KR100861464B1 - 발암/전이유전자 ｔｉｐ41과 이에 의해 코드되는 단백질 및이를 이용한 발암 및 전이 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 위암 유발 유전자 TIP41 및 이에 의해 코드 되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 위암 유발 유전자는 기존의 보고된 발암 유전자들과는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로 위암의 진단, 형질 전환 세포주와 동물의 제조, 안티-센스(anti-sense), siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 위암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

위암, TIP41, 발암 유전자, 세포증식, 진단, 치료

Description

발암/전이유전자 ＴＩＰ41과 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 발암 및 전이 진단 키트{A carcinoma gene TIP41, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same}

본 발명은 신규 위암 유발 유전자 및 이에 의해 코드 되는 단백질에 관한 것으로, 유전자 치료, 발암/전이 진단 키트, 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

인간을 포함한 고등 동물들은 약 30,000개의 유전자를 갖고 있으며, 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상, 즉 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기 조절, 노화 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다(Liang, P. and A.B. Pardee, Science, 257: 967-971, 1992).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 되며 이러한 유전자 변화는 세포 신호체계의 이상을 초래하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라 할 수 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 발암/전이 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양 억제유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간 종양을 일으킨다고 보고되고 있다 (Bishop JM 등, Cell, 64: 235-248, 1991; Hunter T. 등, Cell, 64:249-270, 1991). 또한, 암의 10~30%는 발암/전이 유전자가 증폭됨으로써 발암/전이 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다. 발암/전이 유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

간암은 가장 일반적이면서도 치료하기 힘든 암 중의 하나로, 매년 세계적으로 50만명 이상이 간암으로 사망하고 있다(Parkin 등, Eur J Cancer, 37(8): S4-S66, 2001). 최근 10년간 간암 발병률은 개발도상국에서 높았으나, 서양 국가들에서도 발병률이 높아지고 있는 추세이다(Di Bisceglie AM 등, Hepatology, 28: 1161-5, 1998; Schafer DF 등, Lancet, 353: 1253-7, 1999). 간암 환자들의 진단과 치료는 종양의 특성에 의존할 뿐만 아니라, 만성 간질환 상태에 놓여있는 심각성에 따라 크게 의존한다. 그러므로 최근 CLIP( Cancer of the Liver Italian Program) score system과 같은 간암의 진단 마커들이 개발되고 있으며 (Ueno S 등, Hepatology, 34: 529-34, 2001), 종양과 환자의 특징을 모두 고려하여 점수화한 것이다.

간암의 병인학에 관련해서는 이미 많은 보고가 되면서 잘 알려진 반면, 간암의 발병원인의 분자적 메카니즘에 관하여는 아직 잘 알려지지 않고 있다. 최근의 분자생물학적 연구에 의해 변형 성장인자-α(TGF -α) (Grisham 등, Physiol Gastrointest Liver Physiol., 280(1): G139-48, 2001)와 인슐린 유사 성장인자-2(IGF -2)를 포함하는 몇몇의 성장 인자들은 간암 발병에 영향을 주는 것으로 알려졌다. 또한 E- 카테린 , MMP -1, MMP -7, MT1 - MMP , gankyrin , SMYD3 , WDRPUH 그리고 PEG10과 같은 유전자들이 간암의 발생과 진행에 관련이 있다고 보고되고 있으며(Feitelson MA 등, Oncogene, 21(16): 2593-2604, 2002; Hamamoto R 등, Nat Cell Biol ., 6: 731-740, 2004; Silva FP 등, Neoplasia, 7: 348-355, 2005), p53과 AXINI와 같은 유전자는 간암발생에 있어서 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다(Tanaka S 등, Cancer Res., 53: 2884-2887, 1993; Satoh S 등, Nat Gene ., 24: 245-250, 2000). 그러나 이러한 유전자만으로 간암의 진단 및 치료에 이용하기에는 아직 한계가 있다.

위암은 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다(Parkin 등, Int . J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut 등, Semin . Oncol. 23: 281-291, 1996). 위암과 관련한 유전자는 별로 보고되고 있지 않으나, 최근 분자적 생물학적 분석으로 p53 (Yokozaki 등, Int . Rev . Cytol . 204: 49-95, 2001), β- 카테닌 (박 등, Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999), E- 카데린 (Berx 등, Hum . Mutat. 12: 226-237, 1998), 삼엽형 인자 1(trefoil factor 1) (박 등, Gastroenterology 119: 691-698, 2000), c- met (이 등, Oncogene 19: 4947-4953, 2000)과 같은 유전자들이 위암에서 많은 유전적 변이가 있다고 보고되고 있다. 그리고 CA11 (Yoshikawa 등, Jpn . J. Cancer Res . 91: 459-463, 2000; Shiozaki 등, Int . J. Oncol . 19: 701-707, 2001)과 위장 점막에서 합성되는 삼엽형 인자(trefoil factor)인 TFF1과 TFF2(Shiozaki 등, Int . J. Oncol . 19: 701-707, 2001; Kirikoshi와 KatohKirikoshi, Int . J. Oncol. 21: 655-659, 2002)과 같은 유전자들이 위암에서 저발현된다는 보고도 있다. 또한 장 타입의 위암에서 발현되는 23,040개 유전자로 이뤄진 cDNA 마이크로어레이를 이용해 RPL10 , HSPCB , LOC56287 , IGHM , PGC , REGIA , RNASE1 , TFF1, TFF2 유전자들의 발현이 위암 전이와 관련 있다는 사실을 보고한 바 있다 (Hasegawa 등, Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002). 그러나 이러한 유전자만으로 위암을 진단/ 치료하기에는 아직 불충분하며 현재까지 임상에 사용되는 위암 타겟 유전자는 존재하지 않는 실정이다.

TIP41 유전자는 TIPRL(TOR signalling pathway regulator-like)로도 불리며, 효모에서 처음 분리되었다. TIP41 단백질은 효모에서 TAP42 단백질과 상호작용함으로써 라파마이신(rapamycin)에 반응하는 TOR 신호전달체계를 음성적으로 조절한다고 알려져 있다(Jacinto E 등, Mol cell . 8(5): 1017-26, 2001). 인간의 TIP41 유전자는 효모의 TIP41 유전자와 37% 상동성을 가지며, NF-kappaB 신호전달 체계와 MAPK 신호전달 체계를 활성화한다고 알려져 있다(Matsuda A 등, Oncogene., 22(21): 3307-3318, 2003). 인간 TIP41 유전자의 기능은 효모에서 나타나는 TIP41 유전자의 기능과 달리 세포의 증식을 활성화할 것으로 예상되나, 지금까지 인간 TIP41 유전자의 기능으로 알려진 것들 중 간암이나 위암 또는 암 발생 등과 관련해서는 어떠한 보고도 없는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 간암 또는 위암 발암/전이 유전자인 TIP41의 유전자 서열과 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발암/전이 유전자 또는 그의 단편 및 항체를 포함하는 위암 또는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발암/전이 유전자 또는 그의 단편으로부터 유래되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 siRNA를 제공하고, 이를 사용하여 위암 또는 간암의 발병 또는 전이를 치료 또는 예방하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발암/전이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 또는 간암 발병/전이 억제제의 스크리닝 방법 및 저분자 물질을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 TIP41 유전자가 위암 또는 간암 조직에서 그 발현이 증가한 것에 착안하여 상기 유전자가 암 발생과정에 관여할 것으로 사료되어, 암 발생과 관련한 상기 유전자의 기능을 연구한 결과, TIP41 유전자는 위암 또는 간암에서 특이적으로 발현이 증가하며, 발암/전이 관련 기능을 가진다는 것을 밝혀내었다. 또한 세포증식 신호 전달체계의 한 요소로 작용하며, 암의 전이에도 관여한다는 사실을 밝혀내었다. 따라서 상기 유전자는 발암/전이와 관련한 유전자로 기능하며 위암 또는 간암의 진단 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

이에, 본 발명자는 실시간(real time) RT-PCR 방법에 의해 위암 또는 간암 환자 시료에서 TIP41 유전자가 고발현됨을 확인하고, 상기 유전자의 과발현 또는 siRNA를 이용한 억제에 의해 세포주의 세포증식과 종양 형성능이 활성/억제되는 것을 확인하고 종양의 전이가능성을 증명함으로써 TIP41 유전자가 위암 또는 간암의 발암/전이 유전자임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 기존의 보고된 발암/전이 유전자들과는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규유전자로 위암 또는 간암의 진단 및 치료의 마커로서 위암의 진단, 형질 전환 세포주와 동물의 제조, siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 위암 또는 간암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명은 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 위암 또는 간암 마커 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 정상 대조군과 비교하여 TIP41 단백질 양의 증가로 위암 또는 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 위암 또는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

또한, 본 발명은 TIP41 mRNA를 정량적으로 검출하는 위암 또는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등을 선택할 수 있다. 상기 mRNA 정량 검출 위암 또는 간암 마 커 진단 키트는 TIP41 mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 7 또는 8 중 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 mRNA 정량 검출 위암 또는 간암 마커 진단 키트는 TIP41 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 또는 간암 마커 진단 키트인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드가 서열번호 3 내지 7 중 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 위 조직, 위 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 위암 또는 간암 마커 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 위암 또는 간암 마커 검출 방법은

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 서열번호 1의 TIP41 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 NIH3T3-TIP41 등의 동물 세포 주를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 TIP41 위암 또는 간암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 TIP41 위암 또는 간암 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 TIP41 위암 또는 간암 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 서열을 제공한다. 상기 서열은 서열번호 3 내지 5번 중 하나인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 TIP41 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 TIP41 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 또는 간암 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 유전자 TIP41를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 TIP41 단백질을 제공한다.

본 발명은 TIP41 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 TIP41 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "마커"는 위암 또는 간암 등의 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, TIP41 유전자에 대한 핵산 마커 및 TIP41 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 위암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.

본 발명에서 "진단"은 위암 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 인간 신규 발암/전이 유전자인 TIP41은 서열번호 1(도 8a)로 나타낸 바와 같이 3,032bp 길이의 전체 염기서열을 가지며(GeneBank Accession number: NM_152902), 서열번호 1의 염기서열에서 뉴클레오티드 번호 146 부위에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)을 가지며 여기서 코딩되는 전체 단백질은 272개의 아미노산으로 이루어져 있으며 아미노산 서열은 서열번호 2(도 8b)에 나타낸 바와 같다(“TIP41 단백질”). 그러나 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 발암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된 다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 발암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 발암/전이 유전자로부터 발현되는 단백질은 272개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 30 kDa이다.

본 발명의 발암/전이 유전자 및 단백질은 사람의 위암 또는 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, 이를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

본 발명의 유전자는 실시간 PCR의 분석 방법에서 위암 또는 간암조직에서 비교적 발현이 높기 때문에 위암 또는 간암을 유발하는 발암/전이 유전자로 판단된다. 간암세포주인 Huh7과 위암세포주인 SNU638에 siRNA를 도입하였을 때 세포의 성장속도가 현저히 감소하며, 정상세포주인 NIH3T3에 이 유전자를 형질도입(transfection)시키면 원래의 세포주보다 빠른 성장 속도와 세포 내 신호 전달을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 발암/전이 유전자는 위암 또는 간암의 발생에 관여하는 것으로 판단되며, 위암 또는 간암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 위암 또는 간암 특이적 항암제 탐색, siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있으며, 인간의 수명을 조절하는 유전자로 이용될 수 있다.

상기 발암/전이 유전자를 이용한 암의 진단방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자가 코드한 단백질의 항체를 이용한 방법과 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 조직으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던 블롯팅(Northern blotting)등으로 이를 검출함으로써 대상자가 본 발명의 발암/전이 유전자를 발현하는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하거나 항체를 이용한 면역학적 분석법은 용이하게 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 발암/전이 유전자를 포유동물, 예를 들어, 마우스 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암/전이성 물질 또는 상기 유전자 저해물질 및 항암물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 발암/전이 유전자로부터 유도되는 단백질을 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 발암/전이 유전자로부터 발현된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 단일 항체(Monoclonal antibody) 또는 다중 항체(polyclonal antibody)로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 발암/전이 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

생물학적 시료 중의 TIP41 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 TIP41 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 TIP41 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 TIP41 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏 팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 위암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, TIP41 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 위암 또는 간암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 TIP41 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 내지 50bp의 길이, 좀더 바람직하게는 약 10 내지 30bp의 길이이다. 또한, 대조군 유전자의 핵산서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머레이저 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야 에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 TIP41 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 TIP41 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 암 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, TIP41 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 암 의심환자의 실제 암 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 TIP41 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. TIP41 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 TIP41 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 TIP41에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 위암 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질의 수준은 TIP41 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 TIP41 단백질이 위암 또는 간암 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 TIP41 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 TIP41 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 ZNF312b 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 TIP41 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험 관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 TIP41 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 TIP41 발암/전이 유전자 및 단백질은 사람의 위암, 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, TIP41 유전자가 삽입된 동물 발현용 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 TIP41 유전자에 대한 안티-센스 유전자와 siRNA(small interfering RNA)를 제공한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호 1의 발암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA와 결합하여 리보솜에 의한 해독과정을 저해할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 발암 유전자의 발현으로 인한 암을 치료할 수 있다. 또한 상기 TIP41 유전자의 siRNA는 21~30 뉴클레오티드의 RNA 조각으로 세포 내에 도입되면 다이써(Dicer)에 의해 인지되고 이는 세포 내에 존재하는 상기 유전자의 mRNA를 분해하게 되어 유전자의 발현을 저해하게 된다. 본 발명의 조성물을 이용한 siRNA 유전자 치료에서 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암/전이 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들어 문헌 (Filleur 등, Cancer Res ., 63(14): 3919-22, 2003)에 따라 특별한 생체 내 도입 방법 없이 적은 양의 정맥 주사 방법(low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현이 조절 가능하다는 것을 보여주고 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위한 시도로써, 문헌 (Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005)의 방법에 따라 siRNA의 정맥을 통한 주입에서 복합체를 만들어 사용하는 방법도 제시되고 있다. 이 방법은 정맥 주사의 효율이 기존의 다른 리포솜 복합체보다 약 7배 정도 높게 나타났으며, 부작용도 적은 것이 확인되었다(Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005).

따라서, 본 발명은 TIP41 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 위암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 TIP41 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.5 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물을 이용한 siRNA와 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자를 포함하는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들면, 문헌(J.S. Kim et al., J. Controlled Release, 53, 175-182(1998))의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥 투여한다.

본 발명의 항암 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 안티센스 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 TIP41 발암 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 배양 및 총 RNA 분리

1-1. 세포의 배양

정상세포주 및 간암 또는 위암 세포주에서 TIP41의 특이적 발현을 확인하고 상기 유전자의 기능을 확인하기 위하여 정상세포주 NIH3T3, 간암세포주 Huh7와 위암 세포주 SNU-638을 배양하였다. 위암세포주 SNU 638은 1982년 한국 위암 환자로부터 확립된 것으로 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 본 실험을 위해 사용하였다. 정상세포주 NIH3T3와 간암세포주 Huh7은 DMEM-High glucose (Hyclone, USA), 위암세포주 SNU638은 RPMI-1640 (Hyclone, USA)에서 배양하였으며, 상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100㎎/㎖ 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/㎖ 엠피실린이 포함된 배지에서 배양되었다.

1-2. 총 RNA 분리

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy Total RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 위암 환자로부터 얻은 조직에서 총 RNA를 추출하였다. DNA 오염원을 제거하기 위하여 DNase (Promega, 미국)를 사용하였으며, 페놀-클로로포름 법에 의하여 총 RNA만을 정제하였다.

실시예 2: 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 ( Real - time RT - PCR )

인간 발암/전이 유전자 TIP41가 위암 또는 간암 특이적 발현 유전자임을 보이기 위하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 방법을 사용하여 조사하였다. 먼저, 실시예 1-2에서 얻은 1㎎ 총 RNA를 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다. 이어서 생성된 cDNA를 1/200으로 희석한 후 희석된 cDNA 2㎕를 주형으로 하여 TIP41의 프라이머를 가지고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다(정방향 프라이머: 5'- ATTGAAAGCCAGAGAACAGA -3', 역방향 프라이머: 5'- TCTCGTGTCATTCATTCTGA -3'). 반응액의 조성(10㎕)은 다음과 같았다: 2X SYBR Premix EX Taq (Takara, 일본) 5㎕, 프라이머 각 0.2uM, 주형 cDNA 2㎕. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 조건은 95℃에서 2분간 초기변성 시행 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 70℃에서 62℃까지 한 회당 0.2℃만큼 내려가도록 설정하여(step size: 0.2℃/cycle) 10초 동안 결합반응을 시행한 다음, 72℃에서 10초 동안 연장반응을 거쳐 40℃에서 30초 동안 증폭 산물을 안정화시켰다. 증폭반응은 LightCycler 2.0(Roche, Penzberg, 독일)을 이용하여 시행하였으며, 증폭신호의 검출을 위해서 측정파장 530nm, 분석파장 530/705nm로 설정하여 결합반응에서 형광신호를 단발적으로 측정하였다(single fluorescence measurement).

도 1a는 위암 환자들의 조직으로부터 TIP41의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 1b는 간암 환자들의 조직으로부터 TIP41의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 1a와 1b에서 알 수 있듯이, TIP41은 위암 또는 간암 조직에서 과량으로 고발현됨이 확인되었다.

실시예 3: 면역조직화학 분석

위암 환자로부터 적출한 조직을 10% 중성 포르말린(formalin) 완충용액으로 고정한 후, 녹아 있는 상태의 파라핀에 포매하였다. 파라핀으로 포매시킨 조직을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 박절한 후 상기 절편을 유리 슬라이드 위에 고정하여 자일렌(xylene)과 히스토클리어(histoclear) 용매로 파리핀을 제거하였다. 상기 절편을 1M 트리스 완충용액으로 세척한 후, 1차 항체로 1M 트리스 완충용액으로 100배 희석한 TIP41 단백질에 대한 다클론 항체와 40℃에서 20분 동안 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 1M 트리스 완충용액으로 완전히 세척하여 제거한 후, 2차 항체로 바이오틴(biotin)이 결합된 아비딘-양고추냉이 퍼옥시다아제(avidin-horseradish peroxidase) 용액[Immunotech사]을 40℃에서 10분 동안 처리하였다. 반응하지 않은 2차 항체를 완전히 세척하여 제거한 후 상기 절편을 퍼옥시다아제 기질 용액인 0.05% H₂O₂를 포함한 3-아민-9-에틸카바졸(3-amine-9-ethylcarbazole) 용액에 반응시켜 메이어 헤마톡실린(Meyer's hematoxylin)으로 상호 염색시키고 슬라이드를 봉합한 뒤 광학 현미경으로 확인하였다.

도 2a에서 나타낸 것과 같이 위암 각 시기별 48종의 임상조직에서 면역조직화학 분석한 결과, 23종의 위암 조직(48%)에서 TIP41의 고발현이 확인되었고, 그 예를 잘 분화된(differentiated) 위암 조직 및 하등도 분화된(poorly-differentiaed) 위암 조직에서의 결과로 나타내었다. 또한, 간암에서도 정상 간 조직에 비해 간암 조직에서 TIP41의 고발현이 확인되어(도 2b), 위암 또는 간암에서 TIP41 단백질이 과발현됨을 확인하였다.

실시예 4: 발현벡터 및 siRNA 제조

4-1. TIP41 발현 벡터의 제조

인간 TIP41 유전자는 EcoRI 과 XhoI 제한 효소 인지부위를 포함한 TIP41 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭한 후 pcDNA3.1(Invitrogen, 미국) 벡터에 클로닝 하였다. 먼저 생성된 PCR 산물을 정제한 후 EcoRI 과 XhoI 제한 효소로 자른 다음 pcDNA3.1 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1-TIP41 발현벡터를 제조하였다.

4-2. TIP41 siRNA 제조

TIP41 유전자의 발현 억제에 의한 세포 내 기능을 조사하기 위하여, TIP41의 염기서열 (서열번호 1) 중에서 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 4종류의 siRNA(서열번호 3~6)를 제작하였으며 이들 4종 siRNA의 TIP41 유전자 발현 저해능을 도 3b에 나타내었다.

si-TIP41_1 (서열번호 3) : 5'- UCA UGA AGU CGG CGG AUG U -3'

si-TIP41_2 (서열번호 4) : 5'- CAA UGC UAC AGA UGC GUU A -3'

si-TIP41_3 (서열번호 5) : 5'- CCA UAU GAU UGG ACC UAU A -3'

si-TIP41_4 (서열번호 6) : 5'- CUC CAA AGA GGU UAU UAA A -3'

실시예 5: TIP41 과발현 세포주의 확립

상기 유전자의 기능을 규명하기 위하여 실시예 4-1에서 제조된 벡터 pcDNA3.1-TIP41을 정상세포주인 NIH3T3에 형질도입(transfection)시켜 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41을 확립하였다.

먼저, 과발현 세포주를 확립하기 위하여 정상세포주 NIH3T3 세포에 Lipofectamin 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 NIH3T3-TIP41을 형질도입하였다. 상기 유전자가 발현되는 세포주만을 선택하기 위하여 선별 마커인 G418을 700㎍/㎖이 되게 배양액에 넣어 주었다. 또한 단일 클론을 가진 세포주를 얻기 위하여 콜로 니를 선별하였다. 이를 위해 G418 배지를 3일 간격으로 교환하였다. 형성된 콜로니를 선택하여 세포수를 늘려 동결보관하고 일부는 상기 유전자의 발현 확인을 위해 단백질 추출을 위해 사용되었다. 도 3a와 같이 형질 전환된 세포주인 NIH3T3-TIP41을 확립하였으며, 상기 유전자의 발현 정도는 항체를 사용하여 확인하였다. 확인한 세포주 8개 중 가장 발현 정도가 높았던 NIH3T3-TIP41_6를 TIP41 과발현 세포주(NIH3T3-TIP41 )로 최종적으로 선별하고 이는 TIP41의 기능 규명을 위해 사용되었다.

실시예 6: 세포증식 실험

6-1. TIP41 유전자의 과발현에 의한 세포증식

실시예 5에서 확립된 세포주인 NIH3T3-TIP41을 이용하여 상기 유전자의 과발현을 통한 세포주의 세포 증식능을 조사하였다. 세포증식 실험은 CCK-8 (Dojindo, 일본) 시약을 이용하여 수행하였으며, 이는 테트라졸리움 염을 이용하는 방법으로 세포 내에 존재하는 탈수소효소에 의해 친수성의 포르마겐으로 전환되는 것을 측정하여 세포증식 여부를 판단하는 것이다. 세포 증식의 차이를 확인하기 위하여 세포(5 X 10³ 개)를 96 웰 플레이트에 넣고 24시간 동안 배양한 후 24 시간 간격으로 세포증식 실험을 수행하였다. 도 4a는 세포 증식 실험을 수행한 결과를 나타낸 것으로 상기 유전자의 과발현이 세포 증식을 증가시켰으며, TIP41의 과발현이 세포증식에 영향을 주고 있음을 확인할 수 있었다.

6-2. TIP41 유전자의 발현 억제에 의한 세포증식

도 3b에서 보는 바와 같이 si-TIP41 _1의 저해능이 가장 높은 것으로 조사되어 이를 TIP41유전자의 일시적인 발현 저해 실험에 사용하였다. 간암 세포주인 Huh7에 si-TIP41 _1를 형질도입(transfection)한 후 24시간 후에 세포(5 X 10³ 개, 10 X 10³ 개, 15 X 10³ 개)를 각각 96 웰 플레이트에 넣고 48시간 후에 세포증식 실험을 수행하였다. 세포증식 실험은 실시예 5와 같이 CCK-8 시약을 사용하여 수행하였으며, 도 4b에는 일시적으로 상기유전자의 발현을 저해하였을 때 세포증식이 감소함을 보여주고 있다. 또한 위암세포주인 SNU638에 si-TIP41 _1를 형질도입하여 같은 방법으로 세포증식 실험을 수행한 결과, 도면 4c에서 나타낸 것과 같이 상기유전자의 발현 억제에 의해 세포증식이 감소함을 확인하였다.

실시예 7: 세포주기 실험

세포증식의 또 다른 측정법인 세포주기를 이용한 방법을 사용하여 상기 유전자의 세포증식 관련성을 규명 조사하였다.

세포주기 실험은 PI 염색법을 이용하여 수행하였다. PI는 핵을 염색하는 방법으로써, 각 세포들을 24시간 동안 배양한 후 70% 에탄올로 4℃에서 12시간 이상 고정시킨 후 PI로 염색하여 FACS 분석기를 이용하여 측정하였다. 측정 결과는 도 5a, 5b, 5c로 나타냈으며, 5a는 상기 유전자를 과발현한 경우로 G1기가 감소하고 G2+M 시기가 증가함에 따라 세포 증식률이 증가하였다. 또한 5b는 간암세포주 Huh7 에서, 5c는 위암 세포주 SNU638에서 상기 유전자의 발현을 일시적으로 저해한 경우로 대조군에 비해 상기 유전자의 발현이 저해되었을 때 G1기가 증가되고 G2+M 시기가 감소하여 세포 증식률이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

세포 주기를 이용한 세포증식 실험 또한 실시예 4와 마찬가지로 상기 유전자의 억제/과발현에 의해 세포증식의 억제/활성이 확인되어 본 유전자의 세포 증식과의 관련성을 나타내고 있다.

실시예 8: 콜로니 형성 실험

상기 유전자의 발암/전이 유전자로써의 기능을 확인하기 위하여 콜로니 형성 실험을 수행하였다. 콜로니 형성실험(colony forming assay)은 세포성장 특성 및 약제에 대한 세포의 반응성을 조사하는 목적으로 사용된다. 콜로니 형성 실험은 부드러운 한천(soft-agar)을 사용하여 세포의 콜로니 형성 효율을 측정했다.

45℃의 2배 농도의 DMEM-High glucose 배지와 1.2% 아가로스 용액을 동량씩 섞어 0.6%의 1X 배지를 만들어 6웰 플레이트에 넣고 굳힌다. 한 시간 동안 굳힌 후, 5000개의 세포를 0.5㎖ 배지에 희석하여 동량의 0.6% 아가로스와 섞어 0.6%의 아가로스 평판 위에 넣어 준다. 상온에서 1시간 동안 굳힌 후, 1X 배지를 넣어 준 후 37℃ 배양기에서 배양하면서 콜로니의 형성을 관찰하였다. 형성된 콜로니는 100배율 현미경하에서 관찰하여 계수하여 도식화하였다. 도 6에서 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41을 사용하여 상기 유전자를 과발현시킨 후 콜로니 형성을 관찰한 것이다. 그 결과 상기 유전자가 과발현되었을 때 콜로니 형성이 증가하는 것을 관 찰할 수 있었고, 이로써 상기 유전자가 종양 형성능을 보유하고 있음이 확인되었다.

실시예 9: 세포손상 회복과 세포 이동 실험

상기 유전자가 전이유전자로서 암의 전이에도 관여하는지 확인하기 위하여 상처 회복실험과 세포이동 실험을 실시하였다.

대조군과 TIP41 과발현 세포주의 이동능력을 비교확인하기 위하여 세포손상 회복 실험을 실시하였다. 6웰 플레이트에 세포의 밀도가 3X10⁵이 되도록 하고, 24시간 동안 배양하여 세포가 단층으로 고루 분포되도록 하였다. 단일 세포층을 플라스틱 피펫 팁을 이용하여 긁어 세포층에 손상을 주었으며, 12시간 또는 24시간 동안 배양하여 대조군과 실험군의 손상 회복 정도를 200배 현미경 시야에서 관찰하였다(도 7a). 그 결과 TIP41 과발현 세포주가 대조군에 비해 빠르게 이동하여 세포의 손상을 회복하는 것을 관찰할 수 있었다.

TIP41의 세포 이동을 관찰하기 위하여 트랜스웰(transwell)을 이용한 세포 이동실험을 실시하였다. 먼저 기공 크기 8㎛의 transwell(Corning Incorporated Costar , 미국)의 아래 면을 25㎎/㎖ 피브로넥틴으로 코팅한 다음 transwell insert의 내부에 무혈청배지의 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 10% 혈청을 포함한 배지를 넣어주었다. 세포 부유액을 12시간 및 24시간 동안 배양하였고, 배양이 끝나면 insert의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였다. 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 크리스탈 ㅂ바바이올렛 용액으로 염색하여 비교하였고(도 7b), 200배 현미경 시야에서 계수한 후 도식화하여 비교하였다(도 7c). 그 결과 상기유전자의 과발현이 세포의 이동을 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 세포의 과발현은 암의 전이에도 관여할 것으로 판단된다.

도 1은 위암 또는 간암 환자로부터 얻은 총 RNA를 이용하여 TIP41 유전자에 대한 실시간 RT-PCR를 수행한 것으로 도 1a는 위암 결과를 도 1b는 간암 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 위암 또는 간암 환자의 임상조직을 이용하여 면역화학염색법 (immunohistochemistry)을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 2a는 위암에서의 결과를, 도 2b는 간암에서의 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 정상 세포주에 과발현 벡터 pcDNA3.1-TIP41를 이용하여 확립된 세포주인 NIH3T3-TIP41(도 3a) 및 TIP41의 siRNA를 간암 세포주 Huh7에 도입(도 3b)했을 때의 상기 유전자의 발현을 나타내고 있다. 이는 TIP41의 발암/전이 유전자로써의 기능을 규명하기 위하여 사용되었다.

도 4는 상기 유전자의 세포증식 실험 결과를 나타낸 것으로 상기 유전자의 세포증식 기능 관련성을 나타낸다. 도 4a는 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41의 세포증식 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 TIP41의 si-TIP41_1을 간암 세포주인 Huh7에 도입한 후의 세포증식 결과를 나타낸 것이며, 4c는 TIP41의 si-TIP41_1을 위암세포주인 SNU638에 도입한 후의 세포증식 결과를 나타낸 것이다. 실험결과는 유의성 검사를 통해 결과의 신뢰성을 확인하였으며, 이는 P value 0.05 이하는 95% 의 신뢰도를 갖는 것으로 “ * ”로, 0.01 이하는 99% 의 신뢰도를 갖는 것으로 “**”로, 0.001 이하는 99.9%의 신뢰도를 갖는 것으로 “***”로 그림에 나타내었다. 이는 신뢰성이 요구되는 실험에 공통적으로 적용되어 그림에 나타내었다.

도 5는 상기 유전자의 세포주기 실험 결과를 나타낸 것으로 PI 염색법을 이용하여 DNA를 염색한 후 세포분석기를 이용하여 측정하였다. 도 5a는 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41의 세포주기 결과를 나타낸 것이다. 5b는 TIP41의 si-TIP41_1을 간암세포주인 Huh7에 도입한 후의 세포주기 결과를 나타낸 것이며, 5c는 TIP41의 si-TIP41_1을 위암세포주인 SNU638에 도입한 후의 세포주기 결과를 나타낸 것이다. 좌측 그림은 세포분석기를 통해 분석된 세포주기를 나타내고 있으며, 분석된 세포주기는 세포증식율((G2+M+S기의 세포수/ 전체 세포수) X 100)로 계산하여 우측 그래프로 나타내었다.

도 6은 상기 유전자의 종양 형성능을 알아보기 위하여 실시한 실험이다. 콜로니 형성실험 결과를 나타낸 것으로 부드러운 한천을 이용하여 콜로니 형성 효율을 측정하였으며, TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41의 콜로니 형성 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 상기 유전자의 전이 가능성을 알아보기 위하여 실시한 실험이다. 7a는 상처 치유 실험으로 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41의 세포 이동성 결과를 나타낸 것이다. 7b와 7c는 transwell을 이용한 세포 이동성 실험으로 TIP41 과발현 세포주인 NIH3T3-TIP41의 세포 이동성 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 TIP41의 서열을 나타낸 것으로 8a는 염기서열, 8b는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A carcinoma gene TIP41, a protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same <130> KRIBB-NSK-TIP41 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3032 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggtcggccg gcagggggcg gggccgggca tggtaacggc tcggaagcct aggaggctgg 60 gccggaggga ggcggaggaa ccggtgttcg ccgccgccgc tgcttcagct tattccttgt 120 ggcctctgcg ggtcctgcct cagccatgat gatccacggc ttccagagca gccaccggga 180 tttctgcttc gggccctgga agctgacggc gtccaagacc cacatcatga agtcggcgga 240 tgtggagaaa ttagccgatg aattacatat gccatctctc cctgaaatga tgtttggaga 300 caacgtttta agaatccagc atgggtctgg ctttggaatt gagttcaatg ctacagatgc 360 gttaagatgt gtaaacaact accaaggaat gcttaaagtg gcctgtgctg aagagtggca 420 agaaagcagg acggagggtg aacactccaa agaggttatt aaaccatatg attggaccta 480 tacaacagat tataagggaa ccttacttgg agaatctctt aagttaaagg ttgtacctac 540 aacagatcat atagatacag aaaaattgaa agccagagaa cagattaagt tttttgaaga 600 agttctcctt tttgaggatg aacttcatga tcatggagtt tcaagcctga gtgtgaagat 660 tagagtaatg ccttctagct ttttcctgct gttgcggttt ttcttgagaa ttgatggggt 720 gcttatcaga atgaatgaca cgagacttta ccatgaggct gacaagacct acatgttacg 780 agaatatacg tcacgagaaa gcaaaatttc tagtttgatg catgttccac cttccctctt 840 cacggaacct aatgaaatat cccagtattt accaataaag gaagcagttt gtgagaagct 900 aatatttcca gaaagaattg atcctaaccc agcagactca caaaaaagta cacaagtgga 960 ataaaatgtg atacaacata tactcactat ggaatctgac tggacacctt ggctatttgt 1020 aaggggttat ttttattatg agaattaatt gccttgttta tgtacagatt ttctgtagcc 1080 ttaaaggaaa aaaaaataaa gatcgttaca ggcaggtttc actcaactgc tgtttgtact 1140 gtctgtcttc acattcatat tccagattta tattttctgg agttaaattt ggatgatttc 1200 taaattatca caaagtggga cctcagcagt agtgatgtgt gtgtctcatg agcagtgagc 1260 acagtctgca ttcatcatga aacactatct tctaccagga ggaggttaat gtaaatcacc 1320 aaatcccaat gccttgtgac tttcatagga ttcctgatca tgcatgttga tgtactggct 1380 cttcactttg ggctttctga tgtttattca cacctttgga gagttgcaac ttgccacata 1440 cgaaattagt ctcatagtgt agtgaacttc aaccccaaaa ttttaaaaat gtatttcccc 1500 ccagttttaa attgcctttg aaatttaaaa aaaaaaaatt tagacttagt accagaacca 1560 aaaataccta gatttttgga gaacttatta catacataga aacatgaata tggtttacca 1620 ctgtgtgtgt gtaggatgtt agaattatct gtcctccatc tttaggtgct ttttcttaaa 1680 tgtggttcta cttatactga tatttttaat ttccatcttc catgcaacct cagagtgaat 1740 aaacccctta aatttggtgc tggttcgaaa aagtctaaag ggtttattag gggttgtttt 1800 tcgcaaatat tacatcaatc cttaaagcaa caagattaat tttctgctta aaatatttgg 1860 gaagataggt aaggaggagg gggttttaaa atataaaagc aagtttttct attttaaggt 1920 gcatatttgt aacattacag gggatgaagt aaaatgtaat taattagcac aagacttagg 1980 gagtacagaa aatacacaga agtaaatttc aaatccattt gattgttttc atagtgaccc 2040 cttagtcatt ttatattctt gtctgccttt ctagaaaaat ggttgtcata aagtggaaag 2100 tgattaaaaa gcatcaaata agaaattatt tcaagtggat ttttaaaaat atttttttga 2160 agggcagggg gaaaattcac cccttttctg atttgaaata tgttgtacat atttccattt 2220 gatggataaa tcattaagta agaatatttg atttaaagta ttagccaacc tcttcaggta 2280 ttagcctgaa gataaatttt aacaaaacat atacacttgg gtatccgtca ttgctcaaac 2340 tctatagtgt attgctggag ccaataggca gggtatattt tattagctaa atttgatatt 2400 tgtcttctgc cttctgtatc acctccaagc tataggaaat caggattttg ttggctttaa 2460 gaaaacacat ggtatgttca ctgtatatta aatatacctg tatttaatgt tttctcttag 2520 gacagaaaag tagacacaca cacacacaca cacacacatg ttgtgttcag ctttctgttt 2580 tatattattt gccattgaga ttagaataga acaggctcta ttcatgcaaa ctatatgaaa 2640 tgaaaaactt ttaagactct tcattaattg gagcttctgg gcaacatcgt gtgtgtgtgt 2700 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtatacag acattttttt tttaacttgt tgattcagat 2760 gtcttggtcc ctgaatagtc ctagattact tattttgaga attcattgtt aaaaattaca 2820 gggaattaaa ataattgcct tttttttttt tagagggtaa gagatgggta gaagagtatg 2880 cctctgaaaa ttttattagt ttattcttgt ggagaatacc aagaaaatgt gtatttgccc 2940 attgctaaat atgatatatg ccattttgta tttatttgtc ccaagtgtct ttttgtaaga 3000 ggagaataaa caataaggaa ttactgatca aa 3032 <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Met Ile His Gly Phe Gln Ser Ser His Arg Asp Phe Cys Phe Gly 1 5 10 15 Pro Trp Lys Leu Thr Ala Ser Lys Thr His Ile Met Lys Ser Ala Asp 20 25 30 Val Glu Lys Leu Ala Asp Glu Leu His Met Pro Ser Leu Pro Glu Met 35 40 45 Met Phe Gly Asp Asn Val Leu Arg Ile Gln His Gly Ser Gly Phe Gly 50 55 60 Ile Glu Phe Asn Ala Thr Asp Ala Leu Arg Cys Val Asn Asn Tyr Gln 65 70 75 80 Gly Met Leu Lys Val Ala Cys Ala Glu Glu Trp Gln Glu Ser Arg Thr 85 90 95 Glu Gly Glu His Ser Lys Glu Val Ile Lys Pro Tyr Asp Trp Thr Tyr 100 105 110 Thr Thr Asp Tyr Lys Gly Thr Leu Leu Gly Glu Ser Leu Lys Leu Lys 115 120 125 Val Val Pro Thr Thr Asp His Ile Asp Thr Glu Lys Leu Lys Ala Arg 130 135 140 Glu Gln Ile Lys Phe Phe Glu Glu Val Leu Leu Phe Glu Asp Glu Leu 145 150 155 160 His Asp His Gly Val Ser Ser Leu Ser Val Lys Ile Arg Val Met Pro 165 170 175 Ser Ser Phe Phe Leu Leu Leu Arg Phe Phe Leu Arg Ile Asp Gly Val 180 185 190 Leu Ile Arg Met Asn Asp Thr Arg Leu Tyr His Glu Ala Asp Lys Thr 195 200 205 Tyr Met Leu Arg Glu Tyr Thr Ser Arg Glu Ser Lys Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Met His Val Pro Pro Ser Leu Phe Thr Glu Pro Asn Glu Ile Ser Gln 225 230 235 240 Tyr Leu Pro Ile Lys Glu Ala Val Cys Glu Lys Leu Ile Phe Pro Glu 245 250 255 Arg Ile Asp Pro Asn Pro Ala Asp Ser Gln Lys Ser Thr Gln Val Glu 260 265 270 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ucaugaaguc ggcggaugu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 caaugcuaca gaugcguua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccauaugauu ggaccuaua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 cuccaaagag guuauuaaa 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer <400> 7 attgaaagcc agagaacaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificail primer <400> 8 tctcgtgtca ttcattctga 20

Claims (18)

1. TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단 키트.
2. 제1항에 있어서,

   정상 대조군과 비교하여 TIP41 단백질 양의 증가로 암을 진단하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
3. 제1항에 있어서,

   상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
4. TIP41 mRNA를 정량적으로 검출하는 암 진단 키트.
5. 제4항에 있어서,

   mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
6. 제4항에 있어서,

   TIP41 mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 7 또는 8 중 1종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
7. 제4항에 있어서,

   TIP41 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 키트.
8. TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 위 조직, 위 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 마커 검출 방법.
9. 제8항에 있어서,

   a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

   b) 상기 시료와 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

   c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

   d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 마커 검출 방법.
10. 서열번호 1의 TIP41 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡 터.
11. 제10항의 벡터에 의해 형질전환된 동물 세포주.
12. 제11항에 있어서, 상기 형질전환된 동물 세포주는 NIH3T3-TIP41인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
13. 서열번호 1의 TIP41 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.
14. 서열번호 1의 TIP41 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 TIP41 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 서열.
15. 제14항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 3 내지 5번 중 하나인 것을 특징으로 하는 siRNA 서열.
16. TIP41 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 TIP41 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 억제제의 스크리닝 방법.
17. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 전이 억제용 타겟 유전자 TIP41.
18. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 전이 억제용 타겟 TIP41 단백질.

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