KR20120117810A - 암 치료용 병용 치료요법 및 이에 사용하기 위한 진단 검사 - Google Patents

암 치료용 병용 치료요법 및 이에 사용하기 위한 진단 검사 Download PDF

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위 선
샤오야 린
마크 앤더슨
샤올리 후앙
쥔링 리
레이밍 리
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Abstract

본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제의 병용물에 관한 것이며, 여기서 상기 병용물은 적어도 하나의 다배수 유도제 및 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 포함한다. 또한, 본원 명세서의 교시내용은 또한 하나 이상의 치료제로 치료하기 위한 환자의 분류시 유용한 진단 검사에 관한 것이다.

Description

암 치료용 병용 치료요법 및 이에 사용하기 위한 진단 검사{COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER AND DIAGNOSTIC ASSAYS FOR USE THEREIN}
본원은 2005년 9월 20일자로 출원된 미국 가특허원 제60/718,618호 및 2005년 5월 12일자로 출원된 미국 가특허원 제60/680,107호에 대한 우선권을 청구하는, 2006년 5월 12일자로 출원되어, 현재 미국 특허 제7,390,799호인, 미국 특허원 제11/432,937호의 분할 출원인, 2008년 5월 15일자로 출원된 미국 특허원 제12/120,914호의 부분-연속 출원이다.
기술분야
본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 대상체 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제의 병용물(combination)에 관한 것이다. 당해 병용물은 (1) 적어도 하나의 다배수 유도제(polyploidy inducing agent); 및 (2) 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 포함한다. 또한, 본원 명세서의 교시내용은 또한 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용하여 치료하기 위해 환자를 분류하는데 유용한 진단 검사에 관한 것이다. 특히, 본원 명세서의 교시내용은 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자내에서 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인한 후 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료를 제공받기에 적격인 것으로 환자를 분류하는 것에 관한 것이다.
항-세포자멸사 Bcl-2 계열 단백질 구성원은 다수의 질환과 관련되어 있으므로 강력한 치료용 약물 표적으로 연구 중에 있다. 중재 치료요법(interventional thearpy)을 위한 이들 중요한 표적은 예를 들면, 단백질 Bcl-2, Bcl-XL 및 Bcl-w의 Bcl-2 계열을 포함한다. 최근에 Bcl-2 계열 구성원의 억제제는 문헌(참조: 예를 들면, WO 2005/049594, Oltersdorf, et. al., Nature, 435:677-681 (2005), 미국 특허 제6,720,338호 및 미국 특허 제7,030,115호)에 보고되어 있다. 당해 문헌이 표적 단백질에 대해 높은 결합을 갖는 억제제를 교시하고 있지만, 이는, 화합물이 추가의 또는 연속된 약물 개발을 위해 연구되고 있는 것으로 고려되어야만 하는 많은 매개변수 중 단지 하나이다. 이러한 개발의 일부로서, 경구 투여 후 암의 동물 모델에서 효과적인 화합물을 생산하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 경구 효능을 달성하기 위해, 화합물이 연구하에서 종양 유형 또는 세포주에 대해 강력한 활성을 나타낼 뿐 아니라, 경구 투여 후 전신계적 노출의 허용가능한 수준을 달성하여야만 하는 것은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 화합물의 세포 활성의 대표적인 척도는 50% 세포 효과(EC50)를 유발하는 농도이다. 전신계적 노출의 대표적인 척도는 경구 투여 후 혈장 화합물 농도를 시간에 대해 그래프화 한 후 생성되는 곡선하 영역(AUC)이다. 이들 매개변수(AUC/EC50) 사이의 비는 당해 분야에서 경구 효능을 예측하기 위한 유용한 약력학적 매개변수를 구성하는 것으로 잘 공지되어 있다.
하나의 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 동물에서 경구 투여 후 세포 효능 및 전신계적 노출과 관련하여 향상되고 예측불가능한 특성을 입증하는 일련의 할로알킬설포닐아릴 유사체에 관한 것이다. 상세하게는, 본원 명세서의 교시내용의 화합물은 강력한 세포 효능을 유지하는 한편 동물에 대해 경구 투여 후 적합한 전신계적 노출을 나타낸다. 이는 당해 분야에 교시된 화합물의 것보다 유의적으로 더 높은 AUC/EC50 비를 생성한다. 본원 명세서의 교시내용의 다른 국면들은 본원 명세서에 교시되어 있고 명백하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 B-세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, 에토포시드 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 2는 B-세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, 빈크리스틴 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 3은 B-세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, CHOP 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 4는 B-세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, 리툭시마브 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 5는 B-세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, 라파마이신 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 나타낸다.
도 6은 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma)에 대한 실시예 1의 화합물, R-CHOP 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 7은 외투 세포 림프종에 대한 실시예 1의 화합물, 보르테조미브 및 이들의 병용물의 비교된 항종양발생을 도시한다.
도 8은, BH3 모사체 ABT-263 및 판-아우로라(pan-Aurora) 억제제 VX-680이 상승적으로 치명적격을 나타낸다. 도 8a는, VX-680이, 19개의 다른 화학치료제와 병용된 단일의 고정된 투여량(1μM)에서, 각종 고형 악성종양으로부터 기원한 7개의 세포주의 패널에서 6-pt 투여량-반응에서 스크리닝되었음을 나타낸다. 세포 생존능은 병용물 요법에 대한 노출 후 3일째에 측정하였다. 약물 병용물의 상승작용 또는 길항작용은 약물-약물 상호작용의 블리스 어디티비즘 모델(Bliss additivism model)을 사용하여 측정하였다[참조: Berenbaum, M. C., Cancer Res 35, 269-335 (1981)]. 각각의 투여량에 대한 과도한 블리스 어디티비즘에 있어서의 값을 모든 병용물에 대해 측정하고 다음과 같이 정의하였다: >15=상승적, 0-15=상호작용 없음, <-15=길항적. 이들 값은 SPOTFIRE®(TIBCO®) 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 열지도(heatmap)로 나타내며, 여기서 상승작용은 적색으로, 상호작용 없음은 회색으로, 및 길항작용은 청색으로 표시한다. 각각의 투여량 반응은 VX-680 단독(0 μM 병용 화합물)에 대한 점(point)을 포함하였다. 이들 값들은 블리스 분석에 적용가능하지 않으므로 열지도로부터 배제되었다. 함께 시험한 화합물은 우측에 나타낸다. 이들 제제 각각의 작용의 표적/메카니즘 및 병용물 스크린에 대한 상응하는 투여량 반응은 실시예 40에서 표 a에 요약한다. 도 8b는 D54MG, HCT116, SW620, A549, PC3, 및 EJ1 세포에서 투여량-반응에 있어 ABT-263과 병용물된 VX-680에 대한 세포 생존능 측정의 블리스 분석을 나타낸다. 도 8c는 도 8b에서 분석된 세포 생존능 측정을 나타낸다.
도 9는, 아우로라 B 및 Bcl-XL의 억제가 상승적 세포독성에 충분함을 나타낸다. 도 9a는, HCT116 결장 암종 세포가 루시퍼라제, 아우로라 A, 또는 아우로라 B siRNA 각각으로 형질감염되거나 형질감염되지 않음을 나타낸다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포를 투여량 반응에 있어서 ABT-263으로 처리하고, 세포 생존능을 ABT-263을 첨가한 후 72 시간째에 측정하였다. 도 8b는, HCT116 용해물의 면역블롯이 도 9a에서 사용된 siRNA로 형질감염 후 72시간 째에 표적 단백질의 녹다운을 입증하였음을 나타낸다. MLN8054(도 9c) 또는 AZD1152(도 9d)를 HCT116 세포에서 DMSO 또는 1μM ABT-263과 병용하여 시험하였다. 세포 생존능을 처리 후 72시간 째에 측정하였다. 도 8e는, HCT116 용해물의 면역블롯이 감염 후 72시간 째에 Bcl-2, Bcl-XL, 및 Mcl-1의 녹다운을 입증하였음을 나타낸다. EJ1(도 9f) 또는 HCT116(도 9g) 세포를 도 9e에서와 같이 Bcl-2, Bcl-XL, 또는 Mcl-1 siRNA에 대한 루시퍼라제 siRNA 또는 동일한 세트의 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포들을 상이한 양들의 AZD1152로 처리하였다. 세포 생존능을 AZD1152에 노출시킨 후 72시간 째에 측정하였다. 도 9h는, HCT116 세포가 아우로라 B 또는 Bcl-XL siRNA들의 상이한 양으로 개별적으로 또는 조합되어 형질감염되었음을 나타낸다. 세포 생존능을 형질감염 후 72시간째에 측정하였다. 모든 도면에서, 세포 생존능은 형질감염되지 않은, DMSO-처리된 대조군 세포에 대한 퍼센트로 나타내었다. 적색 생존능 곡선은 상승적 병용물을 나타낸다.
도 10은, 다배수체화(polyploidization)가 세포 Bcl-XL 의존성이 되도록 함을 나타낸다. 도 10a는, HCT116 세포가 INCENP 또는 Bcl-XL siRNA로 투여량-반응으로 개별적으로 또는 조합되어 형질감염되었음을 나타낸다. 세포 생존능은 형질감염 후 72시간째에 측정하였다. 적색 곡선은 상승적 병용물을 나타낸다. 도 10b는, HCT116 용해물의 면역블롯이 도 10a에서와 동일한 siRNA로 형질감염시킨 후 72시간째에 INCENP의 녹다운을 입증하였음을 나타낸다. HCT116 세포(도 10c 내지 도 10f)를 24시간 동안 DMSO 또는 200 nM AZD1152로 처리하였다. 이후에, AZD1152를 배양 배지(AZD 1152)에 두거나 배지를 약물이 없는 성장 배지(AZD 1152 세척제거)로 교체함으로써 세척하였다. 세포를 추가로 72시간 동안 배양한 후 다음 처리/분석에 적용시켰다: p53, 포스포릴화된(pSer10) 및 포스포릴화되지 않은 히스톤 H3의 양을 측정하기 위한 웨스턴 분석(도 10c), 또는 세척 제거와 상관없이, AZD1152 처리된 세포에서 현저하게 증가된 세포 크기 및 다핵화와 같은 다배수의 형태학적 신호를 나타내기 위한 상 대조 영상(도 10d), 1μM ABT-263의 4시간 동안 처리(도 10e)와 카스파제-3 활성에 대한 검사, 및 1μM ABT-263을 사용한 24시간 동안의 추가의 처리(도 10f)와 세포 생존능에 대한 검사.
도 11은 다배수체화 동안 Bcl-2 네트웍(network)의 조정을 나타낸다. HCT116 세포(도 11a)를 DMSO 또는 200 nM AZD1152로 72시간 동안 처리한 후 2시간 째에 1μM ABT-263로 처리하였다. 구조적으로 활성인 BAK 또는 BAX를 면역침전시키고 면역블롯팅으로 검출하였다. D54MG 및 HCT116 세포(도 11b)를 DMSO 또는 200 nM AZD1152로 72시간 동안 처리한 후 1μM ABT-263을 4시간 동안 첨가하였다. 구조적으로 활성인 BAK 또는 BAX를 면역침전시키고 면역블롯팅(상부 및 중간 패널)으로 검출하였다. 세포 용해물을 또한 분획화하고 시토졸(cytosol) 분획내로 사이토크롬 C의 방출을 면역블롯팅으로 검출하였다. HCT116, SW620, 및 D54MG 세포(도 11c)를 DMSO(처리되지 않음) 또는 200 nM AZD1152(AZD1152)로 72시간 동안 처리하고 Bcl-2 네트웍 성분들의 발현을 면역블롯팅으로 검출하였다(도 11d 내지 도 11e). HCT116 세포를 도 11b에서와 같이 처리하였다. 내인성 Bcl-XL 및 Mcl-1을 면역침전시키고, 면역복합체내 Bcl-2 네트웍 성분들은 면역블롯팅으로 검출하였다.
도 12는, Bcl-2 네트웍이 다배수체 세포에서 Bcl-XL "중독" 및 다배수체화-매개된 세포자멸사에 요구됨을 나타낸다. 도 12a는, siRNA 표적화 Bcl-2 네트웍 성분들의 주목된 라이브러리가 HCT116 세포내로 개개 올리고로서 형질감염되었음을 나타낸다. EJ1 및 DLD1 세포(도 12b)를 개개의 NOXA siRNA 또는 BAX 및 BAK siRNA를 함께 사용하여 형질감염시켰다. 도 12a 및 도 12b 둘다에서, 형질감염 후 24시간 째에, 세포를 200 nM AZD1152로 처리하여 다배수를 유도시켰다. AZD1152 첨가 후 72시간 째에, 세포를 1μM ABT-263으로 처리하고 세포 생존능을 ABT-263의 첨가 후 24시간 째에 측정하였다. HCT116 세포(도 12c 및 도 12d)를 대조군, 비표적화 siRNA 또는 NOXA siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포를 200 nM AZD1152로 72시간 동안 처리하였다. 이후에, 1μM ABT-263을 2시간 동안 가한 후 세포 용해 및 Bcl-XL 또는 Mcl-1을 면역침전시켰다. HCT116(도 12e) 세포를 도 12a에서와 같이 주목된 siRNA 라이브러리로 형질감염시키고, 형질감염 후 24시간째에 세포를 200 nM AZD1152로 처리하여 다배수를 유도하였다. AZD1152는 배지를 약물-유리된 성장 배지로 AZD1152의 첨가 후 3 및 7일째에 교체하여 세척하였다. 세포 생존능을 AZD1152의 첨가 후 10일째에 측정하여 다배수체화-유도된 치사율을 평가하였다.
도 13은, ABT-263 및 AZD1152가 생체내에서 상승적인 종양 성장 억제를 생산함을 나타낸다. 도 13a는 실시예 40에서 나타낸 바와 같이, 비히클, ABT-263, AZD1152, 또는 AZD1152과 ABT-263의 병용물의 투여시 마우스에서 HCT116 종양의 성장 곡선을 나타낸다. CT116 종양을 지닌 마우스(도 13b)를 비히클 또는 AZD 1152(100 mg/kg/일(이후 "mkd", IP, QD로 칭함)로 3 연속일 동안 처리한 후 비히클 또는 ABT-263(75 mkd, PO)을 투여하였다. ABT-263을 투여한 후 4시간 및 8시간 째에, 종양을 수집하고, 종양 용해물을 p53 및 구조적으로 활성인 BAX(활성인 BAX를 특이적으로 검출하는 항체인, 6A7로 IP에 이어서 BAX 면역블롯팅)의 풍부성에 대해 분석하였다. 도 13c는 다배수체 세포에서 Bcl-XL "중독" 및 ABT-263에 대한 민감성에 대한 모델을 나타낸다. 다배수체화는 Mcl-1 단백질을 하향조절하고, NOXA를 유도하고, NOXA와 Mcl-1의 상호작용을 증가시키거나, 이들 효과의 일부 조합물에 의해 Mcl-1을 기능적으로 중화시킨다. 또한, Bcl-XL은 tBID 및 BIK와 같은 BH3-유일한 단백질에 의해 부하된다. 이는 Bcl-XL에 의존하여 세포 생존이 증가되도록 한다. 이러한 의존성 또는 "중독"은 Bcl-XL의 항-세포자멸사 기능을 불가능하게 하고, 다배수 종양 세포에서 신속하고 강력한 세포자멸사를 유발하는, ABT-263과 같은 다배수체화의 분자 결점(Achilles' heel)을 나타낸다.
도 14는 종양 세포주에서 BAK 및 BAX 활성화를 나타낸다. D54MG, SW620, 및 EJ1 세포를 도 17b에서와 같이 처리하였다. 구조적으로 활성인 BAK 및 BAX를 면역침전시키고 면역블롯팅으로 검출하였다.
도 15는 Bcl-2 네트웍에서 유전자 발현 변화를 나타낸다. D54MG, SW620, 및 HCT116 세포를 72시간 동안 200 nM AZD1152, 250 nM MLN8054, 또는 1μM VX-680으로 처리하였다. 당해 처리는 후속적인 세포 아우로라 선택성: 아우로라 B, 아우로라 A, 또는 판-아우로라(pan-Aurora)를 각각 생성한다. Bcl-2 네트웍에서 유전자 발현 변화를 마이크로어레이로 검출하였다. 이들 데이타는 SPOTFIRE®(TIBCO®) 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 연관성 유사성 측정을 사용하여 계층적으로 군집화하였다.
도 16은 Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용체(interactome)의 확인을 나타낸다. 도 17a는 나타낸 Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용인자를 확인하기 위한 작업의 흐름도를 나타낸다. HCT116 세포는 200 nM AZD1152, 1μM ABT-263 또는 병용물로 처리하거나 처리하지 않는다. 내인성 Bcl-XL 및 Mcl-1을 면역침전시키고, 면역침전된 단백질을 겔내 트립신 분해 및 LC-MS/MS에 적용시킨다. 모든 처리 조건으로부터 확인된 단백질을 Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용인자로서 단일 목록으로 통합하고 수동 작제된 Bcl-2 네트웍 맵에 적용한다. 상호작용은 녹색으로 나타낸다. 상호작용 성분들을 후속적으로 공-면역침전 및 면역블롯팅(도 17b 및 도 17c) Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용인자로 확인하였다.
도 18은 Bcl-2 네트웍 성분의 siRNA-매개된 녹다운을 나타낸다. HCT116 세포를 나타낸 바와 같이 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 24시간 째에, 세포를 200 nM AZD1152로 처리하고, 용해물을 72시간 후에 제조하고 면역블롯팅으로 분석하였다. Ral-A는 로딩 대조군 및 siNT, 표적화되지 않은, 대조군 siRNA로서 제공한다.
도 19는 다배수체화-매개된 세포자멸사의 시간-경과를 나타낸다. HCT116 세포를 200 nM AZD1152로 처리하고, 세포 생존능을 나타낸 시간 과정에 걸쳐 측정하였다.
도 20은, Mcl-1이 ABT-263에 대한 다배수체 세포의 감작화에 있어서 NOXA에 대해 상위임을 나타낸다. HCT116 세포(도 20a)를 siRNA로 나타낸 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포를 200 nM AZD1152로 추가로 72시간 동안 처리하였다. 이후에, 세포를 4시간 동안 1μM ABT-263으로 처리하고, 카스파제-3 활성을 측정하였다. HCT116 세포(도 20b)를 나타낸 바와 같이 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포를 200 nM AZD1152로 추가로 72시간 동안 처리하였다. 이후에, 세포를 24시간 동안 1μM ABT-263으로 처리하고, 세포 생존능을 측정하였다.
요약
하나의 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 화학식 II의 화합물 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭(prodrug), 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00001
상기 화학식 II에서,
X3은 Cl 또는 F이고;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)2, N(CH3)(CH(CH3)2), 7-아자사이클로[2.2.1]헵탄-1-일 또는 2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일이며,
R0는
Figure pct00002
이고, 여기서
X5는 CH2, C(CH3)2 또는 CH2CH2이고;
X6 및 X7은 둘다 수소이거나 둘다 메틸이며;
X8은 F, Cl, Br 또는 I이거나;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)(CH(CH3)2) 또는 7-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-1-일이고,
R0는
Figure pct00003

; 또는
X4는 N(CH3)2 또는 모르폴린-1-일이고,
R0는
Figure pct00004

이다.
추가의 국면은 화학식 II의 화합물, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함하며, 여기서 X3은 Cl 또는 F이고;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)2, N(CH3)(CH(CH3)2), 7-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-1-일 또는 2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일이며,
R0는
Figure pct00005

이고, 여기서
X5는 CH2, C(CH3)2 또는 CH2CH2이며;
X6 및 X7은 둘다 수소이거나 둘다 메틸이고;
X8은 F, Cl, Br 또는 I이거나;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)(CH(CH3)2) 또는 7-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-1-일이고,
R0는
Figure pct00006

이거나; 또는
X4는 N(CH3)2 또는 모르폴린-1-일이고,
R0는
Figure pct00007

이다.
추가의 다른 국면은 화학식 II의 화합물, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함하며, 여기서 X3은 Cl 또는 F이고;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)2, N(CH3)(CH(CH3)2), 7-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-1-일 또는 2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일이며,
R0는
Figure pct00008

이고, 여기서 X5는 CH2, C(CH3)2 또는 CH2CH2이고, X6 및 X7은 둘다 수소이거나 둘다 메틸이며;
X8은 F, Cl, Br 또는 I이다.
추가의 다른 국면은 화학식 II의 화합물, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함하며, 여기서 X3은 Cl 또는 F이고;
X4는 아제판-1-일, 모르폴린-1-일, 피롤리딘-1-일, N(CH3)(CH(CH3)2) 또는 7-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-1-일이며;
R0는
Figure pct00009

이고, 여기서 X6 및 X7은 둘다 수소이거나 둘다 메틸이며;
X8은 F, Cl, Br 또는 I이다.
추가의 다른 국면은 화학식 II의 화합물, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함하며, 여기서 X3은 Cl 또는 F이고;
X4는 N(CH3)2 또는 모르폴린-1-일이며;
R0는
Figure pct00010

이고;
X8는 F, Cl, Br 또는 I이다.
추가의 다른 국면은 화학식 II의 화합물, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물을 포함하며, 여기서 X3은 F이고; X4는 모르폴린-1-일이며;
R0는
Figure pct00011

이고, 여기서 X5는 C(CH3)2이고; X6 및 X7은 둘다 메틸이며;
X8은 Cl이다.
추가의 다른 국면은
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)-프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드(달리는 본원에서 ABT-263으로 언급됨),
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1- ((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-1-사이클로헵텐-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
4-(((1R)-3-(7-아자비사이클로[2.2.1]헵트-7-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조오일)-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(1,4-옥사제판-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
4-(((1R)-3-(아제판-1-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-N-(4-(4- ((2-(4-클로로페닐)-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)-프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((4-(4-클로로페닐)-5,6-디하이드로-2H-피란-3-일)메틸)피페라진-1- -일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)-아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-((1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-사이클로헵트-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(이소프로필(메틸)아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필) 아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
3-((클로로(디플루오로)메틸)설포닐)-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-1-((페닐설파닐)메틸)-3-(피롤리딘-1-일)프로필)아미노)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-((1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵트-5-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드,
N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-비페닐)-2-일)메틸)-1-피페라지닐)벤조일)-4- (((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드, 및
N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-비페닐)-2-일)메틸)-1-피페라지닐)벤조일)-4- (((1R)-3-(4-모르폴리닐)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드, 및 이의 치료학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 프로드럭의 염 및 대사산물.
추가의 다른 국면은 하나 이상의 항세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질 또는 항세포자멸사 Bcl-w 단백질을 발현하는 질환을 치료하기 위한 조성물을 포함하며, 당해 조성물은 부형제 및 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 포함한다.
추가의 다른 국면은 하나 이상의 항세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질 또는 항세포자멸사 Bcl-w 단백질을 발현하는 환자에서 질환을 치료하는 방법을 포함하며, 당해 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 비정상적인 세포 성장 및/또는 조절되지 않는 세포자멸사의 질환, 예를 들면, 메소티올로마(mesothioloma), 방광암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위장(위, 결장직장 및 십이지장), 만성 림프구 백혈병, 식도 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 고환암, 간세포암(간 및 쓸개관), 원발성 또는 2차 중추 신경계 종양, 원발성 또는 2차 뇌 종양, 호지킨병(Hodgkin's disease), 만성 또는 급성 백혈병, 만성 흑색종 백혈병, 림프구 림프종, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 및 자궁의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌 줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질 암, 담낭 암, 비장의 암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들의 하나 이상의 조합을 포함하는 암을 치료하기 위한 부형제 및 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물을 포함한다.
추가의 다른 국면은 메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위장(위, 결장직장 및 십이지장), 만성 림프구 백혈병, 식도 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 고환암, 간세포암(간 및 쓸개관), 원발성 또는 2차 중추 신경계 종양, 원발성 또는 2차 뇌 종양, 호지킨병, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 흑색종 백혈병, 림프구 림프종, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 및 자궁의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌 줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질 암, 담낭 암, 비장의 암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들의 하나 이상의 조합을 포함하는 암을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 상기 환자에게 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 경부암, 만성 림프구 백혈병, 결장직장암, 식도암, 간세포암, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 골수성 백혈병, 흑색종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암 및 비장암을 치료하기 위한, 부형제 및 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 포함하는, 조성물을 포함한다.
추가의 다른 국면은 방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 경부암, 만성 림프구 백혈병, 결장직장암, 식도암, 간세포암, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 골수성 백혈병, 골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암 및 비장암을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 환자에서 하나 이상의 항세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질 또는 항세포자멸사 Bcl-w 단백질이 발현되는 질환을 치료하기 위한 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 부형제 및 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 치료학적 유효량의 하나의 추가의 치료제 또는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
추가의 다른 국면은 환자에서 하나 이상의 항세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질 또는 항세포자멸사 Bcl-w 단백질이 발현되는 질환을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 치료학적 유효량의 하나의 추가의 치료제 또는 하나 이상의 추가의 치료제를 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위장(위, 결장직장 및 십이지장), 만성 림프구 백혈병, 식도 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘(adrenal gland)의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 고환암, 간세포암(간 및 쓸개관), 원발성 또는 2차 중추 신경계 종양, 원발성 또는 2차 뇌 종양, 호지킨병, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 흑색종 백혈병, 림프구 림프종, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 및 자궁의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌 줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질 암, 담낭 암, 비장의 암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들의 하나 이상의 조합을 치료하기 위한 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 부형제 및 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 하나의 추가의 치료제 또는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
추가의 다른 국면은 메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위장(위, 결장직장 및 십이지장), 만성 림프구 백혈병, 식도 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 고환암, 간세포암(간 및 쓸개관), 원발성 또는 2차 중추 신경계 종양, 원발성 또는 2차 뇌 종양, 호지킨병, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 흑색종 백혈병, 림프구 림프종, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 및 자궁의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌 줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질 암, 담낭 암, 비장의 암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들 중의 하나 이상의 조합을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 하나의 추가의 치료제 또는 하나 이상의 추가의 치료제를 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 환자에서 메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위장(위, 결장직장 및 십이지장), 만성 림프구 백혈병, 식도 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 고환암, 간세포암(간 및 쓸개관), 원발성 또는 2차 중추 신경계 종양, 원발성 또는 2차 뇌 종양, 호지킨병, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 흑색종 백혈병, 림프구 림프종, 림프모구 백혈병, 소포 림프종, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포 폐암, 전립선암, 소 세포 폐암, 신장 및 자궁의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중추신경계의 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비 호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌 줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질 암, 담낭 암, 비장의 암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들 중의 하나 이상의 조합을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 하나 이상의 에토포시드, 빈크리스틴, CHOP, 리툭시마브, 라파마이신, R-CHOP, 보르테조미브, MLN8237, 토자세르티브(또한 VX-680 또는 MK-0457로 공지됨), PHA-739358, AT9283, AZD1152, BI811283, ENMD-2076, CYC116, AMG900, PF-03814735, R763, SNS-314 또는 TAK-901을 투여함을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 에토포시드를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 빈크리스틴을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 CHOP를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 리툭시마브를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 라파마이신을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 R-CHOP를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 외투-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면은 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물 및 보르테조미브를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 외투-세포 림프종을 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은
a) 암으로 고생하는 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제를 투여하는 단계; 및
b) 상기 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제일 수 있다. 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 보다 구체적으로, 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제이다. 예를 들면, 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘이다.
상기 방법에서, Bcl-2 계열 단백질 억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적인 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다.
다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제들의 병용물에 관한 것이다. 당해 병용물은
a) 환자에서 하나 이상의 암 세포에서 다배수체화를 유도하는데 사용하기 위한 적어도 하나의 다배수 유도제; 및
b) 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 포함한다.
상기 병용물에서, 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제일 수 있다. 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 보다 구체적으로, 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제이다. 예를 들면, 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘이다.
상기 병용물에서, Bcl-2 계열 단백질 억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적인 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다.
추가의 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하기에 적격인 환자를 분류하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은
a) 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
b) 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여, 상기 환자를 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료를 제공받기에 적격한 것으로 분류하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제일 수 있다. 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 보다 구체적으로, 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제이다. 예를 들면, 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘이다.
상기 방법에서, Bcl-2 계열 단백질 억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적인 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다.
상기 방법에서, 시험 시료는 조직 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 시험 시료는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료 또는 말초 혈액 시료중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료를 포함한다.
또한, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 동소 하이브리드화(in situ hybridization)로 수행할 수 있다. 예를 들면, 동소 하이브리드화는 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 동소 하이브리드화는 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 추가의 다른 대안에서, 동소 하이브리드화는 펩타이드 핵산 프로브로 수행한다.
또한, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행할 수 있다.
상기 방법에서, 환자는 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이를 병용한 치료를 동시에 제공받을 수 있다.
다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 환자를 모니터링하고 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은
a) 암으로 고생하며 현재 적어도 하나의 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 현재 치료중인 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
b) 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 상기 환자를 계속 치료하여야 하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제일 수 있다. 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 보다 구체적으로, 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제일 수 있다. 예를 들면, 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘이다.
상기 방법에서, Bcl-2 계열 단백질 억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적인 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 시험 시료는 조직 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조직 시료는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료 또는 말초 혈액 시료 중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료를 포함한다.
또한, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 동소 하이브리드화에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 동소 하이브리드화는 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 동소 하이브리드화는 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 추가의 다른 대안에서, 동소 하이브리드화는 펩타이드 핵산 프로브로 수행한다.
또한, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행할 수 있다.
상기 방법에서, 환자는 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이를 병용한 치료를 동시에 제공받을 수 있다.
추가의 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 조합물로 치료에 대해 내성인 암을 갖는 환자를 분류하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은
a) 암으로 고생하는 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여 상기 환자가 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료에 대해 내성인 암을 가진 것으로 분류하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제일 수 있다. 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 보다 구체적으로, 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제이다. 예를 들면, 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘이다.
상기 방법에서, Bcl-2 계열 단백질 억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적인 억제제 또는 이들의 병용물일 수 있다. 상기 방법에서, 상기 시험 시료는 조직 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조직 시료는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료 또는 말초 혈액 시료 중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료를 포함한다.
또한, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 동소 하이브리드화에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 동소 하이브리드화는 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 동소 하이브리드화는 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행한다. 추가의 다른 대안에서, 동소 하이브리드화는 펩타이드 핵산 프로브로 수행한다.
또는, 상기 방법에서, 측정 단계 (b)는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행할 수 있다.
상기 방법에서, 환자는 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이를 병용한 치료를 동시에 제공받을 수 있다.
발명의 자세한 설명
하나의 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 종양 및 암 세포에 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제 및 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여하는 경우 당해 세포내에서 발생하는 상승 효과의 발견에 관한 것이다. 구체적으로, 본원 명세서의 교시내용의 발명자들은, 특정 종양 및 암 세포에서 다배수체화의 유도가, Bcl-XL의 항-세포자멸사 활성에 의존하는 이들 생성되는 다배수체 세포의 생존을 야기하거나 부여함을 발견하였다. 보다 구체적으로, 이들 종양 및 암 세포에서 다배수의 유도는 이들 세포를 Bcl-XL 억제에 대해 감작화시킨다. 따라서, 본 발명자들은, 이들 세포에서 세포자멸사 또는 세포 사멸을 유도하기 위한 다배수-매개된 방법을 개발하였다. 당해 방법은 암으로 고생하는 환자에게 치료제들의 병용물을 투여함을 포함한다. 구체적으로, 환자는 적어도 하나의 다배수 유도제를 투여받는다. 다배수 유도제의 목적은 하나 이상의 암 세포내에서 다배수를 유도하는 것이다. 본원에서 앞서 언급한 바와 같이, 다배수의 유도 후, 이들 다배수체 종양 및 암 세포의 생존은 Bcl-XL에 대해 의존적이다. 다배수 종양 및 암 세포의 세포자멸사 또는 사멸은 환자에게 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여함으로써 수득되거나 달성될 수 있다. 적어도 하나의 다배수 유도제 및 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 투여되는 순서는 중요하지 않다. 그러나, 종양 및 암 세포는, 다배수체의 유도 후까지 Bcl-2 계열 단백질 억제제에 대해 감작화되지 않으므로, 적어도 하나의 다배수 유도제를 환자에게 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제 이전에 또는 이와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 상기 발견과 관련하여, 본원 명세서의 교시내용의 발명자들은 또한, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 종양 및 암 세포(이들 세포가 다배수에 대해 유도되는지 또는 유도되지 않는지에 상관없이)가 면역성이거나 다배수의 유도(적어도 하나의 다배수 유도제를 사용하는 것과 같은) 후 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 사용한 처리에 대해 내성을 나타냄을 발견하였다. 다시 말해서, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 다배수 종양 및 암 세포는 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제로 동시에 또는 후속적으로 처리하는 경우 세포자멸사 또는 세포 사멸을 나타내지 않거나 경험하지 않는다.
따라서, 이러한 추가의 발견의 측면에서, 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 또한 다배수 유도제(아우로라 키나제 억제제와 같은) 치료요법, Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법의 병용에 대한 내성에 대해 암 및 종양 세포를 모니터링하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본원 명세서의 교시내용은 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 대해 시험 시료를 평가함을 포함하여 암 환자를 확인하고, 분류하며 모니터링하기 위한 진단 검사를 제공한다. 본 발명의 검사는 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법 또는 다배수 유도제 및 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법[병용 치료요법과 함께 또는 추가의 다른 치료요법(예를 들면, 화학치료요법, 방사선 또는 이들의 병용과 같은)과 함께의 병용 치료요법으로서]을 제공받기에 적격인 환자를 확인하고 이러한 치료요법에 대한 환자 반응을 모니터링하는 검사 방법을 포함한다. 본원 명세서의 교시내용은 예를 들면, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 동소 하이브리드화(in situ hybridization) 존재 또는 부재하에서 형광성에 의해 측정함을 포함한다. 본원의 방법은 다배수의 유도 전에 또는 다배수의 유도 후에 수행할 수 있다. (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 기본선(또는 예정된) 수준에 걸쳐 하나 이상의 돌연변이에 있어서의 증가 또는 하나 이상의 돌연변이를 가진 것으로 분류된 환자는 다음의 치료요법 각각에 거의 반응하지 않는 것으로 고려될 수 있으므로, 당해 환자는 적어도 하나의 다배수 유도제, 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법의 병용 치료요법을 제공받는데 적격인 것으로 고려될 수 있다. 구체적으로, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 환자는 적어도 하나의 다배수 유도제(다배수체화를 유도하기 위한)를 사용한 치료 전 또는 치료 후 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 사용한 치료에 대해 면역이거나, 내성이거나 거의 감작화되지 않는 것으로 여겨진다.
하나의 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제(제3의 치료요법과 함께 또는 이와 병용하여)를 사용한 치료에 적격인 것으로 환자를 확인하거나 분류하는 방법을 포함한다. 당해 방법은:
(a) 환자로부터 조직 시료를 제공하는 단계;
(b) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
(c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제 둘다를 사용한 치료에 대해 적격인 것으로 상기 환자를 분류하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 상기 환자는 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에서 기본선(또는 예정된) 수준을 초과하는 하나 이상의 돌연변이의 수에 있어서의 증가 또는 적어도 하나의 돌연변이의 존재에 기초하여, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제 둘다를 사용한 치료에 대해 적격일 수 있다. 본원에 앞서 언급한 방법을 사용하는 경우에서와 같이, 당해 방법은 환자에서 다배수의 유도 전 또는 후에 수행할 수 있다.
당해 국면에서, 암은 결장직장 암종 또는 췌장 암과 같은 어떠한 유형의 암일 수 있다. 또한, 당해 국면에서, 유전자 증폭은 다중-색 형광성 동소 하이브리드화(FISH) 검사에 의해, 예를 들면, 폐암 종양 생검 시료상에서 수행할 수 있다. 다른 국면에서, 정량적 폴리머라제 쇄 반응(Q-PCR) 방법이 사용된다.
추가의 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제, 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료요법에 대해 내성인 암을 지닌 환자를 확인하거나 분류하는 방법을 포함하며, 당해 방법은
(a) 환자로부터 시험 시료(예를 들면, 조직 시료와 같은)를 제공하는 단계;
(b) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
(c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재에 기초하여, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 조합물에 대해 내성인 암을 가진 것으로 상기 환자를 분류하는 단계를 포함한다. 본원의 앞에서 언급한 방법을 사용하는 경우에서와 같이, 당해 방법은 환자에서 다배수의 유도 전 또는 후에 수행될 수 있다.
당해 국면에서, 암은 결장직장 암종 또는 췌장 암과 같은 어떠한 유형의 암일 수 있다. 또한, 당해 국면에서, 유전자 증폭은 다중-색 형광성 동소 하이브리드화(FISH) 검사에 의해 측정할 수 있으며, 예를 들면, 폐암 종양 생검 시료상에서 수행할 수 있다. 다른 국면에서, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)이 사용된다.
추가의 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제, 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료받는 환자를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은:
(a) 적어도 하나의 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용으로 치료받는 암 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계(임의로, 조직 시료로부터 수득된 종양 또는 암 세포를 확인하거나 추출할 수 있다);
(b) 시험 시료(예를 들면, 종양 또는 암 세포)내에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
(c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 돌연변이의 수를 기본선 수준 또는 예정된 수준에 대해 비교하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서의 비교에 기초하여, 상기 환자가 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용으로 계속 치료되어야 하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 본원에서 앞서 언급한 방법을 사용하는 경우에서와 같이, 당해 방법은 환자에서 다배수의 유도 전 또는 후에 수행할 수 있다.
시험 시료로부터 측정된 하나 이상의 돌연변이의 수와 기본선 또는 예정된 수준의 비교(또는 정보 분석)는, 검사를 수행하는 장치(예를 들면, 컴퓨터 플랫폼)의 일부 또는 이와 호환가능한 소프트웨어 프로그램 또는 정보 시스템과 같은 자동화된 시스템으로 수행할 수 있다. 또는, 당해 비교 또는 정보 분석은 주치의에 의해 수행될 수 있다.
구체적으로, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 시험 시료(예를 들면, 종양 또는 암 세포)가 기본선 수준 또는 예정된 수준과 동일하거나 이보다 더 높은 경우, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료는 중지되거나, 정지되거나 종결될 수 있다. 또는, 치료하는 주치의는 병용 치료요법으로서 다배수 유도제와 적어도 제2의 치료요법(예를 들면, 제2의 소 분자를 사용한 치료)를 병용할 것을 결정할 수 있다. 추가의 추가의 대안으로, 치료하는 주치의는 병용 치료요법으로서 Bcl-2 계열 단백질 억제제와 적어도 제2의 치료요법(예를 들면, 제2의 소 분자를 사용한 치료)을 병용할 것을 결정할 수 있다. 그러나, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자 (사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이가 기본선 수준 또는 예정된 수준 미만이거나, 돌연변이가 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자 (사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내에서 검출되지 않는 경우, 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료를 지속할 수 있다. 다시, 상기 치료로 수득된 결과에 따라, 치료하는 주치의는 병용 치료요법으로서 다배수 유도제와 적어도 제2의 치료요법(예를 들면, 제2의 소 분자를 사용한 치료)을 결합하는 것을 결정할 수 있다. 또는, 상기 치료로 수득된 결과에 따라, 치료하는 주치의는 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법과 적어도 제2의 치료요법(예를 들면, 제2의 소 분자를 사용한 치료)를 병용할 것을 결정할 수 있다.
다시, FISH 및 PCR 방법을 사용하여 환자로부터 수득된 시험 시료 속에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
본원 명세서의 교시내용은 또한 예를 들면, PCR 프라이머, FISH 프로브 등으로서 사용되도록 가공된 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드를 포장한 키트(kit)에 관한 것이다.
본원 명세서의 교시내용은 암 치료요법, 및 특히 다배수 유도제 치료요법, Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법 또는 다배수 유도제 치료요법과 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법의 병용물에 대한 환자의 개선된 계층화를 제공하는 유의한 능력을 갖는다. 본원 명세서의 교시내용에 따른 이들 바이오마커의 측정은 또한 치료요법에 대한 개개 환자 반응의 추적을 허용한다.
A. 정의
본 단락 및 본원 명세서 전체 교시내용에서 사용된 것으로서 단락 제목은 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는, 내용이 명확하게 달리 기술하지 않는 한 다수의 언급을 포함한다. 본원에서 수치 범위의 인용의 경우, 동일한 정밀도 사이에 존재하는 각각의 개재 수도 명백하게 고려된다. 예를 들면, 6 내지 9의 범위의 경우, 숫자 7 및 8도 6 및 9외에 고려되며, 6.0 내지 7.0의 범위의 경우, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0도 명백하게 고려된다.
a) 항종양발생
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항종양발생"은 종양 성장의 감소를 말한다.
b) 아우로라 키나제 억제제
"아우로라 키나제 억제제"는 아우로라 키나제 A, 아우로라 A, 아우로라 키나제 B, 아우로라 B, 아우로라 키나제 C 또는 아우로라 C 중 적어도 하나에 결합하여, 핵산 또는 단백질에 관련된 적어도 하나의 아우로라 키나제 A, 아우로라 A, 아우로라 키나제 B, 아우로라 B, 아우로라 키나제 C 또는 아우로라 C의 활성을 길항하는 소 분자, 항체, 안티센스, 소 방해 RNA, 또는 마이크로RNA-계 화합물을 포함하는 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적이거나 선택적인)의 치료학적 화합물을 말한다.
c) 아우로라 키나제 A 억제제
"아우로라 키나제 A 억제제"는 아우로라 키나제 A 또는 아우로라 A 중 적어도 하나에 결합하여, 핵산 또는 단백질에 관련된 아우로라 키나제 A 또는 아우로라 A의 활성을 길항하는 소 분자, 항체, 안티센스, 소 방해 RNA, 또는 마이크로RNA-계 화합물을 포함하는 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적이거나 선택적인)의 치료학적 화합물을 말한다. 본원 명세서의 교시내용의 방법은 어떠한 공지되거나 이후에 개발된 아우로라 키나제 A 억제제와 함께 유용하다. 아우로라 키나제 A 억제제의 예는 PHA-739358, MLN-8054, R-763, JNJ-7706621, MP-529 및 MP-235이다.
d) 아우로라 키나제 B 억제제
"아우로라 키나제 B 억제제"는 아우로라 키나제 B 또는 아우로라 B 중 적어도 하나에 결합하여, 핵산 또는 단백질에 관련된 아우로라 키나제 B 또는 아우로라 B의 활성을 길항하는 소 분자, 항체, 안티센스, 소 방해 RNA, 또는 마이크로R A-계 화합물을 포함하는 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적이거나 선택적인)의 치료학적 화합물을 말한다. 예를 들면, 다수의 아우로라 키나제 B 억제제는 적어도 하나의 히스톤 H3 포스포릴화 또는 세포 분열을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 다수의 아우로라 키나제 B 억제제가 적어도 하나의 세포 시스템(급성 골수 백혈병 세포주, 주요 급성 골수 백혈병 배양물 등과 같은)에서 세포자멸사를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 본원 명세서의 교시내용의 방법은 어떠한 공지되거나 이후에 개발된 아우로라 키나제 B 억제제와 함께 유용하다. 아우로라 키나제 B 억제제의 예는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 및 헤스페라딘이다.
또한 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-플루오로페닐)아미노]-2-옥소에틸}-1H-피라졸-3-일)아미노]-퀴나졸린-7-일}옥시)프로필](에틸)아미노]에틸 디하이드로겐 포스페이트로 공지된 AZD1152는 피라졸로퀴나졸린 아우로라 키나제 억제제 (AZD1152-하이드록시퀴나졸린 피라졸 아닐리드(HQPA))의 프로드럭이며 혈장에서 활성 AZD1152-HQPA로 신속하게 전환된다[참조: Mortlock, A A, et al., J. Med. Chem., 50:2213-24 (2007)]. AZD1152-HQPA는 아우로라 B의 매우 강력하고 선택적인 억제제이다.
또한 4-(4-(N-벤조일아미노)아닐리노)-6-메톡시-7-(3-(1-모르폴리노)프로폭시)퀴나졸린으로 공지된 ZM447439는 퀴나졸린 유도체이며, 아우로라 A 및 아우로라 B를 억제한다. ZM447439의 화학적 구조는 문헌[참조: Ditchfield, C., et al., J. Cell Bio., 161(2):267-280 (2003) 및 Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005)]에 제공된다.
VX-680/MK0457은 {4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일)-6-(5-메틸-2H-피라졸-3-일아미노)-피리미딘-2-일설파닐]-페닐}-아미드의 사이클로프로판 카복실산이며 아우로라 A, 아우로라 B 및 아우로라 C를 억제한다. VX-680/MK0457의 화학적 구조는 문헌[참조: Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005)]에 제공된다.
헤스페라딘, 인돌리논은 아우로라 B를 억제한다. 헤스페라딘의 화학적 구조는 문헌[참조: Hauf, S., et al., J. Cell Bio., 161(2):281-294 (2003) 및 Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005)]에 제공된다.
e) 아우로라 키나제 C 억제제
"아우로라 키나제 C 억제제"는 아우로라 키나제 C 또는 아우로라 C 중 적어도 하나에 결합하여, 핵산 또는 단백질 관련된 아우로라 키나제 C 또는 아우로라 C의 활성을 길항하는, 소 분자, 항체, 안티센스, 소 방해 RNA, 또는 마이크로 RNA-계 화합물을 포함하는 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적 또는 선택적)의 치료학적 화합물을 말한다. 본원 명세서의 교시내용의 방법은 어떠한 공지되거나 이후 개발된 아우로라 키나제 C 억제제와 함께 유용하다. 아우로라 키나제 C 억제제의 예는 AZD1152 및 VX-680/MK-0457이다.
f) 서열 동질성 %를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진
"서열 동질성 %를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진"은, 폴리뉴클레오타이드가 길이에 있어서 실질적으로 상이하지 않지만 서열에 있어 실질적으로 상이할 수 있음을 의미한다. 따라서, 100개의 뉴클레오타이드의 공지된 서열 "B"에 대해 적어도 80% 서열 동질성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 "A"는, 폴리뉴클레오타이드 "A"가, 길이가 약 100개 뉴클레오타이드(nts)이지만, 20개 nts까지가 "B" 서열로부터 변할 수 있음을 의미한다. 문제의 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들면, 1 내지 15개의 뉴클레오타이드의 첨가가 실질적으로 동일하지 않은 서열이 첨가되어 의도된 제2의 구조를 창조하는 경우에서와 같이, 프로브, 프라이머 및 다른 분자 도구 등의 특수 유형을 생산하는 것과 같은, 말단의 변형으로 인해 보다 길어지거나 보다 짧아질 수 있다. 이러한 동일하지 않은 뉴클레오타이드는, 서열이 "로 필수적으로 이루어진"에 의해 변형되는 경우 서열 동질성의 계산시 고려되지 않는다.
g) Bcl-2
본원에 사용된 것으로서, 용어 "Bcl-2"는 세포자멸사에 대한 중요한 조절 점을 구성하는 프로- 및 항-세포자멸사 단백질의 계열을 말한다. 당해 계열의 구성원들은 프로- 및 항-세포자멸사 단백질 둘다를 포함하며 Bcl-2 상동성(BH) 1-4 도메인으로 명명된 4개 이하의 보존된 영역에서 상동성을 공유한다. 당해 계열은 3개의 주요 소-부류로 나누어질 수 있다: 항-세포자멸사 단백질, 프로-세포자멸사 단백질, "BH3-만의" 단백질.
Bcl-2 및 Bcl-XL을 포함하는 항-세포자멸사 단백질은 모두 모든 4개의 BH 도메인을 통해 상동성을 공유하는 "다중도메인"이다. 그러나, 프로-세포자멸사 단백질은 또한 소분리되어 BH1-3 도메인에서 서열 상동성을 소유하는, BAX 및 BAK와 같은 다중도메인 단백질을 포함한다. 보다 멀게 관련된 "BH3-만의" 단백질은 지금까지 모두 프로-세포자멸사이며 이들의 세포자멸사 기능에 요구되는 양친매성의 α-나선 BH3 영역내 서열 상동성을 공유한다.
사람 BAK를 암호화하는 사람 BAK 유전자는, 수탁번호 제U23765호이며, 문헌[참조: Chittenden et al. Nature 374:733-736 (1995)]에 기술되어 있다. 사람 BAK-2 유전자는 수탁번호 제U16812호이며, 문헌[참조: Kiefer et al., Nature 374:736-739 (1995)]에 기술되어 있다. 사람 BAX를 암호화하는 사람 BAX 유전자는 수탁번호 제L22475호, 제L22474호 및 제L22473호이며, 문헌[참조: Oltvai et al., Cell 74:609-619 (1993)]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 어절 "사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자"는 적어도 하나의 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 단백질 또는 예를 들면, 사람 BAK 또는 사람 BAX와 같은 이의 단편을 암호화하는 유전자를 말한다.
"BH3-만의 단백질"은 Bcl-2 계열의 제3 소세트를 구성하며, 예를 들면, BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM 및 BAD를 포함한다. 이들 단백질은 양친매성-나선 BH3 영역에서만 서열 상동성을 공유하며, 나타낸 당해 돌연변이 분석은 이들의 사멸 활성에 대한 프로-세포자멸사 구성원에서 요구된다.
사람 BID를 암호화하는 사람 BID 유전자는 수탁번호 제NM_197966호, 제NM_197967호, 제NM_001196호이며 진뱅크(Genbank)에 기술되어 있다. 사람 NOXA를 암호화하는 사람 NOXA 유전자는 수탁 번호 제NM_021127호이며 진뱅크에 기술되어 있다. 사람 PUMA를 암호화하는 사람 PUMA 유전자는 수탁번호 제NM_001127242호, NM_001127241호, 제NM_001127240호, 제NM_014417호이며 진뱅크에 기술되어 있다. 사람 BIK를 암호화하는 사람 BIK 유전자는 수탁번호 제NM_001197호이고 진뱅크에 기술되어 있다. 사람 BIM을 암호화하는 사람 BIM 유전자는 수탁 번호 제NM_138621호, 제NM_207002호, 제NM_006538호, 제BCO33694호, 제AY305714호, 제AY305716호, 제AY423443호, 제AY423442호, 제AY423441호이며 진뱅크에 기술되어 있다. 사람 BAD를 암호화하는 사람 BAD 유전자는 수탁번호 제NM_032989호, 제NM_004322호, 제BC095431호이고 진뱅크에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 어절, "사람 BH3 암호화 유전자"는 적어도 하나의 사람 Bcl-2 BH3-만의 단백질 또는 예를 들면, 사람 BID, 사람 NOXA, 사람 PUMA, 사람 BIK, 사람 BIM 및 사람 BAD와 같은 이의 단편을 암호화하는 유전자를 말한다.
h) Bcl -2 계열 단백질 억제제, Bcl -2 계열 억제제 또는 Bcl -2 계열 단백질의 억제제
본원에 사용된 것으로서, 본원에 상호교환적으로 사용된 어절 "Bcl-2 계열 단백질 억제제", "Bcl-2 계열 억제제" 또는 "Bcl-2 계열 단백질의 억제제"는 미토콘드리아 외막 침투(MOMP)를 지배하고 항-세포자멸사(Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bcl-B, BFL-1 및 MCI-1과 같은)인 적어도 하나의 Bcl-2 계열의 유전자 또는 단백질에 결합하고 이의 활성을 길항하거나 억제하는, 소 분자-, 항체-, 안티센스-, 소 방해 RNA, 또는 마이크로RNA-계 화합물을 포함하는, 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적이거나 선택적인)의 치료용 화합물을 말한다. Bcl-2 계열 단백질 억제제의 예는 본원의 단락 B에 기술된 화합물[즉, ABT-263(이는 N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드)], ABT-737 [공개된 미국 특허원 제20050159427호 및 제20060128706호에 기술된 N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-비페닐)-2-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-니트로벤젠설폰아미드], Bcl-XL 억제제 및 이들의 병용물을 포함한다.
i) Bcl - X L 선택적인 억제제(들)
본원에 사용된 것으로서, 어절 "Bcl-XL 선택적인 억제제(들)"은 Bcl-2 보다 Bcl-XL에 대해 선택성을 나타내는 Bcl-XL 억제제를 말한다. Bcl-XL 억제제가 Bcl-XL 선택적인 억제제인지를 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 구체적으로, 이러한 방법은 Bcl-XL 억제제 화합물에 대한 억제 상수(Ki) 및 결합 선택성 비(예를 들면, Bcl-XL Ki:Bcl-2 Ki)를 측정함을 포함한다. 억제 상수(Ki)는 효소-억제제 복합체 또는 단백질/소 분자 복합체의 해리 상수이며, 여기서 소 분자는 하나의 단백질의 다른 단백질 또는 펩타이드에 대한 결합을 억제한다. 억제 상수는 시간 분석된-형광성 공명 에너지 전달(Time Resolved-Fluorescence Resonance Energy Transfer: TR-FRET) 검사를 사용하여 측정할 수 있다. 화합물에 대한 Ki가 ">" (초과) 특정 수치로 나타난 경우, 이는 결합 친화성 값(예를 들면, Bcl-XL의 경우)이 검사시 측정된 것보다 큼을 의미하는 것으로 의도된다. 화합물에 대한 결합 선택성 비가 ">"(초과) 특정 수치로 나타난 경우, 이는, Bcl-2보다 Bcl-XL에 대한 특정 화합물의 선택성이 나타낸 수보다 적어도 큼을 의미하는 것으로 의도된다. 화합물에 대한 Ki이 "<"(미만) 특정 수치로 나타난 경우, 이는, 결합 친화성 값(예를 들면, Bcl-2의 경우)이 사용된 검사의 검출 한계보다 더 작음을 의미하는 것으로 의도된다. 억제 상수는 왕 방정식(Wang's equation)(참조: Wang Zx,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995, 360:111-4)을 사용하여 측정하였다.
j) 발현, 안티센스 억제 및 공-제어
"발현"은 기능성 최종-생성물의 생산을 말한다. 유전자의 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 전구체 또는 성숙한 단백질로의 해독을 포함한다. "안티센스 억제"는 표적 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생산을 말한다. "공-발현"은 동일하거나 실질적으로 유사한 외부 또는 내인성 유전자의 발현을 제어할 수 있는 센스 RNA 전사체의 생산을 말한다(참조: 미국 특허 제5,231,020호).
k) 분리된
본원에 사용된 것으로서, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 용어 "분리된"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 천연 공급원 속에 존재하는 다른 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 또한, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는, 재조합체 기술로 생산된 경우 다른 세포 물질, 또는 배양 배지를 실질적으로 포함하지 않거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다. 하나의 국면에서, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드가 분리된다.
l) 유전자
"유전자"는 암호화 서열의 상부의 조절 서열(5' 비-암호화 서열) 및 하부(3' 비-암호화 서열)를 포함하는, 특수 단백질을 발현하는 핵산 단편을 말한다.
m) 억제 상수 또는 Ki
본원에 사용된 것으로서, "억제 상수" 또는 "Ki"는 효소-억제제 복합체 또는 단백질/소 분자 복합체의 해리 상수를 말하며, 여기서, 소 분자는 하나의 단백질의 다른 단백질에 대한 결합을 억제한다. 큰 Ki 값은 낮은 결합 친화성을 나타내고, 작은 Ki값은 높은 결합 친화성을 나타낸다. Ki는 왕 방정식(참조: Wang Z X,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995; 360:111-4)을 사용함에 의한 것과 같이, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법을 사용하여서도 측정할 수 있다. 항-세포자멸사 단백질 억제제의 결합 친화성의 전형적인 척도는 단백질과 억제제(Ki) 사이의 결합과 해리 공정 사이의 균형이다.
n) 천연 유전자 및 키메라 작제물
"천연 유전자"는 이의 자체 조절 서열과 함께 천연에서 발견되는 유전자를 말한다. 대조적으로, "키메라 작제물"은 천연에서 일반적으로 함께 발견되지 않는 핵산 단편의 조합물을 말한다. 따라서, 키메라 작제물은 상이한 공급원으로부터 기원한 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 기원한 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있으나, 천연에서 정상적으로 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된다.
o) 핵산 서열 동질성 퍼센트(%)
핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동질성 퍼센트(%)"는 경우에 따라 서열을 정렬하고 갭을 도입하여 최대 서열 동질성 퍼센트를 달성한 후, 목적 서열내 뉴클레오타이드와 동일한 후보물 서열내 뉴클레오타이드의 퍼센트로 정의한다. 핵산 서열 동질성 %를 측정하기 위한 목적의 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 각종 방식, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 비교하는 서열의 완전한 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 요구되는 어떠한 알고리즘도 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 측정할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열이 정렬된 경우, 제공된 핵산 서열 D(이는 제공된 핵산 서열 D에, 이와 함께 또는 이에 대해 특정의 핵산 서열 동질성 %를 갖거나 포함하는 제공된 핵산 서열 C로서 대안적으로 표현될 수 있다)에, 이와 함께 또는 이에 대해 제공된 핵산 서열 C의 핵산 서열 동질성 %은 다음과 같이 계산할 수 있다:
핵산 서열 동질성 % = W/Z*100
여기서
W는 C 및 D의 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘의 정렬에 의한 동일한 매치(match)로 기록된 뉴클레오타이드의 수이고,
Z는 D내 뉴클레오타이드의 총 수이다.
핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동등하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동질성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동질성 %와 동일하지 않을 것이다.
p) 폴리머라제 쇄 반응 또는 PCR
다량의 특수 DNA 분절의 합성을 위한 기술인, "폴리머라제 쇄 반응" 또는 "PCR"은 일련의 반복 주기[제조원: 퍼킨 엘머 세투스 인스트루먼츠(Perkin Elmer Cetus Instruments), 코네티컷주 노워크 소재]로 이루어진다. 전형적으로, 이본쇄 DNA가 열-변성되며, 표적 분절의 3' 경계부에 대해 상보성인 2개의 프라이머를 저온에서 어닐링한 후 중간 온도에서 연장시킨다. 이들 3개의 연속적인 단계 중 하나의 세트를 주기로 언급한다.
PCR은 짧은 시간 동안 주형의 반복된 복제에 의해 DNA를 수백만배 증폭시키기 위해 사용된 강력한 기술이다[참조: (Mullis, K., et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1:263-73 (1986)]; 유럽 특허원 제50,424호; 유럽 특허원 제84,796호; 유럽 특허원 제258,017호, 유럽 특허원 제237,362호; 유럽 특허원 제201,184호, 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,582,788호; 및 미국 특허 제4,683,194호]. 당해 공정을 DNA 합성을 프라이밍(priming)하기 위한 특정의 시험관내 합성된 올리고뉴클레오타이드의 세트를 사용한다. 프라이머의 설계는 분석하여야 하는 DNA의 서열에 의존적이다. 당해 기술은 고온에서 주형을 용융시키고, 프라이머가 주형내 상보성 서열에 대해 어닐링되도록 한 후 주형을 DNA 폴리머라제로 복제하는 많은 주기(일반적으로 20 내지 50 주기)를 통해 수행된다.
PCR 반응의 생성물은 아가로즈 겔내에서 분리에 이어 에티디움 브로마이드 염색 및 UV 투조(transillumination)를 사용한 가시화에 의해 분석할 수 있다. 또는, 방사성 dNTP를 PCR에 가하여 생성물내로 표지를 혼입시킬 수 있다. 이 경우, PCR의 생성물은 겔을 x-선 필름에 노출시킴에 의해 가시화된다. 방사선표지된 PCR 생성물의 가해진 장점은, 개개의 증폭 생성물의 수준이 정량화될 수 있다는 것이다.
q) 폴리펩타이드
"폴리펩타이드"는 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 변형된 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 또는 DNA 모사체(PNA와 같은), 및 이의 유도체, 및 이의 동족체의 핵산 중합체이다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 천연적으로 존재하는 핵산 염기, 당 및 공유결합성 내부-뉴클레오타이드(골격) 연결로 구성된 중합체 및 유사하게 기능하는 비-천연적으로 존재하는 부위를 갖는 중합체를 포함한다. 이러한 변형되거나 치환된 핵산 중합체는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 "유사체"로 언급된다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 약 10개 내지 약 160개 또는 200개 뉴클레오타이드 까지의 짧은 폴리뉴클레오타이드이다.
폴리뉴클레오타이드는 또한 핵산 서열의 유사체 및/또는 유도체, 및 이의 동족체를 포함하는, 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 업자[어플라이드 바이오시스템스 USA 인코포레이티드(Applied Biosystems USA Inc.)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 듀퐁(DuPont)(미국 델라웨어주 윌밍턴 소재), 또는 밀리겐(Milligen)(미국 매사추세츠주 베드퍼드 소재)]로부터 입수가능한 것과 같은 상업적으로 입수가능한 장치를 사용한 고체-상 합성과 같은 통상의 기술에 의해 제조할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 변형된 폴리뉴클레오타이드 또한 당해 분야에 공지된 유사한 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다(참조: 미국 특허 제4,948,882호, 제5,464,746호, 및 제5,424,414호).
r) 폴리펩타이드 유사체
본원에 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드 유사체"는 변형된 골격 또는 비-천연의 내부-뉴클레오사이드 연결을 갖는 중합체를 말한다. 변형된 골격은 골격내에 인 원자를 보유하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에티트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 및 인 원자를 더 이상 갖지 않는 것들, 예를 들면, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 내부-뉴클레오사이드 연결에 의해 형성되거나, 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 내부-뉴클레오사이드 연결과 혼합되거나, 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 내부-뉴클레오사이드 연결로 형성된 골격을 포함한다. 변형된 핵산 중합체(유사체)는 하나 이상의 변형된 당 모이어티(moiety)를 함유할 수 있다.
뉴클레오타이드 단위의 당 및 내부-뉴클레오사이드 연결 둘다가 신규 그룹으로 대체된 RNA 또는 DNA 모사체인 유사체가 또한 유용하다. 이들 모사체에서, 염기 단위는 표적 서열과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 탁월한 하이브리드화 특성을 가진 것으로 밝혀진, 이러한 모사체의 예는 펩타이드 핵산(PNA)이다(참조: Buchardt, O., P. Nielsen, and R. Berg. 1992. Peptide Nucleic Acids).
s) 다배수 유도제
본원에 사용된 것으로서, 어절 "다배수 유도제"는 하나 이상이 세포내에서 다배수를 유도하는, 소 분자, 항체, 안티센스, 소 방해 RNA 또는 마이크로RNA-계 화합물을 포함하는, 어떠한 유형(예를 들면, 비-선택적이거나 선택적인)의 치료학적 화합물을 말한다. 하나 이상의 세포에서 다배수의 유도 또는 증거를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 다배수의 증거는 p53의 상승된 발현을 검출함으로써 측정할 수 있다. p53은 야생형 p53을 지닌 세포내에서 다배수체화를 위한 대리인자이다(참조: Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, 7668-77. (2006)]. 또한, 다배수가 유도된 세포는 세포 크기 및 다핵화에 있어서 중대한 형태학적 증가를 나타내며, 이들 둘다는 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
다배수 유도제의 예는 아우로라 키나제 억제제, 미소관 억제제(예를 들면, 탁소테레, 빈크리스틴, 노코다졸, 파클리탁셀 또는 콜세미드와 같은), 판-키나제 억제제(예를 들면, 스타우로스포린과 같은), 온콜리틱 바이러스(oncolytic virus)(예를 들면, ONYX-015와 같은), 아크리딘 오렌지, 돌라스타인-10, 노스카핀, 토포이소머라제 II 억제제(예를 들면, ICRF-187 또는 ICRF-193과 같은), 2-{4-[(7-클로로-2-퀴녹살리닐)옥시]페녹시}프로피온산, 2-{4-[(7-브로모-2-퀴놀리닐)옥시]페녹시}프로피온산, 플라티코딘 D, 미소관 독소(예를 들면, JG-03-14와 같은), 액틴 중합화 억제제(예를 들면, 사이토칼라신 B와 같은), 비스트라미드 A 또는 항종양 항생제(예를 들면, 미트라마이신 SKI와 같은)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
t) 예정된 수준
본원에 사용된 것으로서, 용어 "예정된 수준"은 일반적으로 예정된 수준에 대해 검사 결과를 비교함으로써 진단 결과를 평가하는데 사용되는 컷-오프 값(cut-off value) 검사를 말하며, 여기서 예정된 수준이 각종 임상 매개변수[예를 들면, 질환의 위험, 중증도, 진행/비-진행/개선의 평가, 시험 시료의 노화 측정, 시험 시료(예를 들면, 혈청 또는 혈장)가 용혈되어 있는지에 대한 측정 등]와 이미 연결되거나 관련되어 있다. 사용될 수 있는 예정된 수준의 예는 하나 이상의 질환 또는 상태로 임의로 고생할 수 있는 하나 이상의 대상체로부터 수득된 기본선 수준이다. 컷오프 값이 검사의 특성에 따라 변할 수 있음을 잘 공지되어 있다. 또한 본원 명세서의 교시내용을 다른 검사에 대해 조정하여 당해 설명을 기초로 다른 검사에 대해 검사-특이적인 컷-오프 값을 수득하는 것은 당해 분야의 숙련가에게 익숙하다.
u) 프라이머 또는 프로브
본원에 사용된 것으로서 "프로브" 또는 "프라이머"는, 길이가 적어도 8개 뉴클레오타이드이고 표적 영역내 서열과 프로브 또는 프라이머내 적어도 하나의 서열의 상보성에 기인하여, 표적 서열과 하이브리드 구조를 형성하는 폴리뉴클레오타이드이다. 프로브의 폴리뉴클레오타이드 영역은 DNA 및/또는 RNA 및/또는 합성 뉴클레오타이드 유사체로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 폴리머라제 쇄 반응 동안에 표적 서열을 준비하는데 사용된 서열 또는 서열들에 대해 상보성인 서열을 함유하지 않는다.
v) 재조합체
"재조합체"는 예를 들면, 화학적 합성 또는 유전 가공 기술에 의한 핵산의 분리된 분절의 조작에 의한, 2개의 달리 분리된 서열의 분절의 인공적인 조합물을 말한다.
w) 특이적으로 하이브리드화되는
"특이적으로 하이브리드화되는"은 제2 핵산에 대해 검출가능하게 및 특이적으로 결합하는 핵산의 능력을 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 비-특이적인 핵산에 의해 검출가능한 결합의 적절한 양을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건하에서 표적 핵산 쇄와 특이적으로 하이브리드화한다.
x) 스트링전시( stringency ) 또는 스트링전트 조건
상보성 단편을 하이브리드화하는 일본쇄 DNA의 특이성은 반응 조건의 스트링전시로 측정한다. 하이브리드화 스트링전시는 DNA 이중쇄(duplex)를 형성하는 경향이 감소함에 따라 증가한다. 핵산 하이브리드화 반응에서, 스트링전시는 특이적인 하이브리드화(고 스트링전시)를 선호하기 위해 선택될 수 있다. 거의 특이적이지 않은 하이브리드화(저 스트링전시)를 사용하여 관련된, 그러나 정확하지 않은 DNA 분자(동종, 그러나 동일하지 않은) 또는 분절을 확인할 수 있다.
DNA 이중쇄는 (1) 상보성 염기 쌍의 수, (2) 염기 쌍의 유형, (3) 반응 혼합물의 염 농도(이온 강도), (4) 반응물의 온도 및 (5) DNA 이중쇄 안정성을 감소시키는, 포름아미드와 같은 특정 유기 용매의 존재에 의해 안정화된다. 일반적인 시도는 온도를 변화시키는 것이며: 더 높은 상대 온도는 스트링전트 반응 조건을 보다 더 생성한다(참조: 하이브리드화 반응의 스트링전시의 탁월한 설명을 제공하는, Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, et al. 1987. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York).
"스트링전트 조건"하에서 하이브리드화는, 서로에 대해 적어도 60% 상동성인 뉴클레오타이드 서열이 하이브리드화되어 남아있는 하이브리드화 프로토콜을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 펩타이드(예를 들면, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한)와 같은 다른 첨부된 그룹, 또는 세포막을 통과하는 수송을 촉진하는 제제를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화-개시된 절단제[참조: van der Krol et al., Biotechniques. 6:958-76 (1988)] 또는 인터카큘레이팅제(intercalculating agent)[참조: Zon, G., Pharm Res. 5:539-49 (1988)]로 변형시킬 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 다른 분자, 예를 들면, 펩타이드, 하이브리드화 개시된 교차-결합제, 수송제, 하이브리드화-개시된 절단제 등에 접합시킬 수 있다.
y) 대상체 (들) 또는 환자(들)
본원에 사용된 것으로서, 용어 "대상체" 및 "환자"는, 대상체가 어떠한 형태의 치료를 받았는지 또는 현재 받고있는지에 상관없이 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "대상체" 및 "대상체들"은 포유동물{예를 들면, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피크, 고양이, 개, 랫트 및 마우스, 비-사람 영장류[예를 들면, 시노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey), 침팬지 등과 같은 원숭이] 및 사람}을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 척추동물을 말한다. 바람직하게는, 대상체는 사람이다. 대상체 또는 환자들은 살아있거나 사체일 수 있다.
z) 표적 서열 또는 표적 핵산 서열
"표적 서열" 또는 "표적 핵산 서열"은 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 사용하여 증폭시키거나, 검출하거나 또는 둘다를 수행할 수 있는 예를 들면, 유전자, 또는 이의 상보체 또는 단편을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 또한, 용어 표적 서열이 때때로 이본쇄 핵산 서열을 언급한다고 해도; 표적 서열은 또한 일본쇄일 수 있다. 표적이 이본쇄인 경우, 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열은 바람직하게는 표적 서열의 쇄 둘다를 증폭시킨다. 특수 유기체에 대해 보다 특이적이거나 특이적이지 않은 표적 서열을 선택할 수 있다. 예를 들면, 표적 서열은 전체 속에 대해, 하나 이상의 속에 대해, 종 또는 아종, 혈청군, 영양요구체형, 혈청형, 균주, 분리체 및 유기체의 다른 소세트에 대해 특이적일 수 있다.
aa ) 시험 시료
"시험 시료"는 대상체, 또는 생물학적 유액으로부터 취한 시료를 의미하며, 여기서 시료는 표적 서열을 함유할 수 있다. 시험 시료는 어떠한 공급원, 예를 들면, 조직, 혈액, 타액, 가래, 점액, 땀, 뇨, 요도 면봉, 경부 면봉, 비뇨생식기 또는 항문 면봉, 결막 면봉, 안구 렌즈 유액, 뇌 척수액 등으로부터 취할 수 있다. 시험 시료는 (i) 공급원으로부터 수득된 것으로서 직접; 또는 (ii) 시료의 특성을 변형시키기 위한 전-처리(pre-treatment) 후에 사용할 수 있다. 따라서, 시험 시료는 예를 들면, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 제조하고, 세포 또는 바이러스 입자를 파괴하고, 고체 물질로부터 액체를 제조하고, 점성액을 희석시키고, 액체를 여과하고, 시약을 가하고, 핵산을 정제하는 등에 의해 사용 전에 전-처리할 수 있다.
bb ) 치료학적 유효량
용어 "치료학적 유효량"은, 환자에게 투여시 바람직한 치료 효과를 생성하기에, 예를 들면, 암성 종양의 성장을 정지하거나 수축시키거나 암 세포 또는 종양을 사멸시키는데 효과적인, 약물의 양을 의미한다.
cc ) "시간 분석된-형광성 공명 에너지 전달"
본원에 사용된 것으로서, 어절 "시간 분석된-형광성 공명 에너지 전달" 또는 "TR-FRET"는 TRF(시간-분석된 형광성) 및 FRET(형광성 공명 에너지 전달)의 원리를 단일화하는 검사를 말한다. 다수의 TR-FRET 검사가 공지되어 있으며 당해 분야에 시판된다. 본 발명에 사용될 수 있는 TR-FRET의 예는 하기 기술되어 있다.
프로브 합성
사용하기 위한 하기 기술된 모든 시약은 달리 명시하지 않는 한 판매회사로부터 입수할 수 있다. 디이소프로필에틸아민(DIEA), 디클로로메탄(DCM), N-메틸피롤리돈(NMP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), N-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 피페리딘을 포함하는 펩타이드 합성 시약은 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드[Applied Biosystems, Inc.(ABI), 캘리포니아주 포스터 시티 소재] 또는 아메리칸 바이오어낼리티칼(American Bioanalytical, 매사추세츠주 나틱 소재)로부터 입수할 수 있다. 예비로딩된(preloaded) 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 아미노산 카트릿지(Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmor-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH)는 ABI 또는 아나스펙(Anaspec, 캘리포니아주 산호세 소재)로부터 입수할 수 있다. 펩타이드 합성 수지(Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지) 및 Fmoc-Lys(Mtt)-OH는 노바바이오켐(Novabiochem, 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수할 수 있다. 단일의-이성체 6-카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(6-FAM-NHS)는 아나스펙(Anaspec)으로부터 입수할 수 있다. 트리플루오로아세트산(TFA)은 오크우드 프로덕츠(Oakwood Products, 샌프란시스코주 웨스트 콜롬비아 소재)로부터 입수할 수 있다. 티오아니졸, 페놀, 트리이소프로필실란(TIS), 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올(DODT) 및 이소프로판올은 알드리치 케미칼 코포레이션(Aldrich Chemical Co., 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 입수할 수 있다. 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 질량-분광법(MALDI-MS)은 어플라이드 바이오시스템스 보이아거(Applied Biosystems Voyager) DE-PRO MS 상에 기록할 수 있다. 전자분무 질량-분광법(ESI-MS)은 피니간(Finnigan) SSQ7000[제조원: 피니간 코포레이션(Finnigan Corp.), 캘리포니아주 산호세 소재] 에 양성 및 음성 이온 방식 둘다로 기록할 수 있다.
고체-상 펩타이드 합성(SPPS)을 위한 일반적인 과정
펩타이드는 최대 250μmol의 예비로딩된 왕 수지/용기(vessel)를 사용하여 ABI 433A 펩타이드 합성기 상에서 250μmol 규모의 FastmocTM 커플링 주기로 합성할 수 있다. 형광단의 부착 위치를 제외하고는, 1 mmol 표준 Fmoc-아미노산을 함유하는 예비로딩된 카트릿지를 사용하며, 여기서 1 mmol Fmoc-Lys(Mtt)-OH가 카트릿지 속에 위치할 수 있고 전도도 피드백 모니터링과 함께 사용될 수 있다. N-말단 아세틸화는 표준 커플링 조건하에서 카트릿지 내에서 1 mmol 아세트산을 사용하여 달성할 수 있다.
리신으로부터 4-메틸트리틸(Mtt)의 제거
합성기로부터의 수지를 DCM으로 3회 세척하고 습윤 상태로 유지시킬 수 있다. 150 mL의 95:4:1 디클로로메탄:트리이소프로필실란:트리플루오로아세트산을 수지 층을 통해 30분에 걸쳐 유동시킬 수 있다. 당해 혼합물은 짙은 황색으로 변한 후 담황색으로 옅어질 수 있다. 100 mL의 DMF를 층을 통해 15분에 걸쳐 유동시킬 수 있다. 이후에, 수지를 DMF로 3회 세척하고 여과한다. 닌하이드린 시험은 1차 아민에 대해 강력한 시그날을 나타내어야 한다.
6-카복시플루오레세인-NHS (6-FAM-NHS)를 사용한 수지 표지화
수지는 1% DIEA/DMF 중 2 당량의 6-FAM-NHS로 처리하고 주위 온도에서 밤새 교반하거나 진탕시킬 수 있다. 완료되면, 수지를 배수하고, DMF로 3회, (1% DCM 및 1% 메탄올로 3회 세척하고 건조시켜 닌하이드린 시험에 의해 음성인 오렌지 수지를 제공할 수 있다.
수지-결합된 펩타이드의 절단 및 탈보호를 위한 일반적인 과정
펩타이드는 80% TFA, 5% 물, 5% 티오아니졸, 5% 페놀, 2.5% TIS, 및 2.5% EDT(1 mL/0.1 g 수지)로 이루어진 절단 콕테일(cleavage cocktail) 속에서 주위 온도로 3시간 동안 진탕시켜 수지로부터 절단할 수 있다. 수지를 여과로 제거하고 TFA로 2회 세정할 수 있다. TFA를 여액으로부터 증발시키고, 생성물을 에테르(10 mL/0.1 g 수지)로 침전시키고, 원심분리에 의해 회수하고, 에테르(10 mL/0.1 g 수지)로 2회 세척하고 건조시켜 조악한(crude) 펩타이드를 수득할 수 있다.
펩타이드의 정제를 위한 일반적인 과정
조악한 펩타이드는 Unipoint® 분석 소프트웨어[제조원; 길슨, 인코포레이티드((Gilson, Inc.), 위스콘신주 미들턴 소재]를 가동시키는 길슨 제조 HPLC 시스템 상에서 공극 크기가 100Å인 Delta-PakTM C18 15μm 입자로 팩킹되고 하기 나열된 구배 방법 중 하나로 용출시키는 2개의 25x100 mm 분절을 함유하는 방사 압축 컬럼 상에서 정제할 수 있다. 1 내지 2 밀리리터의 조악한 펩타이드 용액(90% DMSO/물 중 10 mg/mL)을 주입당 정제할 수 있다. 각각의 수행으로부터 생성물(들)을 함유하는 피크를 혼주시키고 동결건조시킬 수 있다. 모든 예비 수행을 완충액 A: 0.1% TFA-물 및 완충액 B: 아세토니트릴로서의 용출액으로 20mL/분에서 수행할 수 있다.
분석적 HPLC를 위한 일반적인 과정
공극 크기가 120Å인 ODS-AQ 5μm 입자가 패킹된 4.6 x 250 mm YMC 컬럼 상에서 HPLC 3D 켐 스테이션 소프트웨어 버젼(ChemStation software version) A.03.04(제조원: 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard), 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 수행하는 휴렛-팩커드 1046A 형광성 검출기와 다이오드-배열 검출기가 장착된 휴렛-팩커드 1200 시리즈 시스템상에서 분석 HPLC를 수행하고 출발 조건에서 예비평형화한 후 7분 동안 하기 나열된 구배 방법들 중 하나로 용출시켰다. 용출은 완충액 A: 0.1% TFA-물 및 완충액 B: 아세토니트릴일 수 있다. 모든 구배에 대한 유동 속도는 1 mL/분일 수 있다. F-Bak: 펩타이드 프로브: 아세틸--(서열 번호 1)GQVGRQLAIIGDK(6-FAM)-(서열 번호 2) INR-NH2.
Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지를 일반적인 펩타이드 합성 과정을 사용하여 연장시켜, 보호된 수지-결합된 펩타이드(1.020 g)를 제공할 수 있다. Mtt 그룹을 제거하고, 6-FAM-NHS로 표지하고 절단하고 본원의 상기에 기술된 바와 같이 탈보호시켜 오렌지색 고체(0.37 g)로서의 조악한 생성물을 제공할 수 있다. 당해 생성물은 RP-HPLC로 정제할 수 있다. 주요 피크를 통과하는 분획을 분석적 RP-HPLC로 시험하고, 황색 고체로서 표제 화합물(0.0802 g)을 제공하는 주요 피크를 갖는 순수한 분획을 분리하여 동결건조시킬 수 있다; MALDI-MS m/z=2137.1 ((M+H)+).
펩타이드 프로브 F-Bak: 아세틸--(서열 번호 1) GQVGRQLAIIGDK(6-FAM)--(서열 번호 2) INR-NH2의 대안적인 합성
보호된 펩타이드는 플루오레세인(6-FAM)-표지된 리신을 제외하고는 예비-로딩된 1mmol 아미노산 카트릿지를 사용하는 FastmocTM 커플링 주기로 수행하는 어플라이드 바이오시스템스 433A 자동화된 펩타이드 합성기 상에서 0.25 mmol Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지[제조원: 노바바이오켐(Novabiochem)] 상에서 조립할 수 있으며, 여기서 1 mmol Fmoc-Lys(4-메틸트리틸)은 카트릿지내로 칭량할 수 있다. N-말단 아세틸 그룹은 1 mmol 아세트산을 카트릿지내에 놓음으로써 혼입시킬 수 있으며 위에서 기술한 바와 같이 커플링시킬 수 있다. 4-메틸트리틸 그룹의 선택적인 제거는 15분에 걸쳐 수지를 통해 유동하는 95:4:1 DCM:TIS:TFA(v/v/v)의 용액에 이어 디메틸포름아미드의 유동을 퀀칭(quenching)시킴으로써 달성할 수 있다. 단일-이성체 6-카복시플루오레세인-NHS는 DMF 속에서 1% DIEA 속에서 리신 측쇄와 반응시키고 닌하이드린 시험에 의해 완전히 확인하였다. 펩타이드를 수지로부터 절단하고 측쇄를 80:5:5:5:2.5:2.5 TFA:물:페놀:티오아니솔:트리이소프로필실란:3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올(v/v/v/v/v/v)로 처리하여 탈보호시키고, 조악한 펩타이드는 디에틸에테르로 침전시켜 회수하였다. 조악한 펩타이드를 역-상 고-성능 액체 크로마토그래피로 정제하고, 이의 순도 및 실체를 분석적 역-상 고-성능 액체 크로마토그래피 및 매트릭스-보조된 레이저-탈착 질량-분광법(m/z=2137.1 ((M+H)+))으로 확인하였다.
시간 분석된-형광성 공명 에너지 전달(TR-FRET) 검사
대표적인 화합물을 50μM(2x 출발 농도; 10% DMSO)로 출발하는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 속에 일련 희석시키고, 10μL를 384-웰 플레이트로 이전시켰다. 이후에, 10μL의 단백질/프로브/항체 혼합물을 각각의 웰에 하기 표 aa에 나열된 최종 농도에서 가할 수 있다.
[표 aa]
Figure pct00012
6-FAM = 6-카복시플루오레세인; Tb = 테르비움; GST = 글루타티온 S-트랜스퍼라제
이후에 시료를 진탕기 속에서 1분 동안 혼합하고 추가로 3시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 각각의 검사를 위해, 프로브/항체 및 단백질/프로브/항체를 각각의 검사 플레이트 상에 음성 및 양성 대조군으로서 각각 포함시킬 수 있다. 형광성을 엔비젼(Envision)(제조원: 퍼킨 엘머) 상에서 340/35nm 여기 여과기 및 520/525(F-Bak 펩타이드) 및 495/510nm(Tb-표지된 항-히스티딘 항체) 방사 여과기 상에서 측정할 수 있다.
dd ) 치료하다, 치료하는 또는 치료
본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 (i) 발생하는 병리학적 상태를 예방하고(예를 들면, 예방); (ii) 병리학적 상태를 억제하거나 이의 발달을 정지하고; (iii) 병리학적 상태를 완화시키고/시키거나 (i) 내지 (iii) 항목 중 어느 것이 대상체에서 성공적인지에 상관없이, 이러한 병리학적 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 예방하거나 감소시키기 위한 노력에서 대상체에게 하나 이상의 활성제 또는 화합물을 투여함을 의미한다.
ee ) 변이체 폴리펩타이드 또는 변이체 핵산 서열
"변이체 폴리펩타이드" 또는 "변이체 핵산 서열"은 적어도 약 60% 핵산 서열 동질성, 보다 바람직하게는 적어도 약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 핵산 서열 동질성을 가진 폴리뉴클레오타이드 및 추가의 보다 바람직하게는 제공된 핵산 서열과 적어도 약 99% 핵산 서열 동질성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 변이체는 천연의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
일반적으로, 변이체 폴리뉴클레오타이드는, 길이가 적어도 약 8개 뉴클레오타이드, 흔히 적어도 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 뉴클레오타이드, 또는 심지어 길이가 약 75 내지 200개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드이다.
뉴클레오타이드의 영역은, 핵산 분자가 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 이외의 모이어티로 치환, 화학적, 효소적 또는 다른 적절한 수단에 의해 공유결합적으로 변형된 유도체를 포함한다.
B. Bcl -2 계열 단백질 억제제
하나의 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 특정의 Bcl-2 계열 단백질 억제제 화합물에 관한 것이다.
본원의 화합물의 가변 모이어티는 식별자(숫자 및/또는 알파벳 어깨 글자를 갖는 대문자)에 의해 나타내며 구체적으로 구현될 수 있다.
적절한 원자가들이 모든 모이어티 및 이들의 병용물에 대해 유지되며 1개 이상의 원자를 가진 1가 모이어티가 이들의 좌측 말단을 통해 부착되어 있는 것을 이해해야 한다.
또한, 가변 모이어티의 구체적인 국면은 동일한 식별자를 갖는 다른 구체적인 국면과 동일하거나 상이할 수 있음을 이해해야 한다.
본원 명세서의 교시내용의 화합물은 R 또는 S 구조로 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유할 수 있으며, 여기서 용어 "R" 및 "S"는 문헌[참조: Pure Appl. Chem. (1976) 45, 13-10]에 정의되어 있다. 등량의 R 및 S 배열을 비대칭적으로 치환된 탄소 원자들을 갖는 화합물은 이들 원자에서 라세믹이다. 다른 배열에 비해 1개의 배열이 과량인 원자들은 과량의 배열로 지명되며, 바람직하게는 약 85% 내지 90% 과량, 보다 바람직하게는 약 95% 내지 99%의 과량, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 99% 초과의 과량으로 지명된다. 따라서, 본원 명세서의 교시내용은 라세믹 혼합물 및 이의 화합물들의 상대적 및 절대적 부분입체이성체들을 포함하는 것으로 의미된다.
본원 명세서의 교시내용의 화합물은 또한 Z 또는 E 배열의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유할 수 있으며, 여기서, 용어 "Z"는 탄소-탄소 또는 탄소-질소 이중 결합의 동일한 면 상의 보다 큰 2개의 치환체를 나타내고 용어 "E"는 탄소-탄소 또는 탄소-질소 이중 결합의 대향하는 면들 상의 보다 큰 2개의 치환체를 나타낸다. 본원 명세서의 교시내용의 화합물은 또한 "Z"와 "E" 이성체의 혼합물로서 존재할 수 있다.
본원 명세서의 교시내용의 화합물은 또한 토우토머 또는 이의 평형 혼합물로 존재할 수 있으며, 여기서 화합물의 양성자는 하나의 원자에서 다른 것으로 이동한다. 토우토머의 예는 케토-에놀, 페놀-케토, 옥심-니트로소, 니트로-아시(aci), 이민-엔아민 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
NH, C(O)OH, OH 또는 SH 모이어티를 갖는 화학식 II의 화합물은 프로드럭-형성 모이어티에 부착되어 있을 수 있다. 프로드럭-형성 모이어티는 대사 공정에 의해 제거되어 생체내에서 유리된 NH, C(O)OH, OH 또는 SH를 갖는 화합물을 방출한다. 프로드럭은 가용성 및/또는 소수성, 위장관에서 흡수, 생체이용율, 조직 침투 및 청소율과 같이 화합물의 이러한 약력학적 특성을 조절하는데 유용하다.
시험관내 또는 생체내 대사 공정에 의해 생산된, 화학식 II의 화합물의 대사산물은 Bcl-XL 단백질, Bcl-2 단백질 또는 Bcl-w 단백질과 같은 항-세포자멸사 계열 단백질 구성원의 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 용도도 가질 수 있다.
시험관내 또는 생체내에서 대사되어 화학식 II의 화합물을 형성할 수 있는 특정 전구체 화합물은 또한 Bcl-XL 단백질, Bcl-2 단백질 또는 Bcl-w 단백질의 것과 같은 항-세포자멸사 계열 단백질 구성원의 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 유용성을 가질 수 있다.
화학식 II의 화합물은 산 부가 염, 염기성 부가 염 또는 양쪽성이온으로 존재할 수 있다. 화학식 II의 화합물의 염은 이들의 분리 또는 이후 이들의 정제 동안 제조된다. 산 부가 염은 화학식 II의 화합물과 산의 반응으로부터 기원한 것들이다. 따라서, 화학식 II의 화합물의 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 중탄산염, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트(베실레이트), 비설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 디글루코네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글리세로포스페이트, 글루타메이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 락토비오네이트, 락테이트, 말레이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 포스페이트, 피크레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 트리클로로아세틱, 트리플루오로아세틱, 파라-톨루엔설포네이트, 및 운데카노에이트 염이 본원 명세서의 교시내용에 포함됨을 의미한다. 화합물의 염기성 부가 염은 화학식 II의 화합물과 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘과 같은 양이온의 중탄산염, 탄산염, 수산화물 또는 인산염과의 반응으로부터 기원한 것들이다.
화학식 II의 화합물은 예를 들면, 볼내로, 안내로, 경구적으로, 삼투압으로, 비경구적으로(근육내, 복강내, 흉골내, 정맥내, 피하로), 직장으로, 국소적으로, 경피내로, 질내로 및 동맥내로 및 또한 동맥내 주사, 주입 및 예를 들면, 스텐트를 사용한, 예를 들면, 혈관형성과 같은 체내에서 교체로 투여될 수 있다.
화학식 II의 화합물의 치료학적 유효량은 치료받는 사람, 치료하는 질환 및 이의 중증도, 이를 포함하는 조성물, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 효능, 청소율 및 다른 약물이 공-투여되는지 여부에 의존한다. 조성물을 환자에게 단일 투여량 또는 분할된 투여량으로 매일 투여하기 위해 사용된 화학식 II의 화합물의 양은 약 0.03 내지 약 200mg/kg 체중이다. 단일 투여량 조성물들은 이들 양 또는 이들의 약수의 조합을 함유한다.
화학식 II의 화합물은 부형제의 존재 또는 부재하에 투여될 수 있다. 부형제는 캡슐화제 및 흡수 촉진제, 항산화제, 결합제, 완충제, 피복제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 연장제, 여과제, 풍미제, 습윤제, 윤활제, 향료, 방부제, 추진제, 방출제, 멸균제, 감미제, 가용화제, 습윤제, 이의 혼합물 등과 같은 첨가제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
경구 투여될 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 부형제는, 한천, 알긴산, 수산화알루미늄, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 카보머, 카스터 오일, 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 코코아 버터, 옥수수 전분, 옥수수 오일, 면화씨 오일, 크로스-포비돈, 디글리세라이드, 에탄올, 에틸 셀룰로즈, 에틸 라우레이트, 에틸 올레이트, 지방산 에스테르, 젤라틴, 배아 오일, 글루코즈, 글리세롤, 땅콩 오일, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 이소프로판올, 등장성 염수, 락토즈, 수산화마그네슘, 스테아르산마그네슘, 맥아, 만니톨, 모노글리세라이드, 올리브 오일, 땅콩 오일, 인산칼륨 염, 감자 전분, 포비돈, 프로필렌 글리콜, 링거액, 잇꽃 오일, 참깨 오일, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 인산나트륨 염, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 소르비톨, 대두 오일, 스테아르산, 스테아릴 푸마레이트, 슈크로즈, 표면활성제, 활석, 트라가칸트, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 트리글리세라이드, 물, 이의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 안내로 또는 경구로 투여될 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 부형제는 1,3-부틸렌 글리콜, 카스터 오일, 옥수수 오일, 면화씨 오일, 에탄올, 소르비탄의 지방산 에스테르, 배아 오일, 땅콩 오일, 글리세롤, 이소프로판올, 올리브 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 참깨 오일, 물, 이의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 삼투압적으로 투여될 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 부형제는 클로로플루오로하이드로카본, 에탄올, 물, 이의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구적으로 투여될 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 부형제는 1,3-부탄디올, 카스터 오일, 옥수수 오일, 면화씨 오일, 덱스트로즈, 배아 오일, 땅콩 오일, 리포좀, 올레산, 올리브 오일, 땅콩 오일, 링거액, 잇꽃 오일, 참깨 오일, 대두 오일, U.S.P. 또는 등장성 염화나트륨 용액, 물, 이의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 직장으로 또는 질내로 투여될 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 부형제는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 이의 혼합물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서의 교시내용은 또한 치료학적 유효량의 화학식 II의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 치료학적 유효량의 하나 또는 하나 이상의 추가의 치료제 및/또는 이온화 방사선을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암과 같은 비정상적인 세포 성장 및/또는 조절되지 않는 세포자멸사를 포함하는 질환 상태를 치료하는 병용 치료학적 방법을 포함한다.
병용 치료학적 방법은 화학식 II의 화합물과 하나 이상의 추가의 치료제 또는 이온화 방사선을 환자에게 어떠한 바람직한 투여요법 및/또는 스케쥴 요법을 사용하여 투여함을 포함한다.
화학식 II의 화합물은 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 증식억제제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제, 다른 세포자멸사 촉진제(예를 들면, Bcl-XL, Bcl-w 및 Bfl-1) 억제제, 사멸 수용체 경로의 활성인자, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이중-특이적인 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 공액체, 생물제 반응 개질제, 사이클린 의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제, 세포자멸사 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 끼어들기 항생제(intercalating antibiotic), 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열-활성화된 세포내 시그날-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테오좀 억제제, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 에티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소 억제성 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제 등, 및 이들 제제 중 하나 이상과의 병용물과 함께 사용되는 경우 유용한 것으로 예측된다.
BiTE 항체는 T-세포를 지시하여 2개 세포를 동시 결합시킴으로써 암 세포를 공격하는 이중-특이적인 항체이다. 이후에, T-세포는 표적 암 세포를 공격한다. BiTE 항체의 예는 아데카투무마브(adecatumumab)(Micromet MT201), 블리나투모마브(blinatumomab)(Micromet MT103) 등을 포함한다. 이론에 한정되지 않고, T-세포가 표적 암 세포의 세포자멸사를 유발하는 메카니즘 중 하나는 페르포린 및 그란자임 B를 포함하는, 세포분해 입자 성분들의 세포외배출에 의한다. 이와 관련하여, Bcl-2는 페르포린 및 그란자임 B 둘 다에 의한 세포자멸사의 유도를 약화시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이타는, Bcl-2의 억제가 암 세포에 대해 표적화되는 경우 T-세포에 의해 유발된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있음을 제안한다[참조: V. R. Sutton, D. L. Vaux and J. A. Trapani (1997) J. of Immunology. 158 (12): 5783].
SiRNA는 내인성 RNA 염기 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 분자이다. 변형은 세포 활성을 폐지하지 않고, 오히려 증가된 안정성 및/또는 증가된 세포 효능을 부여한다. 화학적 변형의 예는 포스포로티오에이트 그룹, 2'-데옥시뉴클레오타이드, 2'-OCH3-함유 리보뉴클레오타이드, 2'-F-리보뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오타이드, 이들의 병용물 등을 포함한다. siRNA는 다양한 길이(예를 들면, 10 내지 200개 bp) 및 구조(예를 들면, 헤어핀, 단일/이본쇄, 돌출(bulge), 닉(nick)/갭(gap), 미스매치)를 가질 수 있으며 세포내에서 가공되어 활성인 유전자 사일런싱을 제공한다. 이본쇄 siRNA(dsRNA)는 각각의 쇄(평활 말단) 또는 비대칭 말단(오우버행(overhang))에 동일한 수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 1 내지 2개의 뉴클레오타이드의 오우버행은 센스 및/또는 안티센스 쇄 상에 존재할 수 있으며, 제공된 쇄의 5'- 및/또는 3'-말단에 존재할 수 있다. 예를 들어, siRNA 표적화 Mcl-1은 다수의 종양 세포주내에서 ABT-263[즉, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸- )프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드] 또는 ABT-737[즉, N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-비페닐)-2-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-니트로벤젠설폰아미드)의 활성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Tse et. al (2008) Cancer Research. 68(9): 3421 및 당해 문헌의 참조 문헌].
다가 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이다. 다가 결합 단백질은 3개 이상의 항원 결합 부위를 가지도록 가공되며 일반적으로 천연적으로 발생하지 않는 항체이다. 용어 "다중특이적인 결합 단백질"은 2개 이상의 관련되거나 관련되지 않은 표적을 결합시킬 수 있는 결합 단백질을 의미한다. 이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 4가 또는 다가 결합 단백질이다. 이러한 DVD는 단일특이적(즉, 하나의 항원에 결합할 수 있는)이거나 다중특이적(즉, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는)이다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig로 언급된다. DVD Ig의 각각의 반은 중쇄 DVD 폴리펩타이드, 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여된 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
알킬화제는 알트레타민, AMD-473, AP-5280, 아파지쿠온, 벤다무스틴, 브로스탈리신, 부설판, 카르보쿠온, 카르무스틴(BCNU), 클로람부실, CLORETAZINE®(라로무스틴, VNP 40101M), 사이클로포스파미드, 데카르바진, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 이포스파미드, KW-2170, 로무스틴(CCNU), 말포스파미드, 멜팔란, 미토브로니톨, 미토락톨, 니무스틴, 질소 무스타드 N-옥사이드, 라니무스틴, 테모졸로마이드, 티오테파, TREANDA®(벤다무스틴), 트레오설판, 로포스파미드 등을 포함한다.
혈관형성 억제제는 내피세포-특이적인 수용체 타이로신 키나제(Tie-2) 억제제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, 인슐린 성장 인자-2 수용체(IGFR-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 억제제, 혈소판-기원한 성장 인자 수용체(PDGFR) 억제제, 트롬보스폰딘 유사체, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체 타이로신 키나제(VEGFR) 억제제 등을 포함한다.
항대사산물은 ALIMTA®(페메트렉스드 이나트륨, LY231514, MTA), 5-아자시티딘, XELODA®(카페시타빈), 카르모푸르, LEUSTAT®(클라드리빈), 클로파라빈, 사이타라빈, 사이타라빈 옥포스페이트, 사이토신 아라비노사이드, 데시타빈, 데페록사민, 독시플루리딘, 에플로르니틴, EICAR(5-에티닐-1-베타-D-리보푸라노실이미다졸-4-카복사미드), 에녹시타빈, 에티닐사이티딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 단독 또는 류코보린과의 조합물, GEMZAR®(겜시타빈), 하이드록시우레아, ALKERAN®(멜팔란), 머캅토푸린, 6-머캅토푸린 리보사이드, 메토트렉세이트, 마이코페놀산, 넬라바빈, 놀라트렉세드, 옥포스페이트, 펠리트렉솔, 펜토스타틴, 락티트렉세드, 리바비린, 트리아핀, 트리메트렉세이트, S-1, 티아조푸린, 테가푸르, TS-1, 비다라빈, UFT 등을 포함한다.
항바이러스제는 리토나비르, 하이드록시클로로퀸 등을 포함한다.
Bcr-Abl 키나제 억제제는 DASATINIB®(BMS-354825), GLEEVEC®(이마티니브) 등을 포함한다.
CDK 억제제는 AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, 플라보피리돌, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, 셀리시클리브(CYC-202, R-로스코비틴), ZK-304709 등을 포함한다.
COX-2 억제제는 ABT-963, ARCOXIA®(에토리콕시브), BEXTRA®(발데콕시브), BMS347070, CELEBREX®(셀레콕시브), COX-189(루미라콕시브), CT-3, 데라막스®(데라콕시브), JTE-522, 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐)-1-(4-설파모일페닐-1H-피롤), MK-663(에토리콕시브), NS-398, 파레콕시브, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S-2474, T-614, VIOXX®(로페콕시브) 등을 포함한다.
EGFR 억제제는 ABX-EGF, 항-EGFR 면역리포좀, EGF-백신, EMD-7200, ERBITUX®(세툭시마브), HR3, IgA 항체, IRESSA®(게피티니브), TARCEVA®(에를로티니브 또는 OSI-774), TP-38, EGFR 융합 단백질, TYKERB®[라파티니브(lapatinib)] 등을 포함한다.
ErbB2 수용체 억제제는 CP-724-714, CI-1033(카네르티니브), HERCEPTIN®(트라스투주마브), TYKERB®(라파티니브), OMNITARG®(2C4, 페투주마브), TAK-165, GW-572016(이오나파르니브), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2 백신), APC-8024 (HER-2 백신), 항-HER/2neu 이특이적인 항체, B7.her2IgG3, AS HER2 삼기능성 이특이적인 항체, mAB AR-209, mAB 2B-1 등을 포함한다.
히스톤 데아세틸라제 억제제는 뎁시펩타이드, LAQ-824, MS-275, 트라폭신, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), TSA, 발프로산 등을 포함한다.
HSP-90 억제제는 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, 겔다나마이신, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB®(HSP-90에 대한 사람 재조합체 항체), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, 라디키콜, SNX-2112, STA-9090 VER49009 등을 포함한다.
세포자멸사 단백질의 억제제의 억제제는 HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161, LBW-242 등을 포함한다.
항체 약물 접합체는 항-CD22-MC-MMAF, 항-CD22-MC-MMAE, 항-CD22-MCC-DM1, CR-011-vcMMAE, PSMA-ADC, MEDI-547, SGN-19Am SGN-35, SGN-75 등을 포함한다.
사망 수용체 경로의 활성인자는 TRAIL, TRAIL 또는 사망 수용체(예를 들면, DR4 및 DR5)를 표적화하는 다른 제제, 예를 들면, 아포마브, 코나투무마브, ETR2-ST01, GDC0145, (렉사투무마브), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 및 트라스투주마브를 포함한다.
키네신 억제제는 AZD4877, ARRY-520과 같은 Eg5 억제제; GSK923295A와 같은 CENPE 억제제 등을 포함한다.
JAK-2 억제제는 CEP-701(레사우르티니브), XL019 및 INCB018424 등을 포함한다.
MEK 억제제는 ARRY-142886, ARRY-438162 PD-325901, PD-98059 등을 포함한다.
mTOR 억제제는 AP-23573, CCI-779, 에베롤리무스, RAD-001, 라파마이신, 템시롤리무스; PI-103, PP242, PP30, 토린 1 등을 포함하는 ATP-경쟁적 TORC1/TORC2 억제제를 포함한다.
비-스테로이드성 소염제 약물은 AMIGESIC®(살살레이트), DOLOBID®(디플루니살), MOTRIN®(이부프로펜), ORUDIS®(케토프로펜), RELAFEN®(나부메톤), FELDENE®(피록시캄), 이부프로펜 크림, ALEVE®(나프록센) 및 NAPROSYN®(나프록센), VOLTAREN®(디클로페낙), INDOCIN®(인도메타신), CLINORIL®(술린닥), TOLECTIN®(톨메틴), LODINE®(에토돌락), TORADOL®(케토록락), DAYPRO®(옥사프로진) 등을 포함한다.
PDGFR 억제제는 C-451, CP-673, CP-868596 등을 포함한다.
백금 화학치료제는 시스플라틴, ELOXATIN®(옥살리플라틴), 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, PARAPLATIN®(카르보플라틴), 사트라플라틴, 피코플라틴 등을 포함한다.
폴로-유사 키나제 억제제는 BI-2536 등을 포함한다.
포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제는 와르트만닌, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235, XL765 등을 포함한다.
트롬보스폰딘 유사체는 ABT-510, ABT-567, ABT-898, TSP-1 등을 포함한다.
VEGFR 억제제는 AVASTIN®(베박키주마브), ABT-869, AEE-788, ANGIOZYMETM[혈관형성을 억제하는 리보자임(제조원: 리보자임 파마슈티칼스(Ribozyme Pharmaceuticals(콜로라도주 보울더 소재) 및 치론(Chiron)(캘리포니아주 엠베리빌 소재)], 악시티니브(AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (페갑타미브), NEXAVAR®(소라페니브, BAY43-9006), 파조파니브(GW-786034), 바탈라니브(PTK-787, ZK-222584), SUTENT®(수니티니브, SU-11248), VEGF 트랩, ZACTIMATM(반데타니브, ZD-6474) 등을 포함한다.
항생제는 인터컬레이팅 항생제 아클라루비신, 악티노마이신 D, 암루비신, 안나마이신, 아드리아마이신, BLENOXANE®(블레오마이신), 다우노루비신, CAELYX® 또는 MYOCET®(리포좀 독소루비신), 엘사미트루신, 에피르부신, 글라르부이신, ZAVEDOS®(이다루비신), 미토마이신 C, 네모루비신, 네오카르지노스타틴, 페플로마이신, 피라루비신, 레벡카마이신, 스티말라머, 스트렙토조신, VALSTAR®(발루비신), 지노스타틴 등을 포함한다.
토포이소머라제 억제제는 아클라루비신, 9-아미노캄프토테신, 아모나피드, 암사크린, 베카테카린, 벨로테칸, BN-80915, CAMPTOSAR®(이리노테칸 하이드로클로라이드), 캄프토테신, CARDIOXANE®(덱스라족신), 디플로모테칸, 에도테카린, ELLENCE® 또는 PHARMORUBICIN®(에피루비신), 에토포시드, 엑사테칸, 10-하이드록시캄프토테신, 기마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 오라테신, 피라르부신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포시드, 토포테칸 등을 포함한다.
항체는 AVASTIN®(베바키주마브), CD40-특이적인 항체, chTNT-1/B, 데노수마브, ERBITUX®(세툭시마브), HUMAX-CD4®(자놀리무마브), IGF1R-특이적인 항체, 린투주마브, PANOREX®(에드레콜로마브), RENCAREX®(WX G250), RITUXAN®(리툭시마브), 티킬리무마브, 트라스투지마브, CD20 항체 I형 및 II형 등을 포함한다.
호르몬 치료요법은 ARIMIDEX®(아나스트로졸), AROMASIN®(엑세메스탄), 아르족시펜, CASODEX®(비칼루타미드), CETROTIDE®(세트로렐릭스), 데가렐릭스, 데슬로렐린, DESOPAN®(트릴로스탄), 덱사메타손, DROGENIL®(플루타미드), EVISTA®(랄록시펜), AFEMATM(파드로졸), FARESTON®(토레미펜), FASLODEX®(풀베스트란트), FEMARA®(레트로졸), 포르메스탄, 글루코코르티코이드, HECTOROL®(독세르칼키페롤), RENAGEL®(세벨라머 카보네이트), 라소폭시펜, 류프롤리드 아세테이트, MEGACE®(메게스테롤), MIFEPREX®(미페프리스톤), NILANDRONTM(닐루타미드), NOLVADEX®(타목시펜 시트레이트), PLENAXISTM(아바렐릭스), 프레드니손, PROPECIA®(피나스테라이드), 릴로스탄, SUPREFACT®(부세렐린), TRELSTAR®(황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH)), VANTAS®(히스트렐린 임플란트), VETORYL®(트릴로스탄 또는 모드라스탄), ZOLADEX®(포스렐린, 고세렐린) 등을 포함한다.
델토이드 및 레티노이드는 세오칼시톨(EB1089, CB1093), 렉사칼시트롤(KH1060), 펜레티니드, PANRETIN®(알리레티노인), ATRAGEN®(리포좀 트레티노인), TARGRETIN®(벡사로텐), LGD-1550 등을 포함한다.
PARP 억제제는 ABT-888, 올라파리브, KU-59436, AZD-2281, AG-014699, BSI-201, BGP-15, INO-1001, ONO-2231 등을 포함한다.
식물 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
프로테오좀 억제제는 VELCADE®(보르테조미브), MG132, NPI-0052, PR-171 등을 포함한다.
면역제의 예는 인터페론 및 다른 면역-증진제를 포함한다. 인터페론은 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, ACTIMMUNE®(인터페론 감마-1b) 또는 인터페론 감마-nl, 이들의 병용물 등을 포함한다. 다른 제제는 ALFAFERONE®, (IFN-), BAM-002(옥시드화된 글루타티온), BEROMUN®(타소네르민), BEXXAR®(토시투모마브), CAMPATH®(알렘투주마브), CTLA4(세포독성 림프구 항원 4), 데카르바진, 데니류킨, 에프라투주마브, GRANOCYTE®(레노그라스팀), 렌티난, 백혈구 알파 인터페론, 이미퀴모드, MDX-010(항-CTLA-4), 흑색종 백신, 미투모마브, 몰그라모스팀, MYLOTARGTM(겜투주마브 오조가미신), NEUPOGEN®(필그라스팀), OncoVAC-CL, OVAREX®(오레고보마브), 펨투모마브(Y-muHMFG1), PROVENGE®(시푸류셀-T), 사르가라모스팀, 시조필란, 테셀류킨, THERACYS®(칼메트-구에린 간균(Bacillus Calmette-Guerin)), 우베니멕스, VIRULIZIN®(면역치료제, 제조원: 로루스 파마슈티칼스(Lorus Pharmaceuticals)), Z-100(마루야마(SSM)의 특이적인 물질), WF-10(테트라클로로데카옥사이드(TCDO)), PROLEUKIN®(알데슬류킨), ZADAXIN®(티말파신), ZENAPAX®(다클리주마브), ZEVALIN®(90Y-이브리투모마브 티욱세탄) 등을 포함한다.
생물학적 반응 개질제는 생존한 유기체의 방어 메카니즘 또는 조직 세포의 생존, 성장 또는 분화와 같은 생물학적 반응을 수정하여 이들이 항-종양 활성을 가지도록 하는 제제이며 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피키바닐 PF-3512676 (CpG-8954), 우베니멕스 등을 포함한다.
피리미딘 유사체는 사이타라빈(ara C 또는 아라비노사이드 C), 사이토신 아라비노사이드, 독시플루리딘, FLUDARA®(플루다라빈), 5-FU(5-플우오로우라실), 플록수리딘, GEMZAR®(겜시타빈), TOMUDEX®(라티트렉세드), TROXATYLTM (트리아세틸우리딘 트록사키타빈) 등을 포함한다.
푸린 유사체는 LANVIS®(티오구아닌) 및 PURI-NETHOL®(머캅토푸린)을 포함한다.
항유사분열제는 베타불린, 에포틸론 D(KOS-862), N-(2-((4-하이드록시페닐)아미노)피리딘-3-일)-4-메톡시벤젠설폰아미드, 익사베필론(BMS 247550), 파클리탁셀, TAXOTERE®(도세탁셀), PNU100940(109881), 파투필론, XRP-9881(라로탁셀), 빈플루닌, ZK-EPO(합성 에포틸론) 등을 포함한다.
유비퀴틴 리가제 억제제는 MDM2 억제제, 예를 들면, 누틀린스, NEDD8 억제제, 예를 들면, MLN4924 등을 포함한다.
본원 명세서의 교시내용의 화합물은 또한 방사선치료요법의 효능을 향상시키는 방사감작화제로서 사용될 수 있다. 방사선치료요법의 예는 외부 빔 방사선치료요법, 원격방사선치료요법, 근접치료요법 및 밀봉 방사능원 방사선치료요법, 비밀봉 방사능원 방사선치료요법 등을 포함한다.
또한, 화학식 II의 화합물은 ABRAXANETM(ABI-007), ABT-100(파르네실 트랜스퍼라제 억제제), ADVEXIN®(Ad5CMV-p53 백신), ALTOCOR® 또는 MEVACOR®(로바스타틴), AMPLIGEN®(폴리 I:폴리 C12U, 합성 RNA), APTOSYN®(엑시술린드), AREDIA®(팔미드론산), 아르글라빈, L-아스파라기나제, 아타메스탄(1-메틸-3,17-디온-안드로스타-1,4-디엔), AVAGE®(타자로텐), AVE-8062(콤브레아스타틴 유도체) BEC2(미투모마브), 카첵틴 또는 카첵신(종양 괴사 인자), 칸박신(백신), CEAVAC®(암 백신), CELEUK®(셀모류킨), CEPLENE®(히스타민 디하이드로클로라이드), CERVARIX®(사람 파필로마바이러스 백신), CHOP®(C: CYTOXAN®(사이클로포스파미드); H: ADRIAMYCIN®(하이드록시독소루비신); 0: 빈크리스틴(ONCOVIN®); P: 프레드니손), CYPATTM(사이프로테론 아세테이트), 콤브레스타틴 A4P, DAB(389)EGF (His-Ala 링커를 통해 사람 내피 성장 인자에 융합된 디프테리아 독소의 촉매적 및 전좌 도메인) 또는 TransMID-107RTM(디프테리아 독소), 다카르바진, 닥티노마이신, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(DMXAA), 에닐우라실, EVIZONTM(스쿠알라민 락테이트), DIMERICINE®(T4N5 리포좀 로션), 디스코데르몰리드, DX-8951f(엑사테칸 메실레이트), 엔자스타우린, EPO906 (에피틸론 B), GARDASIL®(4가 사람 파필로마바이러스(6, 11, 16, 18형) 재조합체 백신), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (강글리오사이드 접합체 백신), GVAX®(전립선암 백신), 할로푸기논, 히스테렐린, 하이드록시카르바미드, 이반드론산, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR(신트레데킨 베수도톡스), IL-13-슈도모나스 엑소톡신, 인터페론-알파, 인터페론-감마, JUNOVANTM 또는 MEPACTTM(미파무르티드), 로나파르니브, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 밀테포신(헥사데실포스포콜린), NEOVASTAT®(AE-941), NEUTREXIN®(트리메트렉세이트 글루쿠로네이트), NIPENT®(펜토스타틴), ONCONASE®(리보뉴클레아제 효소), ONCOPHAGE®(흑색종 백신 치료), ONCOVAX®(IL-2 백신), ORATHECINTM(루비테칸), OSIDEM®(항체-계 세포 약물), OVAREX® MAb(뮤린(murine) 단클론 항체), 파클리탁셀, PANDIMEXTM(20(S)프로토파낙사디올(aPPD) 및 20(S)프로토파낙사트리올(aPPT)을 포함하는 인삼으로부터의 아글리콘 사포닌), 파니투무마브, PANVAC®-VF (조사의 암 백신), 페가스파르가제, PEG 인터페론 A, 페녹소디올, 프로카르바진, 레비마스타트, REMOVAB®(카투막소마브), REVLIMID®(레날리도미드), RSR13(에파프록시랄), SOMATULINE® LA(란레오티드), SORIATANE®(아시트레틴), 스타우로스포린[스트렙토마이세스 스타우로스포레스(Streptomyces staurospores)], 탈라보스타트(PT100), TARGRETIN®(벡사로텐), TAXOPREXIN®(DHA-파클리탁셀), TELCYTA®(칸포스파미드, TLK286), 테밀리펜, TEMODAR®(테모졸로미드), 테스밀리펜, 탈리도미드, THERATOPE®(STn-KLH), 티미타크(2-아미노-3,4-디하이드로-6-메틸-4-옥소-5-(4-피리딜티오)퀴나졸린 디하이드로클로라이드), TNFERADETM(아데노벡터: 종양 괴사 인자-알파에 대한 유전자를 함유하는 DNA 담체), TRACLEER® 또는 ZAVESCA®(보센탄), 트레티노인(레틴-A), 테트란드린, TRISENOX®(아르세닉 트리옥사이드), VIRULIZIN®, 우크라인(보다 큰 애기똥풀(celandine) 식물로부터의 알칼로이드의 유도체), 비탁신(항-알파벡타3 항체), XCYTRIN®(모텍사핀 가돌리늄), XINLAYTM(아트라센탄), XYOTAXTM (파클리탁셀 폴리글루멕스), YONDELIS®(트라벡테딘), ZD-6126, ZINECARD®(덱스라족산), ZOMETA®(졸렌드론산), 조루비신 등을 포함한다.
BAX 및 BAD 펩타이드는 문헌[참조: Zhang, H. C., Nimmer, P., Rosenberg, S. H., Ng, S. C., 및 Joseph, M. (2002). Development of a High-Throughput Fluorescence Polarization Assay for Bcl-x(L). Analytical Biochemistry 307, 70-75]에 보고되어 있다.
Bcl-XL 단백질에 대한 화학식 II의 화합물의 결합 친화성은 당해 단백질의 활성의 이들의 억제의 지표이다. Bcl-XL 단백질에 대한 화학식 II의 화합물의 결합 친화성을 측정하기 위해, 대표적인 실시예를 DMSO 속에서 100μM 내지 1pM의 농도로 희석시키고 96-웰 미세역가 플레이트의 각각의 웰에 가하였다. 검사 완충액 (20 mM 인산염 완충액(pH 7.4), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.05% PF-68)의 웰 당 125μL, 6 nM의 Bcl-XL 단백질(문헌: Science 1997, 275, 983-986에 기술된 바와 같이 제조됨), 1 nM 플루오레세인-표지된 BAD 펩타이드(내부(in-house)에서 제조함) 및 화합물의 DMSO 용액을 포함하는 혼합물을 2분 동안 진탕시키고 LJL 분석기[제조원: 엘제이엘 바이오 시스템스(LJL Bio Systems), 캘리포니아주 소재]에 두었다. 음성 대조군(DMSO, 15 nM BAD 펩타이드, 검사 완충액) 및 양성 대조군(DMSO, 1 nM BAD 펩타이드, 6 nM Bcl-XL, 검사 완충액)을 사용하여 검사 범위를 측정하였다. 편광을 실온에서 연속적인 플루오레세인 램프(여기 485 nm, 방사 530 nm)를 사용하여 측정하였다. 억제 퍼센트는 (1-((웰의 mP 값-음성 대조군)/범위)) x 100%로 측정하였다. 결과는 표 1에 나타낸다.
Bcl-2 단백질에 대한 화학식 II의 화합물의 결합 친화성은 당해 단백질 활성의 이들의 억제 지표이다. Bcl-2에 대한 화학식 II의 화합물의 결합 친화성을 측정하기 위하여, 대표적인 실시예들을 DMSO 중의 10μM 내지 10pM의 농도로 희석시키고 96-웰 미세역가 플레이트의 각각의 웰에 가하였다. 검사 완충액(20 mM 인산염 완충액(pH 7.4), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.05% PF-68)의 웰 당 125L, 10 nM의 Bcl-2 단백질(문헌: PNAS 2001, 98, 3012-3017에 기술된 과정에 따라 제조), 1 nM 플루오레세인-표지된 BAX 펩타이드(내부에서 제조함) 및 대표적인 실시예의 DMSO 용액을 포함하는 혼합물을 2분 동안 진탕시키고 LJL 분석기(제조원: 엘제이엘 바이오 시스템스, 캘리포니아주 소재)에 두었다. 편광을 실온에서 연속적인 플루오레세인 램프(여기 485 nm, 방사 530 nm)를 사용하여 측정하였다. 결과를 또한 표 1에 나타낸다.
이들 데이타는 항-세포자멸사 Bcl-XL 단백질 및 항-세포자멸사 Bcl-2에 대한 결합제 및 이의 억제제로서 화학식 II의 화합물의 유용성을 입증한다.
화학식 II의 화합물이 Bcl-XL 및 Bcl-2에 결합하여 이이 활성을 억제하므로, 이들은 또한 예를 들면, 항-세포자멸사 Bcl-w 단백질과 같은 BC1-XL 및 Bcl-2에 대해 밀접한 구조적 상동성을 갖는 항-세포자멸사 계열 단백질 구성원의 억제제로서의 유용성을 가질 수 있는 것으로 예측된다.
따라서, 화학식 II의 화합물은 항-세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-2 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-w 단백질 또는 이들의 병용물이 발현되는 동안 질환의 치료에 있어 유용성을 가지는 것으로 예측된다.
사람 종양 세포주에서 세포 효능의 측정
NCI-H146(ATCC, 버지니아주 매너서스 소재) 사람 소 세포 폐 암종 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 속에 웰당 50,000개 세포로 총 100μL의 용적으로, 태아 소 태아 혈청대신 10% 사람 혈청[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드 소재]이 보충된 조직 배양 배지 속에서 플레이팅하고 10μM 내지 0.020μM의 목적 화합물의 2-배 일련 희석물로 처리하였다. 각각의 농도를 적어도 3회의 별개의 회수로 중복 시험하였다. 화합물 처리 후 48시간 때에 생존세포의 수를 CellTiter 96® 수성 비-방사성 세포 증식 MTS 검사를 사용하여 제조업자의 추천[제조원: 프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨 소재]에 따라 측정하였다. 결과를 또한 표 1에 나타낸다.
랫트에서 선택된 화합물의 약력학적 평가
본원 명세서의 교시내용의 화합물의 약력학적 거동을 수컷 스프래그-다울리(Sprague-dawley) 기원한 랫트(그룹당 n=3)에서 1회의 2 mg/kg 정맥내 또는 5 mg/kg 경구 투여량 후 측정하였다. 화합물을 경구 및 정맥내 투여 둘다에 대해 PEG-400 제형 중 10% DMSO 속에서 2mg/mL 용액으로서 제조하였다. 1mL/kg의 정맥내 투여량을 약한 에테르 마취하에 랫트의 목 정맥내에서 느린 주입(약 1 내지 2분)으로 투여하였다. 경구 투여량은 위관영양법(gavage)으로 투여하였다. 일련의 혈액 시료를 투여량 후 0.1(IV로만), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8 및 24 시간째에 각각의 랫트의 꼬리 정맥으로부터 수득하였다. 헤파린처리한 시료를 완전히 혼합하고 빙욕 속에 두었다. 혈장을 원심분리로 분리하고 분석 전에 동결 저장하였다. 결과를 또한 표 1에 나타낸다.
목적 화합물을 아세토니트릴을 사용한 단백질 침전을 사용하여 혈장으로부터 분리하였다. 혈장(100 내지 200 μL, 시료 또는 스파이크된 표준물) 분취량을 96-웰 폴리프로필렌 깊은 웰 플레이트 속에서 50 μL의 내부 표준물(아세토니트릴 중의 제조된 구조적으로 관련된 유사체) 및 1 ml의 아세토니트릴과 합하였다. 플레이트를 30초 동안 와동시킨 후 원심분리(3500 rpm x 15분, 4℃)하였다. 자동화된 방식으로, 상층액을 투명한 96-웰 플레이트로 이전시켰다. 시료를 Micro-VapTM 상에서 건조 질소의 스트림하에 저온(~37℃)에서 거의 무수로 증발시켰다. 시료를 아세토니트릴 중의 0.2 mL의 5% DMSO와 함께 와동시켜 재구성하였다. 0.1 내지 0.2 ml 분취량의 아세토니트릴: 0.1% 트리플루오로아세트산(20:80, 용적 기준)을 각각의 웰에 가한 후 추가로 30초 와동시켰다. 플레이트를 원심분리(3500 rpm x 15분, 4℃)한 후 HPLC-MS/MS 분석하였다. 시료를 스파이크된 혈장 표준물과 함께 동시에 분석하였다. 각각의 연구로부터의 모든 시료를 단일의 뱃치로서 LC-MS/MS 상에서 분석하였다.
목적 화합물 및 내부 표준물을 서로로부터 분리하고 오염물을 아세토니트릴: 0.1% 트리플루오로아세트산 이동상(50:50, 용적 기준)이 있는 50 x 3 mm 키스톤 베타실(Keystone Betasil) CN 5μm 컬럼 상에서 0.7 ml/분의 유동 속도로 공-추출하였다. Sciex API 300TM 생체분자 질량 분석기 상에서 가열된 분무기 인터페이스(nebulizer interface)를 사용하여 분석을 수행하였다. 표제 화합물 및 내부 표준물의 피크 영역을 Sciex MacQuanTM 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 교정 곡선은 최소제곱법선형 회귀비 대 이론적 농도를 사용하여 스파이크된 랫트 혈장 표준물의 피크 영역비(모 약물/내부 표준물)로부터 기원하였다. 상기 방법들을 일반적으로 0.01㎍/mL의 추정된 정량 제한을 사용하여 표준 곡선(상관 계수 ＞0.99)의 범위에 걸쳐 선형화되었다. 각각의 동물로부터 혈장 농도 데이타를 윈논린(WinNonlin)을 사용하는 다중-기하급수 곡선 핏팅(multi-exponential curve fitting)에 제출하였다. 투여후 0 내지 t 시간(마지막 측정가능한 혈장 농도의 시간)의 혈장 농도-시간 곡선하 영역(AUC0 -t)을 혈장 농도-시간 프로파일에 대한 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산하였다. 최종 측정된 혈장 농도(Ct)를 말단 제거율 상수(β)로 나누어 측정한, 무한까지 외삽된 잔류 영역을 AUC0 -t에 가하여 곡선하 총 영역(AUC0 -∞)을 생산하였다. 당해 결과는 표 1에 또한 나타낸다. 하기 표에 나타낸 Ki 값을 왕의 방정식(Wang's equation)(참조: Wang Z X,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995; 360:111-4)을 사용하여 측정하였다.
[표 1]
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본원 명세서의 교시내용의 화합물을 실시예 A 내지 L로서 본원에서 정의한 제WO 2005/049594호에 기재된 화합물과, 세포 효능에 대한 전신계 노출의 비를 측정함으로써 비교하였다. 때때로 AUC/EC50으로 보고된 당해 척도는 약제학적 약물 발견 및 약물 개발 분야의 숙련가들에게 경구 효능의 유용학 약력학적 예측변수로서 잘 공지되어 있다.
본원 명세서의 교시내용의 실시예 및 제WO 2005/049594호에 기재된 화합물 둘다를 H146 세포 검사에서 시험하고 본원 명세서에 앞서 기술된 바와 같이 둘다 랫트에서 경구 약력학적 특성에 대해 평가하였다. 당해 결과를 표 2 및 3에 나타낸다. 데이타에 대한 참조를 사용하여 알 수 있는 바와 같이, 본원 명세서의 교시내용의 화합물은 당해 분야에 공지된 화합물과 비교하여 보다 바람직한 약력학적 프로파일(본 발명의 화합물이 보다 높은 AUC/EC50 값을 나타냄을 의미)을 갖는다. 이들 결과로부터, 다수의 관측이 유추될 수 있다. W1 위치에서 NO2 모이어티를 갖는 화합물은 탁월한 세포 효능(예를 들면, EC50 < 1μM)을 가지는 경향이 있음이 관측될 수 있다. 그러나, 이들 동일한 화합물의 약력학적 특성이 측정된 경우, 경구 투여 후 전신계적 노출은 불량하여 0.5 내지 19.7의 AUC/EC50 비를 생성함을 알 수 있다. 한편, W1 위치에서 CF3 또는 CN 모이어티를 갖는 화합물이 세포 검사에서 시험되는 경우, 이들 유도체는, 심지어 이들이 경구 투여 후에도 적합한 전신계적 노출을 갖는다 해도, 비교적 불량한 세포 효능(예를 들면, EC50 > 1μM)을 갖는다. 다시, 당해 병용물은 약 2.8 내지 약 <7.4의 전체 AUC/EC50 비를 제공한다. 놀랍게도, 본원 명세서의 교시내용의 화합물은 NO2 모이어티를 갖는 한편 경구 투여 후 적합한 전신계적 노출을 유지하는 화합물을 사용하여 파(par)에서의 세포 효능을 입증한다. 본원 명세서의 교시내용의 화합물에 대해 수득되는 AUC/EC50 비는 약 20 내지 약 554이다.
Figure pct00016
[표 2]
Figure pct00017
[표 3]
Figure pct00018
i-Pr은 이소-프로필을 의미한다.
도 1 내지 7에 나타낸 바와 같이, 에토포시드, 빈크리스틴, CHOP, 리툭시마브, 리툭시마브와 CHOP, 라파마이신, 및 VELCADE와 병용되는 실시예 1의 화합물의 경구 효능에 관한 연구들은, 실시예 1의 화합물이 경구 투여되는 경우 병용 치료요법 동안 이들 세포독성제의 효능이 상승적으로 향상되었음을 입증하였다.
또한, 실시예 1의 화합물과 빈크리스틴을 포함하는 병용물은 10%의 완전한 종양 회귀를 생성하였다.
추가의 또한, 실시예 1의 화합물과 리툭시마브를 포함하는 병용물은 70%의 완전한 종양 회귀를 생성한 반면 리툭시마브 단독에 대해서는 종양 회귀가 관측되지 않았다.
추가의 또한, 실시예 1의 화합물과 라파마이신을 포함하는 병용물은 70%의 완전한 종양 회귀를 생성한 반면 라파마이신 단독에 대해서는 10%의 종양 회귀가 관측되었다.
추가의 또한, 실시예 1의 화합물과 리툭시마브와 CHOP를 포함하는 병용물은 90%의 완전한 종양 회귀를 생성한 반면 리툭시마브와 CHOP 만에 대해서는 10%의 종양회귀가 관측되었다.
추가의 또한, 실시예 1의 화합물과 보르텍소미브를 포함하는 병용물은 10%의 완전한 종양 회귀를 생성한 반면, 보르텍소미브 만에 대해서는 종양 회귀가 관측되지 않았다.
항-세포자멸사 Bcl-XL 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-2 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-w 단백질 또는 이들의 병용물이 발현되는 질환은 암 및 자가면역 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 암은 청신경종(acoustic neuroma), 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수세포 백혈병(단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구 및 전골수세포), 급성 t-세포 백혈병, 기저 세포 암종, 담즙관 암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성 암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수세포(과립구) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 증식불량 변화(형성이상 및 화생(metaplasias)), 배아 암종, 자궁내막 암, 내피육종(endotheliosarcoma), 뇌실막종, 내피 암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체 양성 유방암, 본태성 혈소판증가증, 유윙 종양(Ewing's tumor), 섬유육종, 소포 림프종, 배아 세포 고환암, 신경아교종, 중쇄병(heavy chain disease), 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬 무감각 전립선암(hormone insensitive prostate cancer), 평활근육종, 지방육종, 폐 암종, 림프형성내피육종(lymphagioendotheliosarcoma), 림프관육종, 림프모구 백혈병, 림프종[호지킨 및 비-호지킨(Hodgkin's and non-Hodgkin's)], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부 및 자궁의 악성종양 및 고증식성 장애, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발 골수종, 골수성 백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소 세포 폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘 암종, 고환종, 소 세포 폐 암종, 고형 종양(암종 및 육종), 소 세포 폐암 편평세포 암종, 윤활막종, 한선 암종, 발덴스트롬 마이크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 고환 종양, 자궁 암, 빌름스 종양(Wilms' tumor)[참조: Cancer Res., 2000, 60, 6101-10 및 Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)]을 포함하고; 자가면역장애는 후천성 면역결핍증 질환 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 용혈빈혈, 염증성 질환, 및 혈소판감소증[참조: Current Allergy and Asthma Reports 2003, 3:378-384; Br. J. Haematol. 2000 Sep.; 110(3): 584-90; Blood 2000 Feb. 15; 95(4):1283-92; 및 New England Journal of Medicine 2004 Sep.; 351(14): 1409-1418]을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
화학식 II의 화합물은 유방암(에스트로겐-수용체 양성 유방암), 결장직장암, 자궁내막암, 폐 암(소 세포 페암 포함), 림프종(난포 또는 확산성 거대 B-세포 포함), 림프종(비-호지킨 림프종 포함), 신경모세포종, 난소암, 전립선암(호르몬-무감각 전립선암 포함), 고환암(배아 세포 고환암 포함)과 같은 암 또는 신생물로부터 기원한 세포의 성장을 억제할 수 있다.
화학식 II의 화합물은 배아형횡문근육종, 소아 급성 림프모구 백혈병, 소아 급성 골수성 백혈병, 소아 포상횡문근육종, 소아 역형성 뇌실막종, 소아 역형성 거대 세포 림프종, 소아 역형성 속질모세포종, 중추 신경계의 소아 비정형 기형/횡문근양종양, 소아 비페노타이픽 급성 백혈병, 소아 버킷 림프종(pediatric Burkitts lymphoma), 원외 신경외배엽 종양과 같은 종양의 유윙 계열의 소아 암, 소아 확산성 역형성 빌름스 종양, 소아 양호한 조직학 빌름스 종양(pediatric favorable histology Wilm's tumor), 소아 아교모세포종, 소아 속질모세포종, 소아 신경모세포종, 소아 신경모세포종-기원한 골수구종증, 소아 전-B-세포암(예를 들면, 백혈병), 소아 골육종, 소아 횡문근양 신장 종양, 소아 횡문근육종, 및 림프종 및 피부 암과 같은 소아 T-세포 암(공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호), Cancer Res., 2000, 60, 6101-10)과 같은 소아암 또는 신생물로부터 기원한 세포 성장을 억제할 수 있으며; 자가면역 장애는 후천성 면역결핍성 질환 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 용혈빈혈, 염증성 질환 및 혈소판감소증[참조: Current Allergy and Asthma Reports 2003, 3:378-384; Br. J. Haematol. 2000 Sep.; 110(3): 584-90; Blood 2000 Feb. 15; 95(4):1283-92; 및 New England Journal of Medicine 2004 Sep.; 351(14): 1409-1418]을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
화학식 II의 화합물은 합성 화학 공정에 의해 제조될 수 있으며, 이의 예는 하기에 나타낸다. 공정에서 단계들의 순서는 변할 수 있으며, 시약, 용매 및 반응 조건은 구체적으로 언급된 것들로 치환될 수 있고, 약한 모이어티들은 경우에 따라 보호되거나 탈보호될 수 있음이 이해되어야 함을 의미한다.
C(O)OH 모이어티에 대한 보호 그룹은 아세톡시메틸, 알릴, 벤조일메틸, 벤질, 벤질옥시메틸, 3급-부틸, 3급-부틸디페닐실릴, 디페닐메틸, 사이클로부틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 사이클로프로필, 디페닐메틸실릴, 에틸, 파라-메톡시벤질, 메톡시메틸, 메톡시에톡시메틸, 메틸, 메틸티오메틸, 나프틸, 파라-니트로벤질, 페닐, n-프로필, 2,2,2-트리클로로에틸, 트리에틸실릴, 2-(트리메틸실릴)에틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸, 트리페닐메틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
C(O) 및 C(O)H 모이어티에 대한 보호 그룹은 1,3-디옥실케탈, 디에틸케탈, 디메틸케탈, 1,3-디티아닐케탈, O-메틸옥심, O-페닐옥심 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
NH 모이어티에 대한 보호 그룹은 아세틸, 알라닐, 벤조일, 벤질(페닐메틸), 벤질리덴, 벤질옥시카보닐(Cbz), 3급-부톡시카보닐(Boc), 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 디페닐메틸, 디페닐포스포릴, 포르밀, 메탄설포닐, 파라-메톡시벤질옥시카보닐, 페닐아세틸, 프탈로일, 석시닐, 트리클로로에톡시카보닐, 트리에틸실릴, 트리플루오로아세틸, 트리메틸실릴, 트리페닐메틸, 트리페닐실릴, 파라-톨루엔설포닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
OH 및 SH 모이어티에 대한 보호 그룹은 아세틸, 알릴, 알릴옥시카보닐, 벤질옥시카보닐 (Cbz), 벤조일, 벤질, 3급-부틸, 3급-부틸디메틸실릴, 3급-부틸디페닐실릴, 3,4-디메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 디페닐메틸, 포르밀, 메탄설포닐, 메톡시아세틸, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 파라-메톡시벤질, 메톡시카보닐, 메틸, 파라-톨루엔설포닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐, 2,2,2-트리클로로에틸, 트리에틸실릴, 트리플루오로아세틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐, 2-트리메틸실릴에틸, 트리페닐메틸, 2-(트리페닐포스포니오)에톡시카보닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다음 약어들은 나타낸 의미를 갖는다.
ADDP는 1,1'-(아조디카보닐)디피페리딘을 의미하고; AD-mix-β는 (DHQD)2PHAL, K3Fe(CN)6, K2CO3 및 K2SO4의 혼합물을 의미하며; AIBN은 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)을 의미하고; 9-BBN은 9-보라비사이클로[3.3.1]노난을 의미하고; (DHQD)2PHAL은 하이드로퀴니딘 1,4-프탈라진디일 디에틸 에테르를 의미하며; DBU는 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔을 의미하고; DIBAL은 디이소부틸 알루미늄 하이드라이드를 의미하며, DIEA는 디이소프로필에틸아민을 의미하고; DMAP는 N,N-디메틸아미노피리딘을 의미하고; DME는 1,2-디메톡시에탄을 의미하며; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 의미하고; dmpe는 1,2-비스(디메틸포스피노)에탄을 의미하며; DMSO는 디메틸설폭사이드를 의미하고; dppb는 1,4-비스(디페닐포스피노)부탄을 의미하며; dppe는 1,2-비스(디페닐포스피노)에탄을 의미하고; dppf는 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센을 의미하고; dppm는 1,1-비스(디페닐포스피노)메탄을 의미하고; EDAC는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드를 의미하고; Fmoc는 플루오레닐메톡시카보닐을 의미하고; HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N'N'N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하며; HMPA는 헥사메틸포스포르아미드를 의미하고; IPA는 이소프로필 알코올을 의미하며; LDA는 리튬 디이소프로필아미드를 의미하고; LHMDS는 리튬 비스(헥사메틸디실릴아미드)를 의미하며; MP-BH3는 다공성 트리에틸암모늄 메틸폴리스티렌 시아노보로하이드라이드를 의미하고; LAH는 리튬 알루미늄 하이드라이드를 의미하며; NCS는 N-클로로석신이미드를 의미하고; PyBOP는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하며; TDA-1은 트리스(2-(2-메톡시에톡시)에틸)아민을 의미하고; TEA는 트리에틸아민을 의미하며; TFA는 트리플루오로아세트산을 의미하고; THF는 테트라하이드로푸란을 의미하며; NCS는 N-클로로석신이미드를 의미하고; NMM은 N-메틸모르폴린을 의미하며; NMP는 N-메틸피롤리딘을 의미하고; PPh3는 트리페닐포스핀을 의미한다.
[반응식 1]
Figure pct00019

반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 전자(former)의 클로로설폰산 및 암모니아를 반응시킴에 의해 화학식 2의 화합물로 전환시킬 수 있다.
[반응식 2]
Figure pct00020

화학식 2의 화합물은 전자의 화합물과 화학식 3의 화합물 및 커플링제를 염기와 함께 또는 염기없이 반응시켜 화학식 II의 화합물로 전환시킬 수 있다. 커플링제의 예는 EDCI, CDI 및 PyBop를 포함한다. 염기의 예는 TEA, DIEA, DMAP, 및 이의 혼합물을 포함한다.
화학식 2의 화합물은 전자의 화합물과 화학식 Z1-COCl의 화합물 및 염기를 반응시켜 화학식 II의 화합물로 전환시킬 수 있다.
C. 암을 치료하는데 사용하기 위한 다배수 유도제 및 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 상승적 조합물
다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 암으로 고생하는 환자를 치료하는데 유용한 치료제들의 상승적 병용물의 발견에 관한 것이다. 본원에서 앞서 언급한 바와 같이, 본원 명세서의 교시내용의 발명자들은, 특정 종양 및 암 세포에서 다배수체화의 유도가 Bcl-XL의 항-세포자멸사 활성에 따라 수득되는 다배수체 세포를 생존시키거나 생존하도록 함을 발견하였다. 이들 다배수체 세포는 현재 이들의 생존에 대해 Bcl-XL에 의존적이므로, 이들 종양 및 암 세포는 Bcl-XL 억제에 대해 감작화(sensitizing)된다.
따라서, 본원 명세서의 교시내용은 (1) 적어도 하나의 다배수 유도제; 및 (2) 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 포함하는 치료제의 병용물(즉, 병용 치료요법)에 관한 것이다. 적어도 하나의 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제(아우로라 키나제 B 억제제와 같은), 미소관 억제제(예를 들면, 탁소테레, 빈크리스틴, 노코다졸, 파클리탁셀 또는 콜세미드와 같은), 판-키나제 억제제(예를 들면, 스타우로스포린과 같은), 온콜리틱 바이러스(oncolytic virus)(예를 들면, ONYX-015와 같은), 아크리딘 오렌지, 돌라스타인-10, 노스카핀, 토포이소머라제 II 억제제(예를 들면, ICRF-187 또는 ICRF-193와 같은), 2-{4-[(7-클로로-2-퀴녹살리닐)옥시]페녹시}프로피온산, 2-{4-[(7-브로모-2-퀴놀리닐)옥시]페녹시}프로피온산, 플라티코딘 D, 미소관 독소(예를 들면, JG-03-14와 같은), 액틴 중합 억제제(예를 들면, 사이토칼라신 B와 같은), 비스트라미드 A 또는 항종양 항생제(예를 들면, 미트라마이신 SKI와 같은)일 수 있다. 예시적인 다배수 유도제는 아우로라 키나제 억제제이다. 사용될 수 있는 예시적인 아우로라 키나제 억제제는 아우로라 키나제 B 억제제이다. 사용될 수 있는 아우로라 키나제 B 억제제의 예는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 및 헤스페라딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 예시적인 아우로라 키나제 B 억제제는 AZD1152이다.
하나 이상의 세포에서 다배수의 유도 또는 증거를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득할 수 있거나 측정할 수 있다. 예를 들면, 다배수의 증거는 p53의 검출된 상승된 발현에 의해 측정할 수 있다. p53은 야생형 p53을 지닌 세포에서 다배수체화를 위한 대용품이다[참조: Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, 7668-77. (2006)]. 추가로, 다배수가 유도된 세포는 >4N DNA 함량, 세포 크기 및 다핵화에 있어서 총 형태학적 증가를 나타내며, 이들 모두는 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 검출할 수 있다.
적어도 하나의 Bcl-2 계열 구성원 억제제는 본원의 단락 B에 기술된 화합물 (예를 들면, ABT-263와 같은), ABT-737, Bcl-XL 억제제(A-1113567 및 A-1182848과 같은) 및 이들의 병용물 중 어느 것일 수 있다. 예시적인 Bcl-2 계열 구성원 억제제는 ABT-263이다.
치료제, 즉, 적어도 하나의 다배수 제제 및 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 상술한 병용물을 사용하여 암의 적어도 하나의 유형으로 고생하는 환자를 치료할 수 있다. 구체적으로, 이러한 치료 방법은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제 및 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 암으로 고생하며 이의 치료가 요구되는 환자에게 투여함을 포함한다. 적어도 하나의 다배수 유도제 및 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 환자에게 투여하는 순서는 중요하지 않다. 그러나, 종양 및 암 세포는 다배수의 유도 후까지 Bcl-2 계열 단백질 억제제에 대해 감작화되지 않으므로, 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제를 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제 투여 전에 또는 이후에 투여하는 것이 가장 유리하다.
본원에 기술된 치료제의 병용물과 함께 치료되는 환자에게 투여될 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제 및 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제는 당해 분야의 숙련가, 즉, 치료하는 주치의에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
암으로 고생하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제의 예시적인 병용물은 다배수 유도제로서 치료학적 유효량의 AZD 1152 및 Bcl-2 계열 단백질 억제제로서 치료학적 유효량의 ABT-263의 사용을 포함한다.
위에서 언급한 치료제의 병용물은 특정 유형의 종양, 암, 악성종양 또는 이의 조합으로 고생하는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 치료제의 조합물을 사용하여 청신경종, 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수세포 백혈병(단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구 및 전골수세포), 급성 t-세포 백혈병, 기저 세포 암종, 담즙관 암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성 암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수세포(과립구) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 증식불량 변화(형성이상 및 화생(metaplasias)), 배아 암종, 자궁내막 암, 내피육종(endotheliosarcoma), 뇌실막종, 내피 암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체 양성 유방암, 본태성 혈소판증가증, 유윙 종양(Ewing's tumor), 섬유육종, 소포 림프종, 배아 세포 고환암, 신경아교종, 중쇄병(heavy chain disease), 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬 무감각 전립선암(hormone insensitive prostate cancer), 평활근육종, 지방육종, 폐 암종, 림프형성내피육종(lymphagioendotheliosarcoma), 림프관육종, 림프모구 백혈병, 림프종[호지킨 및 비-호지킨(Hodgkin's and non-Hodgkin's)], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부 및 자궁의 악성종양 및 고증식성 장애, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발 골수종, 골수성 백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소 세포 폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘 암종, 고환종, 소 세포 폐 암종, 고형 종양(암종 및 육종), 소 세포 폐암 편평세포 암종, 윤활막종, 한선 암종, 발덴스트롬마이크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 고환 종양, 자궁암 및 빌름스 종양(Wilms' tumor)[참조: Cancer Res., 2000, 60, 6101-10 및 Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)]으로 고생하는 환자를 치료할 수 있다.
D. 폴리뉴클레오타이드 검사
단락 C에서 위에 기술한 발견과 관련하여, 본원 명세서의 교시내용의 발명자들은 또한, 종양 및 암 세포(이들 암 세포가 다배수로 유도되거나 유도되지 않는 것에 상관없이) 및 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 종양 및 암 세포가 적어도 하나의 다배수 유도제와 함께 다배수를 유도한 후 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 사용한 치료에 대해 면역성이며 내성을 나타냄을 발견하였다. 다시 말해서, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 다배수 종양 및 암 세포는 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제와 동시에 또는 이를 후속적으로 치료하는 경우 세포자멸사 또는 세포 사멸을 억제하거나 경험하지 않는다.
따라서, 이러한 발견의 측면에서, 다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용은 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를: (i) 완전한 조직 또는 세포 시료에 대한 동소 하이브리드화 검사, (ii) 조직 시료로부터 추출된 염색체 DNA에 대한 마이크로어레이 하이브리드화 검사, 및 (iii) 조직 시료로부터 추출된 염색체 DNA에 대한 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 다른 증폭 검사에 의해 검출하기 위한 핵산 검사 방법을 제공한다. 상기 양식의 어느 것에서 펩타이드 핵산과 같은 핵산의 합성 유사체를 사용한 분석도 사용할 수 있다.
본원 명세서의 교시내용의 검사는 다배수 유도제 치료요법, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제 치료요법 및 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용에 대한 환자 반응을 모니터링하고 치료요법 반응을 예측하는데 둘 다에 사용하기 위한 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 확인하는데 사용된다. 반응 예측을 위한 검사는 적어도 하나의 다배수 유도제(다배수를 유도하기 위한)의 투여전 또는 다배수의 유도 후 그러나 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여하기 전에 수행할 수 있으며, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 나타내지 않거나 나타내는 환자는 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제 및 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용한 치료요법에 대해 적격인 것으로 고려될 수 있다.
환자 반응을 모니터링하기 위해, 검사를 치료요법의 개시(즉, 적어도 하나의 다배수 유도제를 투여하는 시기 또는 적어도 하나의 다배수 유도제를 투여한 후 그러나 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여하기 전)에 수행하여 조직 시료내에서 돌연변이(들)의 기본선 수준, 예를 들면, 시료내에서 적어도 하나의 돌연변이를 나타내는 총 세포의 퍼센트 또는 세포의 수를 확립할 수 있다. 이후에, 동일한 조직을 시료로 만들고 검사한 다음 돌연변이의 양 또는 수를 기준선 또는 예정된 수준으로 비교하였다. 돌연변이의 수가 동일하거나 감소되어 남아 있는 경우, 치료요법은 효과적일 수 있으며 지속될 수 있다. 기본선 수준 초과의 돌연변이내 유의적인 증가가 발생한 경우, 환자는 연속된 다배수 유도제 치료요법, Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법 또는 다배수 유도제 치료요법과 Bcl-2 계열 단백질 억제제 치료요법의 병용에 대해 반응하지 않거나 발달된 내성을 가질 수 있다.
본원 명세서의 교시내용의 검사는 청신경종, 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수세포 백혈병(단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구 및 전골수세포), 급성 t-세포 백혈병, 기저 세포 암종, 담즙관 암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성 암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수세포(과립구) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 증식불량 변화(형성이상 및 화생), 배아 암종, 자궁내막 암, 내피육종, 뇌실막종, 내피 암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체 양성 유방암, 본태성 혈소판증가증, 유윙 종양, 섬유육종, 소포 림프종, 배아 세포 고환암, 신경아교종, 중쇄병, 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬 무감각 전립선암, 평활근육종, 지방육종, 폐 암종, 림프형성내피육종, 림프관육종, 림프모구 백혈병, 림프종[호지킨 및 비-호지킨], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부 및 자궁의 악성종양 및 고증식성 장애, T-세포 또는 B-세포 기원의 림프구 악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발 골수종, 골수성 백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소 세포 폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘 암종, 정상피종(seminoma), 소 세포 폐 암종, 고형 종양(암종 및 육종), 소 세포 폐암 편평세포 암종, 윤활막종, 한선 암종, 발덴스트롬 마이크로글로불린혈증, 고환 종양, 자궁암 및 빌름스 종양[참조: Cancer Res., 2000, 60, 6101-10]과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 암으로 고생하는 환자로부터 수득된 시험 시료에 사용될 수 있다.
본 발명의 검사는 어떠한 유형의 환자 조직 시료와 같은 어떠한 유형의 시험 시료 또는, 말초 혈액, 종양 또는 의심되는 종양 조직(새로이 동결되고 고정된 파라핀-봉매된 조직 포함), 혈액 시료, 림프절 조직, 골수 및 미세-침 흡인물에서 분리되거나 확인된 혈액순환하는 내피 세포(circulating epithelial cell)와 같은 세포 분리물을 포함하는 이의 유도체 상에서 수행된다.
본원 명세서의 교시내용은 데옥시리보핵산(DNA) 프로브 또는 단백질 핵산(PNA) 프로브, 또는 특이적인 염색체 표적에 대해 하이브리드화하도록 설계된/선택된 표지되지 않은 프라이머와 같은 검출가능하게 표지된 핵산-계 프로브를 사용한 하이브리드화 검사에 의한 게놈 바이오마커의 검출을 포함한다. 표지되지 않은 프라이머는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의한 것과 같은 증폭 검사에서 사용되며, 여기서 프라이머 결합 후, 폴리머라제는 후속적인 검출을 위해 표적 핵산 서열을 증폭시킨다. PCR 또는 다른 증폭 검사에 사용된 검출 프로브는 바람직하게는 형광성이며, 추가의 보다 바람직하게는, "실시간 PCR"에 유용한 검출 프로브이다. 형광성 표지는 또한 동소 하이브리드화에서 사용하기에 바람직하나 하이브리드화 기술에 일반적으로 사용된 다른 검출가능한 표지, 예를 들면, 효소, 색원체 및 동위원소 표지를 또한 사용할 수 있다. 유용한 프로브 표지 기술은 문헌(참조: Fan, Y.-S. 2002. Molecular cytogenetics: protocols and applications. Humana Press, Totowa, N.J. xiv, p. 411, 이들 내용은 본원에 참조로 인용된다)에 기술되어 있다. 마이크로어레이 분석에 의한 게놈 바이오마커의 검출시, 이들 프로브 표지 기술은 환자 시료로부터 추출한 염색체 DNA를 표지하기 위해 적용된 후 마이크로어레이로 하이브리드화된다.
바람직하게는, 동소 하이브리드화를 사용하여 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출한다. 검출되는 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재가 검출되는 예시적인 유전자는 사람 BAX 유전자, 사람 BAK 유전자, 사람 NOXA 유전자 및 이의 모든 조합이다. 프라이머 및 프로브는 당해 분야의 통상의 기술을 사용하거나 BAX, BAK 및 NOXA 유전자의 발현을 검출하고/하거나 측정하기 위한 TAQMAN® 유전자 발현 검사(제조원: 어플라이드 바이오시스템스, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)와 같은 시판되는 키트에 이용가능한 것과 같은 프로브를 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 제조될 수 있다. 사용할 수 있는 어플라이드 바이오시스템스로부터 이용가능한 TAQMAN® 유전자 발현 검사의 예는 하기 표 3에서 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00021
본원 명세서의 교시내용의 동소 하이브리드화 방법에서 사용하기 위한 프로브는 2개의 광범위한 그룹에 속한다: 염색체 계수(enumeration) 프로브, 즉, 염색체 부위, 일반적으로 반복 서열 부위에 하이브리드화하며 전체 염색체의 존재 또는 부재를 나타내는 프로브; 및 유전자자리(locus) 특이적인 프로브, 즉, 염색체 상의 특이적인 유전자자리에 하이브리드화하며 특이적인 유전자자리의 존재 또는 부재를 검출하는 프로브. 염색체 아암(arm) 프로브, 즉, 염색체 부위에 하이브리드화하며 특이적인 염색체의 아암의 존재 또는 부재를 나타내는 프로브를 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 사람 BAX, BAK 및 NOXA 유전자자리와 같이, 정보를 얻는 유전자자리에서 유일한 염색체 DNA 서열의 변화를 검출할 수 있는 유전자자리 특이적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 동소 하이브리드화를 위한 유일한 서열 프로브의 사용 방법은 미국 특허 제5,447,841호에 기술되어 있으며 이의 내용이 본원에 참조로 인용된다.
염색체 계수 프로브는 동원체 근처에 위치하거나 이로부터 제거된 반복 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 염색체의 어떠한 위치에 위치한 유일한 서열에 하이브리드화할 수 있다. 예를 들면, 염색체 계수 프로브는 염색체의 동원체와 관련된 반복된 DNA와 하이브리드화할 수 있다. 주요 염색체의 동원체는 알파-위성 DNA로 언급된, 약 171개 염기 쌍의 단량체 반복 길이로 이루어진 DNA의 긴 탠덤(tandem) 반복체의 복합체 계열을 함유한다. 염색체 14번 및 18번 각각에 대한 동소 하이브리드화 프로브에서 형광성인 동원체는 애보트 몰레큘러(Abbott Molecular, 일리노이주 데스 플레인스 소재)로부터 시판된다.
예외적으로 유용한 동소 하이브리드화 프로브는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,491,224호에 기술된 것과 같은 형광성 프로브로 직접 표지된다. 미국 특허 제5,491,224호는 또한 하나 이상의 형광적으로 표지된 프로브를 사용한 동시 FISH 검사를 기술한다.
유용한 유전자자리 특이적인 프로브는 임의의 방식으로 생산될 수 있으며 일반적으로 약 10,000 내지 약 1,000,000개 염기 길이의 염색체 DNA 표적 서열에 하이브리드화하는 서열을 함유한다. 바람직하게는 프로브는 적어도 100,000개 염기 길이 내지 약 500,000개 염기 길이의 표적 유전자자리에서 염색체 DNA의 표적 신장(stretch)에 하이브리드화하며 또한 이의 내용이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,756,696호에 기재된 바와 같이 프로브 혼합물내에 표지되지 않은 차단 핵산을 포함함으로써 프로브의 비-특이적인 결합을 피한다. 차단 핵산으로서 표지되지 않은, 합성된 올리고머 핵산 또는 펩타이드 핵산을 사용하는 것이 또한 가능하다. 특정 유전자 유전자자리를 표적화하기 위해, 프로브가 유전자를 스팬(span)하는 핵산 서열을 포함함으로써 유전자의 전체 게놈 암호화 유전자자리의 양쪽 측면에 하이브리드화하는 것이 바람직하다. 프로브는 세균 인공 염색체(BAC) 등과 같은 사람 DNA-함유 클론으로 출발하여 생산할 수 있다. 사람 게놈에 대한 BAC 라이브러리는 인비트로겐(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터 이용가능하며 유용한 클론의 확인을 위해 조사할 수 있다. 캘리포니아대 산타 크루즈 브라우저(University of California Santa Cruz Genome Browser)를 사용하여 표적 유전자자리내 DNA 서열을 확인하는 것이 바람직하다. 이들 DNA 서열은 이후에 BAC 라이브러리를 스크리닝하기 위해 PCR 프라이머를 합성하기 위해 사용됨으로써 유용한 클론을 확인할 수 있다. 이후에, 당해 클론은 통상의 닉 해독 방법에 의해 표지되고 동소 하이브리드화 프로브로서 시험될 수 있다.
본원에 기술된 동소 하이브리드화 방법에 사용될 수 있는 형광단의 예는 7-아미노-4-메틸코우마린-3-아세트산(AMCA); Texas RedTM[제조원: Molecular Probes, Inc., 오리건주 유진 소재); 5-(및 -6)-카복시-X-로다민; 리싸민 로다민 B; 5-(및 -6)-카복시플루오레세인; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(FITC); 7-디에틸아미노코우마린-3-카복실산, 테트라메틸-로다민-5-(및 -6)-이소티오시아네이트; 5-(및 -6)-카복시테트라메틸로다민; 7-하이드록시-코우마린-3-카복실산; 6-[플루오레세인 5-(및 -6)-카복스아미도]헥사노산; N-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a 디아자-3-인다센프로피온산; 에오신-5-이소티오시아네이트; 에리트로신-5-이소티오시아네이트; 5-(및 -6)-카복시로다민 6G; 및 CascadeTM 블루 아세틸아지드[제조원: 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes); 인비트로겐 상표명]이다.
프로브는 형광 현미경 및 각각의 형광단용으로 적절한 여과기를 사용하거나, 다중 형광단을 관측하기 위한 이중 또는 삼중 밴드-통과 여과기 세트를 사용함으로써 검토할 수 있다(참조: 이의 내용이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,776,688호). 어떠한 적합한 현미경 영상 방법도 사용하여 자동화된 디지탈 영상 시스템을 포함하는 하이브리드화된 프로브를 가시화할 수 있다. 또는, 유동 세포분석법과 같은 기술을 사용하여 염색체 프로브의 하이브리드화 패턴을 시험할 수 있다.
동소 하이브리드화로부터 생성된 세포 사이(cell-by-cell) 유전자 증폭 분석이 바람직하다고 해도, 게놈 바이오마커는 또한 정량적 PCP에 의해 검출될 수 있다. 당해 양태에서, DNA는 조직 시료로부터 추출된 후 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 BH3 암호화 유전자(사람 BID 유전자, 사람 NOXA 유전자, 사람 PUMA 유전자, 사람 BIK 유전자, 사람 BIM 유전자 및 사람 BAD 유전자와 같은), 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 중 적어도 하나에 대해 특이적이고, 사람 BH3 암호화 유전자(사람 BID 유전자, 사람 NOXA 유전자, 사람 PUMA 유전자, 사람 BIK 유전자, 사람 BIM 유전자 및 사람 BAD 유전자와 같은) 내에서 특이적인 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해, 또는 다수의 프라이머 쌍을 사용하는 다중 PCR에 의해 증폭된다. 바이오마커에 대한 어떠한 프라이머 서열도 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프라이머의 예는 하기 표 4에 나타낸다. 이후에, 적어도 하나의 돌연변이의 존재를 참조 증폭 표준물과 비교하여 측정한다.
[표 4]
Figure pct00022
마이크로어레이-계 카피 수 분석을 또한 사용할 수 있다. 당해 양태에서, 추출 후 염색체 DNA를 기질 표면의 평방 센티미터당 수백만개 프로브까지의 프로브 밀도에서 배열된 다수의 고정되고 표지되지 않은 핵산 프로브를 갖는 기질을 포함하는 마이크로어레이에 대해 하이브리드화를 위해 표지한다. 다수의 마이크로어레이 양식이 존재하여 이들 중 어느 것도 본원 명세서의 교시내용에서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 마이크로어레이의 예는 Affymetrix GeneChip® 맵핑 100K 세트 SNP 어레이[참조: Matsuzaki, H., et al., "Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays," Nat. Methods. 1:109-11 (2004)]; Affymetrix GeneChip® Mapping 250K 검사 키트(GeneChip® 사람 맵핑 250K Nsp 어레이 또는 GeneChip® Human Mapping 250K Sty 어레이와 같은) 또는 Affymetrix GeneChip® Mapping 500K 어레이 세트[이들 각각은 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아피매트릭스, 인코포레이션(Affymetrix, Inc.)에서 시판된다], 아질런트 사람 게놈 aCGH 마이크로어레이 44B(Agilent Human Genome aCGH Microarray 44B)[캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.)로부터 이용가능], 일루미나 마이크로어레이(Illumina microarrays)[캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나, 인코포레이티드(Illumina, Inc.)], 님블레겐 aCGH 마이크로어레이(Nimblegen aCGH microarrays)[위스콘신주 매디슨 소재의 님블레겐 인포포레이티드(Nimblegen, Inc.)] 등이다. 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이를 사용하여 증폭을 검출하는 경우, 표적화된 부위내에 3개 이상의 별개의 위치에 대해 프로브 서열을 갖는 마이크로어레이를 사용하는 것이 바람직하다. 마이크로어레이에서 사용될 수 있는 프로브의 예는 하기 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00023

E. 발현의 검출: mRNA
(i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자 유전자에 대한 유전자 발현의 정도는 시험 시료 속에서 하나 이상의 mRNA의 양을 평가함으로써 측정할 수 있다. 시료 속에서 mRNA를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. mRNA 농도를 측정하기 위해, 시험 시료 속의 세포를 용해시키고, 용해물 또는 용해물로부터 정제되거나 반-정제된 RNA내 mRNA의 농도를 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 어떠한 다양한 방법에 의해서도 측정할 수 있다. 이러한 방법은 검출가능하게 표지된 DNA 또는 RNA 프로브(즉, 노던 블롯팅)를 사용하는 하이브리드화 검사 또는 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 정량적 또는 반-적량적 RT-PCR 방법론을 포함한다. 또는, 정량적 또는 반-적량적인 동소 하이브리드화 검사를 예를 들면, 조직 단면, 또는 용해되지 않은 세포 현탁액, 및 검출가능하게 표지된(예를 들면, 형광성 또는 효소-표지된) DNA 또는 RNA 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. mRNA를 정량화하는 추가의 방법은 RNA 보호 검사(RPA), cDNA 및 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이, 대표적인 차등 분석(RDA), 차등적인 디스플레이, EST 서열 분석, 및 유전자 발현의 일련 분석(SAGE)을 포함한다.
적합한 양태에서, PCR 증폭을 사용하여 시험 시료내 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은)내 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이를 검출한다. 요약하면, PCR에서, 예를 들면, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자에 대한 서열을 함유하는 마커 서열의 반대되는 상보성 쇄 상의 부위에 대해 상보성인 2개의 프라이머 서열을 제조한다. 과량의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 반응 혼합물에 DNA 폴리머라제, 예를 들면, Taq 폴리머라제와 함께 가한다. 표적 서열이 시료 속에 존재하는 경우, 프라이머는 서열에 결합하고 폴리머라제는 뉴클레오타이드에 첨가함에 의해 마커 서열과 함께 프라이머가 연장될 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승시키고 저하시킴으로써, 연장된 프라이머를 마커로부터 분리하여 반응 생성물이 형성될 것이며, 과량의 프라이머는 마커 및 반응 생성물에 결합할 것이고, 당해 공정을 반복함으로써 증폭 생성물이 생성된다. 역전사효소 PCR 증폭 과정을 수행하여 증폭된 mRNA의 양을 정량화할 수 있다.
(i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자의 어떠한 적합한 단편도 증폭시키고 검출할 수 있다. PCR을 위한 효율적인 프라이머의 설계는 당해 분야의 통상의 기술내에 있다. 전형적으로, 검출용으로 증폭된 단편은, 길이가 대략 50 내지 300개 뉴클레오타이드이다.
증폭 생성물은 수개의 방식으로 검출할 수 있다. 증폭 생성물은 시료를 겔 속에서 전기영동 후 DNA 결합 염료, 예를 들면, 에티디움 브로마이드를 사용하여 염색함으로써 가시화할 수 있다. 또는, 증폭 생성물을 방사활성 또는 형광성 뉴클레오타이드로 통합적으로 표지한 후 x-선 필름을 사용하거나 적절한 자극 스펙트럼하에서 가시화할 수 있다.
증폭은 또한 "실시간" 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 실시간 PCR은 핵산 표적의 검출 및 정량화를 허용한다. 전형적으로, 정량적 PCR에 대한 당해 시도는 SYBR GREEN®과 같은, 이본쇄 특이적인 염료일 수 있는, 형광성 염료를 사용한다. 또는, 다른 형광성 염료(예를 들면, FAM 또는 HEX)를 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머에 접합시킬 수 있다. 실시간 PCR을 수행할 수 있는 각종 장치는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, ABI PRISM® 7900(제조원: 어플라이드 바이오시스템스) 및 LIGHTCYCLER® 시스템스[제조원: 로쉐(Roche)]를 포함한다. PCR의 각각의 주기에서 생성된 형광성 시그날은 PCR 생성물의 양에 비례한다. 형광성의 플롯 대 주기 수를 사용하여 증폭의 역학을 기술하고 형광성 한계 수준을 사용하여 초기 주형 농도와 관련된 단편 주기 수를 정의한다. 증폭을 수행하여 열 주기 동안 형광성을 판독할 수 있는 장치 상에서 검출한 경우, 비-특이적인 PCR 생성물로부터 의도된 PCR 생성물은 용융 분석을 사용하여 구별할 수 있다. 형광성에 있어서의 변화를 측정하는 한편 증폭 및 시그날 생성에 대해 후속적인 반응물의 온도를 서서히 증가시킴으로써, 의도된 생성물(들)의 Tm 및 비특이적인 생성물의 Tm을 측정하는 것이 가능할 수 있다.
당해 방법은 또한 "다중 검출" 또는 "다중화(multiplexing)"로 공지된, 시료에서 다수의 핵산을 증폭시킴을 포함한다. "다중 PCR"은 PCR 프라이머의 하나 이상의 세트를 반응물에 가하여 하나 이상의 표적 유전자 마커로부터 핵산을 포함하는 다중 핵산을 검출하고 정량화함을 포함하는 PCR을 말한다. 또한, 내부 대조군(예를 들면, 18S rRNA, GADPH, 또는 액틴)을 사용한 다중화는 반응없이 PCR용 대조군을 제공한다.
F. 시료 프로세싱 및 검사 수행
본원에서 앞서 논의한 바와 같이, 본원 명세서의 교시내용의 시험 시료는 조직 시료일 수 있다. 본원 명세서의 교시내용의 방법에 의해 검사될 조직 시료는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인물 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인물 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료; 또는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인물 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인물 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료 중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료를 포함하는 어떠한 유형도 포함할 수 있다. 예를 들면, 환자 말초 혈액 시료를 초기에 가공하여 내피 세포 집단을 추출한 후, 당해 추출물을 검사할 수 있다. 의심되는 종양 세포가 풍부한 세포 시료를 수득하기 위한 조직 시료의 미세해부를 또한 사용할 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 바람직한 조직 시료는 미세 침 흡인물, 새로이 동결된 조직 및 파라핀 봉매된 조직, 및 골수를 포함하는, 말초 혈액, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직이다.
조직 시료는 동소 하이브리드화 또는 다른 핵산 검사를 수행하기 위한 어떠한 바람직한 방법에 의해서도 가공할 수 있다. 바람직한 동소 하이브리드화 검사를 위해, 파라핀 봉매된 종양 조직 시료 또는 골수 시료를 유리 현미경 슬라이드에 고정시키고 용매, 통상적으로 크실렌을 사용하여 탈파라핀화한다. 조직 탈파라핀화 및 동소 하이브리드화를 위한 유용한 프로토콜은 애보트 몰레큘러 인코포레이티드(일리노이주 데스 플레인즈 소재)로부터 이용가능한다. 어떠한 적합한 장치 또는 자동화도 본 발명의 검사를 수행하는데 사용될 수 있다. PCR계 검사는 m2000 장치 시스템(제조원: 애보트 몰레큘러, 일리노이주 데스 플레인즈 소재) 상에서 수행할 수 있다. 자동화된 영상을 동소 하이브리드화 검사에서 바람직한 형광성을 위해 사용할 수 있다.
하나의 양태에서, 시료는 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자 (사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 대해 시험할 혈액순환하는 종양 또는 암 세포의 추출물을 생산하도록 가공된 환자로부터의 말초 혈액 시료를 포함한다. 혈액순환하는 종양 세포는 이뮤니콘(Immunicon)(펜실베이니아주 헌팅던 밸리 소재)으로부터 이용가능한 것과 같은 면역자기 분리 기술에 의해 분리할 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 혈액순환하는 종양 세포에 대해 측정된 후 치료요법의 개시와 같은 앞서의 시점에서 측정된 하나 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재로 이루어진 측정을 갖는 혈액순환하는 종양 세포의 예측된 수준 또는 기본선 수준과 비교한다. 기본선 수준 또는 예측된 수준과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이의 증가 또는 존재는 치료요법 실패를 나타낼 수 있다.
시험 시료는 임상 진단에 충분한 어떠한 수의 세포도 포함할 수 있으며, 전형적으로 적어도 약 100개의 세포를 함유한다. 대표적인 FISH 검사에서, 하이브리드화 패턴은 약 25 내지 1,000개 세포로 평가된다. 시험 시료는 시료의 충분한 비로 유전자 증폭을 함유하는 것으로 밝혀진 경우 통상적으로 "시험 양성"으로 고려된다. 적어도 하나의 돌연변이를 가진 다수의 세포가 확인되고 사용되어 특정 시료를 양성으로 분류되며, 일반적으로 시료내 세포의 수와 함께 변한다. 양성 분류에 사용된 세포의 수는 컷-오프 값(cut-off value)으로도 공지되어 있다. 측정에 사용될 수 있는 컷-오프 값의 예는 시료 집단에서 약 5, 25, 50, 100 및 250개 세포이거나, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% 및 60%의 세포를 포함한다. 최소 가능한 하나의 세포가 시료를 양성으로 분류하기에 충분할 수 있다. 대표적인 파라핀 봉매된 조직 시료에서, 적어도 30개 세포를 양성으로 확인하는 것이 바람직하며 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것에 대해 적어도 20개 세포를 양성으로 확인하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들면, 30개 세포의 대표적인 파라핀 봉매된 결장직장 암종에 있어서의 검출은 양성으로 조직을 분류하는데 충분할 수 있고 치료에 대해 적격일 수 있다.
G. 키트
본원 명세서의 교시내용은 또한 각종 키트를 고려한다. 하나의 국면에서, 키트는 적어도 다음 2개의 치료제를 함유한다: (1) 적어도 다배수 유도제; 및 (2) 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제. 또한, 키트는 임의로 사용 지침, 즉, 암으로 고생하고 이의 치료가 요구되는 환자에 대한 적어도 2개의 치료제의 투여를 포함할 수 있다. 이들 지침은 디스크, CD, DVD 등과 같은 컴퓨터-판독가능한 형태 또는 종이 형태로 제공될 수 있다.
다른 국면에서, 본원 명세서의 교시내용의 키트는 시험 시료 속에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 키트이다. 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 상기 키트를 사용하여 측정하기 위한 예시적인 유전자는 사람 BAX 유전자, 사람 BAK 유전자, 사람 NOXA 유전자 및 이들의 어떠한 조합이다. 이러한 키트는 상기 기술한 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 하나 이상의 핵산 프로브를 함유할 수 있다. 또는, 또한 상기 프로브들 외에, 키트는 하나 이상의 핵산 프라이머를 함유할 수 있다.
따라서, 본 기내내용은 또한 하나 이상의 핵산 프라이머, 핵산 프로브 또는 본원에 기재된 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 진단 및 품질 조절 키트를 제공한다. 임의로, 본원 명세서의 교시내용의 검사, 키트 및 키트 성분들은 시판되는 플랫폼(예를 들면, 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈의 PRISM®, AxSYM®, ARCHITECT® 및 EIA(비드) 플랫폼, 및 다른 시판되고/되거나 시험관내 진단 검사)에서 사용하기 위해 최적화될 수 있다. 또한, 검사, 키트 및 키트 성분들은 다른 플랫폼, 예를 들면, 전기화학적 또는 다른 소형(hand-held) 또는 현장현시(point-of-care) 검사 시스템 상에서 사용될 수 있다. 본원 명세서의 교시내용은 예를 들면, TnI, CKMB 및 BNP를 포함하는 몇가지 심장 마커에 대한 샌드위치 면역검사를 수행하는 시판되는 애보트 현장현시(Abbott Point of CARE)(i-STAT®, 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈) 전기화학적 면역검사 시스템에 적용가능하다. 단일-용도 시험 장치에서 이들을 작동시키는 방법 및 면역센서는 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 공보 제2003/0170881호, 제2004/0018577호, 제2005/0054078호 및 제2006/0160164호에 기술되어 있다. 전기화학적 및 다른 유형의 면역센서의 제조시 추가의 배경은 이들에 관한 이의 교시를 위해 참조로 또한 인용된 미국 특허 제5,063,081호에서 찾을 수 있다.
임의로, 당해 키트는 품질 조절 시약(예를 들면, 민감성 패널, 교정기(calibrator), 및 양성 대조군)을 포함한다. 품질 조절 시약의 제조는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 각종의 면역진단 제품 삽입 시트(sheet)에 대해 기술되어 있다.
상기 키트는 형광단, 방사활성 모이어티, 효소, 바이오틴/아비딘 표지, 화학단, 화학발광성 표지 등과 같은 검출가능한 표지를 포함할 수 있거나, 상기 키트는 핵산 프라이머, 핵산 프로브를 표지하기 위한 시약, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 핵산 프라이머 및 핵산 프로브를 포함할 수 있다. 프라이머 및/또는 프로브, 교정기 및/또는 대조군은 적절한 검사 양식, 예를 들면, 미세역가 플레이트내로 예비-제공되거나 별도의 용기 속에 제공될 수 있다.
키트는 임의로 완충제, 염, 효소, 효소 보조-인자, 기질, 검출 시약 등과 같은 품질 조절 평가를 촉진하거나 진단 검사를 수행하는데 요구되는 다른 시약을 포함할 수 있다. 완충제 및 시험 시료의 분리 및/또는 처리를 위한 용액(예를 들면, 예비처리 시약)과 같은 다른 성분들이 또한 상기 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 또한 하나 이상의 다른 대조군을 포함할 수 있다. 상기 키트의 하나 이상의 성분들은 동결건조될 수 있으며 상기 키트는 동결건조된 성분들의 재구성에 적합한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트의 각종 성분들이 적합한 용기 속에 임의로 제공된다. 상기 나타낸 바와 같이, 용기 중 하나 이상은 미세역가 플레이트일 수 있다. 상기 키트는 또한 시료를 보유하거나 저장하기 위한 용기(예를 들면, 혈액 또는 뇨 시료를 위한 용기 또는 카트릿지)를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 상기 키트는 또한 반응 용기, 혼합 용기 및 시험 시료 또는 시약의 제조를 용이하게 하는 다른 성분들을 임의로 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 주사기, 피펫, 집게, 계량 스푼 등과 같은 시험 시료를 수득하는 것을 보조하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다.
상기 키트는 또한 임의로 디스크, CD, DVD 등과 같은 컴퓨터-판독가능한 형태 또는 종이 형태로 제공될 수 있는 사용 지침서를 포함할 수 있다.
H. 키트의 조정
상기 키트(또는 이의 성분들), 및 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자 (사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사 암호화 유전자(사람 BAX 유전자 및 사람 BAK 유전자와 같은) 및 사람 NOXA 유전자내 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 본원에 기술된 성분들 및 방법을 사용하여 측정하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,089,424호 및 제5,006,309호에 기술되고, 예를 들면, 애보트 래보러토리즈(일리노이주 애보트 파크 소재)에 의해 ARCHITECT®로서 상업적으로 시판되는 각종 자동화된 및 반-자동화된 시스템(고체상이 미세입자를 포함하는 것들 포함)에서 사용하기 위해 조정될 수 있다.
비-자동화 시스템(예를 들면, ELISA)과 비교하여 자동화되거나 반-자동화된 시스템 사이의 차이점들 중 일부는, 제1의 특이적인 결합 파트너(예를 들면, 포획 항체)가 부착된(이는 샌드위치 형성 및 분석물 반응성에 영향을 미칠 수 있다) 기질, 및 포획, 검출 및/또는 어떠한 임의의 세척 단계의 길이 및 시기선택을 포함한다. ELISA와 같은 비-자동화된 양식은 시료 및 포획 시약을 사용하여 비교적 더 긴 항온처리 시간(예를 들면, 약 2시간)을 필요로 할 수 있지만, 자동화되거나 반-자동화된 양식(예를 들면, ARCHITECT®, 제조원: 애보트 래보러토리즈)은 비교적 보다 짧은 항온처리 시간(예를 들면, ARCHITECT®의 경우 대략 18분)을 가질 수 있다. 유사하게, ELISA와 같은 비-자동화된 양식은 비교적 보다 긴 항온처리 시간(예를 들면, 약 2시간) 동안 접합체 시약과 같은 검출 항체를 항온처리할 수 있지만, 자동화되거나 반-자동화된 양식(예를 들면, ARCHITECT®)은 비교적 보다 짧은 항온처리 시간(예를 들면, ARCHITECT®의 경우 대략 4분)을 가질 수 있다.
애보트 래보러토리즈로부터 이용가능한 다른 플랫폼은 AxSYM®, IMx®(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,294,404호), PRISM®, EIA(비드), 및 QuantumTM II, 및 다른 플랫폼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 검사, 키트 및 키트 성분들은 다른 양식, 예를 들면, 전기화학적 또는 다른 소형 또는 현장현시 검사 시스템 상에서 사용될 수 있다. 본원 명세서의 교시내용은 예를 들면, 샌드위치 면역검사를 수행하는 시판되는 애보트 포인트 오브 케어(Abbott Point of Care)(i-STAT®, 제조원: 애보트 래보러토리즈) 전기화학적 면역검사 시스템에 적용가능하다. 면역센서 및 이들의 제조 방법 및 단일-용도 시험 장치에서 작동은, 이와 관련한 이들의 교시내용에 대한 참조에 의해 이들의 전문이 인용된 미국 특허 제5,063,081호, 미국 특허원 공보 제2003/0170881호, 제2004/0018577호, 제2005/0054078호, 및 제2006/0160164호에 기술되어 있다.
본원에 기술된 방법 및 키트가 검사를 수행하기 위한 다른 시약 및 방법을 필수적으로 포함하는 것은 또한 당연하다. 예를 들면, 당해 분야에 공지되고/되거나 용이하게 제조되거나 사용되도록 최적화된 각종 완충액이 포함된다.
다음 실시예는 본원 명세서의 교시내용의 과정들 및 개념적 국면의 기술을 가장 유용하고 용이하게 이해할 것으로 여겨지는 것들을 제공하기 위해 나타낸다.
실시예 1A
65℃에서 디옥산(700mL) 중 문헌(참조: J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 4943-4952)에 기술된 바와 같이 제조된 3-(R)-((카보벤질옥시)아미노)-γ-부티로락톤(62 g) 및 모르폴린(46 mL)을 24시간 동안 교반하고, 냉각시키고 농축시켰다. 농축액을 10% 메탄올/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1B
80℃에서 톨루엔 (250 mL) 중 실시예 1A의 화합물(16.5 g), 디페닐 디설파이드(14.5 g) 및 트리부틸포스핀(16.6 mL)을 24시간 동안 교반하고, 냉각시키며 농축시켰다. 농축액을 1:1 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1C
25℃에서 아세트산(250 mL) 중 30% HBr 중 실시예 1B의 화합물(18 g)을 24시간 동안 교반하고, 농축시키고, 1M HCl에 붓고 디에틸 에테르로 추출하였다. 추출물을 1M HCl로 추출하고, 당해 추출물을 0℃로 냉각시키고, KOH로 pH 12로 조절하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 염수로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 1D
55℃에서 THF (500 mL) 중 실시예 1C의 화합물(45.4 g)을 1M BH3·THF(650 mL)로 2시간 동안 처리하고, 24시간 동안 교반하고, 0℃로 냉각시키고, 메탄올(80 mL)로 처리하고, 메탄올(500 mL)에 붓고 농축시켰다. 메탄올(400 mL) 중 농축물의 혼합물을 HCl-포화된 메탄올(800 mL)로 처리하고, 24시간 동안 환류시키고, 냉각시키고, 농축시키며, 2M NaOH에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 1M NaOH 및 염수로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 에틸 아세테이트 10% 메탄올/에틸 아세테이트 및 10% 메탄올/10% 아세토니트릴/5% TEA/75% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1E
25℃에서 DMF (80 mL) 중 메틸 바이올로겐 하이드로클로라이드(1.17 g)를 트리플루오로메틸 요오다이드로 포화시키고, 2-플루오로벤젠티올(9.7 mL) 및 TEA(20 mL)로 처리하고, 24시간 동안 교반하고, 물(240 mL)로 희석시키고 디에틸 에테르로 추출하였다. 추출물을 1M NaOH, 포화된 염화암모늄 및 염수로 세척하고 농축시켰다.
실시예 1F
25℃에서 1:1:2 사염화탄소/아세토니트릴/물(800 mL) 중 실시예 1E의 화합물(17.346 g)을 나트륨 퍼요오데이트(56.8 g) 및 염화루테늄(III) 수화물(183 mg)로 처리하고, 18시간 동안 교반하고, 디클로로메탄(100 mL)으로 희석시키고 규조토(Celite®)를 통해 여과하였다. 여액을 포화된 중탄산나트륨으로 세척하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시킨다. 농축물을 실리카 겔을 통해 여과하였다.
실시예 1G
120℃에서 클로로설폰산(32.8 mL) 중 실시예 1F의 화합물(37.3 g)을 18시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각시키고 파쇄된 얼음위에 피펫팅하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 물 및 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 1H
-78℃에서 이소프로판올(706 mL) 중 실시예 1G의 화합물(23 g)을 1시간에 걸쳐 수산화암모늄(98 mL)으로 처리하고, 1시간 동안 교반하고, 6M HCl (353 mL)로 퀀칭시키고, 25℃로 가온시키고 농축시켰다. 농축물을 물과 혼합하고 에틸 아세테이트로 추출하고. 추출물을 건조(MgSO4)시키며, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화하였다.
실시예 1I
THF (218 mL) 중 실시예 1H의 화합물(13.48 g) 및 실시예 1D의 화합물(11.56 g)을 DIEA (15.1 mL)로 처리하고, 50℃에서 4시간 동안 교반하고, 냉각시키고, 포화된 중탄산나트륨으로 처리하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 헥산/에틸 아세테이트로부터 재결정화하였다.
실시예 1J
3℃에서 DMF (10 mL) 및 클로로포름(80 mL)을 PBr3 (12 mL)로 처리하고, 25℃에서 20분 동안 교반하고, 클로로포름(50 mL) 중 4,4-디메틸사이클로헥사논(7.15 g)으로 처리하고, 18시간 동안 교반하고, 얼음위에 붓고, 고체 중탄산나트륨으로 중화시키고 디에틸 에테르로 추출하였다. 추출물을 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1K
메탄올(30 mL) 중 실시예 1J의 화합물(1.7 g) 및 4-피페라진-1-일벤조산 에틸 에스테르(1.9 g)를 나트륨 시아노보로하이드라이드(0.6 g)로 처리하고, 아세트산을 사용하여 pH 5로 조절하고, 18시간 동안 교반하고 규조토(Celite®)를 통해 여과하였다. 여액을 농축시키고, 농축물을 10 내지 30% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1L
7:3:2 DME/물/에탄올(20 mL) 중 실시예 1K의 화합물(1.1 g), 4-클로로페닐보론산(0.6 g), 2M Na2CO3(2 mL) 및 PdCl2(PPh3)2 (0.1 g)을 85℃에서 18시간 동안 교반하고, 규조토(Celite®)를 통해 여과하고 농축시켰다. 농축물을 10 내지 30% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 1M
디옥산(75 mL) 및 물(10 mL) 중 실시예 1L의 화합물(4.59 g) 및 LiOH (1.25 g)를 100℃에서 18시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각시키고 농축시켰다. 농축물을 물 속에 용해하고, 가열하여 환류시키고, 1M HCl(28.5 mL)로 중화시키고, 25℃로 냉각시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 1N
25℃에서 디클로로메탄 (500 mL) 중 실시예 1M의 화합물(31.5 g), 실시예 1I의 화합물(39.93 g), EDAC HCl (20.60 g) 및 DMAP(13.15 g)를 18시간 동안 교반하고, 디클로로메탄으로 희석시키고, 포화된 염화암모늄 및 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 메탄올/암모니아-포화된 디클로로메탄을 사용한 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.38 (d, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.98 (d, 1H), 6.85 (d, 3H), 4.07 (m, 1H), 3.53 (br, 4H), 3.28 (m, 12H), 2.44 (m, 8H), 1.99 (m, 3H), 1.80 (m, 1H), 1.44 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 2A
벤젠(400 mL) 중 분말화된 NaOH(31.2 g), TDA-1(5 mL) 및 2-플루오로벤젠 티올(33.6 mL)을 클로로디플루오로메탄으로 포화시키고, 80℃에서 30분 동안 교반하고 규조토(Celite®)를 통해 여과하였다. 여액을 포화된 NaHCO3로 세척하고 물 층을 디에틸 에테르로 추출하였다. 추출물을 합하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 2B
25℃에서 1:1:2 CCl4/CH3CN/물(1.2 L) 중 실시예 2A의 화합물(46 g)을 NaIO4 (165.6 g) 및 RuCl3·xH2O(534 mg)로 처리하고, 18시간 동안 교반하고, 디클로로메탄으로 희석시키고, 규조토(Celite®)를 통해 여과하였다. 여액을 포화된 NaHCO3로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 실리카 겔을 통해 여과하였다.
실시예 2C
-78℃에서 THF (700 mL) 중 실시예 2B의 화합물(25 g) 및 NCS(17.55 g)를 LHMDS(178.5 mL)로 1시간에 걸쳐 처리하고 1시간 동안 교반하고 염화암모늄으로 퀀칭시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 0 내지 5% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 2D
120℃에서 클로로설폰산(36.7 mL) 중 실시예 2C의 화합물(44 g)을 18시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각시키고, 파쇄된 얼음에 피펫팅하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 물 및 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 2E
-78℃에서 이소프로판올(700 mL) 중 실시예 2D의 화합물(22 g)을 수성 암모니아(90 mL)로 1시간에 걸쳐 처리하고, 추가로 1 시간 동안 교반하고, 6M HCl(300 mL)로 퀀칭시키고, 25℃로 가온시키고 농축시켰다. 농축물을 물과 혼합하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 헥산/에틸 아세테이트로부터 재결정화하였다.
실시예 2F
THF (20 mL) 중 실시예 2E의 화합물(2.89 g) 및 실시예 1D의 화합물(2.39 g)을 디이소프로필에틸아민(3.2 mL)으로 처리하고, 60℃에서 18시간 동안 교반하고, 냉각시키고, 포화된 중탄산나트륨으로 처리하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 메탄올/디클로로메탄 중 1.5 내지 5% 7M 암모니아를 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 2G
-5℃에서 디클로로메탄 (300 mL) 중 헥산-세척된 60% 오일성 NaH (17 g)을 문헌[참조: Tetrahedron (1992), 48 (21), 4459-64, (53.89 g)]에 기술된 바와 같이 제조한 4,4-디메틸-2-옥소-사이클로헥산카복실산 메틸 에스테르로 처리하고, 30분 동안 교반하고, -78℃로 냉각시키며, 트리플루오로메탄설폰산 무수물로 처리하고, 25℃로 가온시키고, 18시간 동안 교반하고, 염수로 세척하고 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 2H
70℃에서 2:1 DME/메탄올(600 mL) 중 실시예 2G의 화합물(86 g), 4-클로로페닐보론산(50 g), CsF(104 g) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (2.5 g)을 18시간 동안 교반하고 농축시켰다. 농축물을 디에틸 에테르 중에 용해시키고, 용액을 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 20% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하는 실리카 겔을 통해 여과하였다.
실시예 2I
붕수소화리튬(18 g)을 디에틸 에테르 (400 mL) 및 메탄올(23 mL) 중 실시예 2H 화합물(76 g)로 처리하고, 4시간 동안 환류하에 교반하고, 냉각시키고 1M HCl로 퀀칭시키고, 물로 희석시키고 디에틸 에테르로 추출하였다. 추출물을 건조(MgSO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 0 내지 30% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 2J
0℃에서 디클로로메탄 (100 mL) 중 실시예 2I의 화합물(17.5 g)을 메탄설포닐 클로라이드(5.6 mL) 및 TEA (21 mL)로 동시 처리하고, 5분 동안 교반하고, 4-피페라진-1-일벤조산 에틸 에스테르(17 g)로 처리하고, 25℃에서 18시간 동안 교반하고, 염화암모늄으로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 10% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 2K
당해 실시예는, 실시예 1M에서, 실시예 1L을 실시예 2J로 대체하여 제조하였다.
실시예 2L
25℃에서 디클로로메탄 (200 mL) 중 실시예 2K의 화합물(16.9 g) 및 실시예 2F의 화합물(22 g)을 EDAC·HCl(11.06 g) 및 DMAP (7.06 g)로 처리하고, 18시간 동안 교반하고, 디클로로메탄 (400 mL)으로 희석시키고, 포화된 염화암모늄 및 염수로 세척하고, 건조(MgSO4)시키며, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 메탄올/암모니아-포화된 디클로로메탄을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (d, 1H), 7.90 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.29 (m, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.86 (d, 1H), 6.80 (d, 2H), 6.76 (d, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.50 (m, 4H), 3.33 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.81 (s, 2H), 2.29 (m, 12H), 1.99 (s, 2H), 1.94 (m, 1H), 1.71 (m, 1H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 3A
당해 실시예는, 실시예 1K에서, 실시예 1J의 화합물을 문헌(참조: Collect. Czech. Chem. Commun., 1961, 26, 3059.)에 기술된 바와 같이 제조된 2-브로모-사이클로헥실렌카르브알데하이드로 대체하여 제조하였다.
실시예 3B
당해 실시예는, 실시예 1L에서, 실시예 1K의 화합물을 실시예 3A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 3C
당해 실시예는, 실시예 1M에서, 실시예 1L의 화합물을 실시예 3B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 3D
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 3C의 화합물 및 실시예 2F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (d, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.27 (t, 2H), 7.18 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.94 (d, 1H), 6.84 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (br, 4H), 3.27 (br, 10H), 2.84 (br, 2H), 2.33 (br, 6H), 2.18 (br, 4H), 1.97 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.66 (s, 4H).
실시예 4A
THF (100 mL) 중의 3-(R)-((카보벤질옥시)아미노)-γ-부티롤락톤(문헌: J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 4943-4952에 기술된 과정에 따라 제조함, 7.72 g, 32.8 mmol)의 용액을 가스성 디메틸아민으로 포화시키고, 실온에서 16시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 잔사를 헥산 중 50% 아세톤으로 용출시키는 실리카 겔의 플러그를 통해 여과하여 목적한 생성물을 수득하였다.
실시예 4B
톨루엔 (15 mL) 중의 실시예 4A의 화합물(8.45 g, 30.14 mmol)의 용액을 트리부틸포스핀(9.76 mL, 39.20 mmol) 및 디페닐디설파이드(7.30 g, 39.20 mmol)로 처리하고 80℃까지 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 헥산 중 0 내지 50% 에틸 아세테이트의 구배로 용출시키는 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물을 수득하였다.
실시예 4C
25℃에서 THF (100 mL) 중의 실시예 4B의 화합물(7.5 g) 및 비스(사이클로펜타디에닐)지르코늄(IV) 클로라이드 수화물(10.31 g)을 20분 동안 교반하고 농축시켰다. 농축물을 헥산 중 50% 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 4D
25℃에서 1,2-디클로로에탄 (50 mL) 중의 실시예 4C의 화합물(2.87 g) 및 N-이소프로필메틸아민(1.92 g)을 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(3 g)로 처리하고, 2시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 2M NaOH, 물 및 염수로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 농축물을 1% 메탄올/디클로로메탄을 사용하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다.
실시예 4E
당해 실시예는, 실시예 1C에서, 실시예 1B의 화합물을 실시예 4D의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 4F
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 4E의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 4G
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 4F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.28 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.75 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 2.04 (m, 4H), 1.99 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.12 (m, 10H), 0.97 (s, 6H).
실시예 5
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조한 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산, 및 실시예 4F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.00 (m, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.13 (m, 4H), 2.78 (m, 2H), 2.55 (m, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (m, 4H), 2.00 (m, 3H), 1.79 (m, 4H), 1.58 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.12 (m, 6H).
실시예 6A
당해 실시예는, 실시예 1C에서, 실시예 1B의 화합물을 실시예 4B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 6B
25℃에서 THF (200 mL) 중의 실시예 6A의 화합물(6.13 g)을 디-3급-부틸디카보네이트(7 g)로 처리하고, 4시간 동안 교반하고 농축시켰다. 농축물을 에틸 아세테이트 (500 mL)내로 용해하고, 1M NaOH, 물 및 염수로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다. 25℃에서 THF (200 mL) 중의 농축물을 1M NaOH(200 mL)로 처리하고, 5시간 동안 교반하고 분리하였다. 물 층을 에틸 아세테이트로 추출하고, THF 및 에틸 아세테이트 추출물을 합하고, 물 및 염수로 세척하고 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켰다.
실시예 6C
당해 실시예는, 실시예 4C에서, 실시예 5B의 화합물을 실시예 6B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 6D
당해 실시예는, 실시예 4D에서, 실시예 4C의 화합물 및 N-이소프로필메틸아민을, 실시예 6C의 화합물 및 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된 2-옥사-5-아자-비사이클로[2.2.1]헵탄으로 대체하여 제조하였다.
실시예 6E
25℃에서 디클로로메탄 (200 mL) 중의 실시예 6D의 화합물(7.86 g)을 디에틸 에테르 (200 mL) 중의 2M HCl로 처리하고, 18시간 동안 교반하고 농축시켰다.
실시예 6F
당해 실시예는, 실시예 2F에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 6E의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 6G
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 실시예 6F의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (s, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (d, 1H), 6.79 (d, 2H), 4.21 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.01 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.46 (m, 1H), 3.18 (m, 6H), 2.86 (m, 4H), 2.75 (m, 4H), 2.28 (m, 2H), 2.18 (m, 4H), 1.88 (m, 4H), 1.66 (m, 4H).
실시예 7
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물을 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 7H), 7.18 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.92 (d, 1H), 6.82 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (m, 4H), 3.26 (m, 10H), 2.82 (m, 2H), 2.30 (m, 10H), 1.94 (m, 1H), 1.72 (m, 5H).
실시예 8A
DMF 중의 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조한 3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-4-페닐설파닐부티르산 및 HATU의 용액을 7-아자-비사이클로[2.2.1]헵탄(문헌: Org. Lett., 2001, 3, 1371-1374에 기술된 바와 같이 제조함); 및 N-메틸모르폴린으로 처리하고, 주위 온도에서 30분 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 1.5% HCl, NaHCO3(aq), H2O 및 염수로 세척하고, 건조(Na2SO4)시키고, 여과하고 농축시켜 목적 생성물을 수득하였다.
실시예 8B
THF 중의 실시예 8A의 화합물의 용액을 디에틸 아민으로 처리하고, 주위 온도에서 2시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2(NH3로 포화시킴)에 이어 에틸 아세테이트로 용출시키는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물을 수득하였다.
실시예 8C
당해 실시예는, 실시예 1D에서, 실시예 1C의 화합물을 실시예 8B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 8D
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 8C의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 8E
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 8D의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.19 (m, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 6H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.76 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.31 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.90 (br, 2H), 2.76 (m 2H), 1.96 (m, 21H).
실시예 9A
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 6E의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 9B
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 실시예 9A의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (d, 1H), 7.94 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 4.40 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.83 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.26 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.80 (br, 2H), 2.78 (m, 4H), 1.97 (m, 14H).
실시예 10
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 9A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.44 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 11
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 6F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.81 (m, 4H), 4.41 (m, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 12
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된, 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산, 및 실시예 9A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.19 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.04 (m, 8H), 2.34 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H).
실시예 13
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된, 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산, 및 실시예 6F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.07 (m, 8H), 2.33 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H).
실시예 14
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 4F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.28 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.79 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.23 (m, 8H), 2.02 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 1.08 (m, 6H), 0.96 (s, 6H).
실시예 15A
당해 실시예는, 실시예 4D에서, 실시예 4C의 화합물 및 N-이소프로필-N-메틸아민을 실시예 6C의 화합물 및 1,4-옥사제판으로 대체하여 제조하였다.
실시예 15B
당해 실시예는, 실시예 6E에서, 실시예 6D의 화합물을 실시예 15A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 15C
당해 실시예는 실시예 1I에서 실시예 1D의 화합물을 실시예 15B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 15D
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 15C의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.32 (s, 1H), 8.01 (br, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.24 (m, 3H), 6.99 (m, 3H), 6.67 (br, 3H), 3.97 (br, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 3.73-3.23 (br m, 12H), 3.14 (m, 6H), 2.29 (s, 6H), 2.08 (m, 2H), 1.74 (s, 4H).
실시예 16A
당해 실시예는, 실시예 4D에서, N-이소프로필-N-메틸아민을 아제판으로 대체하여 제조하였다.
실시예 16B
당해 실시예는, 실시예 4E에서, 실시예 4D의 화합물을 실시예 16A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 16C
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 16A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 16D
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 16C의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 (s, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.23 (m, 3H), 6.98 (m, 3H), 6.67 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.82-3.19 (br m, 10H), 3.12 (s, 4H), 2.86 (m, 2H), 2.55 (br, 2H), 2.29 (s, 4H), 2.06 (m, 1H), 1.93 (m, 3H), 1.74 (s, 8H), 1.60 (m, 2H).
실시예 17A
당해 실시예는, 실시예 1D에서, 실시예 1C의 화합물을 실시예 6A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 17B
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 17C
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산, 및 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (brs, 1H), 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.13 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.38 (m, 4H), 3.15 (m, 4H), 3.02 (m, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.46 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.57 (m, 4H).
실시예 18A
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1H의 화합물 및 실시예 1D의 화합물을 실시예 2E의 화합물 및 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 18B
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 18A의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.60 (brs, 1H), 9.47 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 3H), 7.12 (d, 1H), 6.96 (m, 3H), 6.92 (d, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 3.37 (m, 4H), 3.15 (m, 2H), 3.02 (m, 1H), 2.74 (s, 6H), 2.25 (d, 4H), 2.08 (m, 2H), 1.71 (m, 4H).
실시예 19
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 2F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.27 (m, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.97 (d, 1H), 6.85 (m, 3H), 4.05 (m, 1H), 3.53 (m, 4H), 3.23 (m, 1H), 2.83 (m, 1H), 2.34 (m, 8H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.96 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.44 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 20
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.23 (t, 2H), 7.14 (s, 4H), 6.95 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.58 (m, 4H), 3.08 (m, 4H), 2.73 (s, 6H), 2.27 (m, 2H), 2.08 (m, 2H), 2.02 (s, 2H), 1.47 (t, 2H), 1.00 (s, 6H).
실시예 21
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물을 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된 4-(4-(4-(4-클로로페닐)-5,6-디하이드로-2H-피란-3-일메틸)피페라진-1-일)벤조산으로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 7.89 (d, 2H), 7.59 (d, 2H), 7.48 (m, 4H), 7.37 (m, 3H), 7.13 (m, 1H), 7.01 (m, 3H), 4.35 (s, 2H), 4.24 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.36 (m, 6H), 3.07 (m, 3H), 2.68 (s, 2H), 2.59 (m, 4H), 2.14 (m, 2H), 1.93 (m, 2H).
실시예 22A
당해 실시예는, 실시예 2F에서, 실시예 2E의 화합물을 실시예 4E의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 22
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 실시예 2K의 화합물 및 실시예 22A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.21 (brs, 1H), 8.17 (m, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.31 (m, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.12 (m, 6H), 2.84 (m, 3H), 2.63 (m, 3H), 2.25 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.49 (t, 2H), 1.16 (m, 6H), 0.97 (s, 6H).
실시예 23
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물을 실시예 22A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.21 (brs, 1H), 8.18 (m, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.78 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.84 (m, 2H), 2.63 (m, 3H), 2.28 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 1.17 (m, 6H), 1.00 (s, 6H).
실시예 24
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물을 실시예 2K의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.14 (brs, 1H), 9.89 (brs, 1H), 9.52 (s, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.93 (m, 3H), 3.63 (m, 4H), 2.93 (m, 10H), 2.24 (m, 2H), 2.09 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 25
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 6F의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (brs, 1H), 9.39 (brs, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.63 (d, 1H), 4.43 (d, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.92 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.01 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.04 (m, 6H), 1.49 (m, 2H), 0.98 (s, 6H).
실시예 26
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 17B의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.49 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (m, 2H), 6.78 (d, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.81 (brs, 1H), 2.77 (s, 1H), 2.46 (s, 6H), 2.28 (s, 4H), 2.19 (m, 4H), 2.00 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.65 (m, 4H).
실시예 27A
당해 실시예는, 실시예 4D에서, N-이소프로필에틸아민을 피롤리딘으로 대체하여 제조하였다.
실시예 27B
당해 실시예는, 실시예 4E에서, 실시예 4D의 화합물을 실시예 27A의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 27C
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1D의 화합물을 실시예 27B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 27D
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 27C의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.97 (m, 6H), 2.76 (s, 1H), 2.28 (brs, 4H), 2.19, (m, 4H), 2.05 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.82 (brs, 4H), 1.65 (m, 4H).
실시예 28
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.59 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.13 (brs, 4H), 2.90 (brs, 2H), 2.79 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.28 (brs, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (s, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 29
당해 실시예는 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산, 및 실시예 27C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.60 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.77 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H).
실시예 30A
당해 실시예는, 실시예 1I에서, 실시예 1H의 화합물 및 실시예 1D의 화합물을 실시예 2E의 화합물 및 실시예 27B의 화합물로 대체하여 제조하였다.
실시예 30B
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1D의 화합물을 실시예 30A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.57 (brs, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.27 (m, 4H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 3H), 1.88 (m, 1H), 1.77 (brs, 4H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
실시예 31
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 30A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (brs, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.76 (s, 2H), 2.75 (m, 5H), 2.26 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 3H), 1.86 (m, 1H), 1.76 (brs, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 32
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조된, 4-(4-(2-(4-클로로페닐)사이클로헵트-1-에닐메틸)피페라진-1-일)벤조산 및 실시예 30A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.50 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.98 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H).
실시예 33
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1I의 화합물 및 실시예 1M의 화합물을 각각 실시예 4F의 화합물 및 실시예 3C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.03 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.39-7.34 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.13 (dt, 2H), 6.88 (m, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (m, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.37-3.26 (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.76 (s, 2H), 2.68-2.53 (m, 2H), 2.34-2.13 (m, 10H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.13 (m, 6H).
실시예 34
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 27C의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.53 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.40-7.34 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.71 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.38-3.27 (m, 4H), 3.20-2.84 (m, 10H), 2.79 (s, 2H), 2.27 (s, 4H), 2.20 (t, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 35
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 3C의 화합물 및 실시예 30A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.06 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (m, 2H), 7.21 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.26 (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.78 (m, 6H), 2.27 (s, 4H), 2.18 (m, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (s, 4H), 1.66 (s, 4H).
실시예 36
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 9A의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 37
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물 및 실시예 1I의 화합물을 각각 실시예 2K의 화합물 및 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
실시예 38
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 각각 실시예 1M의 화합물을 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조한, 4-(4-(1,1'-비페닐-2-일메틸)-1-피페라지닐)벤조산으로 대체하고, 실시예 1I의 화합물을 실시예 17B의 화합물로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 3H), 7.52 (d, 4H), 7.40 (d, 2H), 7.35 (m, 1H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.16 (t, 2H), 6.96 (m, 3H), 4.25 (br, 2H), 4.12 (m, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.14 (m, 1H), 3.10 (br, 8H), 2.74 (s, 6H), 2.10 (m, 2H).
실시예 39
당해 실시예는, 실시예 1N에서, 실시예 1M의 화합물을 공동 소유의 미국 특허원 제10/988,338호에 기술된 바와 같이 제조한, 4-(4-(1,1'-bi페닐-2-일메틸)-1-피페라지닐)벤조산으로 대체하여 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.76 (d, 2H), 7.52 (m, 5H), 7.14 (m, 8H), 6.96 (m, 3H), 4.29 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 3.10 (m, 8H), 2.13 (m, 2H).
실시예 40
항체
모든 항체는 다음과 같이 시판되는 공급원으로부터 입수하였다: INCENP, 히스톤 H3, 히스톤 H3-(pSer10), BIK, PUMA, 및 BAK에 대한 항체는 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 입수하고; 아우로라 B, Bad, 및 Ral-A에 대한 항체는 에피토믹스(Epitomics)로부터 입수하며; 아우로라 A, p53, 시토크롬 C, Bid, 및 Bim에 대한 항체는 비디 바이오사이언스(BD Biosciences)로부터 입수하고; Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, 및 S6K1에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터 입수하며; BAX에 대한 항체는 아브캠(Abcam)으로부터 입수하고; NOXA에 대한 항체는 임게넥스(Imgenex)로부터 입수하며; 활성 BAX 이형태체(conformer)(6A7)에 대한 항체는 시그마(Sigma)로부터 입수하며; 활성 BAK 이형태체(Ab2)에 대한 항체는 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 입수하고; 베타-액틴에 대한 항체는 알앤디 시스템스(R&D systems)로부터 입수하였다.
소-분자 및 siRNA
임상 약물 BCNU, 독소루비신, 겜시타빈, 에토포시드, 5-FU, ALIMTA, 라파마이신, 및 앞서 기술된 애보트 화합물, ABT-751(β-튜불린 억제제), ABT-888(PARP 억제제)[참조: Donawho, C. K. et al., "ABT-888, an orally active poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor that potentiates DNA-damaging agents in preclinical tumor models," Clin Cancer Res 13, 2728-37 (2007)], ABT-263 (Bcl-2 단백질 계열 억제제)[참조: Tse, C. et al., "ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor," Cancer Res 68, 3421-8 (2008)], 리토나비르[참조: Kempf, D. J. et al., "Discovery of ritonavir, a potent inhibitor of HIV protease with high oral bioavailability and clinical efficacy," J Med Chem 41, 602-17 (1998)], A-443654(AKT 억제제)[참조: Luo, Y. et al., "Potent and selective inhibitors of Akt kinases slow the progress of tumors in vivo," Mol Cancer Ther 4, 977-86 (2005)], 및 A-407846(히스톤 데아세틸라제)[참조: Vasudevan, A. et al., "Heterocyclic ketones as inhibitors of histone deacetylase," Bioorg Med Chem Lett 13, 3909-13 (2003)]을 본 출원의 양수인인, 애보트 래보러토리즈의 화합물 기탁기관으로부터 입수하였다. 17-AAG는 에이지 사이언티픽(AG Scientific)(캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 시판되었다. MLN8054의 화학 구조[참조: Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007)], AZD1152[참조: Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, 2213-24 (2007)], 및 VX-680/MK-0457[참조: Harrington, E. A. et al., "VX-680, a potent and selective small-molecule inhibitor of the Aurora Kinases, suppresses tumor growth in vivo," Nat Med 10, 262-7 (2004)] 및 BI 2536은 기재되어 있다. 이들 화합물은 비교 목적을 위해 애보트 래보러토리즈에서 합성되었다. AZD1152-하이드록시퀴나졸린 피라졸 아닐리드(HQPA)는 혈장의 존재하에서 인산이수소 프로드럭, AZD1152로부터 신속하게 전환된다[참조: Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, 2213-24 (2007)]. 모든 연구에 대해, AZD1152-HQPA를 사용하였고 AZD1152로 언급하였다.
Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, 아우로라 A, 아우로라 B, INCENP, BIK, NOXA, BAX, BAK, PUMA, BAD, 및 BIM에 대한 siRNA는 다르마콘(Dharmacon)(콜로라도주 라파예트 소재)로부터 시판되었다. 각각의 표적의 경우, 4 ON-TARGET Plus siRNA의 세트를 표적 녹다운(knowdown) 및 오프-표적 세포독성에 대해 예비스크리닝시켰다. 72-시간 증식 검사에서 10% 이상의 오프-표적 성장 억제를 유발하지 않는 표적 단백질의 70% 이상의 감소를 개시한 siRNA를 모든 siRNA-관련 연구에 대해 선택하였다. 각각의 표적에 대해 대부분의 강력한 siRNA가, 단지 하나의 siRNA/표적이 사용된 실험에서 사용되었다. 대조군, 비표적화 siRNA 및 앞서 기술된 루시퍼라제 siRNA[참조: Lin, X. et al., "Seed' analysis of off-target siRNAs reveals an essential role of Mcl-1 in resistance to the small-molecule Bcl-2/Bcl-XL inhibitor ABT-737," Oncogene 26, 3972-9 (2007)]는 또한 다르마콘으로부터 시판되었다.
세포 배양 및 동물 연구
사람 암 세포주 SW620, D54MG, A549, PC3, EJ1, DLD1, HCT116, 및 786-O를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 입수하였다. 모든 세포주는 공급업자의 추천에 따라 배양하였다.
C.B.-17 scid-bg(scid-bg) 또는 C.B.-17 scid(scid) 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 5 내지 6주령 시기에 입수하여 8주령 이상 및/또는 크기가 ~20g일 때 연구에 사용하였다. 모든 동물 연구는 사람 보호 및 동물 사용에 있어서 공중위생국인, 농업 동물 후생 법령(Agriculture Animal Welfare Act)의 미국 부서, 및 실험 동물 후생에 대한 NIH 가이드에 의해 설정된 표준을 충족시키거나 이를 능가하는 조건하에서 실험 동물 보호의 미국 연합회가 승인한, 국제 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Internal Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 따라 특이적인 병원체가 없는 환경하에서 수행하였다. 탈수의 명시적인 신호, 털손질의 결여, 무기력, >15% 체중 손실 및 종양 용적 > 체중의 20%를 사용하여 종양 종결점을 측정하였다.
종양 세포주 HCT116을 마이코플라즈마(Mycoplasma)에 대해 정규적으로 시험하고 감염성 미생물 PCR 증폭 시험(IMPACT, Missouri Research Animal Diagnostic Laboratory)에 의해 생체내 접종 전에 미생물이 없음을 확인하였다. 1 mM L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청이 보충되고, 5% CO2, 95% 공기로 평형화시킨 습윤화된 대기 속에서 37℃로 유지시킨, RPMI 속에서 세포를 성장시키고 종양 세포 접종을 위해 대수기일 때 3 내지 7회 계대배양 사이에서 사용하였다. 세포(1x106)를 매트리겔(제조원: 비디 바이오사이언시스)로 1:1로 혼합하고 암컷 마우스의 제모한 옆구리로 피하 주사(0.2mL)하였다. 종양을 크기-조화(482-606 mm3)시키고 투여를 개시하기 전에 치료 그룹으로 할당하였다. 2개의 양분 직경(bisecting diameter)을 캘리퍼스(calipers)로 측정하고 종양 용적을 수학식: (길이 x 너비2)/2로부터 추정하였다. VX-680을 복강내(I.P., 50 mg/kg/d, 종결점까지 b.i.d.; 종결점에 도달하고 연구가 종결된 경우에 따라 17일) 10% 솔루톨(solutol)[제조원: BASF, 뉴저지주 플로르햄 파크 소재] 및 90% 타르타르산[제조원: 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스 소재]를 함유하는 비히클로 투여하였다. AZD1152를 복강내(100 mg/kg/d, b.i.d. x 3)에 2% 에탄올, 5% 트윈-80, 20% PEG-400, 73% HPMC(제조원: 시그마-알드리치)를 함유하는 비히클로 투여하였다. ABT-263을 PO로, 75 또는 100 mg/kg/d, q.d. x 13 내지 17일 동안 60% 포살(Phosal) 50, 30% PEG 400, 10% 에탄올을 함유하는 비히클로 투여하였다. 제제를 나타낸 기간 동안 조합물 치료요법과 초기에 동시에 투여하였다.
siRNA 형질감염
전형적으로, 세포를 항생제가 없는 성장 배지 속에서 96-웰 플레이트 내에 5,000개/웰로 씨딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 리포펙타민 RNAiMAX 형질감염 시약(제조원: 인비트로겐) 또는 DharmaFECT 형질감염 시약을 사용하여 제조업자의 추천에 따라 siRNA 올리고로 형질감염시켰다. 개개의 siRNA를 10 nM의 최종 농도에서 형질감염시켰다. 면역블롯팅 실험을 위해, 세포를 추가로 3일 동안 배양한 후 용해물을 제조하였다. siRNA/약물 조합물을 위해, 세포를 형질감염 후 24시간 째에 화합물로 처리한 후, 추가로 72시간 동안 배양하였다. 장기간의 다배수체화를 위해, 세포를 형질감염 후 10일까지 배양하였다.
세포 생존능 검사 및 카스파제 3/7 검사
세포 생존능을 CellTiter-GLO 발광성 검사(제조원: 프로메가)를 사용하여 제조업자의 제안된 프로토콜에 따라 측정하였다. 일반적으로, 세포를 >90% 생존능(트립판 블루 배제로 측정된 것으로서)에서 96-웰 플레이트내로 밤새 씨딩하고, 나타낸 기간 동안 화합물 또는 siRNA로 처리하고, 전체 세포 생존능을 발광을 측정함으로써 측정하였다.
카스파제-3 활성은 카스파제-GLO 3/7 검사(제조원: 프로메가)를 CellTiter-GLO 생존능 검사(제조원: 프로메가)와 연계하여 사용하여 측정하였다. 평행 실험을 수행하였으며, 여기서, 하나의 실험에서는 카스파제-3/7 활성이 측정되었고, 다른 실험에서는, 세포 생존능이 측정되었다. 세포당 카스파제-3/7 활성 기준은 카스파제-3 효소의 특이적인 활성 및 생존 세포의 수 둘다를 반영하며, 당해 데이타는 카스파제-3/7 활성을 세포 생존능으로 나누어 나타낸다.
면역블롯팅 및 면역침전
세포 용해물을 CHAPS 용해 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% CHAPS) 또는 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 및 0.5% 데옥시콜레이트(제조원: 인비트로겐)을 함유하는 세포 추출 완충액을 사용하여 제조하였다. 모든 완충액에 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(제조원: 시그마)을 사용 전에 보충하였다. 면역블롯팅을 위해, 용해물을 3x 로딩 완충액(제조원: 셀 시그날링 테크놀로지)과 혼합하고 동일한 양의 단백질을 비스/트리스 겔(제조원: 인비트로겐) 상에서 전기영동으로 분리하였다. 면역침전을 위해, 용해물을 CHAPS 용해 완충액 속에서 제조하고 >4 mg의 세포 용해물을 적어도 8㎍의 면역침전 항체와 밤새 4℃에서 혼합하였다. 다음 날, 30μl의 단백질 A- 또는 단백질 G-아가로즈 슬러리를 추가로 2시간 동안 가하였다. 면역침전물을 CHAPS 용해 완충액 속에서 3회 세척하고, 95℃에서 5분 동안 1.5 x 로딩 완충액 속에서 가열하였다.
시토졸의 정제
대략 20x106개 세포를 빙냉시킨 PBS로 세정하고, 트립신처리하고, 2분 동안 1,300 rpm에서 25℃에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 PBS로 1회 세정하고 미세원심분리 튜브에 이전시켰다. 펠렛이 200μl의 균질화 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM D-만니톨, 1 mM EGTA, 10 mM KCl, 및 5 mM MgCl2와 포스파타제 및 프로테아제 억제제) 중에서 30분 동안 팽윤되도록 한 후 B-형 막자를 사용하여 50 스트록크로 다운스(dounce) 균질화시켰다. 세포 균질물을 1,000xg에서 5분 동안 4℃에서 두 번 원심분리하여 핵 및 세포 부스러기를 펠렛화하였다. 상층액을 10,000xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 당해 회전으로부터의 펠렛을 "미토콘드리아"로 지정하고 80μl의 CHAPS 용해 완충액 속에서 추가로 추출하였다. 미토콘드리아의 추출은 빙상에서 시료를 ~20분 동안 각 1분에 걸쳐 반복적으로 와동시켜 수행하 였다. 최종 추출물을 14,000xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 투명하게 하여 어떠한 오염시키는 세포 부스러기도 제거하였다. 시토졸 및 저 밀도 막을 함유하는 10,000xg 상층액을 다시 100,000xg(TLA 120.2 회전기 속에서 55,000 rpm)에서 1시간 동안 원심분리하여 막을 펠렛화하였다. 상층액을 "시토졸"로 지정하고 시료 완충액 속에서 즉시 비등시켰다.
약물-약물 상호작용의 측정
VX-680 및 화학치료제의 상승적 활성을 블리쓰 어딕티비즘 모델(Bliss additivism model)[참조: Berenbaum, M. C., "Criteria for analyzing interactions between biologically active agents," Adv Cancer Res 35, 269-335 (1981)]을 사용하여 측정하였으며, 여기서 개개의 효과 A 및 B를 갖는 제제 둘다의 조합물된 반응 C는 다음과 같다: C = A + B - (A · B)(여기서 A 및 B는 0과 1 사이의 분획 억제를 나타낸다). 15를 초과하는 조합물된 반응 점수는 상승적인 것으로 고려하였다.
마이크로어레이에 의한 유전자 발현 분석
동결된 세포 펠렛을 용해시키고 총 RNA를 QIAshredder 및 RNeasy 컬럼(제조원: 퀴아젠)을 사용하여 분리하였다. 표지된 cRNA는 마이크로어레이 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하고 사람 게놈 U133A 2.0 어레이[제조원: 아피메트릭스(Affyme trix)]로 하이브리드화하였다. 마이크로어레이 데이타 파일을 분석용 로제타 리졸버 소프트웨어(Rosetta Resolver software)에 로딩하고, 모든 프로브 세트에 대한 강도 값을 리졸버 실험 정의(Resolver's Experimental Definition)를 사용하여 정규화하였다. 리졸버내 집단 분석을 1회 처리 조건에서 1.5-배 변화 또는 그 이상을 갖는 유전자를 사용하여, 유사성 척도에 대한 응집성 알고리즘(Agglomerative algorithm) 및 피어슨 상관관계(Pearson correlation)를 사용하였다. 0.001 미만의 p-값을 갖는 차이만이 나타난다. 경로 분석을 위해, 1.5-배 컷-오프(cut-off)를 적용시키고 5% 거짓 발견율(false discovery rate)을 p-값 컷-오프에 사용하였다[참조: Benjamini, Y. & Hochberg, Y., "Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing," J R Statist Soc B 57, 289-300 (1995)].
면역침전된 단백질의 질량 분광법적 분석
내인성 Bcl-XL 및 Mcl-1을 HCT116 세포로부터 면역침전시켰다. 질량 분광법을 위해 프로세싱될 시료를 10-웰 x 1 mm 4 내지 12% 비스/트리스 겔(제조원: 인비트로겐)의 매 다른 웰에 로딩하여 측면 오염을 감소시켰다. 겔을 45 내지 60분 동안 MOPS 이동 완충액 속에서 고정 200V에서 이동시킨 후, 50% 메탄올, 7% 아세트산 용액에서 속에서 15분 동안 고정시켰다. 물 속에서 세정한 후, 겔을 시프로 루비 단백질 겔 착색제(Sypro Ruby protein gel stain)(제조원: 인비트로겐)으로 3시간 동안 실온에서 처리하였다. 완료된 후, 겔을 10% 메탄올, 7% 아세트산의 용액으로 10분 동안 탈염시킨 후 물 속에서 30분 동안 세척하고 항온처리하였다. 단백질 밴드를 녹색 채널을 사용하여 후지 영상화기(Fuji imager)에서 후속적으로 영상화하였다.
겔 위의 각각의 레인을 24개의 동일한 크기의 조각으로 수동 절단하여, 96-웰 플레이트내에 두고 갈았다. 갈린 겔 조각을 겔속 트립신 분해에 37℃에서 5시간 동안 퍼킨-엘머 매쓰프렙 장치(Perkin-Elmer MassPrep unit)를 사용하고 등급 변형된 트립신(6 ng/μL)을 서열분석하여 적용시켰다. 각각의 시료에 대해 추출된 펩타이드를 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액 10μL의 용액 속에 재현탁하기 전에 동결건조시켰다. 9.5μL의 재현탁된 시료를 미크롬(Michrom) C18AQ 매직(magic) 역상 수지가 충전된 15 cm의 분석 모세관 컬럼(I.D. 75μm, 5μm 입자 크기, 200Å 공극 크기) 위에 주입하였다. 펩타이드를 에익시전트 나노(Eiksigent nano)-LC 단위를 사용하여 35분 선형 구배(0.1% 포름산 중 15 내지 35% 아세토니트릴) 속에서 용출시켰다. 아세토니트릴 조성을 35%에서 80%로 다음 5분에 걸쳐 증가시킴으로서 소수성 펩타이드를 후속적으로 제거하였다. 용출액을 선형 트랩 4중극(linear trap quadrupole: LTQ) 질량 분광계[제조원: 터모피셔(ThermoFisher), 매사추세츠주 월섬 소재]의 오리피스(orifice)내로 향하도록 하였다. 스캔을 크로마토그래피 분리 동안 데이타-의존성 이중-플레이 유형으로 수집하였다.
각각의 LC-MS/MS 데이타 파일을 마스콧 대몬(Mascot Daemon) v.2.2를 포유동물 분류에 한정된 NCBI 풍부하지 않은 데이타베이스에 대해 조사하였다. 2+ 내지 3+ 전하 상태의 펩타이드를 최대 2개의 손실된 트립신 분해, 고정된 변형으로서 카복시아미도메틸, 가변 변형으로서 산화된 메티오닌 및 완전한 펩타이드용의 +1.2 Da 및 탠덤 질량 분광법으로부터 생성된 이온용의 +0.8 Da의 질량 윈도우를 사용하여 조사하였다. 각각의 데이타 파일에 대한 마스코트(Mascot) 조사 결과를 MudPIT 편집 특징을 사용하여 스캐폴드(Scaffold) v.1.0 속에서 겔 레인에 의해 편집하여 처리에 의한 단백질 확인을 수득하였다.
Bcl-2 네트웍의 상호작용체 맵을 인게뉴이티 경로 분석 소프트웨어(Ingenuity Pathway Analysis software)[제조원: 인게뉴이티 시스템스(Ingenuity Systems), 캘리포니아주 레드우드 시티 소재]를 사용하여 수동으로 작제하였다. 모든 처리 조건하에서 Bcl-XL 면역침전물로부터 반납된 모든 단백질 확인의 복합체를 Bcl-2 네트웍 맵에 적용하였다. Mcl-1 면역침전물을 유사하게 분석하였다.
결과
상승적 세포독성을 유발하는 VX -680/ MK -0547 및 ABT -263
아우로라 계열의 세린/트레오닌 키나제를 특이적으로 표적화하는 소-분자 억제제를 단독치료요법으로서 임상 평가하에 두며 다른 화학치료제와 결합되는 것이 명백할 것이다. 아우로라 키나제 억제제와 치료학적으로 결합될 수 있는 제제를 실험적으로 확인하기 위하여, 판-아우로라 억제제 억제제, VX-680을 19개의 임상 및 실험적 암 치료요법과 함께 세포 생존능에 있어서의 이들의 효과에 대해 스크리닝하였다. Bcl-XL, Bcl-2, 및 Bcl-w를 억제하는, 경구로 생체이용가능한 소-분자 BH3 모사체인 ABT-263(도 8a)과 VX-680이 결합되는 경우 유일한 상승 활성이 관측되었다(도 8a). 블리스 분석(Bliss analysis)은, VX-680이 조직학적 유형[예를 들면, D54MG(신경아교종), NCI-H460 및 A549(폐 암종), PC3(전립선암종), EJ1(방광 암종), HCT116, DLD1, 및 SW620(결장 암종), 및 786-O(신장 암종); 도 8a 내지 8b 및 데이타는 나타내지 않음]과 관계없이 종양 세포주에서 ABT-263과 상승적이었음을 나타내며, 이는 종양 약물의 이들 2개 부류에 대해 관측된 상승 효과가 암 세포에서 전반적인 분자 민감성을 반영할 수 있음을 나타낸다. 19개의 임상적 및 실험적 암 치료제 각각의 작용의 표적/메카니즘 및 병용물 스크린에 대한 상응하는 투여량 반응은 하기 표 a에 요약되어 있다.
[표 a]
Figure pct00024
VX-680 및 ABT-263의 상승 활성은 아우로라 B 및 Bcl-XL의 조합의 억제에 충분히 속하는 것으로 고려될 수 있다.
VX-680는, Ki ( app ) 값이 각각 0.6, 18, 및 4.6 nM인 아우로라 A, B, 및 C 키나제의 강력한 억제제이다. 아우로라 A의 억제는 주로 세포분열 지연 또는 정지를 일으키는 반면[참조: Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of Aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007)]; 아우로라 B의 억제는 대량의 다배수체화를 생산한다[참조: Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, a selective inhibitor of Aurora B kinase, inhibits human tumor xenograft growth by inducing apoptosis," Clin Cancer Res. 13, 3682-8 (2007)]. 따라서, VX-680의 판-아우로라 프로파일로부터 ABT-263과 상승작용에 충분할 수 있는 아우로라 키나제 활성을 추출하는 것이 중요하다. 유사하게, ABT-263은 Bcl-XL, Bcl-2, 및 Bcl-w를 각각 ≤0.5, ≤1 및 ≤1nM의 Ki 값을 나타내는 유사한 효능으로 억제하며, 유사한 컴플리케이션(complication)을 나타낸다. 따라서, 이러한 활성들은 디콘볼루트(deconvolute)하여 siRNA 및 선택적인 소-분자 둘다를 사용한 상승 작용에 충분한 활성을 확인하였다. ABT-263, 아우로라 B와 함께, 그러나 아우로라 A를 제외하고 첨가하는 경우, siRNA 둘다가 이들의 각각의 표적을 충분히 녹다운하였다고 해도, siRNA는 ABT-263과 함께 상승적으로 항증식시켰다(도 9a 및 9b). 아우로라 A의 소-분자 억제제인 MLN8054는 아우로라 A-선택적인 농도(<5μM)에서 ABT-263과 함께 상승작용을 나타내지 않았다(도 9c)[참조: Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small molecule inhibitor of Aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007) and Li, J. et al., "Inhibition of Aurora B kinase sensitizes a subset of human glioma cells to TRAIL concomitant with induction of TRAIL-R2," Cell Death Differ, Epub ahead of print (2008)]. 대조적으로, 상승작용은, ABT-263을 아우로라 B-선택적인 억제제, AZD1152와 병용하는 경우 관측되었다[참조: Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, a selective inhibitor of Aurora B kinase, inhibits human tumor xenograft growth by inducing apoptosis," Clin Cancer Res. 13, 3682-8. (2007) and Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, 2213-24 (2007)](도 9d).
ABT-263이 Bcl-2, Bcl-XL, 및 Bcl-w를 억제하지만, 이는 Mcl-1 및 Bcl-A1과 같은 Bcl-2 계열의 다른 항-세포자멸사 구성원에 대해 비교적 불활성이다. Bcl-2 및 Bcl-XL은 일반적으로 많은 사람 암 세포내에서 발현되므로, siRNA는, 2개의 ABT-263 표적 중 이들이 억제되는 경우, 어느 것이 AZD1152와 병용된 ABT-263에 대해 관측된 상승 효과 활성을 표현형모사할 수 있는지를 측정하는데 사용되었다. 상이한 종양 기원의 암 세포(HCT116, DLD1, EJ1, PC3, D54MG)내로 형질감염되는 경우, Bcl-XL, 그러나 루시퍼라제를 제외한, Bcl-2, 또는 Mcl-1 siRNA는 AZD1152와 함께 세포 성장의 상승적 억제를 나타내었다(도 9e 내지 도 9g 및 데이타는 나타내지 않음). 따라서, 그러나 Bcl-2를 제외한, Bcl-XL의 억제는 아우로라 B 억제와 공동작용하여 이들 세포주에서 세포 사멸을 유도한다. Bcl-XL 및 아우로라 B siRNA는 또한 상승적으로 항증식성이었다(도 9h). 종합적으로, 이들 데이타는, VX-680 및 ABT-263의 상승적 활성이 아우로라 B 및 Bcl-XL의 억제에 충분히 속하는 것으로 고려될 수 있음을 나타낸다.
ABT -263은 다배수체 세포내에서 신속한 세포자멸사를 개시한다.
다배수는 아우로라 B의 지속된 억제와 관련된 궁극적인 세포 운명을 나타내므로, 본 발명자들은, Bcl-XL 억제 및 다배수체화가 아우로라 B와 독립적으로 상승적으로 세포독성인지를 측정하기 위해 셋팅하였다. CPC는 아우로라 B, 서바이빈, INCENP, 및 보레알린(borealin)을 포함하는 상위 그룹이며, 세포분열 방추사 조립 체크포인트의 중심이다[참조: Ruchaud, S., Carmena, M. & Earnshaw, W. C., "Chromosomal passengers: conducting cell division," Nat Rev Mol Cell Biol 8, 798-812 (2007)]. CPC의 파괴는 세포질분열 실패 및 다배수를 생성한다[참조: Honda, R., Korner, R. & Nigg, E. A., "Exploring the functional interactions between Aurora B, INCENP, and survivin in mitosis," Mol Biol Cell 14, 3325-41 (2003)]. 다배수에 대해 보호하기 위한 INCENP의 역할에 따라서[참조: Uren, A. G. et al., "Survivin and the inner centromere protein INCENP show similar cell-cycle localization and gene knockout phenotype," Curr Biol 10, 1319-28 (2000)], INCENP siRNA는 다수의 미소핵을 지닌 극도로 확장된 세포와 같은 다배수의 형태학적 특징을 유도하였다(데이타는 나타내지 않음). INCENP의 녹다운은 Bcl-XL 녹다운과 함께 상승적으로 항증식성이었으며(도 10a 내지 10b), 이는, Bcl-XL의 억제가 다배수체 세포에 유해함을 제안한다. 그러나, INCENP를 siRNA로 표적화하는 것은 또한 아우로라 B를 다른 위치로 옮기도록 하여 이의 활성을 억제한다[참조: Klein, U. R., Nigg, E. A. & Gruneberg, U., "Centromere targeting of the chromosomal passenger complex requires a ternary subcomplex of Borealin, Survivin, and the N-terminal domain of INCENP," Mol Biol Cell 17, 2547-58 (2006)]. 따라서, INCENP siRNA의 효과는 아우로라 B의 파괴와는 완전히 분리될 수 없다. 다배수 그 자체가 Bcl-XL 억제에 대해 세포를 민감화하기에 충분한지를 결론적으로 측정하기 위하여, 세포를 AZD1152로 처리하여 다배수를 유도하고, 약물을 세척하고, 다배수체 세포를 아우로라 B 활성이 회복될 때까지 배양하였다. 다배수는 야생형 p53을 지닌 세포내에서 다배수체화용 대용품인, p53의 상승된 발현에 의해(도 10c)[참조: Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, 7668-77. (2006), Li, J. et al., "Inhibition of Aurora B kinase sensitizes a subset of human glioma cells to TRAIL concomitant with induction of TRAIL-R2," Cell Death Differ, Epub ahead of print (2008) and Kojima, K., Konopleva, M., Tsao, T., Nakakuma, H. & Andreeff, M., "Concomitant inhibition of Mdm2-p53 interaction and Aurora Kinases activates the p53-dependent postmitotic checkpoints and synergistically induces p53-mediated mitochondrial apoptosis along with reduced endoreduplication in acute myelogenous leukemia," Blood 112, 2886-95 (2008)], 및 세포 크기 및 다핵화에 있어서 총 형태학적 증가에 의해(도 10d) 입증되었다. AZD1152를 세척 제거한 후, 히스톤 H3 포스포릴화가 처리되지 않은 수준으로 회복되는 것은, 다배수체 세포 (도 10d)내에서 아우로라 B 활성이 완전히 회복되었음을 나타낸다(도 10c). ABT-263은 다배수체 세포내에서, 그러나 이배체 세포를 제외하고, 아우로라 B의 활성화 상태와는 독립적으로, 배수체 세포에서 카스파제-3 활성 및 생존능의 손실을 유도하였다(도 10e 내지 10f). 이들 데이타는, 다배수의 급성 유도가, 세포 생존이 Bcl-XL의 항-세포자멸사 활성에 의존하도록 함을 제안한다.
다배수체화는 Bcl - X L 에 대한 생존 부담을 이동시킨다.
다중도메인 세포자멸사 단백질 BAX 및 BAK는 함께 세포자멸사에 대한 의무적인 포탈(portal)을 구성한다[참조: Wei, M. C. et al., "Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death," Science 292, 727-30 (2001) and Zong, W.X., Lindsten, T., Ross, A. J., MacGregor, G. R. & Thompson, C. B., "BH3-only protein that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of BAX and BAK," Genes Dev 15, 1481-6 (2001)]. Bcl-XL 중화가 다배수체 세포내에서 세포 사멸을 유발하는 메카니즘을 조명하기 위하여, 활성 BAX 및 BAK 이형태체를 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 AZD1152와 다배수를 만든 세포내에서 BAX 및 BAK의 활성화를 시험하였다. 다배수 HCT116, D54MG, SW620, 및 EJ1 세포내로의 ABT-263의 첨가는 BAX 및 BAK 활성화를 신속하고 상승적으로 유도하였다(도 11a 및 도 14). BAX 및 BAK의 활성화는, 세포자멸사로의 전념에 있어 결정적인 현상인, 시토크롬 C의 시토졸내로의 미토콘드리아 방출을 수반하였다(도 11b).
BAX 및 BAK의 프로-세포자멸사 기능은 일반적으로 Bcl-XL 및 Mcl-1과 같은 bCL-2 계열의 항-세포자멸사 구성원에 의해 일반적으로 억제되며, 이는 고유의 경로를 통해 세포자멸사에 대한 한계를 설정한 단지 BH3과 다중도메인 단백질 사이의 상호작용의 균형이다.[참조: Kim, H. et al., "Hierarchical regulation of mitochondrion-dependent apoptosis by BCL-2 subfamilies," Nat Cell Biol 8, 1348-58 (2006) 및 Willis, S, N. et al., "Apoptosis initiated when BH3 ligands engage multiple Bcl-2 homologs, not BAX or BAK," Science 315, 856-9 (2007)]. 다배수체 세포에서 관측된 것과는 대조적으로, Bcl-XL의 중화는 일반적으로 이배체 또는 홀다배수체 세포내에서 세포자멸사를 개시하는데 충분하지 않다(도 8c). 다배수체화가 세포자멸사 기구의 성분들과 관계하여 다배수체 세포 생존을 Bcl-XL-의존성이 되도록 하는 방법을 설명하기 위해, Bcl-2 네트웍를 다배수체화에 대한 반응시 mRNA 및 단백질 수준에서 모니터링하였다. Bcl-2 네트웍 유전자의 계층적 무리화는, 이들이 세포주에 따라 상이하다고 해도(도 15), 다배수체화의 전사 프로파일(VX-680 및 AZD1152)이 아우로라 A 억제(MLN8054)와 비교하여 지속적으로 가장 유사하였음을 나타내었다. 단백질 수준에서, 다수의 프로-세포자멸사 BH3-단독 단백질은 다배수체화 후 상향조절되었다(도 11c). PUMA 및 NOXA에서의 증가는 세포주에 따라 보존된 효과이었던 반면; tBID, BIK, BIM, 및 BAX는 세포주-의존적 방식으로 증가하였다. 발현에서 미묘한 변화만이 Bcl-2 및 Bcl-XL에 대해 관측되었다 하더라고, Mcl-1은 HCT116, SW620, 및 EJ1 세포에서 유의적으로 감소되었다(도 11c 및 데이타는 나타내지 않음). NOXA는 Mcl-1에 결합하여 이의 항-세포자멸사 기능을 억제한다[참조: Chen, L. et al., "Differential targeting of prosurvival Bcl-2 protein by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function," Mol Cell 17, 393-403 (2005)]. 따라서, D54MG 세포내에서 Mcl-1의 풍부성이 감소되지 않았다고 해도(도 11c), D54MG에서 NOXA의 상향조절은 Mcl-1을 길항하는 것으로 예측된다. 종합적으로, 다배수체화는 Mcl-1 기능을 절충하면서, 세포자멸사의 효과를 유도하였다. 세포 생존능이 다배수체화의 당해 기간 동안 유지되므로, 생존능을 지지하는 부담은 Mcl-1으로부터 Bcl-XL로 이동되는 것으로 추론되었다.
유전자 발현이, Bcl-2 네트웍이 조절되는 하나의 수준을 나타낸다고 해도, 프로- 및 항-세포자멸사 단백질 사이의 결합 현상의 수집은 궁극적으로 생존과 세포자멸사 사이의 균형을 결정한다. Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용체는 실증적으로 정의되었으며 이들 상호작용에 있어서 다배수체화의 효과가 모니터링되었다. HCT116 세포는 DMSO, ABT-263, AZD1152, 또는 AZD1152 및 ABT-263으로 처리되었다. 내인성 Bcl-XL 또는 Mcl-1은 이후 면역침전되었고, 면역 복합체가 겔내 트립신 분해 및 LC-MS/MS에 의해 분석되었다. 단백질 확인은 모든 처리로부터 편집되어 모든 Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용이 검출됨을 나타내는 복잡한 상호작용체를 생성하였다(도 16). 상호작용은 후속적으로 공-면역침전 및 면역블롯팅에 의해 각각의 처리 조건하에서 확인되었다(도 11d 내지 11e). 공면역침전된 단백질 중 어느 것도 IgG 동형-조화된 항체를 사용한 항-S6K1 면역침전물에서 검출되지 않았으며(도 1e 내지 1f), 이들 상호작용의 특이성을 강조한다. 다배수체 세포(AZD1152)에서, Bik 및 tBid와 Bcl-XL의 상호작용은 증가한 반면, BAD, BIM, BAX, 및 PUMA의 결합은 변하지 않았으며(도 11e), 이는, Bcl-XL가 다배수체화시 프로-세포자멸사 단백질에 의해 증가되게 부담이 되었음을 나타낸다. Mcl-1 단백질 수준의 감소와 일치하여, 감소된 양의 Mcl-1이 다배수체 세포내에서 면역침전에 의해 포획되었다(도 11e). 또한, 다배수체화동안 NOXA 결합에 있어 화학량론적 증가가 존재하였다(도 11e). 또한, Mcl-1과 Bim 및 Puma의 연합은 다배수체 세포내에서 현저히 약화되었으며(도 11e), 이는, Mcl-1의 감소 및 NOXA의 동시 증가가 Mcl-1을 부분적으로 중화시키기에 충분하였음을 제안한다.
Bcl - X L /아우로라 B 억제제 상승작용에 요구되는 Bcl -2 네트웍 성분들의 확인
비록 다수의 Bcl-2 계열 단백질이 발현 및/또는 단백질-단백질 상호작용의 수준에 있어서 다배수체화에 의해 조절되었다고 하더라도, 이것들이, 만약에 있다면, Bcl-XL 억제에 대한 다배수체 세포의 감작화에 필수적인지는 명확하지 않았다. siRNA 스크린을, Bcl-XL과 Mcl-1 상호작용체를 강조하기 위해 수행하여, 녹다운(knockdown)시, Bcl-2 네트웍의 성분이 아우로라 B 및 Bcl-XL의 이중 억제의 존재하에서 생존능을 구제할 수 있는지를 확인하였다. NOXA, BAX를 표적화하는 다수의 siRNA, 및 보다 적은 정도로 BAK를 표적화하는 다수의 siRNA가 ABT-263-매개된 세포 사멸로부터 다배수체 세포를 구제하는 것으로 밝혀졌다(도 12a 및 도 17). 실제로, 몇몇 세포주에서 NOXA 및 BAX의 siRNA-매개된 고갈은, 다배수체 세포가 Bcl-XL 억제에 대해 내성이 되도록 하였다(도 12b 및 도 17). 이들 데이타는 다배수체 세포에서 BC1-XL 억제의 상승적 활성에 있어서 NOXA 및 BAX에 대한 인과관계적 역할을 나타낸다.
Noxa 억제가 다배수체 세포를 ABT-263-매개된 세포자멸사로부터 보호하는 방법을 추가로 이해하기 위하여, Bcl-XL 및 Mcl-1 상호작용체를 대조군 또는 NOXA siRNA로 형질감염된 세포내에서 다배수체화 전과 후에 비교하였다. 앞서와 같이, Mcl-1 단백질의 감소 및 Mcl-1에 대한 NOXA 결합에 있어서의 화학량론적 증가가 AZD1152를 사용하는 다배수로 제조된 세포내에서 관측되었다(도 12d). NOXA의 고갈은 다배수체 세포내에서 Mcl-1에 대한 Puma 및 Bim의 결합을 회복시켰으며, 이는 프로-세포자멸사 효과인자에 결합하는 Mcl-1의 능력이 회복되었음을 나타낸다. 비록 이것이 Bcl-XL 의존성을 유발하는데 충분하다고 하더라도, 다배수체화 동안 Mcl-1의 억제는, AZD1152/ABT-263에 의해 유도된 세포자멸사가 Mcl-1 녹다운에 의해 증강되므로, 불완전한 것으로 여겨진다(도 19).
이중 아우로라 B/ Bcl - X L 억제로부터 명백한 메카니즘을 포함하는 다배수체화 -매 개된 세포자멸사
암 세포는 다배수체화 동안 생존가능한 세포 질량을 축적하며 AZD1152의 첨가 후 1주까지 계속 이를 지속한다. 그러나, 다배수의 개시 후 10일 째에, 생존능은, 세포가 다배수체화 공정에 굴복하면서 급격하게 감소한다(도 18). 연장된 다배수체화에 대해 2차적인 세포자멸사가 비록 지연되더라도, 아우로라 B/Bcl-XL의 이중 억제와 같은, 동일한 세포자멸사 프로그램에 관여하는지를 측정하기 위해, 추가의 siRNA 구제 스크린을 수행하여, 기능적으로 파괴되는 경우 다배수체 세포의 장기간 생존능을 보존할 수 있는 Bcl-2 네트웍의 성분을 확인하였다(도 12e). AZD1152/ABT-263 병용물에 의해 유도된 급성 세포자멸사에 대한 BAX 및 NOXA의 우세한 요건과는 대조적으로, BAX 및 BAK에 대한 siRNA는 유사한 보호 정도를 부여하며, 조기 구제 스크린에서 효과적이지 않았던, BIK 및 BID에 대한 siRNA는 생존능의 다배수체화-매개된 손실로부터 세포를 보호하였다(도 12f). 또한, NOXA의 고갈은 당해 셋팅에서 어떠한 보호 효과도 제공하는데 실패하였다(도 12f).
ABT -263은 생체내에서 아우로라 키나제 억제제의 효능을 향상시킨다.
아우로라 키나제 억제제가 전임상 연구에서 효과적인 것으로 밝혀졌다고 해도, 다배수 종양 세포에서 Bcl-XL의 표적화는 단독치료요법과 같이 아우로라 키나제 억제제보다 우세한 효능을 생성할 수 있다. 이는 단일 제제 AZD1152 치료의 항종양 효능을 스트링전트 및 치료학적으로 관련된 셋팅: 잘-확립된 거대 종양(~0.5그람) 및 AZD1152의 최대 내성 투여량을 사용할때 AZD1152/ABT-263의 병용물에 대해 비교함으로써 평가하였다. 단일 제제로서 AZD1152는, 비록 종양이 1주내에 치료요법으로 회복되기 시작했다고 하더라도(종양 재성장에 의해 입증됨), HCT116 결장 암종 모델에서 유의적인 종양 성장 억제를 생성하였다. 대조적으로, AZD1152/ABT-263의 병용물 요법은 적어도 2주 동안 지속된 신속하고 보다 지속된 종양 회귀를 생성하였다(도 13a). AZD1152를 사용한 3일 동안 예비치료된 종양에서, 다배수체화의 대용 마커인, p53의 유도가 관측되었다(도 6b). 활성 BAX 이형태체는 AZD1152-처리된 마우스로부터의 종양에서 ABT-263 치료의 4시간내에 검출되었지만, 나이브 종양(naive tumor)에서는 그렇지 않았고, 이는, 다배수 종양 세포에서 ABT-263-매개된 세포자멸사의 신속한 시작을 반영한다(도 13b).
당해 분야의 숙련가들은, 본원 명세서의 교시내용이 언급된 목적을 수행하고, 언급된 결론 및 장점, 및 또한 본원에서 고유한 것들을 수득하기 위해 우수하게 조정됨을 용이하게 인식할 수 있다. 본원에 기술된 분자 복합체 및 방법, 과정, 치료, 분자, 특이적인 화합물은 바람직한 국면을 현재 대표하며, 예시적이고, 본원 명세서의 교시내용의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 당해 분야의 숙련가에게는, 다양한 치환 및 변형이 본원 명세서의 교시내용의 영역 및 취지에 벗어남이 없이 본원 명세서의 교시내용에 대해 이루어질 수 있음이 용이하게 명백할 것이다.
명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보들은 본원 명세서의 교시내용에 관한 당해 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공보는, 각각의 개개 공보가 참조 문헌으로 인용된 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 경우와 동일한 정도로 참조로 인용된다. 본원에 설명적으로 기술된 본원 명세서의 교시내용은 본원에 구체적으로 기재되지 않은 어떠한 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들의 부재하에 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본원의 각각의 경우에서 용어 "포함하는", "로 필수적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 어느 것도 다른 2개의 용어 중 어느 것과 교체될 수 있다. 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 측면에서 및 제한없이 사용되며, 이러한 용어들 및 표현들의 사용에 있어서, 나타내거나 기술된 특징의 어떠한 등량체 또는 이의 일부를 제외할 의도는 없지만, 각종 변형이 특허청구된 교시내용의 범위내에서 가능할 수 있음이 인식된다. 따라서, 비록 본원 명세서의 교시내용이 바람직한 국면 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 기재되어 있다고 해도, 기재된 본원의 개념의 변형 및 변화는 당해 분야의 숙련가에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본원 명세서의 교시내용의 영역내에 있는 것으로 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBOTT LABORATORIES <120> COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER AND DIAGNOSTIC ASSAYS FOR USE THEREIN <130> 7920USP1 <150> 12/630,957 <151> 2009-12-04 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide probe <400> 1 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide probe <400> 2 Ile Asn Arg 1 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tggttatggg atgggtgagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ctgctttttc tcgcccttcc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 tccgaggtgc tccagttgga ggc 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 gcccggcctg ggtctttcgc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 7 cttcaatttt caaatcaaac tgatc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 8 tgaatgcttt gatttcctca cgttt 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 9 ttgcctgaac atcttggaca ttttt 25 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide probe <400> 10 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Lys Ile Asn Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 gatggacggg tccggaga 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ctcagcccat cttcttccag 20

Claims (52)

  1. 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 암으로 고생하는 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 다배수 유도제(polyploidy inducing agent)를 투여하는 단계; 및
    b) 상기 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다배수 유도제가 아우로라 키나제 억제제(Aurora kinase inhibitor)인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 B 억제제인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 B 억제제가 VX-680, AZD1152, ZM44739 또는 헤르스페라딘(Hersperadin)인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  6. 암으로 고생하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제들의 병용물로서, 상기 병용물은
    a) 상기 환자에서 하나 이상의 암 세포에서 다배수체화(polyploidization)를 유도하는데 사용하기 위한 적어도 하나의 다배수 유도제; 및
    b) 적어도 하나의 Bcl-2 계열 단백질 억제제를 포함하는, 암으로 고생하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 치료제들의 병용물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다배수 유도제가 아우로라 키나제 억제제인, 병용물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 B 억제제인, 병용물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 B 억제제가 VX-680, AZD1152, ZM44739 또는 헤르스페라딘인, 병용물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적 억제제 또는 이들의 병용물인, 병용물.
  11. 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하기에 적격인 환자를 분류하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
    b) 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 측정한 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용하는 치료를 제공받기에 적격인 것으로 상기 환자를 분류하는 단계를 포함하는,
    다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하기에 적격인 환자를 분류하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다배수 유도제가 아우로라 키나제 억제제인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 B 억제제인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘인, 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 시험 시료가 조직 시료를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조직 시료가 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료; 또는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료를 포함하는, 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 동소 하이브리드화에 의해 수행되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 펩타이드 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  23. 제11항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행되는, 방법.
  24. 제11항에 있어서, 상기 환자가 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이들의 조합으로 치료되는, 방법.
  25. 암으로 고생하는 환자를 모니터링하고 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 암으로 고생하며 현재 적어도 하나의 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 현재 치료중인 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
    b) 상기 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 측정한 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여, 상기 환자가 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 계속 치료받아야 하는지를 결정하는 단계를 포함하는,
    암으로 고생하는 환자를 모니터링하고 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물로 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 다배수 유도제가 아우로라 키나제 억제제인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 B 억제제인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘인, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 시험 시료가 조직 시료를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조직 시료가 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료; 또는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료를 포함하는, 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 동소 하이브리드화에 의해 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 펩타이드 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  37. 제25항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행되는, 방법.
  38. 제25항에 있어서, 상기 환자가 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이들의 조합으로 치료되는, 방법.
  39. 환자를 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용하는 치료에 대해 내성인 암을 가진 것으로 분류하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 암으로 고생하는 환자로부터의 시험 시료를 제공하는 단계;
    b) 시험 시료 속의 BAX 유전자, BAK 유전자 또는 NOXA 유전자로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 측정된 적어도 하나의 돌연변이의 존재 또는 부재에 기초하여, 상기 환자를 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용하는 치료에 대해 내성인 암을 가진 것으로 분류하는 단계를 포함하는,
    환자를 다배수 유도제, Bcl-2 계열 단백질 억제제 또는 다배수 유도제와 Bcl-2 계열 단백질 억제제의 병용물을 사용하는 치료에 대해 내성인 암을 가진 것으로 분류하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 다배수 유도제가 아우로라 키나제 억제제인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 A 억제제, 아우로라 키나제 B 억제제, 아우로라 키나제 C 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 억제제가 아우로라 키나제 B 억제제인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 아우로라 키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는 헤르스페라딘인, 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 Bcl-2 계열 단백질 억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-XL 선택적 억제제 또는 이들의 병용물인, 방법.
  45. 제39항에 있어서, 상기 시험 시료가 조직 시료를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조직 시료가 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 림프절 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료, 파라핀 봉매된 조직 시료; 또는 말초 혈액 시료, 종양 조직 또는 의심되는 종양 조직, 박층 세포학적 시료, 미세침 흡인 시료, 골수 시료, 뇨 시료, 복수액 시료, 세척액 시료, 식도 브러싱 시료, 방광 또는 폐 세척액 시료, 척수액 시료, 뇌 유액 시료, 관 흡인 시료, 유두 분비물 시료, 흉막 삼출액 시료, 새로이 동결된 조직 시료 또는 파라핀 봉매된 조직 시료 중 어느 것으로부터 생산된 추출물 또는 가공된 시료를 포함하는, 방법.
  47. 제39항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 동소 하이브리드화에 의해 수행되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 형광성 표지된 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 적어도 2개의 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 동소 하이브리드화가 펩타이드 핵산 프로브를 사용하여 수행되는, 방법.
  51. 제39항에 있어서, 상기 측정 단계 (b)가 폴리머라제 쇄 반응에 의해 수행되는, 방법.
  52. 제39항에 있어서, 상기 환자가 또한 화학치료요법, 방사선 또는 이들의 조합으로 치료되는, 방법.
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