KR20120013693A - 혈관 형성 관련 질환 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관 형성 관련 질환을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 혈관 형성 관련 질환의 진단용 마커에 관한 것이다. 구체적으로 상기 마커는 NFAT5 전사인자의 발현이상에 의해 영향받는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 마커이다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커로 사용할 수 있는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 포함하는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 이용한 혈관형성 관련 질환의 예측 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

혈관 형성 관련 질환 진단용 마커 및 이의 용도{Markers for diagnosing angiogenesis-related diseases and use thereof}

본 발명은 혈관 형성 관련 질환을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 혈관 형성 관련 질환의 진단용 마커, 진단용 키트, 마이크로어레이 및 상기 진단용 마커를 이용한 혈관 형성 관련 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 상처치유와 염증반응과 같은 정상적인 인체 방어 및 생리적 현상과 초기 발생과정에 있어서 아주 중요한 역할을 한다. 이러한 혈관신생은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브(관)의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.

또한 혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데(Folkman and Cotran., Int . Rev . Exp . Patho., 16, 207~248, 1976), 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증 등 여러 가지 질환들이 야기된다.

따라서 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암을 포함하는 여러 질환의 예방 및 치료에 있어서 중요한 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제의 개발에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.

혈관신생과 관련된 질환의 하나로서 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis: RA)은 점진적으로 관절을 파괴시키는 만성 염증성 질병으로, 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocytes: FSL)의 증식, 신생혈관형성(angiogenesis), 및 침습적 판누스(invasive pannus) 형성을 특징으로 한다. 관절 활막(joint synovium) 내에서, FLS는 RA의 염증 생성에 적극적으로 관여한다(Firestein, G.S. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Passive responders or transformed aggressors? Arthritis Rheum 39, 1781-1790 (1996)). 이 세포들은 세포사멸(apoptosis)에 저항적이며, 비정상적으로 증식하고, 여러 MMP (matrix metalloproteinase) 뿐만 아니라 IL-1 및 IL-6 와 같은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 및 VEGF (vascular endothelial growth factor) 와 같은 신생혈관형성유도인자(angiogenic factor)들을 생성한다(Bucala, R., Ritchlin, C., Winchester, R. & Cerami, A. Constitutive production of inflammatory and mitogenic cytokines by rheumatoid synovial fibroblasts. J Exp Med 173, 569-574 (1991), Fava, R.A., et al . Vascular permeability factor/endothelial growth factor (VPF/VEGF): accumulation and expression in human synovial fluids and rheumatoid synovial tissue. J Exp Med 180, 341-346 (1994)). 또한, 신생혈관형성은 RA, 특히 이 병의 초기 발명에 있어 매우 활발히 이루어진다(Koch, A.E. Review: angiogenesis: implications for rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 41, 951-962 (1998)). 새로 형성된 혈관들은 판누스(pannus)에 영양분과 산소를 공급할 뿐만 아니라, 활액막염(synovitis) 위치에 염증 세포들을 이동시킴으로써 만성 염증 상태를 유지시킬 수 있다(Firestein, G.S. Starving the synovium: angiogenesis and inflammation in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 103, 3-4 (1999)).

NFAT5는 DNA-결합 도메인의 상동성에 근거한 NFAT 패밀리 전사인자들의 새로운 멤버이다. 처음 NFAT5는 hypertonic 스트레스에 의해 유도되는 유전자들의 상류 조절 영역(upstream regulatory region)에서 나타나는 tonicity response elements에 결합하는 TonEBP(tonicity enhancer binding protein)로 동정되었다(Miyakawa, H., Woo, S.K., Dahl, S.C., Handler, J.S. & Kwon, H.M. Tonicity-responsive enhancer binding protein, a rel-like protein that stimulates transcription in response to hypertonicity. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 2538-2542 (1999)). 하지만, 최근의 보고들에 따르면 NFAT5는 다른 조직들에서는 추가적인 역할을 하는 것으로 보인다. 예를 들어, NFAT5는 림프구의 증식 및 생존에 역할을 하며(Go, W.Y., Liu, X., Roti, M.A., Liu, F. & Ho, S.N. NFAT5/TonEBP mutant mice define osmotic stress as a critical feature of the lymphoid microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 10673-10678 (2004), Trama, J., Lu, Q., Hawley, R.G. & Ho, S.N. The NFAT-related protein NFATL1 (TonEBP/NFAT5) is induced upon T cell activation in a calcineurin-dependent manner. J Immunol 165, 4884-4894 (2000)), CYR61 의존적 경로를 거쳐 골격근 형성 과정(skeletal muscle myogenesis) 동안 근아세포(myoblast) 이동을 매개한다(O'Connor, R.S., Mills, S.T., Jones, K.A., Ho, S.N. & Pavlath, G.K. A combinatorial role for NFAT5 in both myoblast migration and differentiation during skeletal muscle myogenesis. J Cell Sci 120, 149-159 (2007)). 유방암에서는, NFAT5가 α₆β₄ 클러스터링(clustering)에 의해 유도되며, 이것은 증가된 세포 이동을 초래한다(Jauliac, S., et al . The role of NFAT transcription factors in integrin-mediated carcinoma invasion. Nat Cell Biol 4, 540-544 (2002)). 또한, 단핵 식세포(mononuclear phagocytic cells)에서 NFAT5-VEGFC 신호전달은 세포외 부피 및 혈압 항상성의 주된 결정인자이다(Machnik, A., et al . Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med 15, 545-552 (2009)). NFAT5 의 기능적 역할에 대한 이해의 증진에도 불구하고, 염증성 질병의 발병에서의 그것의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

한편, 본 발명자들은 NFAT5가 RA 활막(synoviums)에서 높게 발현되며, 그것이 염증성 자극에 의해 강하게 유도된다는 것을 확인하였다. 특히, 마우스에서 NFAT5 유전자의 이형접합성 결핍(Heterozygous deficiency)은 관절염의 발달을 저해한다는 사실을 확인하였고, NFAT5 siRNA를 처리한 RA FLS 및 내피세포들의 mRNA 프로파일링을 수행함으로서, NFAT5가 RA 발병과 관련된 주요 세포 프로세스로서- 1) 세포주기 및 생존, 2) 신생혈관형성, 3) 세포 이동을 조절한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 데이터에 근거하여, 본 발명자들은 배양된 FLS 및 내피세포를 사용하여 NFAT5의 증식, 신생혈관신생, 및 이동 기능을 확인하였고, NFAT5 결함 마우스의 마크로파지에서는 세포 이동 및 전-염증성 사이토카인 생성 역시 상당히 감소하였다. 따라서 NFAT5가 류마티스성 염증의 중요한 조절인자이며, 나아가 혈관신생 관련 질환의 기작에서 중요한 역할을 함으로써 혈관신생 관련 질환의 잠재적 표적이 될 수 있다.

이에 본 발명자들은 상기 NFAT5의 기능에 대한 연구결과를 바탕으로 NFAT5의 발현에 따라 발현 차이를 보이는 하위 유전자들을 동정한 후, 이들의 혈관형성 관련 질환과의 관련성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 혈관형성 관련 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 신규한 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커로 사용할 수 있는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 포함하는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 이용한 혈관형성 관련 질환의 예측 및 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 표 1에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관형성 관련 질환은 NFAT5 전사인자의 발현이상에 의해 유발된 것을 특징으로 하며, 상기 NFAT5의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 상기 질환은 류마티스 관절염이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커는 상기 표 1의 일련번호 1부터 51까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것으로서, 세포주기 및/또는 증식 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커는 상기 표 1의 일련번호 52부터 71까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것으로서, 세포사멸(apoptosis) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커는 상기 표 1의 일련번호 72부터 77까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것으로서, 신생혈관형성(angiogenesis) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커는 상기 표 1의 일련번호 78부터 84까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것으로서, 세포부착(adhesion) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커는 상기 표 1의 일련번호 85부터 91까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것으로서, 세포이동(migration) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커이다.

또한, 본 발명은 상기 표 1에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 상기 91 개의 유전자들 중 어느 하나의 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 마커를 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 혈관형성 관련 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 상기 표 1에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 혈관형성 관련 질환의 예측 및 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 마커 유전자는 정상 조직 또는 세포에 비해 혈관형성 관련 질환 동물의 조직 또는 세포에서 발현양이 감소 또는 증가되는 것으로 확인됨에 따라, 혈관형성 관련 질환 진단용 마커로 사용할 경우 상기 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 특히 류마티스 관절염을 포함하여 NFAT5 전사인자의 여러 기능 이상과 관련되어 유발될 수 있는 혈관형성 관련 질환을 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 혈관형성 관련 질환인 류마티스 관절염 및 골관절염의 활막세포를 대상으로 상기 세포내에서 발현된 NFAT5의 발현 정도를 면역화학염색법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, 도 1a 내지 1e는 류마티스 관절염의 활막세포를 대상으로 관찰한 것이며, 도 1f 내지 1h는 골관절염의 활막세포를 대상으로 관찰한 것이고, 도 1i는 활막세포에 100mM의 NaCl을 처리하여 삼투 스트레스를 유도한 후, 시간에 따른 NFAT5의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 도 1j 및 1k는 사이토카인의 처리에 따른 NFAT5의 발현 정도 및 세포내에서의 이동을 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 NFAT5의 발현을 억제할 경우, 혈관형성 관련 질환의 증상에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 2a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 콜라겐으로 관절염을 유도한 후, 시간에 따른 통증의 정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 2b는 마우스의 발의 부푼 정도를 측정한 것을 나타낸 그래프이며, 도 2c는 상기 마우스들의 관절 조직 부분을 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색하여 염증 정도, 활막세포의 증식 및 관절의 파괴정도를 관찰한 사진이고, 도 2d는 염증성 세포 침투(IFLM), 활막세포의 증식(SF) 및 관절 파괴(JD) 정도의 측정 결과를 계산한 평균 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 NFAT5이 활막세포의 생존과 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 NFAT5 siRNA를 이용한 결과를 나타낸 것으로서, 도 3a는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA가 도입된 활막세포의 세포 생존율 및 형태를 CCK-8 분석 및 현미경 관찰을 통해 확인한 것을 나타낸 것이고, 3b는 세포사멸 정도를 TUNEL 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 3c는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA를 세포에 각각 처리하고 세포증식을 유도하는 TNF-a 및 TGF-β인 사이토카인을 각각 처리한 후, 세포 증식정도를 비교하여 나타낸 그래프이고, 3d는 NFAT5 siRNA에 의한 세포수의 변화를 나타낸 그래프이며, 3e는 NFAT5 siRNA에 의한 세포 증식 인자인 사이클린 D 및 E의 발현 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 NFAT5의 발현 억제에 따른 혈관내피 세포의 증식 및 이동 변화를 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 4a는 혈관내피세포에 NFAT5 siRNA를 처리한 후, 시간에 따른 세포 생존율을 MTT 어세이를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이고. 도 4b는 NFAT5 siRNA가 처리된 혈관내피세포의 증식 정도에 내피세포 성장인자인 VEGF가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이며, 도 4c는 NFAT5 siRNA에 따른 내피세포에 의한 튜브 형성 억제 정도를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 4d 및 4e는 NFAT5 siRNA가 혈관내피세포의 이동 및 주화성을 억제시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 대식세포의 이동 및 사이토카인의 생성에 NFAT5가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 5a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 3% 티오글리콜레이트를 복강내 주사한 후, 상기 마우스로부터 분리된 대식세포에 LPS 및 IL-1β를 처리한 다음, 대식세포의 이동정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 5b는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포에서 TNF-a의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 5c 및 5d는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포를 LPS 또는 IL-1β으로 자극시킨 후, 생성되는 TNF-a 및 IL-12의 양을 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 FLS 및 HUVEC 에서 NFAT5에 의해 조절되는 분자 표지들(Molecular signatures)의 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 6a는 NFAF5 siRNA를 세포내로 도입시키고 RA FLS에서 NFAT5 mRNA 및 단백질 발현 수준을 RT-PCR(upper panel) 및 웨스턴 블랏 분석(lower panel)으로 측정한 것을 나타낸 것이고, 6b는 HUVEC 세포를 대상으로 수행한 것을 나타낸 것이며, 6c는 NFAF5 siRNA 트랜스펙션 48시간째 RA FLS 또는 HUVEC에서 1373 DEGs의 발현 패턴을 히트맵(Heatmap)으로 나타낸 것이고, 6d는 DEGs의 벤다이어그램을 나타낸 것으로서 RA FLS 및 HUVEC 마이크로어레이 데이터 세트 사이의 중복(overlap)을 나타낸 것이며, 6e는 RA FLS 및 HUVEC에서 NFAT5 siRNA에 의해 방해받는 생물학적 프로세스들 및 세포 타입-의존적 DEGs의 기능분석을 DAVID 소프트웨어를 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이며, 6f는 RA FLS 및 HUVEC에서 NFAT5에 의해 조절 받는 NFAT5, CCNB2, CYR61, 및 RHOB를 포함한 DEGs 서브세트의 정량적 실시간 PCR 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 RA FLS 및 HUVEC에서 NFAT5에 의해 조절받는 유전자들의 실시간 PCR 분석결과를 나타낸 것으로서, RA FLS (a) 및 HUVEC (b)에서 3개의 주요한 세포 프로세스들(세포주기 및 생존, 신생혈관형성, 및 세포 이동)에 관련된 DEGs의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.

본 발명은 혈관형성 관련 질환을 진단 및 예측할 수 있는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커를 제공함에 특징이 있으며, 보다 구체적으로 NFAT5 전사인자와 관련된 질환을 진단 및 예측할 수 있는 마커를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서는 혈관형성을 억제하는 새로운 억제제의 타겟으로 NFAT5 유전자에 초점을 두었는데, 전사인자인 상기 NFAT5(nuclear factor of activated T cells 5)는 NFAT 패밀리의 한 종류로서, NFAT 단백질은 IL-2 프로모터에 결합하여 전사를 촉진하는 작용을 하는 것으로 밝혀진 바 있고, 현재까지 5 종류가 확인되었다. 즉, NFAT 패밀리에는 NFAT1(NFATp 또는 NFATc2), NFAT2(NFATc 또는 NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx 또는 NFATc3) 및 NFAT5로 구성되어 있으며, NFAT 단백질의 가장 중요한 기능으로는 면역세포의 분화와 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, T 세포에서 NFAT 단백질은 흉선세포(thymocytes)의 발달, T 세포의 분화, 자가면역내성(self-tolerance) 등의 활성 및 조절에 관여하며, NFAT 패밀칼슘 신호와 다른 신호의 상호작용에 의해 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 특히 NFAT 패밀리 중에서 NFAT5는 처음에 TonEBP(tonicity enhancer binding protein)으로 동정되었으며, 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자의 상부 조절 부위에 존재하는 긴장성 (tonicity) 반응 요소에 결합하며, 최근에는 NFAT5가 림프구의 증식과 생존에 중요한 역할을 하고, CYR61 의존적 경로를 통해 근육의 분화과정에서 근원세포의 이동을 매개한다는 내용이 보고된 바 있다.

한편, 본 발명에서는 과다한 혈관형성으로 유발되는 질환의 경우, 상기 질환의 세포에서 NFAT5 유전자가 과다 발현되고 있다는 사실을 확인하였으며, 나아가 NFAT5 유전자의 발현을 억제하였을 경우, 상기 질환의 중증도가 감소됨을 확인함으로써 NFAT5의 억제제가 혈관형성 관련 질환을 예방 및 치료할 수 있는 치료제로 사용될 수 있음을 규명하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 과도한 혈관형성으로 인해 유발되는 질환인 류마티스 관절염 및 골관절염의 환자로부터 수득한 활막세포를 대상으로 상기 세포에서 발현된 NFAT5 단백질을 면역화학 염색법을 통해 확인한 결과, 정상인의 활막세포에 비해 류미티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막세포에서는 NFAT5이 과다 발현되고 있다는 사실을 확인하였다(실시예 1 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5가 혈관형성이 정상적으로 조절되지 못하는 경우, 과발현된다는 사실을 알 수 있었다.

일반적으로 혈관형성, 즉 신생혈관은 조직에서 기존의 맥관구조로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정을 말하는데, 병리학적인 혈관형성은 어느 정도의 염증과 거의 일정하게 관련되어 있으며, 따라서 염증을 유발하는 물질에 의해 혈관이 형성 또는 신생될 수 있다.

이에 본 발명자들은 혈관형성 질환에서 과발현되고 있는 NFAT5 유전자가 염증성 사이토카인 및 삼투 스트레스에 의해 발현이 조절되는지를 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 류마티스 관절염 및 골관절염의 환자로부터 수득한 활막세포에 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β와 삼투 스트레스를 유도하는 NaCl을 처리한 다음, 세포내에서의 NFAT5의 발현 및 이동을 웨스턴 블럿 및 공초점 현미경으로 분석한 결과, 염증성 사이토카인 및 삼투 스트레스가 혈관신생 질환에서 NFAT5의 발현을 더욱 증가시킨다는 사실을 알 수 있었으며, 이러한 처리에 의해 발현된 NFAT5 단백질은 세포 내에서 핵으로 이동된다는 사실을 알 수 있었다(실시예 2 참조).

나아가 본 발명자들은 상기 결과를 통해 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제한다면 혈관형성 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 예상을 하였고, 이러한 예상을 규명하기 위해, 본 발명의 일실시예에서는 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스인 NFAT5^+/- 및 대조군으로 NFAT5^+/+ 마우스를 사용하여 항-타입 II 콜라겐 항체를 정맥 주사하여 혈관형성 관련 질환인 관절염을 유도한 후, 시간에 따른 마우스들의 통증 정도를 분석한 결과, 대조군인 NFAT5^+/+ 마우스에 비해 NFAT5^+/- 마우스의 경우, 질환의 중증도가 현저히 감소된 것으로 나타났고, 염증의 정도, 활막의 증식정도 및 관절 파괴 정도도 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(실시예 3 참조).

따라서 상기 결과를 통해 혈관형성 관련 질환 세포에서 NFAT5 유전자의 부분적인 결함만으로도 상기 질환의 중증도를 경감시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, NFAT5 유전자의 발현 억제를 위해 NFAT5 siRNA를 류바티스 관절염 및 골관절염의 활막세포에 형질도입한 후, NFAT5 siRNA에 따른 활막 세포의 세포 생존율 및 세포 증식정도를 측정하였는데, 그 결과, NFAT5 siRNA가 도입된 활막 세포의 경우, 대조군에 비해 아폽토시스가 증가하여 세포생존율은 감소되고 반면 세포 사멸은 증가된 것으로 나타났으며, 세포 증식에 영향을 주는 인자들인 사이클린 D 및 E의 발현도 감소되는 것으로 나타났다(실시예 4 참조). 그러므로 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제하는 것은 병리 세포인 관절염 활막세포의 세포증식을 억제하고 반면 세포사멸을 유도함을 통해 치료학적 효과가 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명에 따른 NFAT5의 발현 또는 활성 억제는 혈관내피세포의 증식 및 이동을 억제하는 특징이 있다.

한편, 혈관형성 이상으로 초래되는 질환 중 암의 경우, 암 조직이 커지기 위해서는 산소 및 영양분의 공급이 요구되며, 이러한 공급통로를 만들기 위해 혈관신생(angiogenesis)이 수반된다. 암 조직에서 혈관신생 과정을 보면, 먼저 암세포가 혈관신생 유도인자를 분비하고 이러한 유도인자가 내피세포에 존재하는 수용체와 결합을 하면서 새로운 혈관의 형성과정이 시작된다. 자극된 내피세포는 성장하기 시작하면서 단백질 가수분해 효소를 분비하게 되고 이러한 단백질 가수분해 효소에 의해 기저막(base membrane)의 분해가 일어나 내피세포가 혈관신생 유도인자가 나오는 곳으로 향하여 움직이게 되는데 이러한 현상을 세포 이동이라고 한다. 이렇게 이동한 내피세포는 혈관 사이에 붙은 후(세포 부착) 침투할 장소로 이동한 다음, 기저막을 뚫고 들어가(세포 침투) 서로 연결되어 튜브를 형성하며, 마지막으로 속이 빈 스프라우트(sprouts)의 끝이 결합하면서 루프가 형성되고 이곳으로 혈액이 들어오게 된다. 즉 이러한 일련의 과정 중 어느 하나가 차단되면 혈관신생을 감소시킬 수 있어 암을 포함하는 혈관신생으로 인해 유도되는 질환을 치료할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

이에 본 발명자들은 NFAT5의 발현 또는 활성 억제가 내피세포의 증식 및 이동을 억제할 수 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA를 도입한 후, 시간별로 내피세포의 세포사멸 및 세포증식 정도를 확인하였는데, 그 결과, NFAT5 siRNA로 형질도입된 내피세포의 경우, 스크램블 siRNA가 도입된 대조군에 비해 세포생존율 및 세포증식이 감소된 것으로 나타났으며, 세포이동 및 튜브형성과 함께 세포 주화성도 감소된 것으로 나타났다(실시예 5 참조).

따라서 NFAT5의 발현 또는 활성 억제는 내피세포의 증식, 이동 및 튜브형성을 감소키는 효과가 있으므로 암을 비롯한 혈관형성으로 인한 질환들을 치료할 수 있는 효과가 있다.

그러므로 본 발명은 NFAT5의 발현 정도에 따라 다르게 발현되는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 혈관형성 관련 질환의 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 혈관형성 관련 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 혈관형성 관련 질환 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 혈관형성 관련 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 혈관형성 관련 질환의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 혈관형성 관련 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명에서 제공하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커는 정상 세포에 비해 혈관형성 관련 질환의 세포에서 발현양이 증가 또는 감소하는 하기 표에 기재된 유전또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 표에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자의 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 혈관형성 관련 질환을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 상기 단백질들이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 혈관형성 관련 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 혈관형성 관련 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 혈관형성 관련 질환 진단용 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 표에 기재된 유전자의 발현수준 또는 그 단백질 수준을 측정하여 혈관형성 관련 질환을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 혈관형성 관련 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 유전자의 발현수준 또는 발현 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 혈관형성 관련 질환 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 발현 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 혈관형성 관련 질환 환자 또는 혈관형성 관련 질환 의심환자에서의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 혈관형성 관련 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

한편, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 혈관형성 관련 질환에는 류마티스 관절염을 포함할 수 있다.

류마티스 관절염은 관절내 활막 세포의 염증으로 인한 비정상적인 증식, 염증 세포의 침윤, 신생 혈관의 과다를 특징으로 하는 자가 면역 질환이다. 류마티스 관절염의 원인은 아직까지 정확하게 규명되지 않았지만, 어떤 항원 물질에 대한 면역 반응 결과 생산되는 사이토카인 같은 면역 반응 매개 물질이 염증세포의 비정상적인 증가를 초래하고 활막염으로 인한 활막세포의 비정상적인 증가와 신생 혈관의 생성, 지속적인 염증 반응을 나타내어 연골이 손상되고 뼈의 손상을 가져와 관절 기능을 제대로 할 수 없는 것으로 알려져 있다. 특히 신생 혈관의 형성은 활막 세포가 증식하고 염증세포가 증식하여 관절염이 지속적으로 진행하여 관절이 파괴되는데 필수적인 역할을 한다. 그러나 류마티스 관절염에서 신생혈관의 생성 기전에 면역 세포인 림프구와 염증 반응이 나타나는 활막 세포간의 상호작용이 어떤 영향을 주는지는 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은 면역 세포인 림프구 표면의 CD40 리간드와 활막 세포 표면의 CD40이 결합하면 강력한 신생혈관 촉진제로 알려진 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 분비가 4배 이상 증가하며 그 과정에 NF-kB라는 세포내 전달물질이 관여함을 학계 최초로 발견하였다(Journal of Immunology, 164(10):5055-5061).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

혈관형성 관련 질환의 세포에서 NFAT5 의 발현 양상 분석

본 발명자들은 과도한 혈관신생으로 인해 발생하는 질환의 세포내에서 NFAT5 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 FLS(fibroblast-like synoviocytes)을 각각 수득한 후(Yoo, S.A et. al., Calcineurin is expressed and plays acritical role in inflammatory arthritis.JImmunol 177,2681-2690, 2006 참조), FCS(fetal calf serum) 또는 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITSA)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 또한, 혈관내피세포인 HUVEC 세포는 정상의 제대혈 정맥으로부터 분리하였고 20% FCS가 함유된 M199 배지에서 배양하였다. 이후, 상기 세포내에서 발현된 NFAT5의 양은 면역화학 염색법을 통해 확인하였는데, 즉, 상기 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 수득한 활막을 5um로 절단한 후, 30분 동안 펩신으로 처리하고 상온에서 30분 동안 BSA(bovine serum albumin)로 블록킹하였다. 그런 뒤, 4℃에서 밤새도록 NFAT5에 대한 항체(Maryland 대학으로부터 구입)를 반응시켰고, 이때 대조군으로 시그마사로부터 구입한 비특이성 마우스의 IgG을 사용하였다. 이후, 각 절편들이 포함된 슬라이드(silde)는 TBS 버퍼로 3번 세척한 후, 습기 있는 챔버에서 바이오틴이 결합된 항-마우스 IgG와 반응시켰다. 그런 뒤, NFAT5 양성 세포들을 33- 디아미노-벤디딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)에 의한 퍼옥시다제-결합형 스트렙타비딘을 이용하여 검출하였고, 상기 슬라이드는 헤마토크실렌으로 염색하였다.

또한, 본 발명자들은 NFAT5가 주위의 삼투성에 의해 발현이 조절된다는 내용이 보고된 바 있어, 상기 FLS 세포에 NaCl를 처리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 NFAT5의 발현 양상을 분석하였는데, 이때 상기 웨스턴 블럿은 100mM의 농도로 NaCl이 처리된 FLS세포를 당업계에 공지된 통상적인 용해 버퍼를 이용하여 용해시킨 후, 불용성 물질들을 12000g에서 20분간 4℃에서 원심분리하여 제거하였다. 이후 수득한 최종 단백질의 농도를 브래드포드 분석을 통해 정량한 다음, SDS-PAGE로 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 전기 이동시킨 후, NFAT5에 대한 항체(Maryland 대학으로부터 구입)를 이용하여 반응시키고 ECL 용액을 사용하여 필름에 가시화 시켰다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막 조직에서 NFAT5는 매우 많은 양이 발현된 것으로 나타났고, 특히 류마티스 관절염의 활막 조직의 경우 골관절염 보다 NFAT5가 더 많이 발현되어 있는 것을 알 수 있었다(도 1a 내지 1h 참조).

또한, 상기 세포에 NaCl을 각 농도별로 처리한 후 NFAT5의 발현정도를 측정한 결과, 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막 세포 모두에서 NaCl 농도 의존적으로 NFAT5의 발현은 증가하는 것으로 나타났다(도 1i 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 과다 혈관생성 질환에서 NFAT5 유전자는 과발현되고 있다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 주위의 삼투압 환경이 조성될 경우, 그 발현양은 더 증가한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

염증성 사이토카인에 의한 NFAT5 의 발현 양상 분석

염증성 사이토카인에 의해 NFAT5의 발현양상이 변화되는지를 조사하기 위해, 상기 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 수득한 활막 세포를 대상으로 전 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β를 각각 10ng/ml의 양으로 처리하고 12시간 배양한 다음, NFAT5에 대한 항체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 TNF-a, IL-1β 및 NaCl의 처리에 따른 NFAT5 단백질의 세포내에서의 이동을 관찰하기 위해 TNF-a 및 IL-1β를 각각 10ng/ml으로 처리하고, 100mM의 농도로 NaCl를 처리한 세포들을 각각 글래스 챔버 슬라이드에 분주한 후, 차가운 메탄올로 고정시키고, 0.25% Triton X-100이 함유된 PBS 용액으로 처리한 다음, NFAT5에 대한 항체를 사용하여 4℃에서 반응시켰다. 이후 Alexa 488-결합된 항 래빗 IgG를 30분 동안 반응시키고 공초점 현미경을 통해 세포내에서의 NFAT5 단백질의 위치를 확인하였으며, 이때 핵은 4,6-디아미노-2-페닐리돌(DAPI)을 사용하여 염색하였다.

그 결과, 도 1j에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β을 처리한 경우, NFAT5의 발현은 처리하지 않은 대조군에 비해 월등히 증가하는 것으로 나타났으며, 발현의 증가 정도는 골관절염에 비해 류마티스 관절염의 경우 더 현저히 증가된 것으로 나타났다. 또한, 공초점 현미경으로 NFAT5 단백질의 위치를 확인한 결과, TNF-a, IL-1β 및 NaCl을 처리한 경우, NFAT5 단백질이 핵으로 이동되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1k 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 염증성 사이토카인 및 삼투성 환경이 혈관신생 질환에서 NFAT5의 발현을 증가시키는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었고, 발현된 NFAT5는 세포 내에서 핵으로 이동되어 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

NFAT5 유전자 결핍에 따른 혈관형성 질환의 중증도 경감 효과

상기 실시예들을 통해 혈관형성 질환의 경우 NFAT5가 과발현되어 있다는 사실을 확인함으로써 NFAT5 유전자가 결핍되어 NFAT5 단백질이 발현되지 못할 경우, 혈관형성 질환의 중증도가 감소될 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, 미국 메릴랜드 대학교 의과대학으로부터 수득한 NFAT5 유전자가 결핍된 8주령의 heterozygous 마우스 NFAT5^+/- 및 대조군으로 NFAT5^+/+ 마우스를 대상으로 관절염을 유도할 수 있는 항-타입 II 콜라겐 항체(5mg)를 정맥 주사한 후, 3일 후에는 50ug의 LPS를 복강내 투여하였다. 이후, 마우스들을 매일 주시하여 관찰하였고, 통증의 정도는 마우스의 팔다리를 관찰하여 통증의 정도에 따라 0~4점을 부여하도록 하였고, 각 마우스당 최대 점수는 16점이 될 수 있도록 하였다. 또한 통증의 정도는 마우스의 발 두께를 측정함을 통해 분석하였는데, 즉 앞발과 뒷발을 매일 마이크로캘리퍼를 사용하여 두께를 측정하였으며, 특정 시간에 발목의 직경을 항체 주입 후 0일째의 두께 측정치로 나눈 값을 발두께 색인으로 사용하였으며, %로 표시하였다. 중증도의 점수는 0~3점으로 측정하였는데, 0은 통증이 없는 것을, 1은 약한 정도의 통증을 2는 보통, 3은 심각한 통증으로 하였다.

나아가 본 발명자들은 NFAT5^+/- 및 NFAT5^+/+ 마우스를 대상으로 관절 부분의 조직을 당업계에 공지된 헤마토크실렌 및 에오신 염색법을 사용하여 염증 정도, 활막의 증식 및 관절 파괴정도를 관찰하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 콜라겐으로 유도된 관절염의 증상은 NFAT5 유전자가 정상적으로 발현되는 NFAT5^+/+ 마우스에 비해 NFAT5^+/-의 경우, 중증도가 감소한 것으로 나타났으며(도 2a), 마우스의 발 두께를 측정하여 관절의 이상정도를 분석한 결과, 관절 발목의 두께 또한 NFAT5^+/+ 마우스에 비해 NFAT5^+/-가 현저히 얇은 것으로 나타났고(도 2b 참조), 면역학적 염색을 통해서도 NFAT5^+/-의 경우 염증 정도, 활막의 증식 및 관절 파괴정도가 NFAT5^+/+ 마우스에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5 유전자의 부분적인 결함만으로도 관절염을 포함하는 혈관형성 질환의 증상을 현저하게 감소시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

NFAT5 의 활막세포에서의 역할 분석

상기 결과를 통해 NFAT5 유전자의 결함이 혈관형성 질환의 증상을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인하였는데, 본 발명자들은 NFAT5 유전자가 실제적으로 활막세포에서 세포의 생존 및 증식에 어떠한 역할을 하는지 조사하였다. 이를 위해, NFAT5의 발현을 억제할 수 있는 siRNA로서 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 NFAT5 siRNA 및 대조군으로 사용하기 위한 컨트롤 NFAT5 siRNA를 각각 제조하였다. 이후, 류마티스 관절염 또는 골관절염의 활막세포에 NFAT5 siRNA(서열번호 2~7 및 서열번호 12~17)를 각각 주입시킨 후, 72시간 배양한 다음, 세포의 생존율 및 형태를 관찰하였다. 이때 대조군으로는 하기 표 1에 기재된 콘트롤 siRNA(서열번호 8~11)를 세포에 각각 주입한 것을 사용하였으며, 서열번호 2~5 및 서열번호 12~17의 NFAT5 siRNA에 대한 대조군 siRNA는 서열번호 8 및 9의 siRNA을 사용하였고, 서열번호 6 및 7의 NFAT5 siRNA에 대한 대조군으로는 서열번호 10 및 11의 siRNA를 사용하였다. 세포 형태는 현미경을 통해 관찰하였고, 세포 생존율은 당업계에 공지된 MTT 분석 방법 또는 세포 카운팅 키트-8(cck-8)를 사용하여 수행하였고, 아폽토시스는 TUNEL 분석을 통해 수행하였다. TUNEL 분석은 Apotag 퍼옥시다제를 사용하여 수행하는 방법으로서, 관절염의 활막 세포를 4개의 챔버 슬라이드에서 배양한 후, NFAT5 siRNA를 상기 세포에 형질도입 시키고 24시간 후에 PBS로 세척한 다음, 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정시켰다. 이후, 고정된 세포들은 digoxigenin- 결합된 dUTP와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하여 TdT 카탈라제 반응시켰다. 이후 상온에서 반응 정지 용액을 처리하였고, 30분동안 퍼옥시다제가 결합된 항- digoxigenin 항체와 반응시킨 다음, 아폽토시스에 의해 절단된 DNA 절편을 퍼옥시다제의 기질인 DAB를 이용하여 염색하여 측정하였다.

NFAT5 siRNA 서열

NFAT5 siRNA 종류	염기서열	서열번호
297R NFAT5 siRNA(S)	5-augcccucggacuucaucucauu-3'	2
297R NFAT5 siRNA(AS)	5'-ugagaugaaguccgagggcauuu-3'	3
569R NFAT5 siRNA(S)	5'-augggcggugcuugcagcuccuu-3'	4
569R NFAT5 siRNA(AS)	5'-ggagcugcaagcaccgcccauuu-3'	5
Control inv569R(S)	5'-ccucgacguucguggcggguauu-3'	8
Control inv569R(AS)	5'-uacccgccacgaacgucgagguu-3'	9
NFAT5 siRNA(S)	5′-cccucucagcaaggguuau(dtdt)-3′	6
NFAT5 siRNA(AS)	5′-auaacccuugcugagaggg(dtdt)-3′	7
Control siRNA(S)	5′-uucuccgaacgugucacgu(tt)-3′	10
Control siRNA(AS)	5′-acgugacacguucggagaa(tt)-3′	11
A_NFAT5 siRNA(S)	5′-GCAAAGAAGUGGACAUUGA(tt)-3′	12
A_NFAT5 siRNA(AS)	5′-UCAAUGUCCACUUCUUUGC(tt)-3′	13
B_NFAT5 siRNA(S)	5′-GCAUAGCUGUUCAGUGAAA(tt)-3′	14
B_NFAT5 siRN(AS)	5′-UUUCACUGAACAGCUAUGC(tt)-3′	15
C_NFAT5 siRNA(S)	5′-GCAAGUAACUCUCUUCUUA(tt)-3′	16
C_NFAT5 siRNA(AS)	5′-UAAGAAGAGAGUUACUUGC(tt)-3′	17

또한, 세포 증식 정도는 NFAT5 siRNA를 세포에 형질도입 시킨 후, 10ng/ml의 TNF-a 또는 TNF-β를 각각 처리한 후, 당업계에 공지된 일반적인 방법인 [³H] 티미딘 도입 방법을 사용하여 측정하였는데, 증식 정도는 c.p.m으로 나타내었으며, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였고, 상기 분석은 3번씩 동일한 방법으로 수행하여 얻은 평균값으로 계산하였다. 아울러 세포 증식에 관여하는 인자인 사이클린 D, E의 발현정도도 웨스턴 블럿을 통해 확인하였으며 웨스턴 블럿은 사이클린 D 및 E의 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예에서 기술한 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

그 결과, 관절염의 활막세포에 서열번호 2~7 및 서열번호 12~17의 NFAT5 siRNA를 형질 도입한 경우, 대조군에 비해 활막 세포의 세포생존율이 감소되는 것으로 나타났으며(도 3a 참조), 반면, TUNEL 분석 결과 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포의 경우, 아무것도 처리하지 않은 세포 및 스크랩블 siRNA를 처리한 군에 비해 아폽토시스가 현저히 증가한 것으로 나타났다(도 3b). 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5가 활막세포의 세포사멸을 조절하는 역할을 한다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 NFAT5 유전자의 발현을 억제할 경우, 관절염 질환의 활막 세포에서 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.

나아가 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포에서는 염증성 사이토카인의 처리에도 불구하고 활막 세포의 세포증식이 억제되는 것으로 나타났고(도 3c 및 3d 참조), 세포증식에 영향을 주는 인자들인 사이클린 D 및 E의 발현 또한 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포에서는 감소되는 것으로 나타났다(도 3e 참조).

< 실시예 5>

NFAT5 의 내피세포의 증식 및 이동에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 NFAT5가 활막 세포 이외에도 혈관형성에 중요한 역할을 하는 내피세포의 증식 및 이동에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 대해 상기 실시예 4에서 사용한 NFAT5 siRNA를 형질도입 시킨 후, 각 시간별로 세포사멸 정도 및 세포증식 정도를 조사하였는데, 세포사멸 및 세포증식은 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. 또한, 이 외에도 HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA를 도입한 후, HUVEC 세포의 이동 및 튜브 형성을 조사하였는데, 먼저 세포이동 측정은 60mm 세포배양 디쉬에 NFAT5 siRNA이 도입된 HUVEC 세포 및 siRNA를 처리하지 않은 세포를 분주하여 디쉬에 가득 차도록 배양한 후, pipette tips을 이용하여 디쉬를 긁은 후, 1mM 티미딘 및 1% FBS가 첨가된 M199 배지에 VEGF₁₆₂(20ng/ml)을 처리하고 12시간 배양하였다. 이후, 세포수를 카운팅 하여 세포의 이동정도를 측정하였다. 또한, 튜브 형성은 HUVEC 세포를 VEGF₁₆₂(20ng/ml)가 첨가된 폴리머화된 마트리겔(BD Bioscience, CA)에 분주한 후, 12시간 배양한 다음 형성된 튜브의 길이를 측정함으로써 분석하였고, 이미지-Pro Plus v4.5를 이용하여 관찰하였다.

또한, 본 발명자들은 HUVEC 세포에서 NFAT5에 의한 세포 주화성(chemotaxis)을 조사하였는데, 주화성 조사는 직경 6.5mm 폴리카보네이트 필터(8um 기공크기)가 구비된 트랜스웰 챔버를 이용하여 분석하였다. 즉,1% FBS가 함유된 DMEM 배지로 준비된 VEGF(50ng/ml)을 하부 웰에 첨가하고, 상부 웰에는 1% FBS가 함유된 DMEM으로 현탁된 5 x 10⁴세포수/ml의 세포를 첨가한 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 필터 상부 표면에서 이동되지 않은 세포들은 면봉을 이용하여 제거하였고, 이동된 세포들은 Diff-Quik 키트를 이용하여 고정 및 염색하였다. 주화성 분석은 현미경을 이용하여 x 200 배율에서 이동된 세포의 수를 카운팅 함으로써 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17의 NFAT5 siRNA을 형질도입한 경우, 대조군에 비해 세포 생존율 및 새포 증식정도가 감소한 것으로 나타났으며, 세포 증식 분석에서 성장인자인 VEGF의 존재 여부와 관계없이 NFAT5 siRNA의 처리에 의해 세포의 증식이 감소되는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b 참조). 또한, 혈관내피세포의 튜브 형성도 상기 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17의 NFAT5 siRNA을 처리한 군의 경우, 대조군에 비해 튜브 형성 정도가 감소하는 것으로 나타났으며(도 4c 참조), 세포의 이동 분석에서도 본 발명에 따른 NFAT5 siRNA을 처리한 경우, VEGF에 의한 세포 이동이 억제되는 것으로 나타났다(도 4d 참조). 세포 주화성 분석 결과, HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA을 형질 도입한 경우, VEGF₁₆₂에 의한 혈관내피세포의 주화성도 현저히 감소되는 것으로 나타났다(도 4e 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 NFAT5의 억제제인 NFAT5 siRNA를 혈관내피세포에 처리하였을 경우, 혈관내피세포의 세포증식, 튜브형성, 세포이동 및 세포 주화성이 모두 억제되는 것으로 나타난 반면, 세포 사멸은 증가하는 것으로 나타났다.

그러므로 본 발명자들은 본 발명에 따른 NFAT5의 억제제, 특히 NFAT5 siRNA는 혈관내피세포의 증식을 억제할 수 있으며, 신생혈관 또는 혈관형성으로 인해 유발될 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

NFAT5 가 마크로파지의 이동 및 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석

나아가 본 발명자들은 NFAT5가 마크로파지 이동 및 사이토카인 생성에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, 3%의 티오글리콜레이트를 NFAT5^+/- 및 NFAT5^+/+ 마우스에 복강내로 주사한 후, 4일 이후에 Lavage fluid로부터 분리한 복강내 대식세포(Kreckler, L.M., Wan, T.C., Ge, Z.D. & Auchampach, J.A. Adenosine inhibits tumor necrosis factor-alpha release from mouse peritoneal macrophages via A2A and A2B but not the A3 adenosine receptor. JPharmacolExpTher 317,172-180, 2006 참조).를 대상으로 상기 대식세포에 LPS(1ug/ml) 또는 IL-1β(10ng/ml)을 12시간 처리한 다음, 세포의 수를 카운팅 하여 마크로파지 즉 대식세포의 이동 정도를 조사하였다.

또한, 사이토카인의 생성은 상기 방법으로 분리된 복강내 대식세포(3X10⁴ cell/ml)를 LPS(1ug/ml) 또는 IL-1β(10ng/ml)로 12시간 처리한 다음, 배지의 상층액을 수집한 후, ELISA를 이용하여 LPS 또는 IL-12의 생성량을 측정하였다. 또한 상기 배양된 세포는 FITC-표지된 항-TNF-a 항체로 30분간 반응시킨 후, 0.1% FBS 및 0.01% NaN₃를 포함하는 PBS 버퍼로 희석한 후, FACS 캘리버(Becton dickinson, mountain view, CA)기기를 사용하여 생성된 TNF-a의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 혈관형성 및 혈관염증에 관여하는 대식세포의 이동에 있어서 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스의 경우에는 염증성 사이토카인의 처리에 의한 대식세포의 이동이 NFAT5 유전자가 정상적으로 발현되는 마우스 군에 비해 감소된 것으로 나타났다(도 5a 참조).

또한, 생성되는 사이토카인의 양을 비교 분석한 결과, IL-12 및 TNF-a의 생성량은 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스의 경우, NFAT5 유전자가 존재하는 마우스에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 5b 내지 도 5d 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 세포, 특히 혈관이 과다 형성된 세포에서 NFAT5 유전자의 발현을 억제할 경우, 혈관형성을 자극하는 사이토카인의 생성을 억제함과 동시에 혈관형성에 관여하는 대식세포의 이동을 억제함을 통해 혈관형성을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 NFAT5의 억제제를 혈관형성에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

NFAT5 의 하향조절( downregulation )에 의해 차별 발현되는 유전자들( DEG : differentially expressed genes)의 동정

(1) DEGs 의 동정

dummy siRNA 또는 NFAT5 siRNA로 트랜스펙션시킨 RA FLS (n=3) 및 HUVEC (n=4) mRNA를 Illumina HumanRef-8 (RA FLS의 경우) 및 HumanHT-12 (HUVEC의 경우)를 사용하여 프로파일링하였다. 트랜스펙션시키지 않은(untransfected) 세포들을 대조군으로 사용하였다. 상기 어레이(array)들로부터의 강도는 분위수 정규화 방법(quantile normalization method)을 사용하여 표준화되었다(Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M. & Speed, T.P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19, 185-193 (2003)). 표준화된 강도를 사용하여, 대조군 siRNA 및 NFAT5 siRNA-transfected 샘플들 사이의 DEGs 를 결정하였다. 상기 결정은 다음과 같은 통합적 통계 가설 시험(integrated statistical hypothesis testing)을 사용하여 이루어졌다: 1) 2개의 독립적 테스트인, T-test 및 log2 median ratio test를 수행하였다; 2) 각각의 테스트의 P values들은 유전자들의 평균이 다르지 않다는 null 가설의 경험적 분포(empirical distribution)를 사용하여 계산되었으며, 이것은 샘플들의 임의적 순열(permutation)로부터 얻어졌다; 3) FDR을 계산하기 위해 Stouffer 법을 사용하여 개별적인 P value들을 조합시켰고(Hwang, D., et al . A data integration methodology for systems biology. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 17296-17301 (2005)), 4) DEGs 는 0.01 미만의 FDR 및 1.5 컷오프 이상의 fold change를 갖는 유전자들로 선별되었다. 마지막으로, NFAT5에 의해 지배되는 DEGs에 의해 과잉표상되는(overrepresented) 세포 프로세스를 동정하기 위하여 DAVID 소프트웨어를 사용하여 DEGs의 기능분석(functional enrichment analysis)을 하였다.

(2) 실시간( real - time ) PCR

대용량(High Capacity) cDNA RT 키트(Applied Biosystems)를 생산자의 지시에 따라 사용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. SYBR Premix (Takara)를 생산자의 지시에 따라 사용한 Thermal cycler dice real-time systems (Takara)를 이용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. β-actin (ACTB)을 PCR 증폭의 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. 전사체의 수준은 대조군에 대한 상대값으로 측정하였고, 2^{-ΔΔ CT} 으로 표현하였다(Yuan, J.S., Reed, A., Chen, F. & Stewart, C.N., Jr. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics 7, 85 (2006)). 상기 데이터는 3반복의 평균 및 표준편차로 나타내었다. 유전자-특이적 프라이머들은 다음과 같다.

실시간 PCR 분석용 프라이머들

유전자	순방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열번호
ACTB	5'-CAACTGGGACGATATGGAGAAG-3'	18	5'-TCTCCTTCTGCATCCTGTCAG-3'	19
AURKA	5'-CATTCCTTTGCAAGCACAAA-3'	20	5'-TTTTGATGCCAGTTCCTCCT-3'	21
AURKB	5'-TGCATTGGAGTGCTTTGCTA-3'	22	5'-TTATGCCTGAGCAGTTTGGA-3'	23
BMP4	5'-ACGGTGGGAAACTTTTGATG-3'	24	5'-TTGAGGTAACGATCGGCTAA-3'	25
CASP4	5'-AAGGACAAACCCAAGGTCAT-3'	26	5'-CGTTGAAGAGCAGAAAGCAA-3'	27
CCL2	5'-GCTGAGACTAACCCAGAAACATC-3'	28	5'-GGAATGAAGGTGGCTGCTAT-3'	29
CCNB2	5'-TTCTTAAGGCGAGCATCAAA-3'	30	5'-GCTGCTTTAAGTTCCATTTTCC-3'	31
CCNE2	5'-CACTGAAAAACCACCAGGAAA-3'	32	5'-TAGGGCAATCAATCACAGCA-3'	33
CDH11	5'-TGTCCGTGAGAACATCATTACTT-3'	34	5'-TGTCTTTGCGGGGGATAAAT-3'	35
CIDEA	5'-AGAAAAGGAAAGGGCTTGGT-3'	36	5'-GTCATTCTTGCGATGGGTTT-3'	37
CTGF	5'-TGACAGTCCGTCAAAACAGA-3'	38	5'-CAAATGCTTCCAGGTGAAAAA-3'	39
CYR61	5'-TTTGGAGCTTGTGGAGTTGA-3'	40	5'-TGCCCTCCCATTTACTTTTG-3'	41
HRK	5'-TTCGAGAAGGAAGTGGAGAGTAAAG-3'	42	5'-TCTGTTTCTGCAGCTGGATTT-3'	43
HSPA2	5'-GCGTAAACCTCTTTGCCTTTC-3'	44	5'-GCACCTCTCCTTTCATTTGC-3'	45
NRP1	5'-TAACAGCACAGGGAAGCAAA-3'	46	5'-GCAAATGTGACTCCCAACAA-3'	47
RHOB	5'-TGCCATAAGCGAACTTTGTG-3'	48	5'-TCGTATGCAAATGACGAGTG-3'	49
TGFB2	5'-TGTTCATGAATGGCTTCACC-3'	50	5'-GTGCCATCAATACCTGCAAA-3'	51
TNFRSF1B	5'-AGTTGGACTGATTGTGGGTGT-3'	52	5'-TTATCGGCAGGCAAGTGA-3'	53
TNFRSF6B	5'-TTCTCACAGACGTGCACAGA-3'	54	5'-ACGAGATCTTGCTCTGGGTCTT-3'	55

(3) 결과

NFAT5가 결핍된 마우스에서 관절염(arthritis) 억제에 대한 가능한 기작(들)을 체계적으로 조사하기 위하여, RA FLS 및 HUVEC(human umbilical vascular endothelial cells)의 mRNA 프로파일링(profiling)을 수행하였다. 이들은 침습적 판누스(invasive pannus)의 두 가지 세포 구성물들이다. 세포들에 NFAT5 siRNA 를 처리한 후, 완전배지(complete medium)에서 추가로 48시간 동안 배양하였다. 본 발명자들은 RA FLS에서 NFAT5 siRNA가 NFAT5 mRNA의 수준 및 단백질 발현을 감소시킨다는 것(도 6a)과 HUVEC에서 단백질의 수준을 감소시킨다는 것(도 6b)을 확인하였다. 그 후 분위수 정규화 방법(quantile normalization method)을 사용하여(Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M. & Speed, T.P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19, 185-193 (2003)), RA FLS 및 HUVEC 데이터세트 각각에 대해 모든 프로브들의 강도를 표준화하였다. 그 후 각각의 세포 타입에서 대조군 siRNA 및 NFAT5 siRNA를 처리한 샘플들 사이에서 서로 다르게 발현된 유전자들(DEGs)을 integrative statistical testing을 이용하여 동정하였다. 그 결과 RA FLS 및 HUVEC 데이터세트에서 각각 682(NFAT5 siRNA 처리 샘플들에서 310 상향조절(upregulated) 및 372 하향조절된(downregulated) 유전자들) 및 910(457 상향조절 및 453 하향조절된 유전자들) DEGs를 동정하였다(false discovery rate (FDR) < 0.01 및 fold change > 1.5)(도 6c)(표 1).

총 1373 DEGs 중에서, RA FLS 및 HUVEC에서 각각 463 및 691 유전자들이 다르게 발현되었고, 219 DEGs 들이 RA FLS 및 HUVEC에 의해 공유되었다(P = 0.00001)(도 6c 및 6d). 상기 공유되었거나 세포 타입에 의존적인 DEGs 에 대해 DAVID 소프트웨어(Huang da, W., Sherman, B.T. & Lempicki, R.A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4, 44-57 (2009))를 사용하여 기능분석(functional enrichment analysis)을 수행한 결과, 상기 DEGs 는 주로 RA 발병과 밀접하게 관련이 있는 세 개의 세포 프로세스, 즉 1) 세포주기 및 생존, 2) 신생혈관형성(angiogenesis), 및 3) 세포 이동(cell migration) 와 관련이 있다는 것을 보여주었다(도 6e). 예를 들어, 219 DEGs 중 41개는 41 DEGs 가 세포주기에 관련되어 있었으며(P=2.2010^-14), 그 중 38 DEGs 가 하향조절 되었고(downregulated) 단지 3 개가 상향조절 되었으며(upregulated), 이것은 NFAT5가 RA FLS 및 내피세포(endothelial cells)의 증식을 촉진하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, RA FLS 에서 우점하는 463 DEGs 중 39개는 세포 사멸의 조절과 관련이 있는 반면, HUVEC에서 우점하는 691 DEGs 중 25 및 21 개는 각각 세포이동 및 신생혈관형성(angiogenesis)과 관련이 있으며(도 6e), 이것은 그들이 세포-타입에 특이적인 세포 프로세스를 나타낸다는 것을 암시한다. 세포주기, 세포사멸, 신생혈관형성, 및 이동과 관련된 19 DEGs의 정량적 실시간(quantitative real time) PCR 분석으로 독립적인 RA FLS 및 HUVEC 샘플들에서 그들의 발현수준의 변화를 확인하였다(도 6f 및 도 7).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Markers for diagnosing angiogenesis-related diseases and use thereof <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFAT5 gene sequence(transcript varient 6) <400> 1 tgcaacggaa acttttggct ccacgaacag aaaagcaaga gcaaaaactc agttaaatgc 60 gttcttcctc catctttgcc tagtccaaaa ggaaaaaaaa agaaacagaa aaaagaaaaa 120 ctgtttggaa gagtagcgtt gaggtttgct ttttacctgt ttttcctcta gaacagccag 180 gtggattcac atgatccaat tttttaattg tcttctatgt cccactccga ataacccgga 240 tgccccagca caatcagaga gatcgttttt tttaaaaaaa atttcagcct ccaaaggtag 300 gaggggagtg ttaggggaga aagtacttta attaaaaatc aataactcga ggtttttggg 360 atacggtttg ccatttccta attaagaaat gggtttgaca gtccctttgt acacactgct 420 atgcaaaccc caaagggttg gcggctgtcc gggcgatgac actccggtcc cctgcgagac 480 cccgggccag ccaggcccgt ccgccgccgg cctctggggt ccgtccccgg ctcgcgcaga 540 cctctcgctt ctctcggctc tgtctcctgc gctcagctct gctcggggcc ggccgcctca 600 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tgttgctgct gatgcttctt cagctccctc ctcttcctcc atgggcggtg 1500 cttgcagctc ctttaccacc tcttccagcc ctaccattta ttctacctca gtcaccgaca 1560 gcaaggctat gcaagtggag agctgctcct cagccgtggg ggtaagtaac agaggggtaa 1620 gtgaaaagca gttaaccagt aacacagttc agcagcatcc atcaacaccg aagaggcaca 1680 cagtcttgta catctcacca ccacctgagg acttgctgga taacagtcgg atgtcctgcc 1740 aggatgaggg gtgtggattg gaatctgagc agagctgcag tatgtggatg gaggattccc 1800 cctccaactt cagtaacatg agcaccagtt cctacaatga taacactgag gtacctcgta 1860 aatcacgaaa acgaaatcca aagcagaggc cgggggtcaa acgacgagat tgtgaagaat 1920 ctaatatgga tatatttgat gccgacagtg ccaaagcacc tcactatgtg ctttctcagc 1980 ttaccacgga caacaaaggc aactcaaaag cgggaaatgg aacattggaa aaccaaaaag 2040 gaactggagt aaagaagagc cctatgttgt gtggacaata tcctgttaaa agtgagggaa 2100 aggagctgaa gatagttgta caacctgaga cacagcaccg agctcggtac ctgactgagg 2160 gcagccgtgg ctcagtgaaa gatagaacac agcaaggctt tcctacagta aagctggaag 2220 gccataatga acctgtagtg ttgcaagtgt ttgtgggcaa cgactctgga cgagtgaaac 2280 cacatggatt 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C_NFAT5 siRNA(AS) <400> 17 uaagaagaga guuacuugc 19

Claims (12)

1. 하기 표에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커.
   

   

   
   

   

   
   

   
2. 제1항에 있어서,
   상기 혈관형성 관련 질환은 NFAT5의 발현 이상에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 혈관형성 관련 질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
4. 제1항에 있어서,
   상기 표의 일련번호 1부터 51까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주기 또는 세포증식 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
5. 제1항에 있어서,
   상기 표의 일련번호 52부터 71까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포사멸(apoptosis) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
6. 제1항에 있어서,
   상기 표의 일련번호 72부터 77까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 신생혈관형성(angiogenesis) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
7. 제1항에 있어서,
   상기 표의 일련번호 78부터 84까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포부착(adhesion) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환 진단용 마커.
8. 제1항에 있어서,
   상기 표의 일련번호 85부터 91까지의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포이동(migration) 기능 이상에 의해 유발되는 혈관형성 관련 질환의 진단용 마커.
9. 제1항의 표에 기재된 91개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 키트.
10. 제1항의 마커를 포함하는 혈관형성 관련 질환 진단용 마이크로어레이.
11. (a) 혈관형성 관련 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 91 개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 혈관형성 관련 질환의 예측 및 진단 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관형성 관련 질환의 예측 및 진단 방법.
    

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