 사람 경쇄 Vλ 유전자 절편으로의 대체를 포함한 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하며, 여기서 하나 이상의 사람 Vλ 절편 각각은 하류측에서 23-량체 이격된 재조합 신호 서열(RSS)과 병치되고, 여기서 12-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에 병치된 사람 또는 마우스 D_H 절편에 작동적으로 연결되고; D_H 유전자 절편은 12-량체 이격된 RSS-병치된 DH 유전자 절편과 재조합하기에 적합한 23-량체 이격된 RSS가 상류에서 병치된 J 절편과 작동적으로 연결되며; V, D_H 및 J 절편은 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.

한 실시형태에서, 마우스는 모든 작용성 V_H 유전자 절편의 하나 이상의 사람 Vκ 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하며, 하나 이상의 사람 Vκ 유전자 절편 각각은 하류측에서 12-량체 이격된 재조합 신호 서열(RSS)과 병치되고, 여기서 V 절편은 23-량체 이격된 RSS와 상류 및 하류 둘 다에 병치된 사람 또는 마우스 D_H 절편에 작동적으로 연결되고; D_H 절편은 23-량체 이격된 RSS-병치된 D_H 절편과 재조합하기에 적합한 12-량체 이격된 RSS가 상류측에서 병치된 J 절편에 작동적으로 연결되며; 여기서 V, D_H 및 J 유전자 절편은 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.

한 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 내인성 마우스 중쇄 불변 영역이다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 암호화한다. 한 실시형태에서, C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 중 하나 이상은 사람이다.

한 실시형태에서, 마우스는 각각이 하류에서 23-량체 이격된 RSS와 병치된 다수의 사람 Vλ 또는 Vκ 유전자 절편, 12-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류 둘 다에서 병치된 다수의 사람 D_H 절편, 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류 둘 다에서 병치된 다수의 사람 J 절편(J_H 또는 Jλ 또는 Jκ)으로의 모든 작용성 V_H 유전자 절편의 대체를 포함한 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 유전자좌는 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 내인성 마우스 불변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 사람 Vλ 또는 Vκ 절편, 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 사람 D_H 절편, 및 모든 또는 실질적으로 모든 J_H 또는 Jλ 또는 Jκ 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, 마우스는 (a) 마우스 서열을 포함하는 중쇄 불변 서열에 연결된 사람 경쇄 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (b) 사람 또는 마우스 경쇄 불변 서열에 연결된 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 항원-결합 단백질을 발현한다. 특정 실시형태에서, 경쇄 서열은 사람 경쇄 서열이며, 항체를 Fc 및 Fab로 절단할 수 있는 프로테아제에 노출시킬 때 λ 서열, κ 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 4개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 완전한 사람 Fab가 형성된다. 한 실시형태에서, Fab는 4개 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 한 실시형태에서, Fab는 6개의 경쇄 CDR을 포함한다. 한 실시형태에서, Fab의 1개 이상의 CDR은 Vλ 절편 또는 Vκ 절편으로부터 유도된 서열을 포함하며, 1개 이상의 CDR은 D 절편으로부터 유도된 서열을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 1개 이상의 CDR은 CDR3이고 CDR은 사람 Vκ 절편, 사람 D 절편 및 사람 Jκ 절편으로부터 유도된다.

한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사람 Vλ 또는 Vκ 유전자 절편, 사람 D_H 유전자 절편 및 사람 J_H 또는 Jλ 또는 Jκ 유전자 절편으로부터 유도된 가변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 불변 서열은 사람 C_H1 및 마우스 C_H2 및 마우스 C_H3 서열로부터 유도된다.

한 양상에서, 사람 J 유전자 절편 및 중쇄 불변 영역 서열에 작동적으로 연결된 재배열되지 않은 사람 Vκ 또는 Vλ 유전자 절편을 생식선에 포함하고, 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 Vκ 도메인을 포함하는 V_L 결합 단백질을 발현하며, 전이성 B 세포(CD19⁺IgM^hiIgD^int) 및 성숙 B 세포(CD19⁺IgM^intIgD^hi)을 포함하여 CD19⁺ B 세포에서 V_L 결합 단백질을 발현하는 비장 B 세포의 군집을 나타내는 마우스가 제공된다.

한 양상에서, 사람 J 유전자 절편 및 중쇄 불변 영역 서열에 작동적으로 연결된 재배열되지 않은 사람 Vκ 또는 Vλ 유전자 절편을 생식선에 포함하고, 중쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린을 B 세포에서 발현하는 마우스가 제공되며, 이 마우스의 골수내 림프구 군집은 야생형 마우스의 프로/프리 B 세포 군집(골수내 림프구)에서와 거의 동일한 수의 프로/프리 B 세포 군집을 나타낸다.

한 실시형태에서, 마우스는 6개 이상의 재배열되지 않은 hVκ 유전자 절편 및 1개 이상의 재배열되지 않은 hJκ 유전자 절편을 포함하고, V_L 결합 단백질을 발현하는 림프구-게이팅된 및 IgM⁺ 비장 세포 군집을 포함하며, 여기서 군집은 야생형 마우스의 림프구-게이팅된 및 IgM⁺ 비장 세포 군집만큼 큰 75% 이상이다.

한 실시형태에서, 마우스는 총 약 90%를 차지하는 IgD⁺ 세포와 IgM⁺ 세포의 성숙한 B 세포-게이팅된 (CD19⁺) 비장 세포 군집을 나타내고; 한 실시형태에서, 변형 마우스의 IgD⁺ 세포와 IgM⁺ 세포의 성숙한 B 세포-게이팅된 (CD19⁺) 비장 세포 군집은 성숙한 B 세포-게이팅된 (CD19⁺) 비장 세포인 야생형 마우스의 IgD⁺ 세포와 IgM⁺ 세포의 총수와 거의 동일하다(예, 10%내 또는 15%내).

한 양상에서, 생식선에서 변형된 내인성 중쇄 유전자좌로부터 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 여기서 변형된 내인성 중쇄 유전자좌에는 작용성 마우스 중쇄 V 유전자 절편이 결여되어 있고, 이 유전자좌는 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 절편 및 재배열되지 않은 J 유전자 절편을 포함하며, 여기서 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 절편 및 재배열되지 않은 J 유전자 절편은 중쇄 불변 영역 서열과 작동적으로 연결되고; 여기서 면역글로불린 단백질은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되며, 여기서 제1 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.

한 양상에서, 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 여기서 면역글로불린 단백질에는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 결여되어 있고, 면역글로불린 단백질은 경쇄 유전자로부터 유도된 제1 가변 도메인 및 경쇄 유전자로부터 유도된 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 제1 가변 도메인 및 제2 가변 도메인은 서로에 대해 동족이고, 여기서 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인은 동일하지 않으며, 여기서 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인은 결합하고 이들이 결합한 경우 목적하는 항원과 특이적으로 결합한다.

한 양상에서, 재배열되지 않은 사람 유전자 절편으로 필수적으로 구성된 유전자 절편으로부터 완전히 유도된 가변 영역을 포함한 면역글로불린 단백질을 생식선에서 재배열되지 않은 유전자 절편으로부터 생성하는 마우스가 제공되며, 여기서 면역글로불린 단백질은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역글로불린 경쇄 불변 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함한다.

한 양상에서, 가변 영역 및 임의로 하나 이상의 체세포 초돌연변이(예, 하나 이상의 N 부가)를 포함한 면역글로불린 단백질을 생식선에서 재배열되지 않은 유전자 절편으로부터 생성하는 마우스가 제공되며, 여기서 상기 모든 가변 영역의 모든 CDR3은 경쇄 V 및 J 유전자 절편으로부터 완전히 생성된다.

한 양상에서, 마우스의 생식선에서 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편으로부터 유도된 체세포 돌연변이 면역글로불린 단백질을 생성하는 마우스가 제공되며, 여기서 면역글로불린 단백질에는 D 유전자 절편으로부터 유도된 서열을 포함하는 CDR이 결여되어 있고, 여기서 면역글로불린 단백질은 경쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 도메인에 제1 CDR3을 포함하며, 중쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 도메인에 제2 CDR3을 포함하고, 여기서 제2 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 재배열 경쇄 가변 영역 서열로부터 유도된다.

한 양상에서, λ 유전자좌, κ 유전자좌 및 이들의 조합으로부터 선택된 작용상 침묵된 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스는 λ 유전자좌 및/또는 κ 유전자좌가 작용하지 않도록 λ 유전자좌 및/또는 κ 유전자좌의 전체 또는 부분 결실을 포함한다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형 면역글로불린 유전자좌를 포함한 세포를 포함하는 마우스 배아가 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스는 키메라이고 배아의 세포 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 본원에 기술된 바와 같은 변형 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 배아의 세포 중 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8%는 본원에 기술된 변형 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 배아는 숙주 세포 및 공여자 ES 세포로부터 유도된 세포를 포함하고, 여기서 공여자 ES 세포로부터 유도된 세포는 본원에 기술된 바와 같은 변형 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 배아는 2-, 4-, 8-, 16-, 32- 또는 64-세포기 숙주 배아 또는 배반포이고, 본원에 기술된 바와 같은 변형 면역글로불린 유전좌를 포함한 공여자 ES 세포를 추가로 포함한다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물을 이용하여 생성된 마우스 또는 세포가 제공된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 세포를 이용하여 생성된 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.

한 양상에서, 제2 사람 경쇄 면역글로불린 가변 서열(V_L2)와 동족인 제1 사람 경쇄 면역글로불린 가변 서열(V_L1)을 암호화하는 핵산 서열을 제조하기 위한 본원에 기술된 마우스의 용도가 제공되며, 여기서 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역(폴리펩타이드 1)과 융합된 V_L1은 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역(폴리펩타이드 2)과 융합된 V_L2와 함께 폴리펩타이드 1/폴리펩타이드 2의 이량체로서 발현하여 V_L1-V_L2 항체를 형성한다.

한 양상에서, 사람 면역글로불린 중쇄 서열과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제조하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 마우스의 용도가 제공되며, 여기서 상기 핵산 서열은 사람 V_L-C_H 폴리펩타이드를 암호화하고, 여기서 사람 V_L-C_H 폴리펩타이드는 이량체로서 발현되며, 여기서 이량체는 면역글로불린 경쇄의 부재하에(예, 사람 λ 또는 사람 κ 경쇄의 부재하에) 발현된다. 한 실시형태에서, V_L-C_H 이량체는 λ 경쇄 및 κ 경쇄의 부재하에 목적하는 항원과 특이적으로 결합한다.

한 양상에서, 면역글로불린 가변 도메인의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 제조하기 위한 본원 기술된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다. 한 실시형태에서, 면역글로불린 가변 도메인은 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 도메인이다.

한 양상에서, 완전한 사람 Fab (사람 경쇄 불변 영역과 융합된 제1 사람 V_L 및 사람 중쇄 불변 영역 서열과 융합된 제2 사람 V_L을 포함) 또는 완전한 사람 F(ab)₂를 제조하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.

한 양상에서, 불멸화 세포주를 제조하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다. 한 실시형태에서, 불멸화 세포주는 마우스 불변 영역 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 사람 Vλ 또는 Vκ 도메인 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

한 양상에서, 하이브리도마 또는 쿼드로마를 제조하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 전분화 세포, 만능 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPS) 및 ES 세포로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포는 마우스 세포(예, 마우스 ES 세포)이다. 한 실시형태에서, 세포는 변형 면역글로불린 유전자좌에 대해 동형접합성이다.

한 양상에서, 사람 중쇄 불변 영역 서열에 융합된 제1 체세포 돌연변이 사람 Vκ 또는 Vλ 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포가 제공된다.

한 실시형태에서, 세포는 사람 경쇄 불변 영역 서열에 융합된 제2 체세포 돌연변이 사람 Vκ 또는 Vλ 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드의 사람 Vκ 또는 Vλ 서열은 제2 폴리펩타이드의 사람 Vκ 또는 Vλ 서열과 동족이다.

한 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드의 Vκ 또는 Vλ, 및 제2 폴리펩타이드의 사람 Vκ 또는 Vλ는 결합한 경우 목적하는 항원과 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 사람 Vκ로 필수적으로 구성된 가변 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드의 사람 Vκ와 동족인 사람 Vκ로 구성된 가변 도메인을 포함하며, 사람 불변 영역 서열은 IgG 서열이다.

한 실시형태에서, 세포는 CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 사람 망막 세포(예, PERC.6^TM 세포)로부터 선택된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 체세포 마우스 세포가 제공된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 생식 세포가 제공된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스로부터 유도된 만능, 유도 만능 또는 전능 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포는 마우스 배아 줄기(ES) 세포이다.

한 양상에서, 마우스, 세포, 또는 치료 단백질(예, 항체 또는 다른 항원-결합 단백질)의 제조를 위한 본원에 기술된 바와 같은 세포의 용도가 제공된다.

한 양상에서, 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에 병치된 사람 D_H 유전자 절편을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 Vκ 유전자 절편을 포함하는 사람 게놈 서열과 상동성인 상동 암(arm)을 포함한다. 한 실시형태에서, 표적화 작제물은 각각이 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에 병치된 모든 또는 실질적으로 모든 사람 D_H 유전자 절편을 포함한다.

한 양상에서, 12-량체 이격된 RSS가 상류에 병치된 사람 Jκ 유전자 절편을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 핵산 작제물은 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에 병치된 사람 게놈 D_H 유전자 서열과의 상동성을 함유한 제1 상동 암을 포함한다. 한 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 게놈 J 유전자 서열과의 상동성을 함유하거나 마우스 중쇄 불변 영역 서열과의 상동성을 함유하거나 마우스 불변 영역 중쇄 서열의 상류의 J-C 유전자간 서열과의 상동성을 함유하는 제2 상동 암을 포함한다.

한 양상에서, 23-량체 이격된 RSS가 하류에 병치된 사람 Vλ 절편, 12-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에 병치된 사람 D_H 절편, 및 23-량체 이격된 RSS가 상류에 병치된 Jκ 절편, 23-량체 이격된 RSS가 상류에 병치된 사람 Jλ 절편, 및 23-량체 이격된 RSS가 상류에 병치된 사람 J_H 절편으로부터 선택된 사람 J 절편을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 한 실시형태에서, 작제물은 마우스 불변 영역 서열, J-C 유전자간 마우스 서열, 및/또는 사람 Vλ 서열과의 상동성을 함유하는 상동 암을 포함한다.

한 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A의 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A의 단편은 hVλ3-27 내지 hVλ3-1에 걸쳐 있다.

한 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B의 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52 내지 hVλ1-40에 걸쳐 있다.

한 실시형태에서, 핵산 작제물은 클러스터 A의 게놈 단편과 클러스터 B의 게놈 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 1개 이상의 유전자 절편과 클러스터 B의 1개 이상의 유전자 절편을 포함한다.

한 실시형태에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 B의 1개 이상의 유전자 절편과 클러스터 C의 1개 이상의 유전자 절편을 포함한다.

한 양상에서, 자연계에서 정상적으로는 Jκ, J_H, Jλ 또는 V_H 절편에 플랭킹된 상태로 발견되는 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에서 병치된 사람 D_H 절편을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 한 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 V-J 유전자간 영역과 상동성이거나 사람 V 유전자 절편을 포함한 사람 게놈 서열과 상동성인 제1 상동 암을 포함한다. 한 실시형태에서, 핵산 작제물은 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열과 상동성인 제2 상동 암을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 핵산 작제물은 12-량체 RSS가 상류에서 플랭킹된 사람 J 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 핵산 작제물은 12-량체 RSS가 상류에서 플랭킹된 J 유전자 절편과의 상동성을 함유하는 제2 상동 암을 포함한다. 한 실시형태에서, J 유전자 절편은 사람 Jκ, 사람 Jλ 및 사람 J_H로부터 선택된다.

한 양상에서, 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에서 병치된 사람 D_H 절편 및 부위-특이적 재조합효소 인식 서열(예, Cre, Flp 또는 Dre 단백질과 같은 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되는 서열)을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.

한 양상에서, 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 절편, 12-량체 또는 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에서 병치된 D_H 절편 및 12-량체 또는 23-량체 이격된 RSS를 갖는 사람 J 절편을 포함하는 핵산 작제물이 제공되며, 여기서 12-량체 또는 23-량체 이격된 RSS는 사람 J 절편의 5'(즉, 전사의 방향에 대해)에 위치한다. 한 실시형태에서, 작제물은 3' 23-량체 이격된 RSS가 병치된 사람 Vλ, 12-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에서 병치된 사람 D_H 절편 및 5' 23-량체 이격된 RSS가 병치된 사람 Jκ 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 작제물은 3' 12-량체 이격된 RSS가 병치된 사람 Vκ, 23-량체 이격된 RSS가 상류 및 하류에서 병치된 사람 D_H 절편 및 5' 12-량체 이격된 RSS가 병치된 사람 Jλ 절편을 포함한다.

한 양상에서, (a) 사람 및 마우스 표적 암으로부터 독립적으로 선택되는 제1 표적화 암 및 제2 표적화 암(여기서, 표적화 암은 벡터를 내인성 또는 변형 면역글로불린 V 영역 유전자좌로 유도한다); 및 (b) 사람 V_L 유전자 절편의 인접 서열 또는 사람 V_L 유전자 절편의 인접 서열 및 하나 이상의 사람 Jκ 유전자 절편(여기서, 인접 서열은 (i) hVκ4-1 내지 hVκ1-6 및 Jκ1, (ii) hVκ4-1 내지 hVκ1-6 및 Jκ1 내지 Jκ2, (iii) hVκ4-1 내지 hVκ1-6 및 Jκ1 내지 Jκ3, (iv) hVκ4-1 내지 hVκ1-6 및 Jκ1 내지 Jκ4, (v) hVκ4-1 내지 hVκ1-6 및 Jκ1 내지 Jκ5, (vi) hVκ3-7 내지 hVκ1-16, (vii) hVκ1-17 내지 hVκ2-30, (viii) hVκ3-31 내지 hVκ2-40, 및 (ix) 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다.

한 실시형태에서, 벡터를 내인성 또는 변형 면역글로불린 유전자좌로 유도하는 표적화 암은 내인성 또는 변형 면역글로불린 유전자좌의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

한 양상에서, 마우스, 세포 또는 치료 단백질(예, 항체 또는 다른 항원-결합 단백질)의 제조에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물의 용도가 제공된다.

한 양상에서, 사람 치료제의 제조를 위한 세포주를 제조하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 마우스 유래의 핵산 서열의 용도가 제공된다. 한 실시형태에서, 사람 치료제는 사람 중쇄 불변 서열과 융합된 사람 경쇄 가변 서열(예, 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 절편으로부터 유도됨)을 포함한 결합 단백질이다. 한 실시형태에서, 사람 치료제는 사람 λ 또는 κ 면역글로불린 경쇄인 제1 폴리펩타이드, 및 사람 중쇄 불변 서열과 융합된 사람 Vλ 또는 Vκ 가변 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.

한 양상에서, 사람 C_H 도메인과 융합된 체세포 돌연변이 사람 V_L 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 작제물로 형질감염된 포유동물 세포를 포함하는 발현 시스템이 제공된다.

한 실시형태에서, 발현 시스템은 사람 C_L 도메인과 융합된 면역글로불린 V_L 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 사람 C_L 도메인과 융합된 V_L 도메인은 사람 C_H 도메인과 융합된 V_L 도메인과 동족 경쇄이다.

한 실시형태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, COS 세포, Vero 세포, 293 세포 및 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예, PER.C6^TM 세포)로부터 선택된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스의 세포 유래의 C_H 영역과 융합된 V_L 영역을 암호화하는 유전자 유래의 V_L 도메인을 암호화하는 뉴크레오타이드 서열을 수득하는 단계, 및 V_L 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 C_H 영역을 암호화하는 유전자와 함께 프레임내로 클로닝하여 사람 결합 단백질 서열을 형성하여, 사람 결합 단백질 서열을 적합한 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법이 제공된다.

한 실시형태에서, 마우스는 목적하는 항원을 이용하여 면역화되고 C_H 영역과 융합된 V_L 영역은 목적하는 항원의 에피토프와 (예, 마이크로몰, 나모몰 또는 피코몰 범위의 K_D로) 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, C_H 영역과 융합된 V_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스에서 체세포적으로 돌연변이된다.

한 실시형태에서, 적합한 세포는 B 세포, 하이브로도마, 쿼드로마, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 사람 망막 세포(예, PERC.6^TM 세포)로부터 선택된다.

한 실시형태에서, C_H 영역은 사람 IgG 이소형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 IgG는 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택된다. 다른 특정 실시형태에서, 사람 IgG는 IgG1이다. 다른 특정 실시형태에서, 사람 IgG는 IgG4이다. 다른 특정 실시형태에서, 사람 IgG4는 변형 IgG4이다. 한 실시형태에서, 변형 IgG4는 힌지 영역에서의 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변형 IgG4는 야생형 사람 IgG4에 대한 아미노산 잔기 228번(카밧(Kabat)의 EU 번호지정체계에 따른 넘버링)에서의 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 잔기 228번에서의 치환은 카밧의 EU 번호지정에 따라 넘버링된 S228P 치환이다.

한 실시형태에서, 세포는 C_H 영역과 융합된 V_L 도메인과 동족인 경쇄 유래의 V_L 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하며, 방법은 사람 Cκ 또는 Cλ 도메인과 융합된 동종 V_L 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

한 양상에서, 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서 마우스의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 절편을 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 절편으로 대체함을 포함하는, 유전자 변형 마우스의 제조 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 마우스 면역글로불린 중쇄 절편(즉, V_H, D_H 및 J_H 절편)의 하나 이상의 작용상 사람 경쇄 절편(즉, V_L 및 J_L 절편)으로의 대체이다. 한 실시형태에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 마우스 중쇄 V_H, D_H 및 J_H 절편의 모든 또는 실질적으로 모든 사람 Vλ 또는 Vκ 절편 및 하나 이상의 Jλ 또는 Jκ 절편으로의 대체이다. 특정 실시형태에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 사람 Jλ 또는 Jκ 절편을 포함한다.

한 양상에서, 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 절편(V_H, D_H 및 J_H)를 하나 이상의 사람 Vλ 또는 Vκ 절편 및 하나 이상의 사람 Jλ 또는 Jκ 절편으로 대체시킴을 포함하는, 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 Vλ 또는 Vκ 절편 및/또는 Jλ 또는 Jκ 절편 절편으로부터 유도된 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 마우스를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 대체는 유전자 변형 마우스 간세포를 형성하는 만능, 유도 만능 또는 전능 마우스 세포에서 이루어지고; 유전자 변형 마우스 간세포는 마우스 숙주내로 도입되며; 유전자 변형 간세포를 포함한 마우스 숙주는 잉태하여 유전자 변형 마우스 간세포로부터 유도된 게놈을 포함한 마우스를 형성한다. 한 실시형태에서, 숙주는 배아이다. 특정 실시형태에서, 숙주는 마우스 전상실배(예, 8- 또는 4-세포기), 4배체 배아, 배아 세포 응집체, 또는 배반포로부터 선택된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 변형을 함유한 핵산을 핵 이입에 의해 세포내로 도입하는 단계, 및 세포를 적합한 조건하에 유지시켜(예, 세포를 배양하고 세포를 포함한 배아를 대리모에 잉태시킴을 포함하는) 본원에 기술된 마우스로 발전시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변형 마우스를 제조하는 방법이 제공된다.

한 양상에서, 마우스 ES 세포 또는 만능 또는 전능 또는 유도 만능 마우스 세포를 본원에 기술된 바와 같이 변형시켜 면역글로불린 중쇄 불변 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 절편을 포함시키는 단계, ES 세포를 배양하는 단계, 배양된 ES 세포를 숙주 배아로 도입하여 키메라 배아를 형성하는 단계, 키메라 배아를 적합한 숙주 마우스내로 도입시켜 변형 마우스로 발전시키는 단계를 포함하는, 변형 마우스를 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편은 사람 λ 또는 사람 κ 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 절편은 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 절편 및 하나 이상의 Jλ, Jκ 또는 J_H 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 중쇄 불변 유전자 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 서열이다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 절편은 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 절편을 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서 대체하며, 중쇄 불변 서열은 C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3을 포함한 마우스 서열이다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스에서 제조된 면역글로불린 가변 영역(VR) (예, 사람 J_L 또는 J_H 또는 D_H와 J_H 또는 D_H와 J_L과 융합된 사람 V_L 서열을 포함)이 제공된다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 VR은 Vκ 절편 및 Vλ 절편으로부터 선택된 생식선 사람 유전자 절편으로부터 유도되며, 여기서 VR은 재배열 서열이 체세포적으로 초돌연변이된 마우스 유래의 재배열 서열에 의해 암호화된다. 한 실시형태에서, 재배열 서열은 1 내지 5개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 서열은 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 서열은 10개 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 서열은 하나 이상의 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열(예, 사람 또는 마우스 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 이들의 조합으로부터 선택됨)과 융합된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스에서 제조된 결합 단백질의 면역글로불린 가변 도메인 아미노산 서열이 제공된다. 한 실시형태에서, VR은 하나 이상의 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열(예, 마우스 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 이들의 조합으로부터 선택됨)과 융합된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스로부터 유도된 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 가변 도메인이 제공된다.

한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스에서 제조되거나 본원에 기술된 바와 같은 마우스에서 제조된 서열로부터 유도된 항체 또는 이의 항원-결합 절편(예, Fab, F(ab)₂, scFv)이 제공된다.

도 1a는 마우스 중쇄 유전자좌의 도해이다(축척화되지 않음). 마우스 중쇄 유전자좌는 길이가 약 3Mb이고, 약 200개의 중쇄 가변(V_H) 유전자 절편, 13개의 중쇄 다양성(D_H) 유전자 절편 및 4개의 중쇄 연결(J_H) 유전자 절편뿐만 아니라, 인핸서(Enh) 및 중쇄 불변(C_H) 영역을 함유한다.
도 1b는 사람 κ 경쇄 유전자좌의 도해이다(축척화되지 않음). 사람 κ 경쇄 유전자좌는 각각 약 440kb 및 약 600kb에 걸친 반대 극성의 원위 및 근위 콘틱으로 복제된다. 두 콘틱 사이에 Vκ 유전자 절편이 없는 것으로 생각되는 약 800kb의 DNA가 존재한다. 사람 κ 경쇄 유전자좌는 약 76개의 Vκ 유전자 절편, 5개의 Jκ 유전자 절편, 인트론 인핸서(Enh) 및 단일 불변 영역(Cκ)을 함유한다.
도 2는 마우스 중쇄 유전자좌내로 40개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 5개의 사람 Jκ 유전자 절편의 단계적 삽입을 위한 표적화 전략을 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신(NEO) 선별 카세트가 재조합효소 인식 부위(R1, R2 등)와 함께 나타내어진다.
도 3은 마우스 C_H 영역에 작동적으로 연결된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 포함하는 변형 마우스 중쇄 유전자좌를 보여준다.
도 4a는 마우스 중쇄 유전자좌내로 사람 Vλ 및 단일 사람 Jλ 유전자 절편의 단계적 삽입을 위한 표적화 전략의 예시를 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신(NEO) 선별 카세트가 재조합효소 인식 부위(R1, R2 등)와 함께 나타내어진다.
도 4b는 마우스 중쇄 유전자좌내로 사람 Vλ 및 4개의 사람 Jλ 유전자 절편의 단계적 삽입을 위한 표적화 전략의 예시를 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신(NEO) 선별 카세트가 재조합효소 인식 부위(R1, R2 등)와 함께 나타내어진다.
도 5a는 마우스 중쇄 유전자좌내로 사람 Vλ, 사람 D_H 및 사람 J_H 유전자 절편의 단계적 삽입을 위한 표적화 전략의 예시를 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신(NEO) 선별 카세트가 재조합효소 인식 부위 (R1, R2 등)와 함께 나타내어진다.
도 5b는 마우스 중쇄 유전자좌내로 사람 Vλ, 사람 D_H 및 사람 Jκ 유전자 절편의 단계적 삽입을 위한 표적화 전략의 예시를 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신(NEO) 선별 카세트가 재조합효소 인식 부위(R1, R2 등)와 함께 나타내어진다.
도 6a는 대표적인 야생형(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 대표적인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 B220 및 IgM의 표면 발현에 대해 염색된 비장세포의 등고선도를 보여준다.
도 6b는 대표적인 야생형(WT) 및 CD19⁺ B 세포에 게이팅되고, 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 대표적인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 비장세포의 등고선도를 보여준다.
도 6c는 야생형(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 CD19⁺ B 세포, 전이성 B 세포(CD19⁺IgM^hiIgD^int) 및 성숙 B 세포(CD19⁺IgM^intIgD^hi)의 총수를 보여준다.
도 7a는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 면역글로불린 M(IgM) 및 B220에 대해 염색된 단일선에 대해 게이팅된 골수의 등고선도를 보여준다. 미성숙, 성숙 및/또는 프로/프리 B 세포는 각각의 점도(dot plot)에 나타나 있다.
도 7b는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO)의 대퇴골로부터 분리된 골수에서의 프리/프로(B220⁺IgM^-), 미성숙(B220^intIgM⁺) 및 성숙(B220^hiIgM⁺) B 세포의 총수를 보여준다.
도 7c는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 CD19⁺에 게이팅되고 ckit⁺ 및 CD43⁺에 대해 염색된 골수의 등고선도를 보여준다.
도 7d는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO)의 대퇴골로부터 수거된 골수에서의 프로 B 세포(CD19⁺CD43⁺ckit⁺) 및 프리 B 세포(CD19⁺CD43^-ckit^-)의 수를 보여준다.
도 7e는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 CD19 및 CD43에 대해 염색된 단일선에 게이팅된 골수의 등고선도를 보여준다. 미성숙, 프리 및 프로 B 세포가 각각의 점 도에 나타나 있다.
도 7f는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO) 유래의 프리 B 세포(CD19⁺CD43^int)에 게이팅되고 면역글로불린 M(IgM)을 발현하는 골수의 히스토그램을 보여준다.
도 7g는 야생형 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 6개의 사람 Vκ 유전자 절편과 5개의 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스(6hVκ-5hJκ HO)의 대퇴골로부터 수거된 골수에서의 IgM⁺ 프리 B 세포(CD19⁺IgM⁺CD43^int) 및 미성숙 B 세포(CD19⁺IgM⁺CD43^-)의 수를 보여준다.
도 8a는 야생형 중쇄 유전자좌 및 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체를 함유한 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 30개의 hVκ 유전자 절편과 5개의 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성이고 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체를 함유한 마우스(30hVκ-5hJκ HO)로부터 CD19⁺에 게이팅되고 Igλ⁺ 및 Igκ⁺ 발현에 대해 염색된 비장세포의 등고선도를 보여준다.
도 8b는 야생형 중쇄 유전자좌 및 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체를 함유한 마우스(WT) 및 내인성 중쇄 유전자좌에 위치한 30개의 hVκ 유전자 절편과 5개의 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성이고 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체를 함유한 마우스(30hVκ-5hJκ HO)의 대퇴골로부터 분리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙(B220^intIgM⁺) 및 성숙(B220^hiIgM⁺)에 게이팅된 골수의 등고선도를 보여준다.
도 9는 마우스 중쇄 유전자좌에 위치한 30개의 hVκ 유전자 절편과 5개의 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성이고 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체를 함유한 미접촉 마우스의 비장세포 RNA로부터 증폭된 12개의 독립적인 RT-PCR 클론의 Vκ-Jκ-mIgG 연결체의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 보여준다. 소문자 염기는 재조합 동안에 돌연변이 및/또는 N 부가로부터 발생된 비-생식선 염기를 나타낸다. 인위적 공간(기간)은 프레임워크 4 영역을 적절하게 정렬하기 위해 포함되고, 이는 IgG1, IgG2a/c 및 IgG3 프라이밍된 클론에 대한 마우스 중쇄 IgG 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 보여준다.

어구 "이특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 에피토프와 선택적으로 결합할 수 있는 결합 단백질을 포함한다. 이특이적 결합 단백질은 제1 C_H 영역과 융합된 제1 경쇄 가변 도메인(V_L1) 및 제2 C_H 영역과 융합된 제2 경쇄 가변 도메인(V_L2)을 포함하는 2개의 상이한 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 제1 및 제2 C_H 영역은 동일하거나 하나 이상의 아미노산 치환(예, 본원에 기술된 치환)에 의해 상이하다. V_L1 및 V_L2는 2개의 상이한 분자(예, 항원) 또는 동일한 분자(예, 동일한 항원) 상의 상이한 에피토프와 특이적으로 결합한다. 만일 이특이적 결합 단백질이 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프와 제2 에피토프)와 선택적으로 결합하는 경우, 제1 에피토프에 대한 V_L1의 친화성은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 V_L1의 친화성에 비해 적어도 1 내지 2배 또는 3배 또는 4배 작으며, V_L2의 경우는 그 반대이다. 이특이적 결합 단백질에 의해 인식된 에피토프는 동일하거나 상이한 표적(예, 동일하거나 상이한 항원) 상에 존재할 수 있다. 이특이적 결합 단백질은 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 V_L1과 V_L2를 조합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 V_L 서열을 암호화하는 핵산 서열을 상이한 C_H 영역을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킬 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있거나 면역글로불린 경쇄를 발현하지 않는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이특이적 결합 단백질은 각각 3개의 경쇄 CDR에 이어서 (N-말단에서 C-말단으로) C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인 및 C_H3 도메인를 갖는 2개의 중쇄 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 결합할 수 있거나 각 중쇄와 결합할 수 있고 V_L1 및/또는 V_L2에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프와 결합할 수 있거나 각 중쇄와 결합할 수 있고 하나 또는 둘 다의 에피토프에 하나 또는 둘 다의 중쇄가 결합하거나 결합을 보조하는 면역글로불린 경쇄를 갖는다.

따라서, 이특이적 결합 단백질의 일반적인 두가지 유형은 (1) V_L1-C_H(이량체) 및 (2) V_L1-C_H:경쇄 + V_L2-C_H:경쇄(여기서, 경쇄는 동일하거나 상이하다)이다. 어떤 경우든 C_H(즉, 중쇄 불변 영역)은 본원에 기술된 바와 같이 별도로 변형되거나(예, 별도로 단백질 A와 결합하도록, 혈청 반감기를 증가시키기 위해서 등) 동일할 수 있다.

서열의 발현과 관련하여 사용된 용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현시키는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포(단일 세포 또는 다중 세포), 세균 세포(예, 이. 콜라이, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 스트레인), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예, 스트렙토코커스 세레비지애, 스트렙토코커스 폼베, 슈도모나스 파스토리스, 슈도모나스 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, B 세포 또는 세포 융합체(예, 하이브리도마 또는 쿼드로마)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이고 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 세포로부터 유도된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하며, 이의 예는 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예, PER.C6^TM 세포)이다.

용어 "동족"은 예를 들면, 제2 V_L 도메인"과 동족"인 제1 V_L 도메인"과 동족"인 관점에서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 마우스에 의해 제조된 동일한 결합 단백질 유래의 2개의 V_L 도메인 사이의 상관성을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 양태에 따라 유전자 변형된 마우스, 예를 들어 V_H, D_H 및 J_H 영역이 V_L 및 J_L 영역으로 대체된 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스는 제1 사람 V_L 도메인과 융합된 동일한 마우스 C_H 영역(예, IgG 이소형)으로 제조된 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄 및 제2 사람 V_L 도메인과 융합된 동일한 마우스 C_L 영역으로 제조된 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄를 갖는 항체-유사 결합 단백질을 생성한다. 마우스에서 클론 선별시, 제1 및 제2 사람 V_L 도메인은 클론 선별 과정에 의해 선별되어 단일 항체-유사 결합 단백질과 관련하여 함께 나타난다. 따라서, 클론 선별 과정의 결과로서 단일 항체-유사 분자에서 함께 나타나는 제1 및 제2 V_L 도메인을 "동족"인 것으로서 언급한다. 반대로, 제1 항체-유사 분자에 나타나는 V_L 도메인과 제2 항체-유사 분자에 나타나는 V_L 도메인은 만일 제1 및 제2 항체-유사 분자가 동일한 중쇄를 갖고 있지 않은 경우 (즉, 제1 사람 중쇄 영역에 융합된 V_L 도메인과 제2 사람 중쇄 영역에 융합된 V_L 도메인이 동일하지 않은 경우) 동족이 아니다.

용어 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자(예, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 2개의 골격 영역 사이에 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어 생식선 서열 또는 재배열 또는 재배열되지 않은 서열에 의해 암호화될 수 있고, 예를 들어 미접촉 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 환경에서(예, CDR3의 경우), CDR은 인접하지 않지만(예, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 서열을 스플라이싱하거나 연결한 결과로서 (예, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합) B 세포 핵산 서열에서 인접하는 2개 이상의 서열(예, 생식선 서열)에 의해 암호화될 수 있다.

용어 "유전자 절편" 또는 "절편"은 재배열에 참여하여(예를 들면, 내인성 재조합효소에 의해 중재됨) 재배열 V/J 또는 V/D/J 서열을 형성할 수 있는 면역글로불린 유전자좌에서(예, 사람 및 마우스에서)의 재배열되지 않은 서열을 포함하는 V(경쇄 또는 중쇄) 또는 D 또는 J(경쇄 또는 중쇄) 면역글로불린 유전자 절편을 가리킨다. 달리 나타내지 않는 한 V, D 및 J 절편은 12/23 규칙에 따라 V/J 재조합 또는 V/D/J 재조합을 유도하는 재조합 신호 서열(RSS)을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 절편은 자연계에서 함께 결합되어 있는 서열 또는 이의 작용상 균등체(예, V 절편 프로모터(들) 및 리더(들)의 경우)를 추가로 포함한다.

용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체 유래의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 구체화되지 않는 한, 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. V_H 도메인은 구체화되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR과 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR과 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인에 이어서 (N-말단으로부터 C-말단으로), C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인, C_H3 도메인, 및 임의로 C_H4 도메인(예, IgM 또는 IgE의 경우) 및 막관통(M) 도메인(예, 림프구에서 막-결합된 면역글로불린의 경우)으로 필수적으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 중쇄의 외측 FR4로부터 C-말단에 걸친 (N-말단으로부터 C-말단측으로) 중쇄 영역이다. 약간의 편차를 갖는, 예를 들어 C-말단으로부터 1, 2, 3개 또는 수개의 아미노산이 절삭된 중쇄 불변 영역은 용어 "중쇄 불변 영역"에 포함되며, 또한 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환과 같은 서열 변형을 갖는 중쇄 불변 영역도 포함된다. 아미노산 치환은 면역글로불린 불변 영역(예, 사람 IgG 불변 영역)의 EU 번호지정체계에 따라 예를 들어 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 및 439로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 이루어질 수 있다.

이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 중쇄 불변 영역은 변형없이 동일한 중쇄 불변 영역과 비교하여 증가된 혈청 반감기를 나타내도록 변형될 수 있고, 위치 250(예, E 또는 Q); 250 및 428(예, L 또는 F); 252(예, L/Y/F/W 또는 T), 254(예, S 또는 T) 및 256(예, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예, 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 갖는다. 다른 예에서, 변형은 428L(예, M428L) 및 434S(예, N434S) 변형; 428L, 259I(예, V259I) 및 308F(예, V308F) 변형; 433K(예, H433K) 및 434(예, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형(예, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.

용어 "경쇄"는 임의의 유기체 유래의 면역글로불린 경쇄 불변(C_L) 영역 서열을 포함하며, 구체화되지 않는 한, 사람 κ 및 λ 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변(V_L) 도메인은 전형적으로 구체화되지 않는 한, 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄(V_L+C_L)는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4을 포함한 V_L 도메인 및 C_L 영역을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 경쇄(V_L+C_L)는 예를 들어 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 (이특이적 결합 단백질의 경우) 에피토프(예, C_H 도메인과 융합된 V_L 도메인에 의해 선택적으로 결합되지 않는 에피토프(들))와 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. C_H 도메인과 융합되는 V_L에 의해 결합된 에피토프(들)와 선택적으로 결합하지 않는 V_L 도메인은 결합 단백질의 에피토프 결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는 것으로 현존 항체 라이브러리(습식 라이브러리 또는 인실리코)에서 가장 흔히 사용되는 경쇄를 스크리닝함으로써 동정될 수 있음을 포함한다. 적합한 경쇄는 C_H 영역에 융합된 V_L에 의해 특이적으로 결합된 에피토프와 (단독으로 또는 C_H 영역과 융합된 동족 V_L과의 조합으로) 결합할 수 있는 것을 포함한다.

용어 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 용어 "나모몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되며; 용어 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하는 것으로 의도된다.

용어 "비-사람 동물"은 원구류, 경골어류, 연골어류(예, 상어 및 가오리), 양서류, 파충류, 포유류 및 조류와 같은 임의의 척추동물을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 포유동물은 비-사람 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 및 설치류를 포함한다. 적합한 비-사람 동물은 래트 및 마우스를 포함한 설치류과로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이다.

마우스, 뉴클레오타이드 서열, 및 결합 단백질

면역글로불린 유전자좌의 요소에 의해 암호화되는 결합 단백질이 제공되고, 여기서 결합 단백질은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 융합된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또한, 마우스에서 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 유전자 변형시켜 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 의해 암호화되는 요소를 함유하는 결합 단백질을 암호화하는 다수의 전략이 제공된다. 이와 같은 유전자 변형 마우스는 면역글로불린 구조를 가지면서 전통적인 항체에 비하여 증가된 다양성을 나타내는 결합 단백질의 특정 군집을 생성하기 위한 공급원을 나타낸다.

본원에 기술된 결합 단백질 양상은 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(또는 이의 일부)을 암호화하는 유전자 절편이 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되도록 변형된 면역글로불린 유전자좌에 의해 암호화되는 결합 단백질을 포함한다. 경쇄 유전자 절편의 재배열시, 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열과 융합된 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 재배열 뉴클레오타이드 서열이 수득된다. 이 서열은 중쇄 불변 영역과 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 따라서, 한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단으로 V_L 도메인, C_H1 영역, 힌지, C_H2 영역, C_H3 영역 및 임의로 C_H4 영역으로 필수적으로 구성된다.

본원에 기술된 변형 마우스에서, 동족 경쇄를 또한 포함하는 결합 단백질이 제조되며, 여기서 한 실시형태에서는 동족 경쇄는 상기된 폴리펩타이드와 쌍을 이루어 항체-유사 결합 단백질을 제조하지만, 결합 단백질은 C_H 영역에 융합된 V_L 영역(V_H 영역이 아님)을 포함한다.

각종 실시형태에서, 변형 마우스는 C_H 영역과 융합된 V_L 영역(하이브리드 중쇄)을 포함한 결합 단백질을 제조하며, 여기서 하이브리드 중쇄의 V_L 영역은 체세포 초돌연변이의 증가된 정도를 나타낸다. 이들 실시형태에서, 증가는 C_L 영역과 융합된 V_L 영역(경쇄)보다 크다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 중쇄의 V_L 영역은 C_L 영역과 융합된 V_L 영역보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 마우스는 항원에 반응하여, 하이브리드 중쇄의 V_L 영역을 포함하는 결합 단백질 군집을 나타내며, 여기서 결합 단백질 군집은 동일한 항원에 반응하여 야생형 마우스에서 관찰된 것에 비하여 하이브리드 중쇄의 V_L 영역에서 평균 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 나타낸다. 한 실시형태에서, 하이브리드 중쇄의 V_L 영역에서 체세포 초돌연변이는 CDR3에서 하나 또는 그 이상 또는 둘 또는 그 이상의 N 부가를 포함한다.

각종 실시형태에서, 결합 단백질은 내인성 경쇄 유전좌로부터 재배열된 경쇄에서 천연적으로 관찰되는 것보다 더 많은 수의 N 부가를 포함하는 면역글로불린 경쇄 서열에 의해 암호화되는 가변 도메인을 포함하며, 예를 들어 결합 단백질은 재배열하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 재배열 유전자를 형성하는 사람 경쇄 V 유전자 절편 및 사람 (경쇄 또는 중쇄) J 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인과 융합된 마우스 중쇄 불변 영역을 포함한다.

각종 실시형태에서, 본 발명의 마우스는 야생형 항체(즉, V_H 도메인을 갖는 항체)보다 평균적으로 더 작은 결합 단백질을 제조하며, 보다 작은 크기와 연관된 이점을 가진다. 보다 작은 크기는 정상적으로 V_H 도메인에 존재하는 D_H 영역에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 부재를 통해 적어도 부분적으로 실현된다. 또한, 보다 작은 크기는 예를 들어 Vκ 영역 및 Jκ 영역으로부터 유도되는 CDR3의 형성으로 실현될 수 있다.

다른 양상에서, 체세포적으로 초돌연변이된 V_L 도메인(예, 체세포적으로 돌연변이된 사람 Vκ 도메인) 및 예를 들어 1 내지 10개 또는 그 이상의 N 부가를 포함하는 재배열 κ 가변 유전자에 의해 암호화된 사람 Vκ 도메인을 갖는 결합 단백질 군집을 제공하기 위한 마우스 및 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 항체 다양성을 생성하기 위한 V_H 영역의 부재하에서 본 발명의 마우스는 V 도메인이 단지 또는 실질적으로 V_L 도메인인 결합 단백질을 예를 들어 항원의 도전에 반응하여 생성할 것이다. 따라서, 마우스의 클론 선별 방법은 V_H 도메인보다 V_L 도메인을 갖는 결합 단백질로부터 단지 또는 실질적으로 선별하는 것에 한정된다. V_L 도메인의 체세포 초돌연변이는 약간의 빈도로 V_L 도메인의 돌연변이를 일으키는 야생형 마우스와 대등한 빈도이거나 실질적으로 빈도가 더 높다(예, 2배 내지 5배 또는 그 이상). 본 발명의 마우스에서 클론 선별 방법은 나노몰 또는 피코몰 범위의 친화성으로 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 포함하는, 변형된 면역글로불린 유전자좌로부터 고 친화성 결합 단백질을 생성할 것이다. 이러한 결합 단백질을 암호화하는 서열은 적절한 발현 시스템을 이용하여 사람 가변 영역과 사람 불변 영역을 함유한 치료용 결합 단백질을 제조하는데 사용할 수 있다.

다른 실시형태에서, 마우스 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌가 작동불능이거나, 비작용성으로 유도되었거나 녹아웃된 본 발명에 따른 마우스가 제조될 수 있고, 마우스에 완전한 사람 또는 키메라 사람-마우스 전이유전자가 도입될 수 있으며, 여기서 전이유전자 중 하나 이상은 변형된 중쇄 유전자좌를 함유한다(예를 들어 하나 이상의 중쇄 유전자 서열에 작동적으로 연결된 경쇄 유전자 절편을 갖는다). 또한, 이러한 마우스는 본원에 기술된 결합 단백질을 제조할 수 있다.

한 양상에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 절편과 재배열되지 않은 J 유전자 절편을 마우스 C_H 유전자 서열과 작동적으로 연결시키는 단계, 동물을 목적하는 항원에 노출시키는 단계, 동물로부터 재배열 및 체세포 초돌연변이 V(경쇄)/J 유전자 서열(여기서, 재배열 V(경쇄)/J 유전자 서열은 면역글로불린 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 융합한다)을 분리하는 단계를 포함하는, 예를 들어 체세포 초돌연변이에 의해 또는 V_L 도메인에의 N 부가에 의해 다양성을 증가시키는 방법이 제공된다.

한 실시형태에서, 초돌연변이 V_L과 융합된 면역글로불린 중쇄는 IgM이고; 다른 실시형태에서, IgG이며; 다른 실시형태에서 IgE이고; 다른 실시형태에서 IgA이다.

한 실시형태에서, 체세포 돌연변이 및 클래스-전환 V_L 도메인은 C_L 서열에 작동적으로 연결된 V_L 서열을 갖는 재배열 및 클래스-전환 항체에서 관찰된 체세포 초돌연변이의 약 2배 내지 5배 또는 그 이상을 함유한다. 한 실시형태에서, 체세포 초돌연변이 V_L 도메인에서 관찰된 체세포 초돌연변이는 C_H 영역에 융합된 V_H 유전자로부터 발현된 V_H 도메인에서 관찰된 것과 숫적으로 거의 동일하다.

한 양상에서, 본 발명의 마우스를 목적하는 항원에 노출시키는 단계, 마우스를 목적하는 항원에 대한 면역 반응을 발생하도록 유도하는 단계, 및 마우스로부터 목적하는 항원과 고친화성으로 특이적으로 결합하는 체세포 돌연변이 및 클래스-전환 사람 V_L 도메인을 분리하는 단계를 포함하는, 고친화성 사람 V_L 도메인을 제조하는 방법이 제공된다.

한 실시형태에서, 체세포 돌연변이 및 클래스-전환 사람 V_L 도메인을 포함한 결합 단백질의 K_D는 나노몰 또는 피코몰 범위이다.

한 실시형태에서, 결합 단백질은 사람 C_H 영역과 융합된 사람 V_L 도메인을 포함한 체세포 돌연변이 및 클래스-전환 결합 단백질로 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드 이량체로 필수적으로 구성된다.

한 실시형태에서, 결합 단백질은 폴리펩타이드 이량체와 2개의 경쇄로 필수적으로 구성되고, 여기서 폴리펩타이드는 사람 C_H 영역과 융합된 사람 V_L 도메인을 갖는 체세포 돌연변이 및 클래스-전환 결합 단백질로 필수적으로 구성되고, 여기서 각 폴리펩타이드의 이량체가 동족 경쇄 V_L 도메인과 사람 C_L 영역을 포함한 동족 경쇄와 결합된다.

한 양상에서, 사람 V_L 유전자 절편 및 사람 J_L 유전자 절편을 내인성 마우스 C_H 유전자와 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 작동적으로 연결시키는 단계, 마우스를 목적하는 항원에 노출시키는 단계, 및 마우스로부터 목적하는 항원과 결합하는 체세포 돌연변이 사람 V_L 유전자 서열을 수득하는 단계를 포함하는, 사람 V_L 유전자 서열을 체세포적으로 초돌연변이시키는 방법이 제공된다.

한 실시형태에서, 상기 방법은 마우스로부터 목적하는 항원과 결합하는 사람 체세포 초돌연변이 사람 V_L 유전자 서열과 동족인 경쇄로부터의 V_L 유전자 서열을 수득하는 것을 추가로 포함한다.

D_H 서열을 갖는 V_L 결합 단백질

각종 양상에서, 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 유전자 절편 및 재배열되지 않은 (예, 경쇄 또는 중쇄) J 유전자 절편을 포함한 마우스는 또한 재배열되지 않은 DH 유전자 절편을 포함하고, 재배열되지 않은 DH 유전자 절편은 J 절편과 재조합하여 재배열 D/J 서열을 형성할 수 있고, 이어서 경쇄 V 절편과 재배열하여 (a) 경쇄 V 절편, (b) DH 절편 및 (c) (예, 경쇄 또는 중쇄) J 절편으로부터 유도된 재배열 가변 서열을 형성할 수 있으며, 재배열 가변 서열은 중쇄 불변 서열(예를 들면, CH1, 힌지, CH2, CH3 및 이의 조합으로부터 선택된다)에 작동적으로 연결된다(예를 들어, 마우스 또는 사람 CH1, 힌지, CH2 및 CH3에 작동적으로 연결된다).

각종 양상에서, 사람 D 절편을 또한 포함하는 재배열되지 않은 사람 경쇄 V 절편 및 J 절편을 포함한 마우스는 예를 들어 CDR3 서열의 증가된 다양성의 공급원으로서 유용하다. 정상적으로, CDR3 서열은 V/J 재조합에 의한 경쇄 및 V/D/J 재조합에 의한 중쇄에 발생한다. 추가의 다양성은 재조합 (예, N 부가) 동안에 발생하는 뉴클레오타이드 부가에 의해서 및 또한 체세포 초돌연변이의 결과로서 제공된다. CDR3 서열에 의해 제공된 결합 특징은 경우에 따라 일반적으로 경쇄 CDR3 서열, 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄와 중쇄 CDR3 서열의 조합에 의해 제공된 특징으로 한정된다. 그러나, 본원에 기술된 마우스에서, 중쇄 폴리펩타이드의 제1 경쇄 CDR3 및 경쇄 폴리펩타이드의 제2 경쇄 CDR3의 조합 결과로서 제공되는 결합 특징으로 인해 다양성의 추가된 공급원이 이용될 수 있다. 본원에 교시된 바와 같이 RSS 유전자조작을 사용하여, D 절편에 작동적으로 연결되고 J 절편 (경쇄 또는 중쇄)에 작동적으로 연결된 경쇄 V 영역으로부터의 재배열되지 않은 V 절편을 포함하는 본 발명의 마우스로부터 가능한 바와 같이, 제1 경쇄 CDR3 D 유전자 절편으로부터 유도된 서열을 함유할 수 있는 추가의 다양성이 가능하다.

다양성의 다른 공급원은 본원에 기술된 마우스에서 가능한 V(경쇄)/J 또는 V(경쇄)/D/J 재조합에서 발생하는 N 및/또는 P 부가이다. 따라서, 본원에 기술된 마우스는 다양성의 다른 공급원 (경쇄-경쇄)을 제공할 뿐만 아니라, 본원에 기술된 마우스에서 재배열 V(경쇄)/J 또는 재배열 V(경쇄)/D/J 유전자에 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 부가로 인한 다양성의 추가적인 공급원을 제공한다.

각종 양상에서, J 유전자 절편 및 경쇄 V 유전자 절편에 작동적으로 연결된 D 유전자 절편의 사용은 다양성 증가를 제공한다. 이 경우에서 D_H 절편의 작동가능한 연결은 D 절편이 J 절편과 재조합할 수 있는 조건을 필요로 한다. 따라서, D 절편과 J 절편이 재배열할 수 있도록 J 절편의 상류에서 병치된 RSS와 조합하는 RSS가 D 절편의 하류에서 병치되어야 한다. 또한, D 절편은 상류에 병치된 적절한 RSS를 필요로 하며, 이것은 V 절편의 하류에서 병치된 RSS와 조합하여 재배열 D/J 절편과 V 절편이 재배열하여 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 형성할 수 있다.

RSS 또는 재조합 신호 서열은 보존 핵산 9량체 서열로부터 비보존 서열의 12개 염기쌍 (bp) 또는 23개 염기쌍 (b) 만큼 분리된 보존 핵산 7량체 서열을 포함한다. RSS는 재조합효소에 의해 사용되어 12/23 규칙에 따른 재배열 과정 동안에 면역글로불린 유전자 절편의 결합을 달성한다. 12/23 규칙에 따라, 12 bp (비보존) 스페이서를 갖는 RSS와 병치된 유전자 절편은 23 bp (비보존) 스페이서를 갖는 RSS와 병치된 유전자 절편과 재배열한다. 즉, 12 bp 스페이서를 갖는 RSS를 각각 포함하거나 23 bp 스페이서를 갖는 RSS를 각각 포함하는 유전자 절편사이의 재배열은 일반적으로 관찰되지 않는다.

λ 경쇄 유전자좌의 경우, 가변 유전자 절편 (Vλ 유전자 절편)은 하류에서 (V 서열의 전사 방향을 기준으로) 23-량체 스페이서를 갖는 RSS와 연결되고, 결합 유전자 절편 (Jλ 유전자 절편)은 상류에서 (J 서열의 전사 방향을 기준으로) 12-량체 스페이서를 갖는 RSS와 연결된다. 따라서, Vλ 및 Jλ 절편은 12/23 규칙에 따르는 RSS와 연결되고 이에 따라 재배열 동안에 재조합할 수 있다.

그러나, 야생형 유기체의 κ 유전자좌에서, 각 작용성 Vκ 절편은 하류에서 12-량체 스페이서를 갖는 RSS와 연결된다. 따라서, Jκ 절편은 이의 상류쪽에서 병치된 23-량체 스페이서를 갖는다. 중쇄 유전자좌에서, V_H 유전자 절편은 23-량체 스페이서를 갖는 RSS와 하류에서 병치되고 이어서 D_H 절편은 12-량체 스페이서와 상류 및 하류에서 병치되며 J_H 절편 각각은 이의 상류쪽에서 23-량체 절편과 병치된다. 중쇄 유전자좌에서, 12-량체 스페이서를 갖는 하류 D_H RSS 및 23-량체 스페이서를 갖는 상류 J_H RSS에 의해 조정되는 D/J 재조합이 먼저 발생하여 12-량체 스페이서를 갖는 RSS를 포함한 상류쪽에 RSS가 병치된 중간적인 재배열 D-J 서열을 생성한다. 그런 다음, 상류쪽에 12-량체를 갖는 RSS가 병치된 재배열 D-J 절편은 하류쪽에 23-량체를 갖는 RSS가 병치된 VH 절편과 재배열하여 재배열 V/D/J 서열을 형성한다.

한 실시형태에서, Vλ 절편이 Jλ 절편인 J 유전자 절편과 함께 중쇄 유전자좌에서 사용되며, Vλ 절편은 Vλ 서열의 하류쪽에 병치된 RSS를 포함하고, RSS는 23-량체 스페이서를 포함하며, J 절편은 12-량체 스페이서를 갖는 RSS가 상류쪽에 병치된 Jλ 절편 (예, 자연계에서 발견되는 것)이다.

한 실시형태에서, Vλ 절편이 Jκ 또는 J_H 유전자 절편인 J 유전자 절편과 함께 중쇄 유전자좌에서 사용되며, Vλ 서열은 이의 하류쪽에서 23-량체 스페이서를 포함한 RSS가 병치되고 Jκ 또는 J_H 유전자 절편은 이의 상류쪽에서 12-량체 스페이서를 포함한 RSS가 병치된다.

한 실시형태에서, Vλ 절편이 D_H 유전자 절편 및 J 유전자 절편과 함께 중쇄 유전자좌에서 사용된다. 한 실시형태에서, Vλ 절편은 23-량체 스페이서를 갖는 RSS가 Vλ 서열의 상류쪽에서 병치되고, DH 절편은 12-량체 스페이서를 갖는 RSS가 DH 서열의 하류쪽에서 병치되며, J 절편은 23-량체 스페이서를 갖는 RSS가 상류쪽에서 병치되고, J 절편은 Jλ, Jκ 및 J_H중에서 선택된다.

한 실시형태에서, Vκ 절편이 J 유전자 절편 (중개 D 절편이 없음)과 함께 중쇄 유전자좌에서 사용되고, Vκ 절편은 12-량체 스페이서 RSS가 Vκ 절편의 하류쪽에서 병치되며, J 절편은 23-량체 스페이서 RSS가 상류쪽에서 병치되고, Jκ 절편은 Jκ 절편, Jλ 절편 및 J_H 절편중에서 선택된다. 한 실시형태에서, V 절편 및/또는 J 절편은 사람이다.

한 실시형태에서, Vκ 절편이 D 절편 및 J 절편과 함께 중쇄 유전자좌에서 사용되고, Vκ 절편은 12-량체 스페이서 RSS가 Vκ 절편의 하류쪽에서 병치되며, D 절편은 이의 상류 및 하류쪽에서 23-량체 스페이서 RSS가 병치되고, J 절편은 이의 상류쪽에서 12-량체 스페이서 RSS가 병치된다. 한 실시형태에서, J 절편은 Jκ 절편, Jλ 절편 및 J_H 절편중에서 선택된다. 한 실시형태에서, V 절편 및/또는 J 절편은 사람이다.

23-량체 스페이서를 갖는 RSS가 상류 말단에서 병치된 Jλ 절편 또는 12-량체 스페이서를 갖는 RSS가 상류 말단에서 병치된 Jκ 절편 또는 J_H 절편은 본 분야에 알려진 임의의 적합한 핵산 서열 제조 방법을 사용하여 제조한다. 선택된 스페이서 (예, 12-량체 또는 23-량체)를 갖는 RSS가 상류에 병치된 J 절편을 제조하는 적합한 방법은 7량체, 9량체 및 선택된 스페이서를 포함하는 핵산을 화학적으로 합성하고 이것을 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원 (예, 사람 서열 공급원)으로부터 클로닝된 J 절편 서열에 융합시키며, 융합된 J 절편 서열 및 RSS를 표적화 벡터표적화 작제물여 RSS-J를 적합한 부위에 안착시키는 것이다.

23-량체 스페이서 RSS가 상류 및 하류에 병치된 D 절편은 본 분야에 알려진 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 한 가지 방법은 상류 23-량체 RSS 및 D 절편 서열 및 하류 23-량체 RSS를 화학적으로 합성하고 RSS-연결된 D 절편을 적합한 벡터에 도입하는 것을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 마우스 D 절편을 12-량체 RSS 서열이 상류 및 하류쪽에 병치된 사람 D 절편으로 치환하도록 설정되거나 예를 들어 사람 V 절편과 사람 또는 마우스 J 절편사이의 위치에서 사람화 유전자좌내로 삽입되도록 설정될 수 있다.

RSS 작제에 적합한 9량체 및 7량체는 본 분야에 잘 알려져 있다(참조예: Janeway's Immunobiology, 7th ed., Murphy et al., (2008, garland Science, Taylor & Francis Group, LLC) at page 148, Fig. 4.5 - 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다). 적합한 비보존 스페이서 서열의 예로는 사람 또는 마우스 면역글로불린 유전자좌의 RSS 서열에서 관찰되는 스페이서 서열이 포함된다.

이특이적-결합 단백질

본원에 기술된 결합 단백질 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 다중특이성 결합 단백질, 예를 들어 이특이적 결합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 양상에서, C_H 영역과 융합된 제1 V_L 도메인으로 필수적으로 구성된 제1 폴리펩타이드는 C_H 영역과 융합된 제2 V_L 도메인으로 필수적으로 구성된 제2 폴리펩타이드와 결합할 수 있다. 제1 V_L 도메인과 제2 V_L 도메인이 상이한 에피토프와 특이적으로 결합하는 경우, 이 두 V_L 도메인을 사용하여 이특이적-결합 분자를 제조할 수 있다. CH 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시형태에서, 예를 들어 C_H 영역중 하나는 단백질 A 결합 결정소를 제거하도록 변형될 수 있는 반면, 다른 중쇄 불변 영역은 변형되지 않는다. 이러한 특정 배열은 예를 들어 단독이량체 (제1 또는 제2 폴리펩타이드의 단독이량체)의 혼합물로부터 이특이적 결합 단백질의 분리를 간편하게 해준다.

한 양상에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 이특이적-결합 단백질을 제조하는데 사용된다. 이러한 양상에서, C_H 영역에 융합되는 제1 V_L 및 C_H 영역제 융합되는 제2 V_L은 각각 독립적으로 동일한 이소형(예, 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 사람 IgG 서열과 프레임내로 클로닝된다. 제1 V_L은 제1 에피토프와 특이적으로 결합하고, 제2 V_L은 제2 에피토프와 특이적으로 결합한다. 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원에 존재하거나 동일한 항원에 존재할 수 있다.

한 실시형태에서, 제1 V_L에 융합된 C_H 영역의 IgG 이소형과 제2 V_L에 융합된 C_H 영역의 IgG 이소형은 동일한 이소형이지만 IgG 이소형 하나가 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 상이하다. 한 실시형태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 이 치환을 함유한 중쇄가 이 치환이 없는 중쇄와 비교하여 단백질 A와 결합할 수 없도록 유도하거나 실질적으로 결합할 수 없도록 유도한다.

한 실시형태에서, 제1 C_H 영역은 IgG1, IgG2 및 IgG4중에서 선택된 사람 IgG의 제1 C_H3 도메인을 포함하고, 제2 C_H 영역은 IgG1, IgG2 및 IgG4중에서 선택된 사람 IgG의 제2 C_H3 도메인을 포함하며, 제2 C_H3 도메인은 단백질 A에 제2 C_H3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변이를 포함한다.

한 실시형태에서, 제2 C_H3 도메인은 카밧의 EU 번호지정체계에 따른 435R 변이를 포함한다. 다른 양태로서, 제2 C_H3 도메인은 카밧의 EU 번호지정체계에 따른 436F 변이를 포함한다.

한 실시형태에서, 제2 C_H3 도메인은 카밧의 EU 번호지정체계에 따른 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I로 이루어진 그룹중에서 선택된 변이를 포함하는 사람 IgG1의 것이다.

한 실시형태에서, 제2 C_H3 도메인은 카밧의 EU 번호지정체계에 따른 N384S, K392N 및 V422I로 이루어진 그룹중에서 선택된 변이를 포함하는 사람 IgG2의 것이다.

한 실시형태에서, 제2 C_H3 도메인은 카밧의 EU 번호지정체계에 따른 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I로 이루어진 그룹중에서 선택된 변이를 포함하는 사람 IgG4의 것이다.

한 실시형태에서, 결합 단백질은 본원에 기술된 하나 이상의 변이를 갖는 C_H 영역을 포함하며, 결합 단백질의 불변 영역은 사람에서 비면역원성이거나 실질적으로 비면역원성이다. 특정 실시형태에서, C_H 영역은 사람에서 면역원성 에피토프를 제시하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태로서, 결합 단백질은 야생형 중쇄에서 발견되지 않는 C_H 영역을 포함하며, C_H 영역은 T-세포 에피토프를 생성하는 서열을 포함하지 않는다.

실시예

본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 설명하기 위해 아래의 실시예를 제공하지만 이들 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 달리 표기하지 않는 한 온도는 섭씨이며 압력은 대기압이다.

실시예 1

중쇄 유전자좌내로 경쇄 유전자 절편의 도입

마우스 게놈 세균 인공 염색체(BAC) 라이브러리를 변이시키기 위해 VELOCIGENE^® 유전자조작기술(참조예: 미국특허 제6,586,251 및 Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659)을 사용하여 여러 가지 표적화 작제물을 제조하였다. 상동재조합에 의해 마우스 BAC DNA를 변형시켜 재배열되지 않은 사람 생식선 κ 경쇄 유전자 서열의 삽입을 위한 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편의 표적화된 결실을 통해 내인성 마우스 중쇄 유전자좌를 불활성화시켰다(도 2의 최상위).

요약하면, 재조합효소-매개된 재조합을 사용한 2회 연속 표적화 과정에서 마우스 중쇄 유전자좌를 결실시켰다. 일차 표적화 과정은 5'부터 3'으로 마우스 상동 암, 재조합효소 인식 부위, 네오마이신 카세트 및 3' 상동 암을 포함한 표적화 벡터를 사용하는, 마우스 중쇄 유전자좌의 5' 말단에서의 표적화을 포함하였다. 5' 및 3' 상동 암은 마우스 중쇄 유전자좌의 서열 5'을 함유하였다. 이차 표적화 과정은 5'부터 3'으로 5' 마우스 상동 암, 5' 재조합효소 인식 부위, 제2 재조합효소 인식 부위, 하이그로마이신 카세트, 제3 재조합효소 인식 부위 및 3' 마우스 상동 암을 함유한 제2 표적화 벡터를 사용하는, JH 유전자 절편의 영역에서 마우스 중쇄 유전자좌의 3' 말단에서의 표적화을 포함하였다. 5' 및 3' 상동 암은 마우스 JH 유전자 절편과 인트론 인핸서 및 불변 영역의 5'를 연결하는 서열을 함유하였다. 상기된 양 표적화 벡터로 적중된 변이 중쇄 유전자좌를 함유한 양성 ES 세포를 염색체분석으로 확인하였다. 이어서, 이중-표적화된 ES 세포로부터 DNA를 분리하고 재조합효소로 처리하여 제1 표적화 벡터의 5' 재조합효소 인식 부위와 제2 표적화 벡터의 5' 재조합효소 인식 부위사이의 마우스 중쇄 유전자좌의 게놈 DNA를 결실시켜 단일 재조합효소 인식 부위와 두 재조합효소 인식 부위사이에 연결된 하이그로마이신 카세트를 형성한다 (참조: 도 2의 최상위). 따라서, 아래 기술된 표적화 벡터를 사용하여 정확하게 사람 κ 생식선 유전자 절편을 단계적으로 삽입시키기 위한, 완전한 CH 유전자를 함유한 변이된 마우스 중쇄 유전자좌가 생성되었다.

본 분야에 알려진 표준 분자 기술에 의해 4개의 독립적인 표적화 벡터를 조작하여 40개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 5개의 사람 Jκ 유전자 절편을 상기된 불활성화 마우스 중쇄 유전자좌내로 단계적으로 삽입시켰다(도 2). 4개의 표적화 벡터를 조작하는데 사용된 사람 κ 유전자 절편은 자연계에서 생식선 사람 κ 경쇄 유전자좌의 원근 콘틱에서 발견된다(도 1b 및 표 1).

일차 6개 사람 Vκ 유전자 절편 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유한 약 110,499 bp 사람 게놈 절편을 조작하여 사람 Jκ5 유전자 절편의 PI-Scel 부위 431 bp 하류 (3')를 도입하였다. 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 중쇄 인트론 인핸서, IgM 스위치 영역(Sμ) 및 IgM 유전자를 함유한 약 7,852 bp 게놈 단편의 5' 말단에 다른 PI-Scel 부위를 도입하여다. 이 마우스 단편을 약 110.5 kb 사람 단편과 결합시켜 3' 상동 암으로서 사용하였고, 이로 인해 5'부터 3'으로 약 110.5 kb의 사람 κ 경쇄 유전자좌 게놈 서열, 일차 6개 연속 Vκ 유전자 절편 및 5개 Jκ 유전자 절편, PI-Scel 부위, 약 7,852 bp의 마우스 중쇄 서열 (마우스 인트론 인핸서, Sμ 및 마우스 IgM 불변 유전자를 함유)를 함유하는 3' 접합부가 형성되었다. 사람 Vκ1-6 유전자로부터의 상류 (5')은 마우스 중쇄 유전자좌의 서열 5'에 상응하는 19,752 bp의 마우스 게놈 DNA를 함유한 5' 마우스 상동 암의 개시전에 추가 3,710 bp의 사람 κ 서열이다. 5' 상동 암과 사람 κ 서열의 개시사이에 3개의 재조합효소 인식 부위에 연결된 네오마이신 카세트가 위치하였다(참조: 표적화 벡터, 도 2). 사람 κ 서열의 일차 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 5'부터 3'으로 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5' 약 20 kb를 함유한 5' 상동 암, 일차 재조합효소 인식 부위(R1), 네오마이신 카세트, 이차 재조합효소 인식 부위(R2), 삼차 재조합효소 인식 부위(R3), 약 110.5 kb의 사람 게놈 κ 서열(일차 6개 연속 사람 Vκ 유전자 절편 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유), PI-Scel 부위 및 3' 상동 암(인트론 인핸서, Sμ 및 마우스 IgM 불변 유전자를 포함한 약 8 kb의 마우스 게놈 서열)을 포함하였다(참조: 도 2, 표적화 벡터 1). 이 표적화 벡터와의 상동재조합은 재조합시 하이브리드 중쇄(즉, 사람 Vκ 도메인과 마우스 C_H 영역)의 형성을 유도하는 내인성 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동적으로 연결된 6개 사람 Vκ 유전자 절편과 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유한 변이 마우스 중쇄 유전자좌를 형성하였다.

하이브리드 중쇄 유전자좌내로 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입

상기된 변이 마우스 중쇄 유전자좌에 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입을 위해 제2 표적화 벡터를 조작하였다 (참조: 도 2, 표적화 벡터 2). 사람 κ 경쇄 유전자좌로부터의 12개 연속 사람 Vκ 유전자 절편을 함유한 140,058 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5'을 함유한 5' 상동 암과 사람 게놈 κ 서열을 함유한 3' 상동 암과 함께 조작하였다. 사람 Vκ1-16 유전자 절편으로부터의 상류 (5')는 표적화 벡터 1의 작제에 사용된 5' 상동 암과 동일한 5' 마우스 상동 암의 개시전의 부가적인 10,170 bp 사람 κ 서열이다(참조: 도 2). 5' 상동 암과 사람 κ 서열의 개시사이에 재조합효소 인식 부위사이에 연결된 하이그로마이신 카세트이다. 3' 상동 암은 표적화 벡터 1의 사람 게놈 κ 서열의 약 110.5 kb의 균등 5' 말단에 상응하는 사람 게놈 κ 서열의 31,165 bp 중복서열을 포함하였다(도 2). 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 5'부터 3'으로 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5' 약 20 kb를 함유한 5' 상동 암, 일차 재조합효소 인식 부위(R1), 하이그로마이신 카세트, 이차 재조합효소 인식 부위(R2) 및 12개의 연속 사람 Vλ 유전자 절편을 함유하는 약 140 kb의 사람 게놈 κ 서열(이의 약 31 kb는 표적화 벡터 1의 사람 κ 서열의 5' 말단과 중첩하고 이 표적화 작제물을 위한 3' 상동 암으로서 작용한다)을 포함한다. 이 표적화 벡터와의 상동재조합은 재조합시 하이브리드 중쇄의 형성을 유도하는 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동적으로 연결된 16개 사람 Vκ 유전자 절편과 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유한 변이 마우스 중쇄 유전자좌를 형성하였다.

하이브리드 중쇄 유전자좌내로 14개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입

상기된 변이 마우스 중쇄 유전자좌에 14개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입을 위해 제3 표적화 벡터를 조작하였다(참조: 도 2, 표적화 벡터 3). 15개 연속 사람 Vκ 유전자 절편을 함유한 160,579 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5'을 함유한 5' 상동 암과 사람 게놈 κ 서열을 함유한 3' 상동 암과 함께 조작하였다. 사람 Vκ2-30 유전자 절편으로부터의 상류(5')는 이전의 표적화 벡터 2개의 작제에 사용된 5' 상동 암과 동일한 5' 마우스 상동 암의 개시전의 부가적인 14,687 bp 사람 κ 서열이다(참조: 도 2). 5' 상동 암과 사람 κ 서열의 개시 사이에 재조합효소 인식 부위 사이에 연결된 네오마이신 카세트이다. 3' 상동 암은 표적화 벡터 2의 사람 게놈 κ 서열의 약 140 kb의 균등 5' 말단에 상응하는 사람 게놈 κ 서열의 21,275 bp 중복서열을 포함하였다(도 2). 14개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 5'부터 3'으로 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5' 약 20 kb를 함유한 5' 상동 암, 일차 재조합효소 인식 부위(R1), 네오마이신 카세트, 이차 재조합효소 인식 부위(R2) 및 15개의 사람 Vκ 유전자 절편을 함유하는 약 161 kb의 사람 게놈 κ 서열(이의 약 21 kb는 표적화 벡터 2의 사람 κ 서열의 5' 말단과 중첩하고 이 표적화 작제물을 위한 3' 상동 암으로서 작용한다)을 포함한다. 이 표적화 벡터와의 상동재조합은 재조합시 키메라 κ 중쇄의 형성을 유도하는 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동적으로 연결된 30개 사람 Vκ 유전자 절편과 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유한 변이 마우스 중쇄 유전자좌를 형성하였다.

하이브리드 중쇄 유전자좌내로 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입

상기된 변이 마우스 중쇄 유전자좌에 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 도입을 위해 제4 표적화 벡터를 조작하였다(참조: 도 2, 표적화 벡터 4). 16개 연속 사람 Vκ 유전자 절편을 함유한 90,398 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5'을 함유한 5' 상동 암과 사람 게놈 κ 서열을 함유한 3' 상동 암과 함께 조작하였다. 사람 Vκ2-40 유전자 절편으로부터의 상류(5')는 이전의 표적화 벡터의 작제에 사용된 5' 상동 암과 동일한 5' 마우스 상동 암의 개시전의 부가적인 8,484 bp 사람 κ 서열이다(참조: 도 2). 5' 상동 암과 사람 κ 서열의 개시 사이에 재조합효소 인식 부위 사이에 연결된 하이그로마이신 카세트이다. 3' 상동 암은 표적화 벡터 3의 사람 게놈 κ 서열의 약 160 kb의 균등 5' 말단에 상응하는 사람 게놈 κ 서열의 61,615 bp 중복서열을 포함하였다(도 2). 10개의 부가적인 사람 Vκ 유전자 절편의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 5'부터 3'으로 마우스 중쇄 유전자좌의 마우스 게놈 서열 5' 약 20 kb를 함유한 5' 상동 암, 일차 재조합효소 인식 부위(R1), 하이그로마이신 카세트, 이차 재조합효소 인식 부위(R2) 및 16개의 사람 Vκ 유전자 절편을 함유하는 약 90 kb의 사람 게놈 κ 서열(이의 약 62 kb는 표적화 벡터 3의 사람 κ 서열의 5' 말단과 중첩하고 이 표적화 작제물을 위한 3' 상동 암으로서 작용한다)을 포함한다. 이 표적화 벡터와의 상동재조합은 재조합시 키메라 κ 중쇄의 형성을 유도하는 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동적으로 연결된 40개 사람 Vκ 유전자 절편과 5개 사람 Jκ 유전자 절편을 함유한 변이 마우스 중쇄 유전자좌를 형성하였다(도 3).

상기된 바와 유사한 방법을 사용하여 마우스 중쇄 불변 영역과 사람 경쇄 가변 도메인의 다른 조합체들을 작제하였다. 부가적인 경쇄 가변 도메인은 사람 Vλ 및 Jλ 유전자 절편으로부터 유도될 수 있다(도 4a 및 도 4b).

사람 λ 경쇄 유전자좌는 1,000 kb 이상이고 가변(V) 또는 연결(J) 절편을 암호화하는 80개 이상의 유전자를 함유한다. 사람 λ 경쇄 유전자좌의 70 Vλ 유전자 절편가운데, 공개 문헌에 따라 작용성 유전자 요소가 30-38로부터 어디든 위치한다. 70 Vλ 서열은 독립적인 V 유전자 계열군의 상이한 일원을 함유하는 3개의 클러스터로 배열된다(클러스터 A, B 및 C). 사람 λ 경쇄 유전자좌내에서, 모든 관찰된 Vλ 도메인중 절반 이상은 유전자 절편 1-40, 1-44, 2-8, 2-14 및 3-21에 의해 암호화된다. 7개의 Jλ 유전자 절편이 있으며, 이 가운데 단지 4개만이 일반적 작용성 Jλ 유전자 절편으로서 간주된다-Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7. 일부 대립유전자에서, 제5 Jλ-Cλ 유전자 절편 쌍은 위유전자로 알려져 있다.

본원에 기술된 바와 같이 하이브리드 중쇄 유전자좌내로 다수 사람 Jλ 유전자 절편을 도입하는 것은 데노보 합성에 의해 수행한다. 이러한 방식으로 생식선 배치에 다수 사람 Jλ 유전자 절편을 함유한 게놈 단편을 다수 사람 Vλ 유전자 단편과 함께 조작하고 중쇄 불변 영역에서 정상적인 V-J 재조합이 이루어지도록 한다.

경쇄 가변 도메인을 중쇄 불변 영역과 결합시키는 것은 비사람 동물에서 사람 VL 영역을 갖는 특정 VL 결합 단백질을 생성하기 위한 잠재적으로 풍부한 다양성 공급원을 대표한다. 마우스에서 사람 λ 경쇄 유전자좌 (또는 상기된 사람 κ 유전자좌)의 다양성을 활용함으로써 특정 하이브리드 중쇄를 조작할 수 있는 결과를 얻게되고 유전자 변형 동물의 면역 레퍼토리에 대한 결합 단백질의 다른 차원을 유발하고 후속적으로 치료제의 제조를 위한 차세포 플랫폼으로 사용하게 된다.

추가적으로, 사람 D_H 및 J_H (또는 Jκ) 유전자 절편을 사람 Vκ 또는 Vλ 유전자 절편과 함께 도입하여 새로운 하이브리드 유전자좌를 작제할 수 있고, 이것은 재조합시 새롭게 조작된 가변 도메인을 형성한다 (도 5a 및 도 5b). 이 경우에서, 단일 유전자좌에 정상적으로 함유되지 않은 유전자 절편의 조합을 조작하는 것은 유전자 절편들이 단일 유전자좌내로 조합될 때 정상적인 재조합이 달성될 수 있도록 개개의 유전자 절편과 연결되는 재조합 신호 서열 (RSS)에 특별한 관심이 요구된다. 예를 들면, V(D)J 재조합은 재조합이 일어나는 정확한 위치에서 각 유전자 절편에 인접해 있는 것으로 밝혀진 7량체 및 9량체 서열로 알려진 보존 비암호화 DNA 서열에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이들 비암호화 DNA 서열사이에 길이가 12 또는 23개 염기씽인 비보존 스페이서 영역이 위치한다. 일반적으로, 재조합은 동일한 염색체상에 위치한 유전자 절편에서만 일어나며, 비록 D_H 유전자 절편중 두 절편 (각각은 12-bp 스페이서에 의해 연결)의 결합이 적은 분량의 항체에서 관찰되었으나, 12-bp 스페이서에 의해 연결된 그러한 유전자 절편들은 23-bp 스페이서에 의해 연결된 유전자 절편에 연결될 수 있다 (즉, 12/23 규칙). 정상적으로 양립가능한 스페이서를 갖지 않는 유전자 절편간의 재조합 (예, Vκ와 D_H 또는 D_H와 Jλ)이 이루어지도록 하기 위하여, 성공적인 재조합이 진행되어 경쇄 가변 영역을 함유한 특정 중쇄를 형성하는 특정 하이브리드 중쇄의 작제를 위해 해당 유전자 절편과 인접한 위치에서 특정 병립가능한 스페이서를 합성한다.

따라서, 내인성 중쇄 유전자좌내로 사람 κ 경쇄 유전자 절편의 삽입에 관한 상기 개괄된 전력을 사용함으로써 사람 λ 경쇄 유전자 절편뿐만 아니라, 특정 사람 중쇄 유전자 절편 (예, D_H 및 J_H)의 다른 조합 및 상기 경쇄와 중쇄 유전자 절편들의 다양한 조합을 사용할 수 있다.

실시예 II

내인성 중쇄 유전자좌에 사람 경쇄 유전자 절편을 함유한 표적화된 ES 세포의 동정

상기 실시예에서 제조된 표적화된 BAC DNA를 전기천공에 의해 마우스 ES 세포에 도입시켜 V_L 결합 단백질 (즉, 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 사람 κ 경쇄 유전자 절편)을 발현하는 키메라 마우스를 생성하는 변형 ES 세포를 생성하였다. 재배열되지 않은된 사람 κ 경쇄 유전자 절편의 삽입을 함유한 ES 세포는 정량 PCR 검정 TAQMAN® (Lie and Petropoulos, 1988. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48)으로 동정하였다. 사람 κ 서열의 삽입 및 결합된 선별 카세트, 마우스 중쇄 서열의 유실 및 내인성 중쇄 유전자좌를 연결하는 마우스 서열의 유지를 위해 특정 프라이머 세트 및 탐침을 설계하였다.

사람 κ 유전자 절편을 함유한 표적화 작제물의 삽입에 의해 도입된 모든 비목적 선별 카세트를 제거하기 위해 재조합효소를 발현하는 작제물로 사람 κ 경쇄 유전자를 함유한 ES 세포를 형질감염시킬 수 있다. 임의로, 재조합효소를 발현하는 마우스에 적용함으로써 선별 카세트를 제거할 수 있다 (예, 미국특허 제6,774,279호). 임의로, 선별 카세트는 마우스에 유지한다.

실시예 III

VL 결합 단백질을 발현하는 마우스의 생성 및 분석

상기된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로 사용하고 VELOCIMOUSE^® 방법에 의해 8-세포기 마우스 배아내로 도입하였다 (참조예: 미국특허 제7,294,754호 및 Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99). 마우스 중쇄 유전자좌에 사람 κ 유전자 절편을 독립적으로 함유하는 VELOCIMOUSE^® (공여 ES 세포로부터 완전하게 유래된 F0 마우스)는 내인성 중쇄 유전자좌에서 특정 사람 κ 유전자 절편의 존재를 검출하는 대립유전자 검정 (상기 Valenzuela et al.)의 변형 방법을 사용한 지노타이핑에 의해 동정하였다. 마우스새끼들을 지노타이핑하고 하이브리드 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합 마우스새끼를 V_L 결합 단백질의 특징적인 발현에 따라 선별한다.

유세포분석. 마우스 중쇄 유전자좌내로 사람 κ 경쇄 유전자 절편의 도입을 사람 κ 경쇄 유전자 절편에 의한 마우스 κ 경쇄 유전자 절편의 현장 치환을 추가로 함유하는 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합 배아로부터 유도된 F1 ES 세포주 (F1H4; 상기 Valenzuela et al., 2007)에서 수행하였다 (미국특허 제6,596,541). 미변형 마우스 C576BL/6N 대립유전자는 IgM^b 단상형을 갖는 반면 사람 κ 경쇄 생식선 가변 유전자 절편은 IgM^a 단상형을 갖는 129S6 대립유전자에 표적화된다. IgM의 이러한 대립유전자 형태는 IgM^a 또는 IgM^b 대립유전자에서 발견되는 다형성에 특이적인 항체를 사용한 유세포분석으로 구별할 수 있다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 내인성 중쇄 유전자좌에 사람 κ 경쇄 유전자 절편을 함유하는 이종접합형 마우스는 유세포분석을 이용하여 사람 V_L 결합 단백질의 발현에 대해 평가하였다.

간단히 설명하면, 마우스 군 (군당 6마리)으로부터 채혈하고 유리 슬라이드를 사용하여 분쇄하였다. CD57BL/6 및 Balb/c 마우스를 대조군으로 사용하였다. 적혈구 (RBC)를 ACK 용해 완충액 (Lonza Walkersville)으로 용해시킨 후 세포를 BD Pharmingen FACS 염색 완충액에 현탁시키고 항-마우스 CD16/32 (BD Pharmingen)으로 차단시켰다. 림프구를 항-마우스 IgM^b-FITC (BD Pharmingen), 항-마우스 IgM^a-PE (BD Pharmingen), 항-마우스 CD19 (클론 1D3; BD Biosciences) 및 항-마우스 CD3 (17A2; BIOLEGEND®)로 염색한 다음, BD CYTOFIX^TM으로 고정시켰다. 모든 과정은 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 최종 세포 펠렛을 염색 완충액에 재현탁시키고 BD FACSCALIBUR^TM 및 BD CELLQUEST PRO^TM 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 표 2는 각 유전자 변이를 갖는 동물군에서 관찰된 B 세포 (CD19⁺), T 세포 (CD3⁺), 하이브리드 중쇄 (CD19⁺IgMa⁺) 및 야생형 중쇄 (CD19⁺IgMb⁺) 발현의 평균% 값을 보여준다.

유사한 실험으로서, 여러 가지 세포 표면 마커의 유세포분석을 사용하여 B 세포 발생의 진행을 위해 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 6개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합형 마우스 (실시예 1에 기술됨, 도 2)로부터의 비장, 혈액 및 골수 구획의 B 세포 함량을 분석하였다.

간단히 설명하면, 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 6개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합형 마우스 및 야생형의 두 군 (각군당 3마리, 8주령 암컷)을 치사시키고 혈액, 비장 및 골수를 수확하였다. 혈액은 EDTA로 마이크로테이너 튜브 (BD Biosciences)에 수집하였다. 골수는 완전 RPMI 배지 (태아 송아지 혈청, 나트륨 피루베이트, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 젠타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 대퇴골을 플러싱하여 수집하였다. 비장 및 골수 제제로부터의 RBC를 ACK 용해 완충액 (Lonza Walkersville)으로 용해시키고 완전 RPMI 배지로 세척하였다.

세포 (1x10⁶)를 항-마우스 CD16/CD32 (2.4G2, BD)과 함께 빙상에서 10분간 배양한 후 다음의 항체 칵테일로 빙상에서 30분간 표지하였다: 항-마우스 FITC-CD43 (1B11, BIOLEGEND®, PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). 골수: 미성숙 B 세포 (B220^intIgM⁺), 성숙 B 세포 (B220^hiIgM⁺), 프로 B 세포 (CD19⁺ckit⁺CD43⁺), 프리 B 세포 (CD19⁺ckit^-D43^-), 프리 B 세포 (CD19⁺CD43^intIgM^+/-, 미성숙 B 세포 (CD19⁺CD43^-IgM^+/-). 혈액 및 비장: B 세포 (CD19⁺), 성숙 B 세포 (CD19⁺IgM^intIgD^hi), 이형/미성숙 B 세포 (CD19⁺IgM^hiIgD^int).

염색 후 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드에 고정하였다. 데이터 수집은 LSRII 유세포분석기로 실시하고 FLOWJO^TM 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)로 분석하였다. 도 6a, 도 6b 및 도 6c는 비장 구획의 결과를 보여준다. 마우스의 각 군으로부터 혈액 구획에 대해 취득된 결과는 각 군의 비장 구획에서 취득한 결과와 비교하여 비슷한 것으로 증명되었다 (데이터 제시되지 않음).

유사한 실험으로, 여러 가지 세포 표면 마커의 유세포분석을 사용하여 B 세포 발생의 진행을 위해 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 30개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합형 마우스 (실시예 1에 기술됨, 도 2)로부터의 비장, 혈액 및 골수 구획의 B 세포 함량을 분석하였다.

간단히 설명하면, 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 치환 및 야생형 중쇄 유전자좌를 함유한 마우스 (WT) 및 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 치환을 함유하고 30개 hVκ 및 5개 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합형 마우스의 두 군 (각군은 3마리, 6주령 암컷)을 사멸시키고 비장 및 골수를 수확하였다. 여러 가지 세포 표면 마커로 염색하기 위해 골수 및 비장세포를 준비하였다 (상기됨).

세포 (1x10⁶)를 항-마우스 CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences)과 함께 빙상에서 10분간 배양한 후 골수 또는 비장세포 패널로 빙상에서 30분간 표지하였다: 골수 패널: 항-마우스 FITC-CD43 (1B11, BIOLEGEND®, PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). 골수 및 비장 패널: 항-마우스 FITC-Igκ (187.1 BD Biosciences), PE-Igλ (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD). 골수: 미성숙 B 세포 (B220^intIgM⁺), 성숙 B 세포 (B220^hiIgM⁺), 프로 B 세포 (CD19⁺ckit⁺CD43⁺), 프리 B 세포 (CD19⁺ckit^-D43^-),

미성숙 Igκ⁺ B 세포 (B220^intIgM⁺Igκ⁺Igλ^-), 미성숙 Igλ⁺ B 세포 (B220^intIgM⁺Igκ^-Igλ⁺), 성숙 Igκ⁺ B 세포 (B220^hiIgM⁺Igκ⁺Igλ^-), 성숙 Igλ⁺ B 세포 (B220^hiIgM⁺Igκ^-Igλ⁺). 비장: B 세포 (CD19⁺), 성숙 B 세포 (CD19⁺IgD^hiIgM^int), 이형/미성숙 B 세포 (CD19⁺IgD^intIgM^hi). 골수 및 비장: Igκ⁺ B 세포 (CD19⁺Igκ⁺Igλ^-), Igλ⁺ B 세포 (CD19⁺ Igκ^-Igλ⁺).

염색 후 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드에 고정하였다. 데이터 수집은 LSRII 유세포분석기로 실시하고 FLOWJO^TM 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)로 분석하였다. 이 결과는 6개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대한 동종접합형 마우스 (상기됨)와 비교했을 대 세 가지 모든 구획에 대해 유사한 염색 패턴과 세포군을 증명하였다. 그러나, 이들 마우스에서 내인성 λ 경쇄 유전자좌가 온전한 상태를 유지하고 있음에도 불구하고, 이들 마우스는 비장 및 골수 구획 모두에서 내인성 λ 경쇄 발현의 유실을 증명하였다 (각각 도 8a 및 도 8b). 이것은 중쇄 불변 영역에서 재배열된 사람 κ 경쇄 도메인이 쥐 λ 경쇄 도메인과 쌍을 이루거나 결합할 수 있는 능력이 없어 Igλ⁺ 세포의 결실을 초래한 것으로 해석할 수 있다.

이소형 발현. 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자좌에 대한 동종접합형 마우스 (VELCOIMMUNE® 사람화 마우스, 미국특허 제7,105,348호 참조) 및 내인성 중쇄 유전자좌내로 조작된 6개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대한 동종접합형 마우스에 대해 TAQMAN® 탐침을 사용한 정량 PCR 검정하여 (실시예 II에서 기술한 바와 같이) 전체 및 표면 (즉, 막결합된) 면역글로불린 M (IgM) 및 면역글로불린 G1 (IgG1)을 결정하였다.

간단히 설명하면, 제조사의 지침에 따라 마우스 CD19 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 마우스 군 (군당 3 내지 4마리)의 비장으로부터 CD19⁺ B 세포를 정제하였다. RNEASY^TM 미니키트 (Qiagen)을 사용하여 전체 RNA를 정제하였다. RNase-제거된 DNase 온-컬럼 처리 (Qiagen)를 사용하여 게놈 RNA를 제거하였다. First Stand cDNA 합성키트 (Invitrogen)을 사용하여 약 200 ng mRNA를 cDNA로 역전사시킨 다음 ABI 7900 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 TAQMAN® Universal PCR 마스터 믹스 (Applied Biosystems)로 증폭시켰다. 특정 프라이머/탐침 조합을 이용하여 IgM 및 IgG1 이소형의 전체, 표면형 (즉, 막통과형) 및 분비형의 발현을 특정적으로 결정하였다 (표 3). 마우스 κ 불변 영역(mCκ)으로 상대적 발현을 표준화하였다.

정량 TAQMAN® PCR 검정에 의한 결과는 전체 IgM 및 전체 IgG1의 감소를 증명하였다. 그러나, IgM 및 IgG1의 분비형 대 표면형의 비율은 VELCOIMMUNE® 사람화 마우스와 비교했을 때 정상으로 나타났다 (데이터 제시되지 않음).

사람 κ 유전자 절편 용법 및 Vκ-Jκ 접합부 분석. 30개 hVκ 및 5개 Jκ 유전자 절편 동종접합형이고 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 치환을 포함한 미접촉 마우스 (30hVκ-5hJκ HO)를 비장세포로부터 분리된 RNA를 사용한 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 마우스 중쇄 (IgG)에서의 특정 사람 Vκ-Jκ 재배열에 대해 분석하였다.

간단하게 설명하면, 비장을 수확하고 멸균 1회용 낭에서 5% HI-FBS를 함유한 10 mL RPMI-1640 (Sigma)로 관류시켰다. 이어서, 단일 비장을 함유한 각 낭을 STOMACHER^TM (Seward)에 넣고 30초간 설정한 배지에서 균질화하였다. 균질화 비장을 0.7 μm 세포 스트레이너로 여과한 다음 원심분리하여 (1000 rpm으로 10분간) 펠렛화하고, RBC를 BD PHARM LYSE^TM (BD Biosciences)에서 3분간 용해시켰다. 비장세포를 RPMI-1649으로 희석하고 다시 원심분리한 후 1 mL의 PBS (Irvine Scientific)에 재현탁시켰다. 본 분야에 알려진 표준 기술을 사용하여 비장세포 펠렛으로부터 RNA를 분리하였다.

사람 hVκ 유전자 절편 및 마우스 IgG에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 비장세포 RNA에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 마우스 IgG 프라이머는 모든 마우스 IgG 이소형으로부터 유도된 RNA를 증폭할 수 있도록 설계되었다. PCR 산물을 겔-정제하고 pCR2.1-TOPO TA 벡터 (Invitrogen)내로 클로닝한 다음, 클로닝 부위를 연결한 위치에서 벡터내에 위치한 프라이머 M13 순방향 (GTAAAACGAC GGCAG, 서열번호 16) 및 M13 역방향 (CAGGAAACAG CTATGAC, 서열번호 17)으로 서열분석하였다. 표 4는 12개의 선별된 클론에서 사용된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 보여준다. 도 9는 12개의 선별된 RT-PCR 클론에서 hVκ-hJκ-mIgG 접합부의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.

본 실시예에 제시된 바와 같이 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 6개 사람 Vκ와 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 대한 동종접합형 마우스 또는 30개 사람 Vκ와 5개 사람 Jκ 유전자 절편 동종접합형 마우스는 생식선 배치에서 경쇄 가변 유전자 절편을 함유한 변이 중쇄 유전자좌로부터 사람 경쇄 가변 영역의 발현을 증명하였다. 이들 마우스에서 여러 단계를 통한 B 세포 발생의 진행이 관찰되었고 다수의 재조합 생성 과정 및 항체 레퍼토리의 일부로서 그러한 하이브리드 중쇄 (즉, 중쇄 불변 영역에 연결된 사람 경쇄 가변 영역)의 발현을 나타낸다.

실시예 IV

V_L 결합 단백질을 발현하는 마우스의 번식

VL 결합 단백질의 새로운 발생을 형성하기 위하여 재배열되지 않은 사람 κ 유전자 절편을 갖는 마우스를 다른 내인성 중쇄 대립유전자의 결실을 함유한 다른 마우스와 교배시킬 수 있다. 이러한 방식으로 획득된 자손은 실시예 1에 기술된 바와 같은 하이브리드 중쇄만을 발현한다. 교배는 본 분야에 알려진 표준 기술이나 영리회사 (예, The Jackson Laboratory)에 의해 수행한다. 하이브리드 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스 스트레인을 특정 하이브리드 중쇄의 존재 및 전통적인 마우스 중쇄의 부재에 대해 스크리닝한다.

다른 방법으로서, 마우스 중쇄 유전자좌에 재배열되지 않은 사람 κ 유전자 절편을 갖는 마우스를 마우스 경쇄 유전자좌 (κ 및 λ)에 하나 이상의 결실을 함유한 다른 마우스와 교배시킴으로써 최적화할 수 있다. 이러한 방식으로 획득된 자손은 실시예 1에 기술된 바와 같은 특정 사람 κ 중쇄 항체만을 발현한다. 교배는 마찬가지로 본 분야에 알려진 표준 기술이나 영리회사 (예, The Jackson Laboratory)에 의해 수행한다. 하이브리드 중쇄 유전자좌 및 마우스 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 결실을 갖는 마우스 스트레인을 사람 κ 경쇄 도메인 및 마우스 중쇄 불변 영역을 함유한 특정 하이브리드 중쇄의 존재 및 내인성 마우스 경쇄의 부재에 대해 스크리닝한다.

또한, 재배열되지 않은 하이브리드 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스를 사람 κ 경쇄 가변 유전자좌에 의한 내인성 마우스 κ 경쇄 가변 유전자좌의 치환을 함유하는 마우스와 교배시킨다 (참조: 미국특허 제6,596,541호, Regeneron Pharmaceiticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology). VELOCIMMUNE® Humanized Mouse는 내인성 마우스 κ 경쇄 가변 불변 영역에 작동적으로 연결된 사람 κ 경쇄 가변 영역을 포함한 게놈을 포함함으로써 이 마우스는 항원 자극에 반응하여 사람 κ 경쇄 가변 도메인 및 마우스 중쇄 불변 도메인을 포함한 항체를 생성한다. 항체의 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 사람 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결할 수 있다. 이어서, DNA를 항체의 완전한 사람 경쇄를 발현할 수 있는 세포에 발현시킬 수 있다. 적합한 교배 일정에 따라, 사람 κ 경쇄 유전자좌에 의한 내인성 마우스 κ 경쇄의 치환 및 재배열되지 않은 하이브리드 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스를 획득한다. 해당 항원으로 면역화하여 체세포 돌연변이 사람 Vκ 도메인을 함유한 특정 V_L 결합 단백질을 분리할 수 있다.

실시예 V

V_L 결합 단백질의 생성

재배열되지 않은 하이브리드 중쇄 유전자좌를 함유하는 마우스를 다른 내인성 Ig 유전자좌의 변이 및 결실을 함유하는 여러 가지 목적하는 스트레인과 교배시킨 후 (실시예 IV에 기술된 바와 같이), 선별된 마우스를 해당 항원으로 면역화시킬 수 있다.

일반적으로, 하나 이상의 하이브리드 중쇄 유전자좌를 함유하는 VELOCIMMUNE® 사람화 마우스를 항원으로 도전하고 동물 (예, 비장 또는 림프절로부터)로부터 세포 (예, B-세포)를 회수한다. 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 불멸화 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있고, 이러한 하이브리도마 세포주를 선별 및 선택하여 면역화에 사용된 항원에 대해 특이적인 하이브리드 중쇄 함유 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정한다. 하이브리드 중쇄의 사람 Vκ 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 목적하는 불변 영역(예, 중쇄 및/또는 경쇄)에 연결시킬 수 있다. 마우스 중쇄 불변 영역에 융합된 사람 Vκ 유전자 절편의 존재로 인해, 특정 항체-유사 레퍼토리를 생성하고 면역글로불린 레퍼토리의 다양성이 생성된 특정 항체 유형의 결과로서 상당히 증가한다. 이것은 면역화시 항원 특이적 레퍼토리에 추가적인 다양성 수준을 제공한다. 후속적으로, 클로닝된 항체 서열 생성물을 CHO 세포와 같은 세포에서 생성할 수 있다. 다른 방법으로는 항원-특이적 림프구 (예, B 세포)로부터 항원-특이적 V_L 결합 단백질 또는 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 직접 분리할 수 있다.

처음에, 사람 Vκ 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고친화성 V_L 결합 단백질을 분리한다. 상기된 바와 같이, V_L 결합 단백질을 성상확인하고 친화성, 선별성, 에피토프 등을 포함하여 목적하는 특징에 대해 선별한다. 마우스 불변 영역을 목적하는 사람 불변 영역으로 치환시켜 본 발명의 재배열되지 않은 하이브리드 중쇄 유전자좌로부터 체세포 돌연변이된 사람 Vκ 도메인을 함유한 특정한 전체 사람 V_L 결합 단백질을 생성한다. 적합한 사람 불변 영역의 예로는 야생형 또는 변이된 IgG1 또는 IgG4가 포함되거나 다른 것으로는 Cκ 또는 Cλ이다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 6개 사람 Vκ 및 5개 사람 Jκ 유전자 절편에 의한 내인성 마우스 중쇄 유전자좌의 치환 및 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편에 의한 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 치환을 함유하는 독립적인 마우스 집단을 사람 세포-표면 수용체 단백질 (항원 X)로 면역화한다. 마우스의 뒷다리 발바닥에 항원 X를 3-4일 마다 6회 연속 주사로 직접 투여한다. 2 내지 3 마이크로그램의 항원 X를 주사전에 10 마이크로그램의 CpG 올리고뉴클레오타이드 (Cat# tlrl-modn - ODN1826 올리고뉴클레오타이드; InVivogen, San Diego, CA) 및 25 마이크로그램의 Adju-Phos (알루미늄 포스페이트 겔 부형제, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)와 혼합한다. 최종 항원 회수전에 총 6회 주사한 후 3-5일 경과하여 치사시킨다. 4차 및 6차 주사 후 채혈하고 항체 면역 반응을 표준 항원-특이적 면역검정으로 모니터링한다.

목적하는 면역반응이 도달된 경우 비장세포를 수거하고 생존력을 보존하기 위해 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포주를 형성한다. 하이브리도마 세포주를 선별 및 선택하여 항원 X-특이적 V_L 결합 단백질을 생성하는 세포주를 동정한다. 이 기술을 사용하여 몇 가지 항-항원 X-특이적 VL 결합 단백질 (즉, 마우스 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에서 사람 κ 도메인을 갖는 결합 단백질)을 수득한다.

다른 방법으로서, 미국특허원 제2007/0280945A1에 기술된 바와 같이 골수종 세포와 융합하지 않고 항원-양성 B 세포로부터 직접 항-항원 X V_L 결합 단백질을 분리한다. 상기 미국특허원은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 원용된다. 이 방법을 사용하여 몇 가지 완전한 사람 항-항원 X V_L 결합 단백질 (즉, 사람 Vκ 도메인 및 사람 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다.

사람 κ 유전자 절편 용법. 생성된 항-항원 X V_L 결합 단백질의 구조를 분석하기 위하여, 미국특허원 제2007/0280945A1에 기술된 방법을 응용하여 사람 Vκ 도메인(V_L 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄 모두로부터)을 암호화하는 핵산을 클로닝하고 서열분석하였다. 항체의 핵산 서열 및 추정 아미노산 서열로부터, 면역화 마우스로부터 수득된 특정 VL 결합 단백질의 하이브리드 중쇄 가변 영역에 대한 유전자 용법을 동정하였다. 표 5는 선정된 항-항원 X VL 결합 단백질로부터 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 유전자 용법을 보여준다. 이것은 본 발명에 따른 마우스가 재배열되지 않은 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 함유하는 내인성 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌에서의 다양한 재배열로 인하여 다양한 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로부터 항원-특이적 VL 결합 단백질을 생성한다는 것을 증명한다. 사람 Vκ 유전자 절편은 여러 가지 Jκ 절편과 재배열하여 특정 항원-특이적 V_L 결합 단백질을 생성한다.

효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA). 항원 X에 대해 발생된 사람 VL 결합 단백질이 항원 X의 천연 리간드 (리간드 Y)를 차단하는 능력을 ELISA 검정으로 시험하였다.

간단히 설명하면, 리간드 Y를 PBS에 희석된 2 μg/mL의 농도로 96-웰 평판에 코팅하고 밤새 배양한 후 0.05% 트윈-20을 함유한 PBS에서 4회 세척하였다. 그런 다음, 평판을 0.5% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유한 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 실온에서 1시간 차단시켰다. 별도의 평판에서 항-항원 X V_L 결합 단백질을 함유한 상청액을 완충액에 1:10으로 희석하였다. VL 결합 단백질의 동일한 성분을 갖는 모의 상청액을 음성 대조군으로 사용하였다. 항원 X의 세포외 도메인(ECD)를 마우스 IgG2a의 Fc 부분에 결합시켰다 (항원 X-mFc). 항원 X-mFc를 0.150 nM의 최종 농도로 첨가하고 실온에서 1시간 배양하였다. 이어서, V_L 결합 단백질/항원 X-mFc 혼합물을 리간드 Y를 함유한 평판에 첨가하고 실온에서 1시간 배양하였다. 리간드 Y에 결합된 항원 X-mFc의 검출량을 항-펜타-His 항체에 결합된 서양고추냉이 과산화효소 (Qiagen, Valencia, CA)로 결정하고 황산에 의해 중화되는 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (BD Bioscience, San Jose, CA)를 사용한 표준 비색반응에 의해 발색시켰다. 흡광도는 0.1초동안 OD450에서 판독하였다. 모든 시료에서 항원 X가 없는 시료의 배경 흡광도를 차감하였다. 각 시료의 배경-차감된 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고 100을 곱해서 얻은 값을 100에서 공제함으로써 250개 이상 (3개의 96웰 평판)의 항원 X-특이적 VL 결합 단백질에 대해 차단율을 계산하였다.

이 결과는 항원 X로 면역화된 마우스로부터 분리된 몇 가지 V_L 결합 단백질이 마우스 IgG2a의 Fc 부분과 융합된 항원 X의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하였음을 나타냈다 (데이터 제시되지 않음).

친화성 결정. 선별된 항원 X-특이적 V_L 결합 단백질 상청액에 대한 평형해리상수 (K_D)를 BIACORETM T100 장비 (GE Healthcare)를 사용한 SPR (표면 플라스몬 공명)에 의해 결정하였다. 모든 데이터는 25℃에서 작용 완충액과 시료 완충액 둘다로서 HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)를 사용하여 획득하였다.

간단하게 설명하면, 표준 아민 결합 화학을 사용하여 고밀도의 항-사람 Fc 항체로 사전에 유도체화된 CM5 센서 칩상에서 조 상청액 시료로부터 VL 결합 단백질을 포획하였다. 포획 단계동안에, 상청액을 항-사람 Fc 표면을 따라 3 μL/분의 유속으로 총 3분간 주입하였다. 포획 단계에 이어서 작용 완충액 또는 분석물 (100 nM의 농도)을 35μL/분의 유속으로 2분간 주입하였다. 포획된 V_L 결합 단백질로부터 항원의 해리를 6분간 모니터링하였다. 10 mM 글라이신 (pH 1.5)를 간단히 주입하여 포획된 V_L 결합 단백질을 제거하였다. 모든 센서그램은 분석물 센서그램으로부터 완충액 주입의 센서그램을 공제하고 그에 따라 포획 표면으로부터 VL 결합 단백질의 해리에 의해 발생된 인위산물을 제거함으로써 이중으로 조회하였다. 각 VL 결합 단백질에 대한 결합 데이터는 BIAcore T100 Evaluation 소프트웨어 버젼2.1을 사용하여 대량 이송의 1:1 결합 모델로 피팅하였다.

34개의 선정된 V_L 결합 단백질의 결합 친화성은 다양하였고 모두는 나노몰 범위 (1.5 내지 130 nM)의 K_D로 나타났다. 또한, 선정된 V_L 결합 단백질중 약 70% (34개중 23개)는 한자릿수 나노몰 친화성을 나타냈다. 선정된 V_L 결합 단백질의 T^1/2 측정 결과 약 0.2 내지 66분의 범위로 나타났다. 34개 V_L 결합 단백질가운데 6개는 항원 X에 대해 3 nM 이상의 친화성을 나타냈다 (1.53, 2.23, 2.58, 2.59, 2.79 및 2.84). 친화성 데이터는 고친화성이고, 클론으로 선별되며, 체세포적으로 돌연변이된 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 연결된 재배열 사람 경쇄 가변 도메인의 조합적 결합으로부터 생성된 V_L 결합 단백질 (표 4)과 일치한다. 본원에 기술된 마우스에 의해 생성된 V_L 결합 단백질은 항원 X의 에피토프 한개 이상에 대한 특이성을 나타내는 다양하고 고친화성-특이적인 결합 단백질의 집합체이다.

다른 실험으로서 LUMINEX® 비드-기본 검정에 의해 항원 X에 대해 발생된 특정 사람 VL 결합 단백질이 항원 X와 항원 X의 천연 리간드 (리간드 Y)의 결합을 차단하는 능력을 시험하였다 (데이터 제시되지 않음). 이 결과는 선정된 VL 결합 단백질이 상기된 나노몰 범위의 친화성으로 항원 X의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 것에 더하여 사이노몰거스 원숭이 (Macaca fascicularis)의 항원 X와도 결합할 수 있음을 증명하였다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> MICE THAT MAKE BINDING PROTEINS COMPRISING VL DOMAINS <130> 1200A-WO <150> US 61/369,909 <151> 2010-08-02 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 gagaggaccg tggacaagtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 tgacggtggt gctgtagaag 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 atgctgagga ggaaggcttt gagaacct 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 gctcgtgagc aactgaacct 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 gccactgcac actgatgtc 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 agtcagccac agtcacctgc ctg 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 gcctgcacaa ccaccatac 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> 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Claims (27)

1. 중쇄 불변 영역 핵산 서열과 작동적으로 연결된 재배열되지 않은(unrearranged) 경쇄 V 절편 및 재배열되지 않은 J 절편을 생식선에 포함하는, 마우스.
2. 제1항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편이 사람 κ 절편, 사람 λ 절편, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 마우스.
3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열이 C_H1 서열, 힌지 서열, C_H2 서열, C_H3 서열, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 마우스.
4. 제1항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편 및 상기 재배열되지 않은 J 절편이 내인성 마우스 중쇄 유전자좌에서 내인성 마우스 중쇄 V 절편 및 내인성 마우스 중쇄 J 절편을 대체하는, 마우스.
5. 제4항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편이 내인성 마우스 중쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 마우스 중쇄 V 절편을 대체하는, 마우스.
6. 제4항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 J 절편이 경쇄 J 절편을 포함하고, 상기 경쇄 J 절편이 내인성 마우스 중쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 마우스 중쇄 J 절편을 대체하는, 마우스.
7. 제6항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편과 상기 재배열되지 않은 경쇄 J 절편이 작동적으로 연결되고, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편과 상기 재배열되지 않은 경쇄 J 절편 사이에 작용성 D 절편이 결여되어 있는, 마우스.
8. 제7항에 있어서, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 절편이 사람 κ 절편이고, 상기 재배열되지 않은 경쇄 J 절편이 사람 κ 절편인, 마우스.
9. 제1항에 있어서, 마우스 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 사람 κ 가변 영역을 포함하는 재배열 면역글로불린 유전자를 게놈에 포함하는 B 세포를 포함하는, 마우스.
10. 제1항에 있어서, 상기 재배열 면역글로불린 유전자가 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재하는, 마우스.
11. 제1항에 있어서, 경쇄 불변 유전자에 작동적으로 연결된 사람 경쇄 V 절편과 사람 경쇄 J 절편을 생식선에 추가로 포함하는, 마우스.
12. 제11항에 있어서, 상기 경쇄 불변 유전자가 마우스 경쇄 불변 유전자인, 마우스.
13. 제12항에 있어서, 상기 사람 경쇄 V 절편이 사람 κV 절편인, 마우스.
14. 제13항에 있어서, 상기 마우스 경쇄 불변 유전자가 마우스 κ 경쇄 불변 유전자인, 마우스.
15. 면역글로불린 중쇄 불변 영역과 융합된 제1 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역과 융합된 제2 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로불린을 생식선에서 발현하는, 마우스.
16. 제15항에 있어서, 상기 제1 사람 경쇄 가변 영역 서열이 사람 κ 가변 영역 서열을 포함하고, 상기 제2 사람 경쇄 가변 영역이 사람 κ 가변 영역 및 사람 λ 가변 영역으로부터 선택되는, 마우스.
17. 제16항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역이 사람 중쇄 불변 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는, 마우스.
18. 제16항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 불변 영역이 사람 경쇄 불변 영역 및 마우스 경쇄 불변 영역으로부터 선택되는, 마우스.
19. 제16항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드가 작용성 내인성 중쇄 V 유전자 절편이 결여된 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현되는, 마우스.
20. 제19항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 작용성 내인성 경쇄 V 유전자 절편이 결여된 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현되는, 마우스.
21. 마우스로서,
    상기 마우스는, 마우스 생식선에서 모든 또는 실질적으로 모든 작용성 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 절편의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 6개 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 절편 및 1개 이상의 재배열되지 않은 J 유전자 절편으로의 대체를 포함하고, 상기 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 절편과 J 유전자 절편은 작동적으로 연결되며, 상기 마우스는 중쇄 V 유전자 절편으로부터 유도된 면역글로불린 중쇄를 발현할 수 없고, 상기 마우스는 야생형 마우스의 비장 B 세포 군집(B220⁺/IgM⁺) 크기의 약 75% 이상인 비장 B 세포 군집(B220⁺/IgM⁺)을 포함하는, 마우스.
22. 사람 경쇄 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제조하기 위한 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 마우스의 용도.
23. 항체를 제조하기 위한 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 마우스의 용도.
24. 제23항에 있어서, 상기 항체가 사람 항체인, 용도.
25. 이특이적 항체를 제조하기 위한 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 마우스의 용도.
26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 마우스로부터 유도된 세포 또는 조직.
27. 제26항에 있어서, 상기 세포가 ES 세포, B 세포 및 하이브리도마로부터 선택되는, 세포.

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