KR20110132930A

KR20110132930A - 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는 슈도모나스 오란티아카 ｉｂ５―１０ 및 이를 함유하는 미생물 제제 및 이를 이용한 사구식물의 복원방법

Info

Publication number: KR20110132930A
Application number: KR1020100052537A
Authority: KR
Inventors: 김종국; 김상달; 임종희; 정희영; 유영현; 윤혁준
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-03
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2011-12-09
Also published as: KR101243349B1

Abstract

본 발명은 환경스트레스 완화 및 색물생장촉진 기능을 갖는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 사구식물의 근권으로부터 분리된, 사구식물의 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는, 한국농업미생물자원센터에 KACC 91561P로 기탁된 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 해안사구식물의 근권에 서식하며 사구식물과 공생하고 있는 시구식물 근권미생물 중 우점, 정착능, 생장촉진능, 병방제능, 환경스트레스 저항성 유도능 등의 효과를 동시에 가지는 다기능 해안사구 PGPR을 이용하여 사구식물의 복원에 사용가능한 미생물 제제를 개발할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 상기 개발된 미생물 제제를 파괴된 해안사구에 처리하는 경우 해안사구식물의 생장이 촉진될 뿐만 아니라, 발아율이 증가하였다. 따라서 본 발명의 미생물 제제를 이용한 해안사구의 복원 및 생태계 복원 효과가 기대된다.

Description

환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는 슈도모나스 오란티아카 ＩＢ５―１０ 및 이를 함유하는 미생물 제제 및 이를 이용한 사구식물의 복원방법 {Pseudomonas aurantiaca IB5-10 having environmental stresses resistance and plant growth promotion, microbial agent containing the same, and method for recovering of coastal sand dune plants}

본 발명은 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 사구식물의 근권으로부터 분리된, 사구식물의 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는, 한국농업미생물자원센터에 KACC 91561P로 기탁된 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10에 관한 것이다.

해안사구는 해양과 육상 생태계의 경계지역으로 해안의 보호와 사구 고유 식물의 서식지로 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 해안 식수원의 저장지 및 뛰어난 경관으로 인간과 자연에게는 보전되어야 할 중요한 지역이다. 하지만, 사구지역의 난개발과 오염 등으로 현재는 원형을 찾아보기 힘들 정도로 훼손되었으며, 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로도 그 심각성이 인식되어 해안사구의 복원과 보존에 심혈을 기울이고 있는 실정이다. 사구생태계의 복원 및 보존에는 시설물 설치로 침식방지 및 퇴적 환경조성, 지면의 식피 등 인위적인 방법 등이 사용될 수 있지만, 훼손된 사구식생의 생태학적 복원을 통한 해안사구 복원이 자연생태계의 순환적인 측면에서 가장 자연친화적이면서 경제적일 것이다. 실제 미국과 유럽을 비롯한 선진국에서는 해안사구 복원방법으로 사구식생의 복원을 가장 많이 사용하고 있다. 사구식생의 대부분을 차지하는 사구식물은 건조와 고염 등의 척박한 환경과 각종 스트레스에 적응하여 살아가야만 하는 것들로 사구식물의 생장과 생육에는 생물적 요인보다는 물리적 요인에 의한 영향이 매우 크며, 이러한 물리적 요인에 의하여 사구식물의 종자발아 및 생장 등에 매우 큰 영향을 받고 있다. 또한, 사구식물처럼 환경스트레스에 노출되어 있는 식물에게 식물의 생장을 조절해 주는 요인은 식물생장조절물질 즉 식물호르몬으로, 식물 생장에 생장조절호르몬의 공급은 식물체내의 내생 호르몬의 양과 물질대사, 식물의 번식과 생육에 많은 영향을 미친다. 사구식물들은 불리한 스트레스환경에서 생장과 종족번식을 위해서 ABA(abscisic acid)나 JA(jasmonic acid) 등의 식물생장조절호르몬 또는 levan 등의 환경스트레스경감 물질을 생산하고, 근권에서 공생, 공존하고 있는 근권 미생물들과 상호작용을 통하여 건조나 고염 등의 환경스트레스를 극복하고 있다.

한편, 사구식생의 대부분을 차지하는 사구식물은 건조와 고염 등의 척박한 환경과 각종 스트레스에 적응하여 살아가야만 하는 것들로 그들의 생장의 위해서 근권에서 공생, 공존하고 있는 근권 미생물들과의 상호작용이 반드시 필요하다. 따라서 이들 근권 미생물들의 활용과 복원은 사라져가는 사구식생의 증식과 확대에 이용하는 것이 당연한 것이다. 이와 같은 사구식물 복원에 미생물을 활용하고자 하는 시도는 거의 전무한 실정이다. 하지만, 작물재배나 원예에서는 식물생장촉진능과 병해방제능 등을 가진 식물생장촉진근권세균(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)을 이용한 많은 연구가 진행되고 있다. 식물성장을 촉진하는 식물생장촉진근권세균(PGPR)은 식물의 근권에 서식하며, 식물생장촉진호르몬에 의한 생장촉진효과 유도, 여러 가지 식물생장조절호르몬 생산, 전신획득저항성(SAR)과 유도전신저항성(ISR)과 같은 식물의 방어기작의 유도, 식물병원균 방제 등의 역할을 한다. PGPR은 크게 식물병원균을 억제하여 간접적으로 식물의 생장에 영향을 주는 biological control PGPR과 식물생장을 촉진시키거나 종자발아 촉진, 작물생산성 증대 등의 효과를 가져오는 것으로 분류할 수 있다. 이러한 PGPR을 이용한 미생물 또는 미생물농약이 개발되었으며, 이미 농업이나 원예현장에서는 널리 적용되고 있는 상태이다. 특히나 녹색성장의 친환경농업이 시대사조의 흐름으로 인식되고 있는 현재에는 가장 대표적인 친환경농업으로 미생물농법이 시행되고 있다. 사구식물도 경제작물이나 원예작물 등과 같은 식물로써 상기의 PGPR을 이용한다면 사구식물의 생장에 많은 도움을 줄 수 있을 것이라 생각한다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 해안사구식물의 근권에 서식하며 시구식물과 공생하고 있는 사구식물 근권 미생물 중 우점, 정착능, 생장촉진능, 병방제능, 환경스트레스 저항성 유도능, 인산가용화능 등을 동시에 가지는 다기능 해안사구 PGPR을 이용하여 사구식물의 복원에 사용가능한 미생물제제를 개발하였으며, 해안사구의 매우 불리한 생육환경에서도 사구식물의 근권에 유리하게 정착할 수 있고 장기간 저장과 보관이 가능한 형태의 안정화 제제화 방법을 개발하여 실제 해안사구 내 자생식물에 적용하여 효과를 검증하였다. 즉, 우리나라 최초의 사구식물 다기능 PGPR의 안정한 제제화 방법을 개발하여 현장적용 함으로써 친환경미생물제제의 저장성 및 안정성에 대한 응용연구의 토대를 마련하고, 궁극적으로 사구식물의 PGPR을 이용하여 점차 사라져가는 사구식물을 복원함으로써 우리나라 황폐화된 사구생태를 보존하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는 신규 미생물 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미생물 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 포함하는 미생물 제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용한 사구식물의 복원방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 사구식물의 근권으로부터 분리된, 사구식물의 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는, 한국농업미생물자원센터에 KACC 91561P로 기탁된 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 제공한다.

본 발명의 상기 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10은 환경스트레스 완화 호르몬 ABA 및 JA, 및 환경스트레스 완화 물질 Levan의 생산능을 갖는 것을 특징으로 한다.

ABA는 식물이 건조나 고염 등의 환경스트레스에 반응하는 물질로, 식물체 잎의 기공개폐 조절과 병원균의 침입에 의해 식물에 저항능을 유도하는 식물호르몬이며, JA는 일반적으로 고등식물인 식물체에서 생산되는 식물호르몬으로 병원균의 침입이나 기계적인 상해, 다양한 환경스트레스에 반응하여 식물에 내성을 갖도록 유도하는 유도체로 알려져 있으며, 과일의 성숙, 수분의 생산, 뿌리의 성장, 미생물의 감염에 의한 식물의 방어시스템에 관여한다. 그리고 Levan은 프럭탄(fructan)의 일종으로 미생물 유래의 levan은 식물체내에서 종자 발아 촉진능 및 저장능을 조절하며, 가뭄, 저온 및 염 스트레스를 완화시켜주는 역할을 한다. 또한 식물체에서 주요 질소원의 저장역할을 하기도 한다. 해안사구의 특성상 태양열로 인한 다량의 수분 증발, 주야의 극심한 온도 차이와 영양결핍에 노출되어 있는 사구식물에게는 절대적으로 필요한 물질이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10이 상기 세 종류의 물질을 생산하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 사구토양내 적용한다면, 사구식물의 기공 개폐 조절로 인한 식물체내 수분손실 감소 및 병원균에 대한 저항능을 유도하여 해안사구식물 생장을 향상시킬 수 있을 것이며, 사구식물들이 사구생태계에서 다양하게 노출되어 있는 환경적, 기계적, 병원균에 의한 스트레스에 내성을 갖는데 크게 기여할 것이며, 또한 급격한 온도 차이와 수분 및 영양분이 결핍된 환경에 놓여있는 해안사구식물에 다양한 환경스트레스 완화 및 질소원 등의 영양분을 공급하여 사구식물 복원에 매우 효과적일 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 상기 미생물 제제는 사구식물의 건조 및 염 스트레스 저항성을 증가시키고, 사구식물의 생장촉진 효과가 있는 것을 특징으로 한다.

구체적으로 본 발명에 따른 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 함유한 미생물 제제는 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 사구식물에 스트레스를 가하는 경우, 건조 스트레스를 가한지 50 일이 지난 후에도 사구식물의 생존이 지속되었으며, 뿐만 아니라 건조 및 염 스트레스를 가한 경우에도 80 %의 생존률이 관찰되었다. 이는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10이 스트레스에 항상 노출되어 있는 사구식물에게 환경스트레스에 대한 저항성을 가지게 하는 것으로 해석할 수 있다. 따라서 사구식물에 저항성을 가지게 함으로써 건조 및 고염 조건에서 사구식물의 생존율을 향상시켜 파괴된 해안사구의 친환경 생태계 복원에 큰 효과가 있을 것으로 사료된다.

본 발명의 상기 미생물 제제는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10의 배양액을 무기담체와 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 배양액은 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 당밀(Molasses) 15-30 g/L, 콘 스팁 리커(Corn steep liquor) 15-30 g/L, 황산암모늄(Ammonium sulfate) 5-15 g/L, 일인산칼륨(Monopotassium phosphate) 4-7 g/L, 이인산칼륨(Dipotassium phosphate) 3-5 g/L, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 2-4 g/L, 황산망간(Manganese sulfate) 0.3-0.7 g/L, 소포제(Antiforming agent) 0.5-0.8 g/L를 포함하는 배지에서 배양한 것이 바람직하다.

또한 상기 무기담체는 AI₂O₃, SiO₂, Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, SO₃, TiO₂, 및 LOI로 구성된 제올라이트(Zeolite), SiO₂, AI₂O_3,Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, P₂O₅, TiO₂, 및 LOI로 구성된 일라이트(Ilite), 또는 SiO_2,Al₂O_3,Na₂O, CaO, Fe2O_3,K₂O, TiO₂ _, 및MgO로 구성된 H1800C인 것을 특징으로 한다. 상기 무기담체는 안정성 높은 제제화를 위해 선택되었으며, 실제 Pseudomonas aurantiaca IB5-10의 무기담체 종류별 저장 안정성을 측정하는 경우, 고온저장중에서는 제올라이트(Zeolite)의 경우 18 주간 10⁹ CFU/ml의 균체 밀도를 유지하였으며, H1800C의 경우 10⁶ CFU/ml의 균체 밀도를 유지하는 안정성을 보였으며, 저온저장중에서는 제올라이트(Zeolite)와 H1800C 모두 균체 밀도가 거의 변화 없이 지속되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 미생물 제제를 사구식물에 투여하는 것을 포함하는 사구식물의 복원방법을 제공한다.

본 발명의 상기 사구식물에의 투여는 미생물 제제를 물에 희석 후, 스프레이 방법으로 처리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 사구식물의 복원은 건조 및 염 스트레스 저항성이 증가되고, 사구식물의 생장이 촉진되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예서와 같이 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 포함하는 본 발명의 미생물 제제를 사구식물에 투여하는 경우, 사구식물의 줄기 길이, 뿌리 길이, 잔뿌리 개수, 및 본엽의 수가 모두 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 개발된 미생물 제제는 사구식물의 생장촉진에 뛰어난 효과가 있다.

뿐만 아니라, 실제 해안사구에서 사구식물복원 실험을 수행해본 결과, 상기 미생물 제제를 처리한 해안사구에서 사구식물의 발아율이 처리하지 않은 대조군(발아율 0 %)에 비해 36.6 %로 나타났다. 따라서 본 발명의 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 함유하는 미생물 제제를 파괴된 해안사구에 처리한다면, 해안사구복원을 위한 해안사구식물 생장촉진 및 발아촉진에 큰 도움이 될 것이다.

또한 상기 사구식물은 갯메꽃, 갯까치수영 또는 갯쇠보리인 것을 특징으로 한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 해안사구식물의 근권에 서식하며 사구식물과 공생하고 있는 시구식물 근권미생물 중 우점, 정착능, 생장촉진능, 병방제능, 환경스트레스 저항성 유도능 등의 효과를 동시에 가지는 다기능 해안사구 PGPR을 이용하여 사구식물의 복원에 사용가능한 미생물 제제를 개발할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 상기 개발된 미생물 제제를 파괴된 해안사구에 처리하는 경우 해안사구식물의 생장이 촉진될 뿐만 아니라, 발아율이 증가하였다. 따라서 본 발명의 미생물 제제를 이용한 해안사구의 복원 및 생태계 복원 효과가 기대된다.

도 1은 지베릴린을 정량하기 위한 spectrophotometric 방법의 모식도 이다.
도 2는 지베릴린 생산능을 측정한 결과이다.
도 3은 환경스트레스 완화 호르몬의 HPLC 분석을 위한 정제 방법 모식도 이다.
도 4는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10이 생산하는 ABA의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10이 생산하는 JA의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Pseudomonas aurantiaca IB5-10의 배양시간별 levan의 생산능을 측정한 결과이다(Lane 1, 2% glucose+2% sucrose+2% fructose+1% levan; Lane 2, 2% sucrose; Lane 3, 2% glucose; Lane 4, 2% fructose; Lane 5, 0.1% levan; Lane 6, 0.5% levan; Lane 7, 1% levan; Lane 8, YPC medium; Lane 9, IB5-10 3hr; Lane 10, IB5-10 6hr; Lane 11, IB5-10 9hr; Lane 12, IB5-10 12hr; Lane 13, IB5-10 15hr; Lane 14, IB5-10 18hr; Lane 15, IB5-10 21hr; Lane 16, IB5-10 24hr; Lane 25, E. coli 24hr).
도 7은 Pseudomonas aurantiaca IB5-10이 생산하는 levan의 시간대별 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 갯메꽃에 대한 건조스트레스 저항성 유도효과(30 일) 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 갯메꽃에 대한 건조스트레스 저항성 유도효과(50 일) 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 갯메꽃에 대한 건조스트레스 저항성 유도효과 결과를 그래프화한 것이다.
도 11은 갯쇠보리에 대한 건조 및 염 스트레스 저항성 유도효과 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 갯쇠보리에 대한 건조스트레스 저항성 유도효과 결과를 그래프화한 것이다.
도 13은 대량배양용 최적탄소원의 종류에 따른 균체 생산량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 대량배양용 최적질소원의 종류에 따른 균체 생산량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 대량배양용 상업배지의 효과 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 PPseudomonas aurantiaca IB5-10의 무기담체 종류별 안정성 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 사구식물생장촉진용 미생물 제제의 시제품을 나타낸 것이다.
도 18은 사구식물생장촉진용 미생물 제제의 고온저장 중 안정성 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 사구식물생장촉진용 미생물 제제의 저온저장 중 안정성 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 미생물 제제를 이용한 갯메꽃에 대한 생장촉진효과 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 미생물 제제를 이용한 갯까치수영에 대한 생장촉진효과 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 미생물 제제를 이용한 갯쇠보리에 대한 생장촉진효과 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 사구식물복원을 위한 갯메꽃 파종지역과 방형구 설치모습을 나타낸 것이다.
도 24는 무처리구의 갯메꽃 발아사진이다.
도 25는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 함유한 미생물 제제 처리구의 갯메꽃 발아사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 해안사구 PGPR 의 분리

해안사구식물 생장촉진능을 가진 PGPR 균주의 분리를 위해, 동해안 일대 포항 사구지역에 서식하고 있는 11 종의 사구식물(참골무꽃, 갯잔디, 갯완두, 통보리사초, 갯방풍, 갯쇠보리, 순비기나무, 갯방풍, 갯메꽃, 갯씀바귀, 갯쇠보리)의 근권으로부터 토양시료를 채취하였다. 균주배양배지로는 해안사구의 특성상 영양물질 결핍과 염분이 높다는 점을 감안하여, 3 % NaCl이 첨가된 0.1, 0.5, 1 배 LB(Becton Dickinson, USA) 아가(agar) 배지를 사용하였다. 균주분리는 토양시료 1 g을 생리식염수(0.85 % NaCl) 9 ml에 현탁, 단계 희석하여 각각의 배지에 도말 후, 30 ℃에서 콜로니(colony)가 형성될 때까지 배양하였다.

배양 결과, 하기 표 1에 나타낸 것과 같이, 1,330 종의 세균 및 58 종의 방선균을 분리할 수 있었으며, 상대적으로 참골무꽃, 갯잔디, 통보리사초, 갯방풍의 근권에서 많은 세균들을 분리할 수 있었으며, 방선균은 세균에 비하여 많이 분리할 수 없었다. 또한 일반인들의 출입이 거의 없는 해안 군부대 내와 그 밖의 사구지역으로 구분하여 시료를 분리하였으며, 군부대 내의 사구지역에서 더 많은 근권 미생물을 분리할 수 있을 것이라 생각하였으나, 사구식물의 종에 따라 분리된 미생물 수에서 차이가 있었고, 지역은 크게 영향 받지 않았다.

[표 1. 해안사구에서의 세균 및 방성균 분리 결과]

실시예 2. 해안사구 PGPR 선발

2-1. 옥신생산성 해안사구 PGPR 선발

실시예 1에서 분리한 1,330 종의 근권 세균과 58 종의 방선균을 대상으로 주요 식물생장촉진호르몬 중의 하나인 옥신의 생산능을 확인하기 위해, Salkowski test[Kim, 2004]를 수행하였다. 분리된 균주들을 King's B broth(L-tryptophan 0.1 %, peptone No.3 2 %, K₂HPO₄ 0.15 %, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.15 %, glycerol 1.5 %, pH 7.0)에서 28 ℃, 200 rpm으로 3 일간 배양한 후, 상기 균주 배양액을 8000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 이후 배양상등액과 Salkowski reagent(27.6 mM FeCl₃, 6.6 M H₂SO₄)를 1:2(v/v)로 혼합하여 암조건, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 반응물을 535 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로 IAA(indole-3-acetic acid, Sigma, USA)를 사용하여 표준곡선을 작성하였다 [Jung et al., 2006].

측정 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 23 종의 근권 세균에서 옥신 생산능을 확인할 수 있었으며, 방선균에서는 옥신 생산능을 확인할 수 없었다. 옥신 생산균주로 확인된 분리 균주들은 모두 표준물질인 IAA와 비교하여 볼 때, 높은 농도의 옥신을 생산할 수 있는 해안사구 PGPR이었다. 또한 이들 해안사구 PGPR의 옥신 생산능은 사구생태계 복원에 있어서, 사구식물의 생산촉진작용에 이용할 만한 가치가 매우 높다고 사료된다.

[표 2. PGPR로부터 옥신 생산능 측정]

2-2. 지베렐린생산성 해안사구 PGPR 의 선발

상기 실시예 2-1에서 선별한 옥신 생산능이 뛰어난 해안사구 PGPR 중에서, 옥신 이외에 종자의 발아에 가장 큰 영향을 주는 지베렐린 생산균주를 선발하고자 하였다.

식물호르몬인 옥신과 지베렐린은 식물체에 서로 다른 생장촉진능을 발휘하므로, 두 식물호르몬을 동시에 생산하는 균주는 사구복원용 PGPR로 매우 용이하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 사구식물의 생장촉진효과도 단일 호르몬 생산균주에 비하여 뛰어날 것이라 사료되었다. 지베렐린의 생산능을 조사하기 위해, Holdbrook 등에 의해 기술된 U.V. spectrophotometric 방법을 이용하였다 [Lee et al., 1983]. 상기 분석 방법은 도 1에 나타낸 것과 같이 진행하였으며, 정량을 위해 GA₃(Sigma, USA)를 표준물질로 사용하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다.

지베렐린 생산균주를 탐색한 결과, 기선발된 고농도 옥신 생산성 다기능 해안사구식물 PGPR 23 균주 중에서 14 균주가 지베렐린 생산능이 있는 것으로 측정되었다(도 2). 특히 P. aurantiaca IB5-5, IB5-8, IB5-10, IB5-14 균주는 5 mg/ml 이상의 지베렐린을 생산하는 균주로 일반적으로 지베렐린의 생산능이 높다고 알려진 진균류의 2 배 이상의 생산능이 있었다. 이러한 결과는 실내포트실험을 통한 사구식물의 생장촉진능 검증이 이루어진다면, 실제 해안사구의 하구토양에 적용해 볼만한 가치가 매우 높을 것으로 사료된다.

실시예 3. 선발된 PGPR 의 균학적 성질 및 분류

상기 실시예 1 및 2에서와 같이 사구식물의 근권으로부터 분리된 균주로 식물생장촉진 호르몬 생산능 및 식물병원성진균의 생육억제능이 뛰어난 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 선발하여 한국농업미생물자원센터에 2010 년 6월 3일자로 P. aurantiaca IB5-10(KACC 91561P)로 기탁하였다. 이후 진해된 실험에서는 P. aurantiaca IB5-10를 사용하여 사구식물의 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 효과를 평가하였다. 상기 기탁된 P. aurantiaca IB5-10의 균학적 성질은 표 3에 나타내었다. 또한 P. aurantiaca IB5-10의 분류(classification)를 위해, 16S rDNA를 분리하여 시퀀싱 하였으며, 16S rDNA 시퀀싱 결과는 서열번호 1에 나타내었다.

[표 3. P. aurantiaca IB5-10의 균학적 성질]

P. aurantiaca IB5-10의 16S rDNA 시퀀싱 결과(서열번호 1)

TGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACT

CCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGC

GACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTT

GCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTC

GCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAG

GCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTG

TCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGG

ACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG

CTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATC

CATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGT

TGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAT

TCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAAT

GCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACAT

CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGC

TTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGG

TGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCA

CCCTCTACCATACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGA

GCCCGGGGATTTCACATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGCTTTACG

CCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTG

GCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAATACTCACG

TATTAGGTAAGTACCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAG

ACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCC

AATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTC

CAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTG

AGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCG

CAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAG

CGTCCGTTTCCGGACGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATT

ACTCACCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGAAGCAAGCTTCTCTCTACCGCTCG

ACTTGCATGTGTAGCCGCNCCC

실시예 4. 스트레스완화 호르몬 ABA의 생산능

ABA는 식물이 건조나 고염 등의 환경스트레스에 반응하는 물질로, 식물체 잎의 기공개폐 조절과 병원균의 침입에 의해 식물에 저항능을 유도하는 식물호르몬으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 선발된 균주가 생산하는 ABA 생산능을 측정하였다.

먼저, 선발된 균주를 정제하였으며, 이를 위해 HPLC를 이용하였다. HPLC 분석을 위한 정제 방법은 도 3에 나타내었다. 유기용매 추출물을 이용하여 조정제 하였으며, 표준물질 ABA는 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 또한 ABA의 정제를 위해, 사구식물 근권 다기능 PGPR 균주, P. aurantiaca IB5-10의 배양 상등액을 7 N HCl로 pH 2.5로 조정한 후, 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 1:1(v:v)로 첨가하고, 15 분간 교반기에서 교반한 후, ABA가 함유된 에틸아세테이트 층과 물 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층은 프리 ABA(free ABA)가 남아있는 층으로, 1/2 부피의 증류수로 3회 세척한 후, 감압농축기로 농축하여 HPLC 분석을 수행하였다. 그리고 물 층은 5 N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정한 후, 동량의 에틸아세티이트를 첨가하고 교반하여 다시 물 층을 회수하였다. 회수된 물 층은 도 3에 보이는 바와 같이, 다시 pH 11.0, pH 7.0, pH 2.0으로 단계별로 조정하면서 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 물 층을 회수하고, 농축하는 방법으로 최종적으로 결합된 ABA를 분리하였다. 또한 최종적으로 농축한 시료는 1 μl/ml의 농도로 50 % MeOH에 녹여 HPLC용 시료로 사용하였다. HPLC는, reverse-phase HPLC를 이용하였으며, C₁₈ 컬럼을 사용하였으며, flow rate는 1 ml/min으로 하였으며, 용매는 20 % MeOH 및 100 % MeOH의 농도구배로 용출하였다. 농도구배시 용매의 용출은 0 ~ 5 분간 20 % MeOH, 5 ~ 36 분간 20 ~ 100 % MeOH, 36 ~ 40 분간 100 % MeOH로 하였다. 측정 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 것과 같이 HPLC 분석 결과, ABA는 Retention time 19 분에서 검출되었음을 확인할 수 있다. 따라서 해안사구의 특성상 고온 건조 조건에 있는 사구식물의 특성상 ABA를 생산하는 해안사구 PGPR균주인 P. aurantiaca IB5-10을 적용한다면 사구식물의 기공 개폐 조절로 인한 식물체내 수분손실 감소 및 병원균에 대한 저항능을 유도하여 해안사구식물 생장을 향상시킬 수 있는 효과를 얻을 수 있다고 사료된다.

실시예 5. 환경스트레스완화 호르몬 JA 의 생산능

JA는 일반적으로 고등식물인 식물체에서 생산되는 식물호르몬으로 병원균의 침입이나 기계적인 상해, 다양한 환경스트레스에 반응하여 식물에 내성을 갖도록 유도하는 유도체로 알려져 있으며, 과일의 성숙, 수분의 생산, 뿌리의 성장, 미생물의 감염에 의한 식물의 방어시스템에 관여하기도 한다. 대부분의 JA 또는 Me-JA는 식물을 제외하고 균류에 의해서 생산되는 것이 대부분으로, PGPR인 세균에서 생산되는 것은 드물다. 이러한 식물호르몬 중 하나인 JA의 생산능을 P. aurantiaca IB5-10에서 측정하였다.

JA의 추출은 실시예 4의 ABA 추출과 동일하게 P. aurantiaca IB5-10의 배양상등액을 시료로 사용하였다. P. aurantiaca IB5-10의 배양상등액을 7 N HCl로 pH 4.5로 조정한 후, 에틸아세테이드(ethyl acetate)를 1:1(v/v)로 첨가하고 15 분간 교반기에서 교반한 다음, JA가 함유된 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 분리된 에틸아세테이트 층은 1/2 부피의 증류수로 3회 세척한 후, 감압농축기로 농축하였다. 농축한 시료는 1 μl/ml의 농도로 50 % MeOH에 녹여 HPLC용 시료로 사용하였다. HPLC 분석은 reverse-phase HPLC로 C₁₈ 컬럼을 사용하였으며, flow rate는 1 ml/min으로 하였으며, 용매는 0.1 % TFA(trifluoroacetic acid) : acetonitrile = 6 : 4 (v/v)를 사용하여 용출하였다 [Go et al., 2006]. 이후, GC-MS 분석을 위해 추출한 시료에 아세톤(aceton)을 넣고 20 분간 교반기를 이용하여 추출한 후, 필터에 여과시키고 내부표준물질로 20 ng의 [9, 10-²H₂]JA를 첨가하였다. 여기에 50 ml 증류수를 첨가시킨 후, 감압 농축시켜 아세톤을 모두 증발시키고, 수용층만 남겼다. 농축된 잔사를 0.1 M potassium phosphate(pH 7.5)로 녹인 후, 6 N HCl을 이용하여 pH 2.5로 조정한 후, 1 g의 DEAE(Diethylaminoethyl) 셀룰로오스(cellulose)를 가하여 1 시간 동안 교반기를 이용하여 진탕시켰다. 진탕시킨 여액을 여과시킨 후, 클로로포름(chloroform)으로 3회 분획한 후, Na₂SO₄로 물을 제거시킨 다음 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 소량의 디에틸에테르(Diethyl ether)로 녹여낸 후, NH₂ Cartridges를 이용하여 통과시킨 후, 클로로포름(Chloroform) : 아이소프로판올(Iso-propanol)(2:1, v/v)와 디에틸에테르(Diethyl ether) : 아세트산(Acetic acid)(98:2, v/v)의 순으로 용출시켰다. 이 여액을 감압 농축하여 디에틸에테르(Diethyl ether)로 용해시킨 후, 1 ml의 Reaction vial로 옮긴 후, 40 ℃에서 질소가스로 건조시킨 다음 바이알(vial)에 30 분간 2 차례에 걸쳐 60 μl Ethereal diazomethane을 첨가하여 메틸 에스테르(Methyl ester)를 유도한 후, 질소가스로 건조하였다. Reaction vial에 있는 시료를 무수 디클로로메탄(Dichloromethane) 40 μl에 녹인 후, 그 중 1 μl를 GC-MS에 주입하였다. JA의 정량분석을 위해 m/z 83, 151, 153의 이온으로 확인한 후, peak 면적의 비율로 정량하였다. 측정 결과는 도 5(HPLC) 및 표 4(GC-MS)에 나타내었다.

HPLC 분석 결과, 사구복원용 PGPR인 P. aurantiaca IB5-10의 JA 생산능을 retention time 3 분의 뚜렷한 단일 peak로 확인할 수 있었다. 또한 표 4에 나타낸 바와 같이, GC-MS 결과 P. aurantiaca IB5-10에서 0.083 ng/ml의 JA가 생성되는 것으로 확인되었다. 이것은 JA를 생산하는 세균의 분리 및 정제에도 의미가 있을 뿐만 아니라, 선발된 해안사구 PGPR 균주인 P. aurantiaca IB5-10의 사구토양내 적용시 사구식물들이 사구생태계에서 다양하게 노출되어 있는 환경적, 기계적, 병원균에 의한 스트레스에 내성을 갖는데 크게 기여할 것으로 보인다.

[표 4. P. aurantiaca IB5-10에서 JA 생산능의 GC-MS 분석]

실시예 6. 스트레스완화 물질 Levan 의 생산능

Levan은 프럭탄(fructan)의 일종으로 미생물 유래의 levan은 식물체내에서 종자 발아 촉진능 및 저장능을 조절하며, 가뭄, 저온 및 염스트레스를 완화시켜주는 역할을 한다. 또한 식물체에서 주요 질소원의 저장역할을 하기도 한다. 해안사구의 특성상 태양열로 인한 다량의 수분 증발, 주야의 극심한 온도차이와 영양결핍에 노출되어 있는 사구식물에게는 절대적으로 필요한 물질이기도 하다. 이에 본 발명자들은 사구식물의 생장과 스트레스 완화에 필요한 물질인 levan의 생산능을 측정하였다.

먼저, P. aurantiaca IB5-10를 2 % 수크로오스(sucrose)가 첨가된 YP broth(1 % bacto-yeast extract, 1 % bacto-peptone) 접종한 후, 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 8000 rpm에서 20 분간 원심분리 후, 배양상등액을 회수하였다. Levan의 생산유무를 확인하기 위해, TLC 및 HPLC 분석을 수행하였다. TLC는 배양상등액을 실리카 겔(silica gel) 60 F254 플레이트에 0.1 μl씩 점적 후, butanol/acetic acid/water(5:4:1, v/v/v) 전개 용매에서 두 번 전개하였다. 전개 후, 흄 후드 내에서 건조 후 95 % 메탄올, 5 % sulfuric acid, 0.3 % N-(1-naphthyl)-ethylenediamine 용매에 담근 후, 120 ℃에서 10 분간 가열하였다 [Kim et al., 2003]. HPLC는 reverse-phase HPLC로 gel filtration column(Shodex Ionpack KS-802, 300×8 mm, Japan)을 사용하였으며, flow rate 0.4 ml/min, 용매는 3차 증류수를 이용하여 용출하였다. 표준물질로는 levan, 수크로오스(sucrose), 프럭토오스(fructose), 글루코오스(glucose)를 사용하였으며, 모두 Sigma 사에서 구입하였다. 측정 결과는 도 6 내지 7 및 표 5에 나타내었다.

도 6에 나타낸 것과 같이, 다기능 해안사구 PGPR 균주인 P. aurantiaca IB5-10은 배양 12 시간 후부터 수크로오스(sucrose)를 이용하여 levan을 생산하기 시작하였으며, 대조군인 E. coli의 경우 수크로오스를 이용하지 못하는 것으로 관찰되었다. 또한 HPLC 분석을 통하여 P. aurantiaca IB5-10를 12 시간 및 24 시간 배양시 levan 생산량을 측정한 결과, 도 7 및 표 5에 나타낸 바와 같이, P. aurantiaca IB5-10을 12 시간 배양하는 경우, 6.60 mg/ml의 levan을 생산하였으며, 24 시간 배양하는 경우에는 7.65 mg/ml 생산하였다. 상기의 결과로, levan 생산능을 가지는 P. aurantiaca IB5-10를 해안사구 현장 적용시 급격한 온도 차이와 수분 및 영양분이 결핍된 환경에 놓여있는 해안사구식물에 다양한 환경스트레스 완화 및 질소원 등의 영양분을 공급하여 사구식물 복원에 매우 효과적일 것이라 기대된다.

[표 5. P. aurantiaca IB5-10에서 levan 생산능]

실시예 7. 환경스트레스 완화 효과 검증

P. aurantiaca IB5-10가 건조의 환경스트레스에 항상 노출되어있는 사구 모래토양에서 사구식물의 건조스트레스 저항성을 유도하는지를 관찰하였다.

실내포트 실험을 통하여 수분공급이 없는 인위적으로 조성된 건조스트레스 환경에서 P. aurantiaca IB5-10를 처리한 후, 갯메꽃의 생육상태를 조사하였다. 먼저, P. aurantiaca IB5-10 처리구 및 무처리구로 나누고 30 일간 5,000 lux, 30 ℃, 50 %, 12 시간 일장인 항온항습실에서 실험을 수행하였으며, 갯메꽃의 수분보충은 생육 초기 10 일 동안 두 차례 모래가 마르지 않을 정도로 수분공급을 실시한 후, 이후 수분 공급을 중지하였다. 그리고 P. aurantiaca IB5-10는 30 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체만 회수하고, 멸균수로 한번 희석하였다. 균체의 접종농도는 10⁷ CFU/ml로 하였으며, 각 실험구는 20 포트, 3회 반복실험한 후 통계 처리하여 조사하였다. 관찰 결과는 도 8 내지 10 및 표 6에 나타내었다.

도 8 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 건조스트레스 하에서 30 일이 경과하였을 때 균체를 무처리한 갯메꽃의 경우, 50 %가 노랗게 말라 줄었으며, P. aurantiaca IB5-10 처리한 갯메꽃에서는 생육이 지속되었다. 또한 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 건조스트레스 하에서 50 일이 경과한 시점에서는 균체를 무처리한 갯메꽃의 약 90 %가 말라죽었으나, P. aurantiaca IB5-10를 처리한 갯메꽃에서는 생존율이 50 %를 나타내었다.

[표 6. 갯매꽃에 대한 건조스트레스 저항성 유도효과(30일 경과)]

또한, 다양한 해안사구식물에서의 건조 및 염스트레스 저항성 유도효과를 검증하기 위하여 갯쇠보리를 이용하여 저항성 유도효과를 관찰하였다. 실험조건은 상기 갯메꽃과 동일하게 수행하였으며, 추가적으로 염스트레스를 가하기 위해서 수분공급시 5 %의 NaCl 수용액을 사용하였다. 관찰 결과는 도 11 내지 12에 나타내었다.

도 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 균체를 무처리한 갯쇠보리의 경우 5 %의 염처리 및 수분공급을 중지한지 10 일 만에 100 % 말라 죽었으나, P. aurantiaca IB5-10을 처리한 갯쇠보리는 80 %의 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 P. aurantiaca IB5-10는 건조 및 고염 조건에 항상 노출되어 있는 사구식물에게 환경스트레스에 대한 저항성을 가지게 함을 보여주는 것이다. 즉, 사구식물에 저항성을 가지게 함으로써 건조 및 고염 조건에서 사구식물의 생존율을 향상시켜 파괴된 해안사구의 친환경 생태계 복원에 큰 효과가 있으리라 사료된다.

실시예 8. 대량배양용 상업배지 개발 및 최적 미생물 배양조건

다기능 PGPR 중 사구식물생장촉진능과 건조스트레스 저항 유도능이 가장 뛰언나 P. aurantiaca IB5-10의 제제화를 위하여, 대량배양용 탄소원과 질소원을 조사하였다.

기본배지인 Davis minimal broth(K₂HPO₄ 0.7 %, KH₂PO₄ 0.2 %, (NH₄)₂SO₄ 0.1 %, Glucose 0.1 %, Sodium citrate 0.05 %, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.01 %)를 변형하여 탄소원으로 아밀로오스(amylose), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 수크로오스(sucrose), 덱스트로스(dextrose), 아라비노스(arabinose), 당밀(molasses), 콘 스타치(corn starch)를 이용하고, 질소원의 경우 황산암모늄(ammonium sulfate), 펨톤(peptone), KNO₃, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, 대두케이크(soybean cake), 콘 스팁 리커(corn steep liquor)를 이용하여 조사하였다. 측정 결과는 도 13 및 14에 나타내었다.

측정 결과, 탄소원의 경우 당밀이 10¹² CFU/ml, 질소원의 경우 황산암모늄(ammonium sulfate)이 10¹¹ CFU/ml의 매우 높은 균체 생성량을 나타내었으며, 대량배양용 배지의 조성은 탄소원과 질소원을 기본으로 하기 표 7과 같이 구성하였다.

[표 7. 대량배양용 상업배지의 조성]

또한, 상기 대량배양용 배지에 8L jar fermentor(KF-8L, KoBioTech Co., Korea)를 이용하여 대량배양시 공기의 유입량과 교반 속도 등의 배양조건에 대하여 조사한 결과, 교반속도의 경우 200 rpm에서 20 시간에서 가장 높은 균체 밀도를 나타내었으며, 공기 주입량의 경우 2.5 NI/min에서 가장 높은 균체 밀도를 나타내었다. 이에 따라 대량배양을 위한 최적 배양조건을 하기 표 8과 같이 결정하였다.

[표 8. 대량배양용 배양조건]

실시예 9. 대량배양용 상업배지의 효과 검증

균체대량생산의 효율성을 위하여 대량배양용 배지와 배양조건을 기존 실험실 내에서 사용하는 LB broth와 균체생육을 비교 측정하였다. 비교배지는 LB broth를 사용하였으며, 8L jar fermentor(KF-8L, KoBioTech Co., Korea)를 이용하여 30 ℃에서 배양하면서 2 시간마다 배양액을 회수한 후, 희석 도말하여 균체생육을 조사하였다.

상기와 같이 조성 및 확립된 대량배양용 배지의 균체생산량을 실험실내 미생물 배양배지로 가장 많이 사용되는 LB 배지와 비교한 결과(도 15), LB 배지의 경우 10¹¹ CFU/ml 최대균체밀도를 보여주었으나, 본 발명에서 개발된 상업용 배지의 경우에는 10¹² CFU/ml 정도의 최대균체밀도를 보여주었다. 따라서 일반배지보다 본 발명의 상업용 배지가 제제화를 위한 다기능 PGPR 균주 대량배양시 배지 단가를 낮출 수 있으며, 균체 생산량을 높여 높은 균체밀도를 가지는 제제를 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 10. 안정성 높은 제제화 방법

P. aurantiaca IB5-10 균주의 담체를 이용한 분상 제제화를 위하여, 사용균주에 가장 높은 안정성을 주는 담체를 선발하였다. 담체를 이용한 분상 제제화 방법은 미생물 제제화시 가장 많이 사용되는 방법 중 하나로, 무기담체를 사용하여 수분활성도를 유지시키고, 담체기공에 미생물을 붙이는 미생물의 안정성을 증가시키는 방법이다. 사용된 담체는 (주)세라이트코리아의 H1800A, H1800B, H1800C와 (주)렉셈의 제올라이트(zeolite), (주)동창일라이트의 일라이트(Ilite), (주)지심테크의 NaY, NZ, ND7, NaX, NaAs를 상기 회사로부터 공급받아 사용하였다.

담체 선발을 위하여, 배양액과 담체를 1:2(v/v)의 비율로 무균상자에서 혼합하고, 혼합 조성물을 45 ℃에서 1 시간 처리하여 LB agar 배지에 희석 도말 후, 생존균체수를 조사하였다. 측정 결과는 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 것과 같이, P. aurantiaca IB5-10 분말 제제화 실험에 사용할 것으로 제올라이트(zeolite), 일라이트(Ilite), H1800C를 선정하였다. 제올라이트(Zeolite), 일라이트(Ilite), H1800C는 다른 담체에 비하여 초기균체량에서 선정한 담체의 정보로, 제올라이트(zeolite)는 (주)대유로부터 공급받은 것으로 화학적 성분으로 AI₂O₃, SiO₂, Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, SO₃, TiO₂, LOI로 구성되어있다. 일라이트(Ilite)는 (주)동창일라이트로부터 공급받은 것으로 두께 30 Å, 지름 0.1 ~ 0.3 μm, 지면간격 10 Å, 비중 2.6 g/ml이고, 화학적 성분으로 SiO₂, AI₂O₃ _,Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, P₂O₅, TiO₂, LOI로 구성되어 있다. H1800C는 (주)세라이트코리아로부터 공급받은 것으로 화학적 성분은 SiO₂ _,Al₂O₃ _,Na₂O, CaO, Fe2O_3,K₂O, TiO_2,MgO로 구성되어 있으며, pH 6.5 ~ 7.3, 비중은 0.15 g/ml이다.

분말 제제화 방법으로는 P. aurantiaca IB5-10 균주를 8L jar fermontor를 이용하여 30 ℃, 200 rpm, 2.5 NI/min, 20 시간 동안 배양하고, 이후 배양액을 회수하여 선발된 담체인 제올라이트(zeolite), 일라이트(Ilite), H1800C와 각각 1:2(v/v)으로 무균상태에서 혼합 후, 1차적으로 폴리에틸렌수지에 밀봉 포장하였다. 분말제제의 고온 및 저온에서의 저장 중 가학안정성 실험을 위하여 도 17과 같이 제제화 샘플을 제조하였다.

실시예 11. 분말제제의 안정성

P. aurantiaca IB5-10 액상 및 분상 제제의 저장, 유통 및 보관 중 경시적 변화에 따른 미생물의 안정성 조사를 위해 하기 표 9와 같이 농촌진흥청 경시변화 시험기준과 방법에 따라 고온 및 저온 가학안정성 실험을 실시하였다. 고온 가학안정성 실험의 경우 각각의 제제 샘플은 30 ℃에서 보관하여 18 주간 3 반복으로 실시하였다. 저온 가학성안정성 실험의 경우 제제 샘플을 0 ℃에서 7 일간 보관하였으며, 1 반복의 사용되는 시료는 5 개를 준비하여 1 주마다 LB agar에 희석 도말하여 생존 균체수를 조사하였다. 측정 결과는 도 18 내지 19에 나타내었다.

[표 9. 경시변화 시험기준화 방법(미생물농약 및 생화학농약 공통)]

측정 결과, 분말 제제의 경우 30 ℃에서의 처리에서는 경시변화를 추적할 수 있었다. 대조구와 일라이트(Ilite)의 경우 10 주부터 균체 밀도가 반감하기 시작하여 18 주에는 10¹ CFU/ml의 균체 밀도를 나타내었으나, 제올라이트(zeolite)의 경우 18 주간 10⁹ CFU/ml의 균체 밀도를 계속 유지하였으며, H1800C의 경우에도 10⁶ CFU/ml 정도의 균체 밀도를 유지하였다(도 18). 또한, 0 ℃에서의 저온 가학실험에서는 대조구와 일라이트(Ilite) 처리구의 경우, 7 일간 저장시 10 배 정도의 균체 밀도가 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 제올라이트(zeolite)와 H1800C를 이용한 P. aurantiaca IB5-10의 경우 균체 밀도가 감소하지 않고 꾸준히 지속되는 것으로 확인되었다(도 19). 상기 결과는 농진청 고시 경시변화 시험기준에 따르면 원제의 특성상 고온에서 경시변화를 추적하지 못할 경우, 30 ℃에서의 시험기준이 인정되므로 약효보증기간을 1년으로 설정하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 사구식물생장촉진용 미생물 제제의 담체이용 분말 제제화를 위한 최적담체로서 저장 중 안정성이 가장 뛰어난 제올라이트(zeolite)를 선발하였으며, 하기의 미생물 제제의 효과검증과 실제 해안사구에서 사구식물복원에 이를 이용한 미생물 제제를 사용하였다.

실시예 12. 사구식물 생장촉진용 미생물 제제의 효과검증

P. aurantiaca IB5-10를 이용하여 제작된 제제의 효과를 검증하기 위하여, 30 ℃, 50 % 습도의 항온항습실 내에서 생장촉진능 실험을 수행하였다. 제제의 처리농도는 10⁷ CFU/pot로 처리하였으며, 생장촉진능 및 염스트레스 저항 유도능 시험에 사용된 사구식물은 동해안 화진해수욕장 해안사구에서 채취한 종자를 파종하여 직접 재배한 갯메꽃, 갯까치수영과 갯쇠보리를 이용하였다. 포트에 사용한 모래는 실제 사구식물의 염분, 영양분 등의 토양환경과 동일하게 하기 위해 동해안 고래불 해수욕장의 사구식물채집지역에서 수집한 것을 사용하였다. 포트당 400 g의 모래를 균일하게 분주하였으며, 분주 후 저온 처리한 종자를 1 cm 깊이로 심고, 30 ℃, 50 % 습도하의 항온항습기에서 발아시켰다. 발아 후, 떡잎이 전개되었을 때 동일한 높이의 갯메꽃 포트만을 선별하여 생육촉진능 실험에 사용하였다. 각 실험구는 20 포트로 하였으며, 3회 반복실험한 후 통계처리하여 제제의 효과에 대하여 측정하였다. 측정 결과는 도 20 내지 22 및 표 10 내지 12에 나타내었다.

도 20 및 표 10에 나타낸 바와 같이, P. aurantiaca IB5-10 분말 제제의 경우 갯메꽃 시험구에서 10 일 후, 무처리구에 비해 줄기 신장이 1.5 배, 뿌리 길이 1.4 배, 잔뿌리 수 1.8 배, 본엽의 수 2.2 배 이상 많은 것으로 측정되었다. 또한 도 21 및 표 11에 나타낸 바와 같이, 갯까치수영 시험구에서는 무처리구에 반하여 P. aurantiaca IB5-10 분말 제제의 경우, 발아율이 4.9 배, 엽면적이 50 % 정도 높았다. 그리고 도 22 및 표 12에 나타낸 바와 같이, 갯쇠보리 시험구에서 P. aurantiaca IB5-10 분말 제제의 경우, 줄기신장 2 배, 뿌리길이 5.2 배, 잔뿌리 수 2.1 배, 본엽의 길이 2.2 배 높은 것으로 조사되었다. 따라서 본 발명에서 개발된 P. aurantiaca IB5-10 분말 제제는 해안사구 식물의 생장촉진에 뛰어난 효과가 있음이 검증되었으므로, 해안사구복원에 충분히 이용할만한 가치가 있다고 사료된다.

[표 10. 갯메꽃에 대한 생장촉진효과]

[표 11. 갯까치수영에 대한 생장촉진효과]

[표 12. 갯쇠보리에 대한 생장촉진효과]

실시예 13. 사구식물 생장촉진용 미생물 제제를 이용한 사구식물복원방법

다기능 PGPR을 이용하여 제작된 제제의 실제 해안사구에서 사구식물복원 가능성을 검증하기 위하여, 현정적용 시험을 수행하였다. 현장적용 시험은 일반인의 출입이 제한되는 경북 포항시 화진해수욕장 50 사단 훈련장 내의 해안사구에서 실시하였으며(도 23), 실험은 처리구 당 60 립의 갯메꽃 종자를 이식 후 분말 제제를 수돗물에 10⁷ CFU/ml가 되도록 희석 후, 스프레이(spray) 방법으로 처리하였다.

먼저, 2009년 7월 29일에 방형구를 설치하여 갯메꽃 종자 60 립을 파종하였다. 이후, 60 일이 지난 2009년 9월 29일에 발아율 조사를 실시하였다. 무처리구의 경우, 발아율이 0 %인 것에 반하여 P. aurantiaca IB5-10 제제 처리구의 경우 36.6 %인 것으로 조사되었다(도 24 내지 25, 표 13). 본 발명에서 개발된 P. aurantiaca IB5-10 제제가 갯메꽃 자연적 발아기간이 아닌 시기에 발아한 점과, 무처리구에 비해 40 %에 가까운 발아율을 나타낸 것은 실제 해안사구현장에서도 뛰어난 효과를 나타낸다고 생각되며, 이는 해안사구식물의 적정 발아기간에 시비하게 된다면 발아율 향상 및 사구식물의 생장촉진효과로 인하여 파괴된 해안사구복원을 위한 해안사구식물 생장촉진 및 발아촉진에 크게 도움이 된다고 사료된다. 이는 다기능 PGPR을 이용한 미생물 제제가 뛰어난 효과가 있을뿐더러 차후 인공구조물에 의한 해안사구복원비 절감 및 친환경 생태계 복원에 큰 효과가 있으리라 예상된다.

[표 13. 사구식물생장촉진용 미생물 제제에 의한 갯메꽃 발아실험 결과]

농업생명공학연구원

KACC91561P

20100603

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pseudomonas aurantiaca IB5-10 having environmental stresses resistance and plant growth promotion, microbial agent containing the same, and producing Plant Growth Promoting Rhizobacteria from the coastal sand dune plant <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA of Pseudomonas aurantiaca IB5-10 <400> 1 tggtaccgtc ctcccgaagg ttagactagc tacttctggt gcaacccact cccatggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc gacattctga ttcgcgatta 120 ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcggttt 180 tatgggatta gctccacctc gcggcttggc aaccctctgt accgaccatt gtagcacgtg 240 tgtagcccag gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300 tcaccggcag tctccttaga gtgcccacca taacgtgctg gtaactaagg acaagggttg 360 cgctcgttac gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca 420 cctgtctcaa tgttcccgaa ggcaccaatc catctctgga aagttcattg gatgtcaagg 480 cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540 ccccgtcaat tcatttgagt tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcaacttaat 600 gcgttagctg cgccactaag agctcaaggc tcccaacggc tagttgacat cgtttacggc 660 gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt 720 atcagtccag gtggtcgcct tcgccactgg tgttccttcc tatatctacg catttcaccg 780 ctacacagga aattccacca ccctctacca tactctagct cgccagtttt ggatgcagtt 840 cccaggttga gcccggggat ttcacatcca acttaacgaa ccacctacgc gcgctttacg 900 cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct ctgtattacc gcggctgctg gcacagagtt 960 agccggtgct tattctgtcg gtaacgtcaa aatactcacg tattaggtaa gtacccttcc 1020 tcccaactta aagtgcttta caatccgaag accttcttca cacacgcggc atggctggat 1080 caggctttcg cccattgtcc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt 1140 gtctcagttc cagtgtgact gatcatcctc tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg 1200 agccattacc tcaccaacta gctaatccga cctaggctca tctgatagcg caaggcccga 1260 aggtcccctg ctttctcccg taggacgtat gcggtattag cgtccgtttc cggacgttat 1320 cccccactac caggcagatt cctaggcatt actcacccgt ccgccgctct caagagaagc 1380 aagcttctct ctaccgctcg acttgcatgt gtagccgcnc cc 1422

Claims

사구식물의 근권으로부터 분리된, 사구식물의 환경스트레스 완화 및 식물생장촉진 기능을 갖는, 한국농업미생물자원센터에 KACC 91561P로 기탁된 균주 Pseudomonas aurantiaca IB5-10.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 환경스트레스 완화 호르몬 ABA 및 JA, 및 환경스트레스 완화 물질 Levan의 생산능을 갖는 것을 특징으로 하는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10.
제 1항에 따른 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제.
제 4항에 있어서, 상기 미생물 제제는 사구식물의 건조 및 염 스트레스 저항성을 증가시키고, 사구식물의 생장촉진 효과가 있는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제 4항에 있어서, 상기 미생물 제제는 Pseudomonas aurantiaca IB5-10의 배양액을 무기담체와 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제 6항에 있어서, 상기 배양액은 Pseudomonas aurantiaca IB5-10을 당밀(Molasses) 15-30 g/L, 콘 스팁 리커(Corn steep liquor) 15-30 g/L, 황산암모늄(Ammonium sulfate) 5-15 g/L, 일인산 칼륨(Monopotassium phosphate) 4-7 g/L, 이인산 칼륨(Dipotassium phosphate) 3-5 g/L, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 2-4 g/L, 황산망간(Manganese sulfate) 0.3-0.7 g/L, 소포제(Antiforming agent) 0.5-0.8 g/L를 포함하는 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제 6항에 있어서, 상기 무기담체는 AI₂O₃, SiO₂, Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, SO₃, TiO₂, 및 LOI로 구성된 제올라이트(Zeolite), SiO2, AI₂O₃ _,Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, P₂O₅, TiO₂, 및 LOI로 구성된 일라이트(Ilite), 또는 SiO₂ _,Al₂O₃ _,Na₂O, CaO, Fe2O₃ _,K₂O, TiO₂ _, 및MgO로 구성된 H1800C인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제 4항에 따른 미생물 제제를 사구식물에 투여하는 것을 포함하는 사구식물의 복원방법.
제 9항에 있어서, 상기 사구식물에의 투여는 미생물 제제를 물에 희석 후, 스프레이 방법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 사구식물의 복원방법.
제 9항에 있어서, 상기 사구식물의 복원은 건조 및 염 스트레스 저항성이 증가되고, 사구식물의 생장이 촉진되는 것을 특징으로 하는 사구식물의 복원방법.
제 9항에 있어서, 상기 사구식물은 갯메꽃, 갯까치수영 또는 갯쇠보리인 것을 특징으로 하는 사구식물의 복원방법.