KR20120031083A - 교반기 시스템 - Google Patents

교반기 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20120031083A
KR20120031083A KR1020127001828A KR20127001828A KR20120031083A KR 20120031083 A KR20120031083 A KR 20120031083A KR 1020127001828 A KR1020127001828 A KR 1020127001828A KR 20127001828 A KR20127001828 A KR 20127001828A KR 20120031083 A KR20120031083 A KR 20120031083A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stirrer
culture vessel
conveying
medium
stirrer system
Prior art date
Application number
KR1020127001828A
Other languages
English (en)
Inventor
알렉산더 알리쉬
마르코 옌치
미하엘 폴샤이트
외르크 틸레
클라우스 발레리우스
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41478681&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20120031083(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20120031083A publication Critical patent/KR20120031083A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/05—Stirrers
    • B01F27/11—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers
    • B01F27/111—Centrifugal stirrers, i.e. stirrers with radial outlets; Stirrers of the turbine type, e.g. with means to guide the flow
    • B01F27/1111—Centrifugal stirrers, i.e. stirrers with radial outlets; Stirrers of the turbine type, e.g. with means to guide the flow with a flat disc or with a disc-like element equipped with blades, e.g. Rushton turbine
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/05—Stirrers
    • B01F27/11—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers
    • B01F27/19—Stirrers with two or more mixing elements mounted in sequence on the same axis
    • B01F27/192—Stirrers with two or more mixing elements mounted in sequence on the same axis with dissimilar elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/80—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis
    • B01F27/81—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis the stirrers having central axial inflow and substantially radial outflow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/02—Apparatus for enzymology or microbiology with agitation means; with heat exchange means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/04—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means
    • C12M1/06—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means with agitator, e.g. impeller
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C12M27/08—Stirrer or mobile mixing elements with different stirrer shapes in one shaft or axis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F2101/00—Mixing characterised by the nature of the mixed materials or by the application field
    • B01F2101/44—Mixing of ingredients for microbiology, enzymology, in vitro culture or genetic manipulation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/05—Stirrers
    • B01F27/11—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers
    • B01F27/111—Centrifugal stirrers, i.e. stirrers with radial outlets; Stirrers of the turbine type, e.g. with means to guide the flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/05—Stirrers
    • B01F27/11—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers
    • B01F27/113—Propeller-shaped stirrers for producing an axial flow, e.g. shaped like a ship or aircraft propeller
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/05—Stirrers
    • B01F27/11—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers
    • B01F27/115—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers comprising discs or disc-like elements essentially perpendicular to the stirrer shaft axis
    • B01F27/1152—Stirrers characterised by the configuration of the stirrers comprising discs or disc-like elements essentially perpendicular to the stirrer shaft axis with separate elements other than discs fixed on the discs, e.g. vanes fixed on the discs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 방사상의 운반 교반기 요소 및 적어도 하나의 축선방향의 운반 교반기 요소의 조합으로 이루어지는 동물 세포 배양을 위한 교반기 시스템에 관한 것이며, 적어도 3 개의 교반기 요소가 존재해야만 하며 최상부 교반기 요소는 축선방향의 운반 교반기 요소이다. 교반기 요소는 교반기 섀프트 상에 서로 위아래로 일정한 거리에 구성된다. 특별한 실시형태는 방사상의 운반 교반기 요소로서 2 개의 디스크 교반기 그리고 축선방향의 운반 교반기 요소로서 경사진 블레이드 교반기로 이루어지는 다중 교반기 시스템이며 경사진 블레이드 교반기는 교반기 섀프트 상의 디스크 교반기 위에 구성된다. 본 발명에 따른 교반기 시스템은 다른 것들 가운데 세포 배양에서 전단 민감성 포유류 세포의 배양에서의 더 부드럽고 더 양호한 상호 혼합을 달성한다.

Description

교반기 시스템{STIRRER SYSTEM}
적어도 하나의 방사상의 운반 요소 및 적어도 하나의 축선방향의 운반 요소의 조합으로 이루어지는 동물 세포 배양을 위한 교반기 시스템이 여기서 보고되며, 적어도 3 개의 운반 요소가 존재해야만 하며 최상부 요소는 축선방향의 운반 요소이다. 운반 요소는 섀프트 상에 서로 위아래로 일정한 간격을 가지고 구성된다. 특별한 실시형태에서 교반기 시스템은 방사상의 운반 요소로서 2 개의 디스크 교반기 그리고 축선방향 운반 요소로서 하나의 경사진 블레이드 교반기로 이루어지고 경사진 블레이드 교반기는 섀프트 상에 디스크 교반기 위에 구성된다. 본 발명에 따른 교반기는 다른 것들 중에서 원핵 세포 (prokaryotic cell) 및 진핵 세포 (eukaryotic cell) 의 배양을 위한 배지의 더 부드럽고 더 양호한 혼합을 달성한다.
원핵 세포 및 진핵 세포에 의한 재조합형 단백질, 백신 및 항체의 생산은 현대 제약 생산에서 필수적인 역할을 한다. 복잡한 전사 후 변형된 단백질 및 항체를 생산하기 위해 동물 유래 세포가 주로 사용된다. 하지만, 동물 유래 세포의 사용은 예컨대 배지, 한계 및 억제 (예컨대 젖산, CO2, 암모늄 등에 의한) 에 대한 민감도, 민감한 외막 (outer membrane) (전단 응력), 배양 조건의 변동 (예컨대, 국부적 불균질성, pH 변동, pO2 변동 등으로 인한) 에 대한 민감도 및 낮은 비속도 (specific rate) 와 같은 이러한 세포의 특정한 특징 때문에 발효 공정에 대한 높은 요구를 설정한다. 이러한 성질은 생물 반응기를 설계할 때 및 공정 제어를 위해 고려되어야만 한다.
최근에 세포 배양을 위한 다양한 타입의 반응기가 개발되어 왔다. 타입에 상관 없이, 반응기는 이하의 기본 기술적 기능 : 적절한 서스펜션 뿐만 아니라 균질화, 적절한 재료 및 열 전달 뿐만 아니라 세포 상의 최소의 전단 응력을 충족할 수 있어야만 한다. 교반된 탱크 반응기는 산업적 사용을 위해 특별히 적합하다. 이러한 반응기에서 기본 기능을 충족하기 위해 필요한 에너지는 기계적 교반에 의해 도입된다.
포유류 세포가 미생물보다 전단력에 더욱 더 민감한 것이 문헌으로부터 공지된다. 이는 보통 세포벽의 결핍에 의한 것으로 본다 (예컨대 Glacken, M.W., 외, Trends Biotechnol. 1 (1983) 102-108; van der Pol, L.A. 및 Tramper, J. Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) 401-407; Nienow, A.W., Cytotechnol. 50 (2006) 9-33; Cervantes, M.I., 외, Chem. Eng. Sci. 61 (2006) 8075-8084; Frahm, B., 외, Chem. Ing. Tech. 79 (2007) 1052-1058 참조). 전단 민감도는 서스펜션 배양 생물 반응기의 기술적 취급에서의 상당한 어려움에 대한 이유이다. 교반된 탱크 반응기는 이들이 요구되는 공정 조건에 대하여 더 가변적으로 제어되고 사용될 수 있기 때문에 세포를 공급하기 위해 생명 공학 생산 공정에 보통 사용된다. 교반된 재료의 유동학 및 시스템의 기하학적 형상 외에, 상기 언급된 기본 기능은 사용되는 교반기 시스템에 의해 주로 충족된다.
배양되는 세포 상의 전단 응력에 대한 주된 이유는 다른 것들 중에서 교반기 시스템에 의해 발생되는 전단력이다. 전단력은 특별히 교반기 블레이드의 구역에 뿐만 아니라 배플의 구역에 강한 효과를 갖는다. Kolmogorov 의 이론에 따르면 교반기에 의해 발생되는 매크로 와류는 에너지 소실에 의해 분해되어 작은 마이크로 와류를 형성한다. 이들의 크기가 발효되는 세포의 크기와 동일하게 될 때, 세포는 손상될 수 있다 ("Advances in animal cell biology and technology for bioprocesses" 에서 Cherry, R.S. 및 Papoutsakis, E.T., Biotechnol. Bioeng. 32 (1988) 1001-1014; Papoutsakis, E.T. 및 Kunas, K.T., Spier, R.E., 외 (Eds) Butterworth, Sevenoaks, Kent, UK (1989) 203-211; Kunas, K.T. 및 Papoutsakis, E.T., Biotech. Bioeng. 36 (1990) 476-483; Zhang, Z.B. 및 Thomas, C.R., Gen. Eng. Biotechnol. 13 (1993) 19-29; Nienow, A.W., Cytotechnol. 50 (2006) 9-33).
동물 서스펜션 세포 배양의 교반기 사용을 위해 중요한 기준으로서 낮은 전단 흐름의 발생을 강조하는 권고가 이루어져 왔다 (예컨대 Feder, J. 및 Tolbert, W.R., Sci. Am. 248 (1983) 24-31; 교반기 제작자 예컨대 Ekato, Chemineer, Bioengineering, Zeta 참조). 그러므로 다수의 낮은 전단력 교반기가 손상을 줄이기 위해 개발되어 왔다 (예컨대 "Elephant Ear Impeller", 또는 "Max Flow Impeller" 참조).
온라인 기사 ("Axial flow down-pumping agitators in biological processes", 2009, 4 월, http://www.postmixing.com/mixing%20forum/Micro/Liq-Solid-Gas/down-pumpers.htm) 에서 상이한 교반기로 이루어지는 교반기 조합이 개선된 물질 전달 (mass transfer) 을 초래하는 것이 나타나 있다. 동물 세포에 대하여, 3 개의 축선방향 운반기가 세포 배양에서 최고의 결과를 달성하기 위해 권장된다. Fujasova, M., 외, (Chem. Eng. Sci. 62 (2007) 1650-1669) 는 다중 스테이지 교반기에 대한 물질 전달의 상관관계를 보고한다. 생물 반응기의 3 개의 스테이지 교반기 시스템을 사용하는 액체 상과 가스 상 사이의 물질 전달이 Puthli 외 (Puthli, M.S., 외, Biochem. Eng. J. 23 (2005) 25-30) 에 의해 보고되었다.
바람직하게는 2 개 또는 3 개의 Rushton 교반기가 부착되는 수직 회전 섀프트를 갖는 세균 세포를 배양하기 위한 발효조의 사용이 US 5,633,165 에 보고되었다. Nienow, A.W., (Cytotechnol. 50 (2006) 9-33) 은 1 ~ 1.3 의 H/D 비를 갖는 동물 세포 배양을 위한 반응기 시스템 및 최저의 교반기 아래에 장착되는 기폭기 (aerator) 를 갖는 2 개의 하방 운반 수중익형 교반기 (축선방향 운반기) 의 사용을 권장한다.
US 2004/0234435 에 방향족 카르복실산을 생산하기 위한 방법 및 장치가 보고되었다. 연속적인 중합 반응기가 US 4,438,074 에 보고되었다. US 2004/0087814 에 알킬 벤젠 산화 반응기를 위한 휘저음 (agitation) 시스템이 보고되었다. 혼합 시스템이 US 5,972,661 에 보고되었다. US 6,250,769 에 고정 혼합기 또는 선회기 (swirler) 수단을 갖는 휘저음 장치가 보고되었다. 휘저음 장치는 US 5,198,156 에 보고되었다. US 4,770,990 에 임펠러 (impeller) 장치가 보고되었다.
본 발명은 개선된 교반기 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
적어도 하나의 방사상의 운반 요소 및 적어도 하나의 축선방향의 운반 요소를 포함하는 교반기 시스템이 여기서 보고되며 적어도 3 개의 운반 요소가 존재해야만 하며 최상부 전달 요소는 축선방향의 운반 요소이다. 전단 민감성 동물 세포를 배양하는데 보통 사용되는 교반기와 비교하여, 여기서 보고된 교반기 시스템은 배지의 세포를 높은 전단 응력에 노출시키지 않으면서 (예컨대 액체 표면을 통하여 염기 또는 산과 같은 정확한 시제 (agent) 를 도입하기 위해) 배지의 더 신속한 혼합을 달성할 수 있다.
일 실시형태에서 교반기 시스템은 3 ~ 5 개의 운반 요소로 이루어진다. 다른 실시형태에서 교반기 시스템은 3 개 또는 4 개의 운반 요소로 이루어진다. 다른 실시형태에서 교반기 시스템의 운반 요소는 수직 섀프트 상에 서로 위아래로 일정한 거리에서 구성된다. 또 다른 실시형태에서 운반 요소는 서로 동일한 거리를 가지고 섀프트 상에 구성된다. 또 다른 실시형태에서 운반 요소 사이의 거리는 1 개의 운반 요소 직경과 2 개의 운반 요소 직경 (d) 사이이다. 일 실시형태에서 교반기 시스템의 운반 요소는 수직 섀프트 상에 구성되고 이에 의해 교반기 시스템이 배지로 채워진 배양 용기에서 작동될 때 최상부 요소는 바닥부 운반 요소로부터 규정된 거리에 있고 배지의 액체 표면으로부터 충분한 거리에 있게 되며 이에 의해 교반기 시스템은 배지의 혼합을 보장하게 된다. 일 실시형태에서 배지의 표면으로부터의 거리는 최상부 교반기 요소와 정상으로부터 2 번째인 교반기 요소 사이의 거리와 동일하다. 일 실시형태에서 모든 운반 요소는 동일한 직경 (d) 을 갖는다.
일 실시형태에서 교반기 시스템은 2 개의 방사상의 운반 요소 그리고 하나의 축선방향의 운반 요소로 이루어지고, 축선방향의 운반 요소는 방사상의 운반 요소 위에 교반기 섀프트 상에 구성된다.
일 실시형태에서 방사상의 운반 요소는 2 ~ 8 개의 교반기 블레이드를 갖고 축선방향의 운반 요소는 2 ~ 10 개의 교반기 블레이드를 갖는다. 다른 실시형태에서 방사상의 운반 요소는 3 ~ 6 개의 교반기 블레이드를 갖고, 다른 실시형태에서 6 개의 교반기 블레이드를 갖는다. 일 실시형태에서 축선방향의 운반 요소는 2 ~ 6 개의 교반기 블레이드를 갖고, 다른 실시형태에서 4 개의 교반기 블레이드를 갖는다. 다른 실시형태에서 모든 방사상의 운반 요소 및 모든 축선방향의 운반 요소는 동일한 개수의 교반기 블레이드를 갖는다. 일 실시형태에서 모든 운반 요소는 4 개 또는 6 개의 교반기 블레이드를 갖는다. 일 실시형태에서 방사상의 운반 요소는 대칭적인 방사상의 운반 요소이다. "대칭적인 방사상의 운반 요소" 는 요소의 길이방향 축선을 따라 대칭적 단면을 갖는 요소이고, 즉 회전 축선을 따르고 이를 포함하는 단면은 점대칭적이고 거울 대칭적 (mirror-symmetric) 이다.
일 실시형태에서 교반기 시스템이 배양 용기에 놓일 때 배양 용기의 직경 (D) 에 대한 운반 요소의 직경 (d) 의 비는 0.2 ~ 0.8 이고, 다른 실시형태에서 0.3 ~ 0.6 이며, 다른 실시형태에서 0.31 ~ 0.39, 또는 실시형태에서 또한 약 0.34 이다. 방사상의 운반 요소의 교반기 블레이드의 폭 (b) 에 대한 축선방향의 운반 요소의 교반기 블레이드의 높이 (hB) 의 비는 0.2 ~ 2.0 이고, 다른 실시형태에서 0.3 ~ 1.4, 또는 다른 실시형태에서 0.4 ~ 1.0 이다. 다른 실시형태에서 섀프트 축선에 대한 축선방향의 운반 요소의 교반기 블레이드의 피치는 10°~ 80°, 다른 실시형태에서 24°~ 60°, 또는 다른 실시형태에서 40°~ 50°이다. 일 실시형태에서 모든 운반 요소는 0.32 ~ 0.35 의 배양 용기의 직경 (D) 에 대한 운반 요소의 직경 (d) 의 비를 갖는다.
일 실시형태에서 교반기 시스템은 5 * 104 ~ 5 * 105 의 레이놀즈 수 (Reynolds number) 에서 5.5 ~ 8.0 의 뉴턴 수 (Newton number) 를 갖는다. 다른 실시형태에서 교반기 시스템은 약 0.05 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 20 초의 혼합 시간 (θ0.95) 그리고 약 0.3 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 10 초의 혼합 시간을 갖는다.
여기서 보고된 다른 양태는 여기서 보고된 교반기 시스템 및 배양 용기를 포함하는 장치이다. 일 실시형태에서 이 장치는 투석 모듈을 또한 포함한다. 다른 실시형태에서 이 장치는 동물 세포의 배양을 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서 이 장치는
a) 배지 및 여기서 배양되는 동물 세포를 수용하기에 적절한 배양 용기,
b) 배양 용기의 수직 축선을 따른 섀프트,
c) 섀프트에 부착되는 여기서 보고된 교반기 시스템,
d) 배양 용기의 바닥부의 가스 입구, 및
e) 용액을 추가, 교정 및/또는 공급하기 위한 액체 표면 위의 배양 용기의 상부 부분의 적어도 하나의 입구를 포함한다.
또한 여기서 보고된 양태는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이며 이하의 단계를 포함한다 :
a) 여기서 보고된 교반기 시스템 또는 여기서 보고된 장치를 포함하는 배양 용기에서 폴리펩타이드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배지로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계, 그리고
c) 폴리펩타이드를 정제하고 이에 의해 폴리펩타이드를 생산하는 단계.
일 실시형태에서 정제는 다중 스테이지의 크로마토그래픽 (chromatographic) 공정이다. 다른 실시형태에서 정제는 친화성 (affinity) 크로마토그래피, 양이온 치환 크로마토그래피 및 음이온 치환 크로마토그래피를 포함한다.
여기서 보고된 다른 양태는 동물 세포를 배양하기 위한 방법으로서, 동물 세포는 여기서 보고된 교반기 시스템을 포함하는 배양 용기에서 배양된다.
일 실시형태에서 배양은 반 연속적 (semi continuous) 배양이다. 다른 실시형태에서 반 연속적 배양은 투석이다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 유도체이다.
여기서 보고된 다른 양태는 배지를 혼합하기 위한 여기서 보고된 교반기 시스템의 사용이다. 이전의 양태의 일 실시형태에서 배지는 원핵 세포 및 진핵 세포의 배양에 적합한 수성 매체이다. 다른 실시형태에서 배지는 뉴턴 액체 (Newtonian liquid) 이다. 일 실시형태에서 교반기 시스템은 0.01 W/㎏ ~ 1 W/㎏ 의 출력 입력에서 작동된다. 다른 실시형태에서 교반기 시스템은 0.04 W/㎏ ~ 0.5 W/㎏ 의 출력 입력에서 작동된다. 또 다른 실시형태에서 배지의 교반기 시스템에 의해 유도되는 흐름은 난류이다. 다른 실시형태에서 배지는 3 mPas * 초 이하의 점도를 갖는다. 다른 실시형태에서 점도는 2mPas * 초 이하이다.
여기서 보고된 다른 양태는 항체 또는 폴리펩타이드의 생산을 위해 혼성 세포 (hibridoma cell) 또는 동물 세포를 배양하기 위한 교반기 시스템의 사용이다. 일 실시형태에서 배양은 침지된 가스 공급식 (gassed) 교반 탱크 반응기에서 실행된다. 다른 실시형태에서 동물 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, COS 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, HEK 293 세포 또는 혼성 세포이다. 또 다른 실시형태에서 항체는 CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Lewis Y 항원, IL-6 수용기, 또는 IGF-1 수용기에 대한 항체이다.
도 1a 는 반응기 내의 여기서 보고된 교반기 시스템을 나타내는 도면이며 D = 컨테이너의 내부 직경, d = 교반기 시스테의 외부 직경, dsp = 가스 분배기 (출구 개구) 의 직경, H = 컨테이너 충전 레벨, HB = 컨테이너 높이, hsp = 가스 분배기의 설치 높이, h1m = 하부 교반기 요소의 설치 높이, h2m = 교반기 요소 (1) 와 교반기 요소 (2) 사이의 거리, h3m = 교반기 요소 (2) 와 교반기 요소 (3) 사이의 거리, bd = 컨테이너 벽으로부터 배플의 거리, w = 배플의 블레이드의 폭이며; 도 1b 는 표준 디스크 교반기를 나타내는 도면이며 : d = 교반기 외부 직경, b = 교반기 블레이드 폭, h = 교반기 블레이드 높이이며; 도 1c 는 경사진 블레이드 교반기를 나타내는 도면이며 :
Figure pct00001
= 교반기 블레이드의 피치, l = 교반기 블레이드의 길이, h = hSB = (돌출된 교반기 블레이드 높이) 이다.
도 2 는 레이놀즈 수의 함수로서 다양한 교반기 시스템의 출력 계수 (Ne) 를 나타내는 도면이며; SSR = 표준 디스크 교반기; SBR = 경사진 블레이드 교반기이다.
도 3 은 다양한 교반기 시스템에 대한 출력 입력의 함수로서 95 % 의 상호 혼합의 정도에 대한 혼합 시간을 나타내는 도면이다.
도 4 는 레이놀즈 수의 함수로서 다양한 교반기 시스템에 대한 혼합 계수 (CH) 의 비교를 나타내는 도면이며; SSR = 표준 디스크 교반기, SBR = 경사진 블레이드 교반기이다.
도 5 는 교반기 시스템 그리고 용적-비출력 (volume - specific power) 입력의 기준 조각 직경 (dVF) 의 종속성을 나타내는 도면이며; SSR = 표준 디스크 교반기, SBR = 경사진 블레이드 교반기이다.
도 6a 및 도 6b 는 항-IGF-1R 항체-생산 세포 라인을 배양하는데 사용되는 교반기 시스템과 발효 시간의 함수로서 살아있는 세포 밀도 (a) 및 생존도 (b) 의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 7 은 항-IGF-1R 항체-생산 세포 라인을 배양하는데 사용되는 교반기 시스템과 발효 시간의 함수로서 생산물 농도의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 8a 및 도 8b 는 항-CD20 항체-생산 세포 라인을 배양하기 위해 여기서 보고된 교반기 시스템을 사용하는 발효 시간의 함수로서 살아있는 세포 밀도 (a) 및 생존도 (b) 의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 9 는 항-CD20 항체-생산 세포 라인을 배양하는데 사용되는 교반기 시스템과 발효 시간의 함수로서 생산물 농도의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 10a 및 도 10b 는 항-HER2 항체-생산 세포 라인을 배양하기 위해 여기서 보고된 교반기 시스템을 사용하는 발효 시간의 함수로서 살아있는 세포 밀도 (a) 및 생존도 (b) 의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 11 은 항-HER2 항체-생산 세포 라인을 배양하는데 사용되는 교반기 시스템과 발효 시간의 함수로서 생산물 농도의 표준화된 시간 코스를 나타내는 도면이다.
도 12 는 비출력 입력의 함수로서 투석시 물질 전달계수를 나타내는 도면이다.
도 13 은 투석 배양을 위한 장치의 개략도이다.
도 14 는 투석 모듈의 중공 섬유의 농도 구배의 개략도이다.
적어도 하나의 방사상의 운반 요소 그리고 적어도 하나의 축선방향의 운반 요소로 이루어지는 교반기 시스템이 여기서 보고되고, 적어도 3 개의 운반 요소가 존재해야만 하고 이에 의해 최상부 요소는 축선방향의 운반 요소이다. 전단 민감성 동물 세포를 배양하는데 현재 사용되는 교반기 시스템과 비교하여, 여기서 보고된 교반기 시스템은 배지의 더 부드럽고 더 신속한 혼합을 가능하게 한다. 여기서 보고된 교반기 시스템의 실시예가 도 1a ~ 도 1f 에 나타나 있다. 따라서, 여기서 보고된 교반기 시스템은 배플, 고정 혼합기, 선회기, 흡출관 (draft tube) 또는 배양 용기 내측의 흐름을 배향하기 위한 다른 수단과 같은 복잡한 추가적 구성 요소의 필요 없이 배양된 세포에 주어지는 더 적은 응력 그리고 또한 더 짧은 혼합 시간을 제공한다.
상호 교환적으로 사용될 수 있는, "요소" 또는 "운반 요소" 라는 용어는 거리 및 각도에 대하여 서로에 대해 고정된 공간적 구성의 교반기 블레이드의 (기능적) 유닛을 나타낸다. 방사상의 운반 요소는 교반기 블레이드가 섀프트 축선에 대해 피치를 갖지 않는 요소를 나타낸다. 축선방향의 운반 요소는 교반기 블레이드가 섀프트 축선에 대하여 피치를 갖는 요소를 나타낸다. 운반 요소의 교반기 블레이드는 일 실시형태에서 사각형 판이지만 다른 기하학적 형태가 사용될 수 있다. 요소의 운반 방향은 요소의 회전 축선에 대해 나타낸다. 운반 요소의 교반기 블레이드는 섀프트 자체로부터 뻗어있지 않을 수 있지만 섀프트 상의 동등한 수단 또는 아암에 장착될 수 있다. 각각의 운반 요소는 규정된 개수의 교반기 블레이드로 이루어진다. 각각의 블레이드는 회전 섀프트에 직접적으로 연결되거나 또는 허브를 통하여 회전 섀프트에 연결된다. 운반 요소와는 독립적인 각각의 교반기 블레이드는 외부 에지 및 내부 에지를 갖는다. 섀프트로의 최대 거리를 갖는 각각의 교반기 블레이드의 부분은 블레이드의 첨단부로 나타낸다. 각각의 운반 요소는 외부 직경과 내부 직경을 갖는다. 예컨대, 축선 방향의 운반 요소의 외부 직경은 대향하는 교반기 블레이드의 첨단부 사이의 최대 거리이고 방사상의 운반 요소의 내부 직경은 대향하는 교반기 블레이드의 내부 에지 사이의 최소 거리이다.
"항체" 라는 용어는 실질적으로 면역글로불린 유전자에 의해 엔코드 된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진다. 확인된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변부 유전자 뿐만 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 항체는, 예컨대 1 가, 2 가, 3 가, 4 가, 5 가, 및 6 가의 형태로서, 뿐만 아니라 단일 특이성, 이중 특이성, 삼중 특이성 또는 4 중 특이성 항체로서 Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단사슬 (scFv) 또는 이중체 (diabodies) 또는 삼중체 (triabodies) 를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다.
"폴리펩타이드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 생산되는, 펩타이드 결합에 의해 결합되는 아미노산으로 이루어지는 폴리머이다. 약 20 아미노산 잔여물 미만의 폴리펩타이드는 "펩타이드" 로 나타낼 수 있지만, 2 이상의 폴리펩타이드로 이루어지거나 또는 100 아미노산 잔여물 초과의 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 분자라면 "프로틴" 이라고 나타낼 수 있다. 폴리펩타이드는, 탄수화물군, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르와 같은 비 아미노산 구성 요소를 또한 포함할 수 있다. 비 아미노산 구성 요소는 폴리펩타이드가 생산되는 세포에 의해 추가될 수 있고 세포의 타입에 의해 변할 수 있다. 폴리펩타이드는 여기서 이들의 아미노산 뼈대 (backbone) 구조 또는 이를 엔코딩하는 핵산에 관하여 규정된다. 탄수화물군과 같은 추가물은 일반적으로 명시되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
침지된 가스 공급식 배양 용기는 항체 또는 폴리펩타이드의 생산을 위한 동물 세포를 배양하기 위해 일반적으로 사용된다. 하나의 스테이지 또는 다중 스테이지 전적으로 축선방향의 운반 또는 전적으로 방사상의 운반 교반기 시스템이 여기서 사용된다. 여기서 "축선방향의 운반" 이라는 용어는 운반 요소가 이 요소로부터 멀어져서 배향되는 요소의 회전 축선 또는 섀프트에 나란한 흐름을 발생하는 것을 나타낸다. 비슷하게 "방사상의 운반" 이라는 용어는 운반 요소가 교반기 요소로부터 멀어져서 배향되고 요소의 회전 축선 또는 섀프트에 수직인 흐름을 발생하는 것을 나타낸다. 이러한 관찰은 반응기가 제한된 공간 치수를 갖고, 따라서 흐름이 반응기 벽에서 편향되는 것과 상관이 없고, 다른 한편 교반기 요소로 유도하는 흐름이 상이할 수 있다는 것과 상관이 없다. 섀프트 및 또한 섀프트 축선은 운반 요소 또는 교반기 시스템이 사용되는 배양 용기의 길이방향 축선을 통과하여 뻗어있다. 요소의 회전 속도 (n) 는 특정 속도로서 사용되고 요소 직경 (d) 은 특정 길이로서 사용된다.
여기서 보고된 개선된 교반기 시스템이 포유류 세포의 배양에 사용하기 위한 운반 요소의 조합을 사용하여 제공될 수 있다. 여기서 보고된 교반기 시스템에 의해 비교할만한 생존도, 세포 밀도 및 생산물 역가가 동일한 시간에 배양된 세포에 대한 줄어든 전단 응력으로 달성될 수 있다. 여기서 보고된 교반기 시스템은 배양 용기 내용물의 혼합을 개선할 수 있고 동시에 예컨대 3 개의 축선방향의 운반 요소 (3 개의 경사진 블레이드 교반기와 같은) 로 이루어지는 교반기 시스템과 비교되는 달성 가능한 세포 밀도를 유지할 수 있는 것이 발견되었다. 여기서 보고된 교반기 시스템은 예컨대 액체 표면을 통하여 예컨대 산, 염기, 영양 배지 (nutrient medium), 소포제 또는 또한 CO2 또는 O2 와 같은 교정제를 도입하기 위해 배지의 표면으로부터 또는 표면에서 액체를 혼합하기에, 그리고 동물 세포를 배양할 때 배지의 신속한 전체 혼합에 또한 특히 적합하다.
유체 역학에서 레이놀즈 수 (Re) 는 유체 역학 시스템의 내부 마찰력에 대한 관성력의 비를 나타낸다. 이로부터 또한 이동되는 매체의 난류의 정도에 대한 설명이 이루어질 수 있다. 교반된 액체에 대하여 교반기 레이놀즈 수는 수학식 1 에서 정의된다 :
Figure pct00002
뉴턴 수 (Ne, 또한 출력 수로서 나타냄) 는 유동력 (flow force) 에 대한 저항력의 비를 나타내며 따라서 교반된 재료의 교반기의 흐름 저항에 대한 측정이며 수학식 2 에서 설명된다 :
Figure pct00003
상이한 교반기 시스템에 대한 Ne 수가 도 2 에 나타나 있다.
프로펠러 또는 경사진 블레이드 교반기와 같은, 낮은 뉴턴 수를 갖는 운반 요소는 Rushton 터빈과 같은 높은 뉴턴 수를 갖는 운반 요소보다 출력 입력을 더 효율적으로 유체 역학 출력으로, 즉 유체 운동으로 변환한다.
배양 공정의 교반 공정을 평가하기 위한 기준은 혼합 시간이다. 불균질한 액체-액체 혼합물의 "혼합 시간" 은 배지의 규정된 균질성을 달성하는데 요구되는 시간을 나타낸다. 혼합 시간에 영향을 미치는 요인은 혼합의 정도 및 관찰 구역이다. 혼합의 정도는 결국 반응기 기하학적 형상, 교반기 기하학적 형상, 교반기의 회전 빈도, 및 교반되는 재료의 물질에 의존한다. 가능한한 모든 세포에는 필요한 기질 (영양 배지, O2 와 같은) 이 최적으로 그리고 균일하게 공급되고 대사 물질 (초과 생산물, CO2) 이 부수적으로 멀어지게 유도되는 것이 배양 공정에 있어서 중요하다. 이는 배양 용기에서 공간적으로 뿐만 아니라 일시적으로 발생할 수 있는 싱크 (sink) 및 저장소 (repository) 가 세포에 대한 손상을 피하기 위해 회피되거나 또는 적어도 최소화되는 것을 의미한다. 이는 예컨대 용기의 내용물을 혼합하기 위해 개선된 교반 시스템을 사용함으로써 달성될 수 있다. 혼합 공정은 하위 공정 마이크로 혼합 및 매크로 혼합으로 나누어질 수 있다. 마이크로 혼합은 확산 또는 마이크로 난류에 의한 분자 농도 조정으로서 규정되고; 이와 대조적으로, 매크로 혼합은 교반기에 의해 야기되는 대류적인 알갱이 (coarse) 혼합으로서 규정된다 (예컨대 Houcine, I., 외, Chem. Eng. Technol. 23 (2000) 605-613; Zlokarnik, M., "Ruehrtechnik Theorie und Praxis", Springer Publishers, Berlin Heidelberg, 1999 참조). 혼합의 정도는 Henzler (Henzler, H.-J., "Homogenisieren: Referenz-Ruehrsysteme und Methoden zur Erfassung der Homogenisierungseigenschaften von Ruehrsystemen", GVC Fachausschuβ Mischvorgaenge, 1998) 에 따라 이하의 수학식 3 과 같이 정의될 수 있다 :
Figure pct00004
이 수학식에서
Figure pct00005
는 이론적으로 혼합을 완료한 이후 추적 물질의 농도에 대응하고 △a 는 시간 (t) 에서 추적 물질의 국부적 농도 사이의 최대 차이에 대응한다. 일반적으로 X1 = 0.95 의 혼합 정도는 충분한 것으로 여겨진다 (상기의 Henzler 참조). 수학식 4 에 나타낸 혼합 계수 (CH 0.95) 는 이러한 혼합 정도를 기본으로 하고 혼합 시간 (θ0.95) 과 사용된 교반기의 회전 속도 (n) 의 생산물이다. 따라서, 혼합 계수는 0.95 의 상호 혼합의 정도를 달성하기 위해 시제 (agent) 의 추가 이후 요구되는 교반기 회전 수에 대응한다.
Figure pct00006
표 1 에 나타내고 도 3 및 도 4 에서 발췌된 혼합 계수는 탈색 방법을 사용하는 혼합 시간 조사로부터 초래되었다.
Figure pct00007
구성의 비교에서 여기서 보고된 교반기 시스템은, 예컨대 각각 65.5 및 77 의 평균 혼합 지수를 갖는 3 개의 별개의 경사진 블레이드 교반기 (3SBR) 또는 3 개의 별개의 표준 디스크 교반기 (3SSR) 로 이루어진 교반기와 비교하여 일정한 레이놀즈 수에서 대략 38 의 평균 혼합 지수를 갖는다. 따라서, 여기서 보고된 장치의 일 실시형태에서 배양 용기의 직경 (D) 에 대한 배양 용기의 충전 높이 (H) 의 비는 약 1.6 이다. "약" 이라는 용어는 그 이후 뒤따르는 값이 정확한 값은 아니지만 단지 범위의 중심 값인 것을 나타낸다. 일 실시형태에서 약 이라는 용어는 중심 값 주위의 +/- 25 %, 다른 실시형태에서 +/- 15 %, 그리고 또 다른 실시형태에서 +/- 10 % 를 나타낸다.
동물 세포의 배양을 위한 다른 공정 파라미터는 배지의 세포에 가해지는 전단 응력이다. 동물 세포 배양은, 다른 것들 중에서 세포에 가해지는 기계적 및 유체 역학적 응력에 의해 제한된다. 응력은, 한편 교반기 자체에 의해 야기되고, 다른 한편 배지의 기포 통기 (bubble aeration) 에 의해 야기된다 (예컨대, Wollny, S. 및 Sperling, R., Chem. Ing. Tec. 79 (2007) 199-208 참조). 교반된 탱크 용기의 대부분에서 두드러지는 난류 영역에 대하여, 유체 역학적 응력은 수학식 (5) 에 따라 레이놀즈 응력 접근에 의해 주어진다 (Henzler, H.J. 및 Biedermann, A., Chem. Ing. Tec. 68 (1996) 1546-1561) :
Figure pct00008
수학식 (5) 에 따르면 주응력은 유체 요소의 난류 속도 변동 (u') 에 의한 것으로 추론될 수 있다.
전단 응력의 특징은 가스 공급되지 않은 상태의 교반기 시스템에 대하여 실행되는 것이다. 기준 조각 직경 (dVF) 은 만연한 응력에 대한 상대 측정을 나타내고 도 5 및 표 2 에 나타나 있다. 기준 조각 직경이 더 클 수록, 유체 역학적 응력은 더 낮다. 이러한 경우 통기가 스위치 온 되지 않을 때 교반기 시스템에 의해서만 단독으로 영향을 받는다.
Figure pct00009
예컨대 3 개의 경사진 블레이드 교반기와 같은, 단지 축선방향의 운반 요소를 갖는 교반기 시스템과 비교하여, 여기서 보고된 교반기 시스템은 상당히 작은 응력을 야기하며, 즉 더 큰 기준 조각 직경 (dVF) 을 갖는 조각을 제공한다.
도 2 는 가스 공급되지 않은 출력 입력이 결정되는 뉴턴 수의 비교를 나타내는 도면이다. 여기서 보고된 교반기 시스템이 더 부드럽고 더 균일한 에너지 입력을 부여하는 상당히 더 높은 뉴턴 수를 발생할 수 있는 것을 볼 수 있다.
다양한 교반기 시스템과의 직접 비교에서 여기서 보고된 교반기 시스템은 혼합 (도 3 및 도 4, 표 1) 뿐만 아니라 발생된 전단 응력 (도 5, 표 2) 에서 상당한 이점을 나타낸다.
높은 생산물 역가 및 좋은 생산물 품질을 달성하기 위해 배양 용기의 작동 모드는 예컨대 세포 라인 개발, 매체 조성 및 배양 용기의 치수 외에 중요한 역할을 한다. 작동 모드 배치 또는 배치 공정, 공급 배치 (fed batch) 또는 공급 공정, 세포를 보유하면서 또는 세포를 보유하지 않으면서의 연속적인 공정 (예컨대 관류 (perfusion) 또는 케모스탯 (chemostat)) 뿐만 아니라 예컨대 내부 또는 외부 투석과 같은 반 연속적 공정 사이에서 구분이 있을 수 있다.
예컨대 내부 또는 외부 투석과 같은 반 연속적인 배양 공정에서, 기질이 막을 걸쳐서 배양 용기에 공급되고 동시에 배양된 세포의 구성 요소/대사 물질 생산물이 멀어지게 유도되는 것을 억제한다. 이러한 재료의 교환은 확산에 의한 것이다. 주된 영향 요인은 따라서 만연한 농도 차이, 막 재료, 막 표면, 막 재료 내측의 각각의 화합물의 확산 계수 및 막에 대한 흐름에 의해 결정되는 상 계면의 두께이다. 투석이 높은 세포 밀도 발효에 이용될 때 이는 반응기에 부착된 투석 모듈 (중공 섬유) 이 배지와 신선한 영양 배지 사이의 교환 영역을 제공하는 관류식, 반 연속적 공정이다. 영양 배지는 투석 모듈을 통하여 저장 컨테이너로부터 펌프되고 그 이후 저장 컨테이너 안으로 다시 복귀된다 (개략적인 다이어그램을 위해 도 13 참조). 투석 모듈은 반응기의 외측에 (외부 투석) 또는 반응기 내에 (내부 투석) 위치될 수 있다. 동일한 물리 법칙이 양 쪽 작동 모드에 적용된다. 따라서, 여기서 보고된 교반기 시스템 및 배양 용기 그리고 선택적으로 투석 모듈을 포함하는 장치가 일 양태로서 여기서 보고된다.
배양 용기는 상부 부분, 중간 부분 및 하부 부분을 갖고, 용기의 길이방향 축선은 상부 부분의 중간 또는 중심으로부터 하부 부분의 중간 또는 중심으로 뻗어있다. 원통형 배양 용기는 길이방향 축선에 수직으로 보았을 때 실질적으로 원형 단면을 갖는다. 배양 용기의 상부 부분은 가스 배출 출구 수단, 하나 이상의 입구 수단, 및/또는 보수 및 클리닝을 위한 맨홀 (man hole) 을 또한 포함할 수 있다. 배양 용기의 하부 부분은 하나 이상의 액체 매체 입구 수단, 하나 이상의 액체 매체 출구 수단, 및/또는 가스 입구 수단을 또한 포함할 수 있다. 배양 용기의 중간 부분은 배양 용기의 외측 벽에 장착되는 열 교환 자켓을 또한 포함할 수 있다. 교반기 시스템의 운반 요소는 그의 회전을 유도하기 위해 적합한 메카니즘에 결합되는 섀프트에 의해 회전하도록 설정된다. 섀프트는 배양 용기의 길이방향 축선을 따라 뻗어있고, 따라서 섀프트는 수직으로 배향된 축선의 회전을 갖는다. 섀프트는 용기의 바닥부까지 뻗어있지 않지만 용기의 바닥 위의 그리고 또한 배양 용기의 바닥부에서의 선택적 가스 스파저 (sparger) 위의 지점까지 뻗어있다. 섀프트는 적합한 결합 메카니즘에 의해 구동 섀프트에 작동적으로 결합된다. 구동 섀프트에 섀프트를 결합하기 위한 수단 외에 섀프트는 추가로 섀프트에 운반 요소를 개별적으로 결합하기 위해 다른 수단, 즉 적어도 3 개의 수단을 포함한다. 교반기 시스템의 운반 요소는 일단 교반기 시스템이 배지에 침지된 후 배양 용기의 배지의 표면 이하인/이하가 되는 위치에서 섀프트에 결합된다. 표면은 배지가 정적일 때, 즉 순환되지 않을 때 결정된다. 배양 용기는 흡출관을 갖지 않는다.
하나의 선택적인 실시형태에서 배양 용기는 배플을 갖는 용기이다. 다른 실시형태에서 배양 용기는 2 개 또는 4 개의 배플을 포함한다. "배플" 은 섀프트 축선과 동일한 방향으로 배양 용기 내측에 놓이고 휘저음 장치를 향하여 배양 용기 안으로 방사상으로 뻗어있는 판을 나타낸다. 배플은 일반적으로 사각형 형상이다. 일 실시형태에서 배플은 배양 용기의 내부 벽에 대하여 거리 (bd) 에 놓인다. 다른 실시형태에서 배플은 배양 용기의 내측의 둘레 주위에 등거리로 이격된다.
일 실시형태에서 장치는 또한 투석 모듈을 포함한다. 장치의 구성 요소는 이런 요소가 의도된 기능을 이행할 수 있는 방식, 즉 배양 용기가 배지를 끌어 올릴 수 있고, 교반기 시스템이 매체를 혼합하고 이에 추가된 화합물을 분산시킬 수 있고 투석 모듈이 신선한 매체를 제공하고 배양된 세포에 의해 분비된 대사 물질 화합물을 멀어지게 유도할 수 있는 방식으로 치수를 갖는다. 따라서, 교반기 시스템은 투석 모듈의 존재 및 부재하는 용기 내의 방해받지 않은 회전을 가능하게 하는 직경을 갖는다. 여기서 보고된 장치에 의해 관류 배양 또는 투석 배양과 같은 높은 세포 밀도가 유리하게는 실행될 수 있다. 배양은 일 실시형태에서 배지에 대한 일정한 출력 입력과 독립적인 레이놀즈 수가, 즉 배양 용기의 난류 배지 흐름의 배양이 제공되는 동안 달성될 수 있는 교반기 시스템의 회전 속도에서 실행된다. 여기서 보고된 장치에 의해 교반기 시스템의 낮은 회전 속도 하지만 다른 교반기 시스템과 비교하여 동일한 출력 입력에서 전단 민감성 포유류 세포를 배양하는 것이 가능하다.
배양 용기의 형태는 제한되지 않는다. 일 실시형태에서 배양 용기는 원통형 용기이다. 다른 실시형태에서 배양 용기는 교반된 탱크 반응기이다. 배양 용기는 어떠한 치수도 가질 수 있다. 일 실시형태에서 배양 용기는 5 ℓ ~ 25,000 ℓ 의 작업 용적을 갖는다.
신선한 영양 배지로부터의 구성 요소는 투석 모듈의 내부로부터 반 투과성 (semi-permeable) 중공 섬유 막을 통하여 배양 용기 안으로 확산되고 동시에 배양된 세포의 대사 물질은 농도 차이에 따라 배양 용기로부터 대향하는 방향으로 영양 배지 안으로 확산된다. 배양 용기의 대사 물질을 억제하는 절대 농도를 가능한 한 낮게 (희석) 유지하고 동시에 배양에서 최적의 레벨로 필수 영양소의 농도를 가능한한 길게 유지하는 것을 목적으로 한다. 이는 투석이 없는 공정과 비교하여 개선된 배양 조건을 초래하고 이는 더 높은 최대 세포 밀도 또는 생산물 역가를 달성하는 것을 가능하게 한다.
투석 모듈의 운반 공정은 픽의 제 1 법칙 (first Fick's law) 과 관련한 이중 막 이론 (two-film theory) 에 의해 가스 기포의 물질 전달에 대하여 등식으로 설명될 수 있다. 따라서, 중공 섬유 투석 모듈의 교환 면적 (AH) 을 기본으로 한 선형 구배를 추정하여, 유효 전달 확산 플럭스 (Jeff) 는 수학식 (6) 에 따른다 :
Figure pct00010
확산의 구동력은 유효 확산 경로 (zeff) 에 대한 투석 모듈의 내측과 외측 사이의 농도 차이 (△Ci) 이다. 이러한 유효 확산 경로는 투석 모듈의 중공 섬유 막의 내부 측의 내부 층류 (laminar) 경계 층 (δBI), 중공 섬유 막 자체 (δM) 및 반응기의 중공 섬유 막의 외부 측의 외부 층류 경계 층 (δHI) 을 통과하는 개별 경로로 구성된다. 이들은 일반적으로 확산 분자의 형상 및 크기, 둘러싸는 매체의 성질 및 온도에 의존한다.
별개의 물질 전달 계수는 각각의 개별 구역에 대하여 정의될 수 있고 이들 상호간의 합으로부터 전체 물질 전달 저항 (1/k) 이 수학식 (7) 에 따라 주어진다 :
Figure pct00011
중공 섬유 막의 내부 및 외부 측의 층류 경계 층의 운반 저항은 중공 섬유 막에 대한 흐름에 또한 의존한다. 막을 향하는 흐름이 더 양호할 수록, 즉 더 수직일수록 층류 경계 층은 더 좁아지고 대응하는 운반 저항은 더 작아진다. 배양 용기의 투석 모듈에 대하여 다른 것들 중에서 이하의 요인으로부터 외부 층류 경계 층의 운반 저항의 직접적인 의존이 존재한다 :
ㆍ 교반기 시스템의 회전 속도,
ㆍ 교반기 시스템의 타입,
ㆍ 막에 대한 흐름,
ㆍ 교반기 시스템에 의해 발생되는 주된 흐름 프로파일.
중공 섬유 막의 내부 측의 층류 경계 층의 저항은 작은 내부 직경과 수반되는 높은 유속 때문에 무시될 수 있다. 본 출원에서 "중공 섬유 막의 내부 측" 이라는 용어는 저장 컨테이너를 향하는 중공 섬유 막의 측을 나타낸다. "중공 섬유 막의 외부 측" 이라는 용어는 배양 용기를 향하는 중공 섬유 막의 측을 나타낸다. 전체 물질 전달 저항은 따라서 주로 막 내의 저항 및 외부 층류 경계 층의 저항이 기여하는 시리즈 저항이다 (Rehm, 외, Biotechnology - volume 3: Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993). 전체 물질 전달 계수 (k) 는 상호간의 전체 물질 전달 저항으로부터 초래되고 중공 섬유 투석 모듈의 용적 비표면 (a) 을 곱함으로써 표면 영역과 연관될 수 있다 (ka 값). 이하의 수학식 (8) 은 균형 공간 반응기 (balance spaces reactor) 및 저장 컨테이너에 대한 농도 시간 코스를 설명하는데 사용될 수 있다 :
Figure pct00012
일반적으로 침지된 가스 공급식 배양 용기는 세포 배양에 사용된다. 이러한 경우 하나의 스테이지 또는 두 개의 스테이지 축선방향의 운반 교반기 시스템이 주로 사용된다. 이는 본질적으로 회전 섀프트와 나란한 흐름 프로파일을 발생한다. 따라서, 회전 축선에 나란한 투석 모듈을 갖는 도 12 에 나타낸 구성에서 투석 모듈에 대한 직접 흐름은 달성되지 않는다. 이는 투석 모듈 (섬유 표면의 더 넓은 외부 층류 경계 층) 의 물질 운반에 불리한 효과를 갖는다.
투석 막에 대한 직접적인 접선 또는 방사상의 흐름이 유리한 효과를 가지며 이는 예컨대 표준 앵커 임펠러에 의해 달성될 수 있다. 이러한 임펠러는 반응기의 모듈 또는 투석 모듈 상에 직접적으로 배향되는 흐름을 발생시키고 따라서 투석 모듈(들)의 표면의 층류 경계 층을 줄인다. 이러한 간단한 방사상의 흐름은, 하지만 특히 침지된 가스 공급식 반응기의 물질 전달 그리고 반응기의 혼합에 대한 다른 기본적인 기술적 공정 기능에 대하여 불리하다. 가스는 예컨대 파이프 스파저 또는 링 스파저를 통하여 배양 용기 안으로 도입될 수 있다.
여기서 보고된 교반기 시스템은, 다른 교반기 시스템과 비교하여 예컨대 액체 표면을 통하여 산 또는 염기와 같은 교정제를 도입하고, 발포 형성을 줄이고 투석 방법에서 바이오파울링 (biofowling) 을 줄이고 투석 모듈에 대한 직접적인 수직 흐름에 의해 물질 운반율을 증가시키기 위해 더 신속하게 배지를 혼합시키는데 사용될 수 있다.
IGF-1R 또는 CD20 또는 HER2 에 대한 항체를 생산하는 동물 세포의 배양에서의 본 발명에 따른 교반기 시스템의 사용은 실시예로서 나타나 있다(WO　2004/087756 참조; WO　2007/045465, WO　2007/115814 및 WO　2005/044859 참조; WO　99/057134 및 WO　92/022653 참조). 이는 개시물의 제한을 나타내지 않으며 단지 본 발명을 나타내는 역할을 한다. 도 6a 및 6b 내지 도 11 에서 볼 수 있는 것과 같이, 여기서 보고된 교반기 시스템의 사용은 상이한 교반기 시스템 (예컨대 3 개의 경사진 블레이드 교반기와 같은) 과 비교할 때 살아있는 세포 밀도, 생존도 및 생산물 형성에 대하여 유사한 시간 코스를 나타낸다.
본 출원에서 사용된 약어는 이하의 의미를 갖는다 (또한 도 1a 참조) :
b : 방사상의 운반 요소의 블레이드의 폭
d : 휘저음 장치 전체 외부 직경
dw : 섀프트의 직경
h : 방사상의 운반 요소의 교반기 블레이드의 높이
hB : 축선방향의 운반 요소의 높이
△h : 2 개의 운반 요소의 높이 차이
l : 축선방향의 운반 요소의 교반기 블레이드의 길이
Figure pct00013
: 축선방향의 운반 요소의 블레이드의 블레이드 피치
z : 교반기 당 교반기 블레이드의 개수
di : 방사상의 운반 요소의 교반기 블레이드 사이의 내부 거리
D : 배양 용기 내부 직경
H : 배양 용기의 충전 높이
일 실시형태에서 배양 용기 직경 (D) 에 대한 2 개의 운반 요소의 높이 차이 (△h) 의 비는 적어도 0.75 이다. 항체 또는 폴리펩타이드의 생산을 위해 세포를 배양하기 위한 여기서 보고된 교반기 시스템의 사용이 여기서 양태로서 보고된다. 일 실시형태에서 배양은 투석이다. 다른 실시형태에서 배양은 침지된 가스 공급식 교반 탱크 배양 용기에서 실행된다. 다른 실시형태에서 세포는 진핵 세포이고, 다른 실시형태에서 포유류 세포이다. 또 다른 실시형태에서 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, COS 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포 또는 HEK 293 세포이다. 일 실시형태에서 세포는 아스로박터 프로토포미에 (Arthrobacter protophormiae), 아스페르질루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르질루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 바실루스 아미롤리쿼패시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), BHK 세포, 칸디다 보이디니 (Candida boidinii), 셀룰로모나스 셀루란스 (Cellulomonas cellulans), 코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), CHO 세포, 대장균 (E.coli), 게오바실루스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus), H. polymorpha, HEK 세포, HeLa 세포, 락토바실루스 델브루에키 (Lactobacillus delbruekii), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), MDCK 세포, 패네바실루스 마세란스 (Paenebacillus macerans), P. pastoris, 슈도모나스 종 (Pseudomonas species), S. cerevisiae, 로도박터 종 (Rhodobacter species), 로도코쿠스 에리스로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 스트렙토미세스 종 (Streptomyces species), 스트렙토미세스 아눌라투스 (Streptomyces anulatus), 스트렙토미세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus), Sf-9 세포 및 잔토모나스 캠페스트리스 (Xantomonas campestris) 로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서 항체는 CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Lewis Y 항원, IL-6 수용기 또는 IGF-1 수용기에 대한 항체이다.
이하의 실시예 및 도면은 본 발명의 주제를 나타내기 위해 제공된다. 보호하려는 내용은 첨부된 특허 청구항에 의해 규정된다. 본 발명의 주제를 벗어나지 않으면서 기재된 방법의 주제에 수정이 이루어질 수 있는 것이 명백하다.
실시예 1
배양 장치
모든 조사는 300 ℓ Plexiglas？ 모델 컨테이너 (이후에 DN 640 으로 나타냄) 또는 생산 반응기 자체에서 실행되었다. 투석 조사는 100 ℓ Plexiglas？ 모델 컨테이너 (이후에 DN 440 으로 나타냄) 에서 실행되었다.
실시예 2
출력 입력
상이한 교반기의 출력 입력은 회전 섀프트의 토크를 측정함으로써 결정되었다. 토크 센서 모델 (DRFL-II-5-A) 와 함께 데이터 프로세싱 시스템 모델 (GMV2) (두 가지 모두 독일, Gschwend 의, "ETH Messtechnik" 사 제조) 이 토크를 기록하는데 사용되었다. 각각의 교반기 시스템에 대하여 토크는 먼저 충전되지 않은 상태 (Mempty) 에서 다양한 선회 속도에서 기록되었고 그 이후 수학식 (9) 에 따라 충전 상태 (Mload) 에서 3 중 계산에 의해 기록되었다 :
Figure pct00014
그 뒤에 대응하는 뉴턴 수 (Ne 수) 및 레이놀즈 수 (Re 수) 가 각각의 지점에 대하여 산출되었다. 교반기 시스템에 대한 뉴턴 수가 난류 구역에서 일정해지기 때문에, 산출된 뉴턴 수는 그 이후 이 구역에서 평균을 내었다 (Uhl, V.W. 및 Gray, J.B., Mixing Theory and Practice, Academic Press, 1966). 이러한 수단은 각각의 교반기의 전체 뉴터 수를 나타낸다.
실시예 3
균질화
균질화는 색상 변화 방법 뿐만 아니라 전도성 방법을 사용하여 결정되었다.
색상 변화 방법은 티오황산나트륨의 추가에 의해 요오드-요오드화칼륨에 의해 착색되는 녹말 용액의 탈색을 기본으로 한다 (독일, Karlsruhe 의, Carl Roth GmbH & Co KG 사로부터 얻어지는 I, KI, 녹말, Na2S2O3). 일 몰 (molar) 의 티오황산나트륨 용액 및 일 몰의 요오드-요오드화칼륨용액 (루골 용액 (Lugol's solution)) 뿐만 아니라 10 g/ℓ 의 농도의 녹말 용액이 초기 용액으로서 사용되었다. 전도성 실험에 대응하여, 적어도 4 개의 속도 단계가 교반기 당 시험되었으며 (속도 단계 당 4 중 계산) 최대 4 번의 실험이 컨테이너 충전량 당 실행되었다. 각각의 경우 녹말 용액이 컨테이너의 충전 당 한 번씩 추가되었다. 각각의 개별 측정에 대하여 요오드-요오드화칼륨용액의 대응하는 용적이 먼저 추가되었고 그 이후 티오황산나트륨이 추가되었다. 혼합 시간은 티오황산나트륨이 추가되고 추가 시간을 고려하기 위해 각각의 경우에 1 초를 뺀 시간 지점으로부터 수동적으로 결정된다. 측정의 완료 이후 컨테이너 충전 용적은 이전에 추가된 티오황산나트륨의 초과를 보상하기 위해 요오드-요오드화칼륨에 의해 적정 (titrated) (중화) 되었다.
전도성 방법에서 혼합 시간은 전해질 용액의 추가로부터 마지막 시간에 대한 측정된 전도성 변동이 정상 상태 (stationary state) 에 도달되는 전도성 값의 ± 5 % 의 공차 범위를 초과하는 시간까지의 시간으로 규정된다. 몇몇의 탐침부 (probe) 가 사용되는 경우, 각각의 경우 가장 긴 검출된 혼합 시간은 전체 시스템에 대한 대표로서 여겨진다.
30 % (w/v) 의 NaCl 용액 (독일, Darmstadt 의, Merck KGaA 사의 NaCl 결정질) 이 전도성 방법에 의해 혼합 시간을 결정하기 위해 전해질 용액으로서 사용되었다. 이는 교반기의 회전 섀프트에서 액체 표면 상에 맥동시 추가되었고 추가물 당 용적은 정상 상태에서 초래되는 전도성에서의 점프가 200 mS/㎝ 를 초과하지 않도록 선택되었다.
각각의 교반기에 대하여 적어도 4 개의 속도 단계가 시험되었다. 혼합 시간은 속도 단계 당 적어도 8 번 결정되었고 이러한 8 개의 값으로 평균을 내었다. 각각의 교반기 시스템의 혼합 계수는 속도 단계 당 평균을 낸 혼합 계수의 평균으로서 주어진다. 전도성은 각각의 경우 컨테이너의 다양한 방사상 또는 축선방향 위치에서 3 개의 4-극 전도성 탐침부 (Weilheim 의, WTW 사의 TetraCon) 에 의해 측정되었다. 전도성 신호는 사용되는 측정 증폭기 (독일, Berlin 의, Knick "Elektronische Messgeraete GmbH & Co, KG" 사의 Cond813) 를 통하여 온라인에서 판독되었다. 측정된 값은 5 초의 표본 추출율 (sampling rate) 에서 소프트웨어 Paraly SW 109 (독일, Berlin 의, Knick "Elektronische Messgeraete GmbH & Co, KG" 사) 를 통하여 동시적으로 모든 탐침부에 대한 것이였으며 온라인에 저장되었다. 연이은 측정이 완료된 이후 데이터는 각각의 탐침부에 대하여 별개로 평가되었다.
실시예 4
전단 응력
모델 입자 시스템, 청색 클레이 폴리머 조각 시스템 (blue clay polymer flake system) 이 전단 응력을 결정하기 위해 사용되었다. 이는 용기에 놓이는 클레이 미네랄 (청색 클레이) 그리고 양이온성 폴리머 (Praestol BC 650) 로 이루어지는 모델 입자 시스템이다. 응집 반응이 Praestol BC 650 의 추가에 의해 시작되고 이는 규정된 크기의 조각을 발생시킨다. 이러한 조각은 그 후에 교반기 시스템의 기계적 및 유체 역학적 응력에 의해 부서진다. 기포-가스 공급식 시스템의 경우 이런 조각은 기포가 형성되고 터질 때 에너지 소실에 의해 추가적으로 부서진다. 모델 입자 시스템의 평균 입자 직경은 전단 응력을 특징짓기 위해 측정된 변수로서 사용되었다. 이러한 경우 입자 크기의 변화는 Mettler Toledo 사의 Focused Beam Reflectance Measurement Probe (이후에 FBRM？ 로 나타냄) 에 의해 그 자리에서 측정되었다. 결정되는 입자 크기의 변화율은 모델 시스템에 만연한 전단 응력에 대한 측정이다. 입자 크기의 변화율의 구배는 실험 코스 동안 점점 작아지지만 평형 상태 (equilibrium state) (약 15 ㎛ 의 청색 클레이 주된 입자의 직경으로의 입자 분쇄) 가 형성되지는 않는다. 이러한 이유로 청색 클레이 폴리머 조각 시스템에 대한 단부 조각 직경 (dP50') 은 이하의 기준 (수학식 10) 에 따라 결정되었다 :
Figure pct00015
상이한 출력 입력 그리고 상이한 교반기 사이의 단부 조각 직경의 비교성을 보장하기 위해, 기준 조각 직경은 이하와 같이 산출되었다 (수학식 11 ~ 수학식 13) :
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
먼저 100 ℓ 모델 컨테이너는 완전한 탈염수 (demineralized water) (VE 물) 의 대응하는 용적 (H/D 비) 으로 채워지고 20℃ 의 온도로 유지되었다. 그 후에 전도성은 CaCl2 용액에 의한 적정에 의해 1000 μS/㎝ 의 값으로 조정되었다. 전도성은 4-극 전도성 탐침부에 의해 측정되었다 (탐침부 : Weilheim 의 WTW Co. 의 TetraCon; 측정 증폭기 : 독일, Berlin 의, Knick "Elektronische Messgeraete GmbH & Co, KG" 사의 Cond813). 그 후에 청색 클레이 및 NaCl 은 용액에 적절한 양으로 추가되었다. 그 이후 균질한 상이 적어도 20 분의 기간 동안 최고의 속도에서 발생하였다. FBRM？ 탐침부 (독일, Giessen 의, Mettler-Toledo GmbH Co., 의 FBRM？ Lasentec？ D600L) 는 벽으로부터 70 ㎜ 의 방사상의 거리에서 위에서부터 수직으로 (담금 깊이 (300 ㎜)) 컨테이너에 장착되었다. 응집 반응은 그 이후 규정된 속도로 Praestol 650 BS 를 추가함으로써 시작되었다. 측정된 값은 데이터 습득 제어 인터페이스 버전 6.7.0 의 프로그램을 통하여 온라인에 기록되었다 (독일, Giessen 의, Mettler-Toledo GmbH). 기준 조각 직경은 측정 데이터로부터 결정되었다. 적어도 3 개의 출력 입력이 각각의 교반기에 대하여 측정되었다. 각각의 경우 3 번의 측정이 출력 입력 당 실행되었다.
실시예 5
투석 (물질 전달 액체 - 액체)
NaCl 용액 (독일, Darmstadt 의, Merck KGaA 사의 NaCl 결정질) 이 용적 비 출력 입력 그리고 사용되는 교반기 시스템에 대하여 모듈 (독일, Wiesbaden 의, MICRODYN-NADIR GmbH 사의, DIADYN-DP 070 F1 OL) 의 농도 반감기를 결정하기 위해 추적 물질로서 사용되었다. 추적 물질은 1500 μS/㎝ 의 베이스 라인 전도성에 대한 각각의 실험 진행의 시작에서 저장 컨테이너에서 조정되었다. 반응기는 각각의 실험 진행에 대하여 완전한 탈염수로 채워졌다. 반응기의 충전 용적은 100 ℓ (H/D = 1.6) 이고 저장 컨테이너의 충전 용적은 400 ℓ (H/D = 2.0) 이고 2 개의 컨테이너 모두는 각각의 실험의 시작에서 20℃ 의 온도로 유지되었다. 2 개의 컨테이너 모두의 전도성은 4-극 전도성 탐침부 (탐침부 : 독일, Weilheim 의 WTW Co. 의 TetraCon; 측정 증폭기 : 독일, Berlin 의, Knick "Elektronische Messgeraete GmbH & Co, KG" 사의 Cond813) 에 의해 측정되었다. 사용되는 측정 증폭기의 표본 추출율은 5 초였고 측정 값은 소프트웨어 Paraly SW 109 (독일, Berlin 의, Knick "Elektronische Messgeraete GmbH & Co, KG" 사) 를 통하여 동시적으로 모든 탐침부에 대한 것이며 온라인에 저장되었다. NaCl 용액은 2.1 ℓ/min 의 일정한 유량으로 공급 컨테이너와 투석 모듈 사이의 연동 펌프 (독일, Rommerskirchen 의, Watson-Marlow GmbH 사의, 하우징 펌프 520 U) 를 통하여 순환되었다. 평가를 위해, 탐침부 (1) 가 반응기에 대하여 기준 탐침부로서 사용되었고 탐침부 (3) 는 저장 컨테이너에 대하여 기준 탐침부로서 사용되었다. 이러한 2 개의 탐침부의 데이터는 평가 루틴에 의해 평가되었다. 각각의 경우 반응기의 적어도 6 개의 상이한 출력 입력이 교반기 당 조사되었다.
NaCl 용액을 통하여 결정되는 물질 전달 특징을 비교하기 위해, 추가적 측정이 추적 물질로서 포도당 용액에 의해 실행되었다. 실험적 설정은 이를 위해 변하지 않았다. 3 g/ℓ 의 농도의 규정된 포도당 농도 (독일, Darmstadt 의, Merck KGaA 사의, 포도당 고형물) 가 저장 컨테이너에 제공되었다. 포도당 농도는 혈당 측정 기구 (독일, Mannheim 의, Roche Diagnostics GmbH 사의, ACCU-CHEK？ Aviva) 를 통하여 10 분의 시간 간격으로 반응기 및 저장 컨테이너에 대하여 동시적으로 그리고 수동적으로 결정되었다.
실시예 6
항-IGF-1R 항체
항-IGF-1R 항체를 분비하는 세포 라인은 국제 특허 출원 WO　2004/087756, WO　2007/045465 및 WO　2007/115814 에서 발행된 데이터에 따라 그리고 일반적으로 공지된 방법을 통하여 생산되고 배양되었다.
실시예 7
항-CD20 항체
항-CD20 항체를 분비하는 세포 라인은 국제 특허 출원 WO 2005/0044859 에서 발행된 데이터에 따라 그리고 일반적으로 공지된 방법을 통하여 생산되고 배양되었다.
실시예 8
항-HER2 항체
항-HER2 항체를 분비하는 세포 라인은 국제 특허 출원 WO 92/022653 및 WO 99/057134 에서 발행된 데이터에 따라 그리고 일반적으로 공지된 방법을 통하여 생산되고 배양되었다.

Claims (15)

  1. 수직 교반기 섀프트 상에 서로 위아래로 구성되는 2 개의 방사상의 운반 요소 그리고 하나의 축선방향의 운반 요소로 이루어지는 교반기 시스템으로서, 축선방향의 운반 요소는 방사상의 운반 요소 위에 구성되는 교반기 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 교반기 시스템은 배지를 포함하는 배양 용기에서 사용될 때 5 * 104 ~ 5 * 105 의 레이놀즈 수에서 5.5 ~ 8.0 의 뉴턴 수를 갖는 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 교반기 시스템은 배지를 포함하는 배양 용기에서 사용될 때 약 0.05 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 20 초의 혼합 시간 (θ0.95) 그리고 약 0.3 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 10 초의 혼합 시간을 갖는 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교반기 시스템은 방사상의 운반 교반기 요소로서 2 개의 Rushton 터빈 또는 2 개의 디스크 교반기 그리고 축선방향의 운반 교반기 요소로서 하나의 경사진 블레이드 교반기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사상의 운반 교반기 요소는 2 ~ 8 개의 교반기 블레이드를 갖고 축선방향의 운반 교반기 요소는 2 ~ 10 개의 교반기 블레이드를 갖는 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모든 운반 요소는 동일한 직경 (d) 을 갖는 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  7. 제 7 항에 있어서, 상기 배양 용기의 직경 (D) 에 대한 교반 요소의 직경 (d) 의 비는 0.32 ~ 0.35 인 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 축선방향의 운반 교반기 요소의 교반기 블레이드의 피치는 교반기 섀프트에 대하여 10°~ 80°인 것을 특징으로 하는 교반기 시스템.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 교반기 시스템 및 배양 용기를 포함하는 장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 상기 교반기 시스템은 배지를 포함하는 배양 용기에서 사용될 때 5 * 104 ~ 5*105 의 레이놀즈 수에서 5.5 ~ 8.0 의 뉴턴 수를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 교반기 시스템은 배지를 포함하는 배양 용기에서 사용될 때 약 0.05 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 20 초의 혼합 시간 (θ0.95) 그리고 약 0.3 W/㎏ 의 출력 입력에서 약 10 초의 혼합 시간을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 동물 세포를 배양하기 위한 방법으로서, 동물 세포는 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 장치에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 동물 세포를 배양하기 위한 방법.
  13. 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법으로서,
    a) 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 장치에서 폴리펩타이드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
    b) 세포 또는 배지로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계,
    c) 폴리펩타이드를 정제하고 이에 의해 폴리펩타이드를 생산하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법.
  14. 동물 세포 배지의 혼합을 위해 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 교반기 시스템의 사용.
  15. 동물 세포를 배양하기 위한 장치에 있어서 :
    a) 배양 용기,
    b) 배양 용기의 중간 축선을 따른 수직 섀프트,
    c) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 교반기 시스템,
    d) 배양 용기의 바닥부의 가스 공급부, 및
    e) 용액을 추가, 교정 및/또는 공급하기 위한 액체 표면 위의 영역의 적어도 하나의 입구를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동물 세포를 배양하기 위한 장치.
KR1020127001828A 2009-07-24 2010-07-23 교반기 시스템 KR20120031083A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09009639.7 2009-07-24
EP09009639 2009-07-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120031083A true KR20120031083A (ko) 2012-03-29

Family

ID=41478681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127001828A KR20120031083A (ko) 2009-07-24 2010-07-23 교반기 시스템

Country Status (14)

Country Link
US (3) US20120135464A1 (ko)
EP (1) EP2456547B2 (ko)
JP (5) JP5921433B2 (ko)
KR (1) KR20120031083A (ko)
CN (1) CN102639221B (ko)
AU (1) AU2010275687A1 (ko)
BR (1) BRPI1010068A2 (ko)
CA (1) CA2766836A1 (ko)
DE (1) DE202010018640U1 (ko)
ES (1) ES2478294T3 (ko)
IL (1) IL216666A0 (ko)
MX (1) MX2012000730A (ko)
SG (1) SG177727A1 (ko)
WO (1) WO2011009625A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101477258B1 (ko) * 2013-05-29 2014-12-30 현대제철 주식회사 용선 교반용 임펠라의 침적 깊이 제어장치 및 제어방법
CN111570489A (zh) * 2020-06-22 2020-08-25 山东润德生物科技有限公司 一种好氧发酵过程的物料补料装置

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201913363VA (en) 2007-07-09 2020-03-30 Genentech Inc Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides
US10076731B2 (en) 2009-06-05 2018-09-18 Hoffman-La Roche Inc. Combination stirrer
CA2766836A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Stirrer system
US8619148B1 (en) 2012-01-04 2013-12-31 Audience, Inc. Image correction after combining images from multiple cameras
WO2014108454A1 (en) 2013-01-11 2014-07-17 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material
US11944946B2 (en) 2013-06-28 2024-04-02 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation Mixing assemblies including magnetic impellers
JP6216449B2 (ja) 2013-06-28 2017-10-18 サン−ゴバン パフォーマンス プラスティックス コーポレイション 磁気インペラを含む混合アセンブリ
WO2015186710A1 (ja) * 2014-06-04 2015-12-10 三菱化学株式会社 連続式反応装置及びトナーの製造装置
FR3022804B1 (fr) * 2014-06-25 2016-07-15 Roquette Freres Arbre d'agitation pour broyeur
CN108026511B (zh) * 2015-09-15 2021-09-24 株式会社美加细胞 利用旋转式搅拌培养法的血小板的制造方法
CN106801009A (zh) * 2015-11-25 2017-06-06 衡阳屹顺化工有限公司 一种好气发酵装置
MY197074A (en) * 2016-03-14 2023-05-24 Omnibrx Biotechnologies Private Ltd A bioreactor system and method thereof
JP7078621B6 (ja) * 2016-12-13 2022-08-01 ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー 食品処理のための人間工学的な泡立て器
JP7148279B2 (ja) * 2018-05-31 2022-10-05 花王株式会社 撹拌方法及び撹拌装置
US20200330936A1 (en) * 2018-10-05 2020-10-22 University Of Baltimore Systems, Methods, and Apparatus for Utilizing a Resuspension Tank
RU2737205C1 (ru) * 2020-02-18 2020-11-26 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Арктический государственный агротехнологический университет" (ФГБОУ ВО Арктический ГАТУ) Аппарат для культивирования микроорганизмов
CN111760542A (zh) * 2020-06-23 2020-10-13 武汉工程大学 一种化妆品膏状反应釜

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3445342A (en) * 1966-02-11 1969-05-20 New Brunswick Scientific Co Fermentation apparatus
JPS497160A (ko) * 1972-05-15 1974-01-22
GB1584103A (en) * 1977-06-01 1981-02-04 Ranks Hovis Mcdougall Ltd Method and apparatus for promoting fermentation
US4438074A (en) * 1981-07-21 1984-03-20 Phillips Petroleum Company Continuous polymerization reactor
JPS5970499U (ja) * 1982-11-05 1984-05-12 味の素株式会社 撹拌翼
JPS61200842A (ja) * 1985-02-28 1986-09-05 Sumitomo Heavy Ind Ltd 撹拌機
SE461444B (sv) 1985-11-21 1990-02-19 Boerje Skaanberg Impellerapparat foer omroerning av vaetska under dispergering av gas daeri
US5198156A (en) 1986-02-17 1993-03-30 Imperial Chemical Industries Plc Agitators
JPS63146782A (ja) * 1986-12-09 1988-06-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法
JPH0751920Y2 (ja) * 1991-05-30 1995-11-29 株式会社横山エンジニアリング 酒造米液化装置における撹拌翼
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
US5342763A (en) * 1992-11-23 1994-08-30 Genentech, Inc. Method for producing polypeptide via bacterial fermentation
GB9309429D0 (en) * 1993-05-07 1993-06-23 Bioscot Ltd Fermenter accessory
JP3193215B2 (ja) * 1993-11-18 2001-07-30 池袋琺瑯工業株式会社 撹拌装置
CN1044334C (zh) * 1994-12-28 1999-07-28 黄为民 搅拌釜
JPH08252445A (ja) * 1996-03-22 1996-10-01 Sumitomo Heavy Ind Ltd 攪拌機
JP3826443B2 (ja) * 1996-05-10 2006-09-27 株式会社カネカ 撹拌装置
FR2763867B1 (fr) * 1997-06-03 1999-07-30 Grande Paroisse Sa Dispositif pour melanger et dissoudre dans un liquide des granules solides, en particulier pour la production d'engrais phospho-azotes
IL139035A0 (en) 1998-05-06 2001-11-25 Genentech Inc Protein purification by ion exchange chromatography
US5972661A (en) 1998-09-28 1999-10-26 Penn State Research Foundation Mixing systems
JP2002537868A (ja) * 1999-03-11 2002-11-12 コブラ・セラピューティクス・リミテッド 細胞溶解物を混合するための容器
US6250769B1 (en) 1999-09-13 2001-06-26 Clair F. Kirk Visor light cap
US6455306B1 (en) * 2000-06-09 2002-09-24 Transcyte, Inc. Transfusable oxygenating composition
DE60124780T2 (de) * 2000-12-20 2007-10-11 Bayer Pharmaceuticals Corp., West Haven Vorrichtung und verfahren zur serienvermehrung von säugerzellen zum animpfen
US6984753B2 (en) 2001-05-15 2006-01-10 Dow Italia S.R.L. Agitation system for alkylbenzene oxidation reactors
US7378503B2 (en) 2003-04-02 2008-05-27 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
US7153480B2 (en) 2003-05-22 2006-12-26 David Robert Bickham Apparatus for and method of producing aromatic carboxylic acids
ME03330B (me) 2003-11-05 2019-10-20 Roche Glycart Ag Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom za vezivanje fc receptora i efektornom funkcijom
JP4081478B2 (ja) * 2004-04-22 2008-04-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 攪拌機
MXPA06011837A (es) * 2004-04-27 2007-01-16 Baxter Int Sistema de reactor de tanque agitado.
CN100375782C (zh) * 2005-09-29 2008-03-19 华东理工大学 用于动物大规模细胞培养的生物反应器***
TW200732472A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Hoffmann La Roche Method for the recombinant expression of a polypeptide
US20080014203A1 (en) 2006-04-11 2008-01-17 Silke Hansen Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP2064314A4 (en) * 2006-09-13 2009-12-30 Abbott Lab IMPROVEMENTS TO CELL CULTURE
JP2008211979A (ja) * 2007-02-28 2008-09-18 Dic Corp ポリエステル化合物の製造方法
WO2008120643A1 (ja) * 2007-03-30 2008-10-09 Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. アルコール連続生産方法
TW200911740A (en) * 2007-06-01 2009-03-16 Solvay Process for manufacturing a chlorohydrin
JP2009072133A (ja) * 2007-09-21 2009-04-09 Hitachi Plant Technologies Ltd 培養槽装置、細胞培養方法及び物質生産方法
CA2766836A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Stirrer system

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101477258B1 (ko) * 2013-05-29 2014-12-30 현대제철 주식회사 용선 교반용 임펠라의 침적 깊이 제어장치 및 제어방법
CN111570489A (zh) * 2020-06-22 2020-08-25 山东润德生物科技有限公司 一种好氧发酵过程的物料补料装置
CN111570489B (zh) * 2020-06-22 2021-04-27 山东润德生物科技有限公司 一种好氧发酵过程的物料补料装置

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011009625A1 (en) 2011-01-27
CA2766836A1 (en) 2011-01-27
JP6505592B2 (ja) 2019-04-24
JP2017209676A (ja) 2017-11-30
IL216666A0 (en) 2012-02-29
JP6827389B2 (ja) 2021-02-10
CN102639221B (zh) 2014-12-10
JP2021007946A (ja) 2021-01-28
JP2012533419A (ja) 2012-12-27
AU2010275687A1 (en) 2012-01-12
EP2456547B1 (en) 2014-06-04
EP2456547A1 (en) 2012-05-30
EP2456547B2 (en) 2024-03-06
BRPI1010068A2 (pt) 2016-03-15
SG177727A1 (en) 2012-02-28
CN102639221A (zh) 2012-08-15
ES2478294T3 (es) 2014-07-21
JP2014140378A (ja) 2014-08-07
DE202010018640U1 (de) 2019-11-14
JP2016073976A (ja) 2016-05-12
US20180187138A1 (en) 2018-07-05
US20120135464A1 (en) 2012-05-31
JP5921433B2 (ja) 2016-05-24
US20150175952A1 (en) 2015-06-25
MX2012000730A (es) 2012-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6827389B2 (ja) 攪拌システム
US20220143562A1 (en) Combination stirrer
Doran Design of mixing systems for plant cell suspensions in stirred reactors
Marques et al. Bioprocess scale‐up: quest for the parameters to be used as criterion to move from microreactors to lab‐scale
Barrett et al. Microwell engineering characterization for mammalian cell culture process development
Scargiali et al. Mass transfer and hydrodynamic characteristics of unbaffled stirred bio-reactors: influence of impeller design
Van’t Riet et al. 2.07 Mixing in Bioreactor Vessels
De Wilde et al. Superior scalability of single-use bioreactors
Bliatsiou et al. Influence of impeller geometry on hydromechanical stress in stirred liquid/liquid dispersions
Kaiser et al. Development of a method for reliable power input measurements in conventional and single‐use stirred bioreactors at laboratory scale
Schaepe et al. kLa of stirred tank bioreactors revisited
Vanags et al. Stirring characteristics in bioreactors
Brucato et al. Unbaffled, stirred bioreactors for animal cell cultivation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right