JPS63146782A - 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は微生物によるリパーゼの生産方法に関する。さ
らに詳しくは、リパーゼ生成能を有する微生物を用いて
リパーゼを生産する際に、微生物保持材料とともに培養
するなどして該微生物の増殖生態を該保持材料に付着・
増殖した生物膜状にすることにより該微生物のリパーゼ
生成能を飛躍的かつ安定的に向上させることを特徴とす
る高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法に関し、本発
明によって油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
適する高リパーゼ活性を有する菌体が生産される。

［従来の技術］ リパーゼは元来、油脂の加水分解反応に対し触媒作用を
有する酵素に与えられた総称であり、動物界では膵臓、
肝臓などに、植物界ではとマシ、燕麦などに、また微生
物界ではカビ、酵母、バクテリアなどに見出される。し
かしながら酵素資源としての見地からは、動物臓器や植
物種子を給源とするものは無尽蔵にうることができず、
また水に抽出されにくく不安定であるという難点をもっ
ている。これに対し微生物起源のものは自然界に多種多
様に存在する微生物のうちから目的にあったリパーゼを
生産するものを選び出し、その培養条件を種々変更する
ことによって人為的に酵素の生産性を高めることができ
るので工業生産には有利である。このような背景から、
たとえばマーガリーン、ショートニングなどの加工脂の
製造において水素添加とならぶ重要な技術である油脂の
エステル交換反応などに利用されるリパーゼは、大部分
が微生物によって工業生産されている。

微生物によるリパーゼの工業生産においては、酵素精製
の簡便さの観点から菌体外リパーゼをうろことを目標に
して微生物のスクリーニングを行ない、それぞれの微生
物を最適な培養条件で培養したのち菌体外に分泌された
リパーゼを分離、精製して市販している。

現在報告されている酵素法による油脂エステル交換反応
などの技術の大部分は、このようにしてえられた市販酵
素をセライトなどの担体に固定化して利用している。

酵素法によるエステル交換反応においては、その反応系
の水分量をコントロールすることが油脂の加水分解によ
るジグリセリドなどの１７’ｌ生成、あるいは交換能の
収率低下を避ける上で重要なポイントとされている。こ
のような実情において、油脂の加水分解を抑制しエステ
ル交換反応を効率よく行なわせるために、たとえばつぎ
のような方法が報告されている。

イ）油脂のエステル交換に際し、水のかわりにリパーゼ
活性化剤として低級多価アルコールを用いる方法（特公
昭５７−６４８０号公報）。

（０１油脂のエステル交換反応系に界面活性剤（乳化剤
）を加え、界面で油脂とリパーゼを効率よく接触さぜる
方法〈特開昭５７−１９８７９８号公報）。

四吸水性樹脂を用いて水分量をコントロールすることに
よりエステル交換反応速度を高める方法（特開昭５８−
１１６６８９号公報）。

に）高融点の脂肪酸を用いるかわりに低融点の脂肪酸の
低級アルコールエステルを用いることにより反応をより
均一に行なう方法（特公昭５１−２７１５９号公報）。

（ホ）溶剤蒸気を乾燥循環することで反応系中の水分を
コントロールする方法（特開昭５８−５００６３８号公
報）。

しかしながら、これらの方法は反応速度が遅い、加水分
解反応の抑制が不充分、工程の煩雑化、リパーゼの回収
再利用への障害などの問題をかかえており、工業的利用
を考えたばあいどれも不充分なものといわざるをえない
。

このような実情のもとに本発明者らは、油脂の加水分解
を抑制し、エステル交換反応を効率よく行なわせる方法
として、リパーゼを生産する微生物を培養して、そのリ
パーゼを菌体内に包蔵した状態の乾燥菌体を前述の方法
のリパーゼ酵素製剤にかわるものとして用いることによ
って、エステル交換反応速度を高め、かつ反応を長時間
安定的に持続させうることを見出し、すでに報告した（
特開昭６０−３４１８９号公報）。

［発明が解決しようとする問題点コ しかしながら、このような乾燥菌体を用いるエステル交
換反応においては、乾燥菌体の有するリパーゼ活性、す
なわちリパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産性
を高めるような培養条件、また乾燥菌体として用いるが
ゆえに、生産されたリパーゼをできるだけ菌体外に分泌
させないような培養条件の決定が重要となる。

本発明者らは上述の培養条件の決定について鋭意研究し
た結果、その培地成分に関してリパーゼ生成に阻害作用
を有するアミノ酸群が存在し、これら阻害作用の大きい
アミノ酸群の含有率の低い有機窒素源をその培地の主成
分として用いることによってリパーゼ生成能を有する微
生物のリパーゼ生成能を高めうること、またアミノ酸ま
たはアミノＭおよびペプチドを主成分とする基質を流加
することによって培養液中のアミノ酸濃度を低濁度に保
ちながら培養づることによってリパーゼ生成能を有する
微生物のリパーゼ生成能を高めうることをすでに見出し
ている。

しかしながら、上記２つの方法によっても攪拌数、通気
最、ｌ！痒ペラの位置、培養槽の幾何学的形状、培養液
ｍなどの諸物理的操作因子の微生物のリパーゼ生成能へ
の影響は複雑であり、前述の培地組成をコントロールす
る方法においてもリパーゼ活性は上昇させうるものの、
安定した一定レベルの高活性をうる操作条件を決定する
ことは非常に困難である。

とくにリパーゼ生成能を有する微生物を培養してリパー
ゼを生産する際には、天然物である有機窒素源の利用が
必須であるため、天然物である有機窒素源のその成分、
組成の不安定さとあいまって、培養条件の決定、ひいて
は工業的利用を考えたばあいにそのスケールアップは非
常に難しい状況下にある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者は上述のような観点から鋭意研究を重ねた結果
、リパーゼを生産する微生物を培養する際に、微生物保
持材料とともに培養するなどしたばあい、微生物は該保
持材料に付着・増殖し、該保持材料表層付近に比較的密
に生物膜を形成しく以下、「生物膜状増殖」という）、
菌体内のリパーゼ活性が飛躍的に上昇することを見出し
た。すなわち本発明は、リパーゼ生成能を有する微生物
を培養してリパーゼを生産する際に、微生物を微生物保
持材料およびグリセライドもしくは脂肪酸とともに培養
することによって該保持材料に付着・増殖させることを
特徴とする高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法を提
供するものであり、微生物保持材料に付着・増殖した生
物膜状の増殖をさせることを特徴とする高リパーゼ活性
を有する菌体の生産方法を提供するものである。

とくに微生物保持材料を用いるばあいには、リパーゼ生
成能を有する微生物の増殖形態に影響を与える培地組成
、培養操作因子などの影響を最小限に抑制できる。した
がって、リパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産
性を安定的に＾めることができるとともに培地組成、培
養操作条件による影響を抑えることができるため、本発
明の方法は油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
利用できる高リパーゼ活性を有する菌体からなるリパー
ゼ酵素製剤の工業的生産を可能ならしめる。

［作用および実施例］ つぎに本発明の方法をさらに詳しく説明する。

本発明の方法は、リパーゼを生産する微生物、たとえば
リゾプス（ＲｔｌｉＺＯｌ）ＩＩｓ）属の耐熱性菌株で
あるリゾプス・キネンシス（Ｒｈ、ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
）を培養してリパーゼを生産する際に、その増殖形態を
微生物保持材料に付着・増殖させた生物膜状（以下、単
に「生物膜状」と記す。）にすることによって微生物の
リパーゼ生成能を飛躍的に向上させ、高リパーゼ活性を
有する乾燥菌体からなるリパーゼ酵素製剤を生産するも
のである。

このように生物膜状の増殖形態にすることによってリパ
ーゼの生産性が飛躍的に上昇する理由は明らかではない
が、前述のごとくリパーゼ生成を促進するにはリパーゼ
生産に阻害のあるアミノ酸あるいは全アミノＷＩ濃度を
低く保つ必要があり、生物膜状形態で増殖させることに
よってこの条件が推進されたり、あるいはリパーゼの菌
体外への分泌が抑制されることなどがその理由として推
察される。

本発明の方法に適用しつる微生物としてはリパーゼ生成
能を有する微生物であれば任意のものを用いることがで
きるが、リパーゼ生成能の高いリゾプス（Ｒｈｉｚｏρ
ｕｓ）ｆｉ　、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）　Ｂなどをその代表的
なものとしてあげることができる。

微生物保持材料としては、微生物のもつ粘着力、吸着力
により微生物の吸着増殖を可能ならしめる任意の材料が
適用できる。たとえば高分子多孔質材料としては、ポリ
エチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィン系
；ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系：ポリウ
レタン、ポリ塩化ビニル、アクリルアミドまたはポリス
チレンなどのビニル系重合体；ポリエーテル、ポリエス
テル、ポリカーボネートまたはナイロンなどの縮合系：
シリコンおよびフッ素樹脂などの材料、無機材料として
は、セラミックス、ガラス、活性炭、軽石および金属類
などが適用できる。いずれの材料においても微生物を良
好に該微生物保持材料に固定化させるため、空げき率が
６０〜９９％、車位置線長さ当りの孔数が２〜５０個／
αの範囲にある多孔質材料が、空隙率が６０〜９９％で
ある金ぶ加工材料などを使用するのが好ましい。

上記の特徴を有する保持材料を適用することによって、
微生物が増殖をくり返す過程において、微生物固有の粘
着力や保持材料の包括作用などによって微生物が吸着固
定化され、リパーゼの生産に効果的な生物膜状の増殖形
態が実現される。

このような各種保持材料は、微生物の種類および培養条
件によって適宜選択でき、形状についてはたとえば球状
、ブロック状あるいはシート状などに加工して使用する
ことができる。寸法については、微生物の種類、培養条
件および反応器の種類などにより決定できる。おおむね
球状であれば直径１〜１００ｍ、ブロック状のものであ
れば一辺が１〜１００Ｍのものが使用される。

しかしながら、あまり大きすぎると微生物保持材料内で
の菌体の充填率（微生物映の占める容積／微生物保持材
料の見かけの容積）が小さくなり、微生物保持材料内で
の死空間の増大を招き好ましくないので、球状であれば
直径２ｏ！Ｉｎ以下、ブロック状のものであれば１辺の
良さが２０Ｍ以下のものが一層好ましい。

微生物を上記微生物保持材料に吸着、増殖させるには、
通常公知の回分、半回分、連続培養法などを用いて容易
に吸着、増殖させることができる。

本発明の方法において通気は空気、酸素または両者の混
合ガスが用いられ、反応器は攪拌線型または無攪拌機型
の各種、気泡塔型のあらゆる型式のものが適用できるが
、通常、微生物保持材料に吸着、生物膜状増殖させるに
は無攪拌機型の反応器が操作面およびコスト面から一層
好ましい。

さらに本発明の方法により微生物保持材料とともに培養
するばあいの培養条件の決定に関しては、培養条件によ
る増殖形態の変化に伴うリパーゼ生産性の低下は考慮す
ることなく、微生物が微生物保持材料に吸着して増殖す
る範囲内で、工業的生産の立場から微生物保持材料内で
の微生物の増殖速度を最大にするような条件に着目して
選択されればよい。

しかしながら本発明者の研究の結果、リパーゼ生成能の
高い微生物、たとえばリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属
のリゾプス・キネンシス（Ｒｈ。

ｃｈｌｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・プレＮ／　−（Ｒｈ
、ｄｅｌｅｉａｒ）、リゾプス・ジャバニカス（Ｒｈ、
　ｊａｐｏｎｉｃｔｌｓ）、リゾプス・オリゴスポラス
（Ｒｈ、ｏｌｉａｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ニベウ
ス（Ｒｈ、ｎ１ｖｅｕＳ）　、リゾプス◆ジャバニカス
（Ｒｈ、　ｊａＶａｎｉｃｔ１３）、さらにはムコール
・ジャバニカス（ＨｕＣＯｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）　
、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
ｎｉｇｅｒ）などでは、微生物にエステル交換反応に適
するリパーゼを生産させるには培養液中に誘導物質とし
てたとえばオリーブオイルなどのグリセライド、あるい
はオレイン酸などの脂肪酸を添加することが必要であり
、本発明の方法による微生物保持材料を用いるばあいに
おいても同様である。しかし微生物保持材料として親油
性の高分子多孔質材料、たとえばポリウレタンなどを用
いるばあい、これらの誘導物質は微生物保持材料内に吸
収される。したがって誘導物質が多金に微生物保持材料
内に吸収されると、微生物保持材料内への酸素、基質の
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖に対してマイナス要因となる。ひいては微生物保持
材料内での増殖が不可能なため保持材料外での増殖が支
配的になり、微生物保持材料による生物膜状増殖の効果
が失なわれ、リパーゼ生成は促進されなくなる。

したがって培養液中に加えられる誘導物質の口は、微生
物保持材料内での安定した増殖を保ち、リパーゼ生成を
促進し、微生物保持材料外での増殖を抑えるためには１
〜８％、好ましくは２〜５％がよい。

さらに微生物保持材料内での安定した増殖を保ち、微生
物の微生物保持材料からの剥離を抑制するためには、培
養液の乱流強度および培養液中の微生物保持材料の濃度
が重要な因子となる。乱流強度が強すぎると微生物は微
生物保持材料から剥離するし、乱流強喰が弱すぎるばあ
いには微生物保持材料と培養液の固液界面あるいは培養
液と通気ガスとのあいだの気液界面で酸素、基質などの
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖速度は非常に遅くなる。

したがって、微生物保持材料内でのリパーゼを生成する
微生物の安定した増殖を維持するための乱流強度の強さ
として、攪拌磯型の反応器では攪拌レイノルズ数で１０
２〜１０７、好ましくは１０３〜１０５　となる攪拌条
件で操作される。

無攪拌機型の気泡塔では、とくに微生物保持材料からの
微生物の剥離の問題は、通気ガスの吹き抜けが発生する
通気線速度までの範囲において認められない。したがっ
て微生物保持材料内での微生物の迅速なＩ１１殖という
観点から、通気線速度において２Ｃ！Ｒ／ｓｅｃ、好ま
しくは３ｃｔａ／Ｓｅｃ以上で各気泡塔のタイプに応じ
た通気ガスの吹き扱けが発生するまでの通気線速度範囲
で操作される。

一方、培養液中に加えられる微生物保持材料の量（濃度
）については、その量（濃度）があまり少なずぎると微
生物が微生物保持材料に付着して増殖する可能性（機会
）を低下させるため、微生物保持材料内での安定した増
殖を確保するためにはその濃度において１０Ｖ／Ｖ％以
上、好ましくは２０Ｖ／Ｖ％以上加えられる。

つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれらに限定されるものではない。

なお以下の実施例において、菌体および微生物保持材料
に吸着した菌体は、培養液より分離後、水道水で２回洗
浄し、ついで８０％アセトン水溶液で２回洗浄したのち
、常温で２４時間真空乾燥した。

菌体に含有されるリパーゼのエステル交換活性について
は未だ一般的な測定法は確立されていないので、本発明
の方法においては反応基質としてオリーブオイル：ステ
アリン酸メチル：ヘキサン−１：４：２．５からなる混
合物を用い、乾燥菌体を適量加えて４０℃で一定時間エ
ステル交換反応を実施せしめ、生成した１、３−ジステ
アロー２−オレオトリグリセリド（以下、ＳＯ８といす
〉の聞より、１時間あたり１ｇのＳＯ３を生成する酵素
量を１ユニツト（１ｕ）とした。

リパーゼの加水分解活性は、オリーブオイルを分解して
生成したオレイン酸を中和滴定して求める公知の方法で
測定した。

実施例１ 各種微生物をポリペプトン（大五栄１１味製）７％、Ｎ
ａＮＯ３０，１％、ＫＨ２ＰＯａｏ、　１％、８０３０
４０．０５％、オレイン酸２％からなる培地で初発ｐＨ
５，６、温度２８°Ｃで４日ＩＨ［ｉ）培養Ｌｒ＝。

微生物保持材料としてはポリウレタンフォーム（１辺６
ｍのブロック状のもの（ブリジストン＠製、エバーライ
トスコツトＨＲ−４０１１を　１００個／１００ａｆ！
培地となるように加えた（１７．８Ｖ／Ｖ％）。対照と
して微生物保持材料を加えないばあいの振盪培養もあわ
せて行ない、乾燥菌体内の活性を第１表に比較して示し
た。

リパーゼ生成能を有する微生物を微生物保持材料ととも
に培養することにより、乾燥菌体中のエステル交換活性
と加水分解活性がともに上昇した。

［以下余白コ 実施例２ 微生物としてリゾプス・キネンシスを用いて、実施例１
のポリペプトンのかわりにリパーゼ生成には不適なアミ
ノ酸組成を有する有機窒素源であり通常の回分培養では
微生物はパルピー状の増殖形態を示す有機窒素源である
イーストペプトン（フードスプリンガー＠製）、プロエ
キスＰ（播州調味料■製）、肉エキス（和光純薬味製）
の各々を用いて実施例１と同様に振盪培養を行ない、取
得した微生物についてその活性を比較した。結果を第２
表に示す。

リパーゼ生成に不適な有機窒素源を用いても、微生物保
持材料とともに培養することによってエステル交換活性
、加水分解活性ともに上昇した。

［以下余白］ 実施例３ 微生物としてリゾプス・デレマーを用い、グルコース１
％、ポリペプトン７％、ＮａＮＯ３０，１％、に’ｔｈ
ＰＯａ　　０．１％、ＨＱＳＯ４０，０５％からなる培
地で２８℃にて２４時間前培養を行ない種母を調製した
。

５ｆ１１１痒壇ジヤーフアーメンタ−（いわしや生物化
学■製、ＨＢ−ｃ−５、攪拌翼外径＝８１）を用い、つ
ぎの条件で回分培養を行なった。

使用培地組成：イーストペプトン７％、ＮａＮＯ３０，
１％、に８２ＰＯ４０，１％、ＨＯ３Ｏ４０，０５％、
オリーブオイ ル２％、 ｐＨ５，６、 攪拌数　４０Ｏｒｐｍ。

通気ｔ　　ｏ、ｓｖｖ＋ 温度３０℃ 微生物保持材料として１辺６Ｍのブロック状ナイロン（
空隙率９５〜９８％、孔数３０個／　ｃｔｘ　）を１５
００個／ＩＪＩ培地（７）　１３　ＩＩ　（２４，５Ｖ
／Ｖ％）で加えた。

あわせて微生物保持材料を加えない対照実験を行ない、
第１図に比較して示したように培養経時における乾燥菌
体におけるエステル交換活性を測定した。

微生物保持材料とともに培養することによってエステル
交換活性は上昇した。

実施例４ 微生物としてリゾプス・オリゴスポラスを用い、実施例
３と同様にして種母を調製した。

第２図に示づ形状の気泡塔を用い、通気線速ａ　３．２
＋７１／　ＳｅＣ（１５ｃｔｘφ断面基準）、温度３０
℃。

ｐＨ５，６で回分培養を行なった。

使用した培地は実施例３のイーストペプトンのかわりに
肉エキスを用いたほかは実施例３と同じであった。

微生物保持材料として球状のステンレス加工材料（直径
５ｍ、空隙率８０〜８５％〉を１５００個／１となるよ
うに加えた（１５．８Ｖ／Ｖ％）、微生物保持材料を用
いないで培養を行なった対照実験での乾燥菌体の活性と
の比較を第３図に示した。

気泡塔においても微生物保持材料とともに培養すること
によってエステル交換活性は上昇した。

［発明の効果］ 本発明によれば、微生物保持材料に付着・増殖させた生
物膜状の増殖をさせることによって微生物のリパーゼ生
成能を有効かつ安定的に引き出すことができる。さらに
また、本発明によれば、培地条件、培養操作条件の増殖
形態への影響を排除できるので、培養における安価な有
機窒素源の利用、攪拌および通気条件などの緩和を可能
とするばかりではなく、微生物は微生物保持材料に吸着
されているため乾燥菌体製造の際のび過、水洗、アセト
ン洗浄、乾燥などの各工程における操作性の向上など、
リパーゼ活性を有し、エステル交換反応、油脂加水分解
反応に利用されるリパーゼを包蔵した菌体の工業的生産
に非常に好都合である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３においてリゾプス・デレマーを微生
物保持材料とともにＩ８￥１したばあいと対照のばあい
における乾燥菌体のエステル交換活性を経時的に比較し
て示したグラフ、第２図は、実施例４において回分培養
に用いた気泡塔を示ず模式図、第３図は、実施例４にお
いてリゾプス・オリゴスポラスを微生物保持材料ととも
に培養したばあいと対照のばあいにおける乾燥菌体のエ
ステル交換活性を経時的に比較して示したグラフである
。 才１２ 通気力゛ス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　リパーゼ生成能を有する微生物を培養してリパーゼ
   を生産する際に、微生物を微生物保持材料およびグリセ
   ライドもしくは脂肪酸とともに培養することによって該
   保持材料に付着・増殖させることを特徴とする高リパー
   ゼ活性を有する菌体の生産方法。 ２　リパーゼ生成能を有する微生物がリゾプス（Ｒｈｉ
   ｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはムコール（Ｍｕｃ
   ｏｒ）属に属する微生物である特許請求の範囲第１項記
   載の生産方法。