JPS63146782A - 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法 - Google Patents
高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法Info
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- JPS63146782A JPS63146782A JP61293754A JP29375486A JPS63146782A JP S63146782 A JPS63146782 A JP S63146782A JP 61293754 A JP61293754 A JP 61293754A JP 29375486 A JP29375486 A JP 29375486A JP S63146782 A JPS63146782 A JP S63146782A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野1
本発明は微生物によるリパーゼの生産方法に関する。さ
らに詳しくは、リパーゼ生成能を有する微生物を用いて
リパーゼを生産する際に、微生物保持材料とともに培養
するなどして該微生物の増殖生態を該保持材料に付着・
増殖した生物膜状にすることにより該微生物のリパーゼ
生成能を飛躍的かつ安定的に向上させることを特徴とす
る高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法に関し、本発
明によって油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
適する高リパーゼ活性を有する菌体が生産される。
らに詳しくは、リパーゼ生成能を有する微生物を用いて
リパーゼを生産する際に、微生物保持材料とともに培養
するなどして該微生物の増殖生態を該保持材料に付着・
増殖した生物膜状にすることにより該微生物のリパーゼ
生成能を飛躍的かつ安定的に向上させることを特徴とす
る高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法に関し、本発
明によって油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
適する高リパーゼ活性を有する菌体が生産される。
[従来の技術]
リパーゼは元来、油脂の加水分解反応に対し触媒作用を
有する酵素に与えられた総称であり、動物界では膵臓、
肝臓などに、植物界ではとマシ、燕麦などに、また微生
物界ではカビ、酵母、バクテリアなどに見出される。し
かしながら酵素資源としての見地からは、動物臓器や植
物種子を給源とするものは無尽蔵にうることができず、
また水に抽出されにくく不安定であるという難点をもっ
ている。これに対し微生物起源のものは自然界に多種多
様に存在する微生物のうちから目的にあったリパーゼを
生産するものを選び出し、その培養条件を種々変更する
ことによって人為的に酵素の生産性を高めることができ
るので工業生産には有利である。このような背景から、
たとえばマーガリーン、ショートニングなどの加工脂の
製造において水素添加とならぶ重要な技術である油脂の
エステル交換反応などに利用されるリパーゼは、大部分
が微生物によって工業生産されている。
有する酵素に与えられた総称であり、動物界では膵臓、
肝臓などに、植物界ではとマシ、燕麦などに、また微生
物界ではカビ、酵母、バクテリアなどに見出される。し
かしながら酵素資源としての見地からは、動物臓器や植
物種子を給源とするものは無尽蔵にうることができず、
また水に抽出されにくく不安定であるという難点をもっ
ている。これに対し微生物起源のものは自然界に多種多
様に存在する微生物のうちから目的にあったリパーゼを
生産するものを選び出し、その培養条件を種々変更する
ことによって人為的に酵素の生産性を高めることができ
るので工業生産には有利である。このような背景から、
たとえばマーガリーン、ショートニングなどの加工脂の
製造において水素添加とならぶ重要な技術である油脂の
エステル交換反応などに利用されるリパーゼは、大部分
が微生物によって工業生産されている。
微生物によるリパーゼの工業生産においては、酵素精製
の簡便さの観点から菌体外リパーゼをうろことを目標に
して微生物のスクリーニングを行ない、それぞれの微生
物を最適な培養条件で培養したのち菌体外に分泌された
リパーゼを分離、精製して市販している。
の簡便さの観点から菌体外リパーゼをうろことを目標に
して微生物のスクリーニングを行ない、それぞれの微生
物を最適な培養条件で培養したのち菌体外に分泌された
リパーゼを分離、精製して市販している。
現在報告されている酵素法による油脂エステル交換反応
などの技術の大部分は、このようにしてえられた市販酵
素をセライトなどの担体に固定化して利用している。
などの技術の大部分は、このようにしてえられた市販酵
素をセライトなどの担体に固定化して利用している。
酵素法によるエステル交換反応においては、その反応系
の水分量をコントロールすることが油脂の加水分解によ
るジグリセリドなどの17’l生成、あるいは交換能の
収率低下を避ける上で重要なポイントとされている。こ
のような実情において、油脂の加水分解を抑制しエステ
ル交換反応を効率よく行なわせるために、たとえばつぎ
のような方法が報告されている。
の水分量をコントロールすることが油脂の加水分解によ
るジグリセリドなどの17’l生成、あるいは交換能の
収率低下を避ける上で重要なポイントとされている。こ
のような実情において、油脂の加水分解を抑制しエステ
ル交換反応を効率よく行なわせるために、たとえばつぎ
のような方法が報告されている。
イ)油脂のエステル交換に際し、水のかわりにリパーゼ
活性化剤として低級多価アルコールを用いる方法(特公
昭57−6480号公報)。
活性化剤として低級多価アルコールを用いる方法(特公
昭57−6480号公報)。
(01油脂のエステル交換反応系に界面活性剤(乳化剤
)を加え、界面で油脂とリパーゼを効率よく接触さぜる
方法〈特開昭57−198798号公報)。
)を加え、界面で油脂とリパーゼを効率よく接触さぜる
方法〈特開昭57−198798号公報)。
四吸水性樹脂を用いて水分量をコントロールすることに
よりエステル交換反応速度を高める方法(特開昭58−
116689号公報)。
よりエステル交換反応速度を高める方法(特開昭58−
116689号公報)。
に)高融点の脂肪酸を用いるかわりに低融点の脂肪酸の
低級アルコールエステルを用いることにより反応をより
均一に行なう方法(特公昭51−27159号公報)。
低級アルコールエステルを用いることにより反応をより
均一に行なう方法(特公昭51−27159号公報)。
(ホ)溶剤蒸気を乾燥循環することで反応系中の水分を
コントロールする方法(特開昭58−500638号公
報)。
コントロールする方法(特開昭58−500638号公
報)。
しかしながら、これらの方法は反応速度が遅い、加水分
解反応の抑制が不充分、工程の煩雑化、リパーゼの回収
再利用への障害などの問題をかかえており、工業的利用
を考えたばあいどれも不充分なものといわざるをえない
。
解反応の抑制が不充分、工程の煩雑化、リパーゼの回収
再利用への障害などの問題をかかえており、工業的利用
を考えたばあいどれも不充分なものといわざるをえない
。
このような実情のもとに本発明者らは、油脂の加水分解
を抑制し、エステル交換反応を効率よく行なわせる方法
として、リパーゼを生産する微生物を培養して、そのリ
パーゼを菌体内に包蔵した状態の乾燥菌体を前述の方法
のリパーゼ酵素製剤にかわるものとして用いることによ
って、エステル交換反応速度を高め、かつ反応を長時間
安定的に持続させうることを見出し、すでに報告した(
特開昭60−34189号公報)。
を抑制し、エステル交換反応を効率よく行なわせる方法
として、リパーゼを生産する微生物を培養して、そのリ
パーゼを菌体内に包蔵した状態の乾燥菌体を前述の方法
のリパーゼ酵素製剤にかわるものとして用いることによ
って、エステル交換反応速度を高め、かつ反応を長時間
安定的に持続させうることを見出し、すでに報告した(
特開昭60−34189号公報)。
[発明が解決しようとする問題点コ
しかしながら、このような乾燥菌体を用いるエステル交
換反応においては、乾燥菌体の有するリパーゼ活性、す
なわちリパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産性
を高めるような培養条件、また乾燥菌体として用いるが
ゆえに、生産されたリパーゼをできるだけ菌体外に分泌
させないような培養条件の決定が重要となる。
換反応においては、乾燥菌体の有するリパーゼ活性、す
なわちリパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産性
を高めるような培養条件、また乾燥菌体として用いるが
ゆえに、生産されたリパーゼをできるだけ菌体外に分泌
させないような培養条件の決定が重要となる。
本発明者らは上述の培養条件の決定について鋭意研究し
た結果、その培地成分に関してリパーゼ生成に阻害作用
を有するアミノ酸群が存在し、これら阻害作用の大きい
アミノ酸群の含有率の低い有機窒素源をその培地の主成
分として用いることによってリパーゼ生成能を有する微
生物のリパーゼ生成能を高めうること、またアミノ酸ま
たはアミノMおよびペプチドを主成分とする基質を流加
することによって培養液中のアミノ酸濃度を低濁度に保
ちながら培養づることによってリパーゼ生成能を有する
微生物のリパーゼ生成能を高めうることをすでに見出し
ている。
た結果、その培地成分に関してリパーゼ生成に阻害作用
を有するアミノ酸群が存在し、これら阻害作用の大きい
アミノ酸群の含有率の低い有機窒素源をその培地の主成
分として用いることによってリパーゼ生成能を有する微
生物のリパーゼ生成能を高めうること、またアミノ酸ま
たはアミノMおよびペプチドを主成分とする基質を流加
することによって培養液中のアミノ酸濃度を低濁度に保
ちながら培養づることによってリパーゼ生成能を有する
微生物のリパーゼ生成能を高めうることをすでに見出し
ている。
しかしながら、上記2つの方法によっても攪拌数、通気
最、l!痒ペラの位置、培養槽の幾何学的形状、培養液
mなどの諸物理的操作因子の微生物のリパーゼ生成能へ
の影響は複雑であり、前述の培地組成をコントロールす
る方法においてもリパーゼ活性は上昇させうるものの、
安定した一定レベルの高活性をうる操作条件を決定する
ことは非常に困難である。
最、l!痒ペラの位置、培養槽の幾何学的形状、培養液
mなどの諸物理的操作因子の微生物のリパーゼ生成能へ
の影響は複雑であり、前述の培地組成をコントロールす
る方法においてもリパーゼ活性は上昇させうるものの、
安定した一定レベルの高活性をうる操作条件を決定する
ことは非常に困難である。
とくにリパーゼ生成能を有する微生物を培養してリパー
ゼを生産する際には、天然物である有機窒素源の利用が
必須であるため、天然物である有機窒素源のその成分、
組成の不安定さとあいまって、培養条件の決定、ひいて
は工業的利用を考えたばあいにそのスケールアップは非
常に難しい状況下にある。
ゼを生産する際には、天然物である有機窒素源の利用が
必須であるため、天然物である有機窒素源のその成分、
組成の不安定さとあいまって、培養条件の決定、ひいて
は工業的利用を考えたばあいにそのスケールアップは非
常に難しい状況下にある。
[問題点を解決するための手段]
本発明者は上述のような観点から鋭意研究を重ねた結果
、リパーゼを生産する微生物を培養する際に、微生物保
持材料とともに培養するなどしたばあい、微生物は該保
持材料に付着・増殖し、該保持材料表層付近に比較的密
に生物膜を形成しく以下、「生物膜状増殖」という)、
菌体内のリパーゼ活性が飛躍的に上昇することを見出し
た。すなわち本発明は、リパーゼ生成能を有する微生物
を培養してリパーゼを生産する際に、微生物を微生物保
持材料およびグリセライドもしくは脂肪酸とともに培養
することによって該保持材料に付着・増殖させることを
特徴とする高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法を提
供するものであり、微生物保持材料に付着・増殖した生
物膜状の増殖をさせることを特徴とする高リパーゼ活性
を有する菌体の生産方法を提供するものである。
、リパーゼを生産する微生物を培養する際に、微生物保
持材料とともに培養するなどしたばあい、微生物は該保
持材料に付着・増殖し、該保持材料表層付近に比較的密
に生物膜を形成しく以下、「生物膜状増殖」という)、
菌体内のリパーゼ活性が飛躍的に上昇することを見出し
た。すなわち本発明は、リパーゼ生成能を有する微生物
を培養してリパーゼを生産する際に、微生物を微生物保
持材料およびグリセライドもしくは脂肪酸とともに培養
することによって該保持材料に付着・増殖させることを
特徴とする高リパーゼ活性を有する菌体の生産方法を提
供するものであり、微生物保持材料に付着・増殖した生
物膜状の増殖をさせることを特徴とする高リパーゼ活性
を有する菌体の生産方法を提供するものである。
とくに微生物保持材料を用いるばあいには、リパーゼ生
成能を有する微生物の増殖形態に影響を与える培地組成
、培養操作因子などの影響を最小限に抑制できる。した
がって、リパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産
性を安定的に^めることができるとともに培地組成、培
養操作条件による影響を抑えることができるため、本発
明の方法は油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
利用できる高リパーゼ活性を有する菌体からなるリパー
ゼ酵素製剤の工業的生産を可能ならしめる。
成能を有する微生物の増殖形態に影響を与える培地組成
、培養操作因子などの影響を最小限に抑制できる。した
がって、リパーゼ生成能を有する微生物のリパーゼ生産
性を安定的に^めることができるとともに培地組成、培
養操作条件による影響を抑えることができるため、本発
明の方法は油脂エステル交換反応や油脂加水分解反応に
利用できる高リパーゼ活性を有する菌体からなるリパー
ゼ酵素製剤の工業的生産を可能ならしめる。
[作用および実施例]
つぎに本発明の方法をさらに詳しく説明する。
本発明の方法は、リパーゼを生産する微生物、たとえば
リゾプス(RtliZOl)IIs)属の耐熱性菌株で
あるリゾプス・キネンシス(Rh、chinensis
)を培養してリパーゼを生産する際に、その増殖形態を
微生物保持材料に付着・増殖させた生物膜状(以下、単
に「生物膜状」と記す。)にすることによって微生物の
リパーゼ生成能を飛躍的に向上させ、高リパーゼ活性を
有する乾燥菌体からなるリパーゼ酵素製剤を生産するも
のである。
リゾプス(RtliZOl)IIs)属の耐熱性菌株で
あるリゾプス・キネンシス(Rh、chinensis
)を培養してリパーゼを生産する際に、その増殖形態を
微生物保持材料に付着・増殖させた生物膜状(以下、単
に「生物膜状」と記す。)にすることによって微生物の
リパーゼ生成能を飛躍的に向上させ、高リパーゼ活性を
有する乾燥菌体からなるリパーゼ酵素製剤を生産するも
のである。
このように生物膜状の増殖形態にすることによってリパ
ーゼの生産性が飛躍的に上昇する理由は明らかではない
が、前述のごとくリパーゼ生成を促進するにはリパーゼ
生産に阻害のあるアミノ酸あるいは全アミノWI濃度を
低く保つ必要があり、生物膜状形態で増殖させることに
よってこの条件が推進されたり、あるいはリパーゼの菌
体外への分泌が抑制されることなどがその理由として推
察される。
ーゼの生産性が飛躍的に上昇する理由は明らかではない
が、前述のごとくリパーゼ生成を促進するにはリパーゼ
生産に阻害のあるアミノ酸あるいは全アミノWI濃度を
低く保つ必要があり、生物膜状形態で増殖させることに
よってこの条件が推進されたり、あるいはリパーゼの菌
体外への分泌が抑制されることなどがその理由として推
察される。
本発明の方法に適用しつる微生物としてはリパーゼ生成
能を有する微生物であれば任意のものを用いることがで
きるが、リパーゼ生成能の高いリゾプス(Rhizoρ
us)fi 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ムコール(Mucor) Bなどをその代表的
なものとしてあげることができる。
能を有する微生物であれば任意のものを用いることがで
きるが、リパーゼ生成能の高いリゾプス(Rhizoρ
us)fi 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ムコール(Mucor) Bなどをその代表的
なものとしてあげることができる。
微生物保持材料としては、微生物のもつ粘着力、吸着力
により微生物の吸着増殖を可能ならしめる任意の材料が
適用できる。たとえば高分子多孔質材料としては、ポリ
エチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィン系
;ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系:ポリウ
レタン、ポリ塩化ビニル、アクリルアミドまたはポリス
チレンなどのビニル系重合体;ポリエーテル、ポリエス
テル、ポリカーボネートまたはナイロンなどの縮合系:
シリコンおよびフッ素樹脂などの材料、無機材料として
は、セラミックス、ガラス、活性炭、軽石および金属類
などが適用できる。いずれの材料においても微生物を良
好に該微生物保持材料に固定化させるため、空げき率が
60〜99%、車位置線長さ当りの孔数が2〜50個/
αの範囲にある多孔質材料が、空隙率が60〜99%で
ある金ぶ加工材料などを使用するのが好ましい。
により微生物の吸着増殖を可能ならしめる任意の材料が
適用できる。たとえば高分子多孔質材料としては、ポリ
エチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィン系
;ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系:ポリウ
レタン、ポリ塩化ビニル、アクリルアミドまたはポリス
チレンなどのビニル系重合体;ポリエーテル、ポリエス
テル、ポリカーボネートまたはナイロンなどの縮合系:
シリコンおよびフッ素樹脂などの材料、無機材料として
は、セラミックス、ガラス、活性炭、軽石および金属類
などが適用できる。いずれの材料においても微生物を良
好に該微生物保持材料に固定化させるため、空げき率が
60〜99%、車位置線長さ当りの孔数が2〜50個/
αの範囲にある多孔質材料が、空隙率が60〜99%で
ある金ぶ加工材料などを使用するのが好ましい。
上記の特徴を有する保持材料を適用することによって、
微生物が増殖をくり返す過程において、微生物固有の粘
着力や保持材料の包括作用などによって微生物が吸着固
定化され、リパーゼの生産に効果的な生物膜状の増殖形
態が実現される。
微生物が増殖をくり返す過程において、微生物固有の粘
着力や保持材料の包括作用などによって微生物が吸着固
定化され、リパーゼの生産に効果的な生物膜状の増殖形
態が実現される。
このような各種保持材料は、微生物の種類および培養条
件によって適宜選択でき、形状についてはたとえば球状
、ブロック状あるいはシート状などに加工して使用する
ことができる。寸法については、微生物の種類、培養条
件および反応器の種類などにより決定できる。おおむね
球状であれば直径1〜100m、ブロック状のものであ
れば一辺が1〜100Mのものが使用される。
件によって適宜選択でき、形状についてはたとえば球状
、ブロック状あるいはシート状などに加工して使用する
ことができる。寸法については、微生物の種類、培養条
件および反応器の種類などにより決定できる。おおむね
球状であれば直径1〜100m、ブロック状のものであ
れば一辺が1〜100Mのものが使用される。
しかしながら、あまり大きすぎると微生物保持材料内で
の菌体の充填率(微生物映の占める容積/微生物保持材
料の見かけの容積)が小さくなり、微生物保持材料内で
の死空間の増大を招き好ましくないので、球状であれば
直径2o!In以下、ブロック状のものであれば1辺の
良さが20M以下のものが一層好ましい。
の菌体の充填率(微生物映の占める容積/微生物保持材
料の見かけの容積)が小さくなり、微生物保持材料内で
の死空間の増大を招き好ましくないので、球状であれば
直径2o!In以下、ブロック状のものであれば1辺の
良さが20M以下のものが一層好ましい。
微生物を上記微生物保持材料に吸着、増殖させるには、
通常公知の回分、半回分、連続培養法などを用いて容易
に吸着、増殖させることができる。
通常公知の回分、半回分、連続培養法などを用いて容易
に吸着、増殖させることができる。
本発明の方法において通気は空気、酸素または両者の混
合ガスが用いられ、反応器は攪拌線型または無攪拌機型
の各種、気泡塔型のあらゆる型式のものが適用できるが
、通常、微生物保持材料に吸着、生物膜状増殖させるに
は無攪拌機型の反応器が操作面およびコスト面から一層
好ましい。
合ガスが用いられ、反応器は攪拌線型または無攪拌機型
の各種、気泡塔型のあらゆる型式のものが適用できるが
、通常、微生物保持材料に吸着、生物膜状増殖させるに
は無攪拌機型の反応器が操作面およびコスト面から一層
好ましい。
さらに本発明の方法により微生物保持材料とともに培養
するばあいの培養条件の決定に関しては、培養条件によ
る増殖形態の変化に伴うリパーゼ生産性の低下は考慮す
ることなく、微生物が微生物保持材料に吸着して増殖す
る範囲内で、工業的生産の立場から微生物保持材料内で
の微生物の増殖速度を最大にするような条件に着目して
選択されればよい。
するばあいの培養条件の決定に関しては、培養条件によ
る増殖形態の変化に伴うリパーゼ生産性の低下は考慮す
ることなく、微生物が微生物保持材料に吸着して増殖す
る範囲内で、工業的生産の立場から微生物保持材料内で
の微生物の増殖速度を最大にするような条件に着目して
選択されればよい。
しかしながら本発明者の研究の結果、リパーゼ生成能の
高い微生物、たとえばリゾプス(Rhizopus)属
のリゾプス・キネンシス(Rh。
高い微生物、たとえばリゾプス(Rhizopus)属
のリゾプス・キネンシス(Rh。
chlnensis)、リゾプス・プレN/ −(Rh
、deleiar)、リゾプス・ジャバニカス(Rh、
japonictls)、リゾプス・オリゴスポラス
(Rh、oliaosporus)、リゾプス・ニベウ
ス(Rh、n1veuS) 、リゾプス◆ジャバニカス
(Rh、 jaVanict13)、さらにはムコール
・ジャバニカス(HuCOr javanicus)
、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger)などでは、微生物にエステル交換反応に適
するリパーゼを生産させるには培養液中に誘導物質とし
てたとえばオリーブオイルなどのグリセライド、あるい
はオレイン酸などの脂肪酸を添加することが必要であり
、本発明の方法による微生物保持材料を用いるばあいに
おいても同様である。しかし微生物保持材料として親油
性の高分子多孔質材料、たとえばポリウレタンなどを用
いるばあい、これらの誘導物質は微生物保持材料内に吸
収される。したがって誘導物質が多金に微生物保持材料
内に吸収されると、微生物保持材料内への酸素、基質の
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖に対してマイナス要因となる。ひいては微生物保持
材料内での増殖が不可能なため保持材料外での増殖が支
配的になり、微生物保持材料による生物膜状増殖の効果
が失なわれ、リパーゼ生成は促進されなくなる。
、deleiar)、リゾプス・ジャバニカス(Rh、
japonictls)、リゾプス・オリゴスポラス
(Rh、oliaosporus)、リゾプス・ニベウ
ス(Rh、n1veuS) 、リゾプス◆ジャバニカス
(Rh、 jaVanict13)、さらにはムコール
・ジャバニカス(HuCOr javanicus)
、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger)などでは、微生物にエステル交換反応に適
するリパーゼを生産させるには培養液中に誘導物質とし
てたとえばオリーブオイルなどのグリセライド、あるい
はオレイン酸などの脂肪酸を添加することが必要であり
、本発明の方法による微生物保持材料を用いるばあいに
おいても同様である。しかし微生物保持材料として親油
性の高分子多孔質材料、たとえばポリウレタンなどを用
いるばあい、これらの誘導物質は微生物保持材料内に吸
収される。したがって誘導物質が多金に微生物保持材料
内に吸収されると、微生物保持材料内への酸素、基質の
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖に対してマイナス要因となる。ひいては微生物保持
材料内での増殖が不可能なため保持材料外での増殖が支
配的になり、微生物保持材料による生物膜状増殖の効果
が失なわれ、リパーゼ生成は促進されなくなる。
したがって培養液中に加えられる誘導物質の口は、微生
物保持材料内での安定した増殖を保ち、リパーゼ生成を
促進し、微生物保持材料外での増殖を抑えるためには1
〜8%、好ましくは2〜5%がよい。
物保持材料内での安定した増殖を保ち、リパーゼ生成を
促進し、微生物保持材料外での増殖を抑えるためには1
〜8%、好ましくは2〜5%がよい。
さらに微生物保持材料内での安定した増殖を保ち、微生
物の微生物保持材料からの剥離を抑制するためには、培
養液の乱流強度および培養液中の微生物保持材料の濃度
が重要な因子となる。乱流強度が強すぎると微生物は微
生物保持材料から剥離するし、乱流強喰が弱すぎるばあ
いには微生物保持材料と培養液の固液界面あるいは培養
液と通気ガスとのあいだの気液界面で酸素、基質などの
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖速度は非常に遅くなる。
物の微生物保持材料からの剥離を抑制するためには、培
養液の乱流強度および培養液中の微生物保持材料の濃度
が重要な因子となる。乱流強度が強すぎると微生物は微
生物保持材料から剥離するし、乱流強喰が弱すぎるばあ
いには微生物保持材料と培養液の固液界面あるいは培養
液と通気ガスとのあいだの気液界面で酸素、基質などの
移動抵抗が大きくなり、微生物保持材料内での微生物の
増殖速度は非常に遅くなる。
したがって、微生物保持材料内でのリパーゼを生成する
微生物の安定した増殖を維持するための乱流強度の強さ
として、攪拌磯型の反応器では攪拌レイノルズ数で10
2〜107、好ましくは103〜105 となる攪拌条
件で操作される。
微生物の安定した増殖を維持するための乱流強度の強さ
として、攪拌磯型の反応器では攪拌レイノルズ数で10
2〜107、好ましくは103〜105 となる攪拌条
件で操作される。
無攪拌機型の気泡塔では、とくに微生物保持材料からの
微生物の剥離の問題は、通気ガスの吹き抜けが発生する
通気線速度までの範囲において認められない。したがっ
て微生物保持材料内での微生物の迅速なI11殖という
観点から、通気線速度において2C!R/sec、好ま
しくは3cta/Sec以上で各気泡塔のタイプに応じ
た通気ガスの吹き扱けが発生するまでの通気線速度範囲
で操作される。
微生物の剥離の問題は、通気ガスの吹き抜けが発生する
通気線速度までの範囲において認められない。したがっ
て微生物保持材料内での微生物の迅速なI11殖という
観点から、通気線速度において2C!R/sec、好ま
しくは3cta/Sec以上で各気泡塔のタイプに応じ
た通気ガスの吹き扱けが発生するまでの通気線速度範囲
で操作される。
一方、培養液中に加えられる微生物保持材料の量(濃度
)については、その量(濃度)があまり少なずぎると微
生物が微生物保持材料に付着して増殖する可能性(機会
)を低下させるため、微生物保持材料内での安定した増
殖を確保するためにはその濃度において10V/V%以
上、好ましくは20V/V%以上加えられる。
)については、その量(濃度)があまり少なずぎると微
生物が微生物保持材料に付着して増殖する可能性(機会
)を低下させるため、微生物保持材料内での安定した増
殖を確保するためにはその濃度において10V/V%以
上、好ましくは20V/V%以上加えられる。
つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれらに限定されるものではない。
、本発明はもとよりこれらに限定されるものではない。
なお以下の実施例において、菌体および微生物保持材料
に吸着した菌体は、培養液より分離後、水道水で2回洗
浄し、ついで80%アセトン水溶液で2回洗浄したのち
、常温で24時間真空乾燥した。
に吸着した菌体は、培養液より分離後、水道水で2回洗
浄し、ついで80%アセトン水溶液で2回洗浄したのち
、常温で24時間真空乾燥した。
菌体に含有されるリパーゼのエステル交換活性について
は未だ一般的な測定法は確立されていないので、本発明
の方法においては反応基質としてオリーブオイル:ステ
アリン酸メチル:ヘキサン−1:4:2.5からなる混
合物を用い、乾燥菌体を適量加えて40℃で一定時間エ
ステル交換反応を実施せしめ、生成した1、3−ジステ
アロー2−オレオトリグリセリド(以下、SO8といす
〉の聞より、1時間あたり1gのSO3を生成する酵素
量を1ユニツト(1u)とした。
は未だ一般的な測定法は確立されていないので、本発明
の方法においては反応基質としてオリーブオイル:ステ
アリン酸メチル:ヘキサン−1:4:2.5からなる混
合物を用い、乾燥菌体を適量加えて40℃で一定時間エ
ステル交換反応を実施せしめ、生成した1、3−ジステ
アロー2−オレオトリグリセリド(以下、SO8といす
〉の聞より、1時間あたり1gのSO3を生成する酵素
量を1ユニツト(1u)とした。
リパーゼの加水分解活性は、オリーブオイルを分解して
生成したオレイン酸を中和滴定して求める公知の方法で
測定した。
生成したオレイン酸を中和滴定して求める公知の方法で
測定した。
実施例1
各種微生物をポリペプトン(大五栄11味製)7%、N
aNO30,1%、KH2POao、 1%、8030
40.05%、オレイン酸2%からなる培地で初発pH
5,6、温度28°Cで4日IH[i)培養Lr=。
aNO30,1%、KH2POao、 1%、8030
40.05%、オレイン酸2%からなる培地で初発pH
5,6、温度28°Cで4日IH[i)培養Lr=。
微生物保持材料としてはポリウレタンフォーム(1辺6
mのブロック状のもの(ブリジストン@製、エバーライ
トスコツトHR−4011を 100個/100af!
培地となるように加えた(17.8V/V%)。対照と
して微生物保持材料を加えないばあいの振盪培養もあわ
せて行ない、乾燥菌体内の活性を第1表に比較して示し
た。
mのブロック状のもの(ブリジストン@製、エバーライ
トスコツトHR−4011を 100個/100af!
培地となるように加えた(17.8V/V%)。対照と
して微生物保持材料を加えないばあいの振盪培養もあわ
せて行ない、乾燥菌体内の活性を第1表に比較して示し
た。
リパーゼ生成能を有する微生物を微生物保持材料ととも
に培養することにより、乾燥菌体中のエステル交換活性
と加水分解活性がともに上昇した。
に培養することにより、乾燥菌体中のエステル交換活性
と加水分解活性がともに上昇した。
[以下余白コ
実施例2
微生物としてリゾプス・キネンシスを用いて、実施例1
のポリペプトンのかわりにリパーゼ生成には不適なアミ
ノ酸組成を有する有機窒素源であり通常の回分培養では
微生物はパルピー状の増殖形態を示す有機窒素源である
イーストペプトン(フードスプリンガー@製)、プロエ
キスP(播州調味料■製)、肉エキス(和光純薬味製)
の各々を用いて実施例1と同様に振盪培養を行ない、取
得した微生物についてその活性を比較した。結果を第2
表に示す。
のポリペプトンのかわりにリパーゼ生成には不適なアミ
ノ酸組成を有する有機窒素源であり通常の回分培養では
微生物はパルピー状の増殖形態を示す有機窒素源である
イーストペプトン(フードスプリンガー@製)、プロエ
キスP(播州調味料■製)、肉エキス(和光純薬味製)
の各々を用いて実施例1と同様に振盪培養を行ない、取
得した微生物についてその活性を比較した。結果を第2
表に示す。
リパーゼ生成に不適な有機窒素源を用いても、微生物保
持材料とともに培養することによってエステル交換活性
、加水分解活性ともに上昇した。
持材料とともに培養することによってエステル交換活性
、加水分解活性ともに上昇した。
[以下余白]
実施例3
微生物としてリゾプス・デレマーを用い、グルコース1
%、ポリペプトン7%、NaNO30,1%、に’th
POa 0.1%、HQSO40,05%からなる培
地で28℃にて24時間前培養を行ない種母を調製した
。
%、ポリペプトン7%、NaNO30,1%、に’th
POa 0.1%、HQSO40,05%からなる培
地で28℃にて24時間前培養を行ない種母を調製した
。
5f111痒壇ジヤーフアーメンタ−(いわしや生物化
学■製、HB−c−5、攪拌翼外径=81)を用い、つ
ぎの条件で回分培養を行なった。
学■製、HB−c−5、攪拌翼外径=81)を用い、つ
ぎの条件で回分培養を行なった。
使用培地組成:イーストペプトン7%、NaNO30,
1%、に82PO40,1%、HO3O40,05%、
オリーブオイ ル2%、 pH5,6、 攪拌数 40Orpm。
1%、に82PO40,1%、HO3O40,05%、
オリーブオイ ル2%、 pH5,6、 攪拌数 40Orpm。
通気t o、svv+
温度30℃
微生物保持材料として1辺6Mのブロック状ナイロン(
空隙率95〜98%、孔数30個/ ctx )を15
00個/IJI培地(7) 13 II (24,5V
/V%)で加えた。
空隙率95〜98%、孔数30個/ ctx )を15
00個/IJI培地(7) 13 II (24,5V
/V%)で加えた。
あわせて微生物保持材料を加えない対照実験を行ない、
第1図に比較して示したように培養経時における乾燥菌
体におけるエステル交換活性を測定した。
第1図に比較して示したように培養経時における乾燥菌
体におけるエステル交換活性を測定した。
微生物保持材料とともに培養することによってエステル
交換活性は上昇した。
交換活性は上昇した。
実施例4
微生物としてリゾプス・オリゴスポラスを用い、実施例
3と同様にして種母を調製した。
3と同様にして種母を調製した。
第2図に示づ形状の気泡塔を用い、通気線速a 3.2
+71/ SeC(15ctxφ断面基準)、温度30
℃。
+71/ SeC(15ctxφ断面基準)、温度30
℃。
pH5,6で回分培養を行なった。
使用した培地は実施例3のイーストペプトンのかわりに
肉エキスを用いたほかは実施例3と同じであった。
肉エキスを用いたほかは実施例3と同じであった。
微生物保持材料として球状のステンレス加工材料(直径
5m、空隙率80〜85%〉を1500個/1となるよ
うに加えた(15.8V/V%)、微生物保持材料を用
いないで培養を行なった対照実験での乾燥菌体の活性と
の比較を第3図に示した。
5m、空隙率80〜85%〉を1500個/1となるよ
うに加えた(15.8V/V%)、微生物保持材料を用
いないで培養を行なった対照実験での乾燥菌体の活性と
の比較を第3図に示した。
気泡塔においても微生物保持材料とともに培養すること
によってエステル交換活性は上昇した。
によってエステル交換活性は上昇した。
[発明の効果]
本発明によれば、微生物保持材料に付着・増殖させた生
物膜状の増殖をさせることによって微生物のリパーゼ生
成能を有効かつ安定的に引き出すことができる。さらに
また、本発明によれば、培地条件、培養操作条件の増殖
形態への影響を排除できるので、培養における安価な有
機窒素源の利用、攪拌および通気条件などの緩和を可能
とするばかりではなく、微生物は微生物保持材料に吸着
されているため乾燥菌体製造の際のび過、水洗、アセト
ン洗浄、乾燥などの各工程における操作性の向上など、
リパーゼ活性を有し、エステル交換反応、油脂加水分解
反応に利用されるリパーゼを包蔵した菌体の工業的生産
に非常に好都合である。
物膜状の増殖をさせることによって微生物のリパーゼ生
成能を有効かつ安定的に引き出すことができる。さらに
また、本発明によれば、培地条件、培養操作条件の増殖
形態への影響を排除できるので、培養における安価な有
機窒素源の利用、攪拌および通気条件などの緩和を可能
とするばかりではなく、微生物は微生物保持材料に吸着
されているため乾燥菌体製造の際のび過、水洗、アセト
ン洗浄、乾燥などの各工程における操作性の向上など、
リパーゼ活性を有し、エステル交換反応、油脂加水分解
反応に利用されるリパーゼを包蔵した菌体の工業的生産
に非常に好都合である。
第1図は、実施例3においてリゾプス・デレマーを微生
物保持材料とともにI8¥1したばあいと対照のばあい
における乾燥菌体のエステル交換活性を経時的に比較し
て示したグラフ、第2図は、実施例4において回分培養
に用いた気泡塔を示ず模式図、第3図は、実施例4にお
いてリゾプス・オリゴスポラスを微生物保持材料ととも
に培養したばあいと対照のばあいにおける乾燥菌体のエ
ステル交換活性を経時的に比較して示したグラフである
。 才12 通気力゛ス
物保持材料とともにI8¥1したばあいと対照のばあい
における乾燥菌体のエステル交換活性を経時的に比較し
て示したグラフ、第2図は、実施例4において回分培養
に用いた気泡塔を示ず模式図、第3図は、実施例4にお
いてリゾプス・オリゴスポラスを微生物保持材料ととも
に培養したばあいと対照のばあいにおける乾燥菌体のエ
ステル交換活性を経時的に比較して示したグラフである
。 才12 通気力゛ス
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 リパーゼ生成能を有する微生物を培養してリパーゼ
を生産する際に、微生物を微生物保持材料およびグリセ
ライドもしくは脂肪酸とともに培養することによって該
保持材料に付着・増殖させることを特徴とする高リパー
ゼ活性を有する菌体の生産方法。 2 リパーゼ生成能を有する微生物がリゾプス(Rhi
zopus)属、アスペルギルス (Aspergillus)属またはムコール(Muc
or)属に属する微生物である特許請求の範囲第1項記
載の生産方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61293754A JPS63146782A (ja) | 1986-12-09 | 1986-12-09 | 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61293754A JPS63146782A (ja) | 1986-12-09 | 1986-12-09 | 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63146782A true JPS63146782A (ja) | 1988-06-18 |
JPH0430833B2 JPH0430833B2 (ja) | 1992-05-22 |
Family
ID=17798793
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61293754A Granted JPS63146782A (ja) | 1986-12-09 | 1986-12-09 | 高リパ−ゼ活性を有する菌体の生産方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63146782A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016073976A (ja) * | 2009-07-24 | 2016-05-12 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 攪拌システム |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS509868A (ja) * | 1973-06-04 | 1975-01-31 | ||
JPS5088283A (ja) * | 1973-12-05 | 1975-07-15 |
-
1986
- 1986-12-09 JP JP61293754A patent/JPS63146782A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS509868A (ja) * | 1973-06-04 | 1975-01-31 | ||
JPS5088283A (ja) * | 1973-12-05 | 1975-07-15 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016073976A (ja) * | 2009-07-24 | 2016-05-12 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 攪拌システム |
JP2017209676A (ja) * | 2009-07-24 | 2017-11-30 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 攪拌システム |
JP2021007946A (ja) * | 2009-07-24 | 2021-01-28 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 攪拌システム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0430833B2 (ja) | 1992-05-22 |
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