KR20120089261A - 지속형 인슐린 조성물 - Google Patents

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토르벤 레쓰만
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토마스 벡게
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사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 혈중에 인슐린 화합물의 치료학적 유효 수준을 적어도 3일 동안 유지하기에 충분한 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 나타냄을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 약제학적 조성물의 제조를 위한 인슐린 화합물의 용도뿐만 아니라 상기 약제학적 조성물을 포함하는 부품 키트에 관한 것이다.

Description

지속형 인슐린 조성물{LONG ACTING INSULIN COMPOSITION}
본 발명은 인슐린 화합물을 포함한 약제학적 조성물, 이 조성물의 용도, 치료 방법, 부품 키트 및 GLP-1 화합물(예, GLP-1 효능제)과의 병용 치료에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 시중의 지속형 인슐린보다 적은 횟수로 투여할 수 있으며, 인슐린 화합물의 실질적 버스트(burst) 없이 투여 사이의 전체 기간에 걸쳐 구조적으로 완전한 인슐린의 방출을 특징으로 한다. 이와 같은 치료는 혈장 인슐린 수준의 최적 조절을 유지하고 궁극적으로 혈당의 최적 조절을 유지할 수 있으면서 환자에게 주사 횟수를 줄일 수 있도록 보조할 수 있다.
인슐린 치료요법의 특징은 치료 범위가 좁고 고인슐린증의 부작용이 잠재적으로 생명을 위협할 수 있기 때문에 인슐린 약물 방출을 매우 엄격한 수준 내로 유지해야 할 필요성이 높은 것이다. 당뇨 환자들의 특정 요건에 맞도록 다른 작용 프로파일을 갖는 많은 인슐린 제제가 시판되고 있다. 속효성 인슐린 유사체는 음식물 섭취 후 혈장 당을 조절하기 위해 식사 직전에 투여되는 반면, 지속형 인슐린 유사체는 정상 기저 인슐린 수준을 제공하기 위해 전형적으로 1일 1회 또는 2회 투여된다.
최근에 개발된 것으로 경구형 인슐린 및 흡입형 인슐린이 또한 포함된다. 그러나, 인슐린은 단백질이기 때문에 경구 투여되면 위 및 위장계에 의해 쉽게 분해된다. 다른 제형으로서, 흡입기를 통해 폐로 전달되는 흡입형 인슐린이 일시적으로 시판되었다(Exubera®, Pfizer는 이 제품을 2007년에 중단하였음). 이 제형은 인슐린을 수 시간에 걸쳐 제공하는 한편 환자에게 지속형 기저 인슐린을 계속적으로 주사하는 것이 요구된다. 이러한 흡입형 인슐린의 또 다른 단점은 제조상의 곤란성으로 인해 상당히 고가의 전달 시스템을 양산한다는 것이다. 결과적으로 시판중에 있는 모든 인슐린 제형은 피하 또는 정맥내 주사에 의해 투여되어야 한다.
이용되고 있는 각종 인슐린의 혈장 프로파일은 상이한 혈장 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 혈장 프로파일은 사용된 인슐린의 제형 및 유형에 의해 좌우되는 최대 혈장 농도와 최소 혈장 농도를 갖는 것으로 나타낼 수 있다. 투여된 인슐린의 혈장 당 저하 효과를 예측하기 위해 개별 환자마다 및 환자 그룹 내에서 재현가능한 혈장 프로파일을 획득하는 것은 상당히 중요하다. 추가로 기저 인슐린을 다중(반복) 투여하는 경우, 최대 혈장 농도와 최소 혈장 농도 사이의 차이가 가능한 작은 것이 바람직하다. 이것은 인슐린의 보다 일정한 혈장 농도를 유도하며, 이에 따라 전체 투여 간격에 걸쳐 보다 균일한 혈당 저하 효과를 제공한다.
현재의 표준 기저 인슐린 치료요법은 NPH 인슐린, 인슐린 글라르긴 또는 인슐린 디터머와 같은 지속형 기저 인슐린의 매일 투여 또는 매일 2회 투여로 구성된다. 비록 최근의 인슐린 유사체는 인슐린분비 효과의 변동성을 줄이는데 목표를 두었을지라도, 이들 지속형 제형의 혈당 저하 효과는 Heise et al., Diabetes, 2004 (53), 1614-1620에 기술된 바와 같이 대규모 피검자간 및 피검자내 변동성의 특징으로 나타난다. 이 연구에서 인슐린 디터머는 변동계수가 15로서 변동계수가 각각 26 및 34인 NPH 인슐린 및 인슐린 글라르긴의 cv에 비하여 최소의 약동학 변동을 나타냈다. 이와 같이 지나치게 큰 변동성은 인슐린 분자에 대한 노출을 예측하는 것이 어렵기 때문에 최적의 혈당 조절을 얻는데 주요 장애물이 된다.
당 주입 속도(GIR)로 평가되는 약력학 변동성에 대한 연구가 동일하게 진행되었다. 이 평가에서 또한 약력학 마커 GIR에 관해서 인슐린 디터머가 NPH 인슐린 및 인슐린 글라르긴보다 낮은 피검자내 변동성을 갖는 것으로 입증되었다. 게다가, 이 연구에서 당 주입 속도에 미치는 인슐린 효과는 24시간의 전체 투여 기간에 내내 지속되지 않은 것으로 입증되었고, 이에 따라 투여들간의 전체 기간 동안에 완전한 혈당 저하 작용을 제공하는 지속형 인슐린이 필요하다는 것이 확실히 증명되었다. 전체 24시간을 지속하지 못하는 현재의 일일 기저 인슐린의 문제점을 피하기 위해, 일부 환자들은 당일의 혈당을 보다 양호하게 조절하기 위한 목적으로 기저 인슐린 용량을 매일 2회 주사로 나눈다.
따라서, 투여 사이의 전체 기간 내내 연속적으로 인슐린을 방출하는 새로운 지속형 인슐린 제제가 필요한 것은 분명하다.
추가로, 비록 환자들이 기저 인슐린의 매일 주사로 혈당을 관리할 수 있을지라도, 인슐린 치료요법 초기에 매일 주사를 맞아야 하는다는 불쾌감에 직면한다. 이것은, American Diabetes Association(ADA) 및 European Association for the Study of Diabetes(EASD)가 최상의 치료 결과를 제공하는 것으로 경구형 메트포르민 후 1차 치료로서 인슐린을 인정하기 때문에(DM Nathan et al., Diabetologica (2008) 51:8-11), 바람직하지 않다.
인슐린 치료의 주사 횟수를 줄일 수 있다면, 인슐린 치료요법의 초기에 심리적 압박은 줄어들 것이고, 이에 따라 환자들은 인슐린 치료요법을 좀더 이른 단계에서 시작할 수 있고 결국 건강 상태가 상당히 호전될 수 있을 것이다.
지속형 기저 인슐린 제형을 개발하기 위한 도전은 인슐린의 좁은 치료 범위에 있으며, 인슐린 약동학에서 최대/최저의 큰 변동뿐만 아니라 버스트 효과는 모든 환경에서 피해야 한다.
좁은 한계내에서 인슐린 방출을 유지하면서 투여 횟수를 줄이는 몇 가지 방법이 제안되었으나, 최대 혈장 농도와 최저 혈장 농도 사이의 낮은 비율을 특징적으로 나타내는 한편 혈당 저하 효과를 이틀 이상 지속하지 못했다.
WO 06003014에는 표준 일일 기저 인슐린 주사에 비교하여 투여 횟수의 가능성이 감소된 인슐린을 방출할 수 있는 하이드로겔이 기술되어 있다. 그러나, 해당 인슐린은 이틀 동안의 정확한 인슐린분비 조절을 보장하기 위해 지나치게 빠른 속도로 방출된다. 사실 해당 인슐린은 약 30시간의 반감기로 방출되며 이것은 최대/최저 비가 정상 상태에서 2 이하가 되도록 하기 위해 프로드럭이 적어도 매 30시간마다 투여되어야 한다는 것을 의미한다.
인슐린의 가역적 고분자 프로드럭 접합체를 제조하는 개념은 Schechter 등에 의해 개발되었고 여러 논문 및 특허 명세서에 기술되어 있다(예, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008(70), 19-28 및 WO-A 2004/089280). 해당 인슐린은 9-하이드록시메틸-7-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트)-플루오렌-N-하이드록시석신이미드 스페이서 분자를 통해 40 kDa PEG 고분자에 접합된다. 이 링커 분자의 가수분해는 인슐린을 약 30 시간의 반감기로 방출하며, 이것은 최대/최저 비가 정상 상태에서 2 이하가 되도록 하기 위해 프로드럭이 적어도 매 30 시간마다 투여되어야 한다는 것을 의미한다.
인슐린 투여 횟수를 줄이기 위한 다른 시도가 있어 왔다. Hinds 등의 Journal of Controlled Release, 2005 (104), 447-460에는 일차로 인슐린 분자를 영구적으로 페길화하고 후속하여 페길화 인슐린을 PLGA 미립자에 미세캡슐화함으로써 주 1회 투여 인슐린을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 단백질의 PLGA 캡슐화는 펩타이드 또는 단백질 아미노 그룹과 고분자 에스테르의 부반응을 일으키는 것으로 제시되었다. 제형이 중성 pH의 완충 용액에 노출된 후 락트산 아실화 산물이 관찰되었다(Nat. Biotechnol. 18 (2000) 52-57; Pharm. Res. 11 (1994) 865-868; Pharm. Res. 19 (2002) 175-181).
특정적으로 인슐린의 경우, 고분자 제형의 유해한 효과가 P. G. Shao 등에 의해 증명되었다(Pharm. Dev. Technol. 4 (1999) 633-642; 및 Pharm. Dev. Technol. 5 (2000) 1-9).
상기의 경우에, 인슐린의 페길화는 PLGA 고분자 제형에서 펩타이드가 열화되지 않도록 보호하는 역할을 하는 것은 분명하기 때문에, 인슐린은 고분자량의 고분자에 의한 영구적 변형을 통해 실질적인 구조적 변형이 이루어졌다.
불행하게도, 그러한 고분자량 변형된 인슐린은 감소된 수용체 결합에 의해 효능이 저하될 수 있으며, 또한 피하 조직에 고분자량의 인슐린이 고농도로 연장하여 존재하기 때문에 지방조직위축증과 같은 주사 부위 반응을 나타낼 수 있다. 게다가, 이러한 페길화 인슐린은 보다 낮은 분포 용적을 나타내며, 이는 특히 당뇨병 치료에 불리하다.
또한, 방출된 인슐린 접합체의 약동학 프로파일은 투여 후 즉시 초기 버스트-유사 방출하는 것을 특징으로 하고, 그러한 방출은 인슐린 접합체의 혈장 농도 감소로 이어지고 결국 이후의 수일 동안에 인슐린 접합체의 혈장 농도 증가로 나타난다. 이러한 약동학 프로파일은 미세캡슐화 약물 제형에서 전형적으로 나타나는 것으로 이와 같은 제형으로 치료받은 환자에게서 예측할 수 없는 혈당 반응을 초래할 수 있다.
따라서, 고분자량 실체의 영구적 부착에 의해 인슐린 약동학이 저해받지 않는 지속형 인슐린 개발의 과제가 남는다.
인슐린이 분자내 3개의 디설파이드 브릿지의 존재와 연관이 있는 부반응을 쉽게 겪는 것으로 알려져 있는 사실에 의해 상황이 더욱 복잡하다. 예를 들면, 인슐린은 디설파이드 결합의 분해에 의해 A 쇄와 B 쇄로 분열되거나 디설파이드 교환 반응으로 인해 이량체 또는 올리고머가 형성될 수 있다. 이러한 디설파이드 재편은 인슐린 분자들이 무작위로 강제로 밀접하게 접촉하게 되는 경우 특히 발생한다("Stability of insulin: studies on the physical and chemical stability of insulin in pharmaceutical formulation", Jens Brange, Springer, 1994). 인슐린 분자의 그러한 본질적인 불안정성은 지속형 데포 개발에 상당한 저해 요인이 되었고, 광범위한 디설파이드 교환으로부터 발생하는 여러 가지 분해 산물을 생성하는 것으로 잘 알려진 무정형 침전물과 비슷한 방식으로 인슐린이 캡슐화되는 다른 고분자 제형의 사용을 방해하였다.
부반응율은 또한 인슐린의 농도에 의해 영향을 받으며, 그 비율은 인슐린이 고 농도로 존재할 때 더 높게 나타난다. 이에, 바람직하지 않은 부반응이 인슐린에 발생하지 않는 고농도 지속형 인슐린 제형을 제형화하는 것에 도전하고 있다.
따라서, 투여들간의 전체 기간 내내 구조적으로 완전한 인슐린을 연속적으로 방출하고 동시에 환자에게 잠재적으로 해로울 수 있는 지나치게 높거나 지나치게 낮은 인슐린 농도를 피하기 위해 최고 혈장 인슐린 농도와 최저 혈장 인슐린 농도 사이의 비율을 낮게 유지하는 새로운 지속형 인슐린 제제가 필요한 것은 분명하다.
당뇨병을 위한 인슐린의 처방은 고도로 개별적이며, 용량은 췌장 베타 세포 기능, 인슐린 민감성, 체중 및 식이섭취를 포함한 몇 가지 생리학적 요인에 의해 좌우된다. 환자가 1일 40 IU 이상의 인슐린을 필요로 하는 것이 흔치 않은 것은 아니다. 이것은 주당 12.6 mg의 사람 인슐린에 상당하는 280 IU/주이다. 환자의 불쾌감을 최소화하기 위해, 인슐린은 소량(예, 1 밀리리터)으로 제형화되어야 한다. 따라서, 본 발명의 목적은 구조적으로 완전한 인슐린을 계속해서 방출하고 실질적으로 버스트가 없는 약동학 프로파일을 전개하면서 인슐린의 농도가 적어도 10 mg/mL인 인슐린 제형을 제공하는데 있다. 또한, 궁극적으로 본 발명의 목적은 지속형 인슐린의 단회 용량이 적어도 10 mg의 인슐린 화합물을 함유한 제형의 단회 주사로서 투여될 수 있도록 하는 데에 있다.
US2007/0207210 A1은 고분자량 단백질, 특히 항체의 무정형 미립자를 제조하는 방법을 제시한다. 이 내용에 따르면 인슐린이 400 mg/mL까지 제형화되는 것으로 예시되어 있다. 그러나, 이 발명의 목적은 지속적인 방출을 제공하는데 있는 것이 아니라 천연 단백질과 유사한 약동학 프로파일을 갖는 제형을 제공하는데 있다. 따라서, US2007/0207210 A1은 인슐린의 투여 횟수를 줄이는 해결책을 제안하는 것은 아니다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해 일부 용어를 아래에 기술되 바와 같이 정의한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 버스트(burst)가 없음" 또는 "실질적으로 버스트가 없는"(양쪽 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다)은 프로드럭 또는 활성 인슐린 화합물일 수 있는 인슐린 화합물의 투여시 예를 들면 피하 또는 근육내 투여 후 최초 48시간 동안에 혈장에서 검출가능한 인슐린 화합물의 최고 농도 대 투여 후 최초 48시간 동안에 혈장에서 검출가능한 인슐린 화합물의 최저 농도의 비율이 2 미만(실질적으로 검출가능한 버스트가 없음), 바람직하게는 1.5 미만(검출가능한 버스트 없음)임을 의미하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "버스트"는 프로드럭 또는 활성 인슐린 화합물일 수 있는 인슐린 화합물의 투여시 예를 들면 피하 또는 근육내 투여 후 최초 48시간 동안에 혈장에서 검출가능한 인슐린 화합물의 최고 농도 대 투여 후 최초 48시간 동안에 혈장에서 검출가능한 인슐린 화합물의 최저 농도의 비율이 2 이상임을 의미하도록 의도된다.
혈중에서 인슐린 화합물을 검출하는 것과 관련하여, 해당 인슐린 화합물은 투여된 인슐린 화합물의 구조적으로 완전한 형태일 수 있거나, 해당 인슐린 화합물이 프로드럭인 경우 검출가능한 인슐린 화합물은 사람 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 유도체 및 이의 절편과 같은 프로드럭으로부터 방출된 완전한 인슐린 화합물일 것이다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1 화합물"은 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2, GLP-1 유사체(GLP-1 효능제 포함)와 같은 모든 GLP-1 화합물을 의미한다. 본원에 사용된 GLP-1 효능제의 예는 GLP-1, 엑센딘-3 또는 엑센딘-4 효능제이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다:
(i) 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 N-말단 변형을 포함하는 다른 아미노산 잔기로 치환된 엑센딘-4 유사체 및 아미드화 엑센딘-4 유사체;
(ii) 절단형 엑센딘-4 및 아미드화 절단형;
(iii) 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체된 절단형 엑센딘-4 및 아미드화 절단형;
(iv) GLP-1 및 아미드화 GLP-1;
(v) 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 N-말단 변형을 포함하는 다른 아미노산 잔기로 대체된 GLP-1 유사체 및 아미드화 GLP-1 유사체;
(vi) 절단형 GLP-1 및 아미드화 절단형;
(vii) 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체된 절단형 GLP-1 및 아미드화 절단형;
(viii) 공지 물질 AVE-0010(ZP-10)(Sanofi-Aventis Zealand Pharma), BAY-73-7977(Bayer), TH-0318, BIM-51077(Ipsen, Tejin, Roche), NN-2211(Novo Nordisk), LY315902.
GLP-1 효능제는 GLP-1이 인슐린분비성이고 당뇨병의 치료에 유익한 작용을 발휘하는 수용체(들)와 결합함으로써 또는 뇨의 흐름, 위배출의 지연, 포만감의 유도, 요로 나트륨 배설의 증가 및/또는 뇨칼륨 농도의 감소에 미치는 엑센딘의 효과를 모사함으로써, 즉 엑센딘에 의해 이들 효과가 유발되는 수용체(들)에 결합함으로써 천연 GLP-1의 활성을 모사한다.
본원에 사용된 용어 "최대/최저 비"는 투여 사이의 주어진 기간 내의 사람 인슐린 등의 인슐린 화합물의 최고 혈장 농도와 최저 혈장 농도 사이의 비를 의미하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "구조적으로 완전한 인슐린 화합물"은 A-쇄와 B-쇄로 불리는 두 개 펩타이드가 두 개의 디설파이드-브릿지에 의해 연결되어 이루어진 완전한 인슐린을 의미하도록 의도된다. 추가로, A-쇄는 분자내 디설파이드-브릿지를 함유한다. A-A 또는 B-B 동종 이량체와 같은 두 쇄의 분자내 또는 분자간 디설파이드 브릿지 또는 재배열의 손실은 인슐린 불활성화를 일으킨다. 구조적 완전성은 인슐린을 엔도-gluC와 같은 적합한 엔도프로테아제로 분해시키고 생성된 절편에 대해 질량분석을 실시하여 측정한다. 단일 인슐린 쇄로부터 발생하는 신호의 부재는 완전한 인슐린을 가리킨다. 본원에 사용된 용어 "프로드럭"은 약리학적 효과를 나타내기 전에 생체변환을 겪는 인슐린 화합물을 의미하도록 의도된다. 따라서, 프로드럭은 모 분자에서 원치않는 특성을 바꾸거나 제거하기 위해 일시적인 양상으로 사용되는 특화된 무독성 보호 그룹을 함유한 생물학적 활성 모이어티(moiety)로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 프로드럭은 생가수분해성 아미드 및 생가수분해성 에스테르일 수 있으며 또한 a) 프로드럭내 생가수분해성 작용기가 포함되어 있는 화합물 및 b) 주어진 작용 그룹에서 생물학적으로 산화 또는 환원될 수 있는 화합물을 포함한다. 전형적인 프로드럭은 향상된 생리화학적 또는 약동학적 특성을 제공하고 생체 내에서 보통 가수분해 절단에 의해 쉽게 제거될 수 있는 일시적 담체 그룹과 해당 활성제의 일시적 결합을 함유하는 담체-연결된 프로드럭 또는 담체 그룹의 절단이 활성화 그룹의 노출 후에만 유효한 캐스케이드 프로드럭일 수 있다.
생체 내에서 인슐린과 같은 약물의 생리화학적 또는 약동학적 특성을 증강시키기 위해, 그러한 약물은 담체와 접합될 수 있다. 약물이 담체 및/또는 링커에 일시적으로 결합되는 경우, 이러한 계는 흔히 담체-연결될 프로드럭으로 지정된다. IUPAC에 의해 제공된 정의에 따르면(2009년 7월 22일에 http://www.qmul.ac.uk/iupac.medchem에 접속하여 얻음), 담체-연결된 프로드럭은 향상된 생리화학적 또는 약동학적 특성을 생성하고 보통 가수분해 절단에 의해 생체 내에서 쉽게 제거될 수 있는 일시적 담체 그룹과 해당 활성제의 일시적 연결을 함유하는 프로드럭이다.
이러한 담체-연결된 프로드럭에 사용된 링커는 일시적이며, 이것은 이들이 예를 들어 1시간 내지 3개월의 반감기 범위에서 생리적 조건(pH 7.4, 37℃에서의 수성 완충액) 하에서 비효소적으로 가수분해적으로 분해될 수 있음(절단될 수 있음)을 의미한다.
적합한 담체는 고분자이며 링커에 직접 연결되거나 비절단성 스페이서를 통해 직접 접합될 수 있다. 용어 "인슐린-하이드로겔 프로드럭"은 인슐린이 하이드로겔 담체에 일시적으로 연결된 프로드럭을 가리킨다. 용어 "하이드로겔 프로드럭" 및 "하이드로겔-연결된 프로드럭"은 하이드로겔에 일시적으로 연결된 생물학적 활성제의 프로드럭을 가리키며 같은 뜻으로 사용된다.
용어 "약물", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 모이어티", "생물학적 활성제", "활성제" 등은 이들로 한정되는 것은 아니지만 바이러스, 세균, 진균, 식물, 동물 및 사람을 포함한 생물학적 유기체의 어떠한 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 모든 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용된 생물학적 활성 분자는 사람 또는 기타 동물의 질환을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하기 위한 목적 또는 사람 또는 동물의 육체적 또는 정신적 건강을 증강시키기 위한 목적의 모든 물질을 포함한다.
본원에 사용된 인슐린의 "치료학적 유효량"은 해당 질환 및 이의 합병증의 임상적 증상을 치유, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양을 의미한다. 이를 달성하기에 적절한 양이 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 각 목적에 대한 유효량은 질환 또는 상처의 중증도 또는 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태에 의해 결정될 것이다. 적절한 용량의 결정은 숙련 의사의 통상적인 기술에 속하는 것으로 관행적인 실험을 사용하여 수치의 매트릭스를 설계하고 매트릭스내의 다른 포인트를 시험함으로써 달성할 수 있음은 이해할 수 있다.
"안정한" 및 "안정성"은 표기된 보관 시간 내에 하이드로겔 접합체가 접합 상태를 유지하고 실질적인 정도로 가수분해되지 않으며 인슐린과 관련하여 허용되는 불순물 프로파일을 나타내는 것을 의미한다. 안정성을 고려할 때 조성물은 약물을 유리 형태로 5% 미만 함유한다.
본원에 사용된 용어 "생가수분해성 에스테르"는 a) 모 물질의 생물학적 활성을 저해하지 않지만 그 물질에 작용 지속, 작용 개시 등과 같은 유리한 생체내 특성을 부여하거나 b) 생물학적으로 불활성이지만 환자에 의해 생체 내에서 생물학적 활성제로 쉽게 전환되는 화합물의 에스테르이다.
본원에 사용된 용어 "생가수분해성 아미드"는 a) 모 물질의 생물학적 활성을 저해하지 않지만 그 물질에 작용 지속, 작용 개시 등과 같은 유리한 생체내 특성을 부여하거나 b) 생물학적으로 불활성이지만 환자에 의해 생체내에서 생물학적 활성제로 쉽게 전환되는 화합물의 아미드이다.
본원에 사용된 용어 "하이드로겔"은 다량의 물을 흡수할 수 있는 삼차원 친수성 또는 양친매성 고분자 네트워크를 의미하도록 의도된다. 네트워크는 동종 중합체 또는 공중합체로 구성되며 화학적 또는 물리적(이온성, 소수성 상호작용, 엉킴) 가교 결합의 존재로 인해 불용성이다. 가교결합은 네트워크 구조 및 물리적 완전성을 제공한다. 하이드로겔은 물과 열역학적 양립성을 나타내어 물에 의해 수성 매질에서 팽창한다. 네트워크의 쇄는 기공이 존재하고 이들 기공의 실질적인 부분이 1 nm 내지 1000 nm의 치수가 되는 방식으로 연결된다.
용어 "겔"은 비가교된 젤리 같은 고분자 용액을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "데포(depot)"는 연장된 기간에 걸쳐 활성 인슐린 화합물을 지속적으로 방출할 수 있는 인슐린 화합물의 약물 전달 시스템, 전형적으로는 피하 또는 근육내 주사로 투여하는 약물 전달 시스템을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "최고 농도"는 인슐린 화합물의 투여 후 획득한 가장 높은 농도를 의미하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 화합물"은 CysA7과 CysB7 사이에 및 CysA20과 CysB19사이에 디설파이드 브릿지 및 CysA6와 CysA11 사이의 내부 디설파이드 브릿지를 갖는 사람 인슐린, 돼지 인슐린 또는 소 인슐린과 같은 포유류 기원의 모든 인슐린, 재조합 사람 인슐린과 같은 재조합 포유류 인슐린, 이들의 인슐린 유사체, 인슐린 유도체 및 절편을 의미하며, 전형적인 예는 rh 인슐린, 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머, 인슐린 글루리신, 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로, 저분자량 PEG에 접합된 인슐린(여기서, 저분자량 PEG는 10 kDa보다 작은 분자량을 갖는다)을 포함한다. 인슐린 화합물은 프로드럭의 형태일 수 있으며, 이 경우에 혈장에 방출되는 화합물은 프로드럭의 투여 후 형성되는 활성 인슐린이다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 유사체(insulin analogue)"는 형식적으로 천연 인슐린의 구조(예, 사람 인슐린의 구조)로부터 천연 인슐린에서 일어나는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실 및/또는 치환 및/또는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가에 의해 유도될 수 있는 분자 구조를 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 부가 및/또는 치환된 아미노산 잔기는 암호화 가능한 아미노산 잔기이거나 다른 천연 잔기 또는 전적으로 합성된 아미노산 잔기일 수 있다.
인슐린 유사체는 B 쇄의 위치 28이 천연 Pro 잔기로부터 Asp, Lys 또는 Lie중 하나로 치환되는 것일 수 있다. 다른 관점으로서, 위치 B29의 Lys가 Pro로 치환된다. 또한, 위치 A21의 Asn이 Ala, Gln, Glu, Gly, His, Lie, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val로 치환될 수 있으며, 특히 Gly, Ala, Ser 또는 Thr로, 바람직하게는 Gly로 치환될 수 있다. 또한, 위치 B3의 Asn이 Lys 또는 Asp로 치환될 수 있다. 인슐린 유사체의 다른 예는 des(B30) 사람 인슐린, des(B30) 사람 인슐린 유사체, PheB1이 결실된 인슐린 유사체, A-쇄 및/또는 B-쇄가 N-말단 연장을 갖는 인슐린 유사체 및 A-쇄 및/또는 B-쇄가 C-말단 연장을 갖는 인슐린 유사체이다. 따라서, 한 개 또는 두 개의 Arg가 위치 B1에 부가될 수 있다.
"desB30 인슐린" 또는 "desB30 사람 인슐린"은 B30 아미노산 잔기가 결실된 천연 인슐린 또는 이의 유사체를 의미한다. 유사하게, "desB29desB30 인슐린" 또는 "desB29desB30 사람 인슐린"은 B29 및 B30 아미노산 잔기가 결실된 천연 인슐린 또는 이의 유사체를 의미한다.
"B1", "A1" 등은 각각 인슐린의 B-쇄에서 위치 1(N-말단으로부터 번호 지정)의 아미노산 잔기 및 인슐린의 A-쇄에서 위치 1(N-말단으로부터 번호 지정)의 아미노산 잔기를 의미한다. 또한, 특정 위치의 아미노산 잔기가 예를 들면 PheB1로서 표기될 수 있고, 이 예는 위치 B1의 아미노산 잔기가 페닐알라닌 잔기임을 의미한다.
"비-활성 링커"는 생물학적 활성제로부터 유도된 약물의 약리학적 효과를 보이지 않는 링커를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 탄소의 직쇄 또는 측쇄를 의미한다. 알킬 탄소의 각 수소는 치환체에 의해 대체될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C1 -4 알킬"은 예를 들어 분자의 말단에 존재하는 경우 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸이거나, 분자의 두 모이어티가 알킬 그룹에 의해 연결되는 경우 예를 들어 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-로서 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 의미한다. C1 -4 알킬 탄소의 각 수소는 치환체에 의해 대체될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C1-6 알킬"은 예를 들어 분자의 말단에 존재하는 경우 C1-4 알킬, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실이거나, 분자의 두 모이어티가 알킬 그룹에 의해 연결되는 경우 예를 들어 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-로서, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 의미한다. C1-6 알킬 탄소의 각 수소는 치환체에 의해 대체될 수 있다.
따라서, "C1 -18 알킬"은 1 내지 18개 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미하고 "C8-18 알킬"은 8 내지 18개 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미한다. 따라서, "C1 -50 알킬"은 1 내지 50개 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미한다
본원에 사용된 용어 "C2-50 알케닐"은 예를 들어 분자의 말단에 존재하는 경우 -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CH-CH2-CH3, -CH=CH-CH=CH2이거나, 분자의 두 모이어티가 알케닐 그룹에 의해 연결되는 경우 예를 들어 -CH=CH-로서, 2 내지 50개 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 비측쇄 알케닐 쇄를 의미한다. C2 -50 알케닐 탄소의 각 수소는 별도로 특정되는 바와 같이 치환체에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 용어 "알케닐"은 적어도 한 개의 탄소 탄소 이중 결합을 갖는 탄소 쇄와 연관이 있다. 임의로 한 개 이상의 삼중 결합이 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C2 -50 알키닐"은 예를 들어 분자의 말단에 존재하는 경우 -C≡CH, -CH2-C≡CH, CH2-CH2-C≡CH, CH2-C≡C-CH3이거나 분자의 두 모이어티가 알키닐 그룹에 의해 연결되는 경우 -C≡C-로서 2 내지 50개 탄소 원자를 갖는 측쇄 또는 비측쇄 알키닐 쇄를 의미한다. C2-50 알키닐 탄소의 각 수소는 별도로 특정되는 바와 같이 치환체에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 용어 "알키닐"은 적어도 한 개의 탄소 탄소 삼중 결합을 갖는 탄소 쇄와 연관이 있다. 임의로 한 개 이상의 이중 결합이 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C3-7 사이클로알킬" 또는 "C3-7 사이클로알킬 고리"는 적어도 부분적으로 포화된 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있는 3 내지 7개 탄소 원자를 갖는 사이클릭 알킬 쇄를 의미하며, 예로서 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸을 들 수 있다. 사이클로알킬 탄소의 각 수소는 치환체에 의해 대체될 수 있다. 용어 "C3 -7 사이클로알킬" 또는 "C3 -7 사이클로알킬 고리"는 또한 노르보난 또는 노르보넨과 같이 가교된 바이사이클을 포함한다. 따라서, "C3-5 사이클로알킬"은 3 내지 5개 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬을 의미한다.
따라서, "C3-10 사이클로알킬"은 3 내지 10개 탄소 원자를 갖는 사이클릭 알킬을 의미하며, 예로서 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실의 C3 -7 사이클로알킬을 들 수 있다. 또한, 용어 "C3 -10 사이클로알킬"은 적어도 부분적으로 포화된 카르보모노 및 바이사이클을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다. 일반적으로 바람직한 할로겐은 플루오로 또는 클로로이다.
본원에 사용된 용어 "4 내지 7원 헤테로사이클릴" 또는 "4 내지 7원 헤테로사이클"은 1 내지 4개 고리 원자가 황(-S(O)-, -S(O)2-을 포함), 산소 및 질소(=N(O)-를 포함)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 헤테로원자에 의해 대체되고, 고리가 탄소 또는 질소 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 연결되며, 이중 결합(완전 포화, 부분 포화 또는 불포화 방향족 또는 비방향족 고리)을 최대 수까지 함유할 수 있는 4, 5, 6 또는 7개 고리 원자를 갖는 고리를 의미한다. 4 내지 7원 헤테로사이클의 예로는 아제티딘, 옥세탄, 티에탄, 푸란, 티오펜, 피롤, 피롤린, 이미다졸, 이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 옥사졸, 옥사졸린, 이소옥사졸, 이소옥사졸린, 티아졸, 티아졸린, 이소티아졸, 이소티아졸린, 티아디아졸, 티아디아졸린, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로티오펜, 피롤리딘, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 옥사졸리딘, 이소옥사졸리딘, 티아졸리디딘, 이소티아졸리딘, 티아디아졸리딘, 설포란, 피란, 디하이드로피란, 테트라하이드로피란, 이미다졸리딘, 피리딘, 피리다진, 피라진, 피리미딘, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 테트라졸, 트리아졸, 트리아졸리딘, 테트라졸리딘, 디아제판, 아제핀 또는 호모피페라진을 들 수 있다.
본원에 사용된 용어 "9 내지 11원 헤테로바이사이클릴" 또는 "9 내지 11원 헤테로바이사이클"은 적어도 한 개의 고리 원자가 양쪽 고리에 의해 공유되고, 1 내지 6개 고리 원자가 황(-S(O)-, -S(O)2-을 포함), 산소 및 질소(=N(O)-를 포함)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 헤테로원자에 의해 대체되고 고리가 탄소 또는 질소 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 연결되며 이중 결합(완전 포화, 부분 포화 또는 불포화 방향족 또는 비방향족 고리)의 최대 수까지 함유할 수 있는 9 내지 11개 고리 원자를 갖는 2개 고리의 헤테로사이클릭계를 의미한다. 9 내지 11원 헤테로바이사이클의 예로는 인돌, 인돌린, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤조옥사졸, 벤즈이소옥사졸, 벤조티아졸, 벤즈이소티아졸, 벤즈이미다졸, 벤즈이미다졸린, 퀴놀린, 퀴나졸린, 디하이드로퀴나졸린, 퀴놀린, 디하이드로퀴놀린, 테트라하이드로퀴놀린, 데카하이드로퀴놀린, 이소퀴놀린, 데카하이드로이소퀴놀린, 테트라하이드로이소퀴놀린, 디하이드로이소퀴놀린, 벤즈아제핀, 퓨린 또는 프테리딘을 들 수 있다. 9 내지 11원 헤테로사이클은 또한 1,4-디옥사-8-아자스피로[4,5]데칸과 같은 두개 고리의 스피로 구조 또는 8-아자-바이사이클로[3.2.1]옥탄과 같은 가교된 헤테로사이클을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 바람직하게는 사람에 사용하기 위해 EMEA(유럽) 및/또는 FDA(미국)와 같은 규제 기관 및/또는 임의의 다른 국가의 규제 기관에 의해 승인된 것임을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물" 또는 "조성물"은 하나 이상의 활성 성분 및 하나 이상의 불활성 성분뿐만 아니라 이들 성분 중 둘 이상이 배합, 혼합 또는 응집하여 또는 이들 성분 중 하나 이상이 분해되어 또는 이들 성분 중 하나 이상이 다른 반응 또는 상호작용 유형으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 발생되는 모든 생성물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물과 약제학적으로 허용되는 부형제(약제학적으로 허용되는 담체)를 혼합하여 제조된 모든 조성물을 포함한다.
약물의 "유리 형태"는 예를 들어 고분자 접합체로부터 방출된 후 변형되지 않은 약리학적 활성 형태의 약물을 가리킨다.
"건식 조성물"은 인슐린 하이드로겔 프로드럭 조성물이 용기에 건조 형태로 제공된다는 것을 의미한다. 적합한 건조 방법은 분무건조 및 동결건조이다. 인슐린 하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물은 잔여 수분 함량이 최대 10%, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 2% 미만(Karl Fischer에 따라 결정됨)이다. 바람직한 건조 방법은 동결건조이다. "동결건조 조성물"은 인슐린 하이드로겔 고분자 프로드럭 조성물이 우선 동결되고 후속적으로 감압 수단에 의해 수분이 감소된 것을 의미한다. 이 용어는 최종 용기 내로 조성물을 충진하기 전에 제조 과정에서 진행되는 추가의 건조 단계를 배제하지 않는다.
"동결건조"는 조성물을 동결시킨 다음 주변 압력을 감소시키고 임의로 가열하여 조성물 내의 동결수가 고체상으로부터 기체로 직접 승화되도록 하는 것을 특징으로 하는 탈수 공정이다.
"재구성(reconstitution)"은 액체를 첨가하여 조성물의 본래 형태로 재구성시킨 것을 의미한다.
"재구성 용액"은 인슐린 하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기 전에 재구성하기 위해 사용된 액체를 가리킨다.
"용기"는 인슐린 하이드로겔 프로드럭 조성물을 담고 재구성시까지 저장할 수 있는 모든 용기를 의미한다.
본원에 사용된 인슐린의 "치료학적 유효량"은 해당 질환 및 이의 합병증의 임상적 증상을 치유, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양을 의미한다. 이를 달성하기에 적절한 양이 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 각 목적에 대한 유효량은 질환 또는 상처의 중증도 또는 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태에 의해 결정될 것이다. 적절한 용량의 결정은 숙련 의사의 통상적인 기술에 속하는 것으로 관행적인 실험을 사용하여 수치의 매트릭스를 설계하고 매트릭스내의 다른 포인트를 시험함으로써 달성할 수 있음은 이해될 것이다.
"완충액" 또는 "완충제"는 pH를 목적하는 범위로 유지시키는 화학적 화합물을 가리킨다. 생리학적으로 허용되는 완충제는 예를 들어 인산, 숙신산, 히스티딘, 중탄산, 시트르산과 아세트산, 황산, 질산, 염산, 피루브산의 나트륨이다. 또한 Mg(OH)2 또는 ZnCO3와 같은 제산제가 사용될 수 있다. 완충 능력은 조건들이 pH 안정성에 가장 민감하게 반응하도록 조절될 수 있다.
"부형제"는 치료제와 함게 투여되는 화합물을 가리키며, 예로서 완충제, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 항흡착제, 산화 보호제 또는 기타 보조제를 포함한다. 그러나, 일부 경우에 한 가지 부형제가 이중 또는 삼중 기능을 가질 수 있다.
"동결건조 보호제"는 해당 단백질과 배합되었을 때 일반적으로 건조시 및 특히 동결건조하고 후속으로 저장하는 동안 그 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 상당히 방지하거나 감소시키는 분자이다. 동결건조 보호제의 예는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 당; 아르기닌, 글라이신, 글루타메이트 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인과 같은 메틸아민; 황산마그네슘과 같은 이액성 염; 3가 이상의 당 알코올(예, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨)과 같은 폴리올; 에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스; 하이드록시알킬 전분(예, 하이드록시에틸 전분(HES)); 및 이의 배합물을 포함한다.
"계면활성제"는 액체의 표면 장력을 낮춰주는 습윤제를 가리킨다.
"등장성 조절제"는 주사 데포에서의 삼투압 차이로 인해 세포 손상으로부터 기인할 수 있는 통증을 최소화해 주는 화합물을 가리킨다.
용어 "안정화제"는 고분자 프로드럭을 안정화시키는데 사용되는 화합물을 가리킨다. 안정화는 단백질-안정화력의 강화에 의해, 변성 상태의 탈안정화에 의해 또는 단백질에의 부형제의 직접적인 결합에 의해 달성된다.
"항흡착제"는 주로 이온성 또는 비이온성 계면활성제 또는 조성물의 용기의 내부 표면에 경쟁적으로 흡착하거나 피복하기 위해 사용되는 다른 단백질 또는 용해성 고분자를 가리킨다. 부형제의 농도 및 유형의 선택은 방지하고자 하는 효과의 의해 좌우되지만 전형적으로 계면활성제의 단층은 CMC 값 바로 위의 계면에서 형성된다.
"산화 보호제"는 아스코르브산, 엑토인, 메티오닌, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 모린, 폴리에틸렌이민(PEI), 프로필 갈레이트, 비타민 E와 같은 산화 보호제, 시트르산, EDTA, 헥사포스페이트, 티오글리콜산과 같은 킬레이트제를 가리킨다.
"항균제"는 세균, 진균, 효모, 원생생물과 같은 미생물을 살해시키거나 미생물의 성장을 억제하고/하거나 바이러스를 파괴시키는 화학 물질을 가리킨다.
"용기의 밀봉"은 용기가 밀폐되어 외부와 내부 사이에 기체 교환이 일어나지 않고 내용물이 무균으로 유지되도록 하는 방식으로 닫혀있음을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는"은 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 저해하지 않고 활성 성분이 투여되는 숙주에게 독성이 없는 모든 부형제 및/또는 첨가제를 포괄하는 의미이다.
용어 "시약"은 본 발명의 프로드럭을 유도하는 제조 공정에 사용되는 중간체 또는 출발물질을 가리킨다.
용어 "화학적 작용 그룹"은 카르복실산 및 활성화된 유도체, 아미노, 말레이미드, 티올 및 유도체, 설폰산 및 유도체, 카르보네이트 및 유도체, 카르바메이트 및 유도체, 하이드록실, 알데하이드, 케톤, 하이드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 인산 및 유도체, 포스폰산 및 유도체, 할로아세틸, 알킬 할라이드, 아크릴로일 및 다른 알파-베타 불포화 마이클 수용체, 아릴 플루오라이드와 같은 아릴화제, 하이드록실아민, 피리딜 디설파이드와 같은 디설파이드, 비닐 설폰, 비닐 케톤, 디아조알칸, 디아조아세틸 화합물, 옥시란 및 아지리딘을 가리킨다.
화학적 작용 그룹이 다른 화학적 작용 그룹에 커플링되는 경우, 생성된 화학 구조를 "결합"이라고 한다. 예를 들어, 카르복실 그룹과 아민 그룹의 반응은 아미드 결합을 생성한다.
"반응성 작용 그룹"은 고분지 모이어티에 연결되어 있는 골격 모이어티의 화학적 작용 그룹이다.
"작용 그룹"은 "반응성 작용 그룹", "분해성 상호연결 작용 그룹" 또는 "접합 작용 그룹"을 위해 사용되는 포괄적 용어이다.
"분해성 상호연결 작용 그룹"은 한쪽 편에는 골격 모이어티에 연결된 스페이서 모이어티가 연결되어 있고 반대 편쪽에는 가교 모이어티에 연결되어 있는 생분해성 결합을 포함한 결합이다. 용어 "분해성 상호연결 작용 그룹", 생분해성 상호연결 작용 그룹", "상호연결 생분해성 작용 그룹" 및 "상호연결 작용 그룹"은 같은 뜻으로 사용된다.
용어 "차단 그룹" 또는 "캡핑 그룹은 동의어로 사용되며 반응성 작용 그룹에 비가역적으로 연결되어 이들이 예를 들어 화학적 작용 그룹과 반응할 수 없도록 하는 모이어티를 가리킨다.
용어 "보호 그룹"은 반응성 작용 그룹과 가역적으로 연결되어 이들이 예를 들어 다른 화학적 작용 그룹과 반응할 수 없도록 하는 잔기를 가리킨다.
용어 "상호연결성 작용 그룹"은 라디칼 중합 반응에 참여하고 가교제 시약 또는 골격 시약의 일부인 화학적 작용 그룹을 가리킨다.
용어 "중합성 작용 그룹"은 라이게이션형 중합 반응에 참여하고 가교제 시약 또는 골격 시약의 일부인 화학적 작용 그룹을 가리킨다.
상호연결된 작용 그룹에 관해서 본 발명에서 사용된 용어 "가수분해적으로 분해가능한"은 1시간 내지 3개월 범위의 반감기로 생리학적 조건(pH 7.4, 37℃의 수성 완충액) 하에서 비효소적으로 가수분해적으로 분해가능한 또는 절단가능한 결합 및 연결을 가리키며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 아코니틸, 아세탈, 아미드, 카르복실 무수물, 에스테르, 이민, 하이드라존, 말레암산 아미드, 오르토 에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴 에스테르, 실릴 에스테르, 설폰 에스테르, 방향족 카르바메이트, 이의 조합 등을 포함한다. 바람직한 생분해성 연결은 카르복실 에스테르, 카르보네이트, 포스포에스테르 및 설폰산 에스테르이며, 가장 바람직한 것은 카르복실 에스테르 또는 카르보네이트이다. 시험관내 연구시 예를 들어 pH 9, 37℃ 수성 완충액과 같은 가속 조건이 실질적인 목적을 위해 사용될 수 있음은 이해되어야 한다.
골격 모이어티는 한쪽 말단에서 골격 모이어티에 결합되고 반대쪽 말단에서는 가교 모이어티에 연결되는 스페이서 모이어티를 포함할 수 있다.
용어 "유도체"는 보호 그룹 및/또는 활성화 그룹으로 적절히 치환된 화학적 작용 그룹 또는 본 분야의 전문가에게 알려져 있는 상응하는 화학적 작용 그룹의 활성화 형태를 가리킨다. 예를 들어, 카르복실 그룹의 활성화 형태는 이들로 한정되는 것은 아니지만 석신이미딜 에스테르, 벤조트리아질 에스테르, 니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 아자벤조트리아질 에스테르와 같은 활성 에스테르, 아실 할로겐화물, 혼합 또는 대칭 무수물, 아실 이미다졸을 포함한다.
용어 "비-효소적 분해성 링커"는 효소 활성없이 생리 조건 하에서 가수분해되는 링커를 가리킨다.
"비생물학적 활성 링커"는 생물학적 활성 모이어티로부터 유도된 약물(D-H)의 약물학적 효과를 나타내지 않는 링커를 의미한다.
용어 "스페이서", "스페이서 그룹", "스페이서 분자" 및 "스페이서 모이어티"는 상호교환적으로 사용되며, 본 발명의 하이드로겔 담체에 존재하는 모이어티를 기술하기 위해 사용되는 경우 C1 -50 알킬, C2 -50 알케닐 또는 C2 -50 알키닐과 같이 두 개의 모이어티를 연결하는데 적합한 모든 모이어티를 가리키며, 이의 절편은 -NH-, -N(C1 -4 알킬)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, 4 내지 7원 헤테로사이클릴, 페닐 또는 나프틸에 의해 임의로 차단된다.
용어 "말단"은 분자 또는 모이어티 내의 작용 그룹 또는 결합의 위치를 가리키며, 그럼으로써 그러한 작용 그룹은 화학적 작용 그룹일 수 있고 결합은 두 모이어티 사이의 결합에 인접하여 위치하거나 결합 내에 위치하거나 올리고머 또는 폴리머 쇄의 말단에 위치함으로써 특징지어지는 분해성 또는 영구성 결합일 수 있다.
용어 "결합 형태" 또는 "모이어티"는 보다 큰 분자의 일부인 하위구조를 가리킨다. 용어 "결합 형태"는 본 분야에 잘 알려진 시약, 출발물질 또는 가상 출발물질을 지명하거나 열거함으로써 모이어티들을 간편하게 언급하기 위해 사용되며, 그럼으로써 결합 형태는 예를 들어 시약 또는 출발 물질에 존재하는 하나 이상의 수소 라디칼(-H) 또는 하나 이상의 활성화 또는 보호 그룹이 모이어티에 존재하지 않음을 의미한다.
고분자 모이어티를 포함한 모든 시약 및 모이어티는 분자량, 쇄 길이 또는 중합도 또는 작용 그룹의 수에서 다양성을 나타내는 것으로 알려진 거대분자 실체를 가리킨다. 따라서, 골격 시약, 골격 모이어티, 가교 시약 및 가교 모이어티를 위해 나타낸 구조들은 단지 대표적인 예에 불과하다.
시약 또는 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. 시약 또는 모이어티가 둘 이상의 말단 그룹을 갖는 경우 선형 시약 또는 잔기라고 한다. 시약 또는 모이어티가 둘 이상의 말단 그룹을 갖는 경우, 이것은 분지형 또는 다수-작용성 시약 또는 모이어티라고 한다.
용어 "폴리(에틸렌 글리콜) 기반 고분자 쇄" 또는 "PEG 기반 쇄"는 올리고 또는 폴리머 분자 쇄를 가리킨다.
바람직하게는, 그러한 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 고분자 쇄는 분지 중심에 연결되며, 한쪽 말단이 분지 중심에 연결되고 다른쪽 말단이 과분지 수지상 모이어티에 연결되어 있는 선형 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄이다. PEG-기반 쇄는 헤테로원자 및 화학적 작용 그룹으로 임의로 치환된 알킬 또는 아릴 그룹에 의해 말단화되거나 차단될 수 있다.
용어 "폴리(에틸렌 글리콜) 기반 고분자 쇄"는 가교제 시약과 관련하여 사용되는 경우 적어도 20 중량% 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함한 가교제 모이어티 또는 쇄를 가리킨다.
본원에 사용되는 표현은 본원에 특별히 언급되지 않거나 명확하게 상반되게 기술되지 않는 한 단수형 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
설명
본 발명은 기저 인슐린 적용범위를 위한 지속형 인슐린 제제에 관한 것이다. 기저 인슐린은 췌장 베타 세포의 기저 인슐린 배출을 모사하도록 고안된 인슐린 또는 인슐린 유사체의 지속형 제형이다. 최적으로, 혈당은 전체 투여 간격동안에 지속적인 방식으로 효과적으로 조절된다.
본 발명자들은 인슐린 화합물이 피하와 같은 주사용 데포로부터 투여간에 어떠한 버스트 효과도 나타내지 않으면서 구조적으로 완전한 형태로 연속적으로 방출될 수 있음을 발견하였다. 방출된 인슐린 화합물의 구조적 완전성은 인슐린 분자들의 분자간 접촉을 최소화하는 완전히 수화된 고분자 매트릭스에 의해 제공된다. 게다가 인슐린의 버스트를 방지함으로써 환자에 유해한 부작용의 위험이 감소된다.
본 발명은 버스트와 같은 인슐린 방출이 없음으로 인해 투여 후 저혈당증의 위험을 줄여 주고, 투여 기간의 마지막에 저혈당증의 위험을 감소시키며, 주사 횟수를 줄여 주고, 환자에게서 예측가능한 혈장 인슐린 수준을 제공한다.
본 발명의 추가적인 목적은 기존의 일일 기저 인슐린 요법보다 주사 횟수가 적게 필요하며 주사 사이의 전체 시간 간격 내내 구조적으로 완전한 인슐린을 방출함으로써 고수준의 안전성을 제공하면서 최대/최저 비가 2 미만인 신규한 기저 인슐린을 제공하는데 있다.
추가의 이점들이 본 명세서의 내용으로부터 명백히 이해될 수 있다.
제1 관점으로서, 본 발명은 혈장에서의 인슐린 화합물의 치료학적 유효 수준을 적어도 3일 동안, 전형적으로는 적어도 80시간 동안, 예를 들어 1주 또는 그 이상 동안 유지하기에 충분한 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
그러한 농도는 환자마다 다양하며 개별 환자의 치료 용량 범위에 의해 좌우되지만, 치료 효과가 적어도 3일간, 예를 들어 1주일(즉, 약 7일) 동안 나타나도록 하기 위해 농도는 전형적으로 적어도 약 10 mg/ml, 예를 들어 10 mg/ml 이상이다.
따라서, 추가의 관점으로서 본 발명은 적어도 10 mg/ml 농도의 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 적어도 11 mg/ml 농도의 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물이 적어도 10 mg의 단일 용량으로 투여되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 단일 인슐린 화합물 용량은 mg으로 표시되며 약제학적 조성물중의 인슐린 화합물 농도는 mg/ml로 표시된다. 인슐린 화합물이 프로드럭인 경우, 농도는 프로드럭으로부터의 유리 인슐린의 방출량을 기준으로 한다. 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해, 조성물의 분획을, 인슐린 농도의 유의적 증가가 관찰되지 않고 방출된 인슐린의 총량이 결정될 때까지 인슐린-방출 조건(수성 완충액 pH 7.4, 37℃ 또는 상승 pH의 가속 조건)에 적용한다. 용해성 담체의 경우 방출량은 가수분해량과 같은 뜻임을 이해하여야 한다.
본 발명의 한 가지 양태로서 인슐린 화합물의 농도는 적어도 11 mg/ml이고, 예를 들어 11 mg/ml 내지 35 mg/ml, 바람직하게는 15 mg/ml 내지 25 mg/ml, 더 바람직하게는 약 20 mg/ml, 훨씬 더 바람직하게는 약 24 mg/ml이다.
환자(예, 사람)에게 예를 들어 시린지로 유효 용량을 투여하기 위한 투여 용량은 바람직하게는 1.5 ml 미만이고, 전형적으로는 1.0 ml 이하이다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물의 단일 용량은 적어도 5 mg이며, 예를 들어 5 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 50 mg, 더 바람직하게는 5 mg 내지 25 mg이다.
추가의 양태로서, 피하 또는 근육내 주사와 같이 투여 후 최초 48시간 동안 혈장 인슐린 화합물의 최고 농도 대 투여 후 최초 48시간 동안 혈중 인슐린 화합물의 최저 농도의 비율이 2 미만, 전형적으로는 1.5 미만이다.
상기 양태뿐만 아니라 아래 기술된 양태는, 특정적으로 어떤 양태가 본 발명의 특정 관점 또는 여러 관점들에 관한 것으로 지정되지 않는 한, 본원에 기술된 관점중 어느 하나뿐만 아니라 본원에 기술된 양태중 어느 하나를 가리키는 것으로 간주되어야 한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 인슐린 화합물을 포함하고 이 인슐린 화합물을 포유류 혈장에 필수적으로 버스트가 발생하지 않는 방식으로 전달하는 것을 특징으로 하는 조절형 전달 시스템이다.
다른 추가의 양태로서, 약동학 프로파일이 사람 혈장과 같은 포유류 혈장에서 측정된다. 혈장 인슐린 농도는 시판되고 있는 ELISA 키트를 이용하여 인슐린 표준물로부터 얻은 교정 곡선에 결과를 도입함으로써 측정할 수 있다. 통계적 유의성을 위해 실험은 적절한 횟수의 생물학적 및 기술적 반복으로 진행하며, 평균치와 중간치를 계산하여 생물학적 및 기술적 변동성을 조정한다.
추가의 양태로서, 조성물은 2 미만, 전형적으로는 1.75 미만, 바람직하게는 1.5 미만, 더 바람직하게는 1.25 미만의 최대/최저 비를 나타내는데 특징이 있다.
다른 추가의 양태로서, 조성물은 투여들간의 전체 기간 내내 구조적으로 완전한 인슐린 화합물의 연속적인 방출에 특징이 있다.
"연속적인 방출"은 인슐린의 중단되지 않는 방출을 가리킨다.
추가의 양태로서, 투여간 전체 기간은 적어도 약 80시간, 예를 들어 약 110 시간, 전형적으로는 적어도 1주, 예를 들어 1 내지 2주 또는 그 이상이다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 프로드럭이다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 담체-연결된 프로드럭이다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 캐스케이드 프로드럭이다.
프로드럭은 용액 또는 겔과 같은 액체로 투여될 수 있거나, 데포에 함유될 수 있거나, 데포가 프로드럭으로 작용하도록 데포에 통합될 수 있다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 데포에 완전히 함유된다.
용어 "완전히 함유된"은 물 1 ml를 데포 1 ml에 첨가하고, 혼합한 다음, 데포를 물로부터 분리한 후 약물(즉, 인슐린)의 10% 미만이 물분획에 존재하는 데포를 가리킨다.
다른 추가의 양태로서, 데포는 하이드로겔과 같은 고분자 겔이다.
추가의 양태로서, 데포는 완전히 수화된 고분자 매트릭스이다.
인슐린 화합물은 데포에 몇 가지 방식으로 함유될 수 있으며, 예를 들어 인슐린 화합물은 비공유 방식으로 결합될 수 있거나 인슐린 화합물은 데포에 공유 결합될 수 있고, 데포는 이들로 한정되는 것은 아니지만 고분자 겔, 하이드로겔 또는 완전히 수화된 고분자 매트릭스중에서 선택된다. 적합한 고분자의 비한정적 예로는 준-무한 삼차원 완전히 수화된 분자 네트워크를 형성할 수 있는 고분자이다. 이러한 하이드로겔은 폴리(프로필렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 화학적으로 또는 물리적으로 가교된 작용화 또는 비작용화 폴리알킬옥시-기반 고분자, 덱스트란, 키토산, 히알루론산 및 유도체, 알기네이트, 크실란, 만난, 카라기난, 아가로스, 셀룰로스, 전분, 하이드록시에틸 전분(HES) 및 다른 카보하이드레이트-기반 고분자, 폴리(비닐 알코올), 폴리(옥사졸린), 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(카보네이트), 폴리(우레탄), 폴리(아크릴산), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드)(HMPA)와 같은 폴리(아크릴아미드), 폴리(아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트)와 같은 폴리(메타크릴레이트), 폴리(오르가노포스파젠), 폴리(실록산), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(락트산) 또는 폴리(글리콜산)과 같은 폴리(에스테르), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(글루탐산) 또는 폴리 라이신과 같은 폴리(아미노산), 콜라겐, 젤라틴, 공중합체, 그라프트 공중합체, 가교 중합체, 하이드로겔 및 상기 수록된 고분자로부터의 블록 공중합체이다. 이들 고분자는 골격 모이어티 또는 가교 모이어티로 작용할 수 있으며, 공중합체로서 상이한 고분자의 조합이 분자 네트워크의 고수준 수화 조건하에 가능하다. 상기 수록된 고분자 유형의 올리고머성 또는 폴리머성 가교 모이어티 이외에, 저분자량 가교 모이어티가, 특히 친수성 고분자량 골격 모이어티를 하이드로겔 프로드럭 담체의 형성을 위해 사용할 때, 사용될 수 있다.
분자 수준에서 인슐린간 접촉을 최소화하는 한 가지 방안은 완전히 수화된 고분자 매트릭스에 인슐린 분자를 균일하게 분포시키는 것이다. 균일한 분포는 인슐린을 고분자에 공유 결합시켜 달성할 수 있으며, 중성 pH의 수성 환경에서 분해하는 링커를 사용함으로써 구조적으로 완전한 인슐린의 느린 방출이 보장된다.
바람직한 것은 필수적으로 생활성이 없는 고분자-연결된 인슐린 프로드럭이며, 이러한 특성은 모든 인슐린분비 활성이 방출된 인슐린에 기인하도록 한다. 따라서, 프로드럭의 방출 특성을 공학적으로 조작함으로써 혈장 인슐린 농도를 고도로 조절할 수 있다.
인슐린은 이 분자에 의해 제공되는 모든 관련 작용기를 통해 연결될 수 있으며, 생체 아미노산에 의해 제공된 바람직한 작용기는 전형적으로 구아니디노, 이미다졸, 인돌, 카르복시, 카르복사미드, 일차 및 이차 하이드록실, 페놀 및 일차 아미노 중에서 선택된다. 예를 들면, 사람 인슐린은 다음과 같은 관련 작용기를 갖는다: 카르복시, 카르복시아미드, 일차 및 이차 하이드록시, 페놀, 이미다졸 및 일차 아미노.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 프로드럭 담체에 라이신 모이어티와의 공유 결합을 통해 및/또는 인슐린 화합물의 A-쇄 또는 B-쇄의 N-말단과의 공유 결합을 통해 결합될 수 있다.
특히 바람직한 양태로서, 프로드럭 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 인슐린 링커 접합체 D-L(여기서, D는 인슐린 모이어티를 나타내고, -L은 아래 화학식 I로 표시되는 비생물학적 활성 링커 잔기 -L1이다)을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
파선은 아미드 결합 형성에 의한 인슐린의 아미노 그룹들 중 하나에의 부착을 나타내고;
X는 C(R3R3a) 또는 N(R3)이며;
R1a, R3a는 H, NH(R2b), N(R2b)C(O)R4 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
R1, R2, R2a, R2b, R3, R4는 H 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
L1은 한 개의 L2-Z로 치환되며 임의로 추가로 대체되고(단, 화학식 I에서 별표로 표시된 수소는 치환되지 않는다);
L2는 단일 화학 결합 또는 스페이서이며;
Z는 하이드로겔이다.
화학식 I의 화합물이 하나 이상의 산성 또는 염기성 그룹을 함유하는 경우, 또한 본 발명은 그들의 상응하는 약제학적으로 또는 독성학적으로 허용되는 염, 특히 그들의 약제학적으로 이용가능한 염을 포함한다. 따라서, 산성 그룹을 함유하는 화학식 I의 화합물은 본 발명에 따라, 예를 들어 알카리 금속 염, 알카리성 토금속 염 또는 암모늄 염으로서 사용될 수 있다. 이와 같은 염의 보다 정확한 예는 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 암모니아 또는 유기 아민(예, 에틸아민, 에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 아미노산)과의 염이다. 하나 이상의 염기성 그룹, 즉 양자화될 수 있는 그룹을 함유하는 화학식 I의 화합물이 존재할 수 있으며 본 발명에 따라 무기 또는 유기 산과의 부가염 형태로 사용될 수 있다. 적합한 산의 예는 염화수소, 브롬화수소, 인산, 황산, 질산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 옥살산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 살리실산, 벤조산, 포름산, 프로피온산, 피발산, 디에틸아세트산, 말론산, 숙신산, 피멜산, 푸마르산, 말레산, 말산, 설팜산, 페닐프로피온산, 글루콘산, 아스코브산, 이소니코틴산, 시트르산, 아디프산 및 기타 본 분야의 전문가에게 알려진 산을 포함한다. 화학식 I의 화합물이 분자 내에 산성 그룹과 염기성 그룹을 동시에 함유하는 경우, 또한 본 발명은 언급된 염 형태에 추가하여 내부 염 또는 베타인(양쪽성 이온)을 포함한다. 화학식 I의 개개 염은 본 분야의 전문가에게 알려져 있는 통상의 방법, 예를 들어 이들을 유기 또는 무기 산 또는 염기와 용매 또는 분산제 중에서 접촉시킴으로써 또는 다른 염과의 음이온 교환 또는 양이온 교환에 의해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명은 낮은 생리학적 부합성으로 인해 약제에 직접적으로 사용하기에 적합하지 않지만 예를 들어 화학 반응 동안의 중간체로서 또는 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 위한 중간체로서 사용될 수 있는 화학식 I의 화합물의 모든 염을 포함한다.
바람직하게는, 화학식 I에서 R2는 L2-Z로 대체된다.
바람직하게는, 화학식 I에서 R1은 L2-Z로 대체된다.
바람직하게는, 화학식 I에서 X는 N(R3)이다.
바람직하게는, 화학식 I에서 X는 C(R3R3a) 및 R3a는 N(R2b)C(O)R4이다.
바람직하게는, X는 C(R3R3a)이고 R3a는 N(R2b)-L2-Z이다.
본 발명의 바람직한 프로드럭은 화학식 I의 L1이 아래 화학식 Ia, Ib, Ic 또는 Id로 표시되는 인슐린 링커 접합체 D-L을 포함한다:
[화학식 Ia]
Figure pct00002
[화학식 Ib]
Figure pct00003
[화학식 Ic]
Figure pct00004
[화학식 Id]
Figure pct00005
상기 화학식에서, R1, R1a, R2, R2a, R2b, R3, R4, L2, Z는 본원에 나타낸 바와 같은 의미를 갖고, L1은 임의로 추가로 치환되며, 단 화학식 Ia 내지 Id에서 별표로 표시된 수소는 치환체에 의해 대체되지 않는다.
바람직하게는, L1은 추가로 치환되지 않는다(필수 치환제 L2-Z는 제외).
예를 들어 화학식 Ia 내지 Id에서 보는 바와 같이 한 개의 수소가 그룹 L2-Z에 의해 대체된다.
일반적으로, L2는 화학식 I에서 별표로 표시된 수소의 대체를 제외하고 어떠한 위치에서도 L1에 부착될 수 있다. 바람직하게는, R1, R1a, R2, R2a, R2b, R3, R3a, R4에서 나타낸 수소 중 하나가 직접적으로 또는 C1 -4 알킬 또는 추가의 그룹의 수소가 L2-Z로 대체된다.
또한, L1은 임의로 추가로 치환될 수 있다. 일반적으로, 분해 원리가 영향을 받지 않는 한 어떠한 치환체도 사용될 수 있다. 그러나, L1이 추가로 치환되지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 하나 이상의 추가적인 임의의 치환체는 할로겐; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, T; C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되며 여기에서 C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 T; -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; N(R11)-; -OC(O)R11-; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 차단되고,
R9, R9a, R9b는 H; T; 및 C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 또는 C2-50 알키닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, T; C1-50 알킬; C2-50 알케닐; 및 C2-50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되며 여기에서 C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 T; -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; 0N(R11)-; -OC(O)R11-; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 차단되고,
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3-10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 9 내지 11원 헤테로바이사이클릴로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되고,
R10은 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이며, 여기서, C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의 치환되고,
R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; 또는 C1-6 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의 치환된다.
용어 "차단된다"는 한 그룹이 두 탄소 사이에 삽입되거나 탄소와 수소 사이의 탄소 쇄 말단에 삽입됨을 의미한다.
L2는 화학적 단일 결합 또는 스페이서이다. L2가 스페이서인 경우 하나 이상의 임의의 상기 치환체로 정의되는 것이 바람직하며, 단 L2는 Z로 치환된다.
따라서, L2가 화학적 단일 결합 이외에 다른 것인 경우, L2-Z는 COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 또는 C2 -50 알키닐이고, 여기서, T; C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되며 여기에서 C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 T; -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; N(R11)-; -OC(O)R11-; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 차단되고;
R9, R9a, R9b는 H; Z; T; 및 C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 또는 C2 -50 알키닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, T; C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되며, 여기에서 C1 -50 알킬; C2 -50 알케닐; 및 C2 -50 알키닐은 T; -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; N(R11)-; -OC(O)R11-; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; 및 -OC(O)N(R11R11a)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 차단되고;
T는 페닐; 나프틸; 인데닐; 인다닐; 테트랄리닐; C3 -10 사이클로알킬; 4 내지 7원 헤테로사이클릴; 또는 9 내지 11원 헤테로바이사이클릴로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 T는 동일하거나 상이한 하나 이상의 R10으로 임의로 치환되고;
R10은 Z; 할로겐; CN; 옥소(=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); 또는 C1-6 알킬이며, 여기서, C1-6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의 치환되고;
R11, R11a, R12, R12a, R12b는 H; Z; 또는 C1 -6 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, C1 -6 알킬은 동일하거나 상이한 하나 이상의 할로겐으로 임의 치환되고;
단 R9, R9a, R9b, R10, R11, R11a, R12, R12a, R12b 중 하나가 Z이다.
더욱 바람직하게는, L2는 C1 -20 알킬 쇄이며, 이 알킬 쇄는 -O- 및 C(O)N(R3aa) 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 차단되고, OH; 및 C(O)N(R3aaR3aaa) 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 치환되며, 여기서, R3aa, R3aaa는 H; 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, L2는 14 g/mol 내지 750 g/mol의 분자량 범위를 갖는다.
바람직하게는, L2는
Figure pct00006
중에서 선택된 말단 그룹을 통해 Z에 결합된다.
L2가 상기와 같은 말단 그룹인 경우, 추가로, L2가 그러한 말단 그룹없이 계산했을때 14 g/mol 내지 500 g/mol의 분자량 범위를 갖는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 링커와 하이드로겔 Z 사이에 형성된 공유 부착은 영구적 결합이다.
바람직하게는, 하이드로겔 Z는 생분해성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 수-불용성 하이드로겔이다. 본원에 사용된 용어 "PEG 기반"은 하이드로겔내에서 PEG 쇄의 질량 비율이 하이드로겔의 총 중량을 기준으로 적어도 10중량%, 바람직하게는 적어도 25중량%임을 의미한다. 나머지 부분은 다른 스페이서 및/또는 올리고머 또는 폴리머(예, 올리고라이신 또는 폴리라이신)로 구성될 수 있다.
또한, 용어 "수-불용성"은 하이드로겔로부터 팽창하는 삼차원적 가교된 분자 네트워크를 가리킨다. 하이드로겔은 과잉의 물 또는 생리적 삼투압의 수성 완충액에 현탁되는 경우 상당한 양의 물(예, 중량 기준 당 10배의 중량까지)을 흡수할 수 있음에 따라 팽창할 수 있으나 과량의 물을 제거한 후 겔의 물리적 안정성과 형태를 계속 유지한다. 이러한 형태는 어떠한 기하학적 구조일 수 있으며 그러한 개개의 하이드로겔 실체느 각 성분이 화학적 결합을 통해 서로 다른 성분에 연결되어 있는 다수의 성분들로 이루어진 단일 분자로 간주된다.
본 발명에 따라 하이드로겔은 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호연결되는 골격 모이어티들로 구성될 수 있다.
바람직하게는, 골격 모이어티는 1 kDa 내지 20 kDa의 분자량 범위를 가지며, 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 15 kDa이고, 더 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 10 kDa이다. 골격 모이어티는 바람직하게는 또한 하나 이상의 PEG 쇄를 포함한 PEG-기반이다.
본 발명에 따른 약물-링커 접합체를 갖는 하이드로겔에서, 골격 모이어티는 상호연결된 생분해성 작용 그룹을 포함한 많은 작용 그룹 및 하이드로겔-연결된 약물-링커 접합체 및 임의의 캡핑 그룹에 의해 특징지어진다. 이것은 골격 모이어티가 많은 하이드로겔-연결된 약물-링커 접합체; 생분해성 상호연결된 작용 그룹을 포함한 작용 그룹; 및 임의의 캡핑 그룹으로 특징지어진다. 바람직하게는 상호연결된 생분해성 작용 그룹과 약물-링커 접합체 및 캡핑 그룹의 총합은 16 내지 128이고, 더 바람직하게는 20 내지 100이고, 더 더욱 바람직하게는 24 내지 80이고, 가장 바람직하게는 30 내지 60이다.
바람직하게는, 골격 모이어티의 상호연결된 작용 그룹 및 하이드로겔-연결된 약물-링커 접합체 및 캡핑 그룹의 총합은 분지 중심으로부터 확장되는 PEG-기반 고분자 쇄의 수로 똑같이 나뉜다. 예를 들어 32개의 상호연결된 작용 그룹 및 하이드로겔-연결된 약물-링커 접합체 및 캡핑 그룹이 있다면, 중심으로부터 확장되는 4개의 PEG-기반 고분자 쇄 각각에 의해 8개 그룹이, 바람직하게는 각 PEG-기반 고분자 쇄의 말단에 부착된 수지상 모이어티의 수단에 의해 제공될 수 있다. 다르게는, 4개 그룹이 중심으로부터 확장되는 8개의 PEG-기반 고분자 쇄 각각에 의해 제공되거나 또는 2개 그룹이 16개 PEG-기반 고분자 쇄 각각에 의해 제공될 수 있다. 분지 중심으로부터 확장되는 PEG-기반 고분자 쇄의 수가 균등한 분포를 허용하지 않는 경우 PEG-기반 고분자 쇄 당 상호연결된 작용 그룹 및 하이드로겔-연결된 약물-링커 접합체 및 캡핑 그룹의 총합의 평균 수로부터의 편차를 최소로 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 담체-연결된 프로드럭에서, 골격 모이어티의 상당량(<10%)이 방출되기 전에 거의 모든 약물(>90%)이 방출되는 것이 바람직하다. 이것은 본 발명에 따라 담체-연결된 프로드럭 반감기 대 하이드로겔의 분해 역학을 조절함으로써 달성될 수 있다.
우선적으로 골격 모이어티는 분지 중심을 가짐으로써 이로부터 적어도 3개의 PEG-기반 고분자 쇄가 확장하는 것으로 특징지어진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 관점으로서, 골격 시약은 적어도 3개의 PEG-기반 고분자 쇄가 확장하는 분지 중심을 포함한다. 이러한 분지 중심은 결합 형태로 폴리- 또는 올리고알코올, 바람직하게는 펜타에리트리톨, 트리펜타에리트리톨, 헥사글리세린, 수크로스, 소르비톨, 프럭토스, 만니톨, 글루코스, 셀룰로스, 아밀로스, 전분, 하이드록시알킬 전분, 폴리비닐알코올, 덱스트란, 히알루로난으로 구성될 수 있거나, 결합 형태로 오르니틴, 디아미노부티르산, 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신, 옥타라이신, 노나라이신, 데카라이신, 운데카라이신, 도데카라이신, 트리데카라이신, 테트라데카라이신, 펜타데카라이신 또는 올리고라이신, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐아민과 같은 폴리- 또는 올리고아민으로 구성될 수 있다.
바람직하게는, 분지 중심은 3 내지 16개, 더 바람직하게는 4 내지 8개의 PEG-기반 고분자 쇄로 확장한다. 바람직한 분지 중심은 결합 형태로 펜타에리트리톨, 오르니틴, 디아미노부티르산, 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신 또는 올리고라이신, 저분자량 PEI, 헥사글리세린, 트리펨타에리트리톨로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 분지 중심은 3 내지 16개, 더 바람직하게는 4 내지 8개의 PEG-기반 고분자 쇄로 확장한다. 바람직하게는, PEG-기반 고분자 쇄는 한쪽 말단이 분지형 중심에 연결되고 다른쪽 말단이 과분지형 수지상 모이어티에 연결되는 선형 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄이다. 고분자 PEG-기반 쇄는 헤테로원자 및 화학적 작용 그룹에 의해 임의로 치환되는 알킬 또는 아릴 그룹에 의해 말단화되거나 차단될 수 있다.
바람직하게는, PEG-기반 고분자 쇄는 적합하게 치환된 폴리에틸렌 글리콜 유도체(PEG 기반)이다.
골격 모이어티에 함유된 분지 중심으로부터 확장하는 상응하는 PEG-기반 고분자 쇄의 바람직한 구조는 예를 들어 JenKem Technology, USA의 제품 목록(2009년 7월 28일 www.jenkemusa.com에 접속하여 다운로드)에 기술된 멀티-아암 PEG 유도체, 4ARM-PEG 유도체(펜타에리트리톨 중심), 8ARM-PEG 유도체(헥사글리세린 중심) 및 8ARM-PEG 유도체(트리펜타에리트리톨 중심)이다. 가장 바람직한 것은 4arm PEG 아민(펜타에리트리톨 중심) 및 4arm PEG 카르복실(펜타에리트리톨 중심), 8arm PEG 아민(헥사글리세린 중심), 8arm PEG 카르복실(헥사글리세린 중심), 8arm PEG 아민(트리펜타에리트리톨 중심) 및 8arm PEG 카르복실(트리펜타에리트리톨 중심)이다. 골격 모이어티에서 그러한 멀티-아암 PEG-유도체의 바람직한 분자량은 1 kDa 내지 20 kDa이며, 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 15 kDa이고, 훨씬 더 바람직하게는 1 kDa 내지 10 kDa이다.
상기된 멀티-아암 분자의 말단 아민 그룹은 골격 모이어티에서 결합 형태로 존재하여 골격 모이어티의 추가의 상호연결된 작용 그룹 및 반응성 작용 그룹을 제공한다는 것이 이해되어야 한다.
골격 모이어티의 상호연결된 작용 그룹 및 반응성 작용 그룹의 총합은 분지 중심으로부터 확장되는 PEG-기반 고분자 쇄의 수로 균등하게 나누어지는 것이 바람직하다. 분지 중심으로부터 확장되는 PEG-기반 고분자 쇄의 수가 균등한 분배를 허용하지 않는 경우, PEG-기반 고분자 쇄 당 상호연결 작용 그룹과 반응성 작용 그룹의 총합의 평균 수로부터 편차가 최소로 유지되는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, 골격 모이어티의 상호연결된 그룹과 반응성 작용 그룹의 총합을 분지 중심으로부터 확장되는 PEG-기반 고분자 쇄의 수로 균등하게 나누는 것이다. 예를 들어 32개의 상호연결된 작용 그룹 및 반응성 작용 그룹이 있는 경우, 8개 그룹은 중심으로부터 확장되는 4개의 PEG-기반 고분자 쇄 각각에 의해, 바람직하게는 각 PEG-기반 고분자 쇄의 말단에 부착된 수지상 모이어티의 수단에 의해 제공될 수 있다. 다르게는, 4개 그룹은 중심으로부터 확장하는 8개 PEG-기반 고분자 쇄 각각에 의해 또는 2개 그룹은 16개 PEG-기반 고분자 쇄에 의해 제공될 수 있다.
이와 같이 추가적인 작용 그룹은 수지상 모이어티에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티는 0.4 kDa 내지 4 kDa의 분자량 범위를 가지며, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 2 kDa이다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티는 적어도 3개의 분지와 적어도 4개의 반응성 작용 그룹 및 63개 이하의 분지와 64개 반응성 작용 그룹을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 7개의 분지와 적어도 8개의 반응성 작용 그룹 및 31개의 분지와 32개의 반응성 작용 그룹을 갖는다.
이와 같은 수지상 모이어티의 예는 결합 형태로 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신, 옥타라이신, 노나라이신, 데카라이신, 운데카라이신, 도데카라이신, 트리데카라이신, 테트라데카라이신, 펜타데카라이신, 헥사데카라이신, 헵타데카라이신, 옥타데카라이신, 노나데카라이신으로 구성된다. 이러한 바람직한 수지상 모이어티의 예는 결합 형태로 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신으로 구성되고, 가장 바람직하게는 결합 형태로 트리라이신, 펜타라이신 또는 헵타라이신, 오르니틴, 디아미노부티르산으로 구성된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔 담체는 골격 모이어티가 화학식 C(A-Hyp)4의 4급 탄소를 갖는 것을 특징으로 하고, 여기서 각 A는 독립적으로 영구적인 공유 결합에 의해 4급 탄소에 말단 부착된 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 고분자 쇄이고, PEG-기반 고분자 쇄의 원위부 말단이 수지상 모이어티 Hyp에 공유 결합되며, 각 수지상 모이어티 Hyp는 상호연결된 작용 그룹과 반응성 작용 그룹을 나타내는 적어도 4개의 작용 그룹을 갖는다.
바람직하게는, 각 A는 화학식 -(CH2)n1(OCH2CH2)nX-(여기서, n1은 1 또는 2이고; n은 5 내지 50의 범위에 있는 정수이며; X는 A와 Hyp를 공유적으로 연결하는 화학적 작용 그룹이다) 중에서 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, A와 Hyp는 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
바람직하게는, 수지상 모이어티 Hyp는 과분지형 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 과분지형 폴리펩타이드는 결합 형태로 라이신을 포함한다. 바람직하게는, 각 수지상 모이어티 Hyp는 0.4 kDa 내지 4 kDa 범위의 분자량을 갖는다. 골격 모이어티 C(A-Hyp)4는 동일하거나 상이한 수지상 모이어티 Hyp로 이루어질 수 있으며 각 Hyp는 독립적으로 선택될 수 있음이 이해된다. 각 잔기 Hyp는 5 내지 32개의 라이신, 바람직하게는 적어도 7개의 라이신으로 구성된다(즉, 각 잔기 Hyp는 5 내지 32개의 라이신이 결합 형태로 구성되며, 바람직하게는 적어도 7개의 라이신이 결합 형태로 구성된다. 가장 바람직하게는, Hyp는 헵타라이시닐로 구성된다).
골격 시약과 중합성 작용 그룹의 반응, 보다 특정적으로는 폴리에틸렌글리콜 기반 가교제 시약의 중합성 작용 그룹과 Hyp의 반응은 영구적 아미드 결합을 형성한다.
바람직하게는, C(A-Hyp)4는 1 kDa 내지 20 kDa, 더 바람직하게는 1 kDa 내지 15 kDa, 훨씬 더 바람직하게는 1 kDa 내지 10 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
한 가지 바람직한 골격 모이어티가 아래에 제시되어 있으며, 파선은 가교제 모이어티에 상호연결되는 생분해성 연결을 가리키며, n은 5 내지 50의 정수이다.
Figure pct00007
본 발명에 따른 하이드로겔의 생분해성은 가수분해적으로 분해가능한 결합의 도입에 의해 달성된다.
용어 "가수분해적으로 분해가능한", "생분해성" 또는 "가수분해적으로 절단가능한", "자가-절단성", 또는 "자체-절단성", "일시적인"은 본 발명의 내용과 관련하여 1시간 내지 3개월 범위의 반감기로 생리학적 조건(pH 7.4, 37℃의 수성 완충액) 하에서 비효소적으로 가수분해적으로 분해가능한 또는 절단 가능한 결합 및 연결를 가리키며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 아코니틸, 아세탈, 아미드, 카르복실 무수물, 에스테르, 이민, 하이드라존, 말레암산 아미드, 오르토 에스테르, 포스파미드, 포스포에스테르, 포스포실릴 에스테르, 실릴 에스테르, 설폰 에스테르, 방향족 카르바메이트, 이의 조합 등을 포함한다.
분해성 상호연결된 작용 그룹으로서 본 발명의 하이드로겔에 존재하는 경우, 바람직한 생분해성 연결은 에스테르, 카보네이트, 포스포에스테르 및 설폰산 에스테르이며, 가장 바람직한 것은 에스테르 또는 카보네이트이다.
영구적 연결은 예를 들어 아미드와 같이 6개월 이상의 반감기로 생리학적 조건(pH 7.4, 37℃의 수성 완충액) 하에서 비효소적으로 가수분해적으로 분해가능하다.
효소적으로 절단가능한 결합을 본 발명의 하이드로겔 담체 내로 도입하기 위해 골격 모이어티는 생분해성 결합의 수단에 의해 서로 직접 연결될 수 있다.
한 가지 양태로서, 생분해성 하이드로겔 담체의 골격 모이어티는 가교 모이어티없이 직접 함께 연결될 수 있다. 그러한 생분해성 하이드로겔의 두 골격 모이어티의 과분지형 수지상 모이어티는 두 과분지형 수지상 모이어티를 연결하는 상호연결된 작용 그룹을 통해 직접 연결될 수 있다. 다르게는, 두 개의 상이한 골격 모이어티의 두 과분지형 수지상 모이어티는 골격 모이어티에 연결된 두 스페이서 모이어티를 통해 상호연결될 수 있으며 반대편에서는 상호연결된 작용 그룹에 의해 분리된 가교 모이어티에 연결된다.
다르게는, 골격 모이어티는 가교 모이어티를 통해 함께 연결될 수 있으며, 각 가교 모이어티는 가수분해적으로 분해가능한 결합 중 적어도 두 개에 의해 말단화된다. 말단 분해성 결합 이외에 가교 모이어티는 추가로 생분해성 결합을 함유할 수 있다. 따라서, 골격 모이어티에 연결된 가교 모이어티의 각 말단은 가수분해적으로 분해가능한 결합을 포함하며 추가의 생분해성 결합은 임의로 가교 모이어티에 존재할 수 있다.
바람직하게는, 생분해성 하이드로겔 담체는 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호연결된 골격 모이어티로 구성되며 골격 모이어티는 가교 모이어티를 통해 함께 연결된다.
생분해성 하이드로겔 담체는 가교 모이어티의 상이한 유형 하나 이상을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 하나를 함유한다. 가교 모이어티는 선형 또는 분지형 분자일 수 있으며, 바람직하게는 선형 분자이다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 가교 모이어티는 적어도 두 개의 생분해성 결합에 의해 골격 모이어티에 연결된다.
바람직하게는, 가교 모이어티는 60 Da 내지 5 kDa의 분자량 범위를 가지며, 더욱 바람직하게는 0.5 kDa 내지 4 kDa이고, 훨씬 더 바람직하게는 1 kDa 내지 4 kDa이며, 더 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 3 kDa이다. 한 가지 양태로서, 가교 모이어티는 고분자로 이루어진다.
올리고머 또는 폴리머 가교 모이어티 이외에, 저분자량 가교 모이어티가 사용될 수 있으며, 특히 친수성 고분자량 골격 모이어티가 본 발명의 생분해성 하이드로겔의 형성을 위해 사용되는 경우에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 에틸렌 글리콜 단위를 포함하고 임의로 추가의 화학적 작용 그룹을 포함하는 탄화수소 쇄이고, 여기에서 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 각각 적어도 m의 에틸렌 글리콜 단위(여기서, m은 3 내지 100의 정수, 바람직하게는 10 내지 70의 정수이다)를 포함한다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 0.5 kDa 내지 5 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
가교 모이어티 또는 분지 중심에 연결된 PEG-기반 고분자 쇄와 관련하여 사용되는 용어 "PEG-기반"은 적어도 20 중량%의 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 가교 모이어티 또는 PEG-기반 고분자 쇄를 가리킨다.
한 가지 양태로서, 고분자 가교 모이어티를 구성하는 단량체는 생분해성 결합에 의해 연결된다. 이와 같은 고분자 가교 모이어티는 가교 모이어티의 분자량 및 단량체 단위의 분자량에 따라 100개 이상의 생분해성 결합을 함유할 수 있다. 이러한 가교 모이어티의 예는 폴리(락트산) 또는 폴리(글리콜산) 기반 고분자이다. 이와 같은 폴리(락트산) 또는 폴리(글리콜산) 쇄는 알킬 또는 아릴 그룹에 의해 말단화되거나 차단될 수 있으며 이들은 임의로 헤테로원자 및 화학적 작용 그룹으로 치환될 수 있음이 이해된다.
바람직하게는, 가교 모이어티는 PEG 기반이며, 바람직하게는 단지 하나의 PEG 기반 분자 쇄로 나타난다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 에틸렌 글리콜 단위를 포함하고 임의로 추가의 화학적 작용 그룹을 포함하는 탄화수소 쇄이고, 여기에서 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 각각 적어도 m의 에틸렌 글리콜 단위(여기서, m은 3 내지 100의 정수, 바람직하게는 10 내지 70의 정수이다)를 포함한다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교 모이어티는 0.5 kDa 내지 5 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 가교 모이어티는 영구적 아미드 결합을 통해 과분지형 수지상 모이어티에 연결된 골격 모이어티에 의해 제공된 두 개의 알파, 오메가-지방족 디카르복실 스페이서에 에스테르 결합을 통해 대칭적으로 연결되는 PEG로 구성된다.
골격 모이어티 및 다른 쪽에 연결된 스페이서 모이어티의 디카르복실산은 3 내지 12개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 5 내지 8개의 탄소 원자로 구성된 가교 모이어티에 연결되며 하나 이상의 탄소 원자로 치환될 수 있다. 바람직한 치환체는 알킬 그룹, 하이드록실 그룹 또는 아미도 그룹이거나 치환된 아미도 그룹이다. 지방족 디카르복실산 메틸렌 그룹 중 하나 이상이 O 또는 NH 또는 알킬-치환된 N에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이다.
바람직하게는, 과분지형 수지상 모이어티와 골격 모이어티에 연결되고 반대 쪽은 가교 모이어티에 연결되는 스페이서 모이어티 사이에 영구적 아미드 결합이 존재한다.
한 가지 바람직한 가교 모이어티가 아래 제시되어 있으며, 여기서 파선은 골격 모이어티에 상호연결되는 생분해성 결합을 나타낸다:
Figure pct00008
상기 식에서, n은 5 내지 50의 정수이다.
바람직하게는, 하이드로겔 담체는 가수분해적으로 분해가능한 결합에 의해 상호연결된 골격 모이어티로 구성된다.
더욱 바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식의 분지 중심을 포함한다:
Figure pct00009

상기 식에서, 파선은 골격 모이어티의 나머지 부분과의 부착을 가리킨다.
더욱 바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식을 포함한다:
Figure pct00010

상기 식에서, n은 5 내지 50의 정수이고, 파선은 골격 모이어티의 나머지 부분과의 부착을 가리킨다.
바람직하게는, 골격 모이어티는 고분지형 모이어티 Hyp를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식의 분지형 모이어티 Hyp를 포함한다:
Figure pct00011

상기 식에서, 파선은 분자의 나머지 부분과의 부착을 가리키며 별표로 표시된 탄소 원자는 S-배위를 나타낸다.
바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식의 적어도 하나의 스페이서에 부착된다:
Figure pct00012

상기 식에서, 별표로 표시된 파선은 하이드로겔과 티오석신이미드 그룹 사이의 결합을 나타내며, 다른 파선은 Hyp와의 부착을 나타내고, p는 0 내지 10의 정수이다.
바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식의 적어도 하나의 스페이서에 결합된다:
Figure pct00013

상기 식에서, 파선은 과분지형 모이어티 Hyp와의 결합을 나타내며, 두번째 파선은 분자의 나머지 부분과의 부착을 나타내고, m은 2 내지 4의 정수이다.
바람직하게는, 골격 모이어티는 아래 구조식을 갖는 가교 모이어티를 통해 함께 연결된다:
Figure pct00014
상기 식에서, q는 3 내지 100의 정수이고; 골격 모이어티와 가교 모이어티 사이의 생분해성 결합의 가수분해율은 PEG-에스테르 카르복시 그룹에 인접하여 연결된 원자의 수 및 유형에 의해 영향을 받거나 결정된다. 예를 들어, PEG 에스테르 형성을 위해 석신산, 아디프산 또는 글루타르산 중에서 선택함으로써 본 발명에 따른 생분해성 하이드로겔 담체의 분해 반감기를 다양하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔의 완전한 분해 후 용액 중의 골격 모이어티의 총량은 측정될 수 있으며, 분해 동안에 용해성 골격 분해 산물의 분획은 본 발명의 불용성 하이드로겔로부터 분리될 수 있고 본 발명의 하이드로겔 실체로부터 방출된 다른 용해성 분해 산물로부터 방해없이 정량될 수 있다. 본 발명에 따른 하이드로겔은 침강 또는 원심분리에 의해 생리학적 삼투압 농도의 완충액의 과량의 물로부터 분리될 수 있다. 원심분리는 상청액이 본 발명에 따른 팽윤 하이드로겔 용적의 적어도 10%를 제공하는 정도로 실시될 수 있다. 이러한 침강 또는 원심분리 단계 후 수성 상청액에는 용해성 하이드로겔 분해 산물이 잔류하며, 이러한 상청액의 분획을 적절한 분리 및/또는 분석 방법에 적용함으로써 하나 이상의 골격 모이어티를 포함한 수용성 분해 산물이 검출될 수 있다.
바람직하게는, 수용성 분해 산물은 0.45 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 수불용성 분해 산물로부터 분리될 수 있으며, 수용성 분해 산물은 여과액에서 발견될 수 있다. 또한, 수용성 분해 산물은 원심분리 및 여과 단계의 조합에 의해 수불용성 분해 산물로부터 분리될 수 있다.
예를 들어, 골격 모이어티는 다른 분해 산물이 UV 흡수를 나타내지 않는 파장에서 UV 흡수를 나타내는 그룹을 갖고 있을 수 있다. 이러한 선택적 UV-흡수 그룹은 아미드 결합과 같은 골격 모이어티의 구조 성분일 수 있거나 인돌릴 그룹과 같은 방향족 고리계의 수단에 의해 반응성 작용 그룹과의 부착에 의해 골격 내로 도입될 수 있다.
본 발명에 따른 그러한 하이드로겔-연결된 인슐린 프로드럭에서, 골격 분해 산물의 상당량(<10%)이 방출되기 전에 거의 모든 인슐린(>90%)이 방출되는 것이 바람직하다. 이것은 하이드로겔-연결된 인슐린 프로드럭의 반감기 대 하이드로겔 분해 역학을 조절함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 하이드로겔-연결된 인슐린 프로드럭은 본 분야에 알려진 통상의 방법에 의해 본 발명의 하이드로겔로부터 출발하여 제조할 수 있다. 본 분야의 전문가는 몇 가지 경로가 존재한다는 것을 알고 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 모이어티가 공유 부착되어 있는 상기 프로드럭 링커를 부분적으로 또는 전체적으로 활성 모이어티(즉, 인슐린)를 갖고 있거나 이미 보유하고 있는 본 발명의 하이드로겔의 반응성 작용 그룹과 반응시킬 수 있다.
바람직한 제조 방법에서, 하이드로겔은 화학적 라이게이션 반응을 통해 생성된다. 하이드로겔은 축합 또는 부가와 같은 반응을 하는 상보적 작용기를 갖는 두 개의 거대분자 유리체로부터 형성될 수 있다. 이들 출발 물질 중 하나는 적어도 두 개의 동일한 작용 그룹을 갖는 가교제 시약이며, 다른 출발 물질은 단독다작용성 골격 시약이다. 가교제 시약에 존재하는 적합한 작용 그룹은 말단 아미노, 카르복실산 및 유도체, 말레미이드 및 비닐설폰과 같은 다른 알파, 베타 불포화 마이클 수용체, 티올, 하이드록실 그룹을 포함한다. 골격 시약에 존재하는 적합한 작용 그룹은 이들로 한정되는 것은 아니지만 아미노, 카르복실산 및 유도체, 말레미이드 및 비닐설폰과 같은 다른 알파, 베타 불포화 마이클 수용체, 티올, 하이드록실 그룹을 포함한다.
가교제 시약 반응성 작용 그룹이 골격 반응성 작용 그룹에 대하여 아화학량론적으로 사용되는 경우, 생성된 하이드로겔은 골격 구조에 부착된 유리 반응성 작용 그룹을 갖는 반응성 하이드로겔일 것이다.
임의로, 프로드럭 링커가 인슐린에 일차로 접합될 수 있으며, 그런 다음 생성된 인슐린-프로드럭 링커 접합체가 하이드로겔의 반응성 작용 그룹과 반응할 수 있다. 다르게는, 프로드럭 링커의 작용 그룹 중 하나를 활성화한 후, 링커-하이드로겔 접합체가 이차 반응 단계로 인슐린과 접촉될 수 있고 하이드로겔-결합된 프로드럭 링커에의 인슐린의 접합 후 과량의 인슐린을 여과에 의해 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 프로드럭의 바람직한 제조 방법은 다음과 같다:
골격 시약 합성을 위해 바람직한 출발 물질은 4-아암 PEG 테트라 아민 또는 8-아암 PEG 옥타 아민이고, PEG 시약은 2000 내지 10000 달톤의 분자량 범위를 가지며 가장 바람직하게는 2000 내지 5000 달톤이다. 이와 같은 멀티-아암 PEG 유도체에 라이신 잔기가 순차적으로 커플링되어 과분지형 골격 시약을 형성한다. 커플링 단계 동안에 보호 그룹에 의해 라이신이 부분적으로 또는 완전히 보호될 수 있으며 또한 최종 골격 시약이 보호 그룹을 함유할 수 있음이 이해된다. 바람직한 빌딩 블록은 bis-boc 라이신이다. 다르게는, 라이신 모이어티의 순차적인 부가 대신에 수지상 폴리-라이신 모이어티가 일차로 집합되고 이어서 4-아암 PEG 테트라 아민 또는 8-아암 PEG 옥타 아민에 커플링될 수 있다. 32개의 아미노 그룹을 갖는 골격 시약을 수득하는 것이 바람직하며, 이어서 7개의 라이신이 4-아암 PEG의 각 아암에 부착되거나 5개의 라이신이 8-아암 PEG의 각 아암에 부착된다. 다른 양태로서, 멀티-아암 PEG 유도체는 테트라- 또는 옥타 카르복시 PEG이다. 이 경우에, 수지상 모이어티는 글루타르산 또는 아스파르트산으로부터 생성될 수 있으며, 생성된 골격 시약은 32개의 카르복시 그룹을 갖는다. 골격 시약의 작용 그룹의 전부 또는 일부가 유리 형태, 염 형태 또는 보호 그룹에 접합된 형태로 존재할 수 있음은 이해되어야 한다. 실용적인 이유 때문에 PEG-아암 당 라이신의 골격 시약의 수는 6 내지 7 사이인 것으로 이해되며, 더욱 바람직하게는 약 7이다.
바람직한 골격 시약은 아래에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00015

가교 시약의 합성은 0.2 내지 5 kDa, 더욱 바람직하게는 0.6 내지 2 kDa 범위의 분자량을 갖는 선형 PEG 쇄로부터 출발하며, 이것은 디카르복실산, 대부분 아디프산 또는 글루타르산의 하프 에스테르로 에스테르화된다. 하프 에스테르 형성에 바람직한 보호 그룹은 벤질 그룹이다. 생성된 비스 디카르복실산 PEG 하프 에스테르는 아실 클로라이드 또는 활성 에스테르(예, 펜타플로오로페닐 또는 N-하이드록시석신이미드 에스테르)와 같은 더욱 반응성인 카르복시 화합물로 전환되며, 가장 바람직한 것은 N-하이드록시석신이미드 에스테르로 이 가운데 바람직하게 선택된 구조는 아래에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00016
상기식에서, 각 m은 독립적으로 2 내지 4의 정수이고, q는 3 내지 100의 정수이다.
보다 바람직한 것은 아래 구조식이다:
Figure pct00017

다르게는, 비스 디카르복실산 PEG 하프 에스테르는 DCC 또는 HOBt 또는 PyBOP와 같은 커플링제의 존재 하에서 활성화될 수 있다.
다른 양태로서, 골격 시약은 카르복시 그룹을 가지며, 상응하는 가교 시약은 에스테르-함유 아미노-말단화된 PEG-쇄로부터 선택된다.
역 에멀젼 중합을 이용하여 골격 시약과 가교 시약을 중합시켜 본 발명의 하이드로겔을 형성할 수 있다. 골격과 가교 작용 그룹 사이의 목적하는 화학량론을 선택한 후 골격과 가교를 DMSO에 용해시키고, 적절히 선택된 HLB 값을 갖는 적합한 에멀젼, 바람직하게는 Arlacel P135를 사용하여 기계식 교반기로 교반 속도를 조절하면서 반전 에멀젼을 형성한다. 중합은 적합한 염기의 첨가, 바람직하게는 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민에 의해 개시된다. 적당한 시간 동안 교반한 후 아세트산 등의 산 및 물을 첨가하여 반응을 켄칭시킨다. 비드를 수확하고 세척한 다음, 기계식 체에 의해 입도에 따라 분획한다. 임의로 이 단계에서 보호 그룹을 제거할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 다작용성 모이어티가 중합화 반응성 하이드로겔의 반응성 작용 그룹에 커플링되어 작용 그룹의 수를 증가시키며, 이러한 증가에 의해 하이드로겔의 약물 부하가 증가될 수 있다. 이와 같은 다작용성 모이어티는 라이신, 디라이신, 트리라이신, 테트라라이신, 펜타라이신, 헥사라이신, 헵타라이신 또는 올리고라이신의 적절히 치환된 유도체, 저분자량 PEI에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 다작용성 모이어티는 라이신이다.
또한, 본 발명에 따른 그러한 하이드로겔은 동일한 작용 그룹을 갖는 스페이서로 작용화될 수 있으며, 예를 들면 적절히 활성화된 COOH-(EG)6-NH-fmoc(EG=에틸렌 글리콜)과 같은 헤테로이작용성 스페이서를 커플링시키고 fmoc-보호 그룹을 제거함으로써 아미노 그룹을 하이드로겔내로 도입할 수 있다.
작용화된 말레이미도 그룹-함유 하이드로겔에 인슐린-링커 접합체가 로딩된 후 모든 나머지 작용 그룹은 머캅토에탄올과 같은 적절한 차단 시약으로 캡핑하여 원치않는 부반응을 차단한다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 링커 모이어티에 연결된 유리 티올 그룹을 갖는 인슐린-링커 접합체는 말레이미드-작용화된 하이드로겔과 실온 내지 4℃의 온도 하에, 더욱 바람직하게는 실온 하에, pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 2.5 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 pH 3.0 내지 4.0의 완충 수용액 중에서 반응시킨다. 이어서, 생성된 인슐린-링커-하이드로겔 접합체는 머캅토에탄올과 실온 내지 4℃의 온도 하에, 더욱 바람직하게는 실온 하에, pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 2.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 2.5 내지 3.5의 완충 수용액 중에서 반응시킨다.
본 발명의 다른 양태로서, 링커 모이어티에 연결된 말레이미드 그룹을 가진 인슐린-링커 접합체는 티올-작용화된 하이드로겔과 실온 내지 4℃의 온도 하에, 더욱 바람직하게는 실온 하에, pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 2.5 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 pH 3.0 내지 4.0의 완충 수용액 중에서 반응시킨다. 이어서, 생성된 인슐린-링커-하이드로겔 접합체는 말레이미드 그룹을 함유한 저분자량 화합물, 바람직하게는 100 내지 300 Da의 말레이미드-함유 화합물(예, N-에틸-말레이미드)로, 실온 내지 4℃의 온도하에, 더욱 바람직하게는 실온 하에, pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 2.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 2.5 내지 3.5의 완충 수용액 중에서 처리한다.
본 발명의 다른 관점은
(a) 말레이미드-작용화된 하이드로겔 미립자를 포함한 수성 현탁액을 티올 그룹을 갖는 인슐린-링커 시약을 포함한 용액과 실온 내지 4℃의 온도 하에 pH 2 내지 5의 완충 수용액 중에서 접촉시켜 인슐린-링커-하이드로겔 접합체를 생성하는 단계;
(b) 임의로 상기 단계 (a)로부터 생성된 인슐린-링커-하이드로겔 접합체를 34 Da 내지 500 Da의 티올-함유 화합물로 실온 내지 4℃의 온도 하에 pH 2 내지 5의 완충 수용액 중에서 처리하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 다른 관점은
(a) 티올-작용화된 하이드로겔 미립자를 포함한 수성 현탁액을 말레이미드 그룹을 갖는 인슐린-링커 시약을 포함한 용액과 실온 내지 4℃의 온도 하에 pH 2 내지 5의 완충 수용액 중에서 접촉시켜 인슐린-링커-하이드로겔 접합체를 생성하는 단계;
(b) 임의로 상기 단계 (a)로부터 생성된 인슐린-링커-하이드로겔 접합체를 100 내지 300 Da의 말레이미드-함유 화합물로 실온 내지 4℃의 온도 하에 pH 2 내지 5의 완충 수용액 중에서 처리하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 인슐린 프로드럭을 제조하는 특히 바람직한 방법은
(a) 화학식 C(A'-X1)4의 화합물(여기서, A'-X1은 Hyp 또는 Hyp의 전구체와 결합하기 전의 A를 나타내고 X1은 적합한 작용 그룹이다)을 화학식 Hyp'-X2의 화합물(여기서, Hyp'-X2는 A와 결합하기 전의 Hyp 또는 Hyp의 전구체이고 X2는 X1과 반응하는 적합한 작용 그룹이다)과 반응시키는 단계;
(b) 임의로 상기 단계 (a)로부터 생성된 화합물을 하나 이상의 추가 단계에서 반응시켜 적어도 4개의 작용 그룹을 갖는 화학식 C(A-Hyp)4의 화합물을 생성하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)로부터 생성된 화합물의 적어도 4개의 작용 그룹을 폴리에틸렌글리콜 기반 가교 시약(여기서, 가교 시약의 반응성 그룹은 C(A-Hyp)4의 반응성 작용 그룹의 총수와 비교하여 아화학량론적 양으로 사용된다)와 반응시켜 하이드로겔을 생성하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 하이드로겔 골격에서 미반응 상태로 남은 작용 그룹(본 발명의 하이드로겔에 포함된 골격의 반응성 작용 그룹을 나타냄)을 인슐린과 일시적 프로드럭 링커의 공유 접합체와 반응시키거나 미반응된 작용 그룹을 일시적 프로드럭 링커와 우선 반응시키고 이어서 인슐린과 반응시키는 단계;
(e) 임의로 남아 있는 미반응된 작용 그룹을 캡핑하여 본 발명의 프로드럭을 생성하는 단계를 포함한다.
특정적으로, 본 발명의 인슐린 프로드럭을 위한 하이드로겔은 다음과 같이 합성한다:
벌크 중합의 경우 골격 시약과 가교 시약은 2:1 내지 1.05:1의 아민/활성 에스테르 비율로 혼합한다.
골격 시약과 가교 시약 둘 다를 DMSO 중에 용해시켜 100 mL 당 5 내지 50 g, 바람직하게는, 100 mL 당 7.5 내지 20 g, 가장 바람직하게는 100 mL 당 10 내지 20 g의 농도를 갖는 용액을 제공한다.
중합을 달성하기 위해, 2 내지 10 용량%의 N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌 디아민(TMEDA)을 가교 시약과 골격 시약을 함유한 DMSO 용액에 첨가하고 혼합물을 1 내지 20초 동안 진탕한 후 정체해 둔다. 1분 미만 내에 혼합물은 고형화한다.
본 발명의 그와 같은 하이드로겔은 바람직하게는 교반, 마쇄, 절단, 가압 또는 밀링 및 임의로 체질과 같은 기계적 공정에 의해 분쇄된다.
에멀젼 중합의 경우, 반응 혼합물은 분산 상과 연속 상으로 구성된다.
분산 상의 경우, 골격 시약과 가교 시약을 2:1 내지 1.05:1의 아민/활성 에스테르의 비율로 혼합하고 DMSO에 용해시켜 100 mL 당 50 g, 바람직하게는 100 mL 당 7.5 내지 20 g, 가장 바람직하게는 100 mL 당 10 내지 20 g의 농도를 갖는 용액을 제공한다.
연속 상은 DMSO와 혼화되지 않고, 염기성이지 않으며, 비양성자성인 임의의 용매이며 10 Pa*s보다 작은 점도를 나타낸다. 바람직하게는, 용매는 DMSO와 혼화되지 않고, 염기성이지 않으며, 비양성자성이고, 점도가 2 Pa*s보다 작으며, 무독성이다. 더욱 바람직하게는, 용매는 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소이다. 가장 바람직하게는, 용매는 n-헵탄이다.
연속 상 중에 분산 상의 에멀젼을 형성하기 위해, 분산 상을 첨가하기 전에 연속 상에 유화제를 첨가한다. 유화제의 양은 분산 상 mL 당 2 내지 50 mg, 더욱 바람직하게는 분상 상 mL 당 5 내지 20 mg, 가장 바람직하게는 분산 상 mL 당 10 mg이다.
유화제는 3 내지 8의 HLB-값을 갖는다. 바람직하게는, 유화제는 소르비톨의 트리에스테르 및 지방산 또는 폴리(하이드록시 지방산)-폴리(에틸렌 글리콜) 접합체이다. 더욱 바람직한 유화제는 쇄의 각 말단에서 선형 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량이 0.5 kD 내지 5 kDa이고 폴리(하이드록시-지방신) 단위의 분자량이 0.5 kDa 내지 3 kDa인 폴리(하이드록시 지방산)-폴리에틸렌 글리콜 접합체이다. 가장 바람직한 유화제는 폴리(에틸렌 글리콜) 디폴리하이드록시 스테아레이트, 시트롤 DPHS(시트롤 DPHS(이전엔 Arlacel P135), Croda International Plc)이다.
이소제트, 인터미그, 프로펠러(EKATO Ruhr- und Mischtechnik GmbH, Germany)와 같은 교반기와 비슷한, 가장 바람직하게는 반응기 직경의 50 내지 90%의 직경을 갖는 이소제트와 비슷한 기하학적 구조를 가진 축류 임펠러로 교반함으로써 분산 상의 액적이 생성된다. 바람직하게는 교반은 분산 상의 첨가 이전에 개시한다. 교반기 속도는 0.6 내지 1.7 m/s로 설정한다. 분산 상은 실온에서 첨가하고 분산 상의 농도는 총 반응 용량의 2% 내지 70%, 바람직하게는 5 내지 50%, 더욱 바람직하게는 10 내지 40%, 가장 바람직하게는 20 내지 35%이다. 분산 상, 유화제와 연속 상의 혼합물은 중합을 달성하기 위해 염기를 첨가하기 전에 5 내지 60분 동안 교반한다.
5 내지 10 당량(형성될 각 아미드 결합을 기준으로 하여)의 염기를 분산 상과 연속 상의 혼합물에 첨가한다. 염기는 비양성자성이고, 비친핵성이며, 분산 상에서 용해성이다. 바람직하게는, 염기는 비양성자성이고, 비친핵성이며, 분산 상과 DMSO 모두에서 용해성이 양호하다. 더욱 바람직하게는, 염기는 비양성자성이고, 비친핵성이며, 분산 상과 DMSO 모두에서 용해성이 양호하고, 아민 염기이며, 무독성이다. 가장 바람직하게는, 염기는 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민(TMEDA)이다. 염기의 존재 하에 교반은 1 내지 16시간 동안 계속된다.
교반 동안에, 분산 상의 액적은 경화되어 본 발명에 따른 가교된 하이드로겔 비드가 되며, 이들은 수거하고 75 ㎛와 32 ㎛ 데크를 갖는 진동 연속식 체질 기기(sieving machine)로 크기별로 분류하여 본 발명의 하이드로겔 미립자를 수득할 수 있다.
본 발명의 인슐린 프로드럭을 위한 하이드로겔은 제조 방법으로부터 미립자의 형태로 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 반응성 하이드로겔은 메쉬 또는 스텐트와 같은 형체이다. 가장 바람직하게는, 하이드로겔은 표준 시린지의 수단에 의해 피하 또는 근육내 주사로서 투여될 수 있는 미립자성 비드로 형성된다. 이와 같은 연질 비드는 1 내지 500 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다.
바람직하게는, 미립자는 등장성 수성 제형 완충액 중에 현탁되는 경우 10 내지 100 마이크로미터의 직경을 가지며, 더욱 바람직하게는 직경이 20 내지 100 마이크로미터이고, 가장 바람직하게는, 25 내지 80 마이크로미터이다.
바람직하게는, 미립자는 내경이 0.6 mm보다 작은 바늘을 통해, 더 바람직하게는 내경이 0.3 mm보다 작은 바늘을 통해, 더 더욱 바람직하게는 내경이 0.225 mm보다 작은 바늘을 통해, 훨씬 더 바람직하게는 내경이 0.175 mm보다 작은 바늘을 통해, 가장 바람직하게는 내경이 0.16 mm보다 작은 바늘을 통해 투여될 수 있다.
용어 "주사에 의해 투여될 수 있는", "주사가능한" 또는 "주사성"은 특정 농도로(w/v) 및 특정 온도에서 액체 중에 팽윤된 본 발명에 따른 생분해성 하이드로겔을 함유한 시린지의 플런저에 적용된 특정 힘, 이러한 시린지의 출구에 연결된 주어진 내경의 바늘 및 바늘을 통한 시린지로부터 본 발명의 생분해성 하이드로겔의 특정 용량을 압출하는데 필요한 시간과 같은 요소의 조합을 가리키고 있음은 이해된다.
주사성을 제공하기 위해, 물에 적어도 5%(w/v)의 농도로 팽윤되어 있고 직경 4.7 mm의 플런저를 수용하고 있는 시린지에 함유된 본 발명의 인슐린 프로드럭 1 mL 용량이 50 뉴튼 미만의 힘을 가함으로써 실온에서 10초 내에 배출될 수 있다.
바람직하게는 주사성은 본 발명에 따른 인슐린 프로드럭이 물에 약 10%(w/v)의 농도로 팽윤됨으로써 달성된다.
추가의 양태로서 상기 조성물은 주사시 데포를 형성하는 액상 조성물인 것을 특징으로 한다.
추가의 양태로서 상기 조성물은 피하 또는 근육내와 같은 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 한다.
추가의 양태로서 조성물은 인슐린 화합물에 의한 치료 또는 예방이 유리한 인슐린 결핍 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 전형적으로는 그러한 질환 또는 장애는 제II형 당뇨병이다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 사람 또는 비사람 인슐린 또는 인슐린 유사체 및 유도체 또는 이의 접합체 중에서 선택된다. 보다 바람직한 것은 사람 인슐린 및 인슐린 유사체이며, 예로는 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글루리신을 들 수 있다. 인슐린 화합물을 투여한 경우 전형적으로 최초 48시간 내에 최대 농도에 도달한다. 추가의 양태로서, 투여 후 최초 24시간 내, 예를 들면 투여 후 최초 12시간 내, 예를 들면 투여 후 최초 6시간 내에 최대 농도에 도달한다.
추가의 관점에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 GLP-1 화합물, 전형적으로는 GLP-1 효능제를 포함한다.
이와 같은 GLP-1 화합물은 전형적으로 하기된 것 중에서 선택된다:
[서열번호: 1] 엑센딘-4
Figure pct00018
[서열번호: 2] 엑센딘-3
Figure pct00019
[서열번호: 3]
Figure pct00020
[서열번호: 4]
Figure pct00021
[서열번호: 5]
Figure pct00022
[서열번호: 6]
Figure pct00023
[서열번호: 7]
Figure pct00024
[서열번호: 8]
Figure pct00025
[서열번호: 9]
Figure pct00026
[서열번호: 10]
Figure pct00027
[서열번호: 11]
Figure pct00028
[서열번호: 12]
Figure pct00029
[서열번호: 13] GLP-1(7-36) 아미드
Figure pct00030
[서열번호: 14]
Figure pct00031
[서열번호: 15] GLP-1(7-37)
Figure pct00032
[서열번호: 16]
Figure pct00033
(여기서, Xaa는 P, F, Y 중에서 선택된다)
[서열번호: 17]
Figure pct00034
(여기서, Xaa는 T, a-아미노부티르산, D-Ala, V, Gly 중에서 선택된다)
[서열번호: 18]
Figure pct00035
[서열번호: 19]
Figure pct00036
(여기서, R은 아세틸, 피로글루타밀, N-2-하이드록시벤조일, N-트랜스-3-헥세노일 중에서 선택된다)
[서열번호: 20]
Figure pct00037
(여기서, Xaa는 6-아미노-헥사노일이다).
추가의 관점에서, 본 발명은 혈장 중의 인슐린 화합물의 치료학적 유효 수준을 적어도 3일 동안, 전형적으로는 적어도 80시간 동안, 예를 들어 1주 또는 그 이상 동안 유지하기에 충분한 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 나타냄을 특징으로 하며, 인슐린 화합물로의 치료 또는 예방이 유익한 인슐린 결핍 연관 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 인슐린 화합물의 용도에 관한 것이다.
그러한 농도는 환자마다 다양하며 개별 환자의 치료 용량 범위에 의해 좌우되지만, 치료 효과가 적어도 3일간, 예를 들어 1주일(즉, 약 7일) 동안 나타나도록 하기 위해 농도는 전형적으로 적어도 약 10 mg/ml, 예를 들어 10 mg/ml 이상이다.
인슐린-하이드로겔 프로드럭의 바람직한 조성물은 아래에 기술되어 있다.
인슐린-하이드로겔 프로드럭의 조성물은 현탁 조성물 또는 건식 조성물로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 약제학적 조성물은 건식 조성물이다. 적합한 건조 방법은 예를 들어 분무 건조 및 동결 건조이다. 바람직하게는, 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 약제학적 조성물은 동결 건조된다.
바람직하게는, 인슐린 하이드로겔 프로드럭은 일회 투여시 적어도 3일간 치료학적 유효량의 인슐린을 제공하기에 충분한 용량이 조성물에 용량화된다. 보다 바람직하게는, 인슐린 하이드로겔 프로드럭의 일회 투여가 1주일간을 위해 충분한 것이다.
본 발명에 따른 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 약제학적 조성물은 하나 이상의 부형제를 함유한다.
비경구 조성물에 사용되는 부형제는 완충제, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 흡착방지제, 산화 보호제, 증점제/점도 증강제 또는 기타 보조제로 분류될 수 있다. 일부 경우에서 이들 성분들은 이중 또는 삼중 기능을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 조성물은 아래 (i) 내지 (x)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 부형제를 함유한다:
(i) 완충제: 인산나트륨, 중탄산나트륨, 나트륨 석시네이트, 나트륨 히스티딘, 나트륨 시트레이트 및 아세테이트, 황산나트륨, 질산나트륨, 염화나트륨, 나트륨 피루베이트와 같은 목적하는 범위의 pH를 유지하기 위해 생리학적으로 허용되는 완충제. 또한 Mg(OH)2 또는 ZnCO3와 같은 제산제가 사용될 수 있다. 완충능은 조건들이 pH 안정성에 가장 민감하게 부합하도록 조정될 수 있다.
(ii) 등장성 조절제: 주사 데포에서 삼투압 차이로 인한 세포 손상으로부터 발생할 수 있는 통증을 최소화한다. 이의 예는 글리세린 및 염화나트륨이 있다. 유효 농도는 혈청에 대한 285 내지 315 mOsmol/kg의 추정 삼투압을 이용한 삼투압 측정에 의해 결정될 수 있다.
(iii) 보존제 및/또는 항균제: 다중 용량 비경구 제제는 주사시 환자가 감염될 위험을 최소화하기에 충분한 농도로 보존제의 첨가를 필요로 하며 상응하는 조절 요건들은 정립되어 있다. 전형적인 보존제는 m-크레졸, 페놀, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메로솔, 소르브산, 나트륨 소르베이트, 벤조산, 클로로크레졸 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다.
(iv) 안정화제: 안정화는 단백질-안정화 힘의 강화에 의해, 변성 스타터의 탈안정화에 의해 또는 단백질에 부형제의 직접적인 결합에 의해 달성된다. 안정화제는 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린과 같은 아미노산, 글루코스, 수크로스, 트레할로스와 같은 당, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리올, 인산나트륨, 황산나트륨과 같은 염, EDTA, 헥사포스페이트와 같은 킬레이트화제, 이가 금속 이온(아연, 칼슘 등)과 같은 리간드, 기타 염 또는 유기 분자(예, 페놀 유도체)일 수 있다. 또한, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 덴드리머, PEG 또는 PVP와 같은 올리고머 또는 폴리머 또는 프로타민 또는 HSA가 사용될 수 있다.
(v) 흡착 방지제: 주로 이온성 또는 비이온성 계면활성제 또는 다른 단백질 또는 용해성 고분자가 조성물의 내부 표면 또는 조성물의 용기에 경쟁적으로 피복되거나 흡착되도록 하는데 사용된다. 이의 예는 폴록사머(Pluronic F-68), PEG 도데실 에테르(Brij 35), 폴리소르베이트 20 및 80, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, PEG-폴리히스티딘, BSA 및 HSA 및 젤라틴을 포함한다. 부형제의 농도 및 유형의 선택은 방지하고자 하는 효과에 의해 좌우되지만 전형적으로 계면활성제의 단층이 CMC 값 바로 위의 계면에서 형성된다.
(vi) 동결보호제 및/또는 냉동보호제: 동결 또는 분무 건조 동안에 부형제는 수소 결합 파괴 및 물 제거에 의해 발생된 탈안정화 효과에 직면할 수 있다. 이 목적을 위해 당과 폴리올이 사용될 수 있으나 상응하는 양성 효과가 또한 계면활성제, 아미노산, 비-수성 용매 및 기타 펩타이드에서 관찰되었다. 트레할로스는 수분-감소된 응집을 줄이는데 특히 효과적이며 또한 물에 단백질 소수성 그룹이 노출되어 잠재적으로 발생된 열 안정성을 향상시킨다. 또한, 만니톨 및 수크로스가 단독으로 동결/냉동 보호제로서 사용될 수 있거나 서로 배합되어 사용될 수 있고, 이 경우에 만니톨 대 수크로스의 보다 높은 비율은 동결건조된 케이크의 물리적 안정성을 높여주는 것으로 알려져 있다. 또한 만니톨은 트레할로스와 배합될 수 있다. 또한, 트레할로스는 소르비톨과 배합될 수 있거나, 소르비톨은 단독의 보호제로서 사용될 수 있다. 전분 또는 전분 유도체가 또한 사용될 수 있다.
(vii) 산화 보호제: 아스코르브산, 엑토인, 메티오닌, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 모린, 폴리에틸렌이민(PEI), 프로필 갈레이트, 비타민 E, 킬레이트화제(예, 시트르산, EDTA), 헥사포스페이트, 티오글리콜산과 같은 항산화제.
(viii) 증점제 또는 점도 증강제: 바이알 및 시린지 내에서 입자의 침전을 저지하며 입자의 혼합 및 재현탁을 촉진하고 현탁액이 보다 용이하게(즉, 시린지 플런저에서 적은 힘으로) 주입되도록 하기 위해 사용된다. 적합한 증점제 또는 점도증강제는 예를 들어 Carbopol 940, Carbopol Ultrez 10과 같은 카르보머 증점제, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(하이프로멜로스, HPMC) 또는 디에틸아미노에틸 셀룰로스(DEAE 또는 DEAE-C)와 같은 셀룰로스 유도체, 교질성 규산마그네슘(Veegum) 또는 규산나트륨, 하이드록시에파타이트 겔, 트리칼슘 포스페이트 겔, 크산탄, Satia 검 UT 30과 같은 카라기난, 폴리(D,L- 또는 L-락트산)(PLA) 및 폴리(글리콜산)(PGA) 및 이들의 공중합체(PLGA)와 같은 지방족 폴리(하이드록시 산), D,L-락타이드, 글리콜라이드와 카프로락톤의 터폴리머, 폴록사머, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌)-폴리(옥시에틸렌)의 트리블록(예, Pluronic®)을 구성하는 친수성 폴리(옥시에틸렌) 블록 및 소수성 폴리(옥시프로필렌) 블록, 폴리에틸렌 글리콜 테레프탈레이트/폴리부틸렌 테레프탈레이트 공중합체와 같은 폴리에테르에스테르 공중합체, 수크로스 아세테이트 이소부티레이트(SAIB), 덱스트란 또는 이의 유도체, 덱스트란과 PEG의 배합물, 폴리디메틸실록산, 콜라겐, 키토산, 폴리비닐 알코올(PVA) 및 유도체, 폴리알킬이미드, 폴리(아크릴아미드-코-디알릴디메틸 암모늄(DADMA)), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루로난과 같은 글라이코사미노글라이칸(GAG), 소수성 A-블록(예, 폴리락타이드(PLA) 또는 폴리(락타이드-코-글라코라이드)(PLGA))와 친수성 B-블록(예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리비닐 피롤리돈)으로 구성된 ABA 트리블록 또는 AB 블록 공중합체를 포함한다. 이와 같은 블록 공중합체뿐만 아니라 상기된 폴록사머는 가역적 열적 겔화 거동(투여가 촉진되도록 실온에서 유체 상태 및 주사 후 졸-겔 전이 온도위 체온에서 겔 상태)을 나타낼 수 있다.
(ix) 확산제 또는 분산제: 간질 공간내 세포외 매트릭스의 성분들의 가수분해를 통해 연결 조직의 투과성을 조정하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 연결조직의 세포간 공간에서 발견되는 다당류인 히알루론산을 예로 들 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만 히알루로니다제와 같은 확산제는 세포외 매트릭스의 점도를 일시적으로 감소시키고 주사된 약물의 확산을 촉진한다.
(x) 기타 보조제: 습윤제, 점도조정제, 항생제, 히알루로니다제. 염산 및 수산화나트륨과 같은 산 및 염기는 제조 동안에 pH를 조정하는데 필요한 보조제이다.
바람직하게는, 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 조성물은 하나 이상의 증점제 및/또는 점도 조정제를 함유한다.
용어 "부형제"는 바람직하게는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제 또는 비히클을 가리킨다. 이와 같은 약제학적 부형제는 페트롤리움, 동물, 식물 또는 합성물의 것을 포함한 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있으며 이들로 한정되는 것은 아니지만 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등이 포함된다. 물은 약제학적 조성물이 경구 투여될 때 바람직한 부형제이다. 염수 및 수성 덱스트로스는 약제학적 조성물이 경구 투여될 때 바람직한 부형제이다. 염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 수용액은 바람직하게는 주사 용액용 액체 부형제로서 사용된다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우 조성물은 또한 소량의 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지방성(sustained-release) 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 부형제(예, 트리글리세라이드)와 함께 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카라이드, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는 E. W. Martin에 의해 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 치료제를 바람직하게는 정제된 형태로 환자에게 그 형태의 적절한 투여를 제공하기에 적합한 양의 부형제와 함께 함유한다. 제형은 투여 방식에 맞아야 한다.
일반적인 양태로서 본 발명의 약제학적 조성물은 건식 형태, 현탁액 또는 기타 형태이든 단회 용량 또는 다중 용량 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 한 가지 양태로서 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물은 단회 용량으로 제공되며 이것은 조성물이 저장된 용기가 단회의 약제학적 용량을 함유하고 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 한 가지 관점으로서 조성물은 단회 용량 조성물로서 제공된다.
바람직하게는, 현탁 조성물은 다중 용량 조성물이며, 이것은 단회 이상의 치료 용량을 함유하고 있음을 의미한다. 바람직하게는, 다중 용량 조성물은 2회 이상의 용량을 함유한다. 인슐린-하이드로겔의 그와 같은 다중 용량 조성물은 최초 용량의 투여 후 잔여 용량을 필요시까지 저장해 두고 이를 필요로 하는 다른 환자들을 위해 사용할 수 있거나 한 환자에게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 관점으로서 조성물은 용기에 포함된다. 바람직하게는 용기는 이중 챔버 시린지이다. 특히 본 발명의 건식 조성물은 이중 챔버 시린지의 제1 챔버에 제공되며 재구성 용액이 이중-챔버 시린지의 제2 챔버에 제공된다.
인슐린-하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기 전에 건식 조성물이 재구성된다. 재구성은 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물이 제공되어 있는 용기, 예를 들어 바이알, 시린지, 이중-챔버 시린지, 앰플 및 카트리지에서 발생할 수 있다. 재구성은 예정량의 재구성 용액을 건식 조성물에 첨가함으로써 실시된다. 재구성 용액은 보존제 및/또는 항균제와 같은 추가의 첨가제를 함유할 수 있는 물 또는 완충액과 같은 멸균 액체이다. 인슐린-하이드로겔 프로드럭 조성물이 단회 용량으로서 제공되는 경우, 재구성 용액은 한 가지 이상의 보존제 및/또는 항균제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 재구성 용액은 멸균수이다. 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 조성물이 다중 용량 조성물인 경우, 재구성 용액은 예를 들어 벤질알코올 및 크레졸과 같은 보존제 및/또는 항균제를 하나 이상 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가의 관점은 재구성된 인슐린 하이드로겔 프로드럭 조성물의 투여 방법에 관한 것이다. 인슐린 하이드로겔 프로드럭 조성물은 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 골내 및 복강내를 포함한 주사 또는 주입 방법에 의해 투여될 수 있다.
추가의 관점은 인슐린이 하이드로겔에 일시적으로 연결되어 있는 인슐린 하이드로겔 프로드럭의 치료학적 유효량 및 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 재구성된 조성물을 제조하는 방법이고, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 재구성 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 관점은 인슐린이 상기 방법에 의해 수득가능한 하이드로겔에 일시적으로 연결되어 있는 인슐린 하이드로겔 프로드럭의 치료학적 유효량 및 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 재구성된 조성물이다.
본 발명의 다른 관점은 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 건식 조성물을 제조하는 방법이다. 한 가지 양태로서, 이와 같은 현탁 조성물은 (i) 인슐린-하이드로겔 프로드럭을 하나 이상의 부형제와 혼합하고, (ii) 단회 또는 다중 용량에 해당하는 양을 적합한 용기 내에 넣고, (iii) 상기 용기 내의 조성물을 건조시키고, (iv) 용기를 밀봉하여 제조한다.
적합한 용기는 바이알, 시린지, 이중-챔버 시린지, 앰플 및 카트리지이다.
다른 관점은 부품 키트이다. 투여 장치가 단순히 피하 시린지인 경우 키트는 시린지, 바늘 및 건식 인슐린-하이드로겔 프로드럭 조성물을 함유하고 시린지와 함께 사용하기 위한 용기와 재구성 용액을 함유한 제2 용기를 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 양태로서, 주사 장치는 단순한 피하 시린지가 아닌 다른 것이고, 재구성된 인슐린-하이드로겔 프로드럭을 함유한 별도의 용기가 사용시 용기 안의 액체 조성물이 주사 장치의 출구와 연결되도록 주사 장치와 작동하도록 체결된다. 투여 장치의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 피하 시린지 및 펜 인젝터 장치가 포함된다. 특히 바람직한 주사 장치는 용기가 카트리지, 바람직하게는 단회용 카트리지인 펜 인젝터이다.
바람직한 부품 키트는 본 발명에 따른 조성물을 함유하고 임의로 재구성 용액을 추가로 함유하는 용기 및 바늘을 포함하고, 용기는 바늘과 사용될 수 있도록 체결되어 있다. 바람직하게는 용기는 이중-챔버 시린지이다.
다른 관점으로서, 본 발명은 펜 인젝터 장치에 사용되는 것으로 상기된 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 조성물을 함유한 카트리지를 제공한다. 카트리지는 단회 용량 또는 다중 용량 인슐린을 함유할 수 있다.
본 발명의 한 가지 양태로서, 인슐린-하이드로겔 프로드럭의 현탁 조성물은 인슐린-하이드로겔 프로드럭 및 하나 이상의 부형제뿐만 아니라 다른 생물학적 활성제를 유리 형태로 또는 프로드럭으로서 함유한다. 바람직하게는, 그러한 추가적인 하나 이상의 생물학적 활성제는 프로드럭이며, 더욱 바람직하게는 하이드로겔 프로드럭이다. 그러한 생물학적 활성제는 이들로 한정되는 것은 아니지만 아래 부류의 화합물을 포함한다:
(i) 설포닐우레아(예, 클로로프로파미드, 톨라자미드, 톨부타미드, 글리부라이드, 글리피지드, 글리메피리드 등);
(ii) 메글리티니드(예, 레파글리니드);
(iii) 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 이의 모사체, 글루코스-인슐린분비 펩타이드(GIP) 및 이의 모사체, 엑센딘 및 이의 모사체 및 디펩틸 프로테아제 억제제(DPPIV);
(iv) 비구아니드(예, 메트포르민);
(v) 티아졸리딘디온(예, 로시글리타존, 피오글리타존, 트로글리타존, 이사글리타존(MCC-555로 알려짐), 2-[2-[(2R)-4-헥실-3,4-디하이드로-3-옥소-2H-1,4-벤조옥사진-2-일]에톡시]-벤젠 아세트산 등);
(vi) GW2570 등;
(vii) 레티노이드-X 수용체(RXR) 조절제(예, 타르그레틴, 9-시스-레틴산 등);
(viii) 다른 인슐린 감작 물질(예, INS-1, PTP-1B 억제제, GSK3 억제제, 글리코겐 포스포릴라제 억제제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 억제제 등);
(ix) 일반적 또는 속효성 인슐린, 중효성 및 지속형 인슐린을 포함한 인슐린, 흡인성 인슐린 및 인슐린 유사체(예, 천연 아미노산 서열에서 약간의 차이를 갖는 인슐린 분자);
(x) 인슐린의 소분자 모사체(이들로 한정되는 것은 아니지만 L-783281, TE-17411 등을 포함함);
(xi) Na-글루코스 공수송체 억제제(예, T-1095, T-1095A, 플로리젠 등);
(xii) 아밀린 효능제(이들로 한정되는 것은 아니지만 프람린티드 등);
(xiii) 글루카곤 길항제(AY-279955 등).
당뇨 치료제 이외에, 생활성 화합물은 지방의 분해 및 흡수를 차단하는 췌장 리파제 억제제인 오를리스타트 또는 식욕 억제제이고 뇌에 세로토닌, 노르에피네프린 및 도파민의 재흡수 억제제인 시부트라민과 같은 비만 치료제, 지방 동원을 증가시키는 성장 인자(예, 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자), 옥신토모듈린 및 그렐린 조절제일 수 있다. 다른 잠재적 생활성 비만 치료제는 이들로 한정되는 것은 아니지만 아드레날린성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 벤즈페타민, 펜메트라진, 펜테르민, 디에틸프로피온, 마진돌, 시부트라민, 페닐프로판올아민 또는 에페드린); 세로토닌성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 퀴파진, 플루옥세틴, 세르트랄린, 펜플루라민 또는 덱스펜플루라민); 도파민 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 아포몰핀); 히스타민성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 히스타민 모사체, H3 수용체 조절제); 에너지 소비 증강제(예, 베타-3 아드레날린성 효능제 및 비결합 단백질 기능의 자극제); 렙틴 및 렙틴 모사체(예, 메트렐렙틴); 신경펩타이드 Y 길항제; 멜라노코르틴-1,3 및 4 수용체 조절제; 콜리시스토키닌 효능제; 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 모사체 및 유사체(예, 엑센딘); 안드로겐(예, 데하이드로에피안드로스테론 및 에티오콜란디온과 같은 유도체), 테스토스테론, 아나볼릭 스테로이드(예, 옥산드롤론) 및 스테로이드성 호르몬; 갈라닌 수용체 길항제; 사이토카인제(예, 섬모 신경 영양 인자); 아밀라제 억제제; 엔테로스타틴 효능제/모사체; 오렉신/하이포크레틴 길항제; 유로코르틴 길항제; 봄베신 효능제; 단백질 키나제 A의 조절제; 코르티코트로핀-방출 인자 모사체; 코카인- 및 암페타민-조절 전사 모사체; 칼시토닌-유전자 연관된 펩타이드 모사체; 및 지방산 합성효소 억제제를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명에 따른 인슐린-하이드로겔 프로드럭 조성물은 인슐린-하이드로겔 프로드럭이 이를 필요로 하는 환자에게 우선 투여된 다음 제2 화합물이 투여되도록 제2 생물학적 활성 화합물과 배합된다. 다르게는, 인슐린-하이드로겔 조성물의 투여가 이들 필요로 하는 환자에게 다른 화합물이 투여된 후 이루어진다.
당뇨 치료제 이외에, 생활성 화합물은 지방의 분해 및 흡수를 차단하는 췌장 리파제 억제제인 오를리스타트 또는 식욕 억제제이고 뇌에 세로토닌, 노르에피네프린 및 도파민의 재흡수 억제제인 시부트라민과 같은 비만 치료제, 지방 동원을 증가시키는 성장 인자(예, 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자), 옥신토모듈린 및 그렐린 조절제일 수 있다. 다른 잠재적 생활성 비만 치료제는 이들로 한정되는 것은 아니지만 아드레날린성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 벤즈페타민, 펜메트라진, 펜테르민, 디에틸프로피온, 마진돌, 시부트라민, 페닐프로판올아민 또는 에페드린); 세로토닌성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 퀴파진, 플루옥세틴, 세르트랄린, 펜플루라민 또는 덱스펜플루라민); 도파민 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 아포몰핀); 히스타민성 기전을 통해 작용하는 식욕 억제제(예, 히스타민 모사체, H3 수용체 조절제); 에너지 소비 증강제(예, 베타-3 아드레날린성 효능제 및 비결합 단백질 기능의 자극제); 렙틴 및 렙틴 모사체(예, 메트렐렙틴); 신경펩타이드 Y 길항제; 멜라노코르틴-1,3 및 4 수용체 조절제; 콜리시스토키닌 효능제; 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 모사체 및 유사체(예, 엑센딘); 안드로겐(예, 데하이드로에피안드로스테론 및 에티오콜란디온과 같은 유도체), 테스토스테론, 아나볼릭 스테로이드(예, 옥산드롤론) 및 스테로이드성 호르몬; 갈라닌 수용체 길항제; 사이토카인제(예, 섬모 신경 영양 인자); 아밀라제 억제제; 엔테로스타틴 효능제/모사체; 오렉신/하이포크레틴 길항제; 유로코르틴 길항제; 봄베신 효능제; 단백질 키나제 A의 조절제; 코르티코트로핀-방출 인자 모사체; 코카인- 및 암페타민-조절 전사 모사체; 칼시토닌-유전자 연관된 펩타이드 모사체; 및 지방산 합성효소 억제제를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명에 따른 인슐린-하이드로겔 프로드럭 조성물은 인슐린-하이드로겔 프로드럭이 이를 필요로 하는 환자에게 우선 투여된 다음 제2 화합물이 투여되도록 제2 생물학적 활성 화합물과 배합된다. 다르게는, 인슐린-하이드로겔 조성물의 투여가 이들 필요로 하는 환자에게 다른 화합물이 투여된 후 이루어진다.
본 발명에 기술된 지속형 인슐린 조성물로의 치료를 필요로 하는 환자는 합병증이 발생할 위험이 높다. 따라서, 적절한 생활성 화합물과 본 발명의 지속형 인슐린의 배합은 예를 들어 고혈압(이들로 한정되는 것은 아니지만 고립성 수축기 고혈압 및 가족성 이상지질혈증 고혈압을 포함함), 울혈성 심부전, 좌심실비대, 말초동맥질환, 당뇨망막변증, 황반변성, 백내장, 당뇨병성 신장병증, 사구체경화증, 만성 신부전증, 당뇨성 신경병증, X 증후군, 월경전 증후군, 관상 심장질환, 협심증, 혈전증, 죽상동맥경화, 심근경색, 일과성 뇌허혈 발작, 뇌졸증, 혈관 재협착, 고혈당증, 고인슐린증, 고지혈증, 고중성지방혈증 인슐린 저항성, 포도당 대사 장애, 내당능장애증, 공복 혈당 장애증, 비만, 발기부전, 피부 및 연결 조직 장애, 족부 궤양 및 궤양성 대장염, 내피세포 기능장애 및 손상 혈관 합병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환 및 장애의 예방, 진행 지연 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
상기 그룹 중에서 선택된 질환 및 장애의 예방, 진행 지연 또는 치료는 본 발명의 지속형 인슐린 조성물을 AT1-수용체 길항제; 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제; 레닌 억제제; 베타 아드레날린 수용체 차단제; 알파 아드레날린 수용체 차단제; 칼슘 채널 차단제; 알도스테론 합성효소 억제제; 알도스테론 수용체 길항제; 중성 엔도펩티다제(NEP) 억제제; 이중 안지오텐신 전환 효소/중성 엔도펩티다제(ACE/NEP) 억제제; 엔도텔린 수용체 길항제; 이뇨제; 스타틴; 질산염; 항응고제; 나트륨이뇨 펩타이드; 디기탈리스 화합물; PPAR 조절제를 포함하는 상기 증세를 치료하는데 사용되는 약물 부류로부터 선택된 하나 이상의 생활성 화합물과 배합하여 달성할 수 있다.
따라서, 추가의 관점으로 본 발명은 인슐린 화합물을 적어도 10 mg/ml의 농도로 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 나타냄을 특징으로 하며, 인슐린 화합물로의 치료 또는 예방이 유익한 인슐린 결핍 연관 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 인슐린 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 양태로서, 인슐린 화합물의 농도는 적어도 11 mg/ml, 예를 들면 11 mg/ml 내지 35 mg/ml, 바람직하게는 15 mg/ml 내지 25 mg/ml, 더 바람직하게는 약 20 mg/ml, 훨씬 더 바람직하게는 약 24 mg/ml이다.
사람과 같은 환자에게 시린지 등에 의해 투여되는 용량은 바람직하게는 1.5 ml 미만이며, 전형적으로는 1.0 ml 미만이다.
추가의 양태로서 인슐린 화합물에 의한 치료 또는 예방이 유리한 인슐린 결핍 연관된 질환 또는 장애는 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군중에서 선택된다. 전형적으로는 그러한 질환 또는 장애는 제II형 당뇨병이다.
다른 추가의 양태는 사람 환자와 같은 포유류 환자에서 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 치료 또는 예방에 관한 것이다.
추가의 양태로서, 사람 환자는 당뇨병전증, 내당능장애, 비만, 고혈압, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군으로 진단되었다.
다른 추가의 양태로서, 약동학 프로파일은 사람 혈장과 같은 포유류 혈장에서 측정된다.
추가의 양태로서, 조성물은 특징적으로 2 미만, 예를 들어 1.75 미만, 1.5 미만 또는 1.25 미만의 최대/최저 비를 나타낸다.
다른 추가의 양태로서, 조성물은 특징적으로 투여간 전체 기간 내내 구조적으로 완전한 인슐린 화합물을 연속적으로 방출한다.
추가의 양태로서, 투여간 전체 기간은 적어도 약 80 시간, 예를 들면 약 110 시간, 전형적으로는 1주이다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 프로드럭이다. 이러한 프로드럭은 전형적으로는 화학식 D-L로 나타낸 상기 구조식으로부터 선택될 수 있다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 데포에 완전히 함유되며, 전형적으로는 고분자 겔, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 함유된다. 전형적으로, 완전히 수화된 고분자 매트릭스는 인슐린 분자의 분자간 접촉을 최소화한다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 데포에, 전형적으로는 고분자 겔에, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 공유 결합된다.
추가의 양태로서, 조성물은 특징적으로 주사시 데포를 형성하는 액상 조성물이다.
다른 추가의 양태로서, 조성물은 피하 또는 근육내와 같은 주사에 의해 투여된다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 사람 또는 비사람 인슐린 또는 인슐린 유사체 및 유도체 또는 이의 접합체 중에서 선택된다. 보다 바람직한 것은 사람 인슐린 및 인슐린 유사체이며, 예로는 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글루리신을 들 수 있다.
다른 추가의 양태로서, 투여 후 최초 24시간내, 예를 들면 투여 후 최초 12시간내 또는 투여 후 최초 6시간 내에 최대 농도에 도달한다.
추가의 양태로서, 조성물은 추가로 GLP-1 화합물을 포함한다.
다른 추가의 양태는 GLP-1 화합물과의 배합이다. 전형적으로는, 인슐린 화합물이 일차로 투여되거나 반대로 이차로될 수 있으며, 인슐린 화합물과 GLP-1 화합물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 혈중에 인슐린 화합물의 치료학적 유효 수준을 적어도 3일 동안, 전형적으로는 적어도 80시간 동안, 예를 들어 1주 또는 그 이상 동안 유지하기에 충분한 농도로 인슐린 화합물의 치료학적 유효량을 투여하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 나타냄을 특징으로 하는, 인슐린 화합물에 의한 치료 또는 예방이 유리한 인슐린 결핍 연관된 질환 또는 장애, 예를 들면 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 포유류 환자를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 적어도 10 mg/ml의 농도로 인슐린 화합물의 치료학적 유효량을 투여하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 나타냄을 특징으로 하는, 인슐린 화합물에 의한 치료 또는 예방이 유리한 인슐린 결핍 연관된 질환 또는 장애, 예를 들면 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 포유류 환자를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 포유류 환자, 예를 들면 사람 환자의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 전형적으로, 사람 환자는 당뇨병전증, 내당능장애, 비만, 고혈압, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군으로 진단받은 자이다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물의 농도는 적어도 11 mg/ml이고, 예를 들어 11 mg/ml 내지 35 mg/ml이다.
다른 추가의 양태로서, 약동학 프로파일은 사람 혈장과 같은 포유류 혈장에서 측정된다.
추가의 양태로서, 조성물은 특징적으로 2 미만, 예를 들어 1.75 미만, 1.5 미만 또는 1.25 미만의 최대/최저 비를 나타낸다.
다른 추가의 양태로서, 조성물은 특징적으로 투여간 전체 기간 내내 구조적으로 완전한 인슐린 화합물을 연속적으로 방출한다.
추가의 양태로서, 투여간 전체 기간은 적어도 약 80 시간, 예를 들면 약 110 시간, 전형적으로는 1주이다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 프로드럭, 예를 들면 본원에 기술된 프로드럭 중 어느 하나이다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 데포에 완전히 함유되며, 전형적으로는 고분자 겔, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 함유된다.
다른 추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 데포에, 전형적으로는 고분자 겔에, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 공유 결합된다.
추가의 양태로서 조성물은 특징적으로 주사시 데포를 형성하는 액상 조성물이다.
다른 추가의 양태로서 조성물은 특징적으로 피하 또는 근육내와 같은 주사에 의해 투여된다.
추가의 양태로서, 인슐린 화합물은 사람 또는 비사람 인슐린 또는 인슐린 유사체 및 유도체 또는 이의 접합체 중에서 선택된다. 보다 바람직한 것은 사람 인슐린 및 인슐린 유사체이며, 예로는 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글루리신을 들 수 있다. 추가의 양태로서, 투여 후 최초 24시간내, 예를 들면 투여 후 최초 12시간내 또는 투여 후 최초 6시간 내에 최대 농도에 도달한다.
추가의 관점에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 GLP-1 화합물을 추가로 포함한다.
다른 추가의 양태는 GLP-1 화합물과의 배합이다. 전형적으로는, 인슐린 화합물이 일차로 투여되거나 반대로 이차로 투여될 수 있으며, 인슐린 화합물과 GLP-1 화합물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
추가의 관점에서, 본 발명은 본원에 기재된 양태 중 어느 하나의 약제학적 조성물 및 상기 조성물을 투여하기 위한 용기를 포함하는 부품 키트에 관한 것이다. 전형적으로, 상기 용기는 시린지이다.
키트의 양태는 추가로 GLP-1 화합물을 포함한다.
도 1a는 인슐린-링커 접합체 12a의 UPLC 크로마토그램이다.
도 1b는 인슐린-링커 접합체 12b의 UPLC 크로마토그램이다.
도 2는 2주에 걸쳐 건강한 래트에 6 mg 인슐린을 함유한 시험물질 11a의 단회 피하 투여 후 동물 1-10의 평균 인슐린 혈중 농도를 보여준다(오차 막대는 10 마리 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 3일전에 취한 것이다).
도 3은 13일의 기간에 걸쳐 건강한 래트에 3 mg 인슐린을 함유한 시험물질 11da의 단회 피하 투여 후 동물 1-8의 평균 인슐린 혈중 농도를 보여준다(오차 막대는 8 마리 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 1일전에 취한 것이다).
도 4는 당뇨 래트(n=7)에 6.4 mg 인슐린을 함유한 시험물질 11da의 단회 피하 투여 후 인슐린 혈중 농도(회색 사각형) 및 혈당 수준(검정색 원형)을 보여준다(오차 막대는 7 마리 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 4일전에 취한 것이다).
도 5는 건강한 래트에 시험물질 11 db 8 mg/kg의 단회 피하 투여 후 최초 24시간 동안의 평균 인슐린 혈중 농도를 보여준다(버스트 분석). 8 마리 래트는 두 그룹으로 나누고 두 그룹 사이에서 교대로 약동학을 위해 혈액 시료를 채취하였다. 어느 그룹도 인지할 수 있는 버스트 효과는 없었다(오차 막대는 그룹당 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 1일전에 취한 것이다).
도 6은 당뇨 래트(n=8)에 시험물질 11da 8 mg/kg의 3주 피하 투여 후 4주 기간 동안의 인슐린 혈중 농도(회색 사각형) 및 혈당 수준(검정색 원형)을 보여준다(오차 막대는 8 마리의 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 3일전에 취한 것이다).
도 7은 13일의 기간에 걸쳐 건강한 래트에 시험물질 11dc로 제형된 12 mg/kg 인슐린의 단회 피하 주사 후 동물 1-8(0.3, 1h, 2h 및 4h 값에서의 개개 동물 1-4 및 동물 5-8)의 평균 인슐린 혈중 농도를 보여준다(오차 막대는 8 마리의 모든 동물로부터 산출된 ± 표준편차로서 제시된 것이며, t0 값은 투여 4일전에 취한 것이다).
도 8은 인슐린-링커-하이드로겔 11a의 인슐린 방출과 하이드로겔 분해의 오버레이를 보여준다. pH 7.4 및 37℃에서 인슐린-링커-하이드로겔을 배양했을 때 인슐린-링커-하이드로겔에서의 인슐린 함량(삼각형) 및 골격 모이어티 방출의 양(원형)이 배양 시간 별로 표시되어 있다.
도 9는 30 G 바늘을 사용했을 때의 작용력 대 유동성을 표시한 그래프를 보여준다. 데이터 포인트: 검정색 사각형 = 에틸렌 글리콜; 검정색 삼각형 = 물; 검정색 점 = 하이드로겔 인슐린 프로드럭.
실시예
재료 및 방법
재조합 사람 인슐린은 인도 방갈로르 소재의 Biocon Ltd.로부터 입수하였다. 아미노 4-아암 PEG 5kDa는 중국 베이징 소재의 JenKem Technology로부터 입수하였다. N-(3-말레이미도프로필)-21-아미노-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-헤네이코사노산 NHS 에스테르(Mal-PEG6-NHS)는 독일 베를린 소재 Celares GmbH로부터 입수하였다.
2-클로로트리틸 클로라이드 수지, HATU, N-사이클로헥실-카르보디이미드-N'-메틸 폴리스티렌 및 아미노산은 달리 언급되지 않는 한 독일 쉬발바흐/Ts 소재의 Merck Biosciences GmbH로부터 입수하였다. Fmoc(NMe)-Asp(OtBu)-OH는 스위스 부벤도르프 소재의 Bachem AG로부터 입수하였다. S-트리틸-6-머캅토헥사노산은 프랑스 스트라스부르 소재의 Polypeptide로부터 구입하였다. 사용된 아미노산은 달리 언급되지 않는 한 L 배위이다.
모든 다른 화학물질은 독일 타우프키르첸 소재의 Sigma-ALDRICH Chemie GmbH로부터 입수하였다.
고체상 합성은 1.3 mmol/g의 로딩으로 2-클로로트리틸 클로라이드(TCP) 수지상에서 실시하였다. 폴리프로필렌 프릿이 장착된 시린지를 반응 용기로 사용하였다.
수지에 제1 아미노산의 로딩은 제조사의 지침에 따라 실시하였다.
Fmoc 탈보호:
Fmoc 보호 그룹의 제거를 위해 수지를 2/2/96(v/v/v) 피페리딘/DBU/DMF와 함께 교반하고(2회 각 10분씩) DMF로 세척하였다(10회).
Fmoc-Aib-로딩된 수지의 Fmoc 탈보호:
고정된 Fmoc-Aib-OH의 Fmoc 탈보호는 50℃에서 20분 동안 수지를 DMF/피페리딘에서 4/1(v/v)로 2회 교반시킴으로써 달성하였다.
2-클로로트리틸 클로라이드 수지의 절단 프로토콜:
합성이 완성되었을 때 수지를 DCM으로 세척하고, 진공 건조시킨 다음, 6/4(v/v) DCM/HFIP로 30분 동안 2회 처리하였다. 용출물을 합치고, 휘발성 물질을 질소 스트림 하에서 제거한 다음, 생성된 조 산물을 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 산물을 함유한 HPLC 분획을 합치고 동결건조시켰다.
TFA 염으로서 수득된 아민 함유 산물을 이온 교환 수지(미국 슈펠코 소재의 Discovery DSC-SAX)를 사용하여 상응하는 HCl 염으로 전환시켰다. 이 단계는 잔여 TFA가 예를 들어 후속 결합 반응을 방해할 것으로 예상되는 경우에 실시하였다.
RP-HPLC 정제:
RP-HPLC는 Waters 600 HPLC 시스템 및 Waters 2487 흡광 검출기에 연결된 1000x20 mm 또는 1000x40 mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μ 컬럼(독일 암머부흐 소재의 Dr. Maisch)에서 실시하였다. 용액 A(수 중 0.1% TFA) 및 용액 B(아세토니트릴 중 0.1% TFA)의 선형 구배가 사용되었다. 산물을 함유한 HPLC 분획은 동결건조하였다.
섬광 크로마토그래피:
섬광 크로마토그래피는 스웨덴 바이오타게 AB 소재의 Isolera One System에서 Biotage KP-Sil 실리카 카트리지 및 용출제로서 n-헵탄과 에틸 아세테이트를 사용하여 실시하였다. 산물은 254 nm에서 검출되었다.
하이드로겔 비드를 위해, 폴리프로필렌 프릿이 장착된 시린지가 세척 단계를 위해 반응 용기로서 사용되었다.
분석 방법:
분석용 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)는 Thermo Scientific의 LTQ Orbitrap Discovery 질량분석기에 연결된 Waters BEH300 C18 컬럼(2.1 x 50 mm, 1.7 ㎛ 입도)이 장착된 Waters Acquity System에서 수행하였다.
PEG 산물의 MS는 PEG 출발 물질의 다분산성으로 인해 일련의 (CH2CH2O)n 모이어티를 보여주었다. 보다 간편한 해석을 위해 단지 하나의 대표적인 m/z 신호가 실시예에 제시된다. 인슐린 접합체의 MS는 대표적인 동위원소로 보고되며 4 가지 양성자 부가물 [M+4H]4+를 가리킨다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 달리 언급되지 않는 한 0.45 ㎛ 입구 필터가 구비된 Superdex200 5/150 GL 컬럼이 장착된 Amersham Bioscience AEKTAbasic System을 사용하여 실시하였다(Amersham Bioscience/GE Healthcare). 20 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4가 이동상으로서 사용되었다.
실시예 1
골격 시약 1g의 합성
Figure pct00038
아래의 스킴에 따라 아미노 4-아암 PEG5000 1a로부터 골격 시약 1g를 합성하였다:
Figure pct00039
화합물 1b의 합성을 위해, 아미노 4-아암 PEG5000 1a(분자량 약 5200 g/mol, 5.20 g, 1.00 mmol, HCl 염)을 20 mL의 DMSO(무수)에 용해시켰다. DMSO(무수) 5 mL 중의 Boc-Lys(Boc)-OH(2.17 g, 6.25 mmol), EDC HCl(1.15 g, 6.00 mmol), HOBt?H2O(0.96 g, 6.25 mmol) 및 콜리딘(5.20 mL, 40 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반시켰다.
반응 혼합물을 디클로로메탄 1200 mL로 희석하고 600 mL의 0.1 N H2SO4(2회), 염수(1회), 0.1 M NaOH(2회) 및 1/1(v/v) 염수/물(4회)로 세척하였다. 수성 층을 DCM 500 mL로 재추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 증발시켜 조 산물 1b 6.3 g을 무색 오일로서 수득하였다. 화합물 1b는 RP-HPLC로 정제하였다.
수율 3.85 g(59%) 무색 유리질 산물 1b.
MS: m/z 1294.4=[M+5H]5+(계산치=1294.6).
메탄올 5 mL 중의 화합물 1b 3.40 g(0.521 mmol) 및 디옥산 중의 4N HCl 9 mL을 실온에서 15분 동안 교반시켜 화합물 1c를 수득하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 산물은 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 1151.9=[M+5H]5+(계산치=1152.0).
화합물 1d의 합성을 위해, 화합물 1c 3.26 g(0.54 mmol)을 DMSO(무수) 15 mL 중에 용해시켰다. DMSO(무수) 15 mL 중의 Boc-Lys(Boc)-OH 2.99 g(8.64 mmol), EDC HCl 1.55 g(8.1 mmol), HOBt?H2O 1.24 g(8.1 mmol) 및 콜리딘 5.62 mL(43 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다.
반응 혼합물을 DCM 800 mL로 희석하고 400 mL의 0.1 N H2SO4(2회), 염수(1회), 0.1 M NaOH(2회) 및 1/1(v/v) 염수/물(4회)로 세척하였다. 수성 층을 DCM 800 mL로 재추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켜 유리질 조 산물을 수득하였다.
산물을 DCM 중에 용해시키고 냉각된(-18℃) 디에틸에테르로 침전시켰다. 이 절차를 2회 반복하고 침전물을 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 4.01 g(89%) 무색 유리질 산물 1d. 이 산물은 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 1405.4=[M+6H]6+ (계산치=1405.4).
메탄올 7 mL 중의 화합물 1d(3.96 g, 0.47 mmol)의 용액 및 디옥산 중의 4 N HCl 20 mL를 실온에서 15분 동안 교반시켜 화합물 1e를 수득하였다. 휘발성 물질을 진공 하에서 제거하였다. 산물을 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 969.6=[M+7H]7+ (계산치=969.7).
화합물 1f의 합성을 위해, 화합물 1e 3.55 g(0.48 mmol)을 DMSO(무수) 20 mL 중에 용해시켰다. DMSO(무수) 18.8 mL 중의 Boc-Lys(Boc)-OH 5.32 g(15.4 mmol), EDC HCl 2.76 g(14.4 mmol), HOBt?H2O 2.20 g(14.4 mmol) 및 콜리딘 10.0 mL(76.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반하였다.
반응 혼합물을 DCM 800 mL로 희석하고 400 mL의 0.1 N H2SO4(2회), 염수(1회), 0.1 M NaOH(2회) 및 1/1(v/v) 염수/물(4회)로 세척하였다. 수성 층을 DCM 800 mL로 재추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 증발시켜 조 산물 1f를 무색 오일로서 수득하였다.
산물을 DCM 중에 용해시키고 냉각된(-18℃) 디에틸에테르로 침전시켰다. 이 절차를 2회 반복하고 침전물을 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 4.72 g(82%) 무색 유리질 산물 1f. 이 산물은 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 1505.3=[M+8H]8+ (계산치=1505.4).
메탄올 20 mL 중의 화합물 1f(분자량 약 12035 g/mol, 4.72 g, 0.39 mmol)의 용액 및 디옥산 중의 4 N HCl 40 mL를 실온에서 30분 동안 교반시켜 화합물 1g를 수득하였다. 휘발성 물질을 진공 하에서 제거하였다.
수율 3.91 g(100%), 유리질 산물 골격 시약 1 g.
MS: m/z 977.2=[M+9H]9+ (계산치=977.4).
1g의 다른 합성 경로
화합물 1d의 합성을 위해, iPrOH(무수) 250 mL 중의 4-아암-PEG5000 테트라아민(1a)(50.0 g, 10.0 mmol)의 현탁액에 boc-Lys(boc)-OSu(26.6 g, 60.0 mmol) 및 DIEA(20.9 mL, 120 mmol)을 45℃에서 첨가하고 혼합물을 30분 동안 교반하였다.
이어서, n-프로필아민(2.48 mL, 30.0 mmol)을 첨가하였다. 5분 후 용액을 MTBE 1000 mL로 희석하고 교반하지 않으면서 -20℃에 밤새 저장해 두었다. 약 500 mL의 상청액을 디캔팅하여 버렸다. 냉 MTBE 300 mL를 첨가하고 1분의 진탕 후 글라스 필터를 통해 여과하여 산물을 수거하여 500 mL의 냉 MTBE로 세척하였다. 산물을 16시간 동안 진공 하에서 건조시켰다.
수율 65.6 g(74%) 1b(백색의 괴상 고체).
MS: m/z 937.4=[M+7H]7+ (계산치=937.6).
2-프로판올 156 mL 중에 전 단계의 화합물 1b(48.8 g, 7.44 mmol)을 40℃에서 교반시켜 화합물 1c를 수득하였다. 2-프로판올 196 mL와 아세틸클로라이드 78.3 mL의 혼합물을 1 내지 2분간 교반 하에 첨가하였다. 용액을 40℃에서 30분간 교반한 다음, -30℃로 밤새 교반하지 않고서 냉각시켰다. 냉 MTBE 100 mL를 첨가하고, 현탁액을 1분간 진탕하고 -30℃에서 1시간 동안 냉각시켰다. 글라스 필터를 통해 여과하여 산물을 수거하고 냉 MTBE 200 mL로 세척하였다. 산물을 16시간 동안 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 38.9 g(86%) 1c(백색 분말).
MS: m/z 960.1=[M+6H]6+ (계산치=960.2).
화합물 1d의 합성을 위해, 2-프로판올 80 mL 중의 전 단계의 1c(19.0 g, 3.14 mmol)의 현탁액에 boc-Lys(boc)-OSu(16.7 g, 37.7 mmol)과 DIEA(13.1 mL, 75.4 mmol)을 45℃에서 첨가하고 혼합물을 45℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, n-프로필아민(1.56 mL, 18.9 mmol)을 첨가하였다. 5분 후 용액을 냉 MTBE 600 mL로 침전시키고 원심분리하였다(3000 min-1, 1분). 침전물을 1시간 동안 진공 하에서 건조시키고 THF 400 mL 중에 용해시켰다. 디에틸 에테르 200 mL를 첨가하고 산물을 교반하지 않고서 16시간 동안 -30℃로 냉각시켰다. 현탁액을 글라스 필터로 여과하고 냉 MTBE 300 mL로 세척하였다. 산물을 16시간 동안 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 21.0 g(80%) 1d(백색 고체).
MS: m/z 1405.4=[M+6H]6+ (계산치=1405.4).
전 단계의 화합물 1d(15.6 g, 1.86 mmol)를 메탄올(81 mL, 243 mmol) 중의 3 N HCl 중에 용해시키고 40℃에서 90분간 교반시켜 화합물 1e를 수득하였다. MeOH 200 mL 및 iPrOH 700 mL를 첨가하고 혼합물을 -30℃에서 2시간 동안 저장하였다. 결정화의 완성을 위해, MTBE 100 mL를 첨가하고 현탁액을 밤새 -30℃에서 저장하였다. 냉 MTBE 250 mL를 첨가하고, 현탁액을 1분간 진탕시킨 다음 글라스 필터를 통해 여과하고 냉 MTBE 100 mL로 세척하였다. 산물을 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 13.2 g(96%) 1e(백색 분말).
MS: m/z 679.1=[M+10H]10+ (계산치=679.1).
화합물 1f의 합성을 위해, 2-프로판올 165 mL 중의 전 단계의 1e(8.22 g, 1.12 mmol)의 현탁액에 boc-Lys(boc)-OSu(11.9 g, 26.8 mmol) 및 DIEA(9.34 mL, 53.6 mmol)을 45℃에서 첨가하고 혼합물을 30분간 교반하였다. 이어서, n-프로필아민(1.47 mL, 17.9 mmol)을 첨가하였다. 5분 후 용액을 2시간 동안 -18℃로 냉각시킨 다음, 냉 MTBE 165 mL를 첨가하고 현탁액을 1분간 진탕시킨 후 글라스 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 필터 케이크를 200 mL의 냉 MTBE/iPrOH 4:1(4회) 및 200 mL의 냉 MTBE(1회)로 세척하였다. 산물을 진공 하에서 16시간 동안 건조시켰다.
수율: 12.8 g, MW(90%) 1f(담황색 괴상 고체).
MS: m/z 1505.3=[M+8H]8+ (계산치=1505.4).
MeOH 30 mL 중에 4ArmPEG5kDa(-LysLys2Lys4(boc)8)4(1f)(15.5 g, 1.29 mmol)를 용해시키고 0℃로 냉각시켜 골격 시약 1g를 수득하였다. 디옥산(120 mL, 480 mmol, 0℃로 냉각됨) 중의 4 N HCl을 3분 내에 첨가하고 빙욕을 제거하였다. 20분 후 메탄올(200 mL, 600 mmol, 0℃로 냉각됨) 중의 3 N HCl을 15분 내에 첨가하고 용액을 실온에서 10분간 교반하였다. 냉 MTBE 480 mL로 산물 용액을 침전시키고 3000 rpm으로 1분간 원심분리하였다. 침전물을 1시간 동안 진공 하에서 건조시키고 MeOH 중에 재용해시킨 후 냉 MTBE 240 mL로 침전시키고 현탁액을 3000 rpm으로 1분간 원심분리하였다. 산물 1g를 진공 하에 건조시켰다.
수율: 11.5 g(89%)(연황색 플레이크).
MS: m/z 1104.9=[M+8H]8+ (계산치=1104.9).
실시예 2
가교 시약 2d의 합성
아래 스킴에 따라 아디프산 모노 벤질 에스테르(English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) 및 PEG2000으로부터 가교 시약 2d를 제조하였다:
Figure pct00040

디클로로메탄(90.0 mL) 중의 PEG 2000(2a)(11.0 g, 5.5 mmol)과 벤질 아디페이트 하프-에스테르(4.8 g, 20.6 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 디사이클로헥실카르보디이미드(4.47 g, 21.7 mmol)을 첨가하고 이어서 촉매량의 DMAP(5 mg)을 첨가한 다음, 용액을 교반하고 밤새(12 시간) 실온에 도달하도록 두었다. 플라스크를 5시간 동안 +4℃에 저장하였다. 고체를 여과하고 진공 하에서의 증류에 의해 용매를 완전히 제거하였다. 잔류물을 1000 mL 1/1(v/v) 디에틸 에테르/에틸 아세테이트 중에 용해시키고 실온에 2시간 동안 저장하였으며, 이때 소량의 플레이크상의 고체가 형성되었다. Celite®의 패드를 통해 여과하여 고체를 제거하였다. 용액을 완전히 밀폐된 플라스크에 넣고 결정화가 완성될 때까지 12시간 동안 -30℃의 냉동고에 저장하였다. 결정 산물을 글라스 프릿을 통해 여과하고 냉각된 디에틸 에테르(-30℃)로 세척하였다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켰다.
수율: 11.6 g(86%) 2b(무색 고체). 산물은 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 813.1=[M+3H]3+ (계산치=813.3).
500 mL 글라스 오토클레이브에서 PEG2000-bis-아디프산-bis-벤질 에스테르 2b(13.3 g, 5.5 mmol)를 에틸 아세테이트(180 mL) 중에 용해시키고 목탄상 10% 팔라듐(0.4 g)을 첨가하였다. 수소의 소모가 정지될 때까지(5 내지 12 시간) 용액을 6 bar, 40℃에서 수소화하였다. Celite®의 패드를 통한 여과에 의해 촉매를 제거하고 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 수율: 12.3 g(정량) 2c(황색 오일). 산물은 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 753.1=[M+3H]3+ (계산치=753.2).
DCM(무수) 75 mL 중의 PEG2000-bis-아디프산 하프 에스테르 2c(9.43 g, 4.18 mmol), N-하이드록시석신이미드(1.92 g, 16.7 mmol)와 디사이클로헥실카르보디이미드(3.44 g, 16.7 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 침전물을 여과하였다. DCM을 증발시키고 잔류물을 THF로부터 재결정하였다.
수율: 8.73 g(85%) 가교 시약 2d(무색 고체).
MS: m/z 817.8=[M+3H]3+ (계산치=817.9 g/mol).
실시예 3
유리 아미노 그룹을 함유한 하이드로겔 비드 (3) 및 (3a)의 제조
DMSO 14 mL중의 1 g 275 mg과 2d 866 mg의 용액을 헵탄 60 mL중의 Arlacel P135(Croda International Plc) 100 mg의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 25℃하에 통상의 금속 교반기로 700 rpm에서 10분간 교반하여 현탁액을 생성하였다. N,N,N',N'-테트라메틸-에틸렌디아민 1.0mL를 첨가하여 중합시켰다. 2시간 후 교반기 속도를 400 rpm으로 줄이고 혼합물을 추가로 16시간 동안 교반하였다. 아세트산 1.5 mL를 첨가한 다음 10분 후 물 50 mL를 첨가하였다. 5분 후 교반기를 정지시키고 수성 상을 따라냈다.
비드 크기별 분별을 위해, 물-하이드로겔 현탁액을 75, 50, 40, 32 및 20 ㎛ 망 스틸 체에서 습식 체질하였다. 32, 40 및 50 ㎛ 체에 걸러진 비드 분획을 모아서 물로 3회, 에탄올로 10회 세척하고, 0.1 mbar에서 16시간 동안 건조시켜 3을 백색 분말로서 수득하였다.
1g 1200 mg, 2d 3840 mg, DMSO 28.6 mL, Arlacel P135 425 mg, 헵탄 100 mL 및 TMEDA 4.3 mL를 사용하는 것을 제외하고 3에 대해 기술한 바와 같이 3a를 제조하였다. 후처리를 위해, 아세트산 6.6 mL를 첨가한 다음 10분 후 물 50 mL 및 염화나트륨 포화 수용액 50 mL를 첨가하였다.
Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206에 기술된 바와 같이 하이드로겔상의 유리 아미노 그룹에 fmoc-아미노산을 접합시키고 이어서 fmoc를 측정하여 하이드로겔의 아미노 그룹 함량을 결정하였다.
3 및 3a의 아미노 그룹 함량은 0.11 내지 0.16 mmol/g인 것으로 측정되었다.
실시예 4
말레이미드 작용화된 하이드로겔 비드 (4) 및 (4a) 및 (4aa)의 제조 및 말레이미드 치환의 결정
Figure pct00041
2/1(v/v) 아세토니트릴/물 4.5 mL 중의 Mal-PEG6-NHS 600 mg(1.0 mmol)의 용액을 무수 하이드로겔 비드 200 mg에 첨가하였다. 인산나트륨 완충액 500 ㎕(pH 7.4, 0.5 M)를 첨가하고 현탁액을 실온에서 30분간 교반시켰다. 비드 4를 2/1(v/v) 아세토니트릴/물, 메탄올 및 1/1/0.001(v/v/v) 아세토니트릴/물/TFA로 5회 세척하였다. 3 대신에 3a를 사용하는 것을 제외하고 상기된 바와 같이 4a를 합성하였다.
다르게는, 99/1(v/v) DMSO/DIEA로 하이드로겔 비드 3a를 사전에 세척하고, DMSO로 세척한 다음 DMSO 중의 Mal-PEG6-NHS(하이드로겔 상의 아미노 그룹의 이론상 양에 대해 상대적으로 2 당량)의 용액과 함께 45분간 배양하였다. 비드 4aa를 DMSO로 2회, pH 3.0 석시네이트(20 mM, 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 시료를 실온 하에 pH 6.0 인산나트륨(50 mM, 50 mM 에탄올아민, 0.01% 트윈-20) 중에서 1시간 동안 배양하고 pH 3.0 나트륨 석시네이트(20 mM, 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)로 3회 세척하였다.
말레이미드 함량을 결정하기 위해, 하이드로겔 비드 4, 4a 또는 4aa의 분취량을 각각 동결건조시키고 중량을 측정하였다. 하이드로겔 비드 4, 4a 또는 4aa의 다른 분취량을 각각 과량의 머캅토에탄올과 반응시키고(실온 하에 50 mM 인산나트륨 완충액 중에서 30분) 엘만 시험(Ellman, G. L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95)에 의해 머캅토에탄올 소모를 검정하였다. 말레이미드 함량은 0.11 내지 0.13 mmol/g 무수 하이드로겔인 것으로 결정되었다.
실시예 5
링커 시약 5d의 합성
링커 시약 5d를 아래 스킴에 따라 합성하였다:
Figure pct00042
링커 시약 중간체 5a의 합성:
4-메톡시트리틸 클로라이드(3 g, 9.71 mmol)을 DCM(20 mL) 중에 용해시키고 DCM(20 mL) 중의 에틸렌디아민(6.5 mL, 97.1 mmol)의 용액에 적하 첨가하였다. 2시간 후 용액을 디에틸 에테르(300 mL)에 붓고 30/1(v/v) 염수/0.1 M NaOH 용액(각각 50 mL)로 3회, 염수(50 mL)로 1회 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 휘발성 물질을 감압 하에 제거하여 Mmt-보호된 중간체(3.18 g, 9.56 mmol)를 수득하였다.
Mmt-보호된 중간체(3.18 g, 9.56 mmol)을 무수 DCM(30 mL) 중에 용해시켰다. 6-(트리틸머캅토)-헥산산(4.48 g, 11.47 mmol), PyBOP(5.67 g, 11.47 mmol) 및 DIEA(5.0 mL, 28.68 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 교반시켰다. 용액을 디에틸 에테르(250 mL)로 희석시키고 30/1(v/v) 염수/0.1 M NaOH 용액(각각 50 mL)로 3회, 염수(50 mL)로 1회 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 5a를 섬광 크로마토그래피로 정제하였다.
수율: 5.69 g(8.09 mmol).
MS: m/z 705.4=[M+4]+, (계산치=705.0).
링커 시약 중간체 5b의 합성:
무수 THF(50 mL) 중의 5a(3.19 g, 4.53 mmol)의 용액에 BH3?THF(1 M 용액, 8.5 mL, 8.5 mmol)를 첨가하고 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 추가로 BH3?THF(1 M 용액, 14 mL, 14 mmol)를 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 메탄올(8.5 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, N,N-디메틸-에틸렌디아민(3 mL, 27.2 mmol)을 첨가한 다음, 용액을 3시간 동안 환류 가열하고 교반하였다. 혼합물을 실온에서 에틸 아세테이트(300 mL)로 희석하고, Na2CO3 포화 수용액(2 x 100 mL) 및 NaHCO3 포화 수용액(2 x 100 mL)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켜 조 아민 중간체(3.22 g)를 수득하였다.
아민 중간체를 DCM(5 mL) 중에 용해시키고, Boc2O(2.97 g, 13.69 mmol)를 DCM(5 mL) 중에 용해시키며, DIEA(3.95 mL, 22.65 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 교반시켰다. 혼합물을 섬광 크로마토그래피로 정제하여 조 Boc- 및 Mmt-보호된 중간체(3 g)를 수득하였다.
MS: m/z 791.4=[M+H]+, 519.3=[M-Mmt+H]+ (계산치=791.1).
0.4 M 수성 HCl(48 mL)를 아세토니트릴(45 mL) 중의 Boc- 및 Mmt-보호된 중간체의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 아세토니트릴(10 mL)로 희석하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 5 M NaOH 용액을 첨가하여 반응 혼합물의 pH 값을 5.5로 조정하고, 감압 하에서 아세토니트릴을 제거하며, 수용액을 DCM(4 x 100 mL)로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 조 5b는 정제하지 않고 사용하였다.
수율: 2.52 g(3.19 mmol).
MS: m/z 519.3=[M+H]+, (MW 계산치=518.8 g/mol).
링커 시약 중간체 5c의 합성:
5b(780 mg, 0.98 mmol, 약 65% 순도) 및 NaCNBH3(128 mg, 1.97 mmol)을 무수 메탄올(13 mL) 중에 용해시켰다. DCM(2 mL) 중의 2,4-디메톡시벤즈알데하이드(195 mg, 1.17 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 조 산물을 DCM 중에 용해시키며, NaCO3 포화 용액으로 세척하였다. 수성상을 DCM으로 3회 추출하고, 합친 유기상을 염수로 세척한 다음, MgSO4로 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 용출제로서 DCM 및 MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 5c를 정제하였다.
수율: 343 mg(0.512 mmol).
MS: m/z 669.37=[M+H]+, (계산치=669.95).
링커 시약 5d의 합성:
Fmoc-Aib-로딩된 TCP 수지(980 mg, 약 0.9 mmol)을 DMF/피페리딘으로 탈보호하고, DMF(5회) 및 DCM(6회)로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 수지를 무수 THF(6 mL) 중의 p-니트로페닐 클로로포르메이트(364 mg, 1.81 mmol)과 콜리딘(398 ㎕, 3.0 mmol)의 용액으로 처리하고, 30분간 진탕시켰다. 시약 용액을 여과에 의해 제거하고 수지를 THF(5회)로 세척한 후 무수 THF(6 mL) 중의 아민 5c(490 mg, 0.7 mmol)과 DIEA(1.23 mL, 7.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 진탕시킨 후 시약 용액을 여과에 의해 제거하고 수지를 DCM(5회)으로 세척하였다. 수지로부터 링커 시약을 절단하고 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 산물 분획에 NaHCO3 포화 수용액을 첨가하여 pH 6으로 조정하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 슬러리를 포화 수성 NaCl과 DCM 사이에 분배하고, 수성층을 DCM으로 추출하였다. 합친 유기상을 농축 건조시켜 링커 시약 5d를 수득하였다.
수율: 230 mg(0.29 mmol).
MS: m/z 798.41=[M+H]+, (계산치=798.1).
실시예 6
링커 시약 6c의 합성
아래 스킴에 따라 링커 시약 6c를 합성하였다:
Figure pct00043
아민 6a의 합성:
트리페닐메탄티올(11.90 g, 43.08 mmol)을 DMSO(40 mL) 중에 현탁시켰다. DBU(7.41 mL, 49.55 mmol) 및 6-브로모헥실프탈이미드(13.32 g, 42.94 mmol)을 첨가하고 혼합물을 약 15분간 반응이 이루어지도록 두었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(700 mL)와 0.1 M HCl(200 mL) 사이에 분배하였다. 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고 합친 유기 분획을 NaHCO3 포화용액(80 mL) 및 염수(80 mL)로 세척한 후 MgSO4로 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 황색 오일을 n-헵탄/에틸 아세테이트로부터 재결정화하였다. 중간체 6-(S-트리틸-)머캅토헥실프탈이미드가 백색 고체(13.3 g, 26.4 mmol, 62%)로서 수득되었다.
6-(S-트리틸-)머캅토헥실프탈이미드(14.27 g, 28.2 mmol)을 에탄올(250 mL) 중에 재현탁시켰다. 하이드라진 수화물(3.45 mL, 70.5 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 환류 가열하였다. 혼합물을 여과하고 여액을 진공 하에 농축시켰다. 잔여 오일에 클로로포름(180 mL)을 첨가하고 생성된 현탁액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 여과하고, 여액을 물(60 mL) 및 염수(60 mL)로 추출하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 농축시켜 조 6-(트리틸머캅토)-헥실아민(10.10 g, 26.87 mmol, 95%)을 수득하였다.
MS: m/z 376.22=[M+]+ (계산치=376.20).
DIEA(1.41 mL, 8.11 mmol) 및 n-부틸 클로로포르메이트(THF 1 mL 중의 908 ㎕, 7.14 mmol)를 THF(50 mL) 중의 6-(트리틸머캅토)-헥실아민(2.44 g, 6.49 mmol)의 냉각(0℃) 용액에 첨가하였다. 30분 후 LiAlH4(THF 중의 1M, 9.74 mL, 9.47 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 90분간 환류 가열하였다. 물, 3.75 M 수성 NaOH 및 물을 첨가하여 침전물을 형성하고 여과하여 혼합물로부터 침전물을 제거하였다. 여액을 진공 하에 농축시켜 6a를 수득하였다.
수율: 2.41 g(6.20 mmol).
MS: m/z 390.22=[M+H]+, (계산치=390.22).
링커 시약 중간체 6b의 합성:
6a(2.1 g, 5.31 mmol)의 용액에 2-브로모에틸프탈이미드(1.96 g, 7.7 mmol) 및 K2CO3(1.09 g, 7.9 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 6시간 동안 환류 가열하였다. 여과 및 농축 후 조 혼합물을 에틸 아세테이트와 NaHCO3 포화 수용액 사이에 분배하였다. 섬광 크로마토그래피에 의해 조 중간체(2-(N-메틸-N-(6-트리틸머캅토헥실-)아미노-)에틸프탈이미드를 정제하였다.
수율: 1.23 g(2.18 mmol).
MS: m/z 563.27=[M+H]+, (계산치=563.27).
에탄올(12 mL) 중의 (2-(N-메틸-N-(6-트리틸머캅토헥실-)아미노-)프탈이미드(672 mg, 1.19 mmol)의 용액에 하이드라진 일수화물(208 ㎕, 4.17 mmol)을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축한 다음, RP-HPLC에 의해 N-(2-아미노에틸-)-N-메틸-N-(6-트리머캅토헥실-)아민을 정제하였다.
수율: 624 mg(0.944 mmol).
MS: m/z 433.27=[M+H]+, (계산치=433.26).
무수 MeOH(6 mL) 중의 N-(2-아미노에틸-)-N-메틸-N-(6-트리머캅토헥실)-)아민(151 mg, 0.229 mmol)와 NaCNBH3(30 mg, 0.463 mmol)의 용액에 무수 CH2Cl2(0.6 ㎕) 중의 2,4-디메톡시벤즈알데하이드의 용액을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 반응 혼합물을 농축시키고, 2 mL 물/아세토니트릴 1/9(v/v) 중에 재용해시킨 다음, RP-HPLC에 의해 6b를 정제하였다.
수율: 177 mg(0.219 mmol).
MS: m/z 583.33=[M+H]+, (계산치=583.33).
링커 시약 6c의 합성
5c 대신에 아민 6b(TFA 염으로서, 430 mg, 0.53 mmol)을 사용하는 것을 제외하고, 5d에 대해 기술한 바와 같이 Fmoc-Aib-로딩된 수지(704 mg, 약 0.6 mmol)로부터 링커 시약 6c를 제조하였다.
실시예 7
링커 시약 7f의 합성
아래 스킴에 따라 링커 시약 7f를 합성하였다:
Figure pct00044
MeOH(10 mL)와 아세트산(0.5 mL) 중의 N-메틸-N-boc-에틸렌디아민(0.5 mL, 2.79 mmol)와 NaCNBH3(140 mg, 2.23 mmol)의 냉각(0℃) 용액에 EtOH(10 mL) 중의 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(0.547 mg, 2.79 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 2 M HCl(1 mL)로 산성화한 다음, Na2CO3 포화 수용액(50 mL)으로 중화시켰다. 모든 휘발성 물질을 증발시키고, 생성된 수성 슬러리를 DCM으로 추출한 다음, 유기 분획을 농축시켜 N-메틸-N-boc-N'-tmob-에틸렌디아민(7a)를 조 오일로서 수득하고 이들 RP-HPLC로 정제하였다.
수율: 593 mg(1.52 mmol).
MS: m/z 377.35=[M+Na]+, (계산치=377.14).
N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH(225 mg, 0.529 mmol)을 DMF(3 mL) 중에 용해시키고 7a(300 mg, 0.847 mmol), HATU(201 mg, 0.529 mmol) 및 콜리딘(0.48 mL, 3.70 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켜 7b를 수득하였다. fmoc 탈보호를 위해 피페리딘(0.22 mL, 2.16 mmol)을 첨가하고 1시간 동안 계속 교반시켰다. 아세트산(1 mL)를 첨가하고, 7c를 RP-HLPC에 의해 정제하였다.
수율: 285 mg(TFA 염으로서 0.436 mmol).
MS: m/z 562.54=[M+Na]+, (계산치=562.67).
6-트리틸머캅토헥산산(0.847 g, 2.17 mmol)을 무수 DMF(7 mL) 중에 용해시켰다. HATU(0.825 g, 2.17 mmol), 콜리딘(0.8 mL, 6.1 mmol) 및 7c(0.78 g, 1.44 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 60분간 교반하고, AcOH(1 mL)로 산성화한 다음, RP-HPLC로 정제하였다. 산물 분획을 NaHCO3 포화 수용액으로 중화시키고 농축시켰다. 남은 수성상을 DCM으로 추출하고 용매를 증발시켜 7d를 분리하였다.
수율: 1.4 g(94%).
MS: m/z 934.7-[M+Na]+, (계산치=934.5).
MeOH(12 mL)와 물(2 mL) 중의 7d(1.40 mg, 1.53 mmol)의 용액에 LiOH(250 mg, 10.4 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 교반하였다. 혼합물을 AcOH(0.8 mL)로 산성화하고, RP-HPLC에 의해 7e를 정제하였다. 산물 분획을 NaHCO3 포화 수용액으로 중화시키고 농축시켰다. 수성상을 DCM으로 추출하고 용매를 증발시켜 7e를 분리하였다.
수율: 780 mg(60%).
MS: m/z 878.9=[M+Na]+, (계산치=878.40).
무수 DCM(4 mL) 중의 7e(170 mg, 0.198 mmol)의 용액에 DCC(123 mg, 0.59 mmol) 및 N-하이드록시-석신이미드(114 mg, 0.99 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 여액을 AcOH 0.5 mL로 산성화하고, RP-HPLC하여 7f를 정제하였다. 산물 분획을 NaHCO3 포화 수용액으로 중화시키고 농축시켰다. 남은 수성상을 DCM으로 추출하고 용매를 증발시켜 7f를 분리하였다.
수율: 154 mg(0.161 mmol).
MS: m/z 953.4=[M+H]+, (계산치=953.43).
다른 방법으로서, 아래 절차에 따라 링커 시약 7f를 합성하였다:
대안으로서의 반응 스킴:
Figure pct00045

MeOH(20 mL) 중의 N-메틸-N-boc-에틸렌디아민(2 g, 11.48 mmol)과 NaCNBH3(819 mg, 12.63 mmol)의 용액에 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(2.08 mg, 10.61 mmol)을 조금씩 나누어 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하고, 3 M HCl(4 mL)로 산성화한 다음, 추가로 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화용액(200 mL)에 첨가하고, CH2Cl2로 5회 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4으로 건조시키고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 생성된 N-메틸-N-boc-N'-tmob-에틸렌디아민(7a)를 고 진공 하에서 완전히 건조시키고 정제하지 않고 다음 반응 단계에 사용하였다.
수율: 3.76 g(11.48 mmol), 89% 순도, 7a : 이중 Tmob 보호된 산물=8:1).
MS: m/z 355.22=[M+H]+, (계산치=354.21).
CH2Cl2(24 mL) 중의 7a(2 g, 5.65 mmol)의 용액에 COMU(4.84 g, 11.3 mmol), N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH(2.08 g, 4.52 mmol) 및 콜리딘(2.65 mL, 20.34 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, CH2Cl2(250 mL)로 희석한 다음, 0.1 M H2SO4(100 mL)로 3회, 염수(100 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 잔류물을 24 mL의 양으로 농축시켰다. 섬광 크로마토그래피를 이용하여 7g를 정제하였다.
수율: 5.31 g(148%, 6.66 mmol).
MS: m/z 796.38=[M+H]+, (계산치=795.37).
THF(60 mL) 중의 7g [5.31 g, 최대 4.51 mmol, N-Fmoc-N-Me-Asp(O)Bn)-OH]의 용액에 DBU(1.8 mL, 3% v/v)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 12분간 교반하고, CH2Cl2(400 mL)로 희석한 다음, 0.1 M H2SO4(150 mL)로 3회, 염수(150 mL)로 3회 세척하였다. 수성상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 여과하였다. 용매를 증발시켜 7h를 분리하고 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
MS: m/z 574.31=[M+H]+, (계산치=573.30).
7h(5.31 g, 4.51 mmol, 조)를 아세토니트릴(26 mL) 중에 용해시키고, COMU(3.87 g, 9.04 mmol), 6-트리머캅토헥산산(2.12 g, 5.42 mmol) 및 콜리딘(2.35 mL, 18.08 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 CH2Cl2(400 mL)로 희석한 다음, 0.1M H2SO4(100mL)로 3회, 염수(100mL)로 3회 세척하였다. 수성 상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 용매를 증발시켜 7i를 분리하였다. 섬광 크로마토그래피를 이용하여 산물 7i를 정제하였다.
수율: 2.63 g(62%, 95% 순도).
MS: m/z 856.41=[M+H]+, (계산치=855.41).
i-PrOH(33 mL)와 물(11 mL) 중의 7i(2.63 g, 2.78 mmol)의 용액에 LiOH(267 mg, 11.12 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 70분 동안 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(200 mL)로 희석하고, 0.1 M H2SO4(50 mL)로 3회, 염수(50 mL)로 3회 세척하였다. 수성 상을 CH2Cl2(100 mL)로 재추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 용매를 증발시켜 7e를 분리하였다. 섬광 크로마토그래피를 이용하여 7j를 정제하였다.
수율: 2.1 g(88%).
MS: m/z 878.4=[M+Na]+, (계산치=878.40).
무수 DCM(4 mL) 중의 7e(170 mg, 0.198 mmol)의 용액에 DCC(123 mg, 0.59 mmol) 및 촉매량의 DMAP를 첨가하였다. 5분 후 N-하이드록시-석신이미드(114 mg, 0.99 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 진공 하에 제거한 다음, 잔류물을 90% 아세토니트릴 + 0.1% TFA(3.4 mL)에 넣었다. 조 혼합물을 RP-HPLC하여 정제하였다. 산물 분획을 0.5 M pH 7.4 인산염 완충액으로 중화시키고 농축하였다. 잔여 수성상을 DCM으로 추출하고 용매를 증발시켜 7f를 분리하였다.
수율: 154 mg(81%).
MS: m/z 953.4=[M+H]+, (계산치=953.43).
실시예 8
NαA1-인슐린-링커 접합체 8b와 8c의 합성
Figure pct00046
Figure pct00047

보호된 인슐린 링커 접합체 8a의 합성
Figure pct00048
링커 시약 5d를 DCM(20 mg/mL) 중에 용해시키고 N-사이클로헥실-카르보디이미드-N-메틸 폴리스티렌-수지(1.9 mmol/g, 10 당량)로 1시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 링커 시약의 용액을 DMSO(100 mg 인슐린/mL) 중의 인슐린(1.2 당량)과 DIEA(3.5 당량)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분간 진탕시켰다. 용액을 아세트산으로 산성화하고, 감압 하에 DCM을 증발시킨 다음, NαA1-접합된 보호된 인슐린-링커 접합체 8a를 RP-HPLC하여 정제하였다.
동결건조된 8a를 90/10/2/2(v/v/v/v) HFIP/TFA/물/트리에틸실란의 혼합물로 실온에서 45분간 처리하였다(2 mL/100 mg의 8a). 반응 혼합물을 물로 희석하고, 모든 휘발성 물질을 질소 스트림 하에 제거하였다. NαA1-접합된 인슐린-링커 접합체 8b를 RP-HPLC하여 정제하였다.
8b:
수율: 링커 5d 62 mg(0.078 mmol)로부터 139 mg(0.023 mmol).
MS: m/z 1524.45=[M+H]4+, (계산치=1524.75).
5d 대신에 6c(72 mg, 0.101 mmol)를 사용하는 것을 제외하고 8b에 대해 기술한 바와 같이 NαA1-접합된 인슐린-링커 접합체 8c를 합성하였다.
8c:
수율: 237 mg(0.039 mmol).
MS: m/z 1528.23=[M+4H]4+, (계산치=1528.28).
실시예 9
NαB1-인슐린-링커 접합체 9의 합성
Figure pct00049

이중 보호된 Nα-boc-GlyA1-Nε-boc-LysB29-인슐린을 J. Markussen, J. Halstrøm, F. C. Wiberg, L. Schaffer, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18814-18818에 기술된 바와 같이 제조하였다. 링커 시약 5d(0.04 mmol)을 DCM(0.5 mL) 중에 용해시키고 N-사이클로헥실-카르보디이미드-N'-메틸 폴리스티렌 수지(0.205 mmol)로 실온에서 2시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 링커 시약의 생성된 용액을 bis-boc-보호된 인슐린(24 mg, 0.004 mmol)과 DIEA(5 ㎕, 0.0229 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 아세트산 100 ㎕로 산성화하고 보호된 인슐린-링커 접합체를 RP-HPLC하여 정제하였다.
수율: 5 mg(0.00075 mmol).
MS: m/z 1660.27=[M+4H]4+, (계산치=1660.43).
동결건조된 보호된 인슐린-링커 접합체를 1 mL의 90/10/2/2(v/v/v/v) HFIP/TFA/물/TES로 실온에서 45분간 처리하였다. 반응 혼합물을 0.5 mL의 물로 희석하고 모든 휘발성 물질을 질소의 스트림 하에서 제거하였다. NαB1-접합된 인슐린-링커 접합체 9를 RP-HPLC하여 정제하였다.
수율: 4 mg(0.0007 mmol).
MS: m/z 1524.46=[M+4H]4+, (계산치=1524.75).
실시예 10
NεB29-인슐린 링커 접합체 10의 합성
Figure pct00050

인슐린(644 mg, 0.111 mmol)을 DMSO 6.5 mL 중에 용해시켰다. 3 mL의 냉각된(4℃) 0.5 M 붕산나트륨 완충액(pH 8.5) 및 DMSO 2.5 mL 중의 7f(70 mg, 0.073 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분간 교반시켰다. 400 ㎕의 AcOH를 첨가하고 보호된 인슐린 접합체를 RP-HPLC하여 정제하였다.
수율: 172 mg(0.025 mmol).
MS: m/z 1662.27=[M+4H]4+, (계산치=1662.48).
동결건조된 산물 분획을 6 mL의 90/10/2/2(v/v/v/v) HFIP/TFA/TES/물로 실온에서 1시간 동안 처리하여 보호 그룹을 제거하였다. NεB29-인슐린 링커 접합체 10을 RP HPLC하여 정제하였다.
수율: 143 mg(0.023 mmol).
MS: m/z 1531.46=[M+4H]4+, (계산치=1531.71).
실시예 11
인슐린-링커-하이드로겔 11a, 11b, 11c, 11d, 11da, 11db 및 11dc의 제조
Figure pct00051
건조 말레이미드 작용화된 하이드로겔 4(82 mg, 10.3 μmol 말레이미도 그룹)을 필터 프릿이 장착된 시린지 내로 충진시켰다. 아세토니트릴/물/TFA 1/1/0.001(v/v/v) 1.0 mL 중의 인슐린-링커-티올 8b(27.8 mg, 4.6 μmol)의 용액을 첨가하고 현탁액을 실온에서 5분간 배양하였다. 아세테이트 완충액(0.4 mL, pH 4.8, 1.0 M)을 첨가하고 시료를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 티올 소모를 엘만 시험에 의해 모니터링하였다. 하이드로겔을 1/0.43/0.001(v/v/v) 아세토니트릴/물/TFA로 10회, 1/1/0.2/0.25(v/v/v/v) 1.0 M 사르코신 pH 7.4/아세토니트릴/0.5 M 인산염 완충액 pH 7.4/물로 2회 세척하였다. 마지막으로, 하이드로겔을 사르코신 용액 중에 현탁시키고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
인슐린-링커-하이드로겔 11a를 아세토니트릴/물/TFA 1/1/0.001(v/v/v)로 10회 세척하고 4℃에 저장하였다.
인슐린-링커-하이드로겔의 분획을 pH 12, 환원 조건 하에서 완전히 가수분해시키고 이어서 RP-HPLC에 의해 인슐린 A-쇄 및 인슐린 B-쇄를 정량하여 인슐린 함량을 결정하였다.
11a의 인슐린 로딩: 인슐린 175 mg/인슐린-링커-하이드로겔 g
10 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5, 135 mM 염화나트륨 중의 11a 현탁액 중의 인슐린 양: 11a 현탁액 1 mL 당 인슐린 12 mg.
8b 대신에 각각 8c, 9 및 10을 사용하는 것을 제외하고 상기된 바와 같이 실시하여 각각 11b, 11c 및 11d를 제조하였다.
8b 및 4 대신에 10 및 4a를 사용하는 것을 제외하고 상기된 바와 같이 실시하여 11da를 제조하였다.
11db를 다음과 같이 제조하였다: pH 2.5 HCl, 0.01% 트윈-20(5.0 mL, 119 μmol 말레이미도 그룹) 중의 말레이미드 작용화된 하이드로겔 4a의 현탁액을 필터가 장착된 시린지에 충진하였다. 8.0 mL HCl pH 2.5, 0.01% 트윈-20 중의 인슐린-링커-티올 10(166 mg, 24.4 μmol)의 용액을 첨가하고 현탁액을 실온에서 5분간 배양하였다. 나트륨 석시네이트 완충액(3.9 mL, pH 4.0, 150 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)을 첨가하여 pH 3.6을 조성하고 시료를 실온에서 90분간 배양하였다. 티올 소모를 엘만 시험에 의해 모니터링하였다. 하이드로겔을 나트륨 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 10회, 200 mM 아세틸 시스테인을 함유한 나트륨 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 3회 세척하였다. 마지막으로, 하이드로겔을 아세틸 시스테인 함유 완충액에 현탁시키고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
인슐린-링커-하이드로겔 11db를 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 10회, 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0, 10 mM; 130 mM NaCl, 0.01% 트윈-20)으로 8회 세척하였다.
11db의 인슐린 로딩: 인슐린-링커-하이드로겔 현탁액 mL 당 인슐린 6.12 mg
11dc를 다음과 같이 제조하였다:
pH 2.5 HCl, 0.01% 트윈-20(58.3 mL, 985 μmol 말레이미도 그룹) 중의 말레이미드 작용화된 하이드로겔 4a의 현탁액을 고체상 합성 반응기에 첨가하였다. 2.5 HCl, 0.01% 트윈-20 중의 인슐린-링커-티올 10(117 mL, 460 μmol)의 용액을 4a에 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 5분간 배양하였다. 석시네이트 완충액(4.8 mL, pH 4.0, 150 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)을 첨가하여 pH 3.6을 조성하고 현탁액을 실온에서 90분간 배양하였다.
티올 소모를 엘만 시험에 의해 모니터링하였다. 하이드로겔을 나트륨 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 10회, 10 mM 머캅토에탄올을 함유한 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 2회 세척하였다. 마지막으로, 하이드로겔을 머캅토에탄올 함유 완충액에 현탁시키고 실온에서 3시간 동안 배양하였다.
인슐린-링커-하이드로겔 11dc를 석시네이트 완충액(pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 10회, 석시네이트/트리스 완충액(pH 5.0, 10 mM; 85 g/L 트레할로스, 0.01% 트윈-20)으로 6회 세척하였다.
11dc의 인슐린 로딩: 인슐린-링커-하이드로겔 현탁액 mL 당 인슐린 18.7 mg
다른 방법으로서, 말레이미드 유도체화된 하이드로겔 미립자 4aa가 4a 대신에 사용될 수 있다.
실시예 12
시험관내 방출 역학
인슐린-링커-하이드로겔 11a, 11b, 11c 및 11d를 각각(약 1 mg의 인슐린을 함유한 인슐린-링커-하이드로겔) 2 mL의 60 mM 인산나트륨, 3 mM EDTA, 0.01% 트윈-20, pH 7.4 중에 현탁시키고 37℃에서 배양하였다. 현탁액을 시간별로 원심분리하고 상청액을 215 nm에서 RP-HPLC 및 ESI-MS하여 분석하였다. 방출된 인슐린과 상관성이 있는 UV-신호를 적분하고 배양 시간별로 그래프로 표시하였다.
곡선-맞춤 소프트웨어를 실행하여 상응하는 방출 반감시간을 계산하였다.
16 d, 10 d, 30 d 및 14 d의 시험관내 반감시간이 11a, 11b, 11c 및 11d에 대해 각각 결정되었다.
다른 방법으로서, 인슐린-링커-하이드로겔 11db를 필터가 장착된 시린지에 충진시키고 6 mL의 60 mM 인산나트륨, 3 mM EDTA, 0.01% 트윈-20, pH 7.4 중에 현탁시킨 다음, 37℃에서 배양하였다. 예정된 시점에서 상청액을 교환하고 방출된 인슐린을 215 nm에서 RP-HPLC하여 정량하였다. 방출된 인슐린의 양을 배양 시간별로 그래프로 표시하였다. 곡선-맞춤 소프트웨어를 실행하고 15 d의 시험관내 반감시간을 11db에 대해 결정하였다.
다른 방법으로서, 인슐린-링커-하이드로겔 11db를 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 온도 조절 배양기(37℃)에 넣었다. 인산나트륨(pH 7.4, 60 mM; 3 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)을 0.25 mL/h(공칭값)의 항속으로 컬럼에 펌핑하고 배양기외부에서 수거하였다. 예정 시점에서 용액을 215 nm에서 RP-HPLC하여 분석하였다. 인슐린의 방출량을 배양 시간별로 그래프로 표시하였다. 곡선-맞춤 소프트웨어를 실행하고 13 d의 시험관내 반감시간을 11db에 대해 결정하였다.
실시예 13
인슐린의 LysB29-링커 접합체(12a) 및 인슐린 리스프로의 LysB28-링커 접합체 (12b)의 합성:
인슐린의 LysB29-링커 접합체 (12a)의 합성
Figure pct00052
1.2 g(0.206 mmol, 0.85 당량)의 인슐린을 실온에서 DMSO 중에 용해시켰다. 30분 후 붕산염 완충액(0.5 M, pH 8.5, 21.6 mL)을 4.40분의 기간에 걸쳐 첨가하면서 용액을 0℃로 냉각시켰다. 용액의 온도를 25 내지 28℃ 사이로 유지하였다. DMSO 40 mL 중의 7f 228 mg(0.239 mmol, 1 당량)의 용액을 3분의 기간에 걸쳐 시불변 하에 첨가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 70 mL의 MeCN/물(1:1, 0.1% TFA) 및 400 ㎕의 AcOH를 첨가하여 반응을 급켄칭시켰다. 12a를 RP-HPLC(용매 A: 0.1% TFA 함유 물, 용매 B: 0.1% TFA 함유 MeCN, 구배: 14분에 걸친 30 내지 80% B, 유속: 40 mL/분)하여 정제하였다.
UPLC 분석(RP HPLC 정제 이전에)에 따른 위치선택성: 인슐린의 GlyA1에 부착된 7f 0.70% 및 인슐린의 LysB29에 결합된 7f 76.2%(도 1a).
수율: 862 mg(TFA-염, 60%).
MS[M+H]1/4 +=1662.25 g/mol ((MW+)1/4, 계산치=1662.35 g/mol)).
인슐린 리스프로의 LysB28-링커 접합체 (12b)의 합성
Figure pct00053
0.347 g(0.059 mmol, 0.85 당량)의 인슐린 리스프로를 6 mL의 DMSO 중에 실온에서 용해시켰다. 30분 후 붕산염 완충액(0.5 M, pH 8.5, 5.64 mL)을 1.40분의 기간에 걸쳐 첨가하면서 용액을 0℃로 냉각시켰다. 용액의 온도를 25 내지 30℃ 사이로 유지하였다. DMSO 8 mL 중에 용해된 7f 67 mg(0.070 mmol, 1 당량)의 용액을 2분의 기간에 걸쳐 시불변 하에 첨가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 20 mL의 MeCN/물(1:1, 0.1% TFA) 및 1 mL의 AcOH를 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 12b를 RP-HPLC(용매 A: 0.1% TFA 함유 물, 용매 B: 0.1% TFA 함유 MeCN, 구배: 14분에 걸친 30 내지 80% B, 유속: 40 mL/분)하여 정제하였다.
UPLC 분석(RP HPLC 정제이전에)에 따른 위치 선택성: 1.3%는 인슐린 리스프로의 GlyA1에 부착된 7f이고, 산물의 76.7%는 인슐린 리스프로의 LysB28에 부착된 7f이었다(도 1b).
수율: 305 mg(TFA-염, 72%).
MS[M+H]1/4 +=1662.25 g/mol((MW+)1/4, 계산치=1662.35 g/mol)).
실시예 14
래트에서의 약동학 연구
래트에 단회 용량의 피하 투여 후 혈중 인슐린 농도를 측정함으로써 11a의 약동학을 결정하였다.
10 마리 위스타 래트(200-250 g)로 구성된 한 그룹을 사용하여 14일의 기간에 걸쳐 혈중 인슐린 수준을 연구하였다. 각 래트에 6 mg 인슐린(12 mg 인슐린/mL)이 함유된 아세테이트 완충액 pH 5 중의 11a 현탁액 500 ㎕를 단회 피하 주사하였다. 동물 및 시점 당 200 ㎕의 혈액을 설하로부터 채취하여 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. 투여 전과 주사 후 4시간, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11 및 14일 경과하여 시료를 수거하였다. 채혈 후 15분 내에 혈장 시료를 동결시키고 검정시까지 -80℃에 저장하였다.
초민감성 인슐린 ELISA 키트(Mercodia)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 혈중 인슐린 농도를 측정하였다. 혈장 시료를 측정 전에 ELISA 완충액(교정기 0으로 1:5 및 1:10)에 희석하였다. 인슐린 표준치를 중복 측정하고 측정 값을 선형 회귀를 사용하여 피팅함으로써 생성된 교정 곡선으로부터 인슐린 농도를 계산하였다. 각각의 희석 인자로 보정되고 시간별로 그래프로 표시된 두 가지 독립적인 희석 시리즈로부터 평균치로서 인슐린 농도를 규정하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 사용된 모든 동물의 평균값을 계산함으로써 각 시점별 평균 혈중 인슐린 농도를 수득하였다.
14일에 걸친 인슐린의 지속적인 방출이 관찰되었다.
실시예 15:
래트에서의 약동학 연구
건강한 래트에서 13일의 기간에 걸쳐 혈중 인슐린 농도를 측정함으로써 11da의 약동학을 결정하였다.
3 mg의 인슐린(약 12 mg/kg)이 함유된 아세테이트 완충액 pH 5중의 시험물질 11da 500 ㎕를 8 마리 위스타 래트(약 250 g 체중)에 단회 피하 주사하였다. 동물 및 시점 당 200 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥으로부터 채취하여 약 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. 시료는 시험물질 투여 하루 전, 투여 후 4시간, 1d, 2d, 3d, 6d, 7d, 8d, 10d 및 13d에 수거하였다. 혈장 시료는 검정시까지 동결하고 -80℃에 저장하였다. 사람 인슐린 초민감성 ELISA 키트(DRG Instruments GmbH, Germany)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈장 시료를 측정하였다. 교정 곡선에 블랭크(교정기 0)가 포함되었고 시료 값으로부터 공제하고 3차 다항방정식을 이용하여 교정 곡선을 피팅하였다. 분석 전에 혈장 시료를 와동시키고 반응 튜브에서 희석시켰다(교정기 0으로 1:5 및 1:10). 분석을 위해 미세역가 평판 판독기(Tecan Ultra)로 참조 파장 보정 없이 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 모든 피검 동물에 대한 13일째까지의 혈중 인슐린 농도의 결과는 도 3에 제시되어 있다.
3 mg 인슐린을 함유한 500 ㎕ 11d의 단회 피하 주사 후 평균 혈중 인슐린 수준은 1일째에 약 500 pM의 최대치로 올랐다. 예상한 바와 같이 혈중 인슐린 농도는 2주에 걸쳐 연속적으로 감소하였다. 본 연구의 최초 한 주 내에 혈중 인슐린 농도의 최대/최저 비는 약 1.7이었다.
실시예 16:
래트에서의 약동학 및 약력학 연구
당뇨 Sprague-Dawley(SD) 래트를 이용한 사전 약동학/약력학 연구에서 혈중 인슐린 농도 및 혈당 강하 효과를 분석함으로써 방출된 인슐린의 양 및 생활성을 연구하였다. 이 목적을 위해, 8 마리 래트에 스트렙토조토신(STZ)로 당뇨를 유도하고 0일째에 350 mg/dL 이상의 혈당 수준을 갖는 모든 동물이 본 연구에 포함되었다. 8 마리 SD 래트 중 7 마리가 당뇨증세를 보였고 이들 동물에 6.4 mg의 인슐린이 함유된 아세테이트 완충액 pH 5 중의 시험물질 11da 500 ㎕를 단회 피하 주사하였다. 동물 및 시점 당 200 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥으로부터 채취하여 약 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. 시료는 시험물질 투여 4일 전, 투여 후 2시간, 1d, 2d, 3d, 6d, 7d, 8d, 10d 및 13d에 수거하였다. 혈장 시료는 검정시까지 동결하고 -80℃에 저장하였다. 혈당은 시험물질 투여 전 및 투여 후 2시간, 1d, 2d, 3d, 6d, 7d, 8d, 10d, 13d, 15d, 17d, 20d, 22d 및 24d에 꼬리 정맥으로부터 AccuCheck Comfort 장치로 3회 측정하였다. 사람 인슐린 ELISA 키트(DRG Instruments GmbH, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈장 시료의 인슐린 함량을 측정하였다. 교정 곡선에 블랭크(교정기 0)가 포함되었고 시료 값으로부터 공제하고 3차 다항 방정식을 이용하여 교정 곡선을 피팅하였다. 분석 전에 혈장 시료를 와동시키고 반응 튜브에서 희석시켰다(교정기 0으로 1:5 및 1:10). 분석을 위해 미세역가 평판 판독기(Tecan Ultra)로 참조 파장 보정 없이 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, 혈중 인슐린 수준은 2주에 걸쳐 모니터링되었고, 혈당 수준은 3주에 걸쳐 모니터링되었다.
인슐린 하이드로겔 11da의 단회 피하 주사 후 혈당 수준은 10일의 기간에 걸쳐 저혈당증에 대한 어떠한 증상 없이 100 mg/dL 이하의 값으로 효과적으로 강하되었다. 동물 당 6.4 mg 인슐린의 보다 높은 용량으로 인해 최대 혈중 인슐린 농도는 1일째에 약 800 pM이었고 2주 내에 계속적으로 약 300 pM까지 감소하였다. 동시에, 혈당치는 10일 후에 올라가기 시작하였고 3주 후에 투여전 수준에 도달하였다.
실시예 17:
래트에서 24시간에 걸친 약동학 연구(버스트 연구)
인슐린이 버스트없이 인슐린-링커-하이드로겔로부터 방출된 것임을 증명하기 위해, 혈중 인슐린 농도를 건강한 래트에서 24시간의 기간에 걸쳐 모니터링하였다.
8 마리 Sprague-Dawley 래트(250-250 g의 체중)를 두 그룹으로 나누고 체중 kg 당 아세테이트 완충액 pH 5중의 시험물질 11db 2 mL를 단회 피하 주사하였다. 시험물질의 농도는 4 mg/인슐린 mL이었고 이에 따라 각 래트는 체중 kg 당 8 mg의 인슐린을 투여받았다. 동물 및 시점 마다 200 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥으로부터 채취하여 약 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. A 그룹의 시료는 시험물질의 투여 전 및 투여 후 5분, 30분, 2시간, 4시간 및 8시간 경과하여 수집하였고, B 그룹의 시료는 시험물질의 투여 전 및 투여 후 15분, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간 경과하여 수집하였다. 혈장 시료는 검정시까지 동결하고 -80℃에 저장하였다. 사람 인슐린 초민감성 ELISA 키트(DRG Instruments GmbH, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈장 시료를 측정하였다. 교정 곡선에 블랭크(교정기 0)가 포함되었고 시료 값으로부터 공제하고 3차 다항 방정식을 이용하여 교정 곡선을 피팅하였다. 분석 전에 혈장 시료를 와동시키고 반응 튜브에서 희석시켰다(교정기 0으로 1:5 및 1:10). 분석을 위해 미세역가 평판 판독기(Tecan Ultra)로 참조 파장 보정 없이 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 이 결과는 도 5에 제시되어 있으며, 인슐린이 어떠한 버스트없이 방출되었음을 명백히 보여준다.
실시예 18:
래트에서 약동학 및 약력학 다중 용량 연구
당뇨 래트에 11da를 매주 1회씩 3회 투여한 후 4주의 기간에 걸쳐 혈중 인슐린 농도 및 혈당 수준을 측정하여 약동학 및 약력학을 결정하였다.
평균 체중이 239 g인 8 마리 Sprague-Dawley 래트가 사용되었다. 스트렙토조토신(STZ)로 당뇨를 유도하였고 0일(시험물질 주사 당일)에 350 mg/dL 이상의 혈당 수준을 갖는 래트는 모두 본 연구에 포함되었다. STZ가 처리된 8 마리 래트 모두 당뇨 증세를 보였고 체중 kg 당 아세테이트 완충액 pH 5 중의 2 mL 시험물질 11da를 0일, 7일째, 및 14일째에 매주 1회씩 3회 피하 주사하였다. 4 mg/mL의 시험물질 인슐린 농도와 함께 투여된 용량은 체중 kg 당 8 mg 인슐린이었다. 동물 및 시점 마다 200 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥으로부터 채취하여 약 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. 시료는 시험물질 투여 3일전 및 투여 후 28일까지 수집하였다. 혈장 시료는 검정시까지 동결하고 -80℃에 저장하였다. 혈당은 주사 전 및 주사 후 30일까지 꼬리 정맥으로부터 3회 AccuChek Comfort 장치로 측정하였다. 사람 인슐린 ELISA 키트(DRG Instruments GmbH, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈장 시료의 인슐린 함량을 측정하였다. 교정 곡선에 블랭크(교정기 0)가 포함되었고 시료 값으로부터 공제하고 3차 다항 방정식을 이용하여 교정 곡선을 피팅하였다. 분석 전에 혈장 시료를 와동시키고 반응 튜브에서 희석시켰다(교정기 0으로 1:5 및 1:10). 분석을 위해 미세역가 평판 판독기(Tecan Ultra)로 참조 파장 보정 없이 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 혈중 인슐린 수준 및 혈당 수준은 4주간에 걸쳐 모니터링하였고 결과는 도 6에 나타나 있다.
곡선의 형태는 방출된 인슐린이 혈당 수준을 3차 주사 후 약 100 mg/dL의 값으로 지속적으로 강하시키고 약 1주간 낮게 유지함으로써 생활성을 나타냈음을 가리킨다. 동시에 최대 인슐린 농도가 일차 투여 후 200 pM으로 시작하여, 이차 투여 후 300 pM으로, 3차 투여 후 400 pM으로 지속적으로 증가하였고, 이후 2주 내에 다시 100 pM 이하의 값으로 감소하였다.
실시예 19:
래트에서의 약동학 연구
건강한 래트에서 13일의 기간에 걸쳐 혈중 인슐린 농도를 측정함으로써 11dc의 약동학을 결정하였다.
8 마리 위스타 래트(약 230 g의 체중)에 3 mg의 인슐린(12 mg/kg 용량)을 함유한 석시네이트 완충액 pH 5(10 mM 석시네이트/트리스, 85 g/l 트레할로스, 0.01% 트윈-20, pH 5.0) 중의 시험물질 11dc 2 mL/kg을 단회 피하 주사하였다. 동물 및 시점 마다 200 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥으로부터 채취하여 약 100 ㎕의 Li-헤파린 혈장을 수득하였다. 시료는 시험물질 투여 4일전 및 투여 후 0.3시간(4 마리 래트), 1시간(4 마리 래트), 2시간(4 마리 래트), 4시간(4 마리 래트), 1d, 2d, 3d, 6d, 8d, 10d 및 13d에 수집하였다. 혈장 시료는 검정시까지 동결하고 -80℃에 저장하였다. 사람 인슐린 초민감성 ELISA 키트(DRG Instruments GmbH, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈장 시료의 인슐린 함량을 측정하였다. 교정 곡선에 블랭크(교정기 0)가 포함되었고 시료 값으로부터 공제하고 3차 다항 방정식을 이용하여 교정 곡선을 피팅하였다. 분석 전에 혈장 시료를 와동시키고 반응 튜브에서 희석시켰다(교정기 0으로 1:5 및 1:10). 분석을 위해 미세역가 평판 판독기(Tecan Ultra)로 참조 파장 보정 없이 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 모든 피검 동물에 대한 13일째까지의 혈중 인슐린 함량에 대한 결과는 도 7에 나타나 있다.
12 mg/kg 11dc의 단회 피하 주사 후 평균 혈중 인슐린 수준은 1일째에 약 500 pM의 최대치로 올랐다. 예상한 바와 같이 혈중 인슐린 농도는 2주에 걸쳐 연속적으로 감소하였다. 최초 한 주 내에 혈중 인슐린 농도의 최대/최저 비는 약 1.4였다.
실시예 20
pH 7.4에서의 실시간 인슐린 방출 및 하이드로겔 분해
pH 5.0 아세테이트 완충액(10 mM, 130 mM NaCl, 0.01%(w/v) 트윈-20) 중의 인슐린-링커 하이드로겔 11a(730 ㎕, 3.19 mg의 인슐린 함유)를 시료 제제 튜브에 충진하고 pH 7.4 방출 완충액(60 mM 인산나트륨, 3 mM EDTA, 0.01%(w/v) 트윈-20)으로 3회 세척한 다음, 1.0 mL로 채웠다. 현탁액 분획(0.5 mM, 1.59 mg 인슐린)을 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 온도 조절 배양기(37℃)에 넣었다. 방출 완충액(pH 7.4)을 0.25 mL/h(공칭값)의 항속으로 컬럼에 펌핑하고 배양기 외부에서 수거하였다. 예정 시점에서 용액을 215 nm에서 RP-HPLC하여 분석하였다. 인슐린의 방출량을 배양 시간별로 그래프로 표시하고 곡선-맞춤 소프트웨어를 실행하여 상응하는 방출 반감시간을 결정하였다. 인슐린 방출에 대한 9.4 d의 반감시간이 결정되었다.
37℃에서 39 d 배양 후 하이드로겔 현탁액을 시료 제제 튜브로 옮기고, 잔여 하이드로겔은 pH 7.4의 방출 완충액으로 컬럼 외부로 세척해낸 다음, 시료는 1.00 mL로 채웠다. 각 300 ㎕의 두 분획을 멸균 시료 제제 튜브로 옮기고, 1.5 mL로 채운 다음, 37℃에서 배양하였다. 시료를 시간별로 채집하고 크기 배제 크로마토그래피하여 분석하였다. 하나 이상의 골격 모이어티(반응성 작용 그룹에 상응함)를 포함한 하이드로겔 방출 수용성 분해 산물에 상응하는 UV-신호를 적분하고 배양 시간별로 그래프로 나타냈다(도 8).
실시예 21
인슐린-링커-하이드로겔 프로드럭의 주사성
pH 5.0 석신산/트리스(10 mM, 40 g/L 만니톨; 10 g/L 트레할로스 이수화물; 0.05% 트윈-20) 중의 5 mL 인슐린-링커-하이드로겔 프로드럭 11dc(32 내지 75 ㎛의 비드 크기 분포, 18 mg 인슐린/mL)가 사용되었다. 인슐린-링커-하이드로겔 프로드럭 현탁액을 20 G 바늘을 통해 1 mL 시린지(길이 57 mm) 내로 충진하였다. 20 G 바늘을 30 G 바늘로 대체하고 시린지 마운팅(Aqua Computer GmbH&Co. KG)에 넣고 172 mm/분(50 ㎕/s와 동일)의 피스톤 속도로 측정을 시작하였다(포스 테스트 스탠드: 멀티테스트 1-d, 데이터 기록 소프트웨어: EvaluatEmperor Lite, Version 1.16-015, 포스 게이지: BFG 200 N(모두 Mecmesin Ltd., UK). 아래 표에 나타낸 바와 같이 피스톤 속도의 증가에 따른 실험을 새로운 인슐린-링커-하이드로겔 프로드럭 시료로 실시하였다. 또한 물 및 에틸렌 글리콜로 실험을 실시하였다. 모든 실험에서 동일한 30 G 바늘이 사용되었다. 30 G 바늘을 이용한 주사력 대 유속이 도 9에 나타나 있다.
Figure pct00054
약어
AcOH 아세트산
AcOEt 에틸 아세테이트
Aib 2-아미노이소부티르산
Bn 벤질
Boc t-부틸옥시카르보닐
COMU (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모 르폴리노-카르베늄 헥사플로오로포스페이트
DBU 1,3-디아자바이사이클로[5.4.0]운데센
DCC N,N-디사이클로헥실카르보디이미드
DCM 디클로로메탄
DIEA 디이소프로필에틸아민
DMAP 디메틸아미노-피리딘
DMF N,N-디메틸포름아미드
Dmob 2,4-디메톡시벤질
DMSO 디메틸설폭사이드
EDC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
eq 화학량론적 당량
ESI-MS 전기분무 이온화법
EtOH 에탄올
Fmoc 9-플루오레닐메톡시카르보닐
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사 플루오로포스페이트
HFIP 헥사플로오로이소프로판올
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HOBt N-하이드록시벤조트리아졸
iPrOH 2-프로판올
LCMS 질량 분석-커플링된 액체 크로마토그래피
Mal 3-말레이미도 프로필
Mal-PEG6-NHS N-(3-말레이미도프로필)-21-아미노-4,7,10,13,16,19-헥사옥사- 헤네이코산산 NHS 에스테르
Me 메틸
MeCN 아세토니트릴
MeOH 메탄올
Mmt 4-메톡시트리틸
MS 질량 스펙트럼/질량 분석
MTBE 메틸 tert-부틸 에테르
MW 분자량
n.d. 미결정
NHS N-하이드록시 석신이미드
OD 광학 밀도
OBu 부틸옥시
OtBu tert-부틸옥시
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
Phth 프탈-
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루 오로포스페이트
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
rpm 분당 회전수
RT 실온
SEC 크기 배제 크로마토그래피
Su 석신이미딜
TCP 2-클로로트리틸 클로라이드 수지
TES 트리에틸실란
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
TMEDA N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민
Tmob 2,4,6-트리메톡시벤질
Trt 트리페닐메틸, 트리틸
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
UV 자외선
VIS 가시적

Claims (32)

  1. 혈장에서의 인슐린 화합물의 치료학적 유효 수준을 적어도 3일 동안 유지하기에 충분한 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트(burst)가 없는 생체내 약동학 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  2. 적어도 10 mg/ml의 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물의 실질적인 버스트가 없는 생체내 약동학 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  3. 적어도 11 mg/ml의 농도로 인슐린 화합물을 포함하고 인슐린 화합물이 적어도 10 mg의 단일 용량으로 투여되는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 화합물의 농도가 적어도 11 mg/ml이고, 예로는 11 mg/ml 내지 35 mg/ml인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2 미만, 예를 들면 1.75 미만, 1.5 미만 또는 1.25 미만의 최대/최저 비(a peak to trough ratio)를 나타냄을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 투여들간의 전체 기간 내내 구조적으로 완전한 인슐린 화합물을 연속적으로 방출함을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 투여들간의 전체 기간이 적어도 약 80시간이고, 예로는 적어도 약 110시간이며, 전형적으로는 적어도 1주인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 화합물이 프로드럭인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 화합물이 데포에, 전형적으로는 고분자 겔에, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 완전히 함유되어 있는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인슐린 화합물이 데포에, 전형적으로는 고분자 겔에, 예를 들면 하이드로겔(예, 완전히 수화된 고분자 매트릭스)에 공유 결합되어 있는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 또는 근육내와 같은 주사에 의해 투여됨을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 화합물이 사람 인슐린, 인슐린 글라르긴, 인슐린 디터머, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글루리신 또는 이들의 프로드럭 중에서 선택되는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 후 최초 24시간내, 예를 들면 투여 후 최초 12시간내 또는 투여 후 최초 6시간 내에 상기 최대 농도에 도달하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 GLP-1 화합물을 포함하는, 조성물.
  15. 인슐린 화합물로의 치료 또는 예방이 유익한 인슐린 결핍 연관 질환 또는 장애, 예를 들면 고혈당증, 당뇨병전증, 내당능장애, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, X 증후군의 치료 또는 예방을 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 제조를 위한, 인슐린 화합물의 용도.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 건식 상태인, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 동결 건조에 의해 건조된, 약제학적 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 인슐린 하이드로겔 프로드럭이, 일회 투여에서 적어도 3일 동안 치료학적 유효량의 인슐린을 제공하기에 충분한 용량으로 조성물에 함유되어 있는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 조성물인 조성물.
  20. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량 조성물인 조성물.
  21. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성제를 유리 형태로서, 프로드럭으로서, 특히 하이드로겔 프로드럭으로서 함유하고, 여기에서 상기 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성제가 설포닐우레아(예, 클로로프로파미드, 톨라자미드, 톨부타미드, 글리부라이드, 글리피지드, 글리메피리드 등); 메글리티니드(예, 레파글리니드); 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 이의 모사체, 글루코스-인슐린분비 펩타이드(GIP) 및 이의 모사체, 엑센딘 및 이의 모사체 및 디펩틸 프로테아제 억제제(DPPIV); 비구아니드(예, 메트포르민); 티아졸리딘디온(예, 로시글리타존, 피오글리타존, 트로글리타존, 이사글리타존(MCC-555로 알려짐), 2-[2-[(2R)-4-헥실-3,4-디하이드로-3-옥소-2H-1,4-벤조옥사진-2-일]에톡시]-벤젠 아세트산 등); GW2570 등; 레티노이드-X 수용체(RXR) 조절제(예, 타르그레틴, 9-시스-레틴산 등); 다른 인슐린 감작 물질(예, INS-1, PTP-1B 억제제, GSK3 억제제, 글리코겐 포스포릴라제 억제제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 억제제 등); 일반적 또는 속효성, 중효성 및 지속형 인슐린을 포함한 인슐린, 흡인성 인슐린 및 인슐린 유사체(예, 천연 아미노산 서열에서 약간의 차이를 갖는 인슐린 분자); 인슐린의 소분자 모사체(이들로 한정되는 것은 아니지만 L-783281, TE-17411 등을 포함함); Na-글루코스 공수송체 억제제(예, T-1095, T-1095A, 플로리젠 등); 아밀린 효능제(이들로 한정되는 것은 아니지만 프람린티드 등); 글루카곤 길항제(AY-279955 등); 비만 치료제(예, 오를리스타트, 췌장 리파제 억제제); 시부트라민; 노르에피네프린 및 도파민; 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자; 옥신토모듈린 및 그렐린 조절제; 벤즈페타민, 펜메트라진, 펜테르민, 디에틸프로피온, 마진돌, 시부트라민, 페닐프로판올아민 또는 에페드린과 같은 식욕 억제제; 퀴파진, 플루옥세틴, 세르트랄린, 펜플루라민 또는 덱스펜플루라민과 같은 식욕 억제제; 아포몰핀과 같은 식욕 억제제; 히스타민 모사체, H3 수용체 조절제와 같은 식욕 억제제; 에너지 소비 증강제(예, 베타-3 아드레날린성 효능제 및 비결합 단백질 기능의 자극제); 렙틴 및 렙틴 모사체(예, 메트렐렙틴); 신경펩타이드 Y 길항제; 멜라노코르틴-1,3 및 4 수용체 조절제; 콜리시스토키닌 효능제; 글루카곤-유사 펩타이드-1 모사체 및 유사체(예, 엑센딘); 안드로겐(예, 데하이드로에피안드로스테론 및 에티오콜란디온과 같은 유도체); 테스토스테론; 아나볼릭 스테로이드(예, 옥산드롤론) 및 스테로이드성 호르몬; 갈라닌 수용체 길항제; 사이토카인제(예, 섬모 신경 영양 인자); 아밀라제 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 용기.
  23. 제22항에 있어서, 상기 용기가 이중-챔버 시린지인, 용기.
  24. 제1항 내지 제14항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 현탁액.
  25. 재구성(reconstitution) 용액을 첨가하여 제16항 또는 제17항의 건식 약제학적 조성물을 재구성하는 단계를 포함하는, 제24항의 현탁액의 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및 이 조성물의 투여를 위한 용기를 포함하는, 부품 키트.
  27. 바늘; 및 상기 바늘과 함께 사용하기 위한 재구성 용액 및 제16항 또는 제17항의 건식 조성물을 함유하는 용기를 포함하는, 부품 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 용기가 이중-챔버 시린지이고, 상기 이중-챔버 시린지의 두개 챔버 중 하나가 재구성 용액을 함유하는, 부품 키트.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 바늘을 통해 주사될 수 있는, 부품 키트.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바늘이 300 ㎛ 미만의 내경을 갖는, 부품 키트.
  31. 제29항에 있어서, 상기 바늘이 225 ㎛ 미만의 내경을 갖는, 부품 키트.
  32. 제29항에 있어서, 상기 바늘이 175 ㎛ 미만의 내경을 갖는, 부품 키트.
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