KR102109763B1

KR102109763B1 - 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법

Info

Publication number: KR102109763B1
Application number: KR1020140047683A
Authority: KR
Inventors: 박종명; 라트나싱; 송효학; 양택호
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2020-05-13
Also published as: KR20150121789A; CN107075462A; WO2015163682A1

Abstract

본 발명은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된, 2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.

Description

2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANEDIOL USING THE SAME}

본 발명은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.

네 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH3CHOHCHOHCH3)인 2,3-부탄디올은 합성고무 제조 공정의 원료물질인 1,3-부타디엔(1,3-Butadiene)과 연료 첨가제 및 용매로 사용되는 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK)으로 화학적 촉매 전환이 가능하다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011). 또한, 2,3-부탄디올은 가솔린(Gasoline)과 혼합하여 octane booster로 적용할 수 있어 산업적으로 매우 중요한 중간체이다(Celinska et al., Biotechnol. Adv., 27: 715, 2009).

2,3-부탄디올은 화학적 합성 공정과 미생물 발효 공정을 통하여 생산할 수 있다. 하지만 상기 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 가격이 매우 높기 때문에 상업적 규모로의 2,3-부탄디올 생산은 이루어지지 않고 있다. 한편, 최근 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 기술의 비약적인 발전과 함께, 화석원료 물질의 급격한 가격 상승과 국제적인 환경오염에 대한 규제가 강화됨에 따라 미생물 발효를 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산에 대한 관심과 연구 개발의 중요성이 증대되고 있다.

바이오 기반 2,3-부탄디올 생산 방법은 2,3-부탄디올 생산능을 보유한 미생물의 발효를 통하여, 재생 가능한 바이오 원료물질(Biomass)을 2,3-부탄디올로 전환하는 것이다. 2,3-부탄디올은 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로벡터(Enterobacter), 바실러스(Bacillus). 세라티아(Serratia) 종(Species) 등 다양한 종류의 미생물에 의하여 생산된다(Maddox IS, Biotechnol., 6: 269, 1996). 특히, 클렙시엘라 뉴모니에(K. pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)가 상대적으로 많은 양의 2,3-부탄디올을 생산하며, 특히 클렙시엘라 뉴모니에와 클렙시엘라 옥시토카는 배양이 용이하고 생장 속도가 빠르며, 목질계 유래의 5탄당을 포함하는 다양한 종류의 바이오 원료물질로부터 2,3-부탄디올 생산할 수 있다는 장점이 있다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011; Chandel et al., Sustainable Biotechnol., 63, 2010; Jansen et al., Biotechnol. Bioeng., 26: 362, 1984; Jansen et al., Adv. Biochem. Eng., 27: 85, 1983).

미생물 발효 공정을 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산 연구는 발효 공정 최적화(온도, pH, 용존산소 등)와 미생물 개발 (미생물 발굴, 생리학적 특성 파악, 돌연변이, 유전자 조작 등) 분야로 나누어서 진행되고 있다. 발효 공정 최적화 측면에 있어서는 2,3-부탄디올을 효율적으로 생산할 수 있는 온도, pH, 용존산소 농도 등 다양한 조건들이 규명되었다(Ji et al., Bioresour. Technol., 100: 3410, 2009; Nakashimada et al., J. Biosci. Bioeng., 90: 661, 2000; Nakashimada et al., Biotechnol. Lett., 20: 1133, 1998). 그러나 상기 조건에서의 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산은 여전히 생산성(Productivity) 및 수율(Yield)이 낮아 상업 공정에 직접 적용하기 어려운 문제가 있다. 또한 발효 과정에서 2,3-부탄디올과 함께 젖산을 포함하는 유기산들(Organic acids)과 에탄올을 포함하는 알코올들(Alcohols)등 다양한 부산물들(By-products)이 생성되는 단점이 있다. 부산물 생성은 바이오 원료물질에 대한 2,3-부탄디올의 수율을 낮출 뿐 아니라 배양액으로부터 2,3-부탄디올 회수 과정에서 막대한 분리 및 정제 비용을 요구한다.

그러므로 2,3-부탄디올 생산에 관련된 미생물 개발 연구는 주로 부산물을 감소시키는 방향으로 진행되어 왔다. 대표적으로 Ji 등은 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주에 물리/화학적 돌연변이 방법의 일종인 UV를 노출시켜 부산물인 유기산들의 생성을 일부 억제시키는 것에 성공하였다(Ji et al., Biotechnol. Lett., 30: 731, 2008). 그 외, 이온 주사(Ion beam) 방식을 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 적용하여 바이오매스의 소모 속도를 증가시킴으로써 2,3-부탄디올 생산을 향상시키는 시도도 있다(Ma et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 49, 2009). 그러나 상기의 개발된 균주들은 2,3-부탄디올 생산성, 최종농도(Concentration) 및 수율 측면에서 상업 공정에 직접 적용하기에 여전히 부족한 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 2,3-부탄디올의 생산성, 농도 및 수율이 높은 재조합 미생물을 연구하던 중 특정 유전자들을 도입시킨 재조합 미생물이 2,3-부탄디올의 선택도 및 생산성이 높은 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된,

2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은,

본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생산성이 높다.

도 1은 2,3-부탄디올 생성 균주에서 2,3-부탄디올의 생합성 경로를 나타낸다.
도 2는 pGSC-budA 플라스미드를 나타낸다.
도 3은 pGSC-budAB 플라스미드를 나타낸다.
도 4는 pGSC-budABC 플라스미드를 나타낸다.
도 5는 비교예 1의 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca wild type)의 발효 결과이다.
도 6은 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB)의 발효 결과이다.
도 7은 실시예 1의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca wild type + pGSC-budRABC)의 발효 결과이다.
도 8은 실시예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주 K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRA)의 발효 결과이다.
도 9는 실시예 3의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRAB)의 발효 결과이다.
도 10은 실시예 4의 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주(K. oxytoca △ldhA △pflB + pGSC-budRABC)의 발효 결과이다.

본 발명은,

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

2,3- 부탄디올 생성능이 증가된 재조합 미생물

본 발명의 재조합 미생물은

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물이다.

또한 본 발명의 재조합 미생물은,

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제로부터 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.

또한 본 발명의 재조합 미생물은,

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제로부터 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 효소의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.

또한 본 발명의 재조합 미생물은,

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제의 활성이 증가된 재조합 미생물이다.

또한, 본 발명의 재조합 미생물은

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 또는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,

2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.

이 경우 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,

피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다

또한, 이 경우 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,

피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로 및 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다

피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로, 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로 및 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진된 것일 수 있다

또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다

또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제 및 아세토락테이트 디카복실레이즈의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다

또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서, 피루베이트-포르메이트 리아제 및 락테이트 디하이드로게나제의 활성이 억제되고, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및 아세토인 리덕타제의 활성이 증가된 재조합 미생물일 수 있다

또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 선택도, 수율, 농도 및 생산성이 높다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 상기 재조합으로 인하여 야생형 미생물보다 포름산, 락테이트 등과 같은 부산물의 생성능이 억제된 것일 수 있다.

아세틸 코에이 생합성 경로

본 발명의 재조합 미생물은 아세틸 코에이 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 2,3-부탄디올 생산 미생물을 이용하여 제조한 재조합 미생물일 수 있다. 본 발명의 아세틸 코에이(Acetyl-CoA) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다.

락테이트 생합성 경로

본 발명의 재조합 미생물은 아세틸 코에이 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 2,3-부탄디올 생산 미생물을 이용하여 제조한 재조합 미생물일 수 있다. 본 발명의 락테이트(lactate) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 락테이트가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 락테이트 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 락테이트가 합성되는 경로 등이 될 수 있다.

2,3 부탄디올 생산 미생물

본 발명의 재조합 미생물은 2,3 부탄디올 생산 미생물을 유전적으로 재조합하여 제조한 재조합 미생물이다. 상기 2, 3 부탄디올 생산 미생물은 예컨대, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 세라티아(Serratia) 속 또는 엔테로벡터 (Enterobacter) 속의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 등이며, 가장 바람직하게는 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca)이다. 클렙시엘라 옥시토카를 이용하여 본 발명의 재조합 미생물을 제조하는 것이 클렙시엘라 뉴모니아를 이용하는 것보다 2,3 부탄디올의 산업적 규모의 생산에 유리하다.

피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로의 억제

피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 피루베이트의 아세틸 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.

피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로의 억제

피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 피루베이트의 포름산으로의 전환을 조절한다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로의 억제

락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 디하이드로게나제를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 디하이드로게나제의 억제는 락테이트 디하이드로게나제의 발현 억제, 락테이트 디하이드로게나제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 디하이드로게나제를 억제할 수 있다.

피루베이트를 알파- 아세토락테이트로 전환하는 경로의 촉진

아세토락테이트 신타제(acetolactate synthase)는 피루베이트의 알파-아세토락테이트로의 전환을 조절하여, 알파-아세토락테이트의 생성에 관여한다. 상기 아세토락테이트 신타제의 활성을 증가시킴으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토락테이트 신타제의 활성 증가는 아세토락테이트 신타제의 유전자의 증폭 발현, 아세토락테이트 신타제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토락테이트 신타제의 활성을 증가시킬 수 있다.

알파- 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로의 촉진

아세토락테이트 디카복실실레이즈(acetolactate decarboxylase)는 알파-아세토락테이트의 아세토인으로의 전환을 조절하여, 아세토인 생성에 관여한다. 상기 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성을 증가시킴으로써 알파-아세토락테이트을 아세토인으로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성 증가는 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 유전자의 증폭 발현, 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성을 증가시킬 수 있다.

아세토인을 2,3- 부탄디올로 전환하는 경로의 촉진

아세토인 리덕타제(acetoin reductase)는 아세토인의 2,3-부탄디올로의 전환을 조절하여, 2,3-부탄디올의 생성에 관여한다. 상기 아세토인 리덕타제의 활성을 증가시킴으로써 아세토인 리덕타제를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로를 촉진시킬 수 있다. 상기 아세토인 리덕타제의 활성 증가는 아세토인 리덕타제의 유전자의 증폭 발현, 아세토인 리덕타제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC를 미생물에 도입시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 유전자의 발현을 증폭시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 아세토인 리덕타제의 활성을 증가시킬 수 있다.

2,3- 부탄디올의 생산 방법

본 발명의 2,3-부탄디올의 생산 방법은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함한다.

배양

본 발명의 재조합 미생물의 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건(microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 미생물은 복합 배지에서 배양될 수 있으며, 복합 배지의 종류는 특별히 제한되지 않고 당업자는 일반적으로 시판, 사용되는 복합 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다는 것은 자명하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

야생형 균주인 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP를 준비하여 이를 비교예 1의 균주로 사용하였다. 또한 이를 이용하여 하기 <1-1> 내지 <1-3>에서 재조합 미생물을 제조하였다.

-2,3-부탄디올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄디올의 양

-2,3-부탄디올 수율(g/g): 2,3-부탄디올 생산량(g)/탄소원(g) × 100

-2,3-부탄디올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄디올의 양

<1-1> ldhA 및 pflB가 결실된 재조합 K. 옥시토카의 제조

표적 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편 제작

클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자를 불활성화 시키기 위하여 박테리아의 재조합 기작을 이용하였고, 제거하고자 하는 유전자의 상동 부위 (homologous region)를 PCR로 증폭하였다. 그 후 상동 부위를 포함하는 해당 DNA 단편을 박테리아에 전달한 후, DNA 단편에 있는 유전자의 상동 부위와 클렙시엘라 옥시토카의 염색체에 있는 유전자 사이에 재조합 효소 (recombinase)에 의한 재조합 기작으로 표적 유전자를 제거하게 된다.

먼저, 클렙시엘라 옥시토카의 락테이트 디하이드로게나제 클로닝하기 위해 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2이 포함된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다.

한편, 클렙시엘라 옥시토카의 피루베이트 포르메이트 리아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 pflB(서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다(표 1). 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.

ldhA 및 pflB 가 결실된 재조합 K. 옥시토카의 제조

상기 제작된 DNA 단편들을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP에 전달하였으며, 미생물의 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거할 수 있었다.

클렙시엘라 옥시토카 야생형에 ldhA 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 ldhA 유전자를 제거한 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 제조하였다. 그리고, 클렙시엘라 옥시토카 야생형에서 ldhA 유전자를 제거한 후, pflB 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 ldhA 유전자에 추가로 pflB 유전자가 제거된 클렙시엘라 옥시토카를 제조하였다.

이렇게 제조된 ldhA 및 pflB가 결실된 K. 옥시토카 KCTC 12132BP 재조합 미생물(이하, “비교예 2”, “K. oxytoca △ldhA △pflB”라 함)를 이용하여 하기 재조합 공정 및 발효 실험들을 수행하였다.

<1-2> pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드의 제조

클렙시엘라 옥시토카 유래의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소 (budA)와 아세토락테이트 신타제 효소 (budB)와 아세토인 리덕타제 효소 (budC)를 코딩하는 유전자의 발현 증폭에 사용할 재조합 플라스미드를 제조하였다.

클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자 발현을 증폭시키는 재조합 벡터를 만들기 위해서 제한 효소 자리, 다중 클로닝 자리 (Multiple cloning site), 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 pBBR1MCS (Kovach et al., Biotechniques, 800-802, 1994) 플라스미드에 증폭하고자 하는 유전자를 클로닝하여야 한다. 해당 플라스미드를 박테리아에 클로닝한 후, 세포 내에서 플라스미드의 복제 기작으로 유전자 발현을 증폭하게 된다.

클렙시엘라 옥시토카의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소를 코딩하는 유전자 (budA, 서열번호 17)와 아세토락테이트 신타제 효소를 코딩하는 유전자 (budB, 서열번호 18)와 아세토인 리덕타제 효소를 코딩하는 유전자 (budC, 서열번호 19)를 클로닝하기 위하여 표적 유전자를 PCR로 증폭하였다 (표 2). 이 때, regulator 유전자인 budR도 각각 함께 도입하였다(서열번호 20). 증폭 시에는 플라스미드의 다중 클로닝 자리에 존재하는 제한 효소 자리 (XbaI, ApaI 등)를 포함하고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 각각의 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편과 플라스미드를 다중 클로닝 자리에 있는 제한 효소 로 동일하게 처리한 후, T4 DNA ligase로 상기 두 단편을 접합하여 pGSC-budA와 pGSC-budAB와 pGSC-budABC 플라스미드를 완성하였다 (도 2 내지 4).

<1-3> 아세토락테이트 디카복실실레이즈, 아세토락테이트 신타제, 및 아세토인 리덕타제를 코딩하는 유전자의 발현 증폭

클렙시엘라 옥시토카 유래의 아세토락테이트 디카복실실레이즈 효소 (budA), 아세토락테이트 신타제 효소 (budB) 및 아세토인 리덕타제 효소 (budC)를 코딩하는 유전자의 발현을 증폭하였다.

상기 <1-2>에서 제조한 pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드를 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 비교예 1 및 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 클로닝하였다. 구체적으로는 야생형 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12132BP (비교예 1)에 pGSC-budABC 플라스미드를 클로닝하여, 상기 유전자들의 발현이 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 완성하였다(이하, 실시예 1, “K. oxytoca wild type + pGSC-budABC”이라 함). 또한 ldhA와 pflB를 동시에 제거한 재조합 미생물인 비교예 2의 클렙시엘라 옥시토카에 pGSC-budA 플라스미드, pGSC-budAB 플라스미드 및 pGSC-budABC 플라스미드를 각각 클로닝하여, 상기 유전자들의 발현이 각각 증폭된 재조합 클렙시엘라 옥시토카를 완성하였다(실시예 2 내지 4). 이 때, regulator 유전자인 budR도 각각 함께 도입하였다. 전기 천공법 다음에 상기 재조합 클렙시엘라 옥시토카들을 30℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 클로람페니콜이 들어있는 LB 복합 고체 배지에 37℃에 각각 스프레딩 (spreading)하여 배양하였다. 그 후, 클로람페니콜이 들어 있는 고체 배지에서 자란 콜로니 (Colony)들을 골라냈다. 그리고 골라낸 콜로니에 들어있는 플라스미드를 분리 (Miniprep)하여 전기 영동을 통해 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 그 결과, 하기의 재조합 미생물들이 제조되었다(표 3).

<실험예 1> 야생형 미생물 및 ldhA 및 pflB이 결실된 재조합 미생물의 2,3-부탄디올 생산능

비교예 1의 야생형 클렙시엘라 및 ldhA와 pflB가 동시에 제거된 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 균주를 이용하여, 2,3-부탄디올의 생산 발효능을 평가하였다.

비교예 1의 야생형 클렙시엘라 옥시토카와 ldhA와 pflB가 동시에 제거된 비교예 2의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 대해 발효를 수행하였다. 상기 미생물들의 배양은 하기와 같이 수행하였다.

먼저, 상기 미생물들을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 150 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다. 배지 내에는 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 야생형 및 재조합 클레비시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다

그 결과, 클렙시엘라 옥시토카에 젖산 탈수소화 효소 (ldhA)와 피루브산-포름산 분해 효소 (pflB)가 제거된 경우, 2,3-부탄디올 생산량은 39.49 g/L이었고, 2,3-부탄디올 생산 수율 (2,3-부탄디올 g/ 포도당 g)은 0.45였다. 상기 비교예 2의 재조합 미생물의 생산성 (g/L/h)는 0.58이었다. 비교예 1의 야생형 균주와 비교하였을 때, 비교예 2의 재조합 미생물은 젖산, 포름산, 에탄올 생산이 현저히 감소하면서 2,3-부탄디올의 생산능이 좋아지면서 2,3-부탄디올 생산 농도, 생산 수율, 생산성, 선택도가 모두 개선되었다(표 4)(도 5 및 도 6).

<실험예 2> budA, budAB, budABC 유전자가 선택적으로 증폭 발현된 재조합 미생물의 2,3-부탄디올 생산능

상기 <1-3>에서 제조한 실시예 1 내지 4의 재조합 클렙시엘라 옥시토카에 대하여 발효를 수행하였다.

구체적인 발효 과정은 하기와 같다. 실험 대상인 재조합 미생물들을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 150 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.5, 배양 온도 37℃로 하였다. 배지 내에는 25 mg/L의 클로람페니콜을 첨가하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 재조합 미생물들에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다

그 결과, 야생형에 budABC를 증폭 발현하였을 경우 (실시예 1), 비교예 1(야생형)에 비하여 2,3-부탄디올의 수율, 농도가 증가한 것을 알 수 있었다. 하지만, 여전히 젖산 (lactate) 등 부산물의 생산량이 2,3-부탄디올에 비해 많다는 것을 알 수 있었다.

한편, 유전자 pflB 및 ldhA을 제거하지 않은 실시예1을 유전자 pflB 및 ldhA을 제거한 실시예4와 대비하여 볼 때 실시예4가 실시예1 대비 젖산 등의 부산물 저감 효과가 뛰어나고, 2,3-부탄디올의 수율 및 농도, 생산성이 보다 우수함을 확인할 수 있었다(표4, 도 7 및 도 10 참조)

또한, 실시예 2의 재조합 미생물은 비교예 2의 재조합 미생물(K. oxytoca △ldhA △pflB)에 비하여 2,3-부탄디올의 수율 및 생산성이 유의하게 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 실시예 2 및 실시예 3의 재조합 미생물들을 서로 비교하여 보면, budA뿐만 아니라 budB를 증폭하였을 때에도 2,3-부탄디올의 생산 성능이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 실시예 3 및 실시예 4의 재조합 미생물들을 비교하여 보면, budC를 증폭하였을 때에도 2,3-부탄디올의 생산 성능이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로는 budABC를 모두 증폭 발현한 실시예 4의 재조합 미생물이 비교예 2의 재조합 미생물과 비교하였을 때 2,3-부탄디올 생산 성능이 가장 개선되었음을 알 수 있었다.

그러므로 2,3-부탄디올 생산에 있어서는 부산물 저감을 위한 유전자 pflB 및 ldhA의 제거뿐만 아니라, 클렙시엘라의 아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자, 아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자, 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자의 발현을 증폭하는 것이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었다(표 5, 도 7 내지 도 10, 도 7: 실시예 1, 도 8: 실시예 2, 도 9: 실시예 3, 도 10: 실시예 4).

<110> gs caltex <120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANEDIOL USING THE SAME <130> GSP130003 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 1 atgaaaatcg ctgtgtatag tacaaaacag tacgacaaga agtatctgca gcatgttaat 60 gatgcatatg gctttgaact ggagtttttt gacttcctgc taaccgaaaa aaccgccaaa 120 accgccaacg gctgtgaagc ggtgtgtatc ttcgtaaacg atgacggtag ccgcccggta 180 cttgaagaac tgaaagccca cggcgtgcag tacatcgcgc tgcgctgcgc ggggttcaac 240 aacgttgacc tcgatgccgc caaagagctg ggcctgcggg tggtgcgcgt cccggcctac 300 tcgccggaag cggtcgctga gcacgcgatc ggcatgatga tgtcgctgaa ccgccgcatt 360 caccgtgcct atcagcgcac ccgcgacgcg aacttctctc tggaagggct gaccggtttc 420 accatgcacg gtaaaaccgc cggcgttatt ggcaccggta aaatcggcgt cgccgcgctg 480 cgcattctta aaggcttcgg tatgcgtctg ctggcgtttg atccctaccc aagcgccgcc 540 gcgctggata tgggcgtgga gtatgtcgat cttgaaaccc tgtaccggga gtccgatgtt 600 atctcactgc actgcccact gaccgatgaa aactaccatt 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DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 9 atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60 cagaacgaag tcaacgtccg cgacttcatc cagaaaaact ataccccgta cgaaggtgac 120 gagtccttcc tggctggcgc aactgacgcg accaccaagc tgtgggacac cgtaatggaa 180 ggcgttaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgatacttc ccttgcatcc 240 accatcactt ctcatgacgc tggctacatc gagaaaggtc tcgagaaaat cgttggtctg 300 cagactgaag ctccgctgaa acgcgcgatt atcccgttcg gcggcatcaa aatggtcgaa 360 ggttcctgca aagcgtacga tcgcgagctg gacccgatgc tgaagaaaat cttcactgaa 420 taccgtaaaa ctcacaacca gggcgtgttt gacgtttaca ccaaagacat cctgaactgc 480 cgtaaatctg gtgttctgac cggtctgccg gatgcctatg gccgtggtcg tatcatcggt 540 gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa atacgctcag 600 ttcgtttctc tgcaagagaa actggaaaac ggcgaagatc tggaagcaac catccgtctg 660 cgcgaagaaa tctctgaaca gcaccgcgcg ctgggtcaga tcaaagaaat ggcggctaaa 720 tatggctgcg atatctctgg tcctgctacc accgctcagg aagctatcca gtggacctac 780 ttcggttacc tggctgccgt aaaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt 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accacaaaat gcaccatact tttgttgaag ccgtgtgcct 180 gggtatcctg gcaaacctga tggtctgcct tgcggtatgg atgagttact ccggccgtag 240 cctgatggat aaagccatga ttatggtttt accggtggca atgtttgttg ccagcgggtt 300 tgagcacagt atcgcgaaca tgtttatgat cccgctgggt atcgttatcc gcgactttgc 360 aagcccggaa ttctggaccg cagttggttc aactccggaa agtttctctc acctgaccgt 420 catgaacttc atcactgata acctgattcc ggtaactatc gggaacatca tcggcggtgg 480 tctgctggtt gggttgacat actgggtcat ttacctgcgt ggcgacgacc atcactaagg 540 gttgtttcag gcagtaaata aaaaatccac ttaagaaggt aggtgttaca tgtccgagct 600 taatgaaaag ttacagcagc aggacgttat tactc 635 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 11 atcggatccg ggtcaactgg cgaaaaactg gctcaacgt 39 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 12 gagtaataac gtcctgctgc tgtaactttt cattaagctc ggacat 46 <210> 13 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 13 atgtccgagc ttaatgaaaa gttacagcag caggacgtta ttactcgtac cttcactcag 60 accatgtaat ggtattgact gaaatcgtac agtaaaaagc gtacaataaa ggctccacgc 120 aagtggggcc tttttagcaa tatcatcctg ccccagtctc ttttgtctgc tgtctatact 180 ttatggataa cagccaaaac agactcgaca tagcctttga gctgtgcatc tacataggcc 240 ccggatgggc caaattcgga gatatcaccg caatgtcaac aattggtcgc attcactcct 300 ttgaatcctg tggcaccgtc gatggcccgg ggattcgctt tatcaccttc ttccagggct 360 gcctgatgcg ctgcctctat tgccacaacc gcgatacctg ggatacccac ggcggcaaag 420 agattaccgt tgaagagctg atgaaagagg tggtgaccta tcgccacttt atgaacgctt 480 ccggcggcgg cgtgacggca tccggcggcg aggctatcct gcaggccgaa tttgttcgcg 540 actggttccg cgcctgtaag aaagaaggta ttcatacctg tctcgatacc aacggctttg 600 tgcgccgcta cgatccggtt attgatgaac tgctggaggt caccgacctg gtgatgctcg 660 atctcaagc 669 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 14 atgtccgagc ttaatgaaaa gttacagcag caggacgtta ttactc 46 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 15 actgcggccg cgcttgagat cgagcatcac caggtcggtg a 41 <210> 16 <211> 1258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 16 gggtcaactg gcgaaaaact ggctcaacgt ctatgttggt aacctgattg gttgcttact 60 gtttgtattg ctgatgtggc tttcaggcga atatatgact gccaacggtc aatggggact 120 taacgttctg caaaccgccg accacaaaat gcaccatact tttgttgaag ccgtgtgcct 180 gggtatcctg gcaaacctga tggtctgcct tgcggtatgg atgagttact ccggccgtag 240 cctgatggat aaagccatga ttatggtttt accggtggca atgtttgttg ccagcgggtt 300 tgagcacagt atcgcgaaca tgtttatgat cccgctgggt atcgttatcc gcgactttgc 360 aagcccggaa ttctggaccg cagttggttc aactccggaa agtttctctc acctgaccgt 420 catgaacttc atcactgata acctgattcc ggtaactatc gggaacatca tcggcggtgg 480 tctgctggtt gggttgacat actgggtcat ttacctgcgt ggcgacgacc atcactaagg 540 gttgtttcag gcagtaaata aaaaatccac ttaagaaggt aggtgttaca tgtccgagct 600 taatgaaaag ttacagcagc aggacgttat tactcgtacc ttcactcaga ccatgtaatg 660 gtattgactg aaatcgtaca gtaaaaagcg tacaataaag gctccacgca agtggggcct 720 ttttagcaat 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atggaacagc gtacgccgtt cgcggtgatg 300 acctggtttc agccgcagta tcgcaaaacg ttcgataaac cggtcagccg tgaacaactg 360 cacgacatca tcgaccagca aattccgtcg gacaatctgt tctgcgccct gcgtattaac 420 ggccattttc gccacgccca tacccgcacg gtaccgcgcc agacgccgcc ataccgggcg 480 atgaccgacg tactcgacga ccagccggtt tttcgcttca accagcgcga gggtgtcctg 540 gttgggttca gaacgccgca gcatatgcag ggcattaacg tggccggcta ccatgaacac 600 ttcatcaccg atgaccgcca gggcggcggc catctgctcg attatcagct cgaccacggc 660 gttctgacct ttggcgagat ccacaaattg atgattgacc ttcctgccga tagcgccttc 720 ctgcaggcgg atctgcatcc agacaatctt gatgccgcca ttcgctcagt cgaaaactaa 780 780 <210> 18 <211> 1680 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 18 gtggataatc aacatcaacc gcgccagtgg gcgcacggcg ccgacctcat cgtcagccag 60 cttgaggccc agggggtacg ccaggtgttc ggcattccgg gggccaaaat cgataaagtc 120 ttcgattcgc tgctcgactc ctccattcgc attatcccgg tgcgccacga agccaacgcc 180 gcctttatgg ccgccgcggt tggccgcatc accggcaaag cgggcgtcgc gctggtcacg 240 tccggaccgg gctgctctaa cctgattacc gggatggcaa cggccaatag 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caggacatcg tcaatagcga tgtcaccctg accgtcgata tggggagctt tcatatctgg 1200 atcgcccgct atctctacag ctttcgcgcc cgtcaggtca tgatttccaa cggtcaacag 1260 accatgggcg tggcgctgcc gtgggcgatt ggcgcctggc tggtcaatcc gcagcgcaaa 1320 gtggtttccg tttccggcga cggcggtttc ctgcagtcca gcatggagct ggagaccgct 1380 gtacggctga aagcgaacgt cctgcatatc atctgggtcg ataacggcta caacatggtg 1440 gcgattcagg aggagaaaaa ataccagcgg ctctccggcg ttgagttcgg cccggtggat 1500 tttaaagtct acgccgaagc cttcggcgcc aaagggtttg cggtagagag cgccgaagcc 1560 cttgagccga cgctgcgggc ggcgatggac gtcgacggcc ccgccgtcgt agccatcccc 1620 gtggattacc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctcc atctcagtca actactttga 1680 1680 <210> 19 <211> 771 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 19 atgaaaaaag tcgcactcgt caccggcgcg ggccagggta tcggtaaagc tatcgccctt 60 cgtctggtga aagatggttt tgccgtggct atcgccgatt ataacgacgc caccgcgcag 120 gcggtcgctg atgaaattaa ccgcagcggc ggccgggcgc tagcggtgaa ggtggatgtg 180 tctcaacgcg atcaggtttt tgccgccgtc gaacaggcgc gcaagggtct cggcggtttt 240 gacgtgatcg tcaacaacgc cggggttgcg ccctccacac caatcgaaga gattcgcgag 300 gaggtgatcg ataaagtcta caatatcaac gttaaaggcg ttatctgggg catccaggcc 360 gcggtagagg cgtttaaaaa agagggccac ggcggcaaaa ttatcaacgc ctgctcccag 420 gcgggccatg taggtaaccc ggagctggcg gtctatagct ccagtaaatt tgccgtgcgc 480 ggcctgacgc aaaccgccgc ccgcgatctg gcgcatctgg ggattaccgt aaacggctac 540 tgcccgggga tcgtcaaaac cccaatgtgg gcggaaattg accgccaggt ttccgaagcg 600 gcgggtaaac cgctgggcta cggaacccag gagttcgcca aacgcattac ccttgggcgg 660 ctatccgagc cggaagacgt cgcagcctgc gtctcttatc tcgccggtcc ggactccaat 720 tatatgaccg gccaatcgct gctgatcgat ggcggcatgg tatttaacta a 771 <210> 20 <211> 873 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 20 atggaacttc gttatctgcg ctacttcgtc gccgtcgccg aggcgcggca cttcactaaa 60 gcggcaaaag aacttggtat ctcccagcca ccgctaagtc agcaaattca acggcttgaa 120 agagaaattg gcacaccgct tttccgccga ttaacgcggg gcgtcgagct gacggaagcg 180 ggggagtcgt tttatgagga tgcttgccag attctggcgt taagcgacgc ggcgctggaa 240 aaaaccaagg gaattgcccg cgggctgaac ggtcggctct cgctgggcat taccagctct 300 gatgcttttc atccgcaaat ctttagcctg ttacagcagt ttcagcagag ttatccgggg 360 gtgacgttgc atcaggtcga aggcaatatg gcgacgctga tgggggcgct tggcgaagcg 420 gagctggata ttgcttttgt acgcctgccc tgcgagagca gtaaagcgtt caatctgcgg 480 attatcgatc aagaaccgat ggtgattgcc ctggcgcgtt cgcacccgct atcgtcccac 540 cgcgagctga cgctggagca actgacggac gtggcgccga ttcttttccc gcgtgaagtg 600 gcccctggcc tgtatgagct ggtgttcaac agctatctgc gcgccggtgt tgacgtgcag 660 cgagcctatc agtcatcgca aatatcatcg tcgctcagca tggtggaggc tggcttcggc 720 tttgcgctgg tgccgcagtc gatgacctgc atcacgctcc ccaacgtgag ctatcacccg 780 ctgatgggta caccgctgaa aaccgatatc gctatcgcct ggcggcgcta cgagcgctcg 840 cgcacggtga agcgttttct ggccatgttt taa 873

Claims

2,3-부탄디올 생산 미생물에 있어서,
피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로, 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되고,
알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진되며,
상기 미생물은 클렙시엘라인,
2,3-부탄디올 생산용 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 추가로 촉진되고,
아세토락테이트 신타제의 활성이 증가함으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 추가로 촉진되고,
아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB의 발현이 증가함으로써 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토락테이트 디카복실실레이즈의 활성이 증가함으로써 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA의 발현이 증가함으로써 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 추가로 촉진되고,
아세토인 리덕타제의 활성이 증가함으로써 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 추가로 촉진되고,
아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC의 발현이 증가함으로써 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
삭제
제 1항에 있어서,
피루베이트-포르메이트 리아제가 억제됨으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 또는 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제가 억제됨으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB 및 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA 중 어느 하나 이상이 결실 또는 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토락테이트 디카복실실레이즈를 코드하는 유전자인 budA의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 클렙시엘라 옥시토카인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생산성이 락테이트의 생산성보다 높은 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
아세토락테이트 신타제를 코드하는 유전자인 budB 또는 아세토인 리덕타제를 코드하는 유전자인 budC의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항 내지 제 7항 및 제 9항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법.