KR20030009346A - 서방형 단백질 고분자 - Google Patents

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KR20030009346A
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스티븐씨. 라우어
캘빈 임
비들피. 레트나라잔
제프리에이. 휴벨
두르가 안나바줄라
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인파임드테라퓨틱스, 잉크.
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Abstract

본 발명은 생물학적 활성을 가진 물질의 전달을 위한 제품, 그러한 제품을 제조하는 방법, 및 그러한 제품을 사용하여 동물을 치료하는 방법을 특징으로 한다.

Description

서방형 단백질 고분자{SLOW RELEASE PROTEIN POLYMERS}
유전공학 및 생물공학 분야에서의 급속한 진전으로 인하여 약학적 제제로서 유용한 단백질 및 폴리펩티드의 개발이 증가하여 왔다. 따라서, 이러한 새로운 약학적 제제의 투여방법의 개발이 점차 중요해지고 있다.
대부분의 단백질들은 비교적 짧은 반감기를 가지기 때문에, 유효한 혈중농도를 유지하기 위해서는 잦은 투여를 요한다. 혈중농도를 치료적 범위 내에 유지함으로써 환자의 편의를 증가시키고 효능 및 안전성을 향상시키기 위해서는, 단백질 약물에 적합한 부드럽게 방출되는 주사가능한 저장 제형(smoothly releasing injectable depot formulation)이 매우 바람직하다.
최근의 고분자 개발은 환자의 신체 내에서 단백질 및 펩티드 분자들이 더 느리게 그리고 더 지속적으로 방출되는 것을 허용함으로써 단백질 및 펩티드의 전달능력을 향상시켜왔다. 그러나, 많은 경우에 단백질의 활성형은 생분해성 고분자로 제형화되기가 어렵다. 생분해성 하이드로겔과 같은 합성물질도 단백질 전달에 사용하기 위한 목적으로 개발되어 왔다. 이용가능한 고분자 및 하이드로겔에 의해 제공되는 진보에도 불구하고, 전신 및 국소 순환계로 단백질을 전달하는 것은 여전히 비교적 빠르고, 어떤 경우에는 지나치게 빨라서 이러한 투여경로를 사용할 수 없다.
[발명의 요약]
본 발명은 생물학적 활성을 가진 물질(biologically active substance; 이하, "BAS"라 함)의 전달을 위한 제품, 및 그러한 제품을 생산하기 위한 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 제품은 BAS를 불용성 형태로 제형화함으로써 BAS의 생물학적 이용 효능(bioavailability)을 향상시킨다. 본 발명은 또한 상기 BAS 전달용 제품을 사용하여 동물을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 첫번째 측면은, 마크로머(macromer), 단백질을 선택적으로 추방하는(preferentially excluding) 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물 및 BAS를 포함하는, BAS 전달용 생체적합성 치료용 제품(biocompatible therapeutic article)을 특징으로 하는데, 여기서 상기 BAS는 마크로머(macromer), 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물 및 BAS를 포함하는 상기 제품의 제형화의 완료시 불용성 형태로 존재한다.
본 발명의 첫번째 측면의 바람직한 구현예에 있어서, 생체적합성 치료용 제품은 다음중 적어도 하나의 특성을 갖는다: BAS는 15% 미만이 응집되어 있다; 상기 제품은 건조중량으로 계산시 최소한 10%의 마크로머 및 최소한 5%의 BAS를 함유한다; 방출가능한 BAS의 5%가 상기 제품으로부터 방출되는 기간이 t50의 1/16을 초과한다; 또는 t50이 t80의 5/8를 초과하거나 또는 그와 동일하다. 보다 바람직하게는, 상기 생체적합성 치료용 제품은 상술한 특성들 중 적어도 두 가지 특성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 생체적합성 치료용 제품은 상술한 특성들 모두를 갖는다.
본 발명의 첫번째 측면의 다른 구현예에 있어서, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자는 마크로머, 폴리(에틸렌 글리콜), 하이알루론산, 또는 폴리(비닐피롤리돈)이다. 또 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 하이드로겔이다. 또 다른 구현예에 있어서, 마크로머, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 및 BAS를 포함하는 제품 내에서의 단백질의 용해도는 5-10mg/ml 미만이고, 보다 바람직하게는 1mg/ml 미만이다.
본 발명의 첫번째 측면의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은, pH가 단백질이 음하전되는 pH인 경우, 양하전 이온-운송 시약(positively charged ion-carrying reagent), 예를 들면, 트리에탄올아민 또는 Tris를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은, pH가 단백질이 양하전되는 pH인 경우, 소디움도데실설페이트와 같은 음하전 이온-운송 시약(negatively charged ion-carrying reagent)을 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은 계면활성제, 예를 들면, Tween 20, Tween 80, 또는폴록사머(poloxamer) F68을 포함한다.
두번째 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 BAS 전달용 치료용 제품의 제조방법을 특징으로 한다:
(a) BAS를 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물과 배합하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 혼합물을 마크로머와 배합하는 단계로서, 여기서 상기 BAS는 불용성 형태이고, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물 및 마크로머와 배합시 불용성으로 유지되는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 배합(combination)의 혼합물을 제조하는 단계; 및
(d) 상기 혼합물을 중합하여 제품을 생산하는 단계.
본 발명의 두번째 측면의 일구현예에 있어서, (a) 및 (b) 단계는 단일 배합단계로 결합된다.
본 발명의 두번째 측면의 바람직한 구현예에 있어서, 생체적합성 치료용 제품은 다음중 적어도 하나의 특성을 갖는다: BAS는 15% 미만이 응집되어 있다; 상기 제품은 건조중량으로 계산시 최소한 10%의 마크로머 및 최소한 5%의 BAS를 함유한다; 방출가능한 BAS의 5%가 상기 제품으로부터 방출되는 기간이 t50의 1/16을 초과한다; 또는 t50이 t80의 5/8를 초과하거나 또는 그와 동일하다. 보다 바람직하게는, 상기 생체적합성 치료용 제품은 상술한 특성들 중 적어도 두 가지 특성을 갖는다.가장 바람직하게는, 상기 생체적합성 치료용 제품은 상술한 특성들 모두를 갖는다.
본 발명의 두번째 측면의 다른 구현예에 있어서, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자는 마크로머, 폴리(에틸렌 글리콜), 하이알루론산, 또는 폴리(비닐피롤리돈)이다. 또 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 하이드로겔이다. 또 다른 구현예에 있어서, 마크로머, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 및 BAS를 포함하는 제품 내에서의 단백질의 용해도는 5-10mg/ml 미만이고, 보다 바람직하게는 1mg/ml 미만이다.
본 발명의 두번째 측면의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은, pH가 단백질이 음하전되는 pH인 경우, 양하전 이온-운송 시약(positively charged ion-carrying reagent), 예를 들면, 트리에탄올아민을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은, pH가 단백질이 양하전되는 pH인 경우, 소디움도데실설페이트와 같은 음하전 이온-운송 시약(negatively charged ion-carrying reagent)을 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 분자들의 혼합물은 계면활성제, 예를 들면, Tween 20, Tween 80, 또는 폴록사머(poloxamer) F68을 포함한다.
세번째 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 측면에 따른 생체적합성 치료용 제품을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물 치료 방법을 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 포유동물은 설치류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 제품은 포유동물의 폐로 투여되거나, 정맥내로, 피하로, 근육내로, 경구로, 또는 경비로 투여된다.
본 발명의 상기 측면들 중 어느 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 마크로머는 (a) 중심 코어 형성 영역; (b) 상기 코어에 부착된 적어도 두 개의 분해성 영역; 및 (c) 상기 분해성 영역에 부착된 적어도 두 개의 중합가능한 말단기를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 중심 코어 형성 영역은 수용성 영역이다. 수용성 영역은 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(에틸렌 옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 공중합체, 다당류, 탄수화물, 단백질, 및 이들의 조합일 수 있다. 분해성 영역은 폴리(α-히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르쏘에스테르), 폴리(오르쏘카보네이트), 및 폴리(포스포에스테르)로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게, 폴리(α-히드록시산)은 폴리(글리콜산), 폴리(DL-젖산), 또는 폴리(L-젖산)이고, 폴리(락톤)은 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 또는 폴리(γ-부티로락톤)이다. 다른 바람직한 구현예에 있어서, 분해성 영역은 폴리(카프로락톤)을 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 중합가능한 말단기는, 마크로머를 중합할 수 있는 탄소-탄소 이중결합을 보유한다.
본 발명의 상기 측면들의 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 (a) 분자량이 3,000-6,000 달톤이고 팔이 세 개인(three-armed) 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역; (b) 상기 (a) 영역에 부착된 락테이트기; 및 (c) 상기 (b) 영역을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기를 포함한다. 이와 달리, 마크로머는 (a) 분자량이 2,000 또는 3,400인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역; (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 락테이트기; 및 (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑하는 아크릴레이트기를 포함할 수도 있다. 또 그 대신에, 마크로머는 (a) 분자량이 3,400 달톤인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역; (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 카프로락톤기; 및 (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑하는 아크릴레이트기를 포함하기도 한다.
본 발명의 상기 측면들의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제품은 건조중량으로 적어도 5%, 보다 바람직하게는 10%, 가장 바람직하게는 20-30%의 활성물질을 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제품은 생분해성이다.
본 발명의 상기 측면들의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 마크로머는 (a) 분자량이 4,200-5,400 달톤이고 팔이 세 개인(three-armed) PEG로 구성된 수용성 영역; (b) PEG의 각 팔의 말단 상의 락테이트기; 및 (c) 상기 락테이트기를 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기를 포함한다.
본 발명의 상기 측면들의 보다 바람직한 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 아크릴레이트-폴리(젖산)-PEG-아크릴레이트-폴리(젖산)-아크릴레이트의 3원 ABA 블록 공중합체로 구성된다. 여기서, PEG는 3,400 달톤의 분자량을 갖고, 양 측면의 폴리(젖산)은 한 측면당 평균 약 5개의 락테이트 단위를 가지므로, 상기 마크로머는 본원에서 "3.4kL5"로 약칭된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, MW 2,000 달톤의 PEG와 같은 더 낮은 분자량의 PEG가 MW 3,400 PEG 대신에 사용되며, 이 경우의 마크로머는 "2kL5"로 약칭된다.
본 발명의 상기 측면들의 보다 바람직한 또 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 아크릴레이트-PCL-PEG-PCL-아크릴레이트 마크로머이다. PEG는 3,400 달톤의 분자량을 가지며, 양 측면에 폴리카프로락톤을 보유하되 한 측면당 평균 약 6개의 카프로일 단위가 존재한다. 이러한 마크로머는 본원에서 "3.4kC6"로 약칭된다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, BAS는 단백질 또는 펩티드이다. 보다 바람직하게, 단백질은 호르몬, 항체, 분화인자, 맥관형성인자, 효소, 싸이토카인, 케모카인, 인터페론, 콜로니-자극 인자, 및 성장인자로 구성된 군에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 단백질은 인간성장호르몬과 같은 성장인자, 또는 LHRH와 같은 펩티드이다.
본 발명의 두번째 및 세번째 측면의 다른 구현예에 있어서, 치료용 제품은 t50보다 11/4배 이상인 기간에 BAS의 적어도 80%를 방출한다. 치료용 제품의 적어도 80%는 약 80 마이크론 미만의 입자크기를 가질 수 있다. 수용성 영역은 분자량이 500-20,000 달톤, 바람직하게는 1,000-10,000 달톤인 PEG를 포함할 수 있다. 분해성 영역은 적어도 두 가지 상이한 중합체들의 블렌드를 포함할 수 있다. 아울러, 마크로머는 비분해성일 수 있다.
본 발명의 두번째 및 세번째 측면의 또 다른 구현예에 있어서, 치료용 제품은 t50보다 최소한 2배 이상인 기간 동안에 BAS를 방출할 수 있다. 상기 제품은 또한 t50보다 최소한 11/4배 이상인 기간 동안에 BAS의 치료용량(therapeutic dose)을 전달할 수 있다.
"마크로머"란 다음의 세 가지 구성요소를 가진 폴리머를 의미한다: (1) 생체적합성, 수용성 영역; (2) 생체적합성/가수분해성 영역; 및 (3) 적어도 두 개의 중합가능한 영역.
"생물학적 활성을 가진 물질" 또는 "BAS"란 제품에 포함되어 있으며 어떤 부위(site)로 방출되거나 전달될 수 있는, 천연(naturally-occurring) 또는 인공 (artificially-derived)의 화합물을 의미한다. 생물학적 활성을 가진 물질은 예를 들면 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 합성 유기분자, 천연 유기분자, 핵산분자, 및 그들의 조합을 의미한다.
"단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물"이란 용액에 첨가시 그 용액 내의 단백질 또는 폴리펩티드의 용해도를 낮추는, 천연 또는 인공의 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물을 의미한다. 단백질 용해도는 바람직하게는 50배, 보다 바람직하게는 100배, 그리고 가장 바람직하게는 약 200배 감소될 것이다. 바람직하게, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물을 포함하는 용액 내의 단백질의 용해도는 5-10mg/ml 미만이고, 보다 바람직하게는 1mg/ml 미만이다.
"실질상 순수한 폴리펩티드 또는 단백질"이란 자연상태에서 그에 동반되는 성분들로부터 분리된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 폴리펩티드와 단백질이라는 용어는 호환가능하게 사용된다. 전형적으로, 폴리펩티드는 단백질 및 자연상태에서 그와 결합되어 있는 천연 유기분자들로부터 중량으로 최소한 60% 자유로울 때, 실질상 순수하다. 실질상 순수한 폴리펩티드는, 예를 들면 천연 소스(예컨대, 목적 폴리펩티드를 발현하는 세포)로부터의 추출에 의해, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성에 의해 수득될수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들면 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 아가로오스 겔 전기영동, 흡광도, 또는 HPLC 분석에 의해 분석가능하다.
단백질은, 자연상태에서 그에 동반되는 오염물로부터 분리될 때, 천연적으로 결합된 성분들(naturally associated components)로부터 실질상 자유롭다. 즉, 화학적으로 합성되거나, 또는 그것이 원래 기원된 세포와는 다른 세포계(cellular system)에서 생산된 단백질은 그의 천연적으로 결합된 성분들로부터 실질상 자유로울 것이다. 따라서, 실질상 순수한 폴리펩티드는 진핵생물로부터 유래된 것은 물론이. 콜라이(E. coli) 또는 다른 원핵생물로부터 유래된 것들도 포함한다.
"정제된 핵산"이란 본 발명의 핵산이 유래된 생물체의 천연 게놈에서 그 유전자에 측접하는(flanking) 유전자들이 없는 핵산을 의미한다. 따라서, 이 용어는 예를 들면 벡터, 자가복제(autonomously replicating) 플라스미드나 바이러스, 혹은 원핵생물이나 진핵생물의 게놈 DNA 내에 도입된 재조합 DNA; 또는 다른 서열로부터 독립되어 별개의 분자(예컨대, cDNA, 또는 PCR이나 제한효소 절단에 의해 생성된 게놈 DNA 또는 cDNA의 절편)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 그것은 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자(hybrid gene)의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"생체적합성(biocompatible)"이란 환자, 세포 또는 조직에 투여되는 임의의 화합물 또는 물질이 환자, 세포 또는 조직의 기능을 치료하거나 대체하거나 또는 강화시키기 위해 사용되고, 그 기능에 해롭지 않음을 의미한다.
"불용성"이란 화합물의 용해도가 용액 내에서 1g/100ml 미만임을 의미한다. 용액은 수용성 용액, 디메틸술폭사이드와 같은 유기용매, 또는 수성용매와 유기용매의 혼합물일 수 있다. 본원에서 사용될 때, BAS는 BAS 전달을 위한 치료용 제품의 제형화의 완료시 불용성 형태로 존재한다. BAS는 상기 치료용 제품을 환자에게 전달시 불용성 형태로 유지되며, 환자에로의 국소적 또는 전신적인 전달을 위해 조절된 속도로 서서히 방출된다. 본원에서 사용될 때, "응집된(aggregated)"이란 BAS가 개별 분자로서 방출가능함을 의미한다. 제품 내의 응집된 BAS의 퍼센트는 예를 들면 SEC-HPLC를 사용하여 측정가능하다.
BAS와 관련하여 "치료용량(therapeutic dose)"이란 최소유효농도(minimum effective level)와 독성농도(toxic level) 사이의 혈장농도를 의미한다.
"혼합물"이란 조성물 내에 함유된 모든 성분들이 균일하게 분포되어 있음을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "기공 크기(pore size)"란, 마크로머, 마크로머의 구성성분, 또는 BAS가 잠재적으로 관통가능한, 완전한 고분자 내의 공간의 치수를 의미한다. 본 발명에 유용한 기공 크기는 특정한 구현예에 존재하는 BAS(예컨대, 단백질 분자 또는 그의 응집물)보다 더 작다.
본원에서 사용될 때, "방출기간(period of release)"이란 BAS의 특정 퍼센트가 제품으로부터 방출되는데 소요되는 시간의 길이를 의미한다. 방출기간은 예를 들면 BAS의 50% 또는 80%가 제품으로부터 방출되는데 소요되는 시간을 측정함으로써 평가가능하다.
"저 분출효과(low burst effect)"란, 제품으로부터 방출되는 BAS의 양이, 초기에는 급속도로 방출되다가 차츰 속도가 느려지기 보다는 오히려 시간을 두고 비교적 꾸준히 방출됨을 의미한다. 예를 들면, BAS는, 방출가능한 BAS의 5%의 방출기간이 t50의 1/16을 초과하는 경우, 또는 t50이 t80의 5/8를 초과하거나 또는 그와 동일한 경우에, 제품으로부터 방출시 저 분출효과(예컨대, 20% 분출 이하)를 가지고 있는 것으로 간주된다. 저 분출제품과 대조적으로, 고 분출제품(예컨대, BAS의 30%를 신속하게 방출하는 제품)은 t50의 1/18 미만의 기간에 그의 방출가능한 BAS의 5%를 방출할 수 있으며, 1/2 t80과 동일한 t50을 갖는다.
본 발명의 저 분출제품의 특수한 예는, BAS를 10일 동안 방출하도록 고안된 제품의 경우 제1일에 BAS의 20% 미만이 방출되어 나오는 제품이다.
"t50"이란 BAS의 원적재량(original load)의 50%가 방출되는 기간이다. 본원에서 사용될 때, 바람직하게는 방출가능한 BAS의 5%가 1/16 t50을 초과하는 시간 동안 방출되거나, 또는 t50이 5/8 t80을 초과하거나 또는 그와 동일하다.
"t80"이란 BAS의 원적재량(original load)의 80%가 방출되는 기간이다. 본원에서 사용될 때, 바람직하게는 방출가능한 BAS의 5%가 1/16 t50을 초과하는 시간 동안 방출되거나, 또는 t50이 5/8 t80을 초과하거나 또는 그와 동일하다.
본 발명은 서방형 약물 전달(sustained-release drug delivery)을 위한 생분해성 조성물, 및 이러한 조성물에 의해 생물학적 활성을 가진 물질을 투여하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 침전된 hGH를 이용하여 제조된 마이크로스피어(microsphere)의 방출 프로파일;
도 2는 2kL5 마이크로스피어로부터의 hGH의 방출 프로파일;
도 3은 4.2kL3-A3 마이크로스피어로부터 분무건조된 bSA의 방출을 도시한 그래프;
도 4는 생물학적 활성을 가진 입자의 크기가 우혈청알부민(bSA)의 30% 3.4kL5로부터의 방출에 미치는 영향을 도시한 그래프;
도 5는 생물학적 활성을 가진 입자의 크기 및 단백질 적재(loading)가 미세분쇄된 bSA(10% 적재된) 및 다양한 결정성 입자(1-10% 적재된)들의 3.4kL5로부터의 방출에 미치는 영향을 도시한 그래프;
도 6은 생물학적 활성을 가진 입자의 크기가 인간성장호르몬(hGH)의 30% 3.4kL5로부터의 방출에 미치는 영향을 도시한 그래프; 및
도 7은 마이크로스피어의 기공 크기가 마이크로화된(micronized) hGH의 제품으로부터의 방출에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.
본 발명은 생물학적 활성을 가진 물질(BAS)을 불용성 형태로 투여하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 BAS를 불용성 형태로 제형화함으로써 BAS의 생물학적 이용 효능(bioavailability)을 향상시킨다. 본 발명의 방법및 조성물은 비교적 다량의 이러한 물질의 제어된 지속적인 전달을 위해 저 분출효과를 제공한다.
마크로머
본 발명의 마크로머는 적어도 하나의 중심 코어 형성 영역, 적어도 하나의 분해성(즉, 가수분해성) 영역, 및 적어도 하나의 중합가능한 영역을 보유한다. 마크로머는 수용성 또는 비수용성일 수 있다. 바람직하게, 중심 코어 형성 영역은 수용성이다. 원하는 경우, 마크로머는 중합되어 하이드로겔을 형성할 수 있는데, 상기 하이드로겔은 물질을 제어된 속도로 전달하는데 유용하다. 마크로머를 제형화하고 제품으로 형상화하기 위한 방법은 예를 들면 본원에 참고자료로 포함된 WO 99/03454에 개시되어 있다. 마크로머의 중요한 측면은 중합가능한 영역들이 적어도 하나의 분해성 영역에 의해 분리되어 있다는 것이다. 이러한 분리는 균일한 생체내(in vivo) 분해를 촉진한다.
마크로머의 중심 코어 영역 및 가수분해성 영역 간의 비율은 마크로머의 여러가지 일반적 특성들을 결정한다. 예를 들면, 마크로머의 수용성은 혐수성 분해성 작용기(hydrophobic degradable group)로 구성된 마크로머의 백분율을 변경함으로써 조절가능하다.
본 발명의 마크로머의 몇 가지 변형이 있다. 예를 들면, 중합가능한 영역은 분해성 영역에 직접적으로 부착될 수 있다; 이와 달리, 중합가능한 영역은 수용성의 비분해성 영역을 통해 간접적으로 분해성 영역에 부착될 수 있는데, 이때 중합가능한 영역들은 분해성 영역에 의해 분리된다. 예를 들면, 마크로머가 분해성 영역에 결합된 단일 수용성 영역을 보유하는 경우, 한 중합가능한 영역은 상기 수용성 영역에 부착되고 나머지 하나의 중합가능한 영역은 분해성 영역에 부착될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 수용성 영역은 마크로머의 중심 코어를 형성하고, 그에 부착된 최소한 두 개의 분해성 영역들을 구비한다. 최소한 두 개의 중합가능한 영역들이, 분해시 중합가능한 영역(특히 중합된 겔 형태를 띤)들이 분리되도록 상기 분해성 영역에 부착된다. 이와 달리, 마크로머의 중심 코어가 분해성 영역에 의해 형성되는 경우, 최소한 두 개의 수용성 영역들이 상기 코어에 부착될 수 있으며, 중합가능한 영역들이 각 수용성 영역에 부착된다.
또 다른 구현예에 있어서, 마크로머는 수용성 골격 영역(water-soluble backbone region)을 구비하며, 분해성 영역이 상기 마크로머 골격에 부착되어 있다. 최소한 두 개의 중합가능한 영역들이 분해성 영역에 부착되어, 분해시 서로 분리되어 겔 산물 용해(gel product dissolution)를 초래한다. 다른 구현예에 있어서, 마크로머 골격 영역은, 분해성 골격에 부착된 가지(branch) 또는 접가지(graft)로서 수용성 영역을 구비한 분해성 골격 영역으로 형성된다. 둘 이상의 중합가능한 영역들이 상기 수용성 가지 또는 접가지 영역에 부착된다.
다른 변형예에 있어서, 마크로머 골격은 다수의 팔을 구비할 수 있다; 예를 들면, 그것은 별모양 또는 빗모양일 수 있다. 골격은 수용성 영역 또는 생분해성 영역을 포함하거나, 수용성의 생분해성 영역을 포함할 수 있다. 중합가능한 영역들이 이러한 골격에 부착된다. 마찬가지로, 중합가능한 영역들은 분해성 영역에 의해 어딘가의 지점에서 분리되어야만 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 하기 약어들이 본 발명의 특수한 마크로머들을 기술하기 위해 종종 사용된다. 세 가지 특정한 실시예에 있어서, 분자량이 4,000 달톤인 PEG로 구성된 수용성 영역을 구비한 마크로머로서, 상기 수용성 영역의 양쪽 측면에 5개의 락테이트기가 위치하고 양쪽 측면이 아크릴레이트기로 캡핑된 마크로머를 "4kL5"라 칭한다. 비슷하게, 분자량이 3,400 달톤인 PEG로 구성된 수용성 영역을 구비한 마크로머로서, 이 수용성 영역의 양쪽 측면에 6개의 카프로락톤기가 위치하고 양쪽 측면이 아크릴레이트기로 캡핑된 마크로머를 "3.4kC6"라 칭한다. 마찬가지로, 분자량이 5,400 달톤인 PEG로 구성된 수용성 영역을 구비한 마크로머로서, 상기 수용성 영역으로부터 뻗어나온 3개의 팔을 구비하되 각각의 팔이 3개의 락테이트기를 보유하고 있으며 각 측면이 아크릴레이트로 캡핑된 마크로머를 "4.2kL3-A3"이라 칭한다.
수용성 영역
바람직한 구현예에 있어서, 중심 코어 영역은 수용성 영역이다. 마크로머의 이러한 수용성 영역은 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(에틸렌 옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 공중합체, 다당류, 탄수화물, 또는 단백질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
마크로머는 바람직하게는 PEG를 포함하는 수용성 코어 영역을 포함하는데, 이는 PEG가 높은 친수성과 수용성은 물론 양호한 생체적합성을 갖고 있기 때문이다. PEG 영역은 바람직하게는 약 400-40,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 1,000-30,000 달톤, 약 1,000-20,000 달톤, 또는 약 2,000-10,000 달톤의 분자량을 갖는다.
분해성 영역
마크로머의 분해성 영역은, 예를 들면 폴리(α-히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르쏘에스테르), 폴리(오르쏘카보네이트), 또는 폴리(포스포에스테르), 또는 이러한 폴리머들의 블렌드 또는 공중합체를 함유할 수 있다.
폴리(α-히드록시산)의 예에는 폴리(글리콜산), 폴리(DL-젖산), 및 폴리(L-젖산)이 포함된다. 폴리(락톤)의 예에는 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(γ-부티로락톤), 폴리(1,5-디옥세판-2-온), 및 폴리(트리메틸렌 카보네이트)가 포함된다. 분해성 영역은 이들 중 최소한 두 개의 상이한 폴리머들의 블렌드를 포함할 수 있다. 공중합체의 예에는 카프로락톤과 글리콜산의 공중합체, 및 카프로락톤과 젖산의 공중합체가 포함된다.
중합가능한 영역
마크로머의 중합가능한 영역은 바람직하게는 마크로머를 중합할 수 있는 탄소-탄소 이중결합을 보유한다. 적절한 중합가능한 작용기의 선택은 신속한 중합 및 겔화를 허용한다. 아크릴레이트류를 함유하는 중합가능한 영역이 바람직한데, 그 이유는 그들이 후술하는 바와 같이 몇몇 개시 시스템(initiating system)을 이용하여 중합될 수 있기 때문이다. 아크릴레이트류의 예에는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 및 메틸 메타크릴레이트가 포함된다.
마크로머의 중합
원한다면, 본 발명의 마크로머는, 장파장 자외선, 가시광선, 열 에너지, 또는 산화환원계(redox system)의 영향 하에 중합 개시제를 사용하여 중합될 수 있다. 중합은 실온에서, 또는 실온보다 낮은 온도, 예를 들면 20℃ 미만에서 수행된다. 중합 중에, 단백질과 같은 물질들이 하이드로겔의 결과되는 중합체 네트워크 내로 도입된다.
마크로머의 중합은 320nm 또는 그 이상의 파장을 갖는 광선에 의해 제자리에서(in situ) 개시될 수 있다. 중합가능한 영역이 아크릴레이트기를 보유하는 경우, 개시제는 크산틴 염료; 아크리딘 염료; 티아진 염료; 페나진 염료; 캄포르퀴논 염료; 아세토페논 염료; 또는 트리에탄올아민, 2,2-디메틸-2-페닐-아세토페논, 및 2-메톡시-2-페닐 아세토페논을 가진 에오신 염료와 같은 다수의 적절한 염료들 중 임의의 것일 수 있다.
중합은 또한 광선의 부재 하에 일어날 수도 있다. 예를 들어, 중합은 당업계의 숙련가에게 공지된 기술에 따라 산환환원계를 이용하여 개시될 수 있다. 몇몇 경우에는, 본 발명의 산화환원계를 이용하여 마크로머를 중합하는 것이 유리한데, 그 이유는 라디칼 개시제 생성이 광범위한 온도에 걸쳐 적당한 속도로 발생하기 때문이다.
산화환원계에 사용가능한 개시제는, 제한 없이, 아세틸, 벤조일, 큐밀 및 t-부틸과 같은 퍼옥사이드류; t-부틸 및 큐밀과 같은 하이드로퍼옥사이드류; t-부틸 퍼벤조에이트와 같은 퍼에스테르류; 아실 알킬술포닐 퍼옥사이드류; 디알킬 퍼옥시디카보네이트류; 디퍼옥시케탈류; 케톤 퍼옥사이드류; 2,2'-아조(비스)이소브티로니트릴(AIBN)과 같은 아조 화합물; 디설파이드류; 및 테트라젠류를 포함한다.
제품 형상화(Shaping of Articels)
본 발명의 제품은 원하는 임의의 형상으로 형성될 수 있다. 예를 들면, 제품은 특정한 신체강(body cavity)에 들어맞도록 형상화될 수 있다. 제품은 또한 마이크로스피어와 같은 얇고 평평한 디스크 또는 입자로 형성될 수 있다. 이와 달리, 제품은 형상화된 후에, 원하는 형상으로 사용 전에 가공되거나 또는 미립자들고 분쇄될 수 있다. 제품의 원하는 형상은 구체적인 용도에 의존할 것이다.
마크로머 입자들은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있는데, 이러한 기술에는 단일 및 이중 유상액 용매 증발(single and double emulsion solvent evaportion), 분무건조(spray drying), 및 용매 추출이 포함된다. 본원에서 사용될 때, "입자(particle)"라는 용어는 마이크로스피어를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 마이크로스피어에서, BAS는 입자 전체에 걸쳐 분산된다. 입자는 매끈하거나 부정형인 표면을 가질 수 있으며, 속이 비지 않았거나 또는 기공이 있을 수 있다. 마이크로스피어를 만드는 방법은 예를 들면 미국특허 제4,272,398호,
등의 문헌에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고자료로 포함된다. 본 발명의 바람직한 일구현예에 있어서, 마이크로스피어는 하이드로겔 비말(hydrogel droplet)로 형성된다.
예를 들어 Mathiowitz, et al.(1990), Benita et al.(1984), 및 미국특허 제4,272,398호에 개시된 바와 같은 용매 증발법(solvent evaporation)에 있어서, 중합체는 메틸렌 클로라이드와 같은 휘발성 유기용매에 용해된다. 용해된 형태 또는 미립자로 분산된 형태로 존재하는, 도입하고자 하는 제제를 선택적으로 상기 중합체 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 폴리(비닐 알코올)과 같은 표면활성제(surface active agent)를 함유하는 수성상(aqueous phase)에 현탁한다. 결과되는 유상액을 유기용매의 대부분이 증발할 때까지 교반하면 고체 마이크로스피어가 남게 되며, 상기 마이크로스피어는 수세 후 동결건조기에서 밤새 건조된다.
예를 들어 Park et al.(J. Controlled Release 55:181-191(1998))에 개시된 바와 같은 용매 제거법(solvent removal)에서는, 치료용 또는 진단용 제제를 메틸렌 클로라이드와 같은 휘발성 유기용매에 용해된 선택된 중합체의 용액에 분산 또는 용해시킨다. 이어서, 그 혼합물을 교반에 의해 실리콘 오일과 같은 오일에 현탁시켜 유상액을 형성한다. 용매가 오일상(oil phase)으로 확산됨에 따라 상기 유상액 비말은 고형 고분자 마이크로스피어로 경화된다.
본원에 참고자료로 포함된 PCT WO 97/41833에는 거대분자의 액상용액을 분무하고, 이 분무단계에서 형성된 비말을 건조한 다음, 그 입자들을 회수함으로써 생물학적 분자의 미립자를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
분무건조는 치료용 제제와 같은 BAS와 하이드로겔을 형성하기 위해 사용되는 중합가능한 마크로머의 균질한 혼합물을 노즐, 회전 디스크(spinning disk) 또는 동등한 장치를 통해 통과시킴으로써 상기 혼합물을 분무하여 미세한 비말을 형성한다. 상기 BAS 및 중합가능한 마크로머는 용액 또는 현탁액, 예를 들어 수용액으로 제공될 수 있다. 상기 미세한 비말은 노광되며, 그 결과 마크로머의 중합 및 BAS가 도입된 하이드로겔 비말의 형성이 초래된다. 하이드로겔은 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 제5,410,016호에 개시된 방법에 따라서, 또는 고분자 화학 분야에 공지된 다른 기술에 따라서 형성될 수도 있다.
다른 구현예에 있어서, 하이드로겔 입자는 유중수(water-in-oil) 공정에 의해 제조되는데, 여기서 중합가능한 마크로머 및 도입될 물질은 유중수 유상액에 현탁된 후 노광되며, 그 결과 마크로머의 중합이 일어나 BAS와 같은 물질이 도입된 하이드로겔 입자를 형성한다. 전형적으로, 중합은 실온에서 수행될 수 있다.
상술한 기술을 사용하여 제조된 마이크로스피어는 동결건조되며, 따라서 긴 저장 수명(생분해 없이)을 가지고 BAS가 생물학적으로 활성을 띤 채로 유지된다. 주사가능한 제형(injectable formulation)의 경우, 상기 마이크로스피어는 사용하기 이전에 염수 또는 다른 액체와 같은 적절한 용액으로 재구성된다. 폐 전달을 위해서는, 동결건조된 입자 또는 재구성된 입자 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
마크로머의 특성
본 발명의 제품은 생분해성이다. 생분해는 연장 올리고머(extension oligomer) 내의 연결부(linkage)에서 발생하며, 비독성이면서 신체로부터 용이하게 제거되고/거나 체내의 정상적이고 안전한 화학적 중간체인 절편들을 초래한다. 이러한 물질들은 특히 친수성 물질의 전달에 유용한데, 그 이유는 중합체의 수용성 영역이 물로 하여금 중합체 내에 포획된 물질에 접근하는 것을 허용하기 때문이다.
마크로머의 용도
마크로머는 제품(article)으로, 예를 들면 마이크로스피어로 형상화될 수 있으며, 이러한 제품은 생체내(in vivo) 조건하에서 도입된 물질들의 조절된 방출(controlled release)을 허용하는 속도로 분해될 수 있다. 그러한 물질의 방출은, 중합체의 분해 이전에 그 물질이 중합체로부터 확산됨으로써, 및/또는 중합체가 분해됨에 따라 그 물질이 중합체로부터 확산됨으로써 일어날 수 있다. 중합체의 분해는 말단 에스테르 결합의 점진적인 가수분해에 의해 결국에는 생체내에서 자유 거대분자의 조절된 방출을 촉진한다. 이와 같이, 종종 다른 방출계(release system)들과 연관된 분출효과는 다양한 제형에서 방지된다.
BAS의 방출속도는, 예를 들어 수용성 영역의 조성 또는 마크로머의 중합도와 같은 다양한 인자들에 의존한다. BAS의 방출속도는 또한 마크로머의 분해성 영역의 분해속도에 의존한다. 예를 들면, 글리콜산 에스테르는 급속한 분해를 초래하고, 젖산 에스테르는 다소 느린 분해를 초래하며, 카프로락톤 에스테르는 매우 느린 분해를 초래한다. 분해성 영역이 폴리글리콜산으로 구성된 경우, 방출기간은 일주일 미만이다. 분해성 영역이 폴리(젖산)으로 구성된 경우, 방출기간은 약 일주일이다. 분해성 영역이 카프로락톤과 젖산의 공중합체, 또는 트리메틸렌 카보네이트와 젖산의 공중합체로 구성된 경우, 방출기간은 2주 내지 4주이다. 분해성 여역이 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 또는 카프로락톤과 트리메틸렌 카보네이트의 공중합체로 구성된 경우, 방출기간은 약 3주 내지 8주이다. 분해성 영역이 폴리(트리메틸렌 카보네이트) 또는 폴리(카프로락톤)으로 구성된 경우, 방출기간은 약 5주 이상이다.
제품으로부터 BAS가 방출되는 정확한 속도는 제품의 친수성 및 혐수성 성분들의 비율을 변경함으로써 수정될 수 있다. 예를 들어, 상당히 가용성인 마크로머는 중합 후에 친수성 겔을 생성할 것이다; 친수성 하이드로겔은 혐수성 겔보다 더 신속하게 분해되는 것으로 확인되었다. 친수성 마크로머(예컨대, 4kL5)와 혐수성의 비수용성 마크로머(3.4kC6)의 블렌드가 중합된 하이드로겔을 형성하는데 사용된 경우, 이러한 하이드로겔은 젖산만을 함유하는 하이드로겔의 방출속도와 카프로락톤만을 함유하는 하이드로겔의 방출속도 사이에 드는 방출속도를 가질 것이다. 분해성 영역이 카프로락톤과 젖산의 공중합체인 마크로머 역시, 주요 분해성기로서 젖산만을 함유하는 하이드로겔의 방출속도와 카프로락톤만을 함유하는 하이드로겔의 방출속도 사이에 드는 방출속도를 가질 것이다. 이와 마찬가지로, 활성물질의 친수성 또한 BAS의 방출속도에 영향을 미치는데, 친수성 활성물질은 일반적으로 혐수성 물질보다 더 빨리 방출된다.
치료용 제품으로부터 주어진 BAS가 방출되는 속도는, 최종 생산품 제형의 퍼센트로서의 적재된 물질의 양에 의존한다. 예를 들면, 고분자 분야에서는 통상 다량의 BAS 적재가 더 긴 기간 동안의 치료용량 전달을 초래함과 동시에 커다란 분출효과도 초래하는 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 다량의 BAS가 적재되었으면서도 낮은 분출효과를 시현하는 제품이 최적의 제품일 것이다. 본 발명의 제품은 이러한 특성을 시현한다.
제품으로부터 BAS의 방출에 영향을 미치는 다른 인자들은 BAS의 응집 및 용해도이다. 본 발명의 제품이 BAS의 전달에 최적인 방출 프로파일을 가지기 위해서는, 응집되는 BAS의 퍼센트가 낮아야만 한다. 본 발명의 제품은, 바람직하게는 15% 미만이 응지된 BAS를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 제품은, 그것이 건조중량으로 최소한 2.5%, 바람직하게는 최소한 5%, 가장 바람직하게는 20 또는 40%의 BAS를 함유하는 경우에 조차도, 이러한 낮은 응집 특성을 가진다.
상술한 바와 같이, 제품으로부터 BAS가 방출되는 속도에 영향을 미치는 또 다른 인자는 제품 내에서의 BAS의 용해도이다. 고분자 화학 분야에 있어서, 통상 BAS와 같은 수용성 물질은 본 발명의 마크로머 내로 도입시 균질계(homogenous system)를 형성할 것으로 여겨지고 있다. 또한, 본 발명의 마크로머의 형성에 소요되는 시간 내에 물에 녹지 않는 물질은 비균질계를 형성할 것으로 생각된다. 비균질계에서의 분출량을 작은 입자들을 가진 미립자로 된 현탁액을 사용함으로써 최소화하는 것이 가능할 지라도, 일반적으로 고분자 전달계에서 최적의 전달을 달성하기 위해서는 물질이 수용성 형태로 존재해야 할 것으로 생각된다. 본 발명의 제품은 불용성 형태로 BAS를 함유하며, 이러한 제품들은 낮은 분출효과를 시현하는데, 이는 예기치 못한 결과이다.
제품으로부터 BAS가 방출되는 속도에 영향을 미치는 또 다른 인자는 BAS의 입자크기이다. 예를 들어, 본 발명의 제품은 분쇄 후 어떤 차원(dimension)에서도 약 75 마이크론보다 작은 미립자를 분리하기 위해서 걸러진 BAS를 특징으로 한다. 이러한 입자들을 사용하여 마이크로스피어를 생산하고, 그 마이크로스피어로부터 BAS가 방출되는 속도를 측정하였다. 이 방출속도를, BAS가 미세분쇄되지 않은 것을 제외하고는 동일한 마이크로스피어로부터 동일한 BAS가 방출되는 속도와 비교하였다. 이 연구의 결과는 미세분쇄된(fne-ground) BAS가 더 느리고 더 낮은 분출효과를 가지는 방출속도를 초래함을 제시하였다. 상술한 인자들을 조정함으로써, 분해 및 조절된 방출은 매우 넓은 범위에 걸쳐 변화될 수 있다. 예를 들면, 방출은 수 시간에 걸쳐, 또는 수 일에 걸쳐, 또는 수 개월에 걸쳐 일어나도록 고안될 수 있다.
본 발명의 방법은 균일한 약물 전달계(homogenous drug delivery system)로 작용하는 입자들을 생산할 수 있다. 본 발명의 제품의 균일한 본성 때문에, 방출되는 물질의 초기 분출(initial burst)은 발생하지 않는다. 또한, 한결같은 일관성(uniform consistency)은 분출효과를 최소화하면서 비교적 다량의 단백질을 도입하는 것을 가능케 해준다.
본 발명은 또한 불용성 마크로머를 특징으로 한다. 이러한 마크로머는 적어도 하나의 수용성 영역, 적어도 하나의 분해성(예컨대, 가수분해성) 영역, 및 적어도 하나의 중합가능한 영역을 보유한다. 상기 분해성 영역은 글리콜산, 젖산, 카프로락톤, 트리메틸렌 카보네이트의 중합체, 또는 그들의 블렌드 혹은 공중합체를 포함한다. 분해성 영역은 비수용성이어야만 한다. 예를 들어, 15-20 락타이드 단위를 함유하는 분해성 영역을 가지는 마크로머가 제조가능한데, 이러한 마크로머는 비교적 빠른 방출속도를 제공할 것이다. 6 카프로락톤 단위를 함유하는 분해성 영역을 가지는 마크로머는 비교적 느린 방출속도를 제공할 것이다. 6 카프로락톤 단위, 4 락타이드 단위 및 4 글리콜라이드 단위의 공중합체를 함유하는 분해성 영역을 가지는 마크로머는 빠른 방출속도를 제공할 것이며, 3 락타이드 단위 및 7 트리메틸렌 카보네이트 단위의 공중합체를 함유하는 분해성 영역을 가지는 마크로머는 중간 정도의 방출속도를 제공할 것이다.
이러한 마크로머의 수용성 영역은 바람직하게는 PEG이다. 수용성 영역은 다수 개의 팔을 가질 수 있다; 예를 들어, 그것은 예컨대 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 5,410,016호에 개시된 바와 같이 별모양 또는 빗모양일 수 있다. 수용성 영역은 바람직하게는 3,4, 6 또는 8개의 팔을 가지며, 분자량은 500-20,000, 바람직하게는 1,000-10,000 달톤이다.
단백질 침전을 증가시키기 위한 방법
본 발명의 제품은, BAS를 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러하 분자들의 혼합물 및 마크로머와 배합하고 이들의 혼합물을 제조한 다음 그 혼합물을 중합함으로써, 불용성 형태의 BAS를 함유하도록 제조가능하다. 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물이 단백질 침전을 증가시키기 위해서 제품 제조에 사용될 수 있다. 단백질을 선택적으로 추방하는 분자들의 예에는, 마크로머, 폴리(에틸렌 글리콜), 하이알루론산, 및 폴리(비닐피롤리돈)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 양 또는 음 이온 전하를 띤 시약이, 제품을 생산하기 위해 중합될 혼합물 내의 BAS의 침전을 증가시키기 위한 목적으로 본 발명의 제품 제조에 사용될 수 있다. 사용될 최적의 시약은 단백질의 전하에 의존하는데, 단백질 전하는 혼합물의 pH에 영향을 받는다. 단백질을 선택적으로 추방하는 분자들의 혼합물의 예에는, 트리에탄올아민 또는 Tris와 같은 양하전 이온-운송 시약을 포함하는 분자들의 혼합물(예컨대, pH가 단백질이 음으로 하전되는 pH인 경우); 또는 소디움 도데실 설페이트와 같은 음하전 이온-운송 시약을 포함하는 분자들의 혼합물(예컨대, pH가 단백질이 양으로 하전되는 pH인 경우)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 계면활성제, 예를 들어 Tween 20, Tween 80, 또는 폴록사머 F68을 포함하는 혼합물도 단백질의 침전을 증가시키는데 사용될 수 있다.
고 적재(high load) 및 저 분출(low burst) 특성
치료용 제제, 예를 들어 BAS가 본원에 기술된 제품 내로 고수율로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 제품은 건조중량으로 최소한 5%의 활성물질을 함유하도록 제조될 수 있다. 바람직하게, 제품은 건조중량으로 적어도 10, 25 또는 40%를 함유한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 BAS는 마크로머와 배합되어 제품으로 형성시 불용성 형태로 존재한다. 제품 내의 활성물질의 고 적재 및 불용성 형태의 조합은 제품에 느린 방출 프로파일과 적은 초기 분출을 제공한다. 이러한 결과는, 고분자 분야에 있어서 불용성 활성물질을 함유하는 제품은 통상 활성물질의 큰 초기 분출을 가질 것이라는 견해에 비추어 볼 때 놀라운 것이다.
본 발명의 제품에 함유된 BAS는 불용성이다. 불용성 BAS를 함유하는 제품의 제형화는, 예를 들면 BAS를 PEG와 혼합한 다음 이들을 원하는 마크로머와 배합함으로써 달성될 수 있다.
마이크로스피어 내에 적재된 BAS의 양은, 그것을 마크로머와 배한합 다음 제품으로 형상화함으로써 측정될 수 있다. 상기 제품은 이어서 적절한 용매, 예를 들면 인산완충 방출배지(0.01% NaN3, 0.05M PBS, pH 7.4)에 용해된 후, 당업계에서 이용가능한 수단, 예를 들면 분광광도계를 사용하여 존재하는 BAS의 양에 대해 분석될 수 있을 것이다.
생물학적 활성을 가진 물질
본 발명의 제품에 도입가능한 BAS는 치료용, 진단용 및 예방용 제제를 포함한다. 이들은 천연 화합물, 합성 유기 화합물, 또는 무기 화합물일 수 있다. 본 발명의 제품에 도입가능한 물질에는 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기물질, 항체, 항종양제, 국소마취제, 항맥관형성제, 혈관작용제, 항응집제, 면역조절제, 세포독성제, 항바이러스제, 항체, 신경전달물질, 정신활성제, 올리고뉴클레오티드, 지질, 세포, 조직, 조직 또는 세포 응집물, 및 이들의 조합이 포함된다.
치료용 제제의 예에는 성장 호르몬(예컨대, 인간성장호르몬), 칼시토닌, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), 모양체 신경영양성 인자, 부갑상선 호르몬, 및 낭포성섬유증 막횡단 조절인자 유전자(cystic fibrosis transmembrane regulator gene)가 포함된다. 다른 특수한 치료용 제제에는 부갑상선 호르몬-관련 폴리펩티드, 소마토스타틴, 테스토스테론, 프로게스테론, 에스트라디올, 니코틴, 펜타닐, 노르에티스테론, 클로니딘, 스코폴로민, 살리실레이트, 살메테롤, 포르메테롤, 알베테롤, 및 바륨이 포함된다.
펜타미딘 이세티오네이트(pentamidine isethionate)를 포함하는 폐렴 치료용 약물이 사용될 수도 있다. 알부테롤 설페이트, β-작동약, 메타프로테레놀 설페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 아세트아마이드, 부데소나이드, 아세토나이드, 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔라이드, 크로몰린 소디움, 에르고타민 타르트레이트, 및 단백질 또는 폴리펩티드 약물(TNF 길항약 또는 인터루킨 길항약과 같은)을 포함하는, 천식과 같은 폐질환을 치료하기 위한 약물도 사용될 수 있다.
다른 치료용 제제에는 싸이토카인, 케모카인, 림포카인 및 실질상 정제된 핵산과 같은 암 화학요법제; 및 감약화 인플루엔자 바이러스와 같은 백신이 포함된다. 본 발명의 제품에 도입가능한 실질상 정제된 핵산은 게놈 핵산서열, 단백질을 암호화하는 cDNA, 발현벡터, 상보성 핵산서열에 결합하여 전사 또는 해독을 저해하는 안티센스 분자, 및 리보자임을 포함한다. 예를 들면, 낭포성섬유증과 같은 질환을 치료하기 위한 유전자가 투여가능하다. 헤파린과 같은 다당류 또한 투여가능하다.
다른 치료용 제제에는 조직 플라스미노젠 활성제(t-PA), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 카탈라아제, 황체형성호르몬 방출호르몬(LHRH), 길항약, IL-11 혈소판 인자, IL-4 수용체, 엔브렐, IL-1 수용체 길항약, TNF 수용체 융합단백질, 거핵구 성장 및 발달 인자(MGDF), 스템젠, 인간화된(humanized) 항-HER-2 및 항-VEGF 단클론 항체, 항-Tac 항체, GLP-1 아밀린, 및 GLP-1 아밀린 유사체가 포함된다.
추가의 치료용 제제에는 심방나트륨배설증가인자, 심방나트륨배설증가펩티드, β-인간융모성성선자극호르몬, 염기성섬유아세포성장인자, 우(牛)성장호르몬, 골형태형성단백질, B세포 자극인자-1, B세포 자극인자-2, 우(牛)소마토트로핀, 암세포파괴인자, 연골유도인자, 코르티코트로핀방출인자, 콜로니자극인자, 분화자극인자-1, 내피세포성장인자, 적혈구분화인자, 신장인자 1-α, 상피성장인자, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 티모포이에틴, 섬유아세포성장인자, 여포자극호르몬, 과립구콜로니자극인자, 신경교원섬유성산성단백질, 성장호르몬방출인자, 인간 α-1 항트립신, 인간심방나트륨배설증가인자, 인간융모성성선자극호르뮨, 인간백혈병저해인자, 헤모포이에틴-1, 간세포성장인자, 인간형질전환성장인자, 인간갑상선-자극호르몬, 인터페론, 면역글로블린 A, 면역글로블린 D, 면역글로블린 E, 인슐린-유사 성장인자-I, 인슐린-유사 성장인자-II, 면역글로블린 G, 면역글로블린 M, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 신장플라스미노젠활성제, 렉틴세포유착분자, 황체형성호르몬, 백혈병저해인자, 단클론항체, 대식세포활성화인자, 대식세포세포독성인자, 대식세포콜로니자극인자, 거핵구콜로니자극인자, 종양괴사인자. 대식세포저해인자. 뮬러리안(Mullerian) 저해물질, 거핵구자극인자. 멜라닌세포자극인자, 호중구화학주성인자, 신경성장인자, 신규한 플라스미노젠 활성제, 비스테로이드성 항-염증 약물, 골형성인자 추출물, 항종양림포카인, 프로스테이트-특이적 항체, 항-혈소판 활성화인자, 플라스미노젠 활성제 저해제, 혈소판-유래 성장인자, 혈소판-유래 상처치유조성물, 혈장성 인간인터루킨유도단백질, 종양혈관형성인자, 조직조절인자, T세포 성장인자, T세포 조절펩티드, 형질전환성장인자, 종양성장저해제, 종양저해인자, 금속단백질의 조직저해제, 종양괴사인자, 조직플라스미노젠활성제, 갑상선자극호르몬, 유로키나아제-플라스미노젠활성제, 혈관내피성장인자, 및 혈관작용성 장펩티드가 포함된다.
바람직한 BAS는 실질상 정제된 폴리펩티드 또는 단백질이다. 단백질은 통상 100개 이상의 아미노산 잔기들로 구성된 것으로 정의되고, 폴리펩티드는 100개 미만의 아미노산 잔기들로 구성된 것으로 정의된다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용되는 단백질이라는 용어는 단백질과 폴리펩티드 양자를 의미한다. 단백질은 예를 들면 천연소스로부터 분리되거나 또는 재조합에 의해 생산될 수 있다. 단백질의 예에는 인슐린; 및 인간성장호르몬 및 우성장호르몬과 같은 성장호르몬을 포함하는 다른 호르몬들이 포함된다. 다른 단백질의 예로는, 인자 VIII; 인자 IX; 인자 VIIa; 및 인터루킨-4를 포함하는 인터루킨과 같은 항-염증제를 들 수 있다. 또 다른 예로는, DNAase 및 프로테아제와 같은 효소들이 있다. 또 다른 예로는,싸이토카인, 인터페론(인터페론-α와 인터페론-β를 포함하는), 포이에틴, 맥관형성인자, 분화인자, 콜로니자극인자, 성장인자, 세레다아제(ceredase), 지베렐린, 옥신, 및 비타민, 및 이들의 단편이 포함된다. 성장인자의 예를 들면, 혈관내피성장인자(VEGF), 내피세포성장인자(ECGF), 염기성섬유아세포성장인자(bFGF), 및 혈소판-유래 성장인자(PDGF) 등이 있다.
단백질은 본 발명의 하이드로겔 내에서 안정하다. 예를 들면, 실시예에서 후술하는 바와 같이, 다수 단백질이 이합체화 및 응집으로부터 보호된다. 나아가, 펩티다아제-저해제를 공도입(co-incorporating)함으로써 단백질 또는 폴리펩티드의 효소분해를 최소화하는 것이 가능하다.
서방형 단백질 고분자를 이용한 동물의 치료
본 발명의 고분자 제품은 BAS를 동물에 전달하여 동물, 예를 들어 마우스, 백쥐 또는 인간을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 제품은 상술한 것과 같은 BAS를 포함할 수 있다.
BAS를 포함하는 치료용 제품의 치료 결과는, 본원에 기술된 바와 같이, 투입되는 BAS에 따라서 달라진다. 예를 들어, 만약 hGH가 본 발명의 치료용 제품을 사용하여 투입된다면, 그러한 치료의 결과로서 성장률이 증가될 것으로 예측된다. 만일 에리트로포이에틴이 상기 치료용 제품을 이용하여 투입된다면, 그러한 치료의 결과로서 동물에서 망상적혈구가 증가될 것으로 예측된다. 만일 인슐린이 상기 치료용 제품을 사용하여 투입된다면, 혈중 포도당 농도의 감소를 가져올 것이다.
본 발명의 제품은 저 분출효과를 가지는 조절된 방식으로 BAS를 방출하기 때문에, BAS의 최적화된 전달을 제공한다. 이러한 방출 속도의 결과, 목적 기간에 걸쳐 약물이 지속적으로 투여되는 것이다. 느리고 일정한 속도의 투여는 결과적으로 BAS가 동물로 투여되어야 하는 횟수의 감소를 가져올 것이다. 또한 저 분출효과는 너무 많은 BAS의 한 부위로의 전달이 동물에 해로운 몇몇 경우에 있어서 매우 바람직할 것이다.
제품의 투여 경로
흡입
본 발명의 하이드로겔 입자의 사용은 약물이 폐로 전달되는 것을 촉진시킨다. 폐로의 투여는 WO 99/03454에 개시된 바와 같이 폐 조직 벽을 통과하여 순환계로 이동할 수 있는 약물의 전달을 제공한다.
활성물질의 폐로의 전달시 문제점은 폐 대식세포가 이 물질을 흡수함으로써 이 물질이 전신 및 국소 순환계로 이입하는 것을 방해할 수 있다는 것이다. 흡수(uptake)는 입자 표면에 흡착된 단백질이 대식세포 표면의 수용체와 결합할 때 발생한다. 흡수를 방지하기 위해서, 본 발명은 비이온성 하이드로겔(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 기재 폴리머로 형성된)을 제공한다. 이러한 하이드로겔은 단백질을 낮은 농도로 흡착하고, 따라서 세포 표면에 잘 결합되지 않는다. 음이온성 하이드로겔(예를 들면, 폴리아크릴산으로 형성된) 또한 단백질을 낮은 농도로 흡착하고, 따라서 세포 표면에 잘 결합되지 않는다.
다른 구현예에서, 생체적합성 마이크로 캡슐이 형성될 수 있으며, 그 표면에는, 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 제5,380,536호에서 설명된 바와 같이, 세포 부착(cell adhesion)을 방지하기 위해서 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)와 같은 수용성 비이온성 고분자가 부착될 수 있다.
입자의 크기와 밀도는 폐에 전달되는 BAS의 양을 최대화하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 대식세포는 작은 입자들을 흡수하는 것 만큼 효율적으로 큰 입자들을 흡수하지 못할 것이다. 그러나, 큰 입자들은 작은 입자들 만큼 폐 깊은곳 까지 잘 전달되지 않는다. 이러한 복잡한 요인들을 극복하기 위해서, 본 발명은 수화(hydration)됨에 따라 커지는 작은 입자들을 제공한다. 상기 입자들은 작고(즉, 1-5 마이크론), 건조하거나 약간 젖은 상태에서 폐 깊숙히 투여되며, 수화시 팽윤(swelling)되어 폐 대식세포가 잘 흡수하지 못하게 된다. 팽윤은, 예를 들어 하이드로겔 고분자의 화학적 물리적 특성에 따라, 이 입자들이 건조상태에서 수화될 때, 및 온도, pH 혹은 염농도의 변화에 의해서나 또는 다른 용매의 존재에 의해서 일정한 수화 상태에서 다른 상태로 수화될 때 발생한다.
본원에서 사용될 때, "건조"라는 용어는 분말 입자가, 분말이 흡입기구 내에 용이하게 분산되어 에어로졸을 형성할 수 있을 정도의 수분함량을 가지는 것을 의미한다. 바람직하게는 입자의 수분함량은 10 중량% 미만(물), 보다 바람직하게는 약 5 중량% 미만, 선택적으로는 약 2 중량% 미만이거나 그보다 더 낮다.
입자의 밀도는 두드림 밀도(tap density)로 표현된다. 두드림 밀도는 외피 중량 밀도(envelope mass density)의 표준 도량단위이다. 등방성 입자의 외피 중량 밀도는 밀폐시의 최소 구 외피부피로 나눈 입자의 중량으로 정의된다. 이 입자의 밀도는 GeoPyc(Micrometers Instrument Corp., Norcross, GA) 또는 AutoTap(Quantachrome Corp., Boyton Beach, FL)에 의해 측정된다.
예를 들면, 3.4kL5 입자의 밀도는 하기와 같이 측정되었다. 3.4kL5(1.0025g), 200mM TEOA(PBS 용액), pH 7(1.0260g) 및 1000ppm 에오신(0.1028g)을 배합하였다. 이 용액 200mg을 탈크(0.1015)와 혼합하였다. 제조된 현탁액을 100㎕ 유리 피펫에 투입한 다음 광(ILC Technology, Inc, Xenon Light Source with Fiber Optics)에 의해 15초간 중합하였다. 제조된 봉을 밀어내어 알루미늄 호일 위에 놓은 후, 다시 3.5분간 중합하였다. 경화된 봉을 18시간 동안 냉동건조(진공 15E mbar, 트랩온도 -50℃)하였다. 건조된 봉(수분함량<10%)을 작은 조각으로 절단하여 헵탄에 넣은 후, 균질기(Silverson L4RT-A)를 사용하여 5,000rpm에서 작은 입자로 분쇄하였다. 분쇄된 입자크기는 1마이크론 내지 0.5mm의 범위였다.
상기 입자 1.645g을 10ml 눈금 실린더(graduated cylinder)에 투입하였다. 상기 눈금 실린더를 Autotap 비중계(Quantachrome) 위에 설치하였다. 시료를 100회 두드린 후, 입자의 부피를 읽었다. 이 과정을 부피에 변화가 없을 때까지 반복하였다. 최종 부피는 2.8ml였다. 입자의 두드림 밀도는 1.6435 g/2.8ml=0.5870g/ml였다.
고분자는 입자형태 뿐만 아니라, 폐 심부로의 전달에 적합한 다른 형태로도 제공될 수 있다. 예를 들면, PEG 유상액 마이크로스피어를 평판 위에 놓고 높은압력과 진공을 적용하여 매우 가벼운 박편형태로 만들 수 있는데, 상기 박편은 예를 들면 유체풍력(fluidic wind force)에 다르게 감응하는 눈송이 굳기(snow flake consistency)를 가진다. 제조된 박편은 예를 들어 0.01 마이크론, 1 마이크론 또는 10 마이크론 두께일 수 있다.
입자들은 호흡계에 단독으로 투여되거나, 또는 액체(예컨대, 염수)나 분말과 같은 약학적으로 허용가능한 임의의 부형제에 혼합되어 투여될 수 있다. 에어로졸 투약량, 제형화 및 전달계가, 예를 들어 Gonda("Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313, 1990); 및 Moren("Aerosol dosage forms and formulations," in: Aerosols in Medicine. Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Elsevier, Amsterdam, 1985)에 설명된 바와 같이, 특정 치료용도로 선택될 수 있다.
폐로의 약물 전달은 액체 분무기, 에어로졸-기재 계량용량 흡입기(aerosol-based metered dose inhaler), 및 건조분말 분산장치와 같은 기구들을 사용하여 이루어질 수 있다. 건조분말 분산장치를 사용하는 경우, 치료제에 도입된 고분자 입자는, 예를 들어 냉동건조 또는 분무건조에 의해 건조분말로 제형화된다. 약학적으로 허용가능한 양의 치료제와 담체를 포함하는, 분무건조된 약학적 건조분말을 제조하는 방법은 본원에 참고자료료 포함된 PCT WO 96/32149에 개시되어 있다.
폐로 투여될 수 있는 BAS의 예에는 인슐린, 항트립신, 칼시토닌, 알파 인터페론, 베타 인터페론, GLP-1 및 DNAse이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
경비 투여
본 발명의 제품은 또한 코를 통하여 화합물을 투여하기 위해서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 또는 재구성된 마이크로스피어가 경비 투여될 수 있다.
근육내 및 피하 투여
본 발명의 제품은 근육주사 또는 피하주사에 의해, 수 일 내지 3 달에 걸쳐서 분해되는 마이크로스피어를 투여하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 성장호르몬은 피하 투여될 수 있다; 성장 호르몬은 투여부위에서 마이크로스피어가 분해됨에 따라 그로부터 방출된다. 그 후, 성장 호르몬은 전신 순환계로 이입한 다음, 그 효능을 직접적으로 발휘하거나, 또는 다른 조직에서 소마토메딘 생산을 유도함으로써 간접적으로 효능을 발휘한다. 이 경우, 최대 0.5mm까지의 입자가 이용가능하다.
다른 구현예에서, 활성 제제는 파상풍 백신, 다른 단백질이나 폴리펩티드, 또는 보다 복잡한 면역원과 같은 백신이다. 상기 백신은 일주일 내지 수주에 걸쳐서 방출되어, 총 면역원 양이 동일한 일회 이상의 부스터 투여(booster shot)가 뒤따라야 하는 알약 복용과 비교하여 보다 개선된 면역반응을 나타낸다. 상이한 종류의 여러가지 마이크로스피어들의 혼합물은 초기 및 부스터 투여형 면역화(initial and booster shot-type immunization)를 가져올 수 있다.
정맥 투여
응고 장애를 치료하는데 유용한 BAS(혈우병의 경우 인자 VIII 또는 IX와 같은)를 포함하는 제품은 정맥투여될 수 있다. BAS는 수일 내지 수주일에 걸쳐서 방출된다. BAS의 치료 농도는 유지되어 더 좋은 치료결과를 나타낸다. 또한 잠재적으로 낮은 총량의 BAS를 투여함으로써 경제적인 이익을 얻을 수 있다. 이러한 접근방법은 환자의 복약이행(compliance)을 촉진하는데 도움이 된다.
정맥 투여의 경우, 마이크로스피어를 이들이 응집되어서 혈관을 막지 않도록 허용가능한 제제로 조제하는 것이 중요하다. 마이크로스피어는 모세관에 머물지 않도록 적절한 크기로 제조되어야 한다. 이를 위해서는, 0.2-0.5 마이크론의 입자크기가 적절하다.
다수의 염증상태에서, 셀렉틴과 ICAM의 발현 및 호중구의 혈관내 침입에 의해 매개되는 염증화 과정의 일환으로, 염증 부위에서 혈관의 누출현상이 생긴다. 하이드로겔 마이크로스피어가 투여되면, 이 마이크로스피어가 염증 부위에서 혈관 밖으로 누출되어, 그들에게 적재된 BAS를 일정시간 동안 국소적으로 방출할 것이다. 이러한 방법이 유용한 질환상태로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 염증성 내장질환(inflammatory bowel disease), 천식, 류마티스성 관절염, 골관절염, 폐기종, 및 낭성 섬유증(효소약물로서 DNase와 함께)이 있다.
싸이토카인류, 림포카인류 또는 암을 치료하기 위한 다른 화합물을 포함하는 하이드로겔 마이크로스피어는 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다. 큰 고형종양 내의 혈관은 일반적으로 누출되기 쉬운 상태이며, 그 내부의 혈행은 매우 느리다. 따라서 마이크로스피어는 고형종양 내에 머물면서 그들의 항암 BAS를 국부적으로 방출하여, 종양 세포를 직접 죽이거나 또는 면역 시스템을 국소적으로 활성화시킬 수 있다. 이러한 접근방법은, 예를 들어, 전신 및 국소 독성에 의해 용량이 제한되며 부작용이 심각한 것으로 알려진, 인터루킨 2와 같은 화합물에 대해서 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로스피어는 순환계로부터 비교적 느리게 제거될 수 있다. 대안으로, 마이크로스피어는 누출성 혈관을 통해서, 또는 좀더 능동적인 표적화 메카니즘(targeting mechanism), 예를 들면 수용체-매개 표적화 메카니즘을 통해서 순환계를 탈출하는 것을 목표로 하는 것도 가능하다.
경구 투여
위장관의 일부 부위에서는, 단백질이 위장 점막을 통하여 전신 및 국소 순환계로 비교적 효율적으로 운반된다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 동결건조된 단백질(매우 작은 입자크기를 가지는)을 포함하는 마이크로스피어는, 약물 함유 마이크로스피어를 효소의 공격 및 상부 GI관에서 발견되는 낮은 pH로부터 보호할 수 있는 적절한 장용성 제형(enteric formulation)으로서 경구 투여될 수 있다. 이러한 장용성 제제는, 위장관을 가로질러 장용성 캡슐로서 BAS-함유 마이크로스피어를 점차적으로 방출하도록, 몇몇 유용한 기술을 사용하여 고안될 수 있다. 이러한 기술은 WO 99/03454 및 Mathiowitz et al.(Nature 386: 410-414(1997))에 보다 상세하게설명되어 있다. 이러한 접근방법은 단백질과 다른 분자들, 심지어는 작은 분자들을 경구로 전달하는 다른 방법들에 비해서 다수의 장점을 가질 것으로 예측된다. 우선, PEG와 단백질은 서로 상용성을 가지므로, 다른 약물 전달방법에서 발견되는 제조 및 안정성 문제를 피할 수 있다. 다음으로, 건조된 하이드로겔은 습윤조직(wet tissue)에 대해서 접착성을 지닌다. 미세분자는 GI 관에 잘 결합하여, 위장 순환계를 통하여 전신으로 운반되거나 또는 그들의 내용물을 위장점막 상에서 방출할 것이며, 그 결과 약물이 전신 및 위장 순환계로 이입될 것이다. 화학촉진제(chemical enhancer), 또는 GI관을 가로질러 전신 순환계로의 이동을 촉진하는 특이적 또는 비특이적 생물학적 운반 메카니즘을 이용하는 조성물을 함유하는 제형 또한 포함될 수 있다.
표적화(targeting)
표적화 배위자(targeting ligand)가 입자상의 반응성 작용기를 통하여 입자에 부착될 수 있다. 표적화 배위자는, 신체의 미세맥관구조(microvasculature) 내의 다양한 지역들에 특유한 특이적 수용체 부위들(예컨대, 폐 내의 수용체 부위 또는 내피세포 상의 수용체 부위)과 입자 간의 결합 상호작용을 가능하게 한다. 표적화 배위자는 특정 표적에 특이적으로 또는 비이징적으로 결합하도록 선택된다. 표적화 배위자의 예로는 항체들 및 항체 가변성 영역(antibody variable region)을 포함하는 그들의 단편, 렉틴류, 호르몬류, 또는 표적 세포의 표면 상에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 유기 분자들을 들 수 있다. 다른 배위자들은 본원에 참고자료료 포함된 Science(279:323-324(1998))에 기술되어 있다.
마이크로스피어는 BAS 및 표적화 분자를 이용하여 제조될 수 있다. 내부 스피어는 약물을 함유하고 외부 PEG 쉘은 표적화 분자 또는 시약을 함유하는 이중 마이크로스피어도 제조가능하다.
부형제 및 담체
치료제 또는 진단제를 포함하는 입자들은, 예를 들어 본원에 참고자료로 포함된 PCT WO 95/31479호에 설명된 바와 같은, 당업계에 공지된 약제학상 허용가능한 한 가지 이상의 부형제와 결합되어 제공될 수 있다. 몇몇 적용예에서는, 균일한 폐 전달을 보장하기 위해서 안정성, 분산성, 연경도(consistency) 및 부피팽창성(bulking)을 증진시킬 수 있는 부형제가 선택될 수 있다. 부형제는, 예를 들면, 인간 혈청 알부민(HSA); 탄수화물류, 아미노산류, 폴리펩티드류와 같은 부피팽창제; pH 조절제 또는 완충액, 및 염류일 수 있다. 추가적인 부형제로는 아연, 아스코르브산, 만니톨(mannitol), 수크로스, 트레할로스, 사이클로덱스트란류, 폴리에틸렌글리콜, 및 United States Pharmacopeia Convention, Inc.에 의해 간행된 The United States Pharmacopeia(1995)(예를 들어 pp. 2205-2207 참조)에 개시된 물질들을 포함하는 통상적으로 약학적 부형제로 사용되는 기타 물질들을 사용할 수 있다. 예시적인 탄수화물류로는 갈락토스와 같은 단당류, 및 락토스와 같은 이당류를 들 수 있다. 단백질을 안정화시키는 부형제류가 특히 유용하다.
몇몇 경우에, 부형제는 담체로서, 즉 활성물질의 방출속도를 조절하기 위해사용된다. 예를 들어, 만니톨은 방출을 가속화하거나 지연시키기 위해 사용될 수 있다.
하기에서 본 발명의 조성물의 제조방법 및 본 발명의 방법을 설명하고 있는 특정 실시예가 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 몇몇 실시예에서, 아크릴레이트-PLA-PEG-PLA-아크릴레이트의 3원 ABA 블록 공중합체로 만들어진 마크로머가 사용되었다. PEG는 3,400 달톤의 분자량을 가지며, 양쪽 말단의 폴리(젖산)은 한쪽에 평균 약 다섯개의 락테이트 단위를 가지고, 이하에서 "3.4kL5"로 지칭된다. 2,000달톤의 낮은 분자량 PEG가 사용될 때, 제조된 마크로머는 "2kL5"로 지칭된다.
다른 실시예에서, 아크릴레이트-PCL-PEG-PCL-아크릴레이트 마크로머가 사용되었다. PEG는 3,400달톤의 분자량을 가지며, 양쪽 말단의 폴리카프로락톤은 한쪽에 평균 약 6개의 카프로일 단위를 가진다. 상기 폴리머는 이하에서 "3.4kC6"로 지칭된다.
또 다른 실시예에서 3개의 작용기를 가진 마크로머가 사용되었다. 이 마크로머는 각각에 3개의 락테이트기가 부착되어 있는 3개의 작용기를 가지고 있는 PEG 코어로 구성되었다. PEG는 4,200 달톤의 분자량을 가지며, 이하에서 "4.2kL3-A3"로 지칭된다.
실시예 1
마크로머 용액의 일반적 제조
단백질 무게를 달아 여기에 하기 성분을 첨가하였다: (i) 90 mM TEOA/PBS, pH 8.0; (ii) 35% n-비닐 피롤리디논(n-VP); 및 (iii) 1000 ppm 에오신. 상기 혼합물을 압설자를 사용하여 혼합하였다. 상기 용액은 암흑속에서 10분동안, 또는 상기 마크로머가 모든 용액을 흡수할 때까지, 또는 용액이 균일한 상태가 될때까지 방치되었다.
하기 성분을 포함하는 마크로머 용액이 제조되었다.
단백질 90mM TEOA 35% n-VP 1000ppm 에오신 3.4kL5 2kL5 총 합계량
15mg 57mg 15mg 3mg 45mg 0mg 135mg
15mg 57mg 15mg 3mg 0mg 45mg 135mg
실시예 2
hGH의 침전 및 하이드로겔 마이크로스피어로의 제조
5mM 탄산수소 암모늄 속의 100mg/ml hGH 용액을 1300mM 트리에탄올아민의 완충액 77μl(pH 8)에 첨가하였다. 400mg의 PEG 2K를 상기 용액에 첨가하여, hGH의 미세침전을 형성하였다. 시료를 4000rpm 속도로 수분간 원심분리하여 0.9ml의 상층액을 제거하였다. 상기 침전 혼합물에 1g의 4.2kL5-A3 마크로머를 첨가한 후, 0.1ml의 10mM 에오신 Y 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 기름상으로 마이크로스피어를 형성하도록 에멀젼화한 다음 아르곤 레이져(argon laser)를 사용하여 중합하였다. 이 조성물의 시험관내 방출특성을 도 1에 나타내었다. 분출은 관찰되지 않았으며, 방출은 최소 5일동안 계속되었다.
실시예 3
동결건조된 인간 성장 호르몬의 미세화 및 하이드로겔 마이크로스피어로의 제조
10 mg/ml 용액의 hGH 암모늄 아세테이트를 동결건조하여 순수 hGH 건조 케이크를 얻었다. 하기 마크로머 용액을 준비하였다: 1g의 2kL5, 1.2g의 포스페이트 완충 염수(pH7), 0.4g의 트리할로스 25% 및 F-68 0.4% 수용액, 0.24g의 2,2-디메톡시 2 페닐-아세토페논 10% 용액(테트라하이드로퓨란). 이 용액에 0.2g의 동결건조 hGH를 첨가하였다. 혼합에 의해 hGH를 분산시킨 후, 현탁액 내에서의 hGH를 1.5인치 20g 바늘로 20회 통과시켜 더욱 미세화하였다. 이 현탁액을 기름상에서 마이크로스피어를 형성하도록 에멀젼화한 다음 UV광(365nm)을 3분간 조사하여 중합하였다. 이 마이크로스피어의 실험관 내 방출특성을 도 2에 나타내었다.
실시예 4
제품의 제조
하이드로겔 형태의 마이크로스피어를 실란화된 유리 슬라이드로 위치시켰다. 스페이서(spacer)로 약 0.4±0.2mm 두께의 플라스틱편을 사용하여 또 하나의 실란화된 유리 슬라이드를 덮은 후, 바인더 클립을 사용하여 단단하게 고정하였다.
광원(ILC Technology, Inc. Xenon Light Source with Fiber Optics)이 5 cm거리를 두고 조준되었다. 디스크의 중심으로 조사하였으며, 디스크의 양면을 불투명한 디스크로 형성하기 위해 각각 2분동안 조사하였다.
실시예 5
4.2kL3-A3 마크로머 및 bSA를 포함하는 제품의 제조
1ml의 50% 에탄올/물 용액에 1g의 4.2kL3-A3 마크로머를 7.8mg의 2,2-디메톡시-2-페닐-아세토페논(DMPA)와 함께 첨가하였다. 마크로머와 DMPA의 완전 용해액에 250mg의 스프레이 건조된 bSA를 첨가한 다음 혼합물이 균일해질 때까지 교반하였다. 전체 혼합물을 200g의 0.5% 레시틴 용액(중백 광유(heaviy white mineral oil) 용액)에서 600rpm으로 교반하여 에멀젼화하였다. 그 직후, 분산된 비말(droplet)을 Black-Ray B100AP UV 램프를 사용하여 15분동안 중합하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이 이 조성물의 실험관내 방출 특성의 프로파일에서 분출은 나타나지 않았다.
분해가능한 마크로머(4.2kL3-A3)를 bSA와 결합시켰다. 상기 단백질은 건조 무게기준 20%로 적재되었다. 에멀젼을 중백광유를 사용하여 형성하였다. 다음으로 마크로머의 하이드로겔로의 고분자화는 스프레이 건조 및 UV중합을 통해 이루어졌다.
실시예 6
마크로머로부터 생물학을 활성을 가지는 물질의 방출 분석
예를 들어 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 제품의 제조후 디스크들을 제거하고, 깨끗한 실란화된 유리 슬라이드 상에서 무게를 측정하였다. 디스크는 하기에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이 열봉합되는 멤브레인 백(heat-sealed membrane bag)에 투입되었다. 20μl 디스크가 각각의 백에 투입되었다. 상기 백을 열 봉합하여, 2.0ml의 포스페이트 완충액 방출 미디어(0.01% NaN3, 0.05M PBS; pH 7.4)속에 위치된 상태로, 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 상에서 100rpm으로 하여, 39℃로 배양하였다.
각각의 시간 지점에서 백은 신선한 2.0ml의 PBS 방출 미디어로 이동되었다. 시편을 BAS가 방출되는 한 매일 분석을 위해 수집하였다.
멤브레인 백을 하기와 같이 준비하였다. 멤브레인 시트를 약 7×2.5cm의 조각으로 절단하였다. 이 시트를 반으로 접었다. 분젠버너(Bunsen burner) 또는 프로판 토치(propane torch)를 이용하여, 압설자를 붉게 되도록 가열하였다. 상기 시트의 가장자리를 정렬하였으며, 멤브레인의 측면이 붉게 가열된 압설자를 사용하여 절단하여 상기 가장자리가 봉합하였다. 디스크가 백 안으로 위치된 후, 마지막 가장자리를 상기와 동일한 열-봉합 기술로 봉합하였다.
시료들을 날마다 SEC-HPLC를 사용하여 분석하였다. 단량체, 이량체 및 용해가능한 응집체가 이 방법에 의해 검출될 수 있다. 이동상으로는 0.008M TFA 용액(60/40% CH2CN/H2O)를 사용하여 pH 2.0, 등용매(isocratic)로 고정되었으며, 1.5ml/분의 유속으로 시행하였다. 신호들은 220nm의 파장에서 검출되었다. 사용된 칼럼은 가드 칼럼(Bio-Rad Bio-Sil® SEC 250 Guard(5 마이크론 입자크기,80×7.8mm ID))을 갖춘 Bio-Rad Bio-Sil® SEC 250(5 마이크론 입자크기, 300×7.8mm ID)였다. 주입 부피는 10μl였다. 기준 보정곡선은 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75였고, 이동상에서 1mg/ml bST였다.
실시예 7
효율적인 단백질 적재 및 저 분출효과를 가지는 마이크로스피어의 제조
도 3은 본 발명의 치료용 제품의 높은 단백질 적재 및 낮은 분출 특성을 나타낸다. 상기 제품은 bSA(단량체 또는 이량체 형태)와 결합된 4.2kL3-A3 마크로머를 포함하며, 스프레이 건조 기술을 이용하여 마이크로스피어로 형성되었다. bSA는 산정된 적재량의 20%로 적재되었다. 마이크로스피어로부터 bSA의 방출은 상기에서 설명된대로 분석되었다. 방출은 느리고 꾸준한 속도로 이루어졌으며, 분출효과가 나타나지 않았다. 9일 후, 30% 미만의 bSA가 bSA를 포함하고 있는 마크로머로부터 방출되었다. 이러한 결과는 본 발명의 치료용 제품이 분출효과가 적거나 아예 없이 BAS의 느린 방출을 제공할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8
30% 3.4kL5로부터 bSA의 방출에 대한 BAS 입자크기의 효과
제품, 예를 들어 마이크로스피어에서 방출에 대한 BAS 입자크기의 효과가 검토되었다. 마이크로스피어를 형성하기 위해 사용되는 bSA는 액체 질소 분위기에서 약 75 마이크론 미만의 미세입자로 분쇄되거나 분쇄되지 않은 상태의 것이다. 30%3.4kL5와 분쇄되거나 분쇄되지 않은 bSA를 포함하는 마이크로스피어는 상기에서 설명된 방법으로 형성되었으며, 건조 중량 기준 25%로 적재되어 bSA의 방출을 시험하였다. 도 4는 이러한 연구 결과를 나타낸다. 분쇄되지 않은 bSA를 포함하는 마이크로스피어에 비교하여 미세분쇄된 bSA를 포함하는 마이크로스피어는 bSA를 더 긴 기간에 걸쳐 방출하였다. 또한 미세분쇄된 bSA를 포함하는 마이크로스피어는 분출효과가 나타나지 않는 일정한 방출 속도(처음 24시간 내에 적재된 총 bSA의 20% 미만을 방출)를 나타내는 반면, 분쇄되지 않은 bSA를 포함하는 마이크로스피어는 분출효과(24시간 내에 적재된 총 bSA의 약 50%를 방출)를 나타내었다. 이러한 결과는 작은 입자크기를 가지는 BAS를 포함하는 마이크로스피어가 좀더 느린 방출 프로파일과 낮은 분출효과를 나타내는 것을 증명한다.
실시예 9
3.4kL5로부터 미세분쇄된 bSA(10% 적재) 및 다양한 결정 입자(1-10% 적재)의 방출에 대한 BAS 입자 크기 및 단백질 적재의 효과
제품으로부터 bSA의 방출에 대한 BAS 입자크기 및 단백질 적재의 효과가 또한 검토되었다(도 5). 마이크로스피어를 형성하기 위해 사용된 bSA는 액체 질소 분위기에서 약 75 마이크론 미만의 미세 입자로 분쇄되었거나, 분쇄되지 않았다. 분쇄되지 않은 bSA는 3.4kL5와 결합하여 상기에서 설명된 방법을 이용하여 10% bSA가 적재된 30% 3.4kL5 마이크로스피어를 형성하였다. 다양한 입자크기를 포함하고 있는 분쇄되지 않은 bSA는 3.4kL5와 결합하여 1-10% bSA를 적재한 30% 3.4kL5 마이크로스피어를 형성하였다. 상기 마이크로스피어에서 다음으로 bSA의 방출이 분석되었다. 도 5는 이러한 연구의 결과를 나타낸다. 분쇄되지 않은 bSA를 포함하는 마이크로스피어에 비교하여, 미세분쇄된 bSA를 10% 적재한 마이크로스피어는 bSA를 더 긴 기간에 걸쳐 방출하였다. 또한 미세분쇄된 bSA를 포함하는 마이크로스피어는 그 반대의 경우(처음 24시간 내에 적재된 총 bSA의 약 50%를 방출)에 비하여 낮은 분출효과(처음 24시간 내에 적재된 총 bSA의 약 20%를 방출)를 나타내었다. 이러한 결과는 작은 입자크기를 가지는 BAS를 많이 적재하는 마이크로스피어가, 다양한 입자크기를 가지며 BAS 적재량이 낮은 마이크로스피어에 비교하여 바람직한 BAS 방출 프로파일을 제공하는 것을 입증한다.
실시예 10
30% 3.4kL5로부터 hGH의 방출에 대한 단백질 입자 크기의 효과
마이크로스피어로부터의 방출에 대한 BAS 입자크기의 효과는 미세분쇄되거나 분쇄되지 않는 hGH를 포함하는 마이크로스피어를 사용하여 검토되었다. 마이크로스피어를 형성하기 위해 사용된 hGH는 액체 질소하에서 약 75 마이크론 미만의 미세입자로 분쇄되거나 분쇄되지 않았다. 30% 3.4kL5 및 미세분쇄되거나 분쇄되지 않은 hGH를 포함하는 마이크로스피어는 상기에서 설명된 방법으로 형성되었으며, 건조 중량 기준 25% 적재되어 hGH의 방출을 시험하였다. 도 6은 이러한 연구 결과를 나타낸다. 분쇄되지 않은 hGH를 포함하는 마이크로스피어에 비교하여 미세분쇄된 hGH를 포함하는 마이크로스피어는 hGH를 더 긴 기간에 걸쳐 방출하였다. 또한 미세분쇄된 hGH를 포함하는 마이크로스피어는 분출효과가 나타나지 않는 일정한 방출 속도(처음 24시간 내에 적재된 총 hGH의 40% 미만을 방출)를 나타내는 반면, 분쇄되지 않은 hGH를 포함하는 마이크로스피어는 분출효과(24시간 내에 적재된 총 hGH의 약 70%를 방출)를 나타내었다. 이러한 결과는 작은 입자크기를 가지는 BAS를 포함하는 마이크로스피어가 치료용 약물의 방출에 대해서 매우 적절한 특성, 즉 느린 단백질 방출 및 낮은 분출효과를 나타내는 것을 증명한다.
실시예 11
마크로머로부터 hGH 방출에 대한 마이크로스피어 기공 크기의 효과
hGH의 방출 속도에 대하여 미세분쇄된 hGH를 포함하고 있는 마이크로스피어의 기공 크기의 효과가 검토되었다(도 7). 제조조건으로서 건조 중량기준 25% 또는 10% 적재되어 있는 hGH 및 30% 2kL5 또는 30% 3.4kL5를 포함하고 있는 마이크로스피어가 상기에서 설명된 기술을 따라 형성되었다. 2kL5를 포함하는 마이크로스피어는 3.4kL5를 포함하는 마이크로스피어보다 더 작은 기공크기를 가지고 있다. 마이크로스피어로부터 hGH의 방출 속도는 상기에서 설명된 방법을 통하여 평가되었다. 이러한 연구는 미세분쇄된 hGH가 2kL5를 포함하는 마이크로스피어로부터 3.4kL5를 포함하는 마이크로스피어에서보다 더 느린 속도로 방출되는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 작은 마이크로스피어 기공 크기를 나타내는 마크로머가 더 큰 마이크로스피어 기공 크기를 나타내는 것 보다 더 느린 속도로 BAS를 방출하는 것을 시사한다.
실시예 12
뇌하수체가 제거된 백쥐에서 소 성장호르몬의 제어된 방출
활성을 가지는 소 성장호르몬(MW 20 Kd)의 제어된 방출은 뇌하수체가 제거된 백쥐 모델에서 확인되었다. 뇌하수체가 제거된 암컷 백쥐들이 Taconic Labs(Germantown, NY)로부터 구입되었다. 이 백쥐들은 매일 아침 몸무게가 측정되었다. 연구를 시작하기에 앞서, 7일동안 충분한 성장이 부족한 것을 확인하였다. 연구 첫째날 백쥐들은 무게가 측정되었다. 다음, 백쥐들은 동일한 평균 무게의 3 그룹으로 분리되었다. 그룹 1은 치료를 하지 않고 음성대조군으로 하였다. 그룹 2는 3.4KL5와 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트(각각 장치가 0.9 내지 1.1mg의 bST를 포함)이 3:1로 혼합되어 만들어진 하이드로겔 내의 bST 임플란트를 이식받았다. 그룹 3 내의 백쥐들은 연구기간동안 100μg bST를 피하로 주사받았다.
12일 동안의 치료기간 후에, 치료기간 동안 백쥐들의 성장에 대해서 분석되었다. 그룹 1의 백쥐들은 거의 성장하지 않았으나, 그룹 2 및 3의 백쥐들은 그룹 1보다 빠른 속도로 성장하였으며, 서로에 대해서는 대략 동일하였다.
실시예 13
백쥐에서 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 제어된 방출
활성을 가지는 인간 에리트로포이에틴(EPO)의 제어된 방출이 숫컷 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 백쥐들이 Taconic Labs(Germantown, NY)로부터 구입되었다. 하이드로겔 기구는 기구당 3000 단위의 EPO 를 포함하도록 제조되었다. 이들 기구 각각은 다수 백쥐들(그룹 1)로 이식되었다. 동일한 숫자의 다른 그룹의 백쥐들(그룹 2)은 EPO(1000 단위)를 3일 동안 매일 피하로 주사받았다. 세번째 그룹의 백쥐들(그룹 3)은 아무런 치료도 받지 않았다.
기구의 이식과 피하 주사 시작으로부터 5번째 날에, 정맥혈이 각 백쥐로부터 채취되어 EDTA에 보관되었다. 망상적혈구(미숙한 적혈구 세포들)의 단편이 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)로 착색된 후 자동화된 흐름 혈구계산기(automated flow cytometry)에 의해 측정되었다. 그룹 1의 백쥐들은 18% 망상적혈구를 가졌으며, 그룹 2의 백쥐들은 15% 망상적혈구를 가졌고, 그룹 3의 백쥐들은 4% 망상적혈구진 것으로 나타났다.
실시예 14
당뇨병을 가진 백쥐에서 인슐린의 제어된 방출
스프래그-다우리 백쥐들이 Taconic Labs(Germantown, NY)으로부터 구입되었다. 스트렙토조토신(65mg/kg, i.v.)으로 처치하여 당뇨병을 유발하였으며, 48시간 후 혈중 글루코스의 상승(〉300mg/dl)에 의해 확인하였다. 다음으로 펜토바르비탈(35mg/kg)을 사용하여 백쥐를 마취하고, 경정맥으로 카테터(catheter)를 삽입하였다. 혈중 글루코스 농도의 확인을 위해 기준 혈액 시료가 채취된 후, 1단위의 인슐린을 포함하고 있는 하이드로겔 시료가 피하로 이식되었다. 혈액시료를 기구의 이식후 15, 30, 60, 120, 및 180분 시점에 채취하여 혈중 글루코스 농도의검사에 사용하였다.
하이드로겔 기구를 이식받은 백쥐의 혈중 글루코스 농도가 감소되어, 기구가 활성을 가진 형태로 인슐린을 방출할 수 있음을 증명하였다.
인슐린 함유 하이드로겔 입자에 대한 폐순환 시스템을 시험하기 위해서, 백쥐의 목을 중간선 절개에 의해 개방하여, 호흡관을 무딘 절개(blunt dissection)에 의해 노출시켰다. 슬릿은 호흡관쪽으로 절개되어, 폴리에틸렌 튜브가 폐속으로 원위로(distally) 밀어넣어졌다. 작은 부피의 인슐린함유 하이드로겔 미세입자(총 3단위 인슐린의 용량)가 폐로 주입되었고, 튜브는 제거되었다. 혈액 시료들이 채취되어 상기 피하기구에서 설명된대로 채취되어 분석되었다.
혈중 글루코스 농도는 30분 내에 현저하게 저하되어, 적어도 180분 동안 낮게(150 mg/dl 미만) 유지되었다.
실시예 15
뇌하수체가 제거된 백쥐에서 인간 성장 호르몬의 제어된 방출
활성을 가진 인간 성장 호르몬(hGh, MW 20Kd)의 제어된 방출이 뇌하수체가 제거된 백쥐 모델에서 확인되었다. Taconic Labs(Germantown, NY)로부터 구입된 뇌하수체가 제거된 암컷 백쥐의 몸무게를 매일 아침 측정하였다. 연구의 시작에 앞서, 백쥐들은 성장되지 않음을 7일동안 확인하였다. 백쥐들은 동일한 평균 무게를 갖는 3 그룹으로 나누어졌다. 그룹 1은 치료하지 않고 음성대조군으로 하였다. 그룹 2는 3.4kL5 및 3.4kC6(약 1mg의 hGH를 포함하는 각각의 기구)의 3:1 블렌드로이루어지는 하이드로겔속에 포함된 hGH의 이식을 받았다. 그룹 3의 백쥐들은 연구기간동안 매일 100μg hGH를 피하주사받았다.
치로받지 않은 대조군은 연구기간동안 자라지 않으며, hGH 하이드로겔 이식 및 연구기간동안 매일 100μg hGH 주사를 받는 그룹 2 및 3은 각각 계속된 성장을 나타낸다.
실시예 16
인간 성장 호르몬(hGH)를 포함하는 폐 기구
20ml 바이알에 0.559g/ml 200mM TEOA(PBS 완충액; pH 7.0), 0.2548g의 3.4 KL5, 0.0206g의 1000PPM 에오신(PBS; pH 7.0) 및 0.0615g의 hGH(Genentech의 hGH 주입가능한 제제)를 투입하였다. 그 혼합물을 교반하여 10ml 유리튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 크세논 광(ILC Technology, Inc. Xenon Light Sourcer with Fiber Optics)으로 10초간 조사하였다. 반경화된 하이드로겔을 튜브에 꺼내어 3.5분간 더 중합시켰다. 중합된 하이드로겔 막대를 15ml 헵탄에 투입하고, 호모게나이져(homogenizer: Silverson L4RT-A)를 사용하여 30초동안 5000rpm으로 분쇄한 후, 다시 3000rpm에서 30초간 분쇄하였다. 헵탄을 상층분리하고, 분말을 질수분위기에서 건조하였다. 분말은 폐, 구강, 또는 피하의 계속되는 hGH 방출용으로 사용된다.
실시예 17
단백질 방출용 경구 제제
상기에서 묘사된 기술을 사용하여, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 인간 알파 인터페론, 또는 에리트로포이에틴이 마크로머 입자로 결합된다. 저온밀링(cryomilling) 또는 당업계에 알려진 다른 밀링 방법을 사용하여, 매우 작은 입자들, 바람직하게는 약 500 나노미터 미만의 평균크기를 가지는 입자들을 제조하였다. 그러한 나노입자들은 외과수술에 의한 상부 GI 관으로의 카테터 주입을 이용하여 삽입된다. 상기 나노입자의 용량은 나노입자 내에서 약 0.5%의 약물이 백쥐의 혈액에서 예를 들면 RIA에 의해 각 약물의 특정 약리학을 고려하여 검출될 수 있다는 가정에 기초한다.
인슐린의 경우, 혈액 시료는 t=-15, 0, 30, 60, 90, 120 및 180분의 시각에 채취되어 인슐린에 대해서는 RIA에 의해, 혈중 글루코스에 대해서는 글루코미터에 의해 측정된다(인슐린이 공급되는 상태일 때, 당뇨병 백쥐가 사용된다).
다른 약물에 대해서, 보통 백쥐들이 사용되며, 혈중 약물 농도는 RIA 또는 ELISA 기술의 경우와 동일한 시각에 측정된다.
상기 방법에 더하여, 상기 약물 함유 마이크로스피어는 소장, 대장 및 다른 적절한 지역의 GI관에서 그 흡수를 증진시키기 위해서 변형될 수 있다. 그러한 변형은 마이크로 캡슐 주위로 지질양막을 침전시켜 소화된 음식으로부터 친지방성 입자가 되거나, 페리틴과 같은 입자를 상기 입자로 결합시키거나, 미세입자의 바깥쪽에 하전된 층을 형성하는 것일 수 있다.
실시예 18
역상 HPLC에 의한 평가
마이크로스피어를 우선 0.154ml의 3M 트리에탄올아민 용액(TEOA; pH 8)을 약 2ml의 100mg/ml hGH 용액(중탄산 암모늄)에 첨가하고 잘 혼합하여 제조하였다. 다음으로 약 800mg의 고체 PEG 2k를 첨가하여 압설자로 혼합하여 매우 적은 양의 hGH를 용액 속에서 침전시켰다. 다음으로 시료들을 4000rpm으로 30분 동안 원심분리시켜, 약 1.8g의 상층액이 제거하였다. 약 1g의 마크로머(4.4k PEG 트리(락테이트)3트리아크릴레이트)를 각 원심튜브로 투입하고 교반하였다. 다음으로 약 0.1 내지 0.15ml의 TEOA를 첨가한 다음 0.05ml의 40mM 에오신 Y가 첨가하였다. 시료들을 4000rpm에서 3분동안 원심분리하였다. 시료들을 실시예 4에서 설명된 대로 빛을 조사하여 디스크 형태로 형성하여 중합하거나, oil(PPG 2k)를 혼합하여 마이크로에멀젼을 만든 다음, 실시예 4에서 설명된 대로 광을 조사하는 것에 의해 중합하였다.
제조된 마이크로스피어는 역상 HPLC(RP-HPLC)에 의해 분석되었다. 시료들은 RP-HPLC를 위해 먼저 마이크로스피어로부터 NaOH를 사용하여 hGH를 추출하여 준비하였다. 즉 10mg의 마이크로스피어를 1ml의 NaOH(1N)/트리(50mM, pH 7.5)(1:9, v/v) 용액으로 첨가하여, 상온에서 5분동안 배양하였다. 5N HCl은 용액을 최종 pH 7.5로 맞추는데 사용하였다. 시료는 다음으로 2분동안 미세원심분리하여 0.45마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 100μL의 hGH 용액을 평준화시켜, 용매로서 n-프로판올/Tris(50mM, pH7.5)(29:71, v/v)를 0.5mL/min속도로 적용하여 등용매 상태에서작동되는 Vydac C-4 칼럼(214TP54)으로 주입하였다. 분리는 칼럼온도 45℃에서 50분동안 220nm의 UV검출로 수행하였다. hGH를 22±3분의 유지시간으로 용리하였다. 결과는 표 1에 나타난 바와 같다. 용어 "% RP"는 모노머 피크에서는 발견되지 않는 단백질(hGH)의 퍼센트를 말하며, 상기 단백질은 상업적으로 시판되는 hGH 제형에서 통상 발견되는 활성이 있고 안전한 형태의(예컨대, 산화된 또는 탈아미노화된 형태의) hGH를 포함할 수 있다.
시료번호 %RP
18-86-1 41
318-1 48
318-2 43
다른 마이크로스피어 배치는 먼저 0.154ml의 3M Tris 완충액(pH6)을 약 2ml의 100mg/ml hGH 용액(암모늄 중탄산염)에 첨가하고 잘 혼합하여 제조하였다. 이 용액에 침전된 단백질을 얻기 위해서 약 800mg의 PEG 10k를 고체상태로 첨가하였다. 다음으로 시료들을 4000rpm에서 30분동안 원심분리하여, 약 1.8g의 상층액을 제거하였다. 약 1g의 마크로머(4.4k PEG 트리(락테이트)3트리아크릴레이트)를 각 원심 튜브로 투입하고 교반하였다. 다음으로, 약 0.1 내지 0.15ml의 TEOA를 첨가한 다음, 0.05ml의 40mM 에오신 Y를 침가하였다. 그후 시료들은 3분동안 4000rpm에서 원심분리되었다. 실시예 4에서 설명된 대로 시료에 광을 조사하여 디스크가 형성되도록 중합하거나, 먼저 오일(PPG 2k)를 혼합하여 마이크로에멀젼을 만든 다음 실시예 4에서 설명된 대로 광을 조사하여 중합하였다. 시료번호 27-50인 시료는 PEG20k를 사용하여 제조하였다.
제조된 마이크로세페어는 역상 HPLC를 사용해서 분석되었다. 시료들은 RP-HPLC로 적용하기 위해 상기에서 설명된 NaOH 추출법이나 또는 하기 저온분쇄법에 의해서 준비하였다. 결과는 하기 지정된 시료 준비방법과 함께 표 2에 나타나 있다. 약 10mg의 마이크로스피어 시료를 마이크로원심 튜브 내로 투입하였다. 막자를 상기 튜브내로 투입한 후 상기 튜브를 액체 질소조에 약 1분 동안 담구었다. 액체질소조 내에서 튜브를 고정시킨 채, 시료를 약 5분간 분쇄하였다. 다음으로 튜브를 빼내어 상온에서 약 2분간 방치하였다. 분쇄된 시료를 약 1mL의 25mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.5) 내에 현탁시켰다. 상기 막자가 제거되고, 상기 시료를 상온에서 약 10분간 배양하였다. 다음으로 맑은 수성 상(aqueous phase)을 얻기 위해서 상기 시료를 약 5분동안 15000rpm에서 원심분리하였다. 상층액이 0.45 마이크론 필터를 통해서 필터링되었다. RP-HPLC는 100μL의 시료를 1mL/분 속도로 등용매조건하에서 n-프로판올/포타슘 포스페이트(25mM, pH 6.5)(27:73, v/v)를 용매로 사용하여 표준화되고 조작되는 Vydac C-18 칼럼(218TP54)으로 주입하여 수행하였다. 분리는 55℃ 칼럼온도에서 30분간 220nm UV 검출에 의해 수행되었다.
시료 번호 %RP
27-32 26(NaOH)
27-50(Tris, PEG 20k) 19(NaOH)
320-4 20(NaOH)
502 15.2(NaOH)
507 17(NaOH)
508 15(NaOH)
530 16(NaOH)
548 10.4(저온분쇄)
556 7.7(저온분쇄)
557 8.7(저온분쇄)
561 8.5(저온분쇄)
570 6.2(저온분쇄)
575 7.2(저온분쇄)
비교를 위해 NaOH 추출법을 이용한 53% 및 저온분쇄법을 이용한 23% 수율 %RP치는 마이크로스피어가 단백질(표 3에서 "대조군")을 선택적으로 제외하는 분자를 포함하지 않도록 하였다. 2개의 시료 제조방법의 비교가 표 3에 나타난다.
시료번호 %RP NaOH법 %RP 저온분쇄법
대조군 53 23
361 30.2 15
362 28 15
기타 실시예
상기 설명으로부터 본 발명에 다양한 변형을 가하여 다양한 용도와 상태로 적용하는 것이 가능하다. 그러한 실시예 또한 하기 첨부되는 본 발명의 첨구범위 내에 포함된다.
본원 명세서 상에서 언급된 모든 특허공개 및 특허공고는 각각의 특허공개 또는 특허공고가 구체적이고 개별적으로 참고자료로 포함되는 것으로 언급된 것과 동일한 정도로 본원에 참고자료로 포함된다.

Claims (75)

  1. 마크로머(macromer), 생물학적 활성을 가진 물질(biologically active substance), 및 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물을 포함하는 생체적합성 치료용 제품(biocompatible therapeutic article)으로서, 상기 생물학적 활성을 가진 물질이 상기 제품 내에서 불용성인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제품이 다음의 특성들 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품:
    상기 생물학적 활성을 가진 물질이 15% 미만으로 응집되어 있거나;
    상기 제품이 건조중량으로 최소한 10%의 마크로머 및 최소한 5%의 생물학적 활성을 가진 물질을 함유하거나;
    방출가능한 생물학적 활성을 가진 물질의 5%가 상기 제품으로부터 방출되는 기간이 t50의 1/16을 초과하거나; 또는
    t50이 t80의 5/8를 초과하거나 또는 그와 동일하다.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제품이 상기 특성들 중 적어도 두 가지를 갖는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 제품이 상기 특성들 중 모두를 갖는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단백질을 선택적으로 추방하는 분자가 마크로머, 폴리(에틸렌 글리콜), 하이알루론산, 및 폴리(비닐피롤리돈)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 단백질을 선택적으로 추방하는 분자가 폴리(에틸렌 글리콜)인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 마크로머가 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품:
    (a) 중심 코어 형성 영역;
    (b) 상기 코어에 부착된 적어도 두 개의 분해성 영역; 및
    (c) 상기 분해성 영역에 부착된 적어도 두 개의 중합가능한 말단기.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 중심 코어가 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(에틸렌 옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 공중합체, 다당류, 탄수화물, 단백질, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 분해성 영역이 폴리(α-히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르쏘에스테르), 폴리(오르쏘카보네이트), 및 폴리(포스포에스테르)로 구성된 군에서 선택되는 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 폴리(α-히드록시산)이 폴리(글리콜산), 폴리(DL-젖산), 및 폴리(L-젖산)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 폴리(락톤)이 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 및 폴리(γ-부티로락톤)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 분해성 영역이 폴리(카프로락톤)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  14. 제 8항에 있어서, 상기 중합가능한 말단기가 상기 마크로머를 중합할 수 있는 탄소-탄소 이중결합을 보유하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  15. 제 8항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품:
    (a) 분자량이 3,000-6,000 달톤이고 팔이 세 개인(three-armed) 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역에 부착된 락테이트기; 및
    (c) 상기 (b) 영역을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  16. 제 8항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품:
    (a) 분자량이 2,000 또는 3,400인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 락테이트기; 및
    (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  17. 제 8항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품:
    (a) 분자량이 3,400 달톤인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 카프로락톤기; 및
    (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  18. 제 2항에 있어서, 상기 제품이 건조중량으로 적어도 5%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 제품이 건조중량으로 적어도 10%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 제품이 건조중량으로 적어도 30%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 제품이 생분해성인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  22. 다음의 단계들을 포함하는 생체적합성 치료용 제품의 제조방법:
    (a) 생물학적 활성을 가진 물질을 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 또는 그러한 분자들의 혼합물과 배합하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 혼합물을 마크로머와 배합하는 단계로서, 상기 생물학적 활성을 가진 물질이 불용성이고, 단백질을 선택적으로 추방하는 분자 및 마크로머와 배합시 불용성으로 유지되는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 형성된 배합(combination)의 혼합물을 제조하여 생체적합성 치료용 제품을 생산하는 단계.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 방법이 상기 (c) 단계에서 제조된 혼합물을 중합하는 (d) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계가 단일 배합단계로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 생체적합성 치료용 제품이 다음의 특성들 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    상기 생물학적 활성을 가진 물질이 15% 미만으로 응집되어 있거나;
    상기 제품이 건조중량으로 최소한 10%의 마크로머 및 최소한 5%의 생물학적 활성을 가진 물질을 함유하거나;
    방출가능한 생물학적 활성을 가진 물질의 5%가 상기 제품으로부터 방출되는 기간이 t50의 1/16을 초과하거나; 또는
    t50이 t80의 5/8를 초과하거나 또는 그와 동일하다.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 생체적합성 치료용 제품이 상기 특성들 중 적어도 두 가지를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 상기 생체적합성 치료용 제품이 상기 특성들 중 모두를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 22항에 있어서, 상기 단백질을 선택적으로 추방하는 분자가 마크로머, 폴리(에틸렌 글리콜), 하이알루론산, 및 폴리(비닐피롤리돈)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 22항에 있어서, 상기 단백질을 선택적으로 추방하는 분자가 폴리(에틸렌 글리콜)인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 22항에 있어서, 상기 마크로머가 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 22항에 있어서, 상기 생체적합성 치료용 제품이 건조중량으로 적어도 5%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 생체적합성 치료용 제품이 건조중량으로 적어도 10%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 제품이 건조중량으로 적어도 30%의 활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  34. 제 1항의 생체적합성 치료용 제품을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물 치료방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 포유동물이 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 중심 코어를 형성하는 수용성 영역;
    (b) 상기 코어에 부착된 적어도 두 개의 분해성 영역; 및
    (c) 상기 분해성 영역에 부착된 적어도 두 개의 중합가능한 말단기.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 수용성 영역이 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(에틸렌 옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 공중합체, 다당류, 탄수화물, 단백질, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 분해성 영역이 폴리(α-히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르쏘에스테르), 폴리(오르쏘카보네이트), 및 폴리(포스포에스테르)로 구성된 군에서 선택되는 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 폴리(α-히드록시산)이 폴리(글리콜산), 폴리(DL-젖산), 및 폴리(L-젖산)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 폴리(락톤)이 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 및 폴리(γ-부티로락톤)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 37항에 있어서, 상기 분해성 영역이 폴리(카프로락톤)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 37항에 있어서, 상기 중합가능한 말단기가 상기 마크로머를 중합할 수 있는 탄소-탄소 이중결합을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 37항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 분자량이 3,000-6,000 달톤이고 팔이 세 개인(three-armed) 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 락테이트기; 및
    (c) 상기 (b) 영역을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  45. 제 37항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 분자량이 2,000 또는 3,400인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 락테이트기; 및
    (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  46. 제 37항에 있어서, 상기 마크로머가 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 분자량이 3,400 달톤인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 영역;
    (b) 상기 (a) 영역의 양쪽 측면 상의 카프로락톤기; 및
    (c) 상기 (b) 영역의 양쪽 측면을 캡핑(capping)하는 아크릴레이트기.
  47. 제 34항에 있어서, 상기 치료용 제품이 동물의 폐에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 34항에 있어서, 상기 치료용 제품이 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 및 경비로 구성된 군에서 선택되는 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 활성을 가진 물질이 단백질인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 단백질이 호르몬, 항체, 분화인자, 맥관형성인자, 효소, 싸이토카인, 케모카인, 인터페론, 콜로니-자극 인자, 및 성장인자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 단백질이 인간성장호르몬인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  52. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 생물학적 활성을 가진 물질이 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 단백질이 호르몬, 항체, 분화인자, 맥관형성인자, 효소, 싸이토카인, 케모카인, 인터페론, 콜로니-자극 인자, 및 성장인자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 단백질이 인간성장호르몬인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 치료용 제품이 t50보다 11/4배 이상인 기간에 상기 생물학적 활성을 가진 물질의 적어도 80%를 방출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 입자의 적어도 80%가 약 80 마이크론 미만의 입자크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 수용성 영역이 1,000-10,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 분해성 영역이 적어도 두 가지 상이한 중합체들의 블렌드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 마크로머가 분해성인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 치료용 제품이 t50보다 최소한 2배 이상인 기간 동안에 상기 생물학적 활성을 가진 물질을 방출할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 22항 또는 제 34항에 있어서, 상기 치료용 제품이 t50보다 최소한 11/4배 이상인 기간 동안에 상기 생물학적 활성을 가진 물질의 치료용량(therapeutic dose)을 전달할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 22항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이, pH가 단백질이 음하전되는 pH인 경우, 양하전 이온-운송 시약(positively charged ion-carrying reagent)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 양하전 이온-운송 시약이 트리에탄올아민인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 상기 양하전 이온-운송 시약이 Tris인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 22항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이, pH가 단백질이 양하전되는 pH인 경우, 음하전 이온-운송 시약(negatively charged ion-carrying reagent)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 상기 음하전 이온-운송 시약이 소디움도데실설페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 22항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 상기 계면활성제가 Tween 20, Tween 80, 및 폴록사머(poloxamer) F68로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 1항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이, pH가 단백질이 음하전되는 pH인경우, 양하전 이온-운송 시약(positively charged ion-carrying reagent)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  70. 제 69항에 있어서, 상기 양하전 이온-운송 시약이 트리에탄올아민인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  71. 제 69항에 있어서, 상기 양하전 이온-운송 시약이 Tris인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  72. 제 1항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이, pH가 단백질이 양하전되는 pH인 경우, 음하전 이온-운송 시약(negatively charged ion-carrying reagent)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 음하전 이온-운송 시약이 소디움도데실설페이트인 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  74. 제 1항에 있어서, 상기 분자들의 혼합물이 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
  75. 제 74항에 있어서, 상기 계면활성제가 Tween 20, Tween 80, 및폴록사머(poloxamer) F68로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 치료용 제품.
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