KR20120123579A - 시클릭 뎁시펩티드 - Google Patents

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KR20120123579A
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에스테르 슈미트
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Abstract

본 출원은 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체, 및 그의 용도, 예를 들어 칼리크레인 7 및 인간 호중구 엘라스타제의 억제제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

시클릭 뎁시펩티드 {CYCLIC DEPSIPEPTIDES}
본 발명은 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다.
칼리크레인 7은 카이모트립신-유사 활성을 나타내는 칼리크레인 유전자 과의 S1 세린 프로테아제이다. 인간 칼리크레인 7 (hK7, KLK7 또는 각질층 카이모트립신분해 효소 (SCCE), 스위스프로트(Swissprot) P49862)은 피부 생리에서 중요한 역할을 한다 (1, 2, 3). 이것은 주로 피부에서 발현되며, 피부 생리에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. hK7은 박리 과정에서 각질화된 편평 상피의 세포간 점착성 구조를 분해하는데 관여한다. 박리 과정은 철저하게 조절되며, 각화세포(corneocyte)의 드 노보(de novo) 생성과 정교하게 균형을 이뤄서 피부 장벽 기능에 중대하게 관여하는 피부 최외층인 각질층을 일정 두께로 유지한다. 이와 관련하여, hK7은 각질결합 단백질인 코르네오데스모신 및 데스모콜린 1을 절단할 수 있는 것으로 보고되었다 (4, 5, 6). 박리에는 상기 2종의 각질결합체(corneodesmosome) 둘다의 분해가 필요하다. 또한, 아주 최근에는, 2종의 지질 프로세싱 효소인 β-글루코세레브로시다제 및 산성 스핑고마이엘리나제가 hK7에 의해 분해될 수 있는 것으로 나타났다 (7). 상기 2종의 지질 프로세싱 효소 모두가 이것들의 기질인 글루코실세라미드 및 스핑고마이엘린과 동시 분비되며, 이들 극성 지질 전구체를 그의 보다 비-극성의 생성물, 예를 들어 세라미드로 프로세싱하고, 이것은 이후에 세포외 층판상 막으로 혼입된다. 상기 층판상 막 구조물은 기능적 피부 장벽에 중대하다. 마지막으로, hK7은 인터류킨-1β (IL-1β) 전구체를 그의 활성 형태로 시험관내 활성화시키는 것으로 나타난 바 있다 (8). 각질세포(keratinocyte)는 IL-1β를 발현하긴 하지만 이것이 특이적 IL-1β 전환 효소 (ICE 또는 카스파제 1)의 활성 형태가 아니기 때문에, 인간 표피에서의 IL-1β 활성화는 또다른 프로테아제, 잠재적인 후보로는 hK7을 통해 일어난다고 제안되었다.
최근의 연구는 hK7의 활성 증가가 아토피성 피부염, 건선 또는 네테르톤 증후군과 같은 염증성 피부 질환과 관련이 있음을 알아냈다. 이것은 각질결합체의 분해가 제어되지 않게 하여 박리의 조절이상을 야기하거나, 지질 프로세싱 효소의 분해를 증진시켜 층판상 막 구조물을 불안정하게 하거나, 염증전(proinflammatory) 사이토킨 IL-1β의 활성화를 제어되지 않게 할 수 있다. 이로 인한 순(net) 결과는 피부 장벽 기능의 손상 및 염증이다 (또한, WO-A-2004/108139 참조).
hK7 활성이 여러 수준에서 제어된다는 사실 때문에, 다양한 인자가 염증성 피부 질환에서의 증가된 hK7 활성에 원인이 될 수 있다. 첫째, 상기 프로테아제의 발현량이 유전적 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 유전적 관련성으로서 hK7 유전자 3'-UTR에서의 다형성이 최근 기재되었다 (9). 상기 문헌의 저자들은 칼리크레인 7 유전자의 3'-UTR에서 상기 문헌에 기재된 4개의 염기 쌍 삽입이 hK7 mRNA를 안정화시켜서 hK7의 과발현을 야기한다는 가설을 세웠다. 둘째, hK7은 층판 소체(lamellar body)를 통해 각질층 세포외 공간에 효소원으로 분비되는데, 이것이 자가활성화될 수 없기 때문에 또다른 프로테아제, 예를 들어 hK5에 의한 활성화가 필요하다 (5). 이러한 활성화 효소의 활성이 제어되지 않아서 hK7의 과다활성화가 야기될 수 있다. 셋째, 활성화된 hK7은 LEKTI, ALP 또는 엘라핀과 같은 천연 억제제에 의해 억제될 수 있다 (10, 11). 이러한 억제제의 발현 감소 또는 결핍이 hK7의 활성 증진을 야기할 수 있다. 최근, LEKTI를 코딩하는 spink5 유전자에서의 돌연변이가 네테르톤 증후군의 원인이고 (12), 상기 유전자에서의 단일 점 돌연변이가 아토피성 피부염과 관련이 있다는 것이 밝혀졌다 (13, 14). 마지막으로, hK7의 활성을 제어하는 또다른 수준은 pH이다. hK7은 중성 내지 약간의 알칼리성 pH에서 최적의 활성을 가지며 (2), 피부의 최내층에서 최외층으로 중성에서 산성의 pH 구배를 갖는다. 비누와 같은 환경적 인자는 각질층의 최외층에서 hK7에 최적인 pH로의 pH 증가를 야기하여 hK7 활성을 증가시킬 수 있다.
hK7의 활성 증가가 염증성 및 과증식성 피부 질환을 비롯하여 피부 장벽 손상을 갖는 피부 질환과 관련이 있다는 가설은 하기하는 연구에 의해 뒷받침된다: 첫째, 네테르톤 증후군 환자는 세린 프로테아제 활성에서의 표현형-의존적 증가, 각질결합체의 감소, 지질 프로세싱 효소인 β-글루코세레브로시다제 및 산성 스핑고마이엘리나제의 감소, 및 장벽 기능의 손상을 나타낸다 (15, 16). 둘째, 인간 칼리크레인 7을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 아토피성 피부염 환자에서 발견되는 것과 유사한 피부 표현형을 나타낸다 (17, 18, 19). 셋째, 아토피성 피부염 및 건선 환자의 피부에서 hK7의 수준이 증가된 것으로 기재되었다 (17, 20). 추가로, K7의 활성 증가 및 그로 인한 상피 장벽 기능이상은 또한 다른 상피 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 크론병의 병리에 중요한 역할을 할 수 있다.
따라서, hK7은 상피 기능이상과 관련이 있는 질환, 예를 들어 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 건선, 네테르톤 증후군, 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형(unspecified) 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 크론병의 치료를 위한 잠재적인 표적으로 간주되며, 그에 대한 특이적 조절제 (효능제 또는 억제제)가 요구된다.
인간 호중구 엘라스타제 (HNE, 또한, 인간 백혈구 엘라스타제, HLE라고도 공지되어 있음)는 세린 프로테이나제의 카이모트립신 과에 속한다. 이것의 촉매 활성은 대략 pH 7에서 최적이고, 촉매 부위는 3개의 수소 결합된 아미노산 잔기 His57, Asp102 및 Ser195 (카이모트립신 번호매김에 따름)로 구성되며, 이것들이 소위 촉매 삼련구조를 형성한다. 상기 효소는 218개의 아미노산 잔기 및 4개의 디술피드 브릿지의 단일 펩티드 쇄로 구성된다. 이것은 다른 엘라스틴분해성(elastinolytic) 또는 비-엘라스틴분해성 세린 프로테이나제와 30％ 내지 40％의 서열 동일성을 나타낸다. HNE는 P1 위치에서 Val을 갖는 산화된 인슐린 B 쇄를 우선적으로 절단하지만, P1 위치에서 Ala, Ser 또는 Cys를 갖는 결합을 가수분해하기도 한다.
HNE는 다형핵 백혈구 (PMNL)의 아주르친화성 과립에 위치하며, 여기서의 HNE 농도는 상당히 높다 (세포 106개 당 효소 3 ㎍). 주요 생리 기능은 박테리아 및 면역 복합체를 소화하고, 숙주 방어 과정에 참여하는 것이다. HNE는 주화성 인자에 대한 반응에서 호중구가 혈액으로부터 다양한 조직, 예컨대 기도로 이동하는 것을 돕는다. HNE는 또한 창상 치유, 조직 복구, 및 PMNL의 세포자멸에도 참여한다.
HNE는 엘라스틴 (폐 결합 조직, 동맥, 피부 및 인대의 고도로 유연하고 고도로 소수성인 성분)에 추가하여 여러가지 유형의 콜라겐, 막 단백질 및 연골 프로테오글리칸을 비롯하여 중요한 생물학적 기능을 갖는 수많은 단백질을 절단한다. HNE는 또한 프로콜라게나제, 프로스트로멜리신 및 프로젤라티나제를 활성화시켜서 세포외 매트릭스 단백질의 파괴를 간접적으로 보조한다. HNE는 수많은 내인성 프로테이나제 억제제, 예컨대 α2-안티플라스민, α1-안티카이모트립신, 항-트롬빈, 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제를 불활성화시킨다.
세포외 엘라스타제 활성은 폐 시스템에서 하부 기도를 엘라스틴용해(elastolytic) 손상으로부터 보호하는 것을 담당하는 α1-프로테아제 억제제 (α1PI)에 의해 치밀하게 제어되지만, 분비형 백혈구 프로테이나제 억제제는 주로 상부 기도를 보호한다. 수많은 폐 병태생리 상태, 예를 들어 폐 기종, 만성 기관지염 및 낭성 섬유증에서는 내인성 엘라스타제 억제제가 HNE 활성을 조절하는데 비효율적이다.
HNE는 염증 질환, 예컨대 폐 기종, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 고혈압, 및 다른 염증 질환 및 또한 조산아에서의 기관지폐 형성장애와 관련이 있는 조직 손상의 1차적인 근원이라고 여겨진다. HNE는, 기도 염증 질환과 일반적으로 관련이 있는 증가되고 비정상적인 기도 분비의 발병기전에 관여한다. 따라서, 만성 기관지염 및 낭성 섬유증 환자로부터의 기관지폐포 세척 (BAL)액에서는 HNE 활성이 증가되어 있다. 추가로, 과도한 엘라스타제는 이러한 만성 염증 질환 뿐만이 아니라 급성 염증 질환, 예컨대 ARDS 및 패혈성 쇼크에도 기여한다고 제안된 바 있다.
따라서, HNE는 HNE 활성이 관여하는 질환, 예를 들어 염증 질환, 예컨대 폐 기종, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 고혈압, 및 다른 염증 질환 및 또한 조산아에서의 기관지폐 형성장애, 및 증가되고 비정상적인 기도 분비를 수반하는 질환 및 또한 급성 염증 질환의 치료를 위한 잠재적인 표적으로 간주된다. 따라서, HNE의 특이적 조절제 (효능제 또는 억제제)가 요구된다.
치료는 예컨대 크림제, 연고제 및 좌제로의 국소 또는 전신 적용, 또는 경구 또는 sc 또는 iv 적용 또는 흡입 각각에 의해 이루어질 수 있다.
콘드로마이세스(Chondromyces)는 폴리안기아세아에(Polyangiaceae) 과의 속이고, 이것은 델타-프로테오박테리아에 속하는 믹소콕칼레스(Myxococcales) 목에 속한다. 믹소박테리아라고도 불리는 믹소콕칼레스 목의 박테리아는 대부분의 다른 박테리아와 구별되는 2가지 특징을 갖는 그람(gram)-음성 막대형 박테리아이다. 이것들은 활성 활주 메카니즘을 이용하여 고체 표면에서 군집하고, 기아시에는 응집하여 자실체를 형성한다 [Kaiser (2003)]. 본 발명자들은 칼리크레인 7을 특이적으로 조정할 수 있는, 콘드로마이세스에 의해 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 동정하였다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00001
상기 식에서, A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고, X 및 A1은 각각 독립적으로 임의적이고, X는 임의의 화학적 잔기이고, A1은 아스파르트산 이외의 표준 아미노산 또는 상기 표준 아미노산의 유도체이고, A2는 트레오닌 또는 세린이고, A3은 비-염기성 표준 아미노산 또는 그의 비-염기성 유도체이고, A4는 Ahp, 데히드로-AHP, 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신 또는 발린이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 류신, 이소류신 또는 발린이다.
별법으로, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체는 하기 화학식 I'에 따라 도시될 수 있다:
<화학식 I'>
Figure pat00002
상기 식에서,
X 및 A1은 특허청구범위에서 정의한 바와 같고,
R2는 H 또는 메틸이고,
R3은 비-염기성 아미노산 또는 그의 비-염기성 유도체의 측쇄이고,
R5는 아미노산 이소류신 또는 발린의 측쇄이고,
R6은 티로신 또는 그의 유도체의 측쇄이고,
R7은 아미노산 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고,
Y는 수소 또는 메틸기이며,
여기서의 Ahp는 데히드로-AHP, Ahp-I, Ahp-II, 프롤린 또는 그의 유도체로 치환될 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, X는 H 또는 아실 잔기, 예를 들어 CH3CH2CH(CH3)CO, (CH3)2CHCH2CO 또는 (CH3)2CHCO일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체, 예를 들어 글루탐산 니트릴 또는 글루탐산 에스테르일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A2는 트레오닌 또는 그의 유도체일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A3은 류신일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A6은 티로신일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 일부 실시양태에서, A4는 Ahp 유도체 3-아미노-피페리딘-2-온, Ahp-I 또는 Ahp-II일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 일부 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신 또는 발린이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신 또는 발린이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 다른 실시양태에서, X는 CH3CH2CH(CH3)CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 다른 실시양태에서, X는 CH3CH2CH(CH3)CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 데히드로-AHP 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 추가의 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 데히드로-AHP, Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
추가로, 본 발명은 또한 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00003
상기 식에서, A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다.
본 발명의 특별한 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다.
*본 발명의 다른 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다. 이러한 실시양태에서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자는 메틸로 치환될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에서, A1, A2, A3, A5, A6 및 A7은 L-아미노산일 수 있다. 추가로, A4는 3S,6R Ahp일 수 있다.
본 발명은 또한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 의약은 암, 특히 난소암의 치료, 또는 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염의 치료, 또는 암, 특히 난소암, 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식의 치료를 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염의 치료, 또는 암, 특히 난소암의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 예를 들어 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체를 적합한 배지 중에서 배양하고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하거나, 또는 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체의 생합성 유전자를 이종 미생물 숙주 균주에서 발현시키고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하여 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 이러한 방법은 콘드로마이세스 크로카투스(Chondromyces crocatus) (DSM 19329) 또는 콘드로마이세스 로부스투스(Chondromyces robustus) (DSM 19330) 또는 콘드로마이세스 아피쿨라투스(Chondromyces apiculatus) (DSM 21595)의 균주를 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 수탁 번호 DSM 19329 또는 DSM 19330 또는 DSM 21595로 기탁된 단리된 콘드로마이세스 미생물, 및 이러한 단리된 콘드로마이세스 미생물에 의해 생산된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다.
도 1: 화학식 II의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼 (600 MHz, d6-DMSO)
도 2: 화학식 II의 화합물의 13C-NMR 스펙트럼 (150 MHz, d6-DMSO)
도 3: 화학식 VIII의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼 (600 MHz, d6-DMSO)
도 4: 화학식 VIII의 화합물의 13C-NMR 스펙트럼 (150 MHz, d6-DMSO)
도 5: Ahp가 3-아미노-피페리딘-2-온으로 전환된 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 (실시예 4)의 1H-NMR 스펙트럼
도 6: 실시예 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 7: 실시예 19에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 8: 실시예 21에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 9: 실시예 26에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 10: 실시예 32에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 11: 실시예 44에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
도 12: 실시예 45에 따른 시클릭 뎁시펩티드 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, d6-DMSO)
발명의 상세한 설명
상기 내용 및 특허청구범위에 기재한 바와 같이, 본 발명은 한 측면에서 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00004
상기 식에서, A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고, X 및 A1은 각각 독립적으로 임의적이고, X는 임의의 화학적 잔기이고, A1은 아스파르트산 이외의 표준 아미노산이고, A2는 트레오닌 또는 세린이고, A3은 비-염기성 표준 아미노산 또는 그의 비-염기성 유도체이고, A4는 Ahp, 데히드로-AHP, 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신 또는 발린이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 류신, 이소류신 또는 발린이다.
별법으로, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체는 하기 화학식 I'에 따라 도시될 수 있다:
<화학식 I'>
Figure pat00005
상기 식에서,
X 및 A1은 특허청구범위에서 정의한 바와 같고,
R2는 아미노산 트레오닌 또는 세린의 측쇄이고,
R3은 비-염기성 아미노산 또는 그의 비-염기성 유도체의 측쇄이고,
R5는 아미노산 이소류신 또는 발린의 측쇄이고,
R6은 티로신 또는 그의 유도체의 측쇄이고,
R7은 아미노산 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고,
Y는 수소 또는 메틸기이며,
여기서의 Ahp는 데히드로-AHP, Ahp-I, Ahp-II, 프롤린 또는 그의 유도체로 치환될 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자는 메틸로 치환될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, X는 H 또는 아실 잔기, 예를 들어 CH3CH2CH(CH3)CO, (CH3)2CHCH2CO 또는 (CH3)2CHCO일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A2는 트레오닌일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A3은 류신일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드에서, A6은 티로신 또는 그의 유도체일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 일부 실시양태에서, A4는 Ahp 유도체 3-아미노-피페리딘-2-온, Ahp-I 또는 Ahp-II일 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 일부 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신 또는 발린이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신 또는 발린이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 다른 실시양태에서, X는 CH3CH2CH(CH3)CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 다른 실시양태에서, X는 CH3CH2CH(CH3)CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 데히드로-AHP 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 추가의 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 데히드로-AHP 또는 그의 유도체이고, A5는 이소류신이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 이소류신이다.
추가로, 본 발명은 또한 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure pat00006
상기 식에서, A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다.
본 발명의 특별한 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 Ahp 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, X는 (CH3)2CHCH2CO이고, A1은 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고, A2는 트레오닌이고, A3은 류신이고, A4는 프롤린 또는 그의 유도체이고, A5는 페닐알라닌이고, A6은 티로신 또는 그의 유도체이며, A7은 발린이다. 이러한 실시양태에서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자는 메틸로 치환될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에서, A1, A2, A3, A5, A6 및 A7은 L-아미노산일 수 있다. 추가로, A4는 3S,6R Ahp일 수 있다.
A5는 이소류신, 페닐알라닌 또는 발린을 의미한다. A5는 특히 이소류신 또는 발린이고, 바람직하게는 이소류신이다.
또다른 실시양태에서, 특히 A4가 Ahp가 아닌 경우에 A5는 페닐알라닌일 수 있고, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 5-히드록시프롤린이고, A5는 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp이고, A5는 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp-I이고, A5는 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp-II이고, A5는 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp이고, A5 및 A7은 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp-I이고, A5 및 A7은 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 Ahp-II이고, A5 및 A7은 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
또다른 실시양태에서, A4는 5-히드록시프롤린이고, A5 및 A7은 이소류신이며, 나머지 가변기는 청구항 제1항에서 정의한 바와 같다.
본원에서 사용된 바와 같이, A1은 글루타민, 글루탐산, 오르니틴, 또는 글루타민 유도체, 예를 들어 글루탐산 니트릴, 글루탐산 에스테르, 예컨대 C1 - 12알킬 에스테르 (예를 들어, 글루탐산 메틸 에스테르) 또는 예컨대 C6 - 24아릴 에스테르 (예를 들어, 글루탐산 페닐 또는 벤질 에스테르)이다.
본 발명은 또한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 의약은 암, 특히 난소암의 치료, 또는 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염의 치료를 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염의 치료, 또는 암, 특히 난소암의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증의 치료를 위한 의약에 있어서 상기한 뎁시펩티드 및 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 예를 들어 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체를 적합한 배지 중에서 배양하고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하거나, 또는 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체의 생합성 유전자를 이종 미생물 숙주 균주에서 발현시키고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하여 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 이러한 방법은 콘드로마이세스 크로카투스 (DSM 19329) 또는 콘드로마이세스 로부스투스 (DSM 19330) 또는 콘드로마이세스 아피쿨라투스 (DSM 21595)의 균주를 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 수탁 번호 DSM 19329 또는 DSM 19330 또는 DSM 21595로 기탁된 단리된 콘드로마이세스 미생물, 및 이러한 단리된 콘드로마이세스 미생물에 의해 생산된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다.
본 발명은,
하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체 또는 그의 제약상 허용가능한 염:
<화학식 I>
Figure pat00007
상기 식에서,
A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 형성되어 있고,
X 및 A1은 각각 독립적으로 임의적이며,
X는 H 또는 아미노기 변형 잔기이고, 전형적으로는 아릴 카르보닐 잔기 또는 아실 잔기로부터 선택될 수 있고,
A1은 글루타민, 오르니틴, 글루탐산 또는 그의 유도체이고,
A2는 트레오닌 또는 세린이고,
A3은 류신이고,
A4는 Ahp, 3-아미노-피페리딘-2-온, 데히드로-AHP, Ahp-I, Ahp-II, 프롤린, 5-히드록시-프롤린 또는 그의 유도체이며, 이때,
프롤린 및 5-히드록시프롤린의 경우에는 융합 지점 (A3 및 A5와의 융합 지점)이 프롤린 및 5-히드록시프롤린의 질소 원자 및 카르복실 산소 (수소 원자가 결합으로 대체되어 이루어짐)이고,
Ahp, 3-아미노-피페리딘-2-온, 데히드로-AHP, Ahp-I 및 Ahp-II는 하기 정의한 바와 같으며, 이들 화합물의 경우에는 융합 지점 (A3 및 A5와의 융합 지점)이 이것들의 질소 원자 (수소 원자가 결합으로 대체되어 이루어짐)이고:
(여기서, X는 O 또는 결합이고, R은 유기 잔기 또는 청구항 제3항에서 정의한 바와 같은 라디칼임),
A5는 이소류신, 페닐알라닌 또는 발린이고,
A6은 티로신, N-Me-티로신 또는 그의 유도체이며,
A7은 류신, 이소류신 또는 발린이다;
청구항 제1항에 있어서, X가 CH3CH2CH(CH3)CO, (CH3)2CHCH2CO, (CH3)2CHCO, CH3CO 또는 페닐-CO인 뎁시펩티드;
청구항 제1항에 있어서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자가 메틸로 치환되고, 티로신의 OH기가 OR이고, 여기서의 R은 수소, (C1 -12)알킬, (C2 -12)알케닐, (C2-12)알키닐, 할로(C1-12)알킬, 할로(C2-12)알케닐, 할로(C2-12)알키닐, (C1 -12)알콕시카르보닐, (C1 -12)알콕시카르보닐(C1 -12)알킬, (C1 -12)알킬아미노카르보닐 (치환되지 않거나, 또는 아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 아릴알키닐, 헤테로시클릴 및 헤테로시클릴알킬로 추가로 치환됨)로 구성된 군에서 선택된 뎁시펩티드;
청구항 제1항에 있어서, A4가 Ahp 유도체 3-아미노-피페리딘-2-온, Ahp-I 또는 Ahp-II이고, 여기서의 R은 (C1 -12)알킬, (C2 -12)알케닐, (C2 -12)알키닐, 할로(C1-12)알킬, (C1 -12)알콕시(C1 -12)알킬, (C1 -12)알콕시(C1 -12)알콕시(C1 -12)알킬, 히드록시(C1-12)알킬, 페닐 및 페닐(C1-6)알킬로 구성된 군에서 선택된 뎁시펩티드;
청구항 제1항에 있어서,
아실 잔기 X가 CH3CH2CH(CH3)CO 또는 (CH3)2CHCO이고,
A1이 글루타민, 글루탐산 또는 그의 유도체이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 Ahp, 3-아미노-피페리딘-2-온, 프롤린, 5-히드록시-프롤린 또는 그의 유도체이고,
A5가 이소류신이고,
A6이 티로신, N-Me-티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 이소류신 또는 발린, 바람직하게는 이소류신인
뎁시펩티드;
청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, A4가 Ahp, Ahp-I, 3-아미노-피페리딘-2-온, 프롤린 또는 5-히드록시-프롤린, 바람직하게는 Ahp, Ahp-I, 3-아미노-피페리딘-2-온 또는 5-히드록시-프롤린, 또한 바람직하게는 Ahp, Ahp-I 또는 5-히드록시-프롤린, 더욱 바람직하게는 Ahp인 뎁시펩티드;
청구항 제1항에 있어서, 하기 화학식 A 또는 B에 따른 화합물인 뎁시펩티드:
Figure pat00009
상기 식에서,
X 및 A1은 청구항 제1항에서 정의한 바와 같고,
R2는 아미노산 트레오닌 또는 세린의 측쇄이고,
R3은 류신의 측쇄이고,
R5는 아미노산 이소류신 또는 발린의 측쇄이고, 특히 R5는 이소류신의 측쇄를 의미하고,
R6은 임의로 유도체화되거나, 특히 청구항 제3항에서 정의한 바와 같이 히드록실기에서 임의로 유도체화된 티로신의 측쇄이고,
R7은 아미노산 류신, 이소류신 또는 발린의 측쇄이고, 특히 R7은 이소류신의 측쇄를 의미하며,
*Y는 수소 또는 메틸이고, Y는 특히 메틸이다;
청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, A1, A2, A3, A5, A6 및 A7이 L-아미노산인 시클릭 뎁시펩티드;
청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A4가 3S,6R Ahp인 시클릭 뎁시펩티드;
청구항 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, A1이 글루타민, 오르니틴, 또는 본 명세서의 임의의 실시예에 기재한 바와 같은 글루타민 유도체이고, 예를 들어 글루탐산 니트릴, 글루탐산 에스테르, 예컨대 C1 - 12알킬 에스테르 (예를 들어, 글루탐산 메틸 에스테르) 또는 예컨대 C6 - 24아릴 에스테르 (예를 들어, 글루탐산 페닐 또는 벤질 에스테르)로부터 선택되는 시클릭 뎁시펩티드;
*청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드, 및 제약상 허용가능한 담체 및/또는 성분을 포함하는 제약 조성물;
청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 특히 청구항 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항과 같은 환자의 치료 방법에 기재한 바와 같이 사용하기 위한 시클릭 뎁시펩티드, 및 상기한 방법 청구항에 기재한 바와 같은 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 상기 뎁시펩티드의 용도;
염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암, 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식으로 고통받는 대상체에게 치료 유효량의 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 상기한 질환 또는 장애로 고통받는 대상체를 치료하는 방법;
청구항 제13항에 있어서, 상기 대상체가 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암으로 고통받는 것인, 대상체를 치료하는 방법;
청구항 제14항에 있어서, 상기 대상체가 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부로 고통받는 것인, 대상체를 치료하는 방법;
청구항 제13항에 있어서, 상기 대상체가 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식으로 고통받는 것인, 대상체를 치료하는 방법;
콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체를 적합한 배지 중에서 배양하고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하는 것을 포함하는, 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법;
콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체의 생합성 유전자를 이종 미생물 숙주 균주에서 발현시키고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하는 것을 포함하는, 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법;
청구항 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 균주가 콘드로마이세스 크로카투스 (DSM 19329) 또는 콘드로마이세스 로부스투스 (DSM 19330) 또는 콘드로마이세스 아피쿨라투스 (DSM 21595)인 방법;
수탁 번호 DSM 19329 또는 DSM 19330 또는 DSM 21595로 기탁된, 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 단리된 콘드로마이세스 미생물;
청구항 제20항의 단리된 콘드로마이세스 미생물에 의해 생산되거나, 또는 청구항 제17항 또는 제18항에 따른 방법으로 수득된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
대안적으로,
a) A4가
Figure pat00010
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00011
인 청구항 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
b) A4가
Figure pat00012
인 화합물을 -50℃ 내지 100℃의 온도에서 용매 중에서 촉매의 존재하에 수소 분자 또는 그의 공급원으로 처리하여 A4가
Figure pat00013
인 청구항 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
c) A4가
Figure pat00014
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 환원제의 존재하에 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00015
인 청구항 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
d) A4가
Figure pat00016
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 치환되거나 치환되지 않은 알칸올 및 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00017
인 청구항 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
e) A1이 Gln 또는 Asn이고, A4가
Figure pat00018
(여기서, R은 바람직하게는 H, 알킬, 치환된 알킬임)인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 용매 중에서 또는 용매 없이 치환되거나 치환되지 않은 알칸올 및 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A1이
Figure pat00019
(여기서, n = 1, 2)이고, A4가
Figure pat00020
(여기서, R은 바람직하게는 H, 알킬, 치환된 알킬임)인 화합물을 제조하거나,
f) A1이 Gln 또는 Asn이고, A4가
Figure pat00021
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 용매 중에서 또는 용매 없이 탈수제로 처리하여 A1이
Figure pat00022
(여기서, R은 바람직하게는 H, OH, O-알킬, 치환된 O-알킬, O-아실임)인 화합물을 제조하거나, 또는
g) A4가
Figure pat00023
이고, A6이 Tyr인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 용매 중에서 또는 용매 없이 알킬화제 또는 아실화제로 처리하여 A4가
Figure pat00024
이고, A6이
Figure pat00025
(여기서, R은 바람직하게는 알킬, 치환된 알킬, 아실, 알콕시카르보닐임)인 화합물을 제조하는 것
을 포함하는, 청구항 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하는 방법; 및
특히 그리고 본질적으로 본 명세서 및/또는 실시예에서 기재한 바와 같은 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염
을 제공한다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 구체적인 실시양태는 다음과 같다:
Figure pat00026
Figure pat00027
화학식 II 내지 VII, XI 내지 XIV 및 XVII의 시클릭 뎁시펩티드는 본 발명의 콘드로마이세스 크로카투스 균주 (DSM 19329)에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 다른 구체적인 실시양태는 다음과 같다:
Figure pat00028
화학식 VIII 내지 X의 시클릭 뎁시펩티드는 본 발명의 콘드로마이세스 로부스투스 (DSM 19330)에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 다른 구체적인 실시양태는 다음과 같다:
Figure pat00029
화학식 XV 및 XVI의 시클릭 뎁시펩티드는 본 발명의 콘드로마이세스 아피쿨라투스 (DSM 21595)에 의해 생산될 수 있다.
약어 목록
Ahp 3-아미노-6-히드록시-2-피페리돈
DSMZ 도이체 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
hK7 인간 칼리크레인 7
HPLC 고성능/고압 액체 크로마토그래피
HTS 고처리량 스크리닝
IC 중간 배양
ID 식별
MB 믹소박테리아
MC 주 배양
PC 예비-배양
*pO2 배양 브로쓰 중 산소 분압 (100％ = 공기로 포화됨)
rpm 1분 당 회전수
SCCE 각질층 카이모트립신분해 효소
SPEX 고체 상 추출
vvm 통기율 (배양 부피 및 1분 당 공기의 부피(Volume of air per culture volume and per minute))
"화학적 잔기"는 임의의 유기 또는 비-유기 화학적 잔기일 수 있다. 표현 "화학적 잔기"는 치환되거나 치환되지 않은 지방족 기, 예를 들어 C1-C3알킬, C1-C6알킬 또는 C1-C12알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 치환되거나 치환되지 않은 아릴알킬, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 할로겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특허청구범위에서 정의한 바와 같은 화학적 잔기는 하기하는 임의의 화학적 기일 수 있다.
표현 "화학적 잔기"는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비-유기 화학적 잔기의 예는 예를 들어 할로겐, 예컨대 Br 또는 Cl이다.
"지방족 기"는 탄소 원자, 수소 원자, 할로겐 원자, 산소, 질소 또는 다른 원자의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 임의로는 1개 이상의 불포화 단위, 예를 들어 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 함유할 수 있는 비-방향족 잔기이다. 지방족 기는 직쇄형, 분지형 또는 시클릭일 수 있고, 바람직하게는 약 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 약 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 함유한다. 지방족 기는 지방족 탄화수소기에 추가하여 예를 들어 폴리알콕시알킬, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 및 폴리이민을 포함한다. 이러한 지방족 기는 추가로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3알킬", "C1-C6알킬" 또는 "C1-C12알킬"은 각각 1개 내지 3개, 1개 내지 6개 또는 1개 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. C1-C3알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필 라디칼을 포함하고, C1-C6알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 네오펜틸 및 n-헥실 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, C1-C12알킬 라디칼의 예는 에틸, 프로필, 이소프로필, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 라디칼 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 알킬"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 지방족 치환기로 치환된 알킬, 예컨대 C1-C12알킬 또는 C1-C6알킬의 기를 지칭한다.
적합한 지방족 치환기는 --F, --Cl, --Br, --I, --OH, 보호된 히드록시, 지방족 에테르, 방향족 에테르, 옥소, --NO2, --CN, 할로겐으로 임의로 치환된 --C1-C12알킬 (예컨대 퍼할로알킬), 할로겐으로 임의로 치환된 C2-C12알케닐, 할로겐으로 임의로 치환된 --C2-C12알키닐, --NH2, 보호된 아미노, --NH--C1-C12알킬, --NH--C2-C12알케닐, --NH--C2-C12알케닐, --NH--C3-C12시클로알킬, --NH-아릴, --NH-헤테로아릴, --NH-헤테로시클로알킬, -디알킬아미노, -디아릴아미노, -디헤테로아릴아미노, --O--C1-C12알킬, --O--C2-C12알케닐, --O--C2-C12알키닐, --O--C3-C12시클로알킬, --O-아릴, --O-헤테로아릴, --O-헤테로시클로알킬, --C(O)--C1-C12알킬, --C(O)--C2-C12알케닐, --C(O)--C2-C12알키닐, --C(O)--C3-C12시클로알킬, --C(O)-아릴, --C(O)-헤테로아릴, --C(O)-헤테로시클로알킬, --CONH2, --CONH--C1-C12알킬, --CONH--C2-C12알케닐, --CONH--C2-C12알키닐, --CONH--C3-C12시클로알킬, --CONH-아릴, --CONH-헤테로아릴, --CONH-헤테로시클로알킬, --CO2--C1-C12알킬, --CO2--C2-C12알케닐, --CO2--C2-C12알키닐, --CO2--C3-C12시클로알킬, --CO2-아릴, --CO2-헤테로아릴, --CO2-헤테로시클로알킬, --OCO2--C1-C12알킬, --OCO2--C2-C12알케닐, --OCO2--C2-C12알키닐, --OCO2--C3-C12시클로알킬, --OCO2-아릴, --OCO2-헤테로아릴, --OCO2-헤테로시클로알킬, --OCONH2, --OCONH--C1-C12알킬, --OCONH--C2-C12알케닐, --OCONH--C2-C12알키닐, --OCONH--C3-C12시클로알킬, --OCONH-아릴, --OCONH-헤테로아릴, --OCONH-헤테로시클로알킬, --NHC(O)--C1-C12알킬, --NHC(O)--C2-C12알케닐, --NHC(O)--C2-C12알키닐, --NHC(O)--C3-C12시클로알킬, --NHC(O)-아릴, --NHC(O)-헤테로아릴, --NHC(O)-헤테로시클로알킬, --NHCO2--C1-C12알킬, --NHCO2--C2-C12알케닐, --NHCO2--C2-C12알키닐, --NHCO2--C3-C12시클로알킬, --NHCO2-아릴, --NHCO2-헤테로아릴, --NHCO2-헤테로시클로알킬, --NHC(O)NH2, --NHC(O)NH--C1-C12알킬, --NHC(O)NH--C2-C12알케닐, --NHC(O)NH--C2-C12알키닐, --NHC(O)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(O)NH-아릴, --NHC(O)NH-헤테로아릴, --NHC(O)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(S)NR2, --NHC(S)NH--C1-C12알킬, --NHC(S)NH--C2-C12알케닐, --NHC(S)NH--C2-C12알키닐, --NHC(S)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(S)NH-아릴, --NHC(S)NR-헤테로아릴, --NHC(S)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(NH)NH2, --NHC(NH)NH--C1-C12알킬, --NHC(NH)NH--C2-C12알케닐, --NHC(NH)NH--C2-C12알키닐, --NHC(NH)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(NH)NH-아릴, --NHC(NH)NH-헤테로아릴, --NHC(NH)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(NH)--C1-C12알킬, --NHC(NH)--C2-C12알케닐, --NHC(NH)--C2-C12알키닐, --NHC(NH)--C3-C12시클로알킬, --NHC(NH)-아릴, --NHC(NH)-헤테로아릴, --NHC(NH)-헤테로시클로알킬, --C(NR)NH--C1-C12알킬, --C(NH)NH--C2-C12알케닐, --C(NR)NH--C2-C12알키닐, --C(NH)NH--C3-C12시클로알킬, --C(NH)NH-아릴, --C(NH)NH-헤테로아릴, --C(NH)NH-헤테로시클로알킬, --S(O)--C1-C12알킬, --S(O)--C2-C12알케닐, --S(O)--C2-C12알키닐, --S(O)--C3-C12시클로알킬, --S(O)-아릴, --S(O)-헤테로아릴, --S(O)-헤테로시클로알킬-SO2NH2, --SO2NH--C1-C12알킬, --SO2NH--C2-C12알케닐, --SO2NH--C2-C12알키닐, --SO2NH--C3-C12시클로알킬, --SO2NH-아릴, --SO2NH-헤테로아릴, --SO2NH-헤테로시클로알킬, --NHSO2--C1-C12알킬, --NHSO2--C2-C12알케닐, --NHSO2--C2-C12알키닐, --NHSO2--C3-C12시클로알킬, --NHSO2-아릴, --NHSO2-헤테로아릴, --NHSO2-헤테로시클로알킬, --CH2NH2, --CH2SO2CH3, -아릴, -아릴알킬, -헤테로아릴, -헤테로아릴알킬, -헤테로시클로알킬, --C3-C12시클로알킬, 폴리알콕시알킬, 폴리알콕시, -메톡시메톡시, -메톡시에톡시, --SH, --S--C1-C12알킬, --S--C2-C12알케닐, --S--C2-C12알키닐, --S--C3-C12시클로알킬, --S-아릴, --S-헤테로아릴, -S-헤테로시클로알킬 또는 메틸티오메틸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등은 추가로 치환될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C2-C12알케닐" 또는 "C2-C6알케닐"은 2개 내지 12개 또는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하고 단일 수소 원자의 제거에 의한 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 탄화수소 잔기로부터 유래된 1가의 기를 나타낸다. 알케닐기는 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 알카디엔 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 알케닐"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 지방족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 "C2-C12알케닐" 또는 "C2-C6알케닐"의 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C2-C12알키닐" 또는 "C2-C6알키닐"은 2개 내지 12개 또는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하고 단일 수소 원자의 제거에 의한 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 탄화수소 잔기로부터 유래된 1가의 기를 나타낸다. 대표적인 알키닐기는 예를 들어 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 알키닐"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 지방족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 "C2-C12알키닐" 또는 "C2-C6알키닐"의 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C6알콕시"는 산소 원자를 통해 모 분자 잔기에 부착된, 상기 정의한 바와 같은 C1-C6알킬기를 지칭한다. C1-C6알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시 및 n-헥속시를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 1개 또는 2개의 방향족 고리를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭 카르보시클릭 고리계를 지칭하고, 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 이데닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 아릴"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 방향족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 아릴기를 지칭한다.
방향족 치환기는 --F, --Cl, --Br, --I, --OH, 보호된 히드록시, 지방족 에테르, 방향족 에테르, 옥소, --NO2, --CN, 할로겐으로 임의로 치환된 --C1-C12알킬 (예컨대 퍼할로알킬), 할로겐으로 임의로 치환된 C2-C12알케닐, 할로겐으로 임의로 치환된 --C2-C12알키닐, --NH2, 보호된 아미노, --NH--C1-C12알킬, --NH--C2-C12알케닐, --NH--C2-C12알케닐, --NH--C3-C12시클로알킬, --NH-아릴, --NH-헤테로아릴, --NH-헤테로시클로알킬, -디알킬아미노, -디아릴아미노, -디헤테로아릴아미노, --O--C1-C12알킬, --O--C2-C12알케닐, --O--C2-C12알키닐, --O--C3-C12시클로알킬, --O-아릴, --O-헤테로아릴, --O-헤테로시클로알킬, --C(O)--C1-C12알킬, --C(O)--C2-C12알케닐, --C(O)--C2-C12알키닐, --C(O)--C3-C12시클로알킬, --C(O)-아릴, --C(O)-헤테로아릴, --C(O)-헤테로시클로알킬, --CONH2, --CONH--C1-C12알킬, --CONH--C2-C12알케닐, --CONH--C2-C12알키닐, --CONH--C3-C12시클로알킬, --CONH-아릴, --CONH-헤테로아릴, --CONH-헤테로시클로알킬, --CO2--C1-C12알킬, --CO2--C2-C12알케닐, --CO2--C2-C12알키닐, --CO2--C3-C12시클로알킬, --CO2-아릴, --CO2-헤테로아릴, --CO2-헤테로시클로알킬, --OCO2--C1-C12알킬, --OCO2--C2-C12알케닐, --OCO2--C2-C12알키닐, --OCO2-C3-C12시클로알킬, --OCO2-아릴, --OCO2-헤테로아릴, --OCO2-헤테로시클로알킬, --OCONH2, --OCONH--C1-C12알킬, --OCONH--C2-C12알케닐, --OCONH--C2-C12알키닐, --OCONH--C3-C12시클로알킬, --OCONH-아릴, --OCONH-헤테로아릴, --OCONH-헤테로시클로알킬, --NHC(O)--C1-C12알킬, --NHC(O)--C2-C12알케닐, --NHC(O)--C2-C12알키닐, --NHC(O)--C3-C12시클로알킬, --NHC(O)-아릴, --NHC(O)-헤테로아릴, --NHC(O)-헤테로시클로알킬, --NHCO2--C1-C12알킬, --NHCO2--C2-C12알케닐, --NHCO2--C2-C12알키닐, --NHCO2--C3-C12시클로알킬, --NHCO2-아릴, --NHCO2-헤테로아릴, --NHCO2-헤테로시클로알킬, --NHC(O)NH2, --NHC(O)NH--C1-C12알킬, --NHC(O)NH--C2-C12알케닐, --NHC(O)NH--C2-C12알키닐, --NHC(O)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(O)NH-아릴, --NHC(O)NH-헤테로아릴, --NHC(O)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(S)NH2, --NHC(S)NH--C1-C12알킬, --NHC(S)NH--C2-C12알케닐, --NHC(S)NH--C2-C12알키닐, --NHC(S)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(S)NH-아릴, --NHC(S)NH-헤테로아릴, --NHC(S)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(NH)NH2, --NHC(NH)NH--C1-C12알킬, --NHC(NH)NH--C2-C12알케닐, --NHC(NH)NH--C2-C12알키닐, --NHC(NH)NH--C3-C12시클로알킬, --NHC(NH)NH-아릴, --NHC(NH)NH-헤테로아릴, --NHC(NH)NH-헤테로시클로알킬, --NHC(NH)--C1-C12알킬, --NHC(NH)--C2-C12알케닐, --NHC(NH)--C2-C12알키닐, --NHC(NH)--C3-C12시클로알킬, --NHC(NH)-아릴, --NHC(NH)-헤테로아릴, --NHC(NH)-헤테로시클로알킬, --C(NH)NH--C1-C12알킬, --C(NH)NH--C2-C12알케닐, --C(NH)NH--C2-C12알키닐, --C(NH)NH--C3-C12시클로알킬, --C(NH)NH-아릴, --C(NH)NH-헤테로아릴, --C(NH)NH-헤테로시클로알킬, --S(O)--C1-C12알킬, --S(O)--C2-C12알케닐, --S(O)--C2-C12알키닐, --S(O)--C3-C12시클로알킬, --S(O)-아릴, --S(O)-헤테로아릴, --S(O)-헤테로시클로알킬-SO2NH2, --SO2NH--C1-C12알킬, --SO2NH--C2-C12알케닐, --SO2NH--C2-C12알키닐, --SO2NH--C3-C12시클로알킬, --SO2NH-아릴, --SO2NH-헤테로아릴, --SO2NH-헤테로시클로알킬, --NHSO2--C1-C12알킬, --NHSO2--C2-C12알케닐, --NHSO2--C2-C12알키닐, --NHSO2--C3-C12시클로알킬, --NHSO2-아릴, --NHSO2-헤테로아릴, --NHSO2-헤테로시클로알킬, --CH2NH2, --CH2SO2CH3, -아릴, -아릴알킬, -헤테로아릴, -헤테로아릴알킬, -헤테로시클로알킬, --C3-C12시클로알킬, 폴리알콕시알킬, 폴리알콕시, -메톡시메톡시, -메톡시에톡시, --SH, --S--C1-C12알킬, --S--C2-C12알케닐, --S--C2-C12알키닐, --S--C3-C12시클로알킬, --S-아릴, --S-헤테로아릴, --S-헤테로시클로알킬 또는 메틸티오메틸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등은 추가로 치환될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아릴알킬"은 C1-C3알킬 또는 C1-C6알킬 잔기를 통해 모 화합물에 부착된 아릴기를 지칭한다. 예는 벤질, 페네틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 아릴알킬"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 방향족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 아릴알킬기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 5개 내지 10개의 고리 원자를 가지며, 이 중에서 1개 이상의 고리 원자가 S, O 및 N으로부터 선택되고, 0개, 1개 또는 2개의 고리 원자가 S, O 및 N으로부터 독립적으로 선택된 추가의 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소이며, 상기 고리 내에 함유된 임의의 N 또는 S는 임의로 산화될 수 있는, 모노시클릭, 바이시클릭 또는 트리시클릭 방향족 라디칼 또는 고리를 지칭한다. 헤테로아릴은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로방향족 고리는 탄소 또는 헤테로 원자를 통해 화학적 구조에 결합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 헤테로아릴"은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 방향족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 헤테로아릴기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C3-C12시클로알킬"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 모노시클릭 또는 바이시클릭 포화 카르보시클릭 고리 화합물로부터 유래된 1가의 기를 나타낸다. 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 바이시클로[2.2.1]헵틸 및 바이시클로[2.2.2]옥틸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 C3-C12시클로알킬"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 지방족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 C3-C12시클로알킬기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로시클로알킬"은 비-방향족의 5원, 6원 또는 7원 고리 또는 바이시클릭기 또는 트리시클릭기 융합 시스템을 지칭하며, 여기서, (i) 각각의 고리는 산소, 황 및 질소로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자를 함유하고, (ii) 각각의 5원 고리는 0개 또는 1개의 이중 결합을 갖고, 각각의 6원 고리는 0개 내지 2개의 이중 결합을 가지며, (iii) 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, (iv) 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있고, (iv) 임의의 상기 고리는 벤젠 고리에 융합될 수 있으며, (v) 나머지 고리 원자는 임의로 옥소-치환될 수 있는 탄소 원자이다. 대표적인 헤테로시클로알킬기는 [1,3]디옥솔란, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐 및 테트라히드로푸릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 헤테로시클로알킬"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 지방족 치환기로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 헤테로시클로알킬기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴알킬"은 C1-C3알킬 또는 C1-C6알킬 잔기를 통해 모 화합물에 부착된 헤테로아릴기를 지칭한다. 예는 피리디닐메틸, 피리미디닐에틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치환된 헤테로아릴알킬"은 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 수의 방향족 치환기의 독립적 대체로 치환된, 상기 정의한 바와 같은 헤테로아릴알킬기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "C1-C3알킬아미노"는 질소 원자를 통해 모 분자 잔기에 부착된, 상기 정의한 바와 같은 1개 또는 2개의 C1-C3알킬기를 지칭한다. C1-C3알킬아미노의 예는 메틸아미노, 디메틸아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노 및 프로필아미노를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "알킬아미노"는 구조 --NH(C1-C12알킬) (여기서, C1-C12알킬은 상기 정의한 바와 같음)의 기를 지칭한다.
용어 "디알킬아미노"는 구조 --N(C1-C12알킬)(C1-C12알킬) (여기서, C1-C12알킬은 상기 정의한 바와 같음)의 기를 지칭한다. 디알킬아미노의 예는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노, 피페리디노 등이지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "알콕시카르보닐"은 카르보닐기를 통해 모 분자 잔기에 부착된 에스테르기, 즉, 알콕시기를 나타내며, 예를 들어 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐 등이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "카르복스알데히드"는 화학식 --CHO의 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "카르복시"는 화학식 --COOH의 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "카르복스아미드"는 화학식 --C(O)NH(C1-C12알킬) 또는 --C(O)N(C1-C12알킬)(C1-C12알킬), --C(O)NH2, --NHC(O)(C1-C12알킬), --N(C1-C12알킬)C(O)(C1-C12알킬) 등의 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "히드록시 보호기"는 합성 절차 동안에 히드록실기를 원치않는 반응으로부터 보호한다고 당업계에 공지된 불안정성 화학적 잔기를 지칭한다. 상기 합성 절차(들) 이후에, 본원에 기재한 바와 같은 히드록시 보호기는 선택적으로 제거될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 히드록시 보호기는 일반적으로 문헌 [T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley ＆ Sons, New York (1999)]에 기재되어 있다. 히드록실 보호기의 예는 벤질옥시카르보닐, 4-니트로벤질옥시카르보닐, 4-브로모벤질옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, 메톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 이소프로폭시카르보닐, 디페닐메톡시카르보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐, 2-푸르푸릴옥시카르보닐, 알릴옥시카르보닐, 아세틸, 포르밀, 클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 메톡시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 메틸, t-부틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴 에틸, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 3-메틸-3-부테닐, 알릴, 벤질, 파라-메톡시벤질디페닐메틸, 트리페닐메틸 (트리틸), 테트라히드로푸릴, 메톡시메틸, 메틸티오메틸, 벤질옥시메틸, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸, 메탄술포닐, 파라-톨루엔술포닐, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리이소프로필실릴 등을 포함한다. 본 발명에 바람직한 히드록실 보호기는 아세틸 (Ac 또는 --C(O)CH3), 벤조일 (Bn 또는 --C(O)C6H5) 및 트리메틸실릴 (TMS 또는 --Si(CH3)3)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보호된 히드록시"는 상기 정의한 바와 같은 히드록시 보호기로 보호된 히드록시기를 지칭하며, 예를 들어 벤조일, 아세틸, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 메톡시메틸의 기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 보호기"는 합성 절차 동안에 아미노기를 원치않는 반응으로부터 보호한다고 당업계에 공지된 불안정성 화학적 잔기를 지칭한다. 상기 합성 절차(들) 이후에, 본원에 기재한 바와 같은 아미노 보호기는 선택적으로 제거될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 아미노 보호기는 일반적으로 문헌 [T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley ＆ Sons, New York (1999)]에 기재되어 있다. 아미노 보호기의 예는 t-부톡시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보호된 아미노"는 상기 정의한 바와 같은 아미노 보호기로 보호된 아미노기를 지칭한다.
용어 "아실"은 카르복실산, 카르밤산, 탄산, 술폰산 및 인산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 산으로부터 유래된 잔기를 포함한다. 예는 지방족 카르보닐, 방향족 카르보닐, 지방족 술포닐, 방향족 술피닐, 지방족 술피닐, 방향족 술포닐, 지방족 술파밀, 방향족 술파밀, 방향족 포스페이트 및 지방족 포스페이트를 포함한다.
"아미노산"은 아민 관능기와 카르복실 관능기를 둘다 함유하는, 화학식 NH2CHRCOOH의 분자이다. 용어 '아미노산'은 표준 아미노산 및 비-표준 아미노산을 포함한다.
"표준 아미노산"은 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이다.
"아스파르트산 이외의 표준 아미노산"은 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된다. 글루타민 또는 글루탐산의 경우에, "그의 유도체"는 예를 들어 니트릴 또는 에스테르, 예컨대 글루타민-니트릴, 글루탐산 에스테르이다.
"비-표준 아미노산"은 표준 아미노산 중 하나가 아닌 아미노산 (아민 관능기와 카르복실 관능기를 둘다 함유하는 분자)이다. 이것의 예는 셀레노시스테인 (UGA 코돈에서 일부 단백질로 혼입됨), 피로라이신 (일부 메탄생성 박테리아에 의해 메탄을 생성하는 효소에서 사용되며, 코돈 UAG로 코딩됨), 란티오닌, 2-아미노이소부티르산, 데히드로알라닌, 3-아미노-6-히드록시-2-피페리돈, 감마-아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모시스테인, 도파민 또는 히드록시프롤린이다.
"비-염기성 표준 아미노산"은 알라닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이다.
"Ahp" (3-아미노-6-히드록시-피페리딘-2-온)는 예를 들어 시아노박테리아에서 발견되는 비-표준 아미노산이다. "Ahp 유도체"는 3-아미노-3,4-디히드로-1H-피리딘-2-온 (데히드로-AHP), 3-아미노-피페리딘-2-온 및 "AHP의 에테르 및 에스테르 유도체"를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 Ahp 유도체는 하기 도시한 바와 같은 3-아미노-피페리딘-2-온, 또는 Ahp-I 또는 Ahp-II (여기서, R은 (C1 -12)알킬, (C2 -12)알케닐, (C2 -12)알키닐, 할로(C1-12)알킬, (C1 -12)알콕시(C1 -12)알킬, (C1 -12)알콕시(C1 -12)알콕시(C1-12)알킬, 히드록시(C1-12)알킬, 페닐 및 페닐(C1-6)알킬로 구성된 군에서 선택됨)이다.
이러한 부류의 비-표준 아미노산의 여러 구성원은 다음과 같다:
Figure pat00030
프롤린 유도체는 예를 들어 5-히드록시프롤린을 포함한다.
"아미노산 유도체"는 O-알킬, O-아릴, O-아실, S-알킬, S-아릴, S-S-알킬, 알콕시카르보닐, O-카르보닐-알콕시, 카르보네이트, O-카르보닐-아릴옥시, O-카르보닐-알킬아미노, O-카르보닐-아릴아미노, N-알킬, N-디알킬, N-트리알킬암모늄, N-아실, N-카르보닐-알콕시, N-카르보닐-아릴옥시, N-카르보닐-알킬아미노, N-카르보닐-아릴아미노, N-술포닐알킬 또는 N-술포닐아릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"비-염기성 표준 아미노산 유도체"는 O-알킬, O-아릴, O-아실, S-알킬, S-아릴, S-S-알킬, 알콕시카르보닐, O-카르보닐-알콕시, 카르보네이트, O-카르보닐-아릴옥시, O-카르보닐-알킬아미노, O-카르보닐-아릴아미노, N-알킬, N-디알킬, N-트리알킬암모늄, N-아실, N-카르보닐-알콕시, N-카르보닐-아릴옥시, N-카르보닐-알킬아미노, N-카르보닐-아릴아미노, N-술포닐알킬 또는 N-술포닐아릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"티로신 유도체"는 -O-알킬, O-아릴, O-헤테로아릴, O-아실, O-PO3H 및 O-SO3H, 및 또한 오르토 또는 메타 위치에서의 할로겐화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
티로신의 OH기는 OR (여기서, R은 수소, (C1 -12)알킬, (C2 -12)알케닐, (C2 -12)알키닐, 할로(C1-12)알킬, 할로(C2-12)알케닐, 할로(C2-12)알키닐, (C1 -12)알콕시카르보닐, (C1-12)알콕시카르보닐(C1 -12)알킬, (C1 -12)알킬아미노카르보닐로 구성된 군에서 선택되고, 치환되지 않거나, 또는 아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 아릴알키닐, 헤테로시클릴 및 헤테로시클릴알킬로 추가로 치환됨)일 수 있다.
"뎁시펩티드 유도체"는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 뎁시펩티드 및 하기 실시예에 구체적으로 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 유도체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염 및 유도체 및 이러한 화합물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 화합물을 수득하는 방법 중 하나는 본 발명의 콘드로마이세스 균주 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 적합한 조건하에, 바람직하게는 본원에서 하기 기재한 발효 프로토콜을 이용하여 배양하는 것이다.
1개 이상의 염-형성 기를 갖는 본 발명의 화합물의 "염"은 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 산기를 갖는 본 발명의 화합물의 염은 예를 들어 상기 화합물을 금속 화합물, 예컨대 적합한 유기 카르복실산의 알칼리 금속 염, 예컨대 2-에틸헥산산의 나트륨 염으로 처리하거나, 유기 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 화합물, 예컨대 상응하는 수산화물, 탄산염 또는 탄산수소염, 예컨대 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 탄산나트륨 또는 탄산칼륨 또는 탄산수소나트륨 또는 탄산수소칼륨으로 처리하거나, 상응하는 칼슘 화합물로 처리하거나, 또는 암모니아 또는 적합한 유기 아민으로 처리하여 형성될 수 있으며, 염-형성 작용제는 화학량적 양 또는 단지 약간만 과량으로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 산 부가염은 통상적인 방식으로 수득되며, 예를 들어 상기 화합물을 산 또는 적합한 음이온 교환 시약으로 처리하여 수득된다. 산 및 염기성 염-형성 기, 예를 들어 유리 카르복시기 및 유리 아미노기를 함유하는 본 발명의 화합물의 내부 염은 예를 들어 염, 예컨대 산 부가염을 예를 들어 약 염기를 사용하여 등전점으로 중화시키거나, 또는 이온 교환제로 처리하여 형성될 수 있다.
염은 통상적인 방식으로 유리 화합물로 전환될 수 있고, 금속 염 및 암모늄염은 예를 들어 적합한 산으로 처리하여 전환될 수 있으며, 산 부가염은 예를 들어 적합한 염기성 작용제로 처리하여 전환될 수 있다.
본 발명에 따라 수득가능한 이성질체들의 혼합물은 공지된 방식으로 개개의 이성질체로 분리될 수 있다 - 부분입체이성질체는 예를 들어 다상 용매 혼합물 사이의 분배, 재결정화 및/또는 크로마토그래피 분리, 예를 들어 실리카겔에서의 크로마토그래피 분리, 또는 예를 들어 역상 컬럼에서의 중압 액체 크로마토그래피로 분리될 수 있으며, 라세미체는 예를 들어 광학적으로 순수한 염-형성 시약을 사용하여 염을 형성하고, 이로써 수득가능한 부분입체이성질체들의 혼합물을 예를 들어 분별 결정화를 이용하거나 광학 활성 컬럼 물질에서의 크로마토그래피를 이용하여 분리함으로써 분리될 수 있다.
중간체 및 최종 생성물은 예를 들어 크로마토그래피 방법, 분배 방법, (재)결정화 등을 이용한 표준 방법에 따라 후처리 및/또는 정제될 수 있다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드는 카이모트립신-유사 프로테아제를 억제할 수 있다. 카이모트립신-유사 프로테아제의 예는 엘라스타제 및 칼리크레인 7이다. 특히, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드는 칼리크레인 7의 우수한 억제제이다.
"억제제"는 효소 반응을 IC50 측정치 100 μM 미만, 예를 들어 50 μM, 30 μM, 20 μM 또는 10 μM로 억제하는 시클릭 뎁시펩티드이다. 특히 바람직한 것은 인간 칼리크레인 7에 대한 IC50이 30 μM 미만인 시클릭 뎁시펩티드, 예를 들어 IC50이 10 μM 미만, 1 μM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만 또는 그보다 더 낮은 값 미만인 시클릭 뎁시펩티드이다. 예를 들어, 실시예 5, 19 및 33의 화합물은 IC50 값을 각각 0.009 μM, 0.007 μM, 0.005 μM로 나타냈다. 인간 칼리크레인에 대한 IC50은 바이오신탄(Biosyntan) (독일 베를린 소재)에서 구입할 수 있는 형광-켄칭(quenching) 기질
Figure pat00031
(여기서, ^는 분리가능한 결합을 나타내고, MS 분석으로 확인됨)을 사용하여 결정할 수 있다. 효소 반응은 150 mM NaCl 및 0.05％ (w/v) CHAPS를 함유하는 pH 5.6의 50 mM 시트르산나트륨 완충제 중에서 수행하였다. IC50 값을 결정하기 위한 검정은 실온에서 384웰 플레이트에서 수행하였다. 모든 최종 검정 부피는 30 ㎕였다. 시험 화합물을 90％ (v/v) DMSO/물 중에 용해하고, 물 (0.05％ (w/v) CHAPS를 함유함) 중에서 원하는 검정 농도의 3배로 희석하였다. 11가지 최종 화합물 농도는 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μM, 3 μM, 10 μM 및 30 μM이었다. 각각의 검정시에, 물/CHAPS (± 시험 화합물) 10 ㎕를 웰마다 첨가한 후에 프로테아제 용액 (1.5× 검정 완충제로 희석함) 10 ㎕를 첨가하였다. 최종 검정 용액 중의 프로테아제 농도는 0.2 nM (브래드포드(Bradford) 방법으로 측정한 효소 농도)이었다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 기질 용액 10 ㎕ (1.5× 검정 완충제 중에 용해한 기질. 최종 농도는 2 μM이었음)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 상기 화합물이 효소 활성에 미치는 효과는 선형 진전 곡선(progress curve)으로부터 구하였고, 2개의 판독치로부터 결정하였는데, 하나는 기질 첨가 후에 바로 (t = 0분) 측정한 것이었고, 다른 하나는 1시간 후 (t = 60분)에 측정한 것이었다. IC50 값은 비-선형 회귀 분석 소프트웨어 (XLfit, 버전 4.0; 아이디 비지니스 솔루션 리미티드(ID Business Solution Ltd.), 영국 서레이 길드포드 소재)를 사용하여 억제율(％) vs. 억제제 농도의 플롯으로부터 계산하였다.
따라서, 상기 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 "질환" 및 "장애"는 카이모트립신-유사 프로테아제와 관련이 있다고 공지된 질환이다. 더욱 바람직한 것은 엘라스타제 또는 칼리크레인 7 활성과 관련이 있다고 공지된 질환이다. 동일하게 바람직한 것은 인간 호중구 엘라스타제와 관련이 있다고 공지된 질환이다. 따라서, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 질환 및 장애는 동통, 급성 염증, 만성 염증, 관절염, 염증이 생긴 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 연소성 류마티스성 관절염, 패혈성 관절염, 근섬유통(fibromyalgia), 전신성 홍반성 루푸스, 정맥염, 건염, 발진, 건선, 여드름, 습진, 안면 지루성 습진, 손, 얼굴 또는 목의 습진, 포피 감염, 무좀, 누관(fistula) 감염, 감염된 국소 궤양, 신생아의 배꼽 감염, 주름, 반흔, 켈로이드, 종기, 사마귀 및 알레르기성 가려움증, 치질, 창상, 창상 감염, 화상으로 인한 창상, 진균 감염 및 면역학적 장애, 예컨대 자가면역 질환을 포함한다. 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 바람직한 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환 (예를 들어, 폐 기종 및 만성 기관지염), 만성 및 급성 간질성 폐렴, 특발성 간질성 폐렴 (IIP), 미만성 범세기관지염, 낭성 폐 섬유증, 급성 폐 손상 (ALI)/급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 기관지확장증, 천식, 췌장염, 신장염, 간염 (간부전), 만성 류마티스성 관절염, 아테롬성동맥경화증, 골관절염, 건선, 치주 질환, 아테롬성 동맥경화증, 장기 이식 거부, 허혈/재관류에 의해 야기되는 조직 손상, 쇼크, 패혈증, 혈액 응고장애, 예컨대 파종성 혈관내 응고 (DIC) 및 심정맥-혈전증, 결막염, 각막염, 각막 궤양, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스를 포함한다. 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 더욱 바람직한 질환 및 장애는 "상피 기능이상" 또는 "상피 질환", 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 크론병, 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드는 암, 특히 난소암을 치료하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 바람직하게 치료되거나 예방될 수 있는 질환 및 장애는 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암, 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선 및 천식을 포함한다.
따라서, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 더욱 바람직하게 치료되거나 예방될 수 있는 질환 및 장애는 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암을 포함한다.
따라서, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 동일하게 바람직하게 치료되거나 예방될 수 있는 질환 및 장애는 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 기관지염, 유전성 기종, 류마티스성 관절염, IBD, 건선, 천식을 포함한다.
본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 사용하여 훨씬 더욱 바람직하게 치료되거나 예방될 수 있는 질환 및 장애는 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증, 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부를 포함한다.
인간 칼리크레인 7 (hK7)은 인간 피부에 위치하여 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소이다. 이것은 처음에는 각질층 카이모트립신분해 효소 (SCCE)로 기재되었고, 각질층의 단백질 (예를 들어, 코르네오데스모신 및 플라코글로빈)을 절단하여 각질층을 박리하는데 소정의 역할을 할 수 있다. 각질층은 표피의 장벽-형성 최외층이고, 고도로 조직화된 지질로 둘러싸인 각질화 상피 세포로 구성된다. 이것은 표피 분화에 의해 연속적으로 형성되며, 정상적인 표피에서는 각질세포의 증식과 박리 사이의 균형에 의해 각질층이 일정 두께로 유지된다. 염증성 피부 질환에서 SCCE의 발현 증대는 병인학적 유의성을 가질 수 있다 [Hansson, et al. (2002)]. 표피 각질세포에서 인간 칼리크레인 7을 발현하는 트랜스제닉 마우스에서는 표피 두께의 증가, 각화과다증, 피부 염증 및 중증 소양증을 수반하는 병리적 피부 변화가 발생하는 것으로 밝혀졌다. 각질층 카이모트립신분해 효소 유전자의 3'UTR에서의 4 bp (AACC) 삽입과 아토피성 피부염 사이의 유전적 관련성이 보고된 바 있으며 [Vasilopoulos, et al. (2004)], 상기 효소가 아토피성 피부염의 발생에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 아토피성 피부염은 피부 장벽이 손상된 질환으로, 15％ 내지 20％의 아동에서 발생한다.
칼리크레인 7은 카이모트립신-유사 활성을 나타내는 칼리크레인 유전자 과의 S1 세린 프로테아제이다. 인간 칼리크레인 7 (hK7, KLK7 또는 각질층 카이모트립신분해 효소 (SCCE), 스위스프로트 P49862)은 피부 생리에서 중요한 역할을 한다 (1, 2, 3). 이것은 주로 피부에서 발현되며, 피부 생리에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. hK7은 박리 과정에서 각질화된 편평 상피의 세포간 점착성 구조를 분해하는데 관여한다. 박리 과정은 철저하게 조절되며, 각화세포의 드 노보 생성과 정교하게 균형을 이뤄서 피부 장벽 기능에 중대하게 관여하는 피부 최외층인 각질층을 일정 두께로 유지한다. 이와 관련하여, hK7은 각질결합 단백질인 코르네오데스모신 및 데스모콜린 1을 절단할 수 있는 것으로 보고되었다 (4, 5, 6). 박리에는 상기 2종의 각질결합체 둘다의 분해가 필요하다. 또한, 아주 최근에는, 2종의 지질 프로세싱 효소인 β-글루코세레브로시다제 및 산성 스핑고마이엘리나제가 hK7에 의해 분해될 수 있는 것으로 나타났다 (7). 상기 2종의 지질 프로세싱 효소 모두가 이것들의 기질인 글루코실세라미드 및 스핑고마이엘린과 동시 분비되며, 이들 극성 지질 전구체를 그의 보다 비-극성의 생성물, 예를 들어 세라미드로 프로세싱하고, 이것은 이후에 세포외 층판상 막으로 혼입된다. 상기 층판상 막 구조물은 기능적 피부 장벽에 중대하다. 마지막으로, hK7은 인터류킨-1β (IL-1β) 전구체를 그의 활성 형태로 시험관내 활성화시키는 것으로 나타난 바 있다 (8). 각질세포는 IL-1β를 발현하긴 하지만 이것이 특이적 IL-1β 전환 효소 (ICE 또는 카스파제 1)의 활성 형태가 아니기 때문에, 인간 표피에서의 IL-1β 활성화는 또다른 프로테아제, 잠재적인 후보로는 hK7을 통해 일어난다고 제안되었다.
최근의 연구는 hK7의 활성 증가가 아토피성 피부염, 건선 또는 네테르톤 증후군과 같은 염증성 피부 질환과 관련이 있음을 알아냈다. 이것은 각질결합체의 분해가 제어되지 않게 하여 박리의 조절이상을 야기하거나, 지질 프로세싱 효소의 분해를 증진시켜 층판상 막 구조물을 불안정하게 하거나, 염증전 사이토킨 IL-1β의 활성화를 제어되지 않게 할 수 있다. 이로 인한 순 결과는 피부 장벽 기능의 손상 및 염증이다 (또한, WO-A-2004/108139 참조).
hK7 활성이 여러 수준에서 제어된다는 사실 때문에, 다양한 인자가 염증성 피부 질환에서의 증가된 hK7 활성에 원인이 될 수 있다. 첫째, 상기 프로테아제의 발현량이 유전적 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 유전적 관련성으로서 hK7 유전자 3'-UTR에서의 다형성이 최근 기재되었다 (9). 상기 문헌의 저자들은 칼리크레인 7 유전자의 3'-UTR에서 상기 문헌에 기재된 4개의 염기 쌍 삽입이 hK7 mRNA를 안정화시켜서 hK7의 과발현을 야기한다는 가설을 세웠다. 둘째, hK7은 층판 소체를 통해 각질층 세포외 공간에 효소원으로 분비되는데, 이것이 자가활성화될 수 없기 때문에 또다른 프로테아제, 예를 들어 hK5에 의한 활성화가 필요하다 (5). 이러한 활성화 효소의 활성이 제어되지 않아서 hK7의 과다활성화가 야기될 수 있다. 셋째, 활성화된 hK7은 LEKTI, ALP 또는 엘라핀과 같은 천연 억제제에 의해 억제될 수 있다 (10, 11). 이러한 억제제의 발현 감소 또는 결핍이 hK7의 활성 증진을 야기할 수 있다. 최근, LEKTI를 코딩하는 spink5 유전자에서의 돌연변이가 네테르톤 증후군의 원인이고 (12), 상기 유전자에서의 단일 점 돌연변이가 아토피성 피부염과 관련이 있다는 것이 밝혀졌다 (13, 14). 마지막으로, hK7의 활성을 제어하는 또다른 수준은 pH이다. hK7은 중성 내지 약간의 알칼리성 pH에서 최적의 활성을 가지며 (2), 피부의 최내층에서 최외층으로 중성에서 산성의 pH 구배를 갖는다. 비누와 같은 환경적 인자는 각질층의 최외층에서 hK7에 최적인 pH로의 pH 증가를 야기하여 hK7 활성을 증가시킬 수 있다.
hK7의 활성 증가는 염증성 및 과증식성 피부 질환을 비롯하여 피부 장벽 손상을 갖는 피부 질환과 관련이 있다. 첫째, 네테르톤 증후군 환자는 세린 프로테아제 활성에서의 표현형-의존적 증가, 각질결합체의 감소, 지질 프로세싱 효소인 β-글루코세레브로시다제 및 산성 스핑고마이엘리나제의 감소, 및 장벽 기능의 손상을 나타낸다 (15, 16). 둘째, 인간 칼리크레인 7을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 아토피성 피부염 환자에서와 유사한 피부 표현형을 나타낸다 (17, 18, 19). 셋째, 아토피성 피부염 및 건선 환자의 피부에서 hK7의 수준이 증가된 것으로 기재되었다 (17, 20). 추가로, K7의 활성 증가 및 그로 인한 상피 장벽 기능이상은 또한 다른 상피 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 크론병의 병리에 중요한 역할을 할 수 있다.
따라서, hK7은 상피 기능이상과 관련이 있는 질환, 예컨대 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암의 치료를 위한 잠재적인 표적으로 간주되며, 그에 대한 특이적 조절제 (효능제 또는 억제제)가 요구된다.
인간 호중구 엘라스타제 (HNE, 또한, 인간 백혈구 엘라스타제, HLE라고도 공지되어 있음)는 세린 프로테이나제의 카이모트립신 과에 속한다. 이것의 촉매 활성은 대략 pH 7에서 최적이고, 촉매 부위는 3개의 수소 결합된 아미노산 잔기 His57, Asp102 및 Ser195 (카이모트립신 번호매김에 따름)로 구성되며, 이것들이 소위 촉매 삼련구조를 형성한다. 상기 효소는 218개의 아미노산 잔기 및 4개의 디술피드 브릿지의 단일 펩티드 쇄로 구성된다. 이것은 다른 엘라스틴분해성 또는 비-엘라스틴분해성 세린 프로테이나제와 30％ 내지 40％의 서열 동일성을 나타낸다. HNE는 P1 위치에서 Val을 갖는 산화된 인슐린 B 쇄를 우선적으로 절단하지만, P1 위치에서 Ala, Ser 또는 Cys를 갖는 결합을 가수분해하기도 한다.
HNE는 다형핵 백혈구 (PMNL)의 아주르친화성 과립에 위치하며, 여기서의 HNE 농도는 상당히 높다 (세포 106개 당 효소 3 ㎍). 주요 생리 기능은 박테리아 및 면역 복합체를 소화하고, 숙주 방어 과정에 참여하는 것이다. HNE는 주화성 인자에 대한 반응에서 호중구가 혈액으로부터 다양한 조직, 예컨대 기도로 이동하는 것을 돕는다. HNE는 또한 창상 치유, 조직 복구, 및 PMNL의 세포자멸에도 참여한다.
HNE는 엘라스틴 (폐 결합 조직, 동맥, 피부 및 인대의 고도로 유연하고 고도로 소수성인 성분)에 추가하여 여러가지 유형의 콜라겐, 막 단백질 및 연골 프로테오글리칸을 비롯하여 중요한 생물학적 기능을 갖는 수많은 단백질을 절단한다. HNE는 또한 프로콜라게나제, 프로스트로멜리신 및 프로젤라티나제를 활성화시켜서 세포외 매트릭스 단백질의 파괴를 간접적으로 보조한다. HNE는 수많은 내인성 프로테이나제 억제제, 예컨대 α2-안티플라스민, α1-안티카이모트립신, 항-트롬빈, 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제를 불활성화시킨다.
세포외 엘라스타제 활성은 폐 시스템에서 하부 기도를 엘라스틴용해 손상으로부터 보호하는 것을 담당하는 α1-프로테아제 억제제 (α1PI)에 의해 치밀하게 제어되지만, 분비형 백혈구 프로테이나제 억제제는 주로 상부 기도를 보호한다. 수많은 폐 병태생리 상태, 예를 들어 폐 기종, 만성 기관지염 및 낭성 섬유증에서는 내인성 엘라스타제 억제제가 HNE 활성을 조절하는데 비효율적이다.
HNE는 염증 질환, 예컨대 폐 기종, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 고혈압, 및 다른 염증 질환 및 또한 조산아에서의 기관지폐 형성장애와 관련이 있는 조직 손상의 1차적인 근원이라고 여겨진다. HNE는, 기도 염증 질환과 일반적으로 관련이 있는 증가되고 비정상적인 기도 분비의 발병기전에 관여한다. 따라서, 만성 기관지염 및 낭성 섬유증 환자로부터의 기관지폐포 세척 (BAL)액에서는 HNE 활성이 증가되어 있다. 추가로, 과도한 엘라스타제는 이러한 만성 염증 질환 뿐만이 아니라 급성 염증 질환, 예컨대 ARDS 및 패혈성 쇼크에도 기여한다고 제안된 바 있다.
따라서, HNE는 HNE 활성이 관여하는 질환, 예를 들어 염증 질환, 예컨대 폐 기종, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 고혈압, 및 다른 염증 질환 및 또한 조산아에서의 기관지폐 형성장애, 및 증가되고 비정상적인 기도 분비를 수반하는 질환 및 또한 급성 염증 질환의 치료를 위한 잠재적인 표적으로 간주된다. 따라서, HNE의 특이적 조절제 (효능제 또는 억제제)가 요구된다.
치료는 예컨대 크림제, 연고제 및 좌제로의 국소 또는 전신 적용, 또는 경구 또는 sc 또는 iv 적용 또는 흡입 각각에 의해 당업계에 공지된 방식으로 이루어질 수 있다.
한 측면에서, 본 발명에 따른 뎁시펩티드는 2007년 4월 24일자로 DSMZ에 기탁된 콘드로마이세스 크로카투스 균주 (DSM 19329)를 배양하여 수득되거나, 또는 2007년 4월 24일자로 DSMZ에 기탁된 콘드로마이세스 로부스투스 균주 (DSM 19330)를 배양하여 수득되거나, 또는 2008년 6월 23일자로 DSMZ에 기탁된 콘드로마이세스 아피쿨라투스 균주 (DSM 21595)를 배양하여 수득된다.
균주의 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 이루어졌다. 기탁된 균주는 취소가 불가능할 것이고, 특허 허여시에는 제한이나 조건 없이 공개적으로 이용될 것이다. 기탁된 균주는 당업자에게 단지 편의상 제공되는 것이며, 기탁물이 있어야 가능하다는 것을 인정하는 것은 아니다.
본 발명이 특정 균주인 콘드로마이세스 크로카투스 및 콘드로마이세스 로부스투스 및 콘드로마이세스 아피쿨라투스의 배양으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 오히려, 본 발명은 뎁시펩티드를 생산할 수 있는 다른 유기체, 예컨대 X선 조사, 자외선 조사, 화학적 돌연변이유발원의 처리, 파지 노출, 항생제 선별 등과 같은 공지된 수단에 의해 상기 유기체로부터 유래될 수 있는, 상기 균주의 돌연변이체 또는 변이체의 배양을 고려한다.
본 발명의 뎁시펩티드는 다양한 미생물에 의해 생합성될 수 있다. 본 발명의 화합물을 합성할 수 있는 미생물은 믹소박테리아라고도 불리는 믹소콕칼레스 목의 박테리아를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 믹소박테리아 속에 속하는 구성원의 비-제한적인 예는 콘드로마이세스, 소르안기움(Sorangium), 폴리안기움(Polyangium), 비소파가(Byssophaga), 하플로안기움(Haploangium), 야니아(Jahnia), 난노시스티스(Nannocystis), 코플레리아(Koffleria), 믹소콕쿠스(Myxococcus), 코랄로콕쿠스(Corallococcus), 시스토박터(Cystobacter), 아르크안기움(Archangium), 스티그마텔라(Stigmatella), 히알란기움(Hyalangium), 멜리탄기움(Melittangium), 픽시콕쿠스(Pyxicoccus)를 포함한다. 믹소박테리아의 분류는 복잡하고, 문헌 [Garrity GM, Bell JY, Lilburn TG (2004) Taxonomic outline of the prokaryotes, Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition, release 5.0 May 2004] (http://141.150.157.80/bergeysoutline/main.htm)을 참조한다.
화학식 I 내지 XVII의 화합물은 콘드로마이세스 크로카투스 또는 콘드로마이세스 로부스투스 또는 콘드로마이세스 아피쿨라투스 배양물을 접종한 적합한 배지를 제어된 조건하에 호기성 발효시켜 생산된다. 적합한 배지는 바람직하게는 수성이고, 흡수가능한 탄소, 질소 및 무기 염의 공급원을 함유한다.
적합한 배지는 실시예 1 및 2에서 하기 언급한 성장 배지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 발효는 약 10℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 약 3일 내지 약 20일 동안 수행한다. 그러나, 최적의 결과를 위해서는 발효를 약 30℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 발효 동안에 영양 배지의 pH는 약 6.0 내지 약 9.0일 수 있다.
뎁시펩티드-생산 미생물을 접종한 배양 배지는 예를 들어 회전 진탕기 또는 교반되는 탱크 발효기를 사용하여 호기성 조건하에 인큐베이션할 수 있다. 통기는 인큐베이션 동안에 공기, 산소 또는 적절한 기체 혼합물을 접종된 배양 배지로 주입하여 달성될 수 있다. 충분한 양의 뎁시펩티드 화합물이 축적되는 즉시, 통상적이고 일반적인 방식, 예를 들어 추출 및 크로마토그래피 방법, 침전 또는 결정화, 및/또는 본원에 개시한 방식으로 이것들을 농축시키고 배양액으로부터 단리할 수 있다. 추출의 예로서, 상기 배양물을 적합한 유기 용매, 예컨대 n-부탄올, 에틸 아세테이트, 시클로헥산, n-헥산, 톨루엔, n-부틸 아세테이트 또는 4-메틸-2-펜타논과 혼합하여 교반할 수 있고, 유기 층 중의 뎁시펩티드 화합물을 감압하의 용매 제거로 회수할 수 있다. 생성된 잔류물은 예를 들어 물, 에탄올, 메탄올 또는 이것들의 혼합물을 사용하여 임의로 재구성하고, 적합한 유기 용매, 예컨대 헥산, 사염화탄소, 디클로로메탄 또는 이것들의 혼합물로 재추출할 수 있다. 용매 제거 후에, 상기 화합물을 예를 들어 크로마토그래피 방법을 통해 추가로 정제할 수 있다. 크로마토그래피의 예로서, 유기 용출 용매 또는 이것들의 혼합물, 예를 들어 에테르, 케톤, 에스테르, 할로겐화 탄화수소 또는 알콜을 사용한 정지 상, 예컨대 실리카겔 또는 알루미나 옥시드를 적용할 수도 있고, 또는 다양한 관능기를 갖는 변형된 실리카겔에서의 역상 크로마토그래피를 사용하고 유기 용매 또는 이것들의 수성 혼합물, 예컨대 아세토니트릴, 메탄올 또는 테트라히드로푸란 (여러 pH)으로 용출시킬 수도 있다. 또다른 예는 예를 들어 고체-액체 또는 액체-액체 방식의 분배-크로마토그래피이다. 또한, 예를 들어 세파덱스(Sephadex) LH-20 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 사용하고 상이한 용매, 바람직하게는 알콜로 용출시키는 크기 배제 크로마토그래피를 적용할 수도 있다.
본 분야에서 통상적인 바와 같이, 생산 및 또한 회수 및 정제 과정은 다양한 분석 방법, 예를 들어 생물학적 검정, TLC, HPLC 또는 이것들의 조합을 이용하고, 상이한 검출 방법, TLC의 경우에는 전형적으로 UV 광, 요오드 증기 또는 착색 시약을 분무하거나, HPLC의 경우에는 전형적으로 UV 광, 질량 감응성 또는 광 산란 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, HPLC 기술은 관능화된 실리카겔을 갖는 역상 컬럼을 사용하고, 특정 pH의 극성 수혼화성 용매 및 물의 선형 구배 혼합물인 용출액을 적용하고, 여러가지 파장의 UV 광 및 질량 감응성 검출기를 사용한 검출 방법을 이용하는 것으로 대표된다.
미생물에 의해 생합성된 뎁시펩티드는 경우에 따라 무작위로 및/또는 특정하게 화학적 변형시켜서 유도체 또는 구조적 유사체인 화합물을 형성할 수 있다. 유사한 기능적 활성을 갖는 이러한 유도체 또는 구조적 유사체는 본 발명의 범위에 포함된다. 뎁시펩티드는 당업계에 공지되고 본원에 기재한 방법을 이용하여 임의로 변형될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 뎁시펩티드의 유도체는 화학식
Figure pat00032
의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화로 제조될 수 있으며, 이것은
a) A4가
Figure pat00033
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -30℃ 내지 실온의 온도에서 용매, 예를 들어 디클로로메탄, THF 중에서 또는 용매 없이 유기산 또는 무기산, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 황산, 염산, 또는 루이스산, 예를 들어 삼불화붕소 에테레이트로 처리하여 A4가
Figure pat00034
인 상기 화합물을 제조하거나,
b) A4가
Figure pat00035
인 화합물을 -50℃ 내지 100℃의 온도, 바람직하게는 실온의 온도에서 용매, 예를 들어 2-프로판올 중에서 촉매, 예를 들어 팔라듐의 존재하에 수소 분자 또는 그의 공급원, 예를 들어 시클로헥센, 포름산암모늄으로 처리하여 A4가
Figure pat00036
인 상기 화합물을 제조하거나,
c) A4가
Figure pat00037
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -50℃ 내지 실온의 온도에서 용매, 예를 들어 디클로로메탄, THF 중에서 또는 용매 없이 환원제, 예를 들어 트리에틸실란의 존재하에 유기산 또는 무기산, 예를 들어 황산, 염산, 또는 루이스산, 예를 들어 삼불화붕소 에테레이트로 처리하여 A4가
Figure pat00038
인 상기 화합물을 제조하거나,
d) A4가
Figure pat00039
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -30℃ 내지 50℃의 온도에서 용매, 예를 들어 치환된 알칸올, 치환되지 않은 알칸올, THF, 디클로로메탄, 바람직하게는 치환된 알칸올, 치환되지 않은 알칸올 중에서 또는 용매 없이 치환되거나 치환되지 않은 알칸올 및 유기산 또는 무기산, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 황산, 염산, 또는 루이스산, 예를 들어 금속 염으로 처리하여 A4가
Figure pat00040
인 상기 화합물을 제조하거나,
e) A1이 Gln 또는 Asn이고, A4가
Figure pat00041
(여기서, R은 바람직하게는 H, 알킬, 치환된 알킬임)인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -30℃ 내지 실온의 온도에서 용매, 예를 들어 치환된 알칸올, 치환되지 않은 알칸올, THF, 디클로로메탄, 바람직하게는 치환된 알칸올, 치환되지 않은 알칸올 중에서 또는 용매 없이 치환되거나 치환되지 않은 알칸올 및 유기산 또는 무기산, 예를 들어 트리플루오로아세트산, 황산, 염산, 또는 루이스산, 예를 들어 삼불화붕소 에테레이트로 처리하여 A1이
Figure pat00042
(여기서, n = 1, 2)이고, A4가
Figure pat00043
(여기서, R은 바람직하게는 H, 알킬, 치환된 알킬임)인 상기 화합물을 제조하거나,
f) A1이 Gln 또는 Asn이고, A4가
Figure pat00044
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -30℃ 내지 실온의 온도에서 용매, 예를 들어 디클로로메탄 중에서 또는 용매 없이 염기, 예를 들어 디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재하에 탈수제, 예를 들어 트리플루오로아세트산 무수물로 처리하여 A1이
Figure pat00045
(여기서, n = 1, 2)이고, A4가
Figure pat00046
(여기서, R은 바람직하게는 H, OH, O-알킬, 치환된 O-알킬, O-아실임)인 상기 화합물을 제조하거나, 또는
g) A4가
Figure pat00047
이고, A6이 Tyr인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도, 바람직하게는 -30℃ 내지 실온의 온도에서 바람직하게는 초음파로 촉진되어 용매, 예를 들어 DMF 중에서 또는 용매 없이 염기, 예를 들어 탄산나트륨의 존재하에 알킬화제, 예를 들어 메틸 요오다이드, 벤질 브로마이드, 프로파르길 브로마이드, 또는 아실화제, 예를 들어 에틸 클로로포르메이트 또는 알킬 또는 아릴 이소시아네이트로 처리하여 A4가
Figure pat00048
이고, A6이
Figure pat00049
(여기서, R은 바람직하게는 알킬, 치환된 알킬, 아실, 알콕시카르보닐임)인 상기 화합물을 제조하는 것
을 포함한다.
달리 언급하지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위에서 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건, IC50 등을 표현하는데 사용된 모든 수치는 모든 경우에 용어 "약"으로 변형될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 경우에는, 본 명세서 및 첨부한 특허청구범위에 기재한 수치적 파라미터는 근사치이다. 최소한, 각각의 수치적 파라미터는 적어도 유의한 도면 번호 및 통상의 관련 기술을 적용하여 고려되어야 하며, 이것은 특허청구범위와 동등한 원리의 적용을 제한하려는 시도가 아니다. 본 발명의 넓은 범위를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치이긴 하지만, 실시예, 표 및 도면에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고하였다. 임의의 수치 값은 본래가 실험, 시험 측정치, 통계적 분석 등에서의 변동으로 인한 특정 오차를 함유할 수 있다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 학술적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재한 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 모순되는 점이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서의 내용이 우선할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 화합물의 생산
실시예 1.1: 화학식 II 내지 VII , XI 내지 XIV 및 XVII 의 화합물의 생산
균주: 콘드로마이세스 크로카투스 균주는 본 실험실에 있는 환경적 샘플인 호두 나무의 썩은 목재로부터 단리하였다.
상기 균주는 자실체의 형태 및 또한 16S-RNA 유전자의 부분 서열을 기초로 할 때 콘드로마이세스 크로카투스인 것으로 명확하게 확인되었다. 콘드로마이세스 크로카투스는 DSMZ에 의해 생물학적 위험군 1로 배정되었다 (DSMZ (2007)). 콘드로마이세스는 폴리안기아세아에 과의 속이고, 델타-프로테오박테리아에 속하는 믹소콕칼레스 목에 속한다. 믹소박테리아라고도 불리는 믹소콕칼레스 목의 박테리아는 대부분의 다른 박테리아 구별되는 2가지 특징을 갖는 그람-음성 막대형 박테리아이다. 이것들은 활성 활주 메카니즘을 이용하여 고체 표면에서 군집하고, 기아시에는 응집하여 자실체를 형성한다 [Kaiser (2003)].
본 발명의 콘드로마이세스 크로카투스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 19329로 기탁되었다.
본 발명의 콘드로마이세스 크로카투스 균주는 순수한 배양물로서는 생존할 수 없고, 동반 균주(companion strain) 없이 유지될 수 없다. 동반 균주는 한천 플레이트 (LB 배지)상의 발효 공동 배양물의 분취액을 스트리킹(streaking)하여 수득될 수 있고 순수한 배양물로서 유지될 수 있다. 라이쉔바하(Reichenbach) 군에서도 유사하게 관찰되었다 ([Jacobi, et al. (1996)] 및 [Jacobi, et al. (1997)]). 본 발명의 콘드로마이세스 크로카투스의 동반 균주의 16S-rRNA 유전자의 부분 DNA 서열을 기초로 할 때, 가장 밀접하게 매치되는 것은 알파-프로테오박테리아에 속하는 리조비알레스(Rhizobiales) 목의 보세아 티오옥시단스(Bosea thiooxidans)였다. 조사한 424 bp 서열 단편 16S-rRNA는 진뱅크(genebank)의 서열 AF508112 (보세아 티오옥시단스)과 약 98％ 동일성 (적어도 8개의 뉴클레오티드 교환)을 갖는다. 보세아 티오옥시단스는 인도 콜카타(Calcutta) 부근의 여러 농지로부터 수집한 토양 샘플에서 단리되었다. 이것은 환원된 무기 황 화합물을 일부 유기 기질의 존재하에 산화시킬 수 있고, 1996년도에 신규한 종 및 신규한 속으로 기재되었다 [Das, et al. (1996)]. 모든 5종의 기재된 보세아 종의 부분 16S-RNA 서열로부터 유도된 계통수는 콘드로마이세스 크로카투스로부터 단리된 보세아 동반 균주가 떨어진 위치에 있음을 나타낸다.
배양: 100 L 발효기 배양을 하기하는 프로토콜에 따라 수행하였다:
배플이 장착된(baffled) 200 mL 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 (문헌 [Bode et al. 2003]에 따름, 표 6 참조) 50 mL에 본 발명의 콘드로마이세스 크로카투스 균주의 액체 배양물로부터 5 mL (= 10％)를 접종하여 예비-배양을 시작하였다. 30℃ 및 120 rpm의 회전 진탕기에서 11일 동안 인큐베이션한 후에, 배플이 장착된 500 mL 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 100 mL 5개에 상기 예비-배양물로부터 각각 10 mL (= 10％)씩을 접종하여 첫번째 중간 배양을 시작하였다. 30℃ 및 120 rpm의 회전 진탕기에서 7일 동안 인큐베이션한 후에, 배플이 장착되지 않은 2-L 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 500 mL 19개에 상기 첫번째 중간 배양물로부터 각각 25 mL (= 5％)씩을 접종하여 두번째 중간 배양을 시작하였다. 30℃ 및 150 rpm의 회전 진탕기에서 6일 동안 인큐베이션한 후에, 생산 배지 POL1 100 리터에 상기 두번째 중간 배양물 전체 (9.5 리터 = 9.5％)를 접종하였다 (문헌 [Kunze et al. 1995]에 따름, 표 7 참조).
이러한 100-L 주 배양은 100-L 스케일의 강철 탱크 발효기에서 수행하였다. 온도는 30℃로 제어하였고, 통기율은 20 L/분 (= 0.2 vvm)이었으며, 교반 속도는 50 rpm이었다. 발효기 용기 내부에는 0.5 bar의 약간 과한 압력을 유지하였다. 배양물의 pH는 3 N H2SO4 또는 3 N NaOH의 첨가를 제어하여 6.9 내지 7.1로 유지하였다. 약 1일의 대수기 이후에는 산소 소모량이 약 4일 동안 가속화되어, 배양물의 지수 성장을 나타냈다. 마지막 2일 동안에는 산소 소모량이 약간 감소되어, 배양물이 정지기임을 나타냈다. 7일 후에 상기 배양물을 수확하였고, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 역가는 5.3 mg/L였다.
추출: 상기 전체 발효 브로쓰를 1시간 동안 1600 L 강철 용기로 옮겨 경사분리하였다. 종이 필터를 통한 여과에 의해 바닥 분획물로부터 습윤 세포 펠렛 (200 g)을 수확하였다. 상기 세포 펠렛을 30분 동안 균질화하여 3회 추출하였고, 이때 각각 에틸 아세테이트 10 L씩을 사용하였다. 이어서, 잔류 물을 용매 상으로부터 분리하였다. 상기 용매 상을 물 5 L로 세척한 후에 증발시켜서, '세포 추출물'이라 지칭되는 건조 추출물을 수득하였다. 배양물 여액을 에틸 아세테이트 200 L로 추출하였다. 1시간의 균질화를 포함하는 2시간의 접촉 시간 후에 유기상을 분리하여 물 20 L로 세척하고 마지막으로는 증발시켜서, '배양물 여액 추출물'이라 지칭되는 건조 추출물을 수득하였다.
화합물 단리: 상기 배양물 여액 추출물 (4.4 g)을 메탄올 80 mL 중에 용해하였다. 불용성 성분들은 원심분리로 제거하고, 상등액을 건조될 때까지 증발시켜서 추출물 3.3 g을 수득하였다. 상기 추출물을 MeOH 7.5 mL, DMSO 3 mL 및 디클로로메탄 0.5 mL 중에 용해하고, 용매로서 0.01％ 포름산 (용매 A) 및 0.1％ 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (용매 B)을 사용한 역상 크로마토그래피 (워터스 선파이어(Waters Sunfire) RP18 10 ㎛, 30×150 mm)로 정제하였다. 유속은 50 mL/분이었다. 구배는 하기 표 1에 나타냈다. 상기 물질을 7회의 크로마토그래피 운행으로 정제하였다. 각각의 운행으로부터 수집한 분획물들을 HPLC로 분석하고, 본 발명에 따른 시클릭 뎁시펩티드를 함유하는 분획물들을 합하여 진공하에서 건조해질 때까지 증발시켰다. 크로마토그래피에 의해서, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드를 순도 >97％의 것 134 mg 및 순도 90％의 것 80 mg을 수득하였다.
Figure pat00050
Figure pat00051
세포 추출물 (6.67 g)을 디클로로메탄/메탄올 4:1 중에 용해하였다. 상기 용액을 여과하고, 여액을 규조류 (추출물 1 g 당 규조류 2 g, 이솔루트(Isolute)®, 영국 헨괴드 미드 글람 소재의 인터내셔널 소르벤트 테크놀로지 리미티드(International Sorbent Technology Ltd.))에 흡착시킨 후에 증발시켰다. 고체 잔류물을 사전 충전된 실리카겔 컬럼 (4×18 cm, 90 g 실리카겔 40-63)에 로딩하고, 시클로헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올의 구배로 용출시켰다. 상기 구배는 표 2에 나타냈고, 유속은 28 mL/분이었다. 28 mL 부피의 분획물들을 수집하였다. 상기 분획물들을 UV-추적에서 육안으로 확인된 피크에 따라 합하여, 12개의 분획물들 (A 내지 L)을 모았다. 뎁시펩티드를 함유하는 분획물들 (H 내지 J)을 역상 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 크로마토그래피 방법 및 후처리 절차는 배양물 여액에 대해 기재한 정제 방법과 동일하였다. 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 총 46.1 mg, 화학식 III에 따른 시클릭 뎁시펩티드 총 17.9 mg, 및 화학식 VI 및 VII에 따른 뎁시펩티드의 1:1 혼합물 총 6.1 mg을 단리하였다. 화합물 VI 및 VII의 구조 배정은 고해상도 MS 및 화합물 VI 및 VII의 혼합물의 1H-NMR 데이타와 화합물 II의 1H-NMR 데이타 비교를 기초로 하였다.
또한, 화학식 II에 따른 다른 시클릭 뎁시펩티드도 세포 추출물 중에 더 낮은 농도로 발견되었다. 이러한 다른 시클릭 뎁시펩티드는 화학식 IV, V 및 XI 내지 XV 및 XVII에 따른 화합물을 포함하였다.
화합물의 특징규명:
화학식 II의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00052
Figure pat00053
화학식 III의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00054
화학식 IV의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00055
화학식 V의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00056
화학식 XI의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00057
화학식 XII의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00058
화학식 XIII의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00059
화학식 XIV의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00060
화학식 XVII의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00061
1H NMR (600 MHz) d6-DMSO δH: δH: 화학적 이동이 배정되지 않음 (2종의 부분입체이성질체들의 혼합물. 다른 관련 화합물, 예를 들어 화합물 II와의 비교를 통해 구조를 배정함)
실시예 1.2: 화학식 VIII , IX , X의 화합물의 생산
균주: 콘드로마이세스 로부스투스 균주는 변 샘플로부터 단리하였다. 본 발명의 콘드로마이세스 로부스투스 균주는 자실체의 형태 및 또한 16S-RNA 유전자의 부분 서열을 기초로 할 때 콘드로마이세스 로부스투스인 것으로 확인되었다. 콘드로마이세스 로부스투스는 DSMZ에 의해 생물학적 위험군 1로 배정되었다 (DSMZ (2007)). 콘드로마이세스는 폴리안기아세아에 과의 속이고, 델타-프로테오박테리아에 속하는 믹소콕칼레스 목에 속한다. 믹소박테리아라고도 불리는 믹소콕칼레스 목의 박테리아는 대부분의 다른 박테리아 구별되는 2가지 특징을 갖는 그람-음성 막대형 박테리아이다. 이것들은 활성 활주 메카니즘을 이용하여 고체 표면에서 군집하고, 기아시에는 응집하여 자실체를 형성한다 [Kaiser (2003)].
본 발명의 콘드로마이세스 로부스투스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 19330으로 기탁되었다.
배양: 100 L 발효기 배양을 하기하는 프로토콜에 따라 수행하였다:
배플이 장착된 500 mL 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 (문헌 [Bode et al. 2003]에 따름) 100 mL 6개에 본 발명의 콘드로마이세스 로부스투스 균주의 액체 배양물로부터 각각 20 mL (= 20％)씩을 접종하여 예비-배양을 시작하였다. 30℃ 및 120 rpm의 회전 진탕기에서 1일 동안 인큐베이션한 후에, 배플이 장착된 2-L 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 400 mL 6개에 상기 예비-배양물로부터 각각 100 mL (= 25％)씩을 접종하여 첫번째 중간 배양을 시작하였다. 30℃ 및 120 rpm의 회전 진탕기에서 3일 동안 인큐베이션한 후에, 배지 MD1 15 리터를 함유하는 20-L 강철 탱크 발효기에 상기 첫번째 중간 배양물 3 리터 (= 20％)를 접종하여 두번째 중간 배양을 시작하였다. 온도는 30℃로 제어하였고, 통기율은 20 L/분 (= 1.0 vvm)이었으며, 교반 속도는 80 rpm이었다. 발효기 용기 내부에는 0.5 bar의 약간 과한 압력을 유지하였다. pH 제어는 없었지만, 배양물의 pH는 시작할 때의 pH 6.95에서 약간만 감소하여 제7일에는 pH 6.88이었다. 7일 후에, 생산 배지 POL1 (문헌 [Kunze et al. 1995]에 따름) 90 리터에 상기 두번째 중간 배양물 전체 (18 리터 = 20％)를 접종하였다 (출발 부피 = 108 리터). 이러한 주 배양은 100-L 스케일의 강철 탱크 발효기에서 수행하였다. 온도는 30℃로 제어하였고, 통기율은 30 L/분 (= 0.3 vvm)이었으며, 교반 속도는 시작할 때는 50 rpm이었고 4일 후에는 80 rpm이었다. 발효기 용기 내부에는 0.5 bar의 약간 과한 압력을 유지하였다. 배양물의 pH는 2 N H2SO4 또는 1.5 N NaOH의 첨가를 제어하여 6.8 내지 7.2로 유지하였다. 14일 후에 상기 배양물을 수확하였고, 역가는 3 mg/L였다.
추출: 상기 전체 발효 브로쓰를 1시간 동안 1600 L 강철 용기로 옮겨 경사분리하였다. 종이 필터를 통한 여과에 의해 바닥 분획물로부터 습윤 세포 펠렛 (약 200 g)을 수확하였다. 상기 세포 펠렛을 30분 동안 균질화하여 3회 추출하였고, 이때 각각 에틸 아세테이트 10 L씩을 사용하였다. 이어서, 잔류 물을 용매 상으로부터 분리하였다. 상기 용매 상을 물 5 L로 세척한 후에 증발시켜서, '세포 추출물'이라 지칭되는 건조 추출물 11.9 g을 수득하였다. 배양물 여액을 에틸 아세테이트 200 L로 추출하였다. 1시간의 균질화를 포함하는 2시간의 접촉 시간 후에 유기상을 분리하여 물 20 L로 세척하고 마지막으로는 증발시켜서, '배양물 여액 추출물'이라 지칭되는 건조 추출물 12.5 g을 수득하였다.
화합물 단리: 각각의 추출물 (균사체 및 배양물 여액으로부터의 추출물)을 디클로로메탄/메탄올 4:1 중에 용해하였다. 상기 용액을 여과하고, 여액을 규조류 (추출물 1 g 당 규조류 2 g, 이솔루트®, 영국 헨괴드 미드 글람 소재의 인터내셔널 소르벤트 테크놀로지 리미티드)에 흡착시킨 후에 증발시켰다. 고체 잔류물을 사전 충전된 실리카겔 컬럼 (4×18 cm, 100 g 실리카겔 40-63)에 로딩하고, 시클로헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올의 구배로 용출시켰다. 상기 구배는 하기 표 4에 나타냈고, 유속은 28 mL/분이었다. 28 mL 부피의 분획물들을 수집하였다. 상기 분획물들을 UV-추적에서 육안으로 확인된 피크에 따라 합하였다. 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 함유하는 분획물을 용매로서 0.01％ 포름산 (용매 A) 및 0.1％ 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (용매 B)을 사용한 역상 크로마토그래피 (워터스 선파이어 RP18 10 ㎛, 30×150 mm)로 추가로 정제하였다. 유속은 50 mL/분이었다. 구배는 하기 표 5에 나타냈다. 주입을 위해서, 상기 물질을 MeOH/DMSO 1:1 중에 용해하였다 (농도 200 mg/mL). 수집한 분획물들을 HPLC로 분석하고, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 함유하는 분획물들을 합하여 진공하에서 건조해질 때까지 증발시켰다. 상기 추출물을 크로마토그래피하여 화학식 VIII에 따른 순수한 (>97％) 시클릭 뎁시펩티드 52 mg을 수득하였다. 상기 합한 추출물로부터 화학식 VIII에 따른 순수한 시클릭 뎁시펩티드를 총 85 mg 단리할 수 있었다.
또한, 화학식 VIII에 따른 다른 시클릭 뎁시펩티드도 세포 추출물 중에 더 낮은 농도로 발견되었다. 이러한 다른 시클릭 뎁시펩티드는 화학식 IX 및 X에 따른 화합물을 포함하였다.
Figure pat00062
Figure pat00063
배지 (50 mM HEPES를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)
Figure pat00064
Figure pat00065
화합물의 특징규명:
화학식 VIII의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00066
Figure pat00067
화학식 IX의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00068
화학식 X의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00069
1H NMR (600 MHz) d6-DMSO δH: δH: 화학적 이동이 배정되지 않음 (회전이성질체들의 혼합물. NMR 데이타 (N-메틸기가 없는 것)를 화합물 IX의 NMR 데이타와 비교한 것을 기초로 하여 구조를 배정함)
실시예 1.3: 화학식의 화합물 XV 및 XVI 의 생산
균주: 콘드로마이세스 아피쿨라투스 균주는 토양 샘플로부터 단리하였다. 본 발명의 콘드로마이세스 균주는 16S-RNA 유전자의 부분 서열을 기초로 할 때 콘드로마이세스 아피쿨라투스인 것으로 확인되었다. 콘드로마이세스 아피쿨라투스는 DSMZ에 의해 생물학적 위험군 1로 배정되었다 (DSMZ (2007)). 콘드로마이세스는 폴리안기아세아에 과의 속이고, 델타-프로테오박테리아에 속하는 믹소콕칼레스 목에 속한다. 믹소박테리아라고도 불리는 믹소콕칼레스 목의 박테리아는 대부분의 다른 박테리아 구별되는 2가지 특징을 갖는 그람-음성 막대형 박테리아이다. 이것들은 활성 활주 메카니즘을 이용하여 고체 표면에서 군집하고, 기아시에는 응집하여 자실체를 형성한다 [Kaiser (2003)].
본 발명의 콘드로마이세스 아피쿨라투스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 DSM 21595로 기탁되었다.
배양: 배플이 장착된 500 mL 진탕 플라스크 중의 배지 MD1 (문헌 [Bode et al. 2003]에 따름) 100 mL 10개에 본 발명의 콘드로마이세스 아피쿨라투스 균주의 액체 배양물로부터 각각 20 mL (= 20％)씩을 접종하여 예비-배양을 시작하였다. 30℃ 및 120 rpm의 회전 진탕기에서 6일 동안 인큐베이션한 후에, 상기 배양물 총 부피 1 L를 50 L 웨이브(Wave)® 백에 배지 MD1 5 L와 함께 옮겼다. 바이오웨이브(BioWave) 200 SPS 반응기 (웨비브 바이오테크 아게(Wave Biotec AG), 스위스 소재)에서 7일 동안 인큐베이션한 후에, 배지 M7/14 40 L를 상기 백에 첨가하여 생산을 시작하였다. 19일 후에 상기 배양물을 수확하였다.
추출: 수확을 위해서, 상기 웨이브 백 윗공간의 공기를 진공으로 제거하고, 상기 백을 매달아서 수지 및 세포가 침강되도록 하였다. 1시간 동안 침강시킨 후에, 상등액 43 L를 제거하여 버렸다. 세포 및 수지를 함유하는 잔류물 7 L를 밤새 동결시켰다. 해동시킨 후, 종이 필터를 통한 여과에 의해 상기 세포 및 수지를 수득하였다. 여액은 버렸다. 상기 세포/수지 펠렛 (습윤 중량: 대략 3 kg)을 금속 용기로 옮겨 에틸 아세테이트 15 L로 2회 추출하였는데, 첫번째 추출 동안에는 5분 동안 균질화하였다. 2개 배치(batch) 둘다의 혼합물을 종이 여과로 분리한 후에 여액을 합하였다. 유기 용매 상을 수상으로부터 분리한 후, 상기 용매 상을 순수한 물 2 L로 세척한 후에 건조해질 때까지 증발시켰다. 수상은 버렸다.
화합물 단리: 상기 추출물 (5 g)을 디클로로메탄/메탄올 4:1 중에 용해하였다. 상기 용액을 여과하고, 여액을 규조류 (추출물 1 g 당 규조류 2 g, 이솔루트®, 영국 헨괴드 미드 글람 소재의 인터내셔널 소르벤트 테크놀로지 리미티드)에 흡착시킨 후에 증발시켰다. 고체 잔류물을 사전 충전된 실리카겔 컬럼 (4×18 cm, 100 g 실리카겔 40-63)에 로딩하고, 시클로헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올의 구배로 용출시켰다. 상기 구배는 표 2에 나타냈고, 유속은 28 mL/분이었다. 28 mL 부피의 분획물들을 수집하였다. 상기 분획물들을 UV-추적에서 육안으로 확인된 피크에 따라 합하였다. 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 함유하는 분획물들을 용매로서 0.01％ 포름산 (용매 A) 및 0.1％ 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (용매 B)을 사용한 역상 크로마토그래피 (워터스 선파이어 RP18 10 ㎛, 30×150 mm)로 추가로 정제하였다. 유속은 50 mL/분이었다. 구배는 표 1에 나타냈다. 주입을 위해서, 상기 물질을 MeOH/DMSO 1:1 1.6 mL 중에 용해하였다. 수집한 분획물들을 HPLC로 분석하고, 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드를 함유하는 분획물들을 합하여 진공하에서 건조해질 때까지 증발시켰다. 상기 추출물을 크로마토그래피하여 화학식 XV에 따른 순수한 시클릭 뎁시펩티드 7 mg 및 화학식 XVI에 따른 순수한 시클릭 뎁시펩티드 1.2 g을 수득하였다.
배지
Figure pat00070
Figure pat00071
화합물의 특징규명:
화학식 XV의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00072
화학식 XVI의 화합물의 물리적 데이타
Figure pat00073
실시예 2: 시험관내 생물학적 활성의 결정
예를 들어 화학식 II 내지 X의 화합물을 포함하는 본 발명의 화합물은 약리 활성을 나타내기 때문에 의약품으로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 칼리크레인-7 활성 및 HNE 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 본 발명의 화합물은 하기하는 검정으로 결정한 IC50 값이 1 nM 내지 10 μM이었다:
실시예 2.1: 시험관내 칼리크레인-7 억제 활성
물질 및 완충제
형광-켄칭 기질
Figure pat00074
(여기서, ^는 분리가능한 결합을 나타내고, MS 분석으로 확인됨)은 바이오신탄 (독일 베를린 소재)에서 구입하였고, -20℃에서 DMSO 중의 5 mM 원액 용액으로서 보관하였다. 모든 다른 화학물질들은 분석 등급이었다.
효소 반응은 150 mM NaCl 및 0.05％ (w/v) CHAPS를 함유하는 pH 5.6의 50 mM 시트르산나트륨 완충제 중에서 수행하였다.
모든 단백질 및 펩티드-함유 용액은 초음파처리된 튜브 (라이프 시스템즈 디자인(Life Systems Design), 스위스 메렌쉬반트 소재)에서 취급하였다. 화합물 용액 및 또한 효소 및 기질 용액은 시바이-웰(CyBi-Well) 96-채널 피펫 (시바이오 아게(CyBio AG), 독일 예나 소재)을 사용하여 384웰 플레이트 (흑색 클리니플레이트(Cliniplate); 카탈로그 번호 95040020, 핀란드에 소재하는 랩시스템즈 오이(Labsystems Oy))로 옮겼다.
FI 측정을 위한 기기
형광 강도 (FI) 측정을 위해서, 울트라 에볼루션(Ultra Evolution) 판독기 (테칸(TECAN), 스위스 맨네도르프 소재)를 사용하였다. 상기 장치에는 형광 여기 및 방출 획득 각각을 위한 350 nm (20 nm 대역폭) 및 500 nm (25 nm 대역폭) 통과대역 필터의 조합물이 장착되어 있었다. 신호:백그라운드(background) 비율을 증가시키기 위해서 적절한 2색성 거울을 사용하였다. 상기 광학 필터 및 2색성 거울은 테칸에서 구입하였다. 각 웰에서의 형광단은 매 측정시마다 3회의 섬광으로 여기시켰다.
IC 50 값의 결정
IC50 값을 결정하기 위한 검정은 실온에서 384웰 플레이트에서 수행하였다. 모든 최종 검정 부피는 30 ㎕였다. 시험 화합물을 90％ (v/v) DMSO/물 중에 용해하고, 물 (0.05％ (w/v) CHAPS를 함유함) 중에서 원하는 검정 농도의 3배로 희석하였다. 11가지 최종 화합물 농도는 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μM, 3 μM, 10 μM 및 30 μM이었다. 각각의 검정시에, 물/CHAPS (± 시험 화합물) 10 ㎕를 웰마다 첨가한 후에 프로테아제 용액 (1.5× 검정 완충제로 희석함) 10 ㎕를 첨가하였다. 최종 검정 용액 중의 프로테아제 농도는 0.2 nM (브래드포드 방법으로 측정한 효소 농도)이었다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 기질 용액 10 ㎕ (1.5× 검정 완충제 중에 용해한 기질. 최종 농도는 2 μM이었음)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 상기 화합물이 효소 활성에 미치는 효과는 선형 진전 곡선으로부터 구하였고, 2개의 판독치로부터 결정하였는데, 하나는 기질 첨가 후에 바로 측정한 것이었고, 다른 하나는 1시간 후에 측정한 것이었다. IC50 값은 비-선형 회귀 분석 소프트웨어 (XLfit, 버전 4.0; 아이디 비지니스 솔루션 리미티드, 영국 서레이 길드포드 소재)를 사용하여 억제율(％) vs. 억제제 농도의 플롯으로부터 계산하였다.
시클릭 뎁시펩티드는 h칼리크레인7을 하기 표 11에 나타낸 바와 같은 IC50 값으로 억제하였다.
Figure pat00075
Figure pat00076
Figure pat00077

실시예 2.2: 시험관내 HNE 억제 활성
물질 및 완충제
인간 호중구 엘라스타제 (카탈로그 번호 SE563)는 엘라스틴 프로덕츠 컴퍼니, 인크.(Elastin Products Company, Inc.) (이피씨(EPC), 미국 오웬스빌 소재)로부터 구입하였다. 상기 건조 분말 (제조업체가 언급한 바에 따르면, 순도 > 95％)을 20 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 5.0), 50％ (v/v) 글리세롤 중에 용해하고, -80℃에서 분취액으로 동결시켰다.
형광-켄칭 기질 (
Figure pat00078
(여기서, ^는 분리가능한 결합을 나타내고, MS 분석으로 확인됨))은 바켐 아게(Bachem AG) (스위스 부벤도르프 소재)에서 구입하였고, -20℃에서 DMSO 중의 5 mM 원액 용액으로서 보관하였다.
모든 다른 화학물질들은 분석 등급이었다.
효소 반응은 500 mM NaCl 및 0.05％ (w/v) CHAPS를 함유하는 pH 7.5의 100 mM Tris/HCl 완충제 중에서 수행하였다.
모든 단백질 및 펩티드-함유 용액은 초음파처리된 튜브 (라이프 시스템즈 디자인, 스위스 메렌쉬반트 소재)에서 취급하였다.
화합물 용액 및 또한 효소 및 기질 용액은 시바이-웰 96-채널 피펫 (시바이오 아게, 독일 예나 소재)을 사용하여 384웰 플레이트 (흑색 클리니플레이트; 카탈로그 번호 95040020, 핀란드에 소재하는 랩시스템즈 오이)로 옮겼다.
FI 측정을 위한 기기
형광 강도 (FI) 측정을 위해서, 울트라 에볼루션 판독기 (테칸, 스위스 맨네도르프 소재)를 사용하였다. 상기 장치에는 형광 여기 및 방출 획득 각각을 위한 350 nm (20 nm 대역폭) 및 500 nm (25 nm 대역폭) 통과대역 필터의 조합물이 장착되어 있었다. 신호:백그라운드 비율을 증가시키기 위해서 적절한 2색성 거울을 사용하였다. 상기 광학 필터 및 2색성 거울은 테칸에서 구입하였다. 각 웰에서의 형광단은 매 측정시마다 3회의 섬광으로 여기시켰다.
시클릭 뎁시펩티드는 인간 호중구 엘라스타제를 표 11에 나타낸 IC50 값으로 억제하였다.
또한, 시클릭 뎁시펩티드는 인간 카이모트립신을 0.001 μM 내지 0.02 μM 범위의 IC50으로 억제하였다.
화학식 VIII에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 생물학적 활성을 칼리크레인 7을 사용하여 결정하였다. 본 발명의 이러한 시클릭 뎁시펩티드는 인간 칼리크레인 7을 3 nM 미만의 IC50으로 억제하였다. 상기 시클릭 뎁시펩티드는 인간 카이모트립신 및 인간 호중구 엘라스타제를 각각 약 0.004 μM 및 약 0.0025 μM의 IC50으로 억제하였다.
실시예 3: 생체내 칼리크레인-7 억제 활성의 결정
A) 마우스에서 피부 장벽 파괴의 회복에 대한 시험
방법: 무모(無毛)(hairless) SKH1 마우스의 군에서 에스-스쾀(S-Sqame)® 피부 샘플링 디스크를 사용하여 피부를 반복적으로 박리하여 피부 장벽 파괴를 달성하였다. 상기 절차는 경표피 수분 손실 (TEWL (transepidermal water loss))이 ≥ 40 mg/㎠/시간에 이르렀을 때 완료하였다. TEWL을 테와미터(Tewameter) TM210 (독일 쾰른 소재의 코우리지 카자카(Courage Khazaka))을 사용하여 평가하였다. 장벽 파괴 직후에 시험 화합물 30 ㎕를 10 mM 농도로 적용하였다. 유사하게, 대조군 동물에게는 용매 (에탄올/프로필렌 글리콜, 3/7 (v/v))를 단독으로 처치하였다. TEWL을 장벽 파괴 전, 장벽 파괴 직후, 및 장벽 파괴 후 제3시간에 측정하였다. 각각의 동물에서, 회복률(％)을 하기 식으로 계산하였다: (1 - [제3시간의 TEWL - 기준선 TEWL]/[박리 직후의 TEWL - 기준선 TEWL]) × 100％.
결과: 시험 화합물 (화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드)의 단일 적용은 용매를 단독으로 처치한 마우스에서의 복구에 비해 장벽 복구를 57％만큼 가속화하였다 (p < 0.05). 하기 표 12를 참조한다.
동물 장벽 파괴에서의 회복률(％)
평균 ( SD 값),
n: 군 당 동물 4마리
10 mM 시험 화합물
(화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드)
처치		 72.0 (9.1)
용매 단독 처치 45.8 (8.0)
B) 알레르기성 접촉성 피부염 (ACD)의 뮤린(murine) 모델에서의 소염 활성에 대한 시험
방법: Crl:NMRI 마우스를 제1일에 면도된 복부에 2％ 옥사졸론 50 ㎕로 감작화하고, 제8일에는 우측 귀의 안쪽 표면에 옥사졸론 10 ㎕를 시험투여(challenge)하였다. 시험투여를 실시하지 않은 좌측 귀를 정상적인 대조군으로 하였고, 제9일에 귀 중량의 차이 (염증성 종창의 측정치로 함)로서 피부염을 평가하였다. 시험투여 30분 후, 상기 동물에게 시험 화합물 10 ㎕ 또는 오직 용매만을 국소 처치하였다. 처치 효능은 비히클 단독 처치된 동물에 대한 염증성 귀 종창의 억제율(％)로서 계산하였다.
결과: 시험 화합물 (화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드)의 단일 적용은, ACD에서의 염증성 종창을 용매-처치된 동물에 비하여 10 mM에서는 40％ 억제하였고, 30 mM 농도에서는 46％ 억제하였다 (p < 0.001) (표 13 및 표 14).
동물 Δ 귀 중량
평균 ( SD 값),
n: 군 당 동물 8마리 		염증성 종창의 억제율(％)
평균 ± SE
30 mM 시험 화합물
(화학식 II에 따른
시클릭 뎁시펩티드)
처치		 15.3 (5.4) 46 ± 7.5
10 mM 시험 화합물
(화학식 II에 따른
시클릭 뎁시펩티드)
처치		 17.0 (4.8) 40 ± 6.9
용매+ 단독 처치 28.1 (4.6) -
+: 디메틸아세트아미드/에탄올/아세톤 (1/2/2)의 혼합물
염증성 종창의
억제율(％) 		염증성 종창의
억제율(％)
시험 화합물의 농도 시험 화합물의 농도
하기 화학식에 따른
화합물 		30 mM 10 mM
실시예 9 38 42
실시예 10 25 22
실시예 23 40 48
실시예 25 38 39
실시예 43 55 42
C) 알레르기성 접촉성 피부염 (ACD)의 돼지 모델에서의 소염 활성에 대한 시험
ACD를 유발하기 8일 전에 10％ 2,4-디니트로플루오로벤젠 (DNFB, DMSO/아세톤/올리브유 [1/5/3, v/v/v] 중에 용해함) 500 ㎕를 양쪽 귀 아래쪽 및 양쪽 서혜부 (100 ㎕/부위)에 분할된 부피로 피부에 적용하여 감작화시켰다. 시험투여 반응은, 면도된 등쪽의 반대되는 양측 시험 부위들 (각각 7 ㎠ 크기)에 DNFB (1.0％) 15 ㎕로 유발하였다. 처치를 위해서, 시험 화합물 및 위약 (오직 용매)을 시험투여 0.5시간 및 6시간 후에 각각의 동물에서 2군데 시험 부위의 반대되는 양측에 적용하였다. 시험투여 24시간 후에 염증이 최고에 이르렀을 때 시험 부위를 임상적으로 조사하였다. 변화를 0 내지 4의 스케일로 스코어링하여 (표 15), 지정 부위 당 합한 최대 스코어가 12가 되도록 하였다. 피부 발적은 a* 값을 이용한 반사율측정으로 결정하였다.
ACD 에 걸린 시험 부위의 임상적 징후에 대한 스코어링
스코어 홍반/강도 홍반/정도 경화
0 없음 없음 없음
1 육안으로 거의 보이지 않음 소형 반점 거의 감지되지 않음
2 중간 정도 대형 반점 중간 정도의 경화
3 뚜렷함 융합성 뚜렷한 경화
4 중증 (또는 검푸르게 변색됨) 균일한 발적 경화가 뚜렷하고 상승됨
결과: ACD에 걸린 시험 부위에 시험 화합물 (화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드)의 1％ 용액을 2회 처치한 것은, 임상적 염증 변화를 30％ 억제하였고 (p < 0.01) 피부 발적을 27％ 억제하는 것으로 결정되었다 (p < 0.05) (표 16)
시험 부위 임상적 스코어
(평균, SD , n: 8+) 		A* 값
(평균, SD , n: 8+)
1％ 시험 화합물
(화학식 II에 따른
시클릭 뎁시펩티드)
처치		 5.1 (1.7) 8.6 (1.4)
위약 (용매) 처치 7.2 (1.9) 12.0 (2.5)
위약-처치 부위와 비교한 억제 29.9 (11.7) 27.0 (2.5)
+: 4마리 동물 각각에서 2군데의 시험 부위
실시예 4: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
a) 1-단계 절차:
디클로로메탄/아세토니트릴 (1:1) 2 mL 중 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 20 mg 및 트리에틸실란 0.027 mL의 용액에 -50℃에서 삼불화붕소 에테레이트 0.014 mL를 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물이 -5℃로 가온되도록 하고 이 온도에서 30분 더 유지시키고, 포화 NaHCO3 용액에 붓고 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시키고 용매를 진공하에 제거하였다. 수득된 잔류물을 HPLC (엑스테라(XTerra) [5 cm]; 아세토니트릴/탄산암모늄 완충제 (pH 10) 구배)로 정제하여 Ahp가 3-아미노-피페리딘-2-온으로 전환된, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 9.8 mg을 수득하였다. ESI MS: 935.36 [M+Na]+.
b) 2-단계 절차:
디클로로메탄/아세토니트릴 (1:1) 300 mL 중 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 1 g의 용액에 -50℃에서 삼불화붕소 에테레이트 0.68 mL를 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물이 -20℃로 가온되도록 하였다. 이어서, 추가의 0.68 mL의 삼불화붕소 에테레이트를 상기 반응 혼합물에 서서히 첨가하고, 출발 물질을 더이상 관찰할 수 없을 때까지 (HPLC) 이 온도에서 유지시켰다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시키고 용매를 진공하에 제거하여 Ahp가 3-아미노-3,4-디히드로-1H-피리딘-2-온으로 전환된, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체를 수득하였다. ESI MS: 933.28 [M+Na]+.
상기 조 물질을 2-프로판올 400 mL 중에 용해하여 Pd/C (10％) 115 mg을 첨가하고, 상기 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지 (HPLC) 대기압하에 수소화하였다. 수득된 잔류물을 크로마토그래피 (SiO2; cHex/EtOAc (1:1) + 10％ MeOH)로 정제하여 Ahp가 3-아미노-피페리딘-2-온으로 전환된 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 684 mg을 수득하였다.
실시예 5: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
1-PrOH 5 mL 중 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 75 mg (0.081 mmol)의 용액에 황산 30 ㎕를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 포화 중탄산염 용액으로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 실리카겔에서의 크로마토그래피 (cHex/EtOAc (1:1) + 10％ MeOH)로 정제하였다. 수율: Ahp가 3-아미노-6-프로폭시-피페리딘-2-온으로 전환된, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 65 mg (83％). ESI MS: 993.37 [M+Na]+.
유사하게, 상응하는 알콜로 처리하여 하기하는 화합물을 수득하였다:
Figure pat00079
Figure pat00080
동시에, 하기 유형의 화합물을 동일 조건하에 수득하였다:
Figure pat00081
Figure pat00082
실시예 21: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
디클로로메탄 2 mL 중 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 25 mg (0.027 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, DIPEA 및 트리플루오로아세트산 무수물 (TFAA)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고 4시간 더 교반하였다. 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 염산 및 포화 중탄산염 용액으로 세척하였다. 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 실리카겔에서의 크로마토그래피 (cHex/EtOAc (1:1) + 10％ MeOH)로 정제하였다. 수율: A1 측쇄의 아미드가 니트릴로 전환된, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 14 mg (57％). ESI MS: 933.30 [M+Na]+.
유사하게, 하기 유형의 화합물을 수득하였다:
Figure pat00083
Figure pat00084
실시예 26: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
디클로로메탄 (MC) 2 mL 중 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드 25 mg (0.027 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, DIPEA 24 ㎕ 및 헥실 클로로포르메이트 14 ㎕를 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물이 실온으로 가온되게 하고, 4시간 더 교반하였다. 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 염산, 포화 중탄산염 용액 및 염수로 세척하였다. 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 실리카겔에서의 크로마토그래피 (cHex/EtOAc (1:1) + 10％ MeOH)로 정제하였다. 수율: A6의 페놀 잔기가 상응하는 탄산 헥실 에스테르로 변환된, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 20 mg (70％). ESI MS: 1079.41 [M+Na]+.
유사하게, 실시예 4에 기재한 화합물을 출발 물질로서 사용하여 하기 화합물을 수득하였다:
Figure pat00085
Figure pat00086
실시예 32: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
무수 아세톤 2 mL 중 실시예 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드 200 mg (0.21 mmol) 및 K2CO3 57.5 mg (0.41 mmol)의 혼합물에 (E)-3-페닐-2-프로페닐 브로마이드 60.5 mg (0.31 mmol)을 첨가하고, 밤새 초음파 처리하였다 (온도는 약 50℃로 상승하였음). 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 HPLC (15 cm 조르박스(Zorbax); 아세토니트릴/수성 NH4OAc 완충제: 20％→95％)로 정제하였다. 수율: A6에서의 O-((E)-3-페닐-2-프로펜-1-일)-L-티로신을 특징으로 하는, 실시예 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 100 mg (45％). ESI MS: 1109.37 [M+Na]+.
유사하게, 실시예 4 또는 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드를 적절한 알킬화제로 처리하여 하기 화합물을 수득하였다:
Figure pat00087
Figure pat00088
실시예 42: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
무수 아세톤 2 mL 중 실시예 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드 200 mg (0.21 mmol), 요오드화나트륨 46.5 mg (0.31 mmol) 및 K2CO3 57.5 mg (0.41 mmol)의 혼합물에 3-(클로로메틸)-1,5-디메틸-1H-피라졸 44 mg (0.31 mmol)을 첨가하고, 밤새 초음파 처리하였다 (온도는 약 50℃로 상승하였음). 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 HPLC (15 cm 조르박스; 아세토니트릴/수성 NH4OAc 완충제: 20％→95％)로 정제하였다. 수율: A6에서의 O-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일)메틸-L-티로신을 특징으로 하는, 실시예 5에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 90 mg (40.5％). ESI MS: 1101.39 [M+Na]+.
실시예 43:
유사하게, 화학식 II에 따른 시클릭 뎁시펩티드를 3-(클로로메틸)-1,5-디메틸-1H-피라졸로 처리하여, A6에서의 O-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일)메틸-L-티로신을 특징으로 하는 화합물을 수득하였다. ESI MS: 1059.19 [M+Na]+.
실시예 44: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
Figure pat00089
디클로로메탄 2 mL 중 실시예 33에 따른 시클릭 뎁시펩티드 17 mg (0.0165 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 845 ㎕를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 톨루엔으로 희석하고 용매를 진공하에 제거하여 상응하는 조 산 22.5 mg을 수득하였다.
상기 산 20 mg, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 tert-부틸에스테르 6.81 mg (0.031 mmol) 및 HATU 15.8 mg (0.041 mmol)을 무수 DMF 2 mL 중에 용해하여 DIEPA 11 ㎕를 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 후처리를 위해, 상기 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고 포화 NaHSO4, NaHCO3 용액 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 HPLC (15 cm 조르박스; 아세토니트릴/수성 NH4OAc 완충제: 20％→95％)로 정제하였다. 수율: 표제 화합물 7 mg (29％). ESI MS: 1194.32 [M+Na]+.
8-아미노-3,6- 디옥사옥탄산 tert - 부틸에스테르
무수 DMF 1 mL 중 8-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-3,6-디옥사옥탄산 tert-부틸에스테르 100 mg (0.226 mmol)을 피페리딘 (89.5 ㎕; 0.862 mmol)으로 실온에서 3시간 동안 처리하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 구배 cHex→EtOAc→EtOAc/MeOH (1:1) + 3％ MeOH를 사용한 실리카겔에서의 크로마토그래피로 정제하였다. 수율: 표제 화합물 12 mg (24％). ESI MS: 220.08 [M+H]+.
8-(9- 플루오레닐메톡시카르보닐아미노 )-3,6- 디옥사옥탄산 tert - 부틸에스테르
8-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-3,6-디옥사옥탄산 150 mg (0.389 mmol), 이소부틸렌 546 mg (9.73 mmol) 및 95％ 내지 98％ H2SO4 4.3 ㎕의 용액을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 후처리를 위해, 상기 반응 용액을 디클로로메탄으로 희석하고 포화 중탄산염 용액으로 세척하였다. 황산나트륨에서 건조시킨 후에 용매를 제거하고, 수득된 잔류물을 cHex/EtOAc 구배를 사용한 실리카겔에서의 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 145 mg (84.4％)을 수득하였다. ESI MS: 464.12 [M+Na]+.
실시예 45: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
Figure pat00090
톨루엔/DMF (10:1) 11 mL 중 실시예 41의 화합물 101 mg (0.1 mmol) 및 CuI 40 mg의 혼합물에 DIEPA 50 L 및 1-아지도-2-[2-(2-아지도-에톡시)-에톡시]-에탄의 1 M 용액 1 mL를 첨가하고, 45℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 포화 NaH2PO4 용액으로 세척하여 황산나트륨에서 건조시키고 용매를 증발시켰다. 수득된 잔류물을 크로마토그래피 (SiO2; cHex/EtOAc (1:1) + 20％ MeOH)로 정제하여 표제 화합물 14 mg (11.7％)을 수득하였다. ESI MS: 1231.34 [M+Na]+.
실시예 46: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
Figure pat00091
물 25 mL 중 화학식 II에 따른 뎁시펩티드 25 mg의 용액을 실온에서 교반하였다. HPLC 분석에서는 상기 용액에서 화학식 II에 따른 뎁시펩티드와 평형을 이루는 추가의 피크가 관찰되었다. 20일 후에 상기 용액을 동결건조로 건조시키고, 상기 추가의 피크를 실시예 1에 기재한 바와 같은 역상 크로마토그래피로 단리하였다. 이것으로, Ahp가 5-히드록시프롤린으로 전환된, 실시예 46에 따른 시클릭 뎁시펩티드 0.75 mg을 수득하였다.
Figure pat00092
실시예 47: 본 발명의 시클릭 뎁시펩티드의 유도체화
Figure pat00093
0.5 N HCl 25 mL 중 화학식 II에 따른 뎁시펩티드 100 mg의 용액을 50℃에서 24시간 동안 교반하였다. 후처리를 위해, 5 N NaOH를 사용하여 상기 반응 혼합물의 pH를 pH 7로 조정하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨에서 건조시키고 용매를 진공하에 제거하였다. 수득된 잔류물을 역상 크로마토그래피 (실시예 1에 기재한 것과 동일한 조건)로 정제하여 A1의 글루타민이 글루탐산으로 대체된, 실시예 47에 따른 시클릭 뎁시펩티드 17 mg을 수득하였다.
Figure pat00094
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
청구항 1. 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체 또는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 제약상 허용가능한 염:
<화학식 I>
Figure pat00095
상기 식에서,
A7의 카르복시기와 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고,
X 및 A1은 각각 독립적으로 임의적이고,
X는 임의의 화학적 잔기이고,
A1은 아스파르트산 이외의 표준 아미노산이고,
A2는 트레오닌 또는 세린이고,
A3은 비-염기성 표준 아미노산 또는 그의 비-염기성 유도체이고,
A4는 Ahp, 데히드로-AHP, 프롤린 또는 그의 유도체이고,
A5는 이소류신 또는 발린이고,
A6은 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7은 류신, 이소류신 또는 발린이다;
청구항 2. 제1항에 있어서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자가 메틸로 치환된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X가 H 또는 아실 잔기인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X가 CH3CH2CH(CH3)CO, (CH3)2CHCH2CO 또는 (CH3)2CHCO인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A1이 글루타민인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, A2가 트레오닌인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, A3이 류신인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, A6이 티로신인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A4가 Ahp 유도체 3-아미노-2 피페리돈인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
X가 (CH3)2CHCO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 AHP 또는 그의 유도체이고,
A5가 이소류신 또는 발린이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 이소류신 또는 발린인
시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
X가 CH3CH2CH(CH3)CO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 AHP 또는 그의 유도체이고,
A5가 이소류신이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 이소류신인
시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
X가 CH3CH2CH(CH3)CO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 데히드로-AHP 또는 그의 유도체이고,
A5가 이소류신이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 이소류신인
시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
X가 (CH3)2CHCH2CO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 데히드로-AHP 또는 그의 유도체이고,
A5가 이소류신이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 이소류신인
시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 14. 하기 화학식 I의 구조를 갖는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체 또는 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체의 제약상 허용가능한 염:
<화학식 I>
Figure pat00096
상기 식에서,
A7의 카르복시기 및 A2의 히드록시기 사이에는 에스테르 결합이 존재하고,
X는 (CH3)2CHCH2CO이고,
A1은 글루타민이고,
A2는 트레오닌이고,
A3은 류신이고,
A4는 Ahp 또는 프롤린 또는 그의 유도체이고,
A5는 페닐알라닌이고,
A6은 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7은 발린이다;
청구항 15. 제14항에 있어서,
X가 (CH3)2CHCH2CO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 AHP 또는 그의 유도체이고,
A5가 페닐알라닌이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 발린인
시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 16. 제14항에 있어서,
X가 (CH3)2CHCH2CO이고,
A1이 글루타민이고,
A2가 트레오닌이고,
A3이 류신이고,
A4가 프롤린 또는 그의 유도체이고,
A5가 페닐알라닌이고,
A6이 티로신 또는 그의 유도체이며,
A7이 발린인
* 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 17. 제14항에 있어서, A5와 A6 사이의 아미드 결합의 질소 원자가 메틸로 치환된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, A1, A2, A3, A5, A6 및 A7이 L-아미노산인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, A4가 3S,6R Ahp인 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 21. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 암, 특히 난소암의 치료, 또는 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염의 치료, 또는 암, 특히 난소암의 치료를 위한 의약으로 사용하기 위한 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 포함하는 제약 조성물;
청구항 23. 염증성 및/또는 과증식성 및 소양성 피부 질환, 예컨대 켈로이드, 비후성 반흔, 여드름, 아토피성 피부염, 건선, 농포성 건선, 장미증, 네테르톤 증후군 또는 다른 소양성 피부병, 예컨대 결절성 양진, 노인의 비정형 가려움증 및 또한 상피 장벽 기능이상을 갖는 다른 질환, 예컨대 노화된 피부, 염증성 장 질환 및 크론병, 및 또한 췌장염, 또는 암, 특히 난소암으로 고통받는 대상체에게 치료 유효량의 청구항 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 상기한 질환 또는 장애로 고통받는 대상체를 치료하는 방법;
청구항 24. 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체를 적합한 배지 중에서 배양하고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법;
청구항 25. 콘드로마이세스 균주, 그의 변이체 또는 돌연변이체의 생합성 유전자를 이종 미생물 숙주 균주에서 발현시키고, 임의로는 이로써 생산된 시클릭 뎁시펩티드를 화학적으로 유도체화하는 것을 포함하는, 청구항 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 방법;
청구항 26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 균주가 콘드로마이세스 크로카투스 (DSM 19329) 또는 콘드로마이세스 로부스투스 (DSM 19330)인 방법;
청구항 27. 수탁 번호 DSM 19329 또는 DSM 19330로 기탁된, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체를 생산하는 단리된 콘드로마이세스 미생물;
청구항 28. 제27항의 단리된 콘드로마이세스 미생물에 의해 생산되거나, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 시클릭 뎁시펩티드 또는 그의 유도체;
청구항 29.
대안적으로,
a) A4가
Figure pat00097
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00098
인 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
b) A4가
Figure pat00099
인 화합물을 -50℃ 내지 100℃의 온도에서 용매 중에서 촉매의 존재하에 수소 분자 또는 그의 공급원으로 처리하여 A4가
Figure pat00100
인 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나,
c) A4가
Figure pat00101
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 환원제의 존재하에 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00102
인 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하거나, 또는
d) A4가
Figure pat00103
인 화합물을 -78℃ 내지 150℃의 온도에서 치환되거나 치환되지 않은 알칸올 및 유기산, 무기산 또는 루이스산으로 처리하여 A4가
Figure pat00104
인 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하는 것
을 포함하는, 제1항에 따른 시클릭 뎁시펩티드의 유도체 또는 그의 유도체를 제조하는 방법.
참고문헌
Figure pat00105
Figure pat00106
DSMZ DSMZ21595 20080623 DSMZ DSMZ19329 20070424 DSMZ DSMZ19330 20070424

Claims (1)

  1. 시클릭 뎁시펩티드를 투여하는 것을 포함하는 염증 질환 치료 방법.
KR1020127024969A 2007-08-17 2008-08-14 시클릭 뎁시펩티드 KR20120123579A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07114507 2007-08-17
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