KR20130026976A - 제주조릿대 잎 추출물 또는 그로부터 분리된 파라-쿠마르산을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물 - Google Patents

제주조릿대 잎 추출물 또는 그로부터 분리된 파라-쿠마르산을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물 Download PDF

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김세재
강성일
고희철
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제주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 제주조릿대 추출물을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물을 개시한다. 상기 제주조릿대 추출물은 동물실험에서 체중 증가 및 지방 축적을 억제하고, 아디포넥틴의 발현량을 증가시키며 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시키는 활성을 나타낸다. 또한 상기 제주조릿대 추출물은 간 손상의 지표효소인 글루타민산피루브산트랜스아미나아제(이하 "GPT"), 글루타민산옥살로아세트산트랜스아미나아제(이하 "GOT") 및 락테이트디하이드로게나제(이하 "LDH")의 함량을 낮추는 활성 등을 나타낸다.

Description

제주조릿대 잎 추출물 또는 그로부터 분리된 파라-쿠마르산을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물{Composition for improving obesity and fatty liver using an extract of leaves of Sasa quelpaertensis or p-coumaric acid}
본 발명은 제주조릿대(Sasa quelpaertensis) 잎 추출물 또는 그로부터 분리된 파라-쿠마르산(p-coumaric acid)을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.
최근 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상, 바쁜 생활 환경에 따른 운동 부족, 영양의 과잉 섭취 등으로 비만 인구가 급속히 늘고 있다. 우리나라의 비만(BMI> 25) 인구 비율은 1995년 11.7%이던 것이 2008년 30.7%, 고도 비만(BMI> 30) 인구 비율은 1998년 2.3%에서 2008년 4.1%로 빠른 증가세를 보이고 있다(보건복지부, 2009).
비만은 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다(Clinical Endocrinology 28:675-689, 1998; Clinical Obesity (eds. Kopelman PG, Stock MJ) 248-89 (Blackwell Science, Oxford 1998).
세계보건기구(WHO)는 동양인 기준 BMI(Body Mass Index: 체질량지수)가 23~25를 과체중, 25~30을 비만, 30 이상을 고도비만으로 보고 있다.
비만의 원인으로는 고지방·고열량의 식생활, 바쁜 사회적 환경에 따른 운동 부족, 내분비 이상 등 환경적 요인과 유전적 요인을 들 수 있는데, 이 중 비만의 50 내지 70% 정도가 환경적 요인에 의한 것으로 알려져 있고, 나머지가 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다.
지방간이란 정상적인 지방대사가 이루어지지 못함으로써 간에 지질, 특히 중성지방(트리클리세라이드)이 과도하게 축적되어 간세포 절반 이상에서 지방 공포(空胞)가 관찰되는 상태의 질환을 말한다.
임상적으로는 간세포의 5% 이상에서 지방이 관찰되거나 간 100mg 당 지방이 5mg 이상일 때를 지방간으로 분류한다. 최근 들어서는 생활 수준의 향상에 따른 고지방, 고열량의 식생활, 문명의 발달로 인한 운동부족 등으로 인하여 지방간 환자가 급증하고 있으며, 연령층도 10대부터 50, 60대 이후까지 전반적으로 발병되고 있다. 지방간은 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행될 수 있다.
지방간의 원인으로서는 알코올, 당뇨, 비만, 영양불량증(장기간의 저단백식, 고지방식, 기아, 비타민 부족, 과잉의 당질 섭취), 약물의 남용(김성훈 외, "복부초음파로 진단된 지방간의 원인" 가정의학회지 175(1995.12) pp.785-794) 등이 보고 되어 있다.
현재 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(Orlistat)가 주원료로 하는 제니칼™(로슈), 시브트라민을 원료로 하는 리덕틸™(애보트) 등이 시판되고 있으나 오심, 설사, 복통, 불면증, 혈압상승, 지방변 등의 부작용을 보이고 있으며, 지방간의 치료제로서는 클로피브레이트(clofibrate)로 대표되는 피브레이트계 약제 등이 임상에서 사용되고 있으나, 간기능 장애 등의 부작용이 보고되고 있다(Atherosclerosis. 92:31-40 (1992)).
이처럼 합성 의약품의 부작용과 서양 의학이 한계를 보임에 따라 천연물 의약품에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다.
본 발명은 제주조릿대 추출물의 비만 개선 활성과 지방간 개선 활성을 개시한다.
본 발명의 목적은 비만 개선제 조성물과 지방간 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 일 측면에 있어서 비만 개선제 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 제주조릿대 잎 열수 추출물을 실험동물에 고지방식이와 함께 투여하였을 때 고지방식이만을 투여한 경우에 비하여, 체중 증가가 유의성 있게 감소하고 복부지방 및 신장지방의 증가 정도를 감소시킴을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명자들은 제주조릿대 추출물의 투여군에서는 아디포넥틴(adiponectin)의 발현량이 증가하고 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시키고(p-AMPK 증가) ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 활성을 억제시킴(p-ACC 증가)을 확인하였으며, 세포실험에서도 제주조릿대 추출물이 AMPK를 활성화시키고 CPT-1α(carnitine palmitoyl transferase-1α)를 활성화시킴(CPT-1α 증가)을 확인할 수 있었다.
그리고 본 발명자들은 제주조릿대 추출물에서 분리된 생물활성 물질인 p-쿠마르산(p-coumaric acid)도 세포실험에서 중성지방의 축적을 억제하고 AMPK의 인산화 및 ACC의 인산화를 증가시킴과 함께 AMPK를 활성화시키는 LKB1의 인산화를 증가시키고 CPT-1의 전사인자인 PPARα 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
아디포넥틴의 발현량 증가는 비만 개선과 깊은 연관성이 있다고 알려져 있으며(Commb, T. P., et al, J. Clin. Invest., 108(12):1875-1881, 2001), AMPK는 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 담당하는 효소로서 포도당 결핍, ROS 등의 산화적 스트레스에 의해 AMP:ATP 비율이 증가하게 되면 활성화된다고 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002; J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002). AMPK가 활성화되면 ACC가 인산화되어 불성화되는데, ACC는 지방산 합성의 초기 단계에 관여하는 효소로서 아세틸코에이(acetyl-CoA)를 말로닐코에이(malonyl-CoA)로 합성하는 효소이다(Trends Biochem. Sci. 24:22-25, 1999; Biochem. Soc. Trans. 31:162-168, 2003). ACC가 불활성화되면 말로닐코에이(malonyl-CoA)의 세포 내 농도가 낮아져 UCP2, CPT-1α 등이 활성화되어 지방 산화가 촉진되는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002, J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002).
따라서 아디포넥틴의 발현량이 증가하고 AMPK가 활성화되면 체내 지방의 축적을 억제할 수 있으며, 결과적으로 체중의 증가를 억제할 수 있고, 또한 혈중 중성 지방과 콜레스테롤 농도를 저하시키는 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 비만 개선제 조성물은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 비만 개선제 조성물은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "제주조릿대 잎 추출물"은 추출 대상으로 제주조릿대 잎을 사용하고, 추출 용매로 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다. 추출 방법은 유효성분의 추출 정도, 보존 정도 등을 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식을 적용될 수 있다. 또한 유효물질(활성을 나타내는 미지의 단일물질)을 변화 또는 유효물질의 다양화를 유도하기 위하여 추출시에 다당류 분해 효소를 사용할 수 있는데, 단당류가 3 분자 이상, 바람직하게는 10 분자 이상 결합하여 이루어진 당류를 분해할 수 있는 효소이면 어떠한 효소라도 무방하다. 그러한 효소로서는 예컨대, 셀룰나제(cellulase), 키실라나제(xylanase), 헤미셀룰나제(hemicellulase) 및 베타-클루카나제(β-glucanase), 셀로비하이드롤나제(cellobihtydrolase), 1,4-베타-디-클루코시다제(1,4-β-D-glucosidase) 및 1,4-베타-디-글루카나제(1,4-β-D-glucanase), 아밀로클루코시다제(amyloglucosidase), 알파-아밀라제(α-amylase), 펙틴나제(pectinase), 펙토산나제(pentosanase), 만나제(mannase), 펙틴트란스리미나제(pectintranseliminase), 폴리칼락토나제(polygalactonase), 펙틴에스터라제(pectinesterase) 및/또는 이들 효소를 함유한 동식물 추출물 등을 들 수 있다. 실제적으로는 Pectinex™(Novo Nordisk, Denmark), Ultraflo L™(Novo Nordisk, Denmark), Viscozyme L™(Novo Nordisk, Denmark), Ceremix™(Novo Nordisk, Denmark), Celluclast™(Novo Nordisk, Denmark), Filterase BR™(Gist-Brocades, Netherlands), Termamyl (Novozymes, Denmark) 등 상업적으로 판매되고 있는 효소가 사용될 것이다. 상기 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된, 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물일 수 있다. 특히 "제주조릿대 추출물"은 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 추출 용매로 사용하여 얻어진 것을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "비만"이란, 그것이 유전적 요인에 의한 비만이든 또는 환경적 요인에 의한 비만이든 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미하며, 체질량지수의 구분에 따른 비만(BMI이 25 이상인 경우)과 과체중(BMI이 23~25인 경우)을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, 상기 "비만 개선"이란 비만의 예방, 비만의 치료를 포함하여, 체지방의 감소 및/또는 체중의 감소를 포함하는 의미이다.
본 발명의 비만 개선제 조성물은 그 유효성분을 비만 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 비만 개선 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선제 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 "다이어트"란 체중 상태가 비만이나 과체중은 아니지만 미용이나 건강 목적으로 체중/체지방의 감소가 바람직하거나 필요한 상태로서 정의된다. 통상 본 발명의 다이어트용 조성물은 정상인의 미용이나 건강 목적으로 제조·사용될 것이다.
또 본 명세서에서, "고지혈증"이란 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방량이 많아 유발되는 질환을 말한다.
본 발명의 다이어트용 조성물과 고지혈증 개선제 조성물에 있어서, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만이 원인이 되어 발생하는 질환 예방용 조성물에 관한 것이다.
비만이 지속되면 비만이 원인이 되어 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면무호흡증, 당뇨병 등이 발병할 수 있다.
그러므로 상기 "비만이 원인이 되어 발생하는 질환"이란 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면무호흡증 및 당뇨병 중 하나로서 이해할 수 있다.
본 발명의 비만이 원인이 되어 발생하는 질환 예방용 조성물에 있어서도, 그것의 유효성분인 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.
아래의 실험예는 제주조릿대 추출물이 글루타민산피루브산트랜스아미나아제(이하 "GPT"), 글루타민산옥살로아세트산트랜스아미나아제(이하 "GOT") 및 락테이트디하이드로게나제(이하 "LDH")의 함량을 낮추는 것을 보여주며, 또한 적출된 실험동물의 간 조직의 조직 절편 관찰에 있어서도 고지방식이와 함께 제주조릿대 추출물이 투여된 군의 경우는 간 조직 형태가 정상식이군과 유사한 반면 고지방식이만이 투여된 군은 지방간의 현저히 진행되었음을 보여준다.
상기에서 GPT, GOT 및 LDH는 간이 비만, 알콜 등이 원인이 되어 손상을 입을 경우 간으로부터 혈액 중으로 분비되기 때문에, 이들 효소의 활성은 간 기능 장애를 나타내는 일반적인 지표로서 사용되고 있는데, 이들 효소의 활성이 낮다는 것은 간 손상 정도가 낮다는 것을 의미한다.
제주조릿대 추출물에서 분리된 p-쿠마르산의 경우도 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 SREBP-1c(sterol regulatory element binding protein -1c)의 활성화를 농도 의존적으로 억제하였다. 상기 SREBP-1c는 간에서의 지방산과 중성지방의 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Cell, 89 (3): 331-340, 1997)
이러한 실험 결과는 제주조릿대 추출물 등이 지방간 개선 용도로도 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
본 명세서에서, "지방간"은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화 등의 원인이 되는 질병으로서, 간의 지방대사 장애로 인하여 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태의 질환을 말한다.
본 발명의 지방간 개선제 조성물에 있어서도, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.
한편, 지방간은 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행될 수 있다. 따라서 본 발명의 지방간 개선제 조성물은 지방간이 원인이 되어 발생하는 간염, 간경병증 또는 간암의 예방 목적으로 사용될 수도 있다.
따라서 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간이 원인이 되어 발생하는 질병인 간염, 간경병증 또는 간암의 예방용 조성물로서 파악될 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선제 조성물에 관한 것이다.
비만은 인슐린 저항성의 여러 원인 중 하나에 해당한다. 고도 비만에서 인슐린 저항성이 발병하지 않는 경우도 있지만, 인슐린 저항성과 비만은 밀접한 상관관계가 있어, 일반적으로 비만이 심할수록 특히 내장 비만(visceral obesity)이 심할수록 인슐린 저항성도 심해진다고 알려져 있다.
지방세포는 생리활성물질인 아디포사이토카인을 분비하는데, 이 아디포사이토카인은 대사의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하지만, 비만 즉 지방의 과도한 축적 상태가 되면 아디포사이토카인의 생성·분비가 과잉 또는 과소가 되어 균형이 파괴됨으로써 인슐린 저항성이 야기되는 것으로 이해되고 있다.
아디포사이토카인 중에는 인슐린 감수성을 항진시키는 것과 인슐린 저항성을 야기시키는 것이 있으며, 전자의 대표적인 경우가 아디포넥틴과 AMPK(AMP-의존성 단백질 키나아제)이며, 후자의 대표적인 경우가 TNF-α, lL-6, 레지스틴(resistin) 등을 들 수 있다.
특히 AMPK 활성 저하는 인슐린 저항성과 고혈당을 수반하므로 AMPK를 활성화시킬 수 있는 물질은 인슐린 저항성을 개선할 수 있는 후보 물질일 수 있다는 연구 결과들이 발표된 바 있다(J. Biol. Chem., 277(28):25226-32, 2002; Diabetes. 51(7):2074-81, 2002; J. Clin. Invest. 108(8):1167-74, 2001).
아래의 실시예 및 실험예는 본 발명의 비만 개선제 조성물의 유효성분인 상기 제주조릿대 추출물 또는 그것으로부터 분리된 p-쿠마르산이 AMPK를 활성화시킴을 보여준다. 이러한 실험 결과는 제주조릿대 추출물 등이 비만 개선제로서 뿐만 아니라 인슐린 저항성 개선제로서도 유용하게 활용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 "인슐린 저항성"이란 세포, 장기, 인체 등이 정상적인 대사 활동을 위하여 통상적인 양 이상의 인슐린을 필요로 하는 상태, 즉 인슐린의 작용력이 저하된 인슐린의 작용 부전 상태를 의미하며, 인슐린 비의존형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병과 동일한 의미로 받아들여진다. 당뇨병은 췌장의 β-세포가 파괴된 결과 그 치료를 위하여 인슐린이 필수적으로 요구되는 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린의 작용력이 저하되어 그 치료에 인슐린이 요구되지 않은 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분되기 때문에, 당업계에서 인슐린 저항성, 인슐린 비의존형 당뇨병 그리고 제2형 당뇨병은 동일한 의미로 받아들여지고 있다.
본 발명의 인슐린 저항성 개선제 조성물에 있어서도, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.
본 발명의 비만 개선제 조성물, 다이어트용 조성물, 고지혈증 개선제 조성물, 비만 합병증 예방용 조성물, 지방간 개선제 조성물, 지방간이 원인이 되어 발병하는 질환의 예방제 조성물 및 인슐린 저항성 개선제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.
미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 그 기능성을 상승 보강하거나 다른 기능성(예컨대 숙취 해소 활성 등)을 부가하기 위하여 이미 비만 개선 활성, 숙취 해소 활성 등이 있다고 알려진 임의의 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 분말 또는 추출물, 지치 분말 또는 추출물, 노근 분말 또는 추출물, 계피 분말 또는 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 상기에서 추출물의 의미는 제주조릿대 추출물과 관련하여 앞서 설명한 바와 같다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.
상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.
부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 사용할 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비만 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 지방간 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 고지혈증 개선제 조성물, 인슐린 저항성 개선제 조성물 등을 제공할 수 있다. 본 발명의 비만 개선제 조성물 등은 기능성 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 제주조릿대 열수 추출물의 크로마토그램과 그 주성분의 분자 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우 실험동물(HFD+SQE)의 체중(body weight)을 5일마다 70일간 측정한 결과이다.
도 3은 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방(epididymal adipose tissue) 세포 크기를 확인한 결과이다.
도 4는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방에서 아디포넥틴의 RNA 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방에서 p-AMPK, p-ACC 의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 6은 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 간조직(liver) 절편을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 3T3-L1 지방세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 8은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 L6 골격근 세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 9는 제주조릿대 추출물(SQE)의 지방화가 유도된 HepG2 간 세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 10은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 3T3-L1 지방세포에서 CPT-1a의 RNA 발현을 측정한 결과이다.
도 11은 p-쿠마르산이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 중성지방의 축적을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 12는 p-쿠마르산이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 농도 의존적으로 LKB1의 인산화, AMPK의 인산화 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 13은 p-쿠마르산이 분화된 L6 골격근 세포에서 농도 의존적으로 AMPK 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 14는 p-쿠마르산이 분화된 L6 골격근 세포에서 농도 의존적으로 PPARα 발현을 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 15는 p-쿠마르산이 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 농도 의존적으로 AMPK 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 16은 p-쿠마르산이 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 농도 의존적으로 SREBP-1c의 발현을 증가시킴을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 제주조릿대 추출물의 제조 및 생리활성 물질의 분리
<실시예 1> 제주조릿대 추출물의 제조예 1
제주조릿대 6 kg을 수돗물로 수세하고, 동결건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 제주조릿대를 물에 침지시켜 90℃에서 4시간 동안 열수추출하고 감압농축 후 추출용매를 제거하여 분말 형태의 제주조릿대 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 제주조릿대 추출물의 제조예 2
제주조릿대 6 kg을 수돗물로 수세하고, 동결건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 제주조릿대를 그 중량의 3% 만큼의 viscozyme™(Novo Nordisk, Denmark), 3% celluclast™(Novo Nordisk, Denmark)와 구연산(pH 4.5)이 포함된 물에 첨가한 다음 50에서 5시간 동안 추출하고, 100℃에서 1시간 동안 효소를 불활성화시켰다. 그리고 감압농축 후 동결건조시켜 추출용매를 제거하고 분말 형태의 제주조릿대 추출물을 제조하였다.
<실시예 3> 생리활성 물질의 분리
(1) 제주조릿대 추출물의 분획
제주조릿대 추출물 100g을 증류수 1L에 현탁시키고, 여기에 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 1L씩을 가하여 각각 3회씩 순차적으로 반복하여 추출한 후 회전농축기를 사용하여 40℃에서 농축하였다.
(2) 표준용액의 조제
제주조릿대 열수추출물의 성분 확인을 위한 표준용액은 chlorogenic acid, p-쿠마르산와 tricin 10mg을 1mL의 DMSO(dimethylsulfoxide)로 녹인 후 9mL의 메탄올로 정용한 후 이를 희석하여 표준용액으로 사용하였다.
(3) 시험용액의 조제
상기 <실시예 1>의 제주조릿대 열수추출물 약 500mg을 취해 DMSO 2.5 mL를 넣고 메탄올 2.5mL를 가하여 10분 동안 sonication 한 후 이 추출액을 0.50 mm 테프론(PTFE, polytetrafluoroethylene)과 주사기 필터 (Advantec Toyo Roshi Kaisha Ltd., DISMICR-13JP, Japan)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.
(4) 화합물의 분석
제주조릿대 열수추출물의 정성분석은 HPLC (Waters사, 2695 Alliance system, USA), SunfireTM C18 컬럼 (250 × 4.6 mm ID. 5㎛)를 사용하였고, 컬럼 온도는 40℃를 유지하였다. 제주조릿대 분획의 성분탐색은 PDA 검출기를 이용하여 200 ~ 600 nm 범위의 UV 흡광도에서 검출하였고, 이동상은 MeOH과 초순수를 사용하여 기울기 용리법으로 분리하였다(표 1). 유속은 1.0 mL/min을 유지하였다.
(5) 화합물의 분리 및 동정 방법
제주조릿대 열수추출물의 화합물 분리를 위한 장비는 HPLC (Waters사, 2695 Alliance system, USA), SymmetryprepTM C18 컬럼(7.8 300 mm ID. 7 m)을 사용하였고, 컬럼 온도는 40℃를 유지하였다. 검출기는 PDA 검출기를 이용하여 200 ~ 600 nm 범위의 UV 흡광도에서 검출하였다. 이동상은 MeOH과 초순수를 사용하여 기울기 용리법으로 분리하였다. 유속은 1.8 mL/min을 유지하였고 머무름 시간이 동일한 peak를 반복 분취하였다. 구조분석에 이용된 NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 분광기는 400 MHz FT-NMR (JEOL 사, JNM-LA, Japan)을 이용하였고, 측정 시 용매는 Merck사의 CD3OD와 CDCl3을 사용하였다.
Figure pat00001
(6) 분리된 화합물의 동정
제주조릿대 열수추출물에 함유되어 있는 3개의 화합물을 HPLC를 사용하여 분리하였고 문헌(J. Agric . Food Chem ., 2007, 55(25), 10086-10092; J. Appl . Biol . Chem., 2008, 51(4), 148-154; Arch . Pharm . Res ., 2007, 30(2), 161-166; Bull . Koeran Chem . Soc ., 2010, 31(4), 1088-1090)과 비교하여 chlorogenic acid, p-쿠마르산, tricin과 동일 화합물임을 확인하였다. 또한 이를 확인하기 위해 각각의 분리된 화합물의 표준물질을 사용하여 정성분석을 실시하였다. 열수추출물에서 분리된 구성 화합물을 확인하기 위해 320nm에서 3번 반복 주입하여 각 화합물 peak의 머무름을 확인하였고, 그 결과 chlorogenic acid peak는 7분 근처에 p-쿠마르산 peak는 10~11분 사이에 tricin peak는 18~19분 사이에 검출되었고 표준용액의 표준물질과 동일한 머무름 및 흡광도를 나타내었다. 제주조릿대 추출물에서 클로로젠산(chlorogenic acid), p-쿠마르산, 트리신(tricin)은 각각 0.132, 23.706, 0.286 mg이 함유되어 있는 것으로 확인되었다(도 1). 제주조릿대 열수 추출물의 주요 구성성분을 분석한 결과, 가장 많은 함량을 나타내는 것은 p-쿠마르산이었다. 따라서 아래의 실험에서는 열수 추출물의 주성분인 p-쿠마르산가 세포 지질대사에 미치는 영향을 조사하였다.
< 실험예 > 제주조릿대 추출물과 이로부터 분리된 p -쿠마르산의 대사성 질환 개선 활성 실험
< 실험예 1> 제주조릿대 추출물의 대사성 질환 개선 활성 실험
<실험예 1-1> 동물실험에서 체중 및 체지방 측정 실험
(주)나라바이오텍에서 구입한 4주령 C57BL/6 수컷 생쥐를 고형사료와 물을 공급하면서 1주간 적응시킨 후, 체중이 비슷한 생쥐를 무작위로 10 마리씩 3개의 군으로 나누었다. 정상군(ND)은 정상식이, 비만대조군(HFD)은 고지방식이, 실험군(HFD+SQE)은 고지방식이와 상기 제주조릿대 추출물(150mg/kg of body weight/day)을 경구투여 하면서 두 마리씩 분리·사육하였다. 사육환경은 온도 23℃, 습도 50±5%, 밤과 낮을 12시간 주기로 유지시켰다.
상기에서 정상식이는 10% kcal 지방식이(Research Diets, USA) 사료를 사용하였고, 고지방식이는 60% kcal 지방식이(Research Diets, USA) 사료를 사용하였다.
체중에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 5일마다 같은 시간대에 동물체중계를 사용하여 70일간 측정하여 실험 결과를 도 2에 그래프로 나타내었고, 식이 섭취량은 5일마다 같은 시간대에 70일간 측정하여 5일 단위 측정량의 평균(g/cage/5day)을 표 2에 나타내었다. 그리고 70일 동안의 체중 증가 총량(70일 후 최종 체중에서 처음 체중을 제함으로써 측정)을 표 3에 나타내었다.
식이 섭취량
구분 ND HFD HFD+SQE
식이 섭취량(g/cage/5day) 26.57±0.40a 21.19±0.28b 21.04±0.28b
* a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05)
체중 증가 총량
구분 ND HFD HFD+SQE
체중 증가량(g) 5.65±0.60a 15.60±0.78c 10.76±0.59b
* a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05)
도 2 및 표 3은 제주조릿대 추출물이 투여된 HFD+SQE군의 경우 HFD군에 비해 체중 증가가 유의성 있게 감소하였음을 보여준다. 표 2에서는 HFD+SQE군이 HFD군과 비교하여 식이 섭취량이 적지 않았음을 확인할 수 있다.
복부지방(백색지방)과 신장지방 무게에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 무게를 측정하였고, 그 실험 결과를 표 4에 나타내었는데, HFD+SQE이 HFD군에 비해 백색지방 무게가 덜 증가하였음을 알 수 있다.
복부지방과 신장지방의 증가 총량
구분 ND HFD HFD+SQE
복부지방(g) 0.86±0.05a 2.02±0.12c 1.42±0.06b
신장지방(g) 0.50±0.06a 1.23±0.07c 0.97±0.06b
* a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05)
한편, 복부지방(epididymal adipose tissue)의 세포 크기에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 조직 절편 후 세포의 크기를 현미경으로 관찰하였고, 그 실험 결과를 도 3에 군당 개체 2마리의 조직 절편 사진으로 나타내었다. 도 3은 HFD+SQE군의 지방조직 세포 크기는 ND군과 유사한 크기인데 반해 HFD군은 지방조직 크기가 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.
<실험예 1-2> RT - PCR 를 통한 아디포넥틴 발현량 측정 실험
복부지방(epididymal adipose tissue)의 사이토카인의 발현에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 전체 RNA 분리 후 Real time RT-PCR 기법으로 측정 하였고, 그 실험 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다.
Real-time PCR을 위한 total RNA는 Trizol Reaent(Invitrogen, USA)를 500㎕ 첨가하여 상온에서 5-10 분간 세포를 균질화한 후, 튜브로 옮기고 chloroform 100㎕를 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분) 하였다. 상층액을 회수하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분)하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 3회 세척하고 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수에 용해시킨 후 nanodrop 2000 spectrometer(Nanodrop, USA)를 이용하여 260㎚의 흡광도를 측정하여 정량하였다. A260/A280 ㎚ 의 비율이 1.8-2.2 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 DNase(Wako, Japan)를 처리하여 순수한 RNA만을 분리하여 실험에 사용하였다.
cDNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1㎍ total RNA와 nuclease-free water를 총 20㎕가 되게 tube에 넣고 45℃에서 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 여기에 30㎕의 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후 PCR에 사용하였다.
Real time polymerase chain reaction(PCR)은 5㎕의 cDNA, 각 primer는 0.4㎕(10pmol/L/㎕)씩, 2㎕ nuclease-free water와 6㎕ iQ™ SYBR? Green Supermix(Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Peltier thermal cycler(Bio-rad, USA) real time PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 65℃/20초, 72℃/30초로하여 49회 증폭하였고 결과는 1회 증폭할 때마다 형광량을 측정하였으며 모든 cycle이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 primer의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10(Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열은 adiponectin, 5'-GAC CTG GCC ACT TTC TCC TC-3'(서열번호 1) 및 5'-GTC ATC TTC GGC ATG ACT GG-3'(서열번호 2); β-actin, 5'-AGG CTG TGC TGT CCC TGT AT-3'(서열번호 3) 및 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3'(서열번호 4)이다.
도 4는 HFD군의 아디포넥틴의 발현량이 ND군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있고, 그에 반해서 HFD+SQE군의 아디포넥틴의 발현량은 비만대조군에 비해 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.
<실험예 1-3> Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험
복부지방(백색지방)의 AMPK 활성화에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 단백질 분리 후 Western blot 기법으로 측정 하였고, 그 실험 결과를 도 5에 사진으로 나타내었다.
Western blot 분석을 위해 시료가 처리된 지방조직을 PBS로 2회 세척 후 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstatin, 1㎍/㎖ leupeptin 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 vortexing 하여 분해시킨 후 원심분리(15000 rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질 농도는 Bio-rad protein assay kit(Bio-rad, USA)를 사용하여 micro reader로 595㎚에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 35㎍의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride(PVDF) membrane(Milipore, USA)에 전이(100V, 120분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk 또는 5% BSA를 함유한 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline(TTBS) 용액으로 blocking 시킨 후, 1차 항체(p-AMPK, p-ACC, 및 β-actin)와 반응시켰다. p-AMPK antibody(1:2,000, Cell Signaling, USA), p-ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA), and β-actin antibody clone AC-74(1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TTBS용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:2,000, 1:5,000 혹은 1:10,000으로 희석하여 1시간동안 반응한 후 TBS-T로 세척하였다. 각 단백질의 발현은 WEST-ZOL western blot detection system(iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름(Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.
도 5는 HFD군의 AMPK 활성화(p-AMPK) 및 ACC 불활성화(p-ACC)가 ND군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있고, 그에 반해서 HFD+SQE군의 AMPK 활성화 및 ACC 불활성화는 HFD군에 비해 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.
<실험예 1-4> 혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 측정 실험
혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 함량에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 혈청을 분리하여 분석용 키트(아산제약, 대한민국)를 이용하여 측정하였고, 그 실험 결과를 표 5에 나타내었는데, HFD+SQE군에서 HFD군에 비해 혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 함량이 낮음을 알 수 있다.
혈중 총콜레스테롤(T-CHO) 및 혈중 중성지방(TG)의 총 증가량
구분 ND HFD HFD+SQE
T-CHO(mg/dL) 119.71±4.09a 179.14±3.90c 158.57±2.38b
TG(mg/dL) 92.29±4.86a 138.43±9.15b 83.43±3.03a
* a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05)
<실험예 1-5> 간 조직 관찰 실험
간조직 손상에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 조직 절편 후 현미경 관찰을 통하여 확인하였고, 실험 결과를 도 5에 군당 개체 2마리의 조직 절편 사진으로 나타내었다. 도 6은 HFD+SQE군의 경우 ND군과 유사함을 보여주고 있고 HFD군의 경우는 HFD+SQE군이나 ND군에 비해 다량의 지방구가 증가하였음을 보여주고 있다.
<실험예 1-6> 간 손상 지표 효소 활성 측정 실험
간 조직 손상 정도의 지표 효소로 이용되고 있는 GPT, GOT 및 LDH의 수치는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 혈청을 분리하여 분석용 키트(아산제약, 대한민국)를 이용하여 측정하였고, 실험 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6을 참조하여 보면 HFD+SQE군이 HFD군에 비해 GPT, GOT 및 LDH 수치가 낮음은 물론이고 거의 ND군 수치와 비슷한 것을 알 수 있다.
GPT, GOT 및 LDH 활성
구분 ND HFD HFD + SQE
GPT(IU/L) 8.57±0.85a 17.29±3.03b 8.29±0.65a
GOP(IU/L) 42.29±1.62a 57.43±3.14b 44.00±1.21a
LDH(IU/L) 440.86±80.48a 981.86±117.44b 566.57±26.43a
* a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05)
<실험예 1-7> 세포실험에서의 Western blot 을 통한 p- AMPK 의 발현량 측정 실험
제주조릿대 추출물이 동물실험에서 AMPK를 활성화시키는 결과를 세포 수준으로 확인하기 위해, 3T3-L1 세포(지방세포), L6 세포(골격근세포), HepG2 세포(간세포)를 배양하여 확인하였고, 실험 결과를 각각 도 7, 도 8 및 도 9에 사진으로 나타내었다.
분화된 지방세포에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화와 그 하위 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 지방세포의 분화를 다음과 같이 수행하였다. 3T3-L1 전구지방세포를 10% BCS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate (1.6 또는 2.0 × 105 cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 pre-confluent 상태가 되도록 하였다. Pre-confluent 상태에서 배지를 한 번 더 교환하여 48시간을 더 배양하였다. Confluent 상태(분화유도 0일째)에서 배양액을 분화유도 배지[10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 1% P/S, 1μM dexamethasone (DEXA.; Sigma, USA), 0.5μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; Sigma, USA) 및 5㎍/㎖ 인슐린(Sigma, USA)이 함유된 DMEM 배지]로 교환하여 2일간(분화유도 2일째) 분화 유도하였다. 다시 2일 후(분화유도 4일째)부터는 실험에 사용할 때까지 2일 마다 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 분화유도 8-10일째에 배양용기에서 배지를 제거하고 DMEM로 2번 세척한 후 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 16시간 배양한 후 농도별(20, 100, 250, 500 및 1,000 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다.
L6 myotube에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 근육세포의 분화를 다음과 같이 수행하였다. L6 myoblast를 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 12 well cell culture plate (1 × 105 cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 pre-confluent 상태가 되도록 하였다. Pre-confluent 상태에서 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM)를 한 번 더 교환하여 48시간을 더 배양하였다. Confluent 상태(분화유도 0일째)에서 배양액을 분화유도 배지(2% FBS가 첨가된 DMEM 배지)로 교환하여 분화 유도하였다. 실험에 사용할 때까지 배지를 2일 마다 동일한 배지로 교환하였다. 분화유도 9-10일째에 배양용기에서 배지를 제거하고 DMEM 배지로 세척한 후 0.5% BSA가 첨가된 DMEM 배지로 4시간 배양하였다. 이후 농도별 (125, 250, 500 및 1,000 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다.
지방-유도된 간세포에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 간세포의 지방유도를 다음과 같이 수행하였다. HepG2 세포를 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 12 well cell culture plate (1 × 106 cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여, DMEM 배지로 2번 세척한 후 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 16시간 배양한 후 0.4mM palmitate가 함유된 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 24시간 배양하여 HepG2 세포에 지방유도를 하였다. 지방유도 후 배지를 제거하고 무혈청 상태(0.5% BSA + DMEM)로 농도별 (62.5, 125, 250, 500 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다.
Western blot 분석을 위해 시료가 처리된 세포를 PBS로 2회 세척 후 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstatin 1㎍/㎖ leupeptin 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 vortexing 하여 분해시킨 후 원심분리(15000 rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질 농도는 Bio-rad protein assay kit(Bio-rad, USA)을 사용하여 micro reader로 595㎚에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 35㎍의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride(PVDF) membrane(Milipore, USA)에 전이(100V, 120분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk 또는 5% BSA를 함유한 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline(TTBS) 용액으로 blocking 시킨 후, 1차 항체(p-AMPK, AMPK, p-ACC, ACC 및 β-actin)와 반응시켰다. p-AMPK antibody(1:2,000, Cell Signaling, USA), AMPKα antibody(1:5,000, Cell Signaling, USA), p-ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA), ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA) and β-actin antibody clone AC-74(1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TTBS용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:2,000, 1:5,000 혹은 1:10,000으로 희석하여 1시간동안 반응한 후 TBS-T로 세척하였다. 각 단백질의 발현은 WEST-ZOL western blot detection system(iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름(Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.
도 7, 도 8 및 도 9를 참조하여 보면 제주조릿대 추출물이 세 종류의 세포 모두에서 AMPK 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다.
<실험예 1-8> RT - PCR 를 통한 CPT -1a 발현량 측정 실험
특히, 제주조릿대 추출물이 3T3-L1 세포에서 지방산의 β-산화 정도를 측정하는 지표인 AMPK 하위 조절자 CPT-1a의 RNA 발현을 확인하였고, 실험 결과를 도 9에 그래프로 나타내었다. 도 10을 참조하여 보면 제주조릿대 추출물이 CPT-1a 발현을 증가시키는 것을 알 수 있다.
Real-time PCR을 위한 total RNA는 Trizol Reaent(Invitrogen, USA)를 500㎕ 첨가하여 상온에서 5-10 분간 세포를 균질화한 후, 튜브로 옮기고 chloroform 100㎕를 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분) 하였다. 상층액을 회수하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분)하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 3회 세척하고 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수에 용해시킨 후 nanodrop 2000 spectrometer(Nanodrop, USA)를 이용하여 260㎚의 흡광도를 측정하여 정량하였다. A260/A280 ㎚ 의 비율이 1.8-2.2 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 DNase(Wako, Japan)를 처리하여 순수한 RNA만을 분리하여 실험에 사용하였다.
cDNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1㎍ total RNA와 nuclease-free water를 총 20㎕가 되게 tube에 넣고 45℃ 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 여기에 30㎕의 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후 PCR에 사용하였다.
Real time polymerase chain reaction(PCR)은 5㎕의 cDNA, 각 primer는 0.4㎕(10pmol/L/㎕)씩, 2㎕ nuclease-free water와 6㎕ iQ™ SYBR? Green Supermix(Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Peltier thermal cycler(Bio-rad, USA) real time PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 65℃/20초, 72℃/30초로하여 49회 증폭하였고 결과는 1회 증폭할 때 마다 형광량을 측정하였으며 모든 cycle이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 primer의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10(Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열은 carnitine palmitoyltransferase-1a(CPT-1a), 5'-ACC CTG AGG CAT CTA TTG ACA-3'(서열번호 5) 및 5'-TGA CAT ACT CCC ACA GAT GGC-3'(서열번호 6); β-actin, 5'-AGG CTG TGC TGT CCC TGT AT-3'(서열번호 7) 및 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3'(서열번호 8)이다.
< 실험예 2> p -쿠마르산의 대사성 질환 개선 활성 실험
<실험예 2-1> 전구지방세포의 지방세포로의 분화 억제 활성 실험
3T3-L1 전구지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 3T3-L1 전구지방세포는 1% penicillin/streptomysin (PS), 10% bovine calf serum (BCS)이 포함된 Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다.
세포가 가득 찬 상태에서 2일 정도 더 배양 후 세포들은 1% PS, 10% fetal bovine serum (FBS), MDI(0.5mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1M dexamethasone, 1㎍/mL insulin)이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 분화를 유도하였다. 분화 유도 2일 후에는 1% PS, 10% FBS, 1㎍/mL insulin이 포함된 DMEM 배지로 교체해 주었으며, 다시 2일 후에는 1% PS, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교체하였으며, 이 배지를 실험 전까지 2일 마다 교체해주었다.
지방세포 분화 유도 동안 시료(p-쿠마르산)를 100uM의 농도로 각 배지에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다. 구체적으로 3T3-L1 전구지방세포는 분화유도 8일 후, PBS (Phosphate-buffered saline)로 두 번 세척하였고 3.7% formaldehyde 로 1시간 동안 고정하였다. 이후 1차 증류수로 두 번 세척 후 0.6% Oil Red O 시약을 처리하여 1시간 동안 염색을 실시하였다. 염색 후 Oil Red O를 제거하여 1차 증류수로 두 번 세척 후 세포를 건조하였고, 염색된 지방방울을 정량하기 위하여 4% Nonidet P-40을 첨가하였다. 이후 540nm의 흡광도에서 수치를 측정하였고, 결과는 순수 분화유도 시킨 세포의 흡광도와 시료를 처리한 세포의 흡광도를 비교하여 나타내었다.
결과를 도 11에 나타내었다. 도 11을 참조하여 보면, Day4 ~ Day8 동안 p-쿠마르산를 처리한 군에서 TG 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있다. 이러한 효과는 p-쿠마르산가 지방세포 분화 이후 TG의 합성 및 lipolysis와 관련이 있다고 추측할 수 있다.
<실험예 2-2> 분화된 3 T3 - L1 지방세포에서 Western blot 을 통한 p- LKB1 및 p-AMPK의 발현량 측정 실험
분화된 3T3-L1 지방세포에서 p-쿠마르산가 지방 산화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Day 8일째 분화된 지방세포를 0.2% BSA, 1% PS가 포함된 DMEM 배지에서 12시간 동안 starvation 하여, 배지를 제거한 후 10%FBS, 1% PS가 포함된 DMEM 배지와 p-쿠마르산를 농도별로 처리하였다.
배양된 세포들은 차가운 PBS로 세척하였고, lysis buffer [1×RIPA (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, USA), 1mM phenylemthyl-sulfonyl fluoride, 1mM, 1mM NaF, 1㎍/mL aprotinin, 1㎍/mL pepstatin, 1㎍/mL leupeptin]를 사용하여 세포를 수확하였고, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 원심분리를 통하여 세포찌꺼기를 제거하였고, 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 Bio-Rad protein Assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 통해서 정량하였다. 정량한 단백질은 SDS를 함유하고 있는 10% Polyacrylamide gel을 통해서 전기영동 하였고, polyvinylidene difluoride membranes에 transfer 하였다. Membranes은 5% BSA, 0.1% Tween 20을 포함하는 Tris-bufferd saline (TBS)에서 1시간 동안 Blocking 처리하였다. 이후 1차 Anti-body를 4℃ 에서 16 시간 이상 처리하였고, 2차 Anti-body는 상온에서 1 시간 동안 처리하였다. 타겟 단백질은 ECL western blotting detection reagent (Amersham Biosciences)을 통해서 확인되었다.
결과를 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하여 보면, p- 쿠마르산는 분화된 3T3-L1세포에서 AMPK를 활성화시킨다고 알려진 LKB1의 인산화를 증가시켰으며, AMPK와 ACC의 인산화 역시 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 p-쿠마르산가 지방세포에서 지질의 축적을 억제시키며, 성숙한 지방세포에서는 AMPK signal을 통해서 β-oxidation과 같은 지질대사를 활성화 시킴으로써 항비만 효과를 나타낸다는 것을 암시한다.
<실험예 2-3> 분화된 L6 세포에서 Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험
Rat 유래 L6 골격근 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 10% FBS와 1% PS가 포함된 DMEM에서 배양하였고, 37℃의 5% CO2 조건을 유지하였다. 세포 분화를 위하여 실험에 사용하기 전까지 이틀마다 2% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교체하였다. 분화된 L6 세포는 0.5% bovine serum albumin (BSA)이 포함된 serum-free DMEM으로 4시간 동안 절식 배양한 후, p-쿠마르산를 농도별로 48시간 처리하였다.
다음 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 AMPK와 ACC의 인산화 정도를 Western blot을 통해 분석하였다.
결과를 도 13에 나타내었다. 도 13을 참조하여 보면, 대조군에 비하여 p-쿠마르산를 처리한 군의 AMPK와 ACC의 인산화가 농도의존적으로 증가하였음을 알 수 있다. 특히, 최고 농도인 50uM에서 AMPK, ACC 모두 인산화 정도에 있어서 현저한 증가를 보였다. 이는 p-쿠마르산가 분화된 L6 세포에서 AMPK를 활성화시킴으로써 AMPK의 downstream인 ACC가 인산화되었다고 판단된다. 인산화된 ACC는 궁극적으로 미토콘드리아 내의 지방산 산화(fatty acid β-oxidation)에 관여한다고 보고되어 있다(FENS let., 223 (2): 217-222, 2003). 따라서 p-쿠마르산는 AMPK를 활성화시킴으로써 세포 내 β-oxidation에 관여할 것이라고 사료된다.
<실험예 2-4> 분화된 L6 세포에서 Western blot 을 통한 PPAR α 발현량 측정 실험
상기 <실험예 2-3>과 동일한 방법으로 p-쿠마르산를 농도별로 48시간 처리하고, 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 PPARα의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.
결과를 도 14에 나타내었다. 도 14을 참조하여 보면, 대조군의 PPARα 발현과 비교하여 p-쿠마르산를 처리한 군의 PPARα 발현이 증가하였음을 알 수 있다. Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)는 지질 대사와 에너지 항상성에 관련된 유전자 발현을 조절한다고 알려져 있다(Diabetes, 52: 2249-2259, 2003). 특히, PPAR는 지방산을 이용하여 에너지를 만들어내는 과정인 β-oxidation과 관련된 유전자의 전사 조절에 중요한 역할을 한다(Molecular and cellular biology, 20 (5): 1868-1876, 2000). 이처럼 β-oxidation과 관련된 유전자 발현을 조절하는 PPARα 발현 증가는 p-쿠마르산가 분화된 L6 세포에서 β-oxidation에 관여한다는 것을 시사하고 있다.
<실험예 2-5> HepG2 세포에서 Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험
HepG2 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 세포배양은 10% FBS에 1% PS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하의 환경에서 배양하였다. 세포는 T-75 cell culture flask 바닥에 세포가 80% 정도 찼을 때 계대 배양하여 유지하였다. HepG2 세포의 지방 축적 유도는 Gomez-Lechon 등의 방법(Chem Biol Interact., 165 (2): 106-116, 2007)을 변형하여 수행하였다. HepG2 세포를 10% FBS와 1% PS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate에 접종(1 × 106 cells/well)하고 6 well cell culture plate 바닥에 80% 정도 찬 상태가 될 때까지 배양하였다. 세포가 80% 정도 찬 상태에서 0.5% BSA가 함유된 DMEM 배지에서 Starvation overnight을 하였다. 자유유리지방산인 oleic acid를 600uM 와 p-쿠마르산가 첨가한 배지로 교환한 뒤 24시간 동안 배양하여 HepG2 세포에 지방 축적을 유도하였다. 세포에 oleic acid 600M과 p-쿠마르산를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 p-AMPK 및 p-ACC의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.
결과를 도 15에 나타내었다. 도 15를 참조하여 보면 지방산 산화에 관여하는 AMPK, ACC 인산화가 농도의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
<실험예 2-5> HepG2 세포에서 Western blot 을 통한 SREBP -1c의 발현량 측정 실험
상기 <실험예 2-4>와 동일한 방법으로 지방축적을 유도한 세포에 oleic acid 600M과 p-쿠마르산를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 SREBP-1c의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.
결과를 도 16에 나타내었다. 도 16을 참조하여 보면 지방산과 중성지방의 합성에 관여하는 SREBP-1c가 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있다.

Claims (20)

  1. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 비만 개선제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 비만 개선제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 비만 개선제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 비만 개선제 조성물.
  5. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선제 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선제 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선제 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선제 조성물.
  9. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선제 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 지방간 개선제 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 지방간 개선제 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 지방간 개선제 조성물.
  13. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선제 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선제 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선제 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선제 조성물.
  17. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 식품 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 것을 특징으로 하는 다이어트용 식품 조성물.
  19. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 비만이 원인이 되어 발생하는 질환의 예방용 식품 조성물로서,
    상기 비만 합병증은 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면무호흡증 및 당뇨병 중 하나인 것을 특징으로 하는 비만이 원인이 되어 발생하는 질환의 예방용 식품 조성물.
  20. 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 지방간이 원인이 되어 발병하는 질환인 간염, 간경변증 또는 간암의 예방용 식품 조성물.
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