KR20180066938A

KR20180066938A - 제주조릿대 잎 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20180066938A
Application number: KR1020160167821A
Authority: KR
Inventors: 지영흔; 김주성; 헤와게 이레샤 나디카 마두샤니 헤랏 카라헤; 조진희; 김아름; 도양회; 고광석; 박용립; 홍정수
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 주식회사 한라산
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2018-06-20
Also published as: KR102018233B1

Abstract

본 발명은 알코올 처리에 의한 간세포의 세포독성, 산화적 손상, 세포자멸을 억제하는 활성을 가진 제주조릿대 잎 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물을 개시한다.

Description

제주조릿대 잎 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물{Composition for Improving Liver Injury Using an Extract of Leaves of Sasa quelpaertenisis Nakai}

본 발명은 제주조릿대(Sasa quelpaertenisis Nakai) 잎 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물에 관한 것이다.

간은 인체에서 주요한 장기 중 하나로 단백질 합성, 호르몬 생산, 해독 작용 등 체내의 여러 물질 대사에 주요한 역할을 담당한다. 또 간은 알코올 대사를 담당하는 주요한 장기로, 여러 알코올 분해 효소들에 의해 알코올을 아세트알데하이드(acetaldehyde)를 거쳐 아세테이트(acetate)와 활성산소(reactive oxygen species, ROS)로 분해한다[1]. 적절한 알코올의 섭취는 허혈성 뇌졸중, 당뇨, 고혈압을 예방할 수 있으나[2, 3], 과하거나 지속적인 알코올의 섭취는 만성 간 질환, 간 섬유증 및 경화증, 간암 등의 질환을 야기한다고 보고되었다[4, 5]. 만성적인 알코올 노출 및 대사에 의해 활성산소가 지속적으로 발생할 경우 지질과산화, 산화방지제 감소, DNA 손상 등이 발생해 간세포의 손상이 알코올성 간 질환의 원인이라고 알려져 있다[6, 7].

사람과 동물의 알코올 대사 과정이 완전히 동일하지 않기 때문에, 알코올성 간 손상 질환을 연구할 때는 사람의 샘플을 사용하는 것이 좀 더 효과적이다[8]. 따라서 사람의 간세포의 기능적 특징을 많이 가지고 있는 HepG2 세포주가 알코올성 간 질환 연구에 주로 사용된다[9, 10].

제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakia)는 벼과(Gramineae)의 식물로 한라산 일대에 군락을 형성하여 폭넓게 분포하는 높이 10~80cm, 지름 3~4mm의 상록관엽식물이다. 최근 제주조릿대의 왕성한 번식으로 개체수가 급격히 증가함에 따라 다른 식물의 자생을 억제하고 한라산 생태의 종 다양성을 저해시키고 있어 문제가 되고 있다. 이 때문에 제주조릿대를 이용한 음료수, 화장품 등 제주조릿대를 이용하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 제주조릿대 잎에는 당류, 비타민류가 포함되어 있고 생리활성을 나타내는 물질로는 arumdoin, cylindrin, taraxerol, freiendelin 등이 알려져 있다[11]. 동의보감에 따르면 예로부터 조릿대 잎, 줄기, 뿌리 모두 약용으로 사용되어 왔고 또한 고혈압, 위염, 당뇨병, 해열 등에 효과가 있다고 보고하였다. 최근 보고에 의하면 제주조릿대는 항암[12], 항염[13], 항산화[14], 지질대사[15], 항바이러스[16] 효능 등을 가진다고 보고되었다.

본 발명은 제주조릿대 잎 추출물의 알코올성 간 손상 보호, 개선 효과 등을 개시한다.

참조문헌

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[3] Sacco RL, Elkind M, Boden-Albala B, et al. The protective effect of moderate alcohol consumption on ischemic stroke. JAMA 1999;281:53-60.

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[11] Kim NJ, Lee SJ, Kwon CH, et al. Antilipoperoxidatant effects of leaves of phyllostachys bamausoides S et Z, Korean Journal of Phamacognosy 1995;26:368-76.

[12] Kim M, Kim YS, Kim KM, et al. Combination of Sasa quelpaertensis Nakai leaf extract and cisplatin suppresses the cancer stemness and invasion of human lung cancer cells. Integrative cancer therapies 2014;13:529-40.

[13] Kim KM, Kim YS, Lim JY, et al. Sasa quelpaertensis leaf extract suppresses dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by inhibiting the proinflammatory mediators and mitogen-activated protein kinase phosphorylation. Nutrition Research 2014;34:894-905.

[14] Kim JY, Kim JH, Byun JH, et al. Antioxidant and anticancer activities of water and ethanol extracts obtained from Sasa quelpaertensis Nakai. Life Science Journal 2013;10:1250-4.

[15] Kim JH, Kang SI, Shin HS, et al. Sasa quelpaertensis and p-coumaric acid attenuate oleic acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2013;77:1595-8.

[16] Kang MC, Ahn G, Yang X, et al. Hepatoprotective effects of dieckol-rich phlorotannins from Ecklonia cava, a brown seaweed, against ethanol induced liver damage in BALB/c mice. Food and Chemical Toxicology 2012;50:1986-91.

본 발명의 목적은 제주조릿대 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 제주조릿대 잎을 추출 대상으로 하여, 물 추출물, 20%, 40%, 60% 및 80% (v/v) 에탄올 추출물을 제조하고, 그 추출물이 알코올 처리에 의하여 손상된 HepG2 세포주에 처리할 경우, 물 추출물과 20%, 40% 및 60% 에탄올 추출물은 그 생존율 향상에 특별한 효과를 보이지 않았으나, 80% 에탄올 추출물이 뚜렷한 효과를 보임을 확인하고, 나아가 그 80% 에탄올 추출물이 알코올 처리에 의한 간세포의 산화적 손상을 회복시키고 간세포의 세포자멸을 뚜렷하게 억제함을 확인함과 함께, 알코올 투여 실험동물 간 조직의 지방 변성을 억제하며, 혈중 알콜 농도를 현저히 감소시킴을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서 제주조릿대 잎의 80%(v/v) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간 손상 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 제주조릿대 잎의 80%(v/v) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 숙취 해소용 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 "알코올성 간 손상"은 알코올에 의한 간세포 손상·자멸 및 그 간세포의 손상·자멸에 따른 간 질환을 포함하는 의미로서, 그러한 간 질환에는 지방간, 간섬유증 및 간경화를 포함한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "개선"은 증상의 예방, 치료 및 경감을 포함하는 의미이다.

본 발명의 알코올성 간 손상 개선용 조성물 및 숙취 해소용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")에서 그 유효성분은 알코올성 간 손상 개선 효과, 숙쉬 해소 효과 또는 주름 개선 효과 등 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 간 손상 개선 효과, 숙쉬 해소 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 간 손상 개선 효과, 숙쉬 해소 효과 등의 상승·보강을 위하여 또는 체지방 감소, 혈중 콜레스테롤 개선 활성, 혈중 중성지방 개선 활성 등 유사 활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성이 확인된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임), 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 "건강기능식품에관한법률"임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물 등이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전 또는 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 개별 인정 원료로서, 알코올성 간 손상 보호 활성을 가진 유산균 발효 다시마 추출물, 헛개나무 과병 추출물 등이나, 간 건강 기능성을 가진 도라지 추출물, 밀크씨슬 추출물, 발효 울금, 복분자 추출물 등이나, 체지방 감소 기능성을 가진 가르시니아 캄보지아 껍질 추출물, 공액 리놀렌산(유리지방산), 공액리놀렌산(트리글리세라이드), 녹차 추출물, 키토산, 그린마떼 추출물, 그린커피빈 추출물, 깻잎 추출물, 대두 배아 추출물 등의 복합물, 돌외잎 주정 추출 분말, 락토페린(우유 정제 단백질), 레몬 밤 추출물 혼합 분말, 마테 열수 추출물 또는 미역 등의 복합 추출물(잔티젠) 등이나, 혈중 콜레스테롤 개선 기능성을 가진 녹차 추출물 또는 스피루리나, 대나무 잎 추출물, 보리 베타글루칸 추출물, 보이차 추출물, 식물 스타놀에스테르, 감태주정추출물, 아마인, 알로에 복합 추출물 또는 알로에 추출물 등이나, 혈중 중성지방 개선 기능성을 가진 DHA 농축 유지, 난소화성 말토덱스트린, 대나무 잎 추출물, 식물성 유지 디글리세라이드, 정제 오징어유, 글로빈 가수분해물 또는 정어리 정제어유, 혈행 개선 기능성을 가진 은행잎 추출물, 나토균 배양 분말, 나토 배양물, 메론 추출물 또는 카카오 분말 또는 홍삼 추출물 등이 그러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격")에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 제주조릿대 추출물을 이용한 알코올성 간 손상 개선용 조성물을 제공할 수 있으며, 더불어 제주조릿대 추출물을 이용한 숙취 해소용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 또는 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 제주조릿대 잎 물 추출물, 20%, 40%, 60% 및 80% (v/v) 에탄올 추출물이 알코올 처리에 의한 간세포(HepG2) 독성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 2 및 도 3은 제주조릿대 잎 80% 에탄올 추출물이 알코올 처리에 의한 간세포의 산화적 손상 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 제주조릿대 잎 80% 에탄올 추출물이 알코올 처리에 의한 간세포의 세포자멸 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 제주조릿대 잎 40%, 80% 에탄올 추출물이 알코올 투여 실험동물의 간 조직에서 지방 변성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 6은 제주조릿대 잎 40%, 80% 에탄올 추출물이 알코올 투여 실험동물의 간 조직에서 알코올 분해 효소(CYP2E1) 발현 양상에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 7은 제주조릿대 잎 80% 에탄올 추출물이 알코올 투여 실험동물의 혈중 알코올 농도에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 제주조릿대 잎 추출물의 제조

제주 조릿대 잎 세절물에 20배 중량의, 물, 20%, 40%, 60% 및 80%(v/v) 에탄올을 가하고, 이후 ultrasonic bath(Power sonic 520, Hwashin Co., Korea)에서 초음파를 방사하여 25℃ 미만의 온도에서 90분간 3회 반복 추출하여 Whatman No. 2 여과지(Whatman International Limited, Kent, England)를 이용하여 여과하였다. 여과 후 여과박(filter cake)을 회수하여 동일 농도의 에탄올 동량을 이용하여 반복 추출하였고, 여과된 추출물은 감압회전농축기 (Hei-VAP Precision 280rpm, Heldolph, Germany)를 이용하여 감압농축 하였다.

< 실험예 > 알코올성 간 손상 개선 효과 및 숙취 해소 효과 평가

< 실험예 1> 알코올 처리 간세포를 이용한 실험

<1> 간세포( HepG2 cell) 준비

HepG2 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea)에서 분양받아 CO₂가 5%로 공급되는 세포 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 세포 배양액은 10% 소태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Gibco BRL)과 1% 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin, Gibco BRL)가 포함된 DMEM 배지(DulbeccoModified Eagle Medium, Gibco BRL)를 사용하였으며, 3~4일 간격으로 세포를 계대 배양하였다.

<2> 알코올 처리 간세포 생존율에 미치는 효과 평가

알코올 처리 HepG2 간세포에서 실시예 시료의 세포 독성 억제 효과를 평가하기 위하여, 400mM 에탄올을 HepG2 세포에 처리하고 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide(MTT) 분석법을 이용하여 실시예의 시료가 간세포의 생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 96-well plate에 400mM 에탄올을 처리한 HepG2 세포를 1×10⁵cells/well로 넣은 후, 실시예 시료를 예비실험을 통하여 결정한 1,600㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양 후, MTT 용액(5mg/ml)을 각각의 well에 15㎕씩 넣고 4시간 배양하여 버퍼(solubilzation buffer, pH 4.7) 100㎕를 넣어 formazan 결정을 녹여 570mm, 630mm에서 흡광도를 측정하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하여 보면, 400mM 에탄올 처리가 모든 실험군에서 유의적으로 세포독성을 유발하였음을 알 수 있으며, 실시예의 시료를 처리한 경우 물 추출물, 20% 에탄올 추출물, 40% 에탄올 추출물 및 60% 에탄올 추출물은 에탄올 처리군에 비해 유의성 있게 세포 생존율을 높이지 못하였으나, 80% 에탄올 처리군에 비해 뚜렷하게 유의적으로 세포 생존율을 높임과 함께, 에탄올을 처리하지 아니한 경우에 비해서도 높은 세포생존율을 보임을 알 수 있다.

<3> 알코올 처리 간세포에서 활성 산소 생성에 미치는 영향 평가

알코올 처리 HepG2 세포에서 실시예 시료의 산화적 손상 억제 효과를 DCF-DA(dichlorofluorescein diacetate) assay으로 평가하였다.

96-well plate에 HepG2 세포를 1×10⁵cells/well로 넣은 후 250㎍/ml 또는 500㎍/ml의 실시예의 시료를 400mM 에탄올과 함께 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 25μM의 DCF-DA를 처리한 후 30분간 배양하여 DPBS로 세척한 후 485nm, 520nm에서 형광강도를 측정하였다. 여기서 실시예 시료는 상기 간세포 생존율 활성 평가에서 가장 효과가 우수한 것으로 나타난 80% 에탄올 추출물을 사용하였다.

결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하여 보면 알코올 처리에 의하여 산화적 손상이 유발되었음을 알 수 있으며 실시예 시료인 80% 에탄올 추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 그 산화적 손상을 억제함을 알 수 있다.

<4> 알코올 처리 간세포에서 항산화 효소 발현에 미치는 영향 평가

실시예의 시료가 알코올 처리 간세포에서 항산화 효소의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해서 western blotting을 수행하였다. 상기 <3>에서와 동일하게 알코올(800mM 에탄올)과 실시예의 시료를 처리하고 각 실험군 별로 세포를 수확한 후 용해액(lysis buffer, 40mM tris, 120nM NaCl, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10mg/㎕ leupeptin, 2mM sodium orthovanadate, 10㎍/ml aprotinin; Sigma-Aldrich, MO, USA)에 넣어 균질화한 후 12,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심 분리하여 단백질을 추출하였고, 추출한 단백질을 정량하여 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electophoresis(10% SDS PAGE)를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 100V에서 120분간 전이시킨 후 비특이적 반응을 막기 위하여 2% 탈지우유(skim milk)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 항산화 효소인 Catalase, GPX-1 등을 탐색할 수 있는 1차 항체를 4℃에서 18시간 반응시키고, 2차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse 또는 rabbit IgG(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 사용하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 각 반응 단계 사이에는 0.2% Tween-20이 포함된 phosphate buffered saline (PBS)을 이용해 니트로셀룰로오스막을 충분히 세척하였다. 단백질 밴드는 ECL detection kit(Amersham, UK)로 발현시켜 Fusion Solo(Vilver Lourmat, France)를 이용하여 이미지를 얻어, Bio-1D program(Vilber Loumat)을 이용하여 분석하였다. 여기서도 실시예 시료는 상기 간세포 생존율 활성 평가에서 가장 효과가 우수한 것으로 나타난 80% 에탄올 추출물을 사용하였다.

결과를 도 3에 나타내었다. 에탄올을 아세트알데하이드로 분해하는 과정에 관여하는 항산화 효소인 catalase의 경우 에탄올 처리 없이 실시예의 시료를 처리한 경우 처리 농도에 비례하여 그 발현이 증가하였고, 또 에탄올을 처리하였을 경우에도 그 에탄올 처리에 의하여 감소된 catalase의 발현 양을 유의적으로 증가시켰음을 알 수 있다.

또 활성 산소를 물로 환원하여 활성산소를 소거하는 과정에 관여하는 항산화 효소 중 하나인 GPX-1의 경우, 실시예의 시료 처리가 에탄올을 처리하거나 처리하지 않은 경우 모두에 있어 농도 의존적으로 그 발현을 증가시켰음을 알 수 있다.

<5> 알코올 처리 간세포에서 세포자멸사에 미치는 영향 평가

실시예의 시료가 알코올 처리 간세포에서 발생하는 세포자멸사에 미치는 영향을 평가하기 위해서 PI staining을 수행하였다. 핵을 염색시키는 PI는 정상세포의 경우 세포막에 가로막혀 염색되지 않지만, 세포자멸사가 일어나 세포막에 손상이 발생하면 세포 내로 침투해 핵을 염색할 수 있다. 이때, 세포자멸사에 의한 세포 손상이 일어나면 DNA의 손상이 나타나게 되는데, 이는 Sub-G1기의 비율을 통해 측정할 수 있다.

24-well plate에 HepG2 세포를 1×10⁶cells/well로 넣은 후 실시예의 시료를, 단독으로 또는 800mM 에탄올과 함께 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 세포를 수확하여 DPBS로 세척한 뒤 차가운 70% 알코올로 세포를 고정하여 PI reagent (20㎍/mL propidium idoine, 200㎍/mL RNase)를 첨가하여 30분간 배양한 후 flow cytometry(CytoFLEX flow cytometers, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용해 분석하였다. 여기서도 실시예 시료는 상기 간세포 생존율 활성 평가에서 가장 효과가 우수한 것으로 나타난 80% 에탄올 추출물을 사용하였다.

결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하여 보면 에탄올을 처리하지 않은 HepG2 세포의 경우 실시예의 시료를 250㎍/ml 또는 500㎍/ml 처리하였을 경우 대조군과 대비하였을 때 크게 영향을 받지 않음을 알 수 있다. 그러나 에탄올을 처리할 경우 비처리군에 비해 세포자멸사 비율이 유의적으로 증가하였으며, 실시예의 시료를 처리할 경우 뚜렷하게 세포자멸사 비율이 감소함을 알 수 있다.

< 실험예 2> 알코올 투여 실험동물을 이용한 실험

<1> 실험용 마우스의 준비

7~10주령 C57BL/6 마우스를 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 표준적인 사육조건으로서 온도는 23±1℃, 습도를 50±5%로 유지시키고 사료는 NIH-07 식이를 급여하였고, 음수는 자유급여 하였다. 본 실험을 위한 동물실험 계획서는 제주대학교 동물관리 및 사용위원회 승인을 받았으며, 모든 실험은 제주대학교의 동물실험 규정에 따라 수행되었다.

<2> 알코올 투여 동물 모델 구축

30%의 에탄올(EtOH)을 C57BL/6 마우스에 체중 당 5g씩 12시간 간격으로 3번 투여하였고, 마지막 투여 후 4시간 뒤에 마우스를 부검하여 간 조직을 채취하였다.

실험군은 정상군(Control), 30% 에탄올만 단독으로 투여한 대조군(EtOH), 30% 에탄올과 제주조릿대잎 40% 에탄올 추출물(EtOH+SQE 40%)을 투여한 실험군, 그리고 30% 에탄올과 제주조릿대잎 80% 에탄올 추출물(EtOH+SQE 80%)을 투여한 실험군으로 총 4개의 군으로 나누었다. 제주조릿대잎 추출물은 마우스 체중 당 100mg의 농도로 에탄올과 동시에 경구 투여 하였다.

<3> 제주조릿대잎 추출물이 알코올 투여 동물 모델에서 병리조직상 간지질 함량 변화에 미치는 영향 평가

<3-1> 실험 방법

부검하여 얻은 간 조직을 파라핀에 포매한 후, 3㎛의 두께로 박절하여 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 탈파라핀 과정(xylene 3분씩 3번) 및 함수(100% 에탄올에 5분간 2번, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올에 3분) 과정을 수행한 후, hematoxylin, eosin 순으로 조직 절편을 염색하고 흐르는 물에 세척하였다. 탈수(70%, 80%, 90%, 95% 에탄올에 3분, 100% 에탄올에 5분간 2번) 및 투명화(xylene 3분씩 3번) 과정을 거쳐 캐나다 발삼(canada balsam)으로 봉입하여 광학현미경 하에서 병리조직상의 변화를 평가하였다.

<3-2> 실험 결과

결과를 도 5에 나타내었다. 도 5를 참조하여 보면, 정상 간은 신장과 비슷한 적갈색을 띄지만, 지방간이 진행될수록 간의 색이 밝게 빛나면서 신장보다 하얗게 변한다. 에탄올의 투여 후 간 조직을 부검해 육안 소견을 평가한 결과, 에탄올 단독 투여군(EtOH)의 경우 간 조직의 색상이 정상군(Control)에 비해 밝고 창백하게 변하는 것을 확인할 수 있었다(그림 5의 A 및 D). 제주조릿대잎 40% 에탄올 추출물을 병행 투여한 경우(EtOH+SQE 40%) 간 조직의 색상이 에탄올 단독 투여군에 비해 미약한 변화를 보였으나 여전히 밝고 창백하였다(도 5의 G). 그러나, 제주조릿대잎 80% 에탄올 추출물을 병행 투여할 경우(EtOH+SQE 80%) 간 조직의 색상이 정상군과 거의 유사한 적갈색을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5의 J).

각 그룹간 간 조직 변성 변화를 H&E 염색법을 수행한 결과, 에탄올 단독 투여군(EtOH)에서는 간 조직의 지방 변성이 정상군(Control)에 비해 심하게 관찰되었고(도 5의 B와 C 및 도 5의 E와 F 비교 참조), 제주조릿대잎 40% 에탄올 추출물을 병행 투여할 경우 지방 변성이 거의 완화되지 않았으나(도 5의 H-J), 제주조릿대잎 80% 에탄올 추출물을 병행 투여할 경우 40% 에탄올 추출물을 투여하였을 경우 보다 현저하게 지방 변성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5의 K와 L).

<4> 제주조릿대잎 추출물이 알코올 투여 동물 모델에서 알코올 분해 효소( CYP2E1 )의 발현 양상 변화에 미치는 영향 평가

<4-1> 실험 방법

부검하여 얻은 간 조직을 파라핀에 포매한 후, 3㎛의 두께로 박절하여 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 탈파라핀 과정(xylene 3분씩 3번) 및 함수(100% 에탄올에 5분간 2번, 95%, 90%, 80%, 70% 에탄올에 3분) 과정을 수행한 후, 항원성 부활을 위해 10mM Sodium Citrate 용액(pH 6.0)에 슬라이드를 담가 전자레인지에서 20분간 가열한 후 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 조직 내 내인성 과산화효소의 작용을 억제하기 위해서 0.3% 과산화수소 용액에 처리한 후, Cytochrome P450 2E1(CYP2E1) 등을 탐색할 수 있는 항체를 4℃에서 18시간 반응시켰다. 이후 biotinylated anti-rabbit 또는 mouse IgG(Vectastain Elite ABC kit, Vector, Birlingham, CA)를 실온에서 45분, avidin-biotin horseradish peroxidase (Vectastain Elite ABC kit, Vector)로 45분간 실온에서 반응시켰다. 3,3'-diaminobenzidine(DAB; Vector)을 이용하여 목표 분자의 발현 양상을 확인하였다. 발색 반응이 끝난 후 hematoxylin으로 대조 염색하고, 탈수(70%, 80%, 90%, 95% 에탄올에 3분, 100% 에탄올에 5분간 2번) 및 투명화(xylene 3분씩 3번) 과정을 거쳐 캐나다 발삼(canada balsam)으로 봉입하여 광학현미경하에서 목표 분자의 발현 양상 변화를 평가하였다.

<4-2> 실험 결과

결과를 도 6에 나타내었다. Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)은 간의 대표적인 알코올 분해 효소라고 알려져있다. 에탄올 단독 투여군(EtOH)에서는 CYP2E1의 양성 반응이 정상군(Control)에 비해 강하게 관찰되었고(도 6의 A, B와 C, D 비교 참조), 제주조릿대잎 40% 에탄올 추출물 병행 투여군(EtOH+SQE 40%)에서도 알코올 단독 투여군(EtOH)과 유사한 양성 반응이 나타났다(도 6의 E, F). 반면, 제주조릿대잎 80% 추출물 병행 투여군(EtOH+SQE 80%)의 경우 CYP2E1의 양성 반응이 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 6의 G,H).

<5> 제주조릿대잎 추출물이 알코올 투여 동물 모델에서 혈중 에탄올 농도 변화에 미치는 영향 평가

<5-1> 실험 방법

알코올 투여 모델에서 제주조릿대잎 80% 에탄올 추출물이 혈중 에탄올 농도 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각 실험군별 마우스의 전혈을 채취하였다. 초고속원심분리기를 이용해 4℃, 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 뒤 ethanol assay kit(K-ETOH, Megazyme, Ireland), acetaldehyde assay kit(K-ACHYD, Megazyme)를 이용하여 지시된 실험법에 따라 실험을 수행하여 혈중 에탄올 농도 변화를 측정하였다.

<5-2> 실험 결과

혈중 에탄올 농도의 경우, 대조군에 비해 알코올 단독 투여군에서 유의성 있게 증가하였으며, 제주조릿대잎 80% 에탄올 추출물을 마우스 체중 당 100 mg/kg 투여하였을 경우 알코올 단독 투여군 대비 유의성 있게 감소하였다(도 7).

Claims

제주조릿대 잎의 80%(v/v) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간 손상 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제주조릿대 잎의 80%(v/v) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 조성물
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.