KR102508900B1 - 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지 - Google Patents
식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P)인 식물 생육 증진 및 식물 병원균의 생육 억제 기능을 갖는 미생물을 제공할 수 있다.
또한, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P) 배양배지인 것을 특징으로 하는 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지를 제공할 수 있다.
또한, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P) 배양배지인 것을 특징으로 하는 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저렴한 비용으로 생산 가능하고, 작물 생육 시기에 맞춰 사용할 수 있는 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지에 관한 것이다.
친환경농업이란 농림축산물을 생산함에 있어 화학농약·비료·항생제를 사용하지 않거나 최소한으로 사용하여 자연 생태계를 유지보존하면서 안전한 농축산물을 생산하는 농업을 일컫는다. 이러한 친환경농업을 실현하기 위해서는 화학농약·비료를 대체하는 천연재료를 이용하여야 한다.
현재 천연에서 얻은 자원을 이용하여 다양한 작물 생육용 및 병해충 방제용 친환경 농자재가 개발되고 있다. 이 가운데 작물 생육 증진 및 병해충 예방에 유용미생물을 많이 이용하고 있다. 이 외에도 유용미생물은 토양 개량, 식물 면역 증진, 토양 생물상 개선, 양분의 공급 등의 목적으로써도 많이 활용 되고 있다.
특히 식물 생장 촉진 근권미생물(PGPR, Plant Growth Promoting Rhizobacteria)은 친환경 농가뿐만 아니라 관행 농가에서도 화학비료와 화학농약 대신 또는 보조용으로 많이 사용되고 있다.
유용미생물은 일본 류쿠대학(the University of the Ryukyus Japan) Higa 교수에 의하여 개발된 것으로써 5과 10속 80여종의 유익한 미생물을 혼합하여 만든 제품이다. 이 유용미생물의 대표적인 것은 광합성균, 유산균, 효모균 및 바실러스균으로 알려져 있다. 이 가운데 바실러스균은 생물계면활성제로 알려진 Iturin계의 항생제 등 다양한 항생 물질을 생산하여 식물에 병을 일으키는 곰팡이 병원균의 증식을 억제하는 활성을 나타낸다.
이러한 유용미생물을 농가에 공급하기 위해서는 미생물을 배양하는 과정이 필요하다. 미생물을 배양하기 위해서는 미생물 생육에 필요한 영양분을 공급해 주어야 하는데 이러한 영양분의 공급 역할을 하는 것이 미생물 배지이다.
여기서 사용되어지는 배지와 배지원료는 주로 외국으로부터 수입되어진 제품으로 고가이며, 현재 상품화되고 판매되어 지고 있는 미생물 생육용 배지는 미생물 균수를 증진 하는데 맞춰져 있어 실질적으로 미생물 배양액이 사용되어지는 작물에는 최적화가 되어져 있지 않는 것으로 보여진다.
물론 미생물의 사용 효과는 미생물 배지에 포함되어 있는 배지의 효과보다 미생물의 직접적인 작물 생육 증진 및 병해충 방제에 효과가 있다고 볼 수 있다.
하지만 미생물 배지에도 엄연히 비료성분이 포함되어 있다. 현재 미생물 배양을 위해 사용하고 있는 배지는 대부분 질소 성분이 높다. 이렇게 질소 성분이 높은 미생물 배양액을 작물 결실기 또는 비대기에 사용된다면 작물이 생식 생장기로 전환이 되어야 하는데 영양생장기에 머물러 열매의 착과와 비대가 다소 낮아질 수 있다.
작물은 생육 시기별로 필요한 비료 성분이 조금씩 다르다. 그러므로 현재 사용하고 있는 미생물 배양배지는 작물과는 영양성분 조합이 맞지 않을 수 있다.
예를 들면, 생육 초기에는 영양 생장을 위해서 질소(Nitrogen) 비료가 많이 필요하고, 생식 생장기에 접어드는 결실기에는 꽃을 피우고 열매를 맺기 위해 인(Phosphorus)과 칼륨(Potassium) 비료가 더 많이 필요하며, 비대기에는 질소비료 보다 칼륨비료가 상대적으로 많이 공급 되어야 한다.
그러므로 이러한 작물 생육 특성에 맞는 미생물 배양배지를 개발하여 작물 생육 시기에 맞춰 적절하게 사용하는 기술이 필요한 실정이다.
종래기술로는 대한민국 등록특허 제10-0680318호 "미생물 배양용 영양배지"가 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 친환경적 농업에 활용 가능하도록 저렴한 비용으로 생산 가능하고, 작물 생육 시기에 맞춰 사용할 수 있는 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지를 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 식물 병원균은, 검은무늬병(KACC 40019), 잿빛곰팡이병(KACC 40574), 고추탄저병(KACC 40003, KACC 40489), 도열병(KACC 40439), 인삼뿌리썩음병(KACC 41077), 시들음병(KACC 44452), 역병(KACC 40483), 모잘록병(KACC 40125), 인삼균핵병(KACC 45152), 상추균핵병(KACC 40457), 감귤점무늬병(KACC 45782) 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P) 미생물 배양배지인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 미생물 배양배지는, 포도당, 효모추출물, 글루타민산, 요소, 인산칼륨 및 황산칼륨 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 배양배지는, 작물의 생육 시기에 따라 구분하여 생장기용 배양배지 및 결실기용 배양배지를 포함할 수 있다.
또한, 상기 생장기용 배양배지는, 포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 20 내지 40중량부, 인산칼륨 5 내지 12중량부 및 황산칼륨 0.5 내지 5중량부 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 결실기용 배양배지는, 포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 4 내지 15중량부, 인산칼륨 8 내지 20중량부 및 황산칼륨 1 내지 10중량부 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면 친환경적 농업에 활용 가능하도록 저렴한 비용으로 생산 가능하고, 작물 생육 시기에 맞춰 사용할 수 있는 미생물 배양배지를 제공할 수 있다.
또한, 미생물 배양배지는 작물 생육 증진 및 병해충 방제에 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 대치배양했을 때 각 식물 병원균의 증식을 억제하는 사진.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 생리활성 반응 결과 사진.
도 3은 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 16s rRNA 염기서열.
도 4는 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 동정 분석 결과데이터.
도 5는 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 TSA 배지에 배양시킨 후 콜로니를 촬영한 사진.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 클로로포름 추출물을 처리하여 대치배양하였을 때 각 식물 병원균의 증식을 억제하는 사진.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 Gelatinase, Protease, Cellulase 및 Lipase 효소활성 측정 결과 사진.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 질소 고정능력 측정 결과 사진.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 인가용화 활성 측정 결과 사진.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지의 IAA 생산 특성을 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 생리활성 반응 결과 사진.
도 3은 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 16s rRNA 염기서열.
도 4는 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 동정 분석 결과데이터.
도 5는 선발된 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 TSA 배지에 배양시킨 후 콜로니를 촬영한 사진.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 클로로포름 추출물을 처리하여 대치배양하였을 때 각 식물 병원균의 증식을 억제하는 사진.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 Gelatinase, Protease, Cellulase 및 Lipase 효소활성 측정 결과 사진.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 질소 고정능력 측정 결과 사진.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 인가용화 활성 측정 결과 사진.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지의 IAA 생산 특성을 나타낸 그래프.
이하, 도면을 참조한 본 발명의 설명은 특정한 실시 형태에 대해 한정되지 않으며, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 또한, 이하에서 설명하는 내용은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하의 설명에서 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용되는 용어로서, 그 자체에 의미가 한정되지 아니하며, 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
여기서, 반복되는 설명, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능, 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명의 실시형태는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명은 토양으로부터 분리되어 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지를 제공하는데 있다.
이러한 본 발명의 미생물은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P)로서, 본 발명에서 최초로 분리 동정된 신규한 미생물로, 토양에 내생하고 있는 미생물을 배양법에 기초하여 처음으로 분리 동정하였다.
이하, 토양으로부터 신미생물을 동정하기 위한 방법 및 신미생물의 식물 병원균에 대한 방제효과, IAA 생성능, 인산염 분해능, 효소활성에 대하여 실시예를 중심으로 설명한다.
1. 미생물 분리 및 선발
식물이 재배되고 있는 토양으로부터 식물병 방제 효과가 있는 미생물을 분리하기 위하여, 전라북도 순창군의 11개읍면 작물 경작지에서 토양 150점을 채집하여 분리하였고, 미생물 선발은 검은무늬병균, 잿빛곰팡이병균, 고추탄저병균, 도열병, 인삼뿌리썩음병, 시들음병균, 역병, 인삼균핵병균, 모잘록병, 상추균핵병 및 감귤점무늬병균과의 대치배양에 의한 길항력 검정에 의해 억제율을 비교하여 선발하였다. 길항력 검정에 의해 선발된 미생물의 분리는 TSB(Tryptic soy broth) 배지에서 배양하여 분리하였고, 선발된 미생물은 글리세롤을 첨가하여 최종 25 %로 맞춘 후 -70℃에 보관하였다.
길항력 검정으로 식물 병원균에 대한 균사생장 억제효과를 보기 위해, 각각의 식물 병원균을 PDA 배지에서 7일 간 암조건에서 배양한 후, 균사 끝 부분에서 5 mm 직경의 cork-borer로 agar plug를 떼어 내어 LB agar(Duchefa, Haarlem, Netherlands)와 PDA를 50 %씩 혼합한 PLA(PD+LBA)배지 한쪽 편에 접종하였다. 그리고 25℃, 암조건에서 하루를 배양시킨 후 길항균을 반대편에 치상하였다. 25℃에서 6일간 배양하여 균사의 저지원 길이를 측정하였다. 이때 한 개의 plate를 한 반복으로 3반복 실험하였다.
여기서 대조구로는 무처리한 PLA(PD+LBA)배지의 반대쪽 편을 이용하였다.
<억제율(%) = (대조구 - 실험구)/대조구 * 100>
분리된 미생물을 검은무늬병균, 잿빛곰팡이병균, 고추탄저병균, 도열병, 인삼뿌리썩음병, 시들음병균, 역병, 인삼균핵병균, 모잘록병, 상추균핵병 및 감귤점무늬병균과 대치배양한 결과, SCAT002는 Alternaria alternate(검은무늬병 KACC 40019)에 대해 36.3 %, Botrytis cinerea (잿빛곰팡이병, KACC 40574)에 대해 29.8 %, Colletotrichum gloeosporioides (고추탄저병, KACC 40003)에 대해 29.6 %, Colletotrichum autatum(고추탄저병, KACC 40489)에 대해 31.4 %, Pyricularia glisea(도열병, KACC 40439)에 대해 40.8%, Cylindrocarpon destructans (인삼뿌리썩음병, KACC 41077)에 대해 34.1 %, Fusarium oxysporum(시들음병, KACC 44452)에 대해 31.0 %, Phytophthora capsici (역병, KACC 40483)에 대해 30.7 %, Rhizoctonia solani(모잘록병, KACC 40125)에 대해 30.6 %, Sclerotinia nivalis(인삼균핵병, KACC 45152)에 대해 48.6 %, Sclerotinia scleotiorum(상추균핵병, KACC 40457)에 대해 24.0 %, Diaporthe citri(감귤점무늬병, KACC 45782)에 대해 43.3 % 및 Colletotrichum scovillei (고추탄저병)에 대해 31.4 %의 억제율을 보였다(표 1 및 도 1).
따라서, 식물병 방제 효과가 있는 미생물로 SCAT002를 선발하였다.
2. 미생물의 생화학적 특성분석
선발된 SCAT002 미생물의 생화학적 특성분석을 위해, API 50CHB kit(BioMerieux, France)를 이용하여 생리학적 특성 분석을 실시하였다.
실험에 사용된 미생물은 미리 배양기에서 배양 한 TSA 배지상의 미생물들을 실험 당일 API Suspension medium 2 ㎖에 현탁하여 McFarland 탁도 5로 조정하였다. 조정된 미생물은 API 50CHB kit의 각 cupule에 65 ㎕를 접종하고 37℃에서 4시간 배양하여 색깔 변화로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과는 표 2, 도 2와 같다.
<0: 0nmol, 1: 5nmol, 2: 10nmol, 3: 20nmol, 4: 30nmol, 5: 40nmol>
SCAT002 미생물의 효소 활성은 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase)에 4 nmol, 에스테레이스(Esterase, C4)에 2 nmol, 애시드 포스파타아제(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제(Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)에 각각 1 nmol 정도의 활성을 보였다.
이와 같은 결과에서, 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 애시드 포스파타아제(Acid phosphatase) 등의 활성이 나타내는 것을 보았을 때, 토양 내에 있는 불용성 인산을 가용화하여 작물의 인산 흡수율을 높일 수 있을 것으로 사료된다.
한편, Control, Lipase, Leucine arylamidase, Valine arylamidase, Crystine arylamidase, Trypsin, α-chymotrypsin, α-galactosidase, β-glucuronidase, β-glucosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, α-fucosidase에서는 활성이 확인되지 않았다.
3. 미생물의 동정
선발된 미생물인 SCAT002의 동정을 위해, Bergey's Manual of Determinative bacteriology의 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다.
동정을 실시하기 위해 하기 표 3의 프라이머를 사용하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 염기서열을 비교 분석하였으며, MEGA6 프로그램을 사용하여 계통학적 위치를 확인하였다.
그 결과로, SCAT002의 염기서열 및 계통학적 위치는 도 3 및 도 4와 같이 나타났다.
SCAT002 미생물은 16S rRNA 유전자 DNA서열 분석에서 바실러스 속(Bacillus)의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 미생물로서 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)와 높은 유사도를 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 도 5와 같이 배양하여 분석한 결과, SCAT002 미생물은 그람양성균으로, 호기성, 운동성, 포자를 형성하는 간균이며, TSA 배지에서 아이보리색(상아색)을 띄는 것을 확인하였다.
이에 따라, SCAT002 미생물을 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002 미생물로 명명하였다.
4. 미생물 유기용매추출물의 항균활성
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002 미생물의 클로로포롬 추출물(유기용매 추출물)에 따른 항균활성을 확인하기 위하여, TSB배지에 SCAT002를 접종 한 후 진탕배양기(140 rpm)에서 30℃에서 5일간 배양하고, 원심분리(6,000 rpm, 15 min)하여 균체와 배양여액으로 분리하였다.
배양여액을 pH2로 조정 후 Ethylacetate, Butanol 및 Chloroform을 가하여 물 층과 유기용매 층으로 분획하였다.
분리된 유기용매 층을 회수하여 감압 농축기(Buchi, Switzerland)에서 50℃로 각각 감압 농축하고 Metanol을 이용하여 회수 하였다.
미리 멸균하여 준비한 PDA배지 중앙에 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum autatum)을 각각 접종하고 Paper disc를 이용하여 회수한 유기용매 획분을 10 mg/disc 농도로 처리하였다. 처리 후 25℃에서 7일간 배양하며 균사의 생육 저지활성을 확인하였다.
SCAT002의 클로로포름 추출물 처리에 따른 항균활성을 조사한 결과, SCAT002 미생물은 에틸아세테이트(Ethylacetate) 추출물에서 항균활성을 나타났다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002를 Paper disc 법을 통해 클로로포름 추출물의 항균활성을 조사한 결과 클로로포름 추출물 10 mg을 처리하여 대치배양하였을 때 각 식물 병원균의 증식을 억제하는 사진이다.
여기서, SCAT002 미생물은 Colletotrichum gloeosporioides (고추탄저병)에 대해 26.5 %, Colletotrichum autatum (고추탄저병)에 대해 24.5 %의 억제율을 보였다.
이에 따라, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002 미생물은 클로로포롬 추출물 속에 항균활성 물질이 포함되어 있을 것으로 사료된다.
5. 균주의 특성 조사
1) 효소활성
효소활성을 평가하기 위하여, 젤라티나아제(Gelatinase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성을 하기와 같은 방법을 통해 조사하였다.
Gelatinase, protease활성은 gelatin agar 배지(1 % gelatin, 0.05 % KH2PO4, 0.05 % K2HPO4, 0.1 % NaCl, 0.15 % NH4NO3, 0.04 % MgSO4·7H2O, 0.02 % KCl, 0.02 % yeast extract, 20 % agar 및 pH 7.0) skim milk agar 배지 (10 % skim milk, 20 % agar) 에서 Y1균주를 획선 또는 평판도말하여 30℃에서 3일 간 배양하여 투명환 형성 유무로 생성을 판단하였다. Celluase 활성은 Carboxymethylcellulose (CMC) Sodium salt 0.2 %, NaNO3 0.2 %, K2HPO4 0.1 %, MgSO4 0.05 %, KCl 0.05 %, Peptone 0.02 %, Agar 1.8% 로 하여 배지를 조제한 후 미생물 현탁액을 접종하여 30에서 24시간 배양한 다음 요오드 용액(KI 0.6 % 및 Iodine 0.3 %)을 처리해 5분 후 관찰한다. 미생물 콜로니 주변에 투명환이 생기면 활성이 있는 것으로 판단하였다.
lipase는 Tween-80이 첨가된 lipid agar 배지 (2.5 % Luria-bertani, 1 % Tween-80, 20 % agar)에 획선을 그어 30℃에서 3일 간 배양하여 콜로니 (colony) 형성 유무로 판단하였다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 Gelatinase, Protease, Cellulase 및 Lipase 효소활성 측정 결과 사진이다.
그 결과, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002 미생물은 젤라티나아제(Gelatinase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성이 나타난 것을 확인할 수 있었다.
2) 질소 고정
바실러스 벨레젠시스 SCAT002의 질소 고정능력을 확인하기 위하여 Kanimozhi와 Panneerselvam(2010)의 질소고정능력 측정법을 응용한 방법을 사용하였다. 시험관에 KOH와 NaOH로 pH를 6.6-7.0으로 조정한 NFB배지(Malicacid 5.0 g, K2HPO4 0.6 g, K2HPO4 0.4 g, MnSO4 0.01 g, MgSO4 0.05 g, NaCl 0.02 g, Na2MoO4 0.002 g, Bromothymol blue (0.5% in alcohol) 2 ml, 증류수 1000 ml, Agar 1.75 g)를 시험관에 5 ml씩 분주하고 고압 멸균하여 식힌 후 전 배양한 한 다음 미생물을 loop로 접종하여 배양하면서 변색여부를 관찰하였다. 접종 주변에 하얀 밴드가 형성되거나 색깔이 파란색으로 변할 경우 양성으로 판단하였다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002의 질소 고정 측정 결과 사진이다.
그 결과, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002 미생물은 배지가 연녹색에서 연청녹색으로 변하는 것으로 나타나 질소 고정능력이 있는 것을 확인할 수 있었다.
3) 인가용화 활성
바실러스 벨레젠시스 SCAT002의 인산가용화 능력을 확인하기 위하여 불용성인산(Tricalcium phosphate)를 포함하는 Pikovaskaya's medium(Zaidi 등, 2006) (Glucose 10.0 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCl 0.2 g, MgSO4 0.1 g, MnSO4 0.002 g, FeSO4 0.002 g. Yeast extract 0.5 g, Tricalcium phosphate (Calcium phosphate tribasic, Ca3(PO4)2) 5.0 g, 증류수 1000 ml, Agar 20 g)을 샤레에 10 ml씩 분주하여 굳힌 후 샤레 정 중앙에 paper disc를 치상하고 그 위에 미생물 현탁액을 40 μl씩 접종하였다. 30℃에서 14일간 배양한 후 균총 주변에 투명환(Clear zone, halo zone) 형성 유무로 인가용화 활성을 판정하였다.
그 결과, 도 9와 같이 SCAT002 접종 부위 주변이 투명환이 형성된 것으로 보아 바실러스 벨레젠시스 SCAT002는 불용성인산을 가용화 하는 것으로 확인할 수 있었다.
이에 따라, 바실러스 벨레젠시스 SCAT002는 인산비료가 토양에 살포되면서 알루미늄, 칼슘하고 결합하여 작물이 흡수를 못하는 상태가 되는 문제가 발생할 때, 인산염 분해능을 통해 이를 분해시켜줌으로써 작물의 인산 흡수율을 향상시켜줄 수 있을 것으로 사료된다.
또한, 본 발명에서는 바실러스 벨레젠시스 SCAT002의 배양배지인 것을 특징으로 하는 작물 생육 시기별 맞춤형 미생물 배양배지를 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, 미생물 배양배지는 바실러스 벨레젠시스 SCAT002를 배양하는 배지로서, 특히 바실러스균을 배양하는데 활용하여, 작물 생육 시기에 맞는 미생물 비료로 제공될 수 있다.
이때, 미생물 배양배지는 포도당, 효모추출물, 글루타민산, 요소, 인산칼륨 및 황산칼륨 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 모두 포함하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 미생물 배양배지는 이외에도 통상적으로 배양배지 재료로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이러한 미생물 배양배지는 작물이 균형적인 성장을 할 수 있도록 작물의 생육 시기에 따라 구분하여 생장기용 배양배지 및 결실기용 배양배지를 포함할 수 있다.
이때, 생장기는 초기, 중기 및 말기로 이루어진 작물의 생육에 있어서 생육 초기부터 중기까지 작물의 급격한 생장이 이루어지는 시기를 의미할 수 있으며, 결실기는 작물의 생육 중기부터 말기까지 작물의 결실이 이루어지는 시기를 의미할 수 있다.
이때, 작물의 생장기 및 결실기의 시기는 작물 종류에 따라 달라질 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
생장기용 배양배지는 포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 20 내지 40중량부, 인산칼륨 5 내지 12중량부 및 황산칼륨 0.5 내지 5중량부 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
가장 바람직한 생장기용 배양배지는 포도당 7 내지 9중량부, 효모추출물 6 내지 8중량부, 글루타민산 0.8 내지 1.2중량부, 요소 28 내지 32중량부, 인산칼륨 7 내지 9중량부 및 황산칼륨 1.5 내지 2.5중량부를 포함할 수 있다.
결실기용 배양배지는 포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 4 내지 15중량부, 인산칼륨 8 내지 20중량부 및 황산칼륨 1 내지 10중량부 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
가장 바람직한 결실기용 배양배지는 포도당 7 내지 9중량부, 효모추출물 6 내지 8중량부, 글루타민산 0.8 내지 1.2중량부, 요소 9 내지 11중량부, 인산칼륨 9 내지 11중량부 및 황산칼륨 3.5 내지 4.5중량부를 포함할 수 있다.
이와 같이, 작물의 생장기 및 결실기에 필요한 영양소가 서로 다름에 따라 미생물 배지에 함유된 요소, 인산칼륨 및 황산칼륨의 양을 각각의 생육 시기에 맞춰 서로 다르게 조절하여, 보다 작물의 생장을 촉진하는 효과가 있다.
6. 작물 생육 시기별 활용을 위한 미생물 최적 배지 조건 조사
작물 생육 시기별 활용을 위한 미생물 배양용 기본 배지 조성은 표 4 같이 하였다. 사용 균주는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis SCAT002)를 이용하였고, 표 4과 같이 조성을 만든 후 미생물을 접종하여 날짜별 미생물 생균수를 조사하였다. 조사 방법은 작물생육 시기별로 조성한 액체배지에 TSB를 이용하여 배양한 SCAT002 배양액 100 ㎕를 각각의 배지에 접종 후 30℃, 140 rpm에서 3일간 배양하며 생균수를 TSA배지를 이용하여 조사하였다.
그 결과, 작물생육 시기별 맞춤형 미생물 배지에 배양 후 생균수는 배양 1일째 생장기용 배지(FCG)가 1.0 x 108, 결실기용 배지(FCP) 3.0 x 107, 상업용 배지(C2)가 2.2 x 106으로 조사되었다. 배양 2일째는 C2, FCG 및 FCP배지 모두 107 이상으로 나타났으며, 3일째는 C2가 2.2 x 108, FCP 3.2 x 107 및 FCG 4.3 x 106으로 조사되었다.
이에 따라, 본 발명에 따른 FCG 및 FCP는 배양 후 1일 차 C2보다 생균수가 높은 것을 확인할 수 있었고, 배양기간이 길수록 생균수가 낮아지는 경향을 확인할 수 있었다.
7. 작물 생육 시기별 활용을 위한 미생물 배양배지의 특성 조사
작물 생육 시기별로 조성한 미생물 배양배지에 TSB를 이용하여 배양한 SCAT002 100 ㎕ 각각의 배지에 접종 후 30℃ 140 rpm에서 4일간 배양하며 날짜별로 10 ml씩 시료를 채취하여 pH 변화양상을 조사하였다. 조사 방법은 pH 미터(Thermo scientific, USA) 및 EC 미터 (Lab 945, SI analytics, Germany)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 미생물 배양액의 pH는 전체적으로 배양 1일차에 감소하다가 배양 2일차부터 4일차까지 꾸준히 상승하였다. FCP(결실기용) 배지는 pH6에서 배양 1일차에 pH5로 떨어졌으며, 다시 2일차에 pH6 수준으로 상승하였다. FCG 배지의 경우, pH7에서 6으로 떨어졌다가 배양 3일차에 다시 pH7로 상승하였다. 이런 pH 변화는 배양 중에 미생물이 생산하는 유기산 등으로 인해 pH 변화가 나타나는 것으로 사료된다. 또한 FCP 및 FCG 배양배지의 EC는 전체적으로 배양 1일차부터 4일차까지 약간 증가하는 추세를 보였다. 배양 4일차까지 FCG는 0.0148 dS/m에서 0.0153 dS/m로, FCF는 0.0157 dS/m에서 0.0171 dS/m로 상승하였다.
8. 작물 생육 시기별 활용을 위한 미생물 배양배지의 IAA 측정
작물 생장 호르몬인 옥신(Indol acetic acid, IAA) 측정은 tryptophan을 첨가하지 않고 배지를 조제한 후 SCAT002를 접종하여 배양한 다음 배양액 3 ml를 취하여 E-tube에 옮겨 15,000 rpm으로 10분간 상온에서 원심분리하였다. 원심분리한 상등액 1 ml를 취하여 2 ml의 Fe-H2SO4 solution(1 ml of 0.5 M FeCl3·6H2O in 75ml of 6.13 M H2SO4)과 혼합 후 암실에 45분간 정치한 다음 VarioskanTM LUX multimode microplate reader(Thermo scientific, USA)를 이용하여 530 nm에서 흡광도를 확인하였다. IAA(Sigma, USA) 0~30 ㎍/ml 범위를 사용해 얻은 표준곡선을 이용하여 정량화 하였다.
그 결과, 도 10과 같이 FCG(생장기용)에서 4일차가 12.34 ㎍/ml로 가장 높게 나타났다. 다음으로 3일차 10.97 ㎍/ml, 2일차 9.89 ㎍/ml, 1일차 1.26 ㎍/ml으로 조사되었다. FCP(결실기용)에서는 2일차 12.81 ㎍/ml로 가장 높게 나타났다. 다음으로 4일차 9.91 ㎍/ml, 3일차 9.25 ㎍/ml, 1일차 3.97 ㎍/ml으로 조사되었다. FMS(비대기용)은 3일차 9.62 ㎍/ml로 가장 높게 나타났다. 다음으로 2일차 9.55 ㎍/ml, 4일차 8.34 ㎍/ml, 1일차 1.71 ㎍/ml으로 조사되었다. 상업용 배지에서는 4일차 2.44 ㎍/ml로 가장 높게 나타났다. 다음으로 2일차 1.78 ㎍/ml, 3일차 0.40 ㎍/ml, 1일차 0.15 ㎍/ml으로 조사되었다. 결과적으로 미생물 배양배지인 생장기용 및 결실기용으로 제조된 배지는 3일차를 제외하고는 트립토판을 넣지 않아도 상업용 배지 보다 IAA생산량이 더 많이 나타났다. 이는 작물 정식 초기에 뿌리 발육과 생장에 많은 도움을 줄 것으로 사료된다.
9. 작물 생육 시기별 활용을 위한 미생물 배양배지의 작물 생육 증진 특성 조사
1) 고추
포트(pot) 재배 실험을 통해 본 발명에 따른 미생물 배양배지의 작물 생육 증진 효과를 측정하였다. 고추는 4주된 유묘 홍보석 품종을 구입하여 포트(20 cm x 30 cm)에 정식 한 후 실험을 진행하였다. 작물 생장기용 및 결실기용 배양배지를 조성한 후 각각의 배지에 SCAT002를 접종하고 3일(30℃, 140 rpm)간 배양하여 200배 희석하였다. 처리구는 무처리(W), 미생물 배양배지(T1) 200배 희석액, 상업용 배지(C2) 200배 희석액으로 하였고, 처리구별로 일주일 간격으로 주당 500 ml씩 3회 처리하였다. 미생물 배양배지는 1회차 생장기용(FCG) 처리, 2회차 결실기용(FCP) 처리, 3회차는 생장기용(FCG)을 처리하였다. 최종 처리 1주 및 2주 뒤 지상부 길이 및 무게, 줄기 두께, 수확량, 고추 영양성분 분석을 실시하였다.
건조된 고추의 영양성분 분석은 열풍건조기로 80℃에서 건조하여 40 mesh로 분쇄한 시료 0.5 g을 습식분해액(HClO4:H2SO4 = 2:1) 10 ml로 분해시킨 여액을 희석하여 사용하였다. 총 질소는 Kjeldahl법, 인산은 Vanadomolybdate법으로 발색시켜 Spectrometer를 이용하여 분석하였고, K, Mg, Ca는 ICP(Inductively Coupled Plasma, ICP-MS)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 표 5와 같이 FCG 및 FCP 200배 희석 처리에 따른 고추 생육 증진 특성 조사결과 초장, 줄기 두께, 생체중 및 수확량에서 FCG 및 FCP 처리구가 W 처리구 및 C2 처리구 보다 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
또한, 고추 영양 성분 조사 결과 표 6과 같이 질소 함량의 경우, FCG 및 FCP 200배 희석 처리구가가 2.17 %로, W처리구 2.08 % 및 C2처리구 2.11 %보다 높게 나타났으며, 나머지 성분 함량은 같거나 낮게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로 본 발명에 따른 미생물 배양배지가 상업용 배지 보다 초장 생육이 우수한 것으로 확인되었다.
2) 상추
상추씨앗(적치마, 아시아종묘)을 105공 트레이에 상토(한아름 원예용 상토, 신성미네랄)를 이용하여 배지를 만든 다음 셀 당 1개씩 파종하여 식물생장상에서 재배하여 본 실험에 사용하였다. 5 ~ 6엽의 상추 유묘를 포트(10 cm x 15 cm)에 옮겨 심은 후 1일 1회 관수 하였고, 2주간에 걸쳐 식물생장상(JSPC-950C, JSR, JAPAN)을 이용하여 실험을 수행하였다. 결실기용 배지(FCP)에 SCAT002를 접종하고 2일(30℃, 140 rpm) 배양하여 10배(FCP 10)와 100배(FCP 100) 희석한 후 일주일 간격으로 주당 50 ml씩 2회 처리하였다. 대조구로 무처리(W), 상업용 배지(C2) 100배 희석한 배양액을 주당 50 ml씩 동일하게 처리하였다. 생육 조사는 2회 처리 후 지상부의 엽수, 엽장, 엽폭, 생체중을 측정하였다. 엽수는 모든 잎수, 엽장과 엽폭은 가장 큰 잎의 길이와 폭을 측정하였다. 생체중은 지하부를 제외하고, 지상부의 무게를 전자저울을 이용하여 측정하였다. 측정항목은 6반복하여 측정하였다.
그 결과, 미생물 처리 결과 표 7에서 보는 바와 같이 FCP 10배 처리구가 생체중 면에서 생육 증진 효과가 가장 높았다. 생육조사 결과, 생체중이 12.12 g으로 FCP 10배 처리구가 가장 높았으며, 다음으로 C2가 9 g, FCP 100배 처리구가 6.48 g 순으로 높았다. 잎수, 엽장, 엽폭을 측정하였을 때 처리구간의 차이가 많이 보이지 않았다. 결과적으로 상추 재배 시 FCP 배지를 10배 희석하여 유묘기 때에 2회 처리하는 것이 초기 상추 생육에 좋을 것으로 사료된다.
이상에서 설명하는 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경하여 구현할 수 있으며, 이러한 구현은 앞서 설명한 실시예의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가라면 쉽게 구현할 수 있는 것이다.
Claims (7)
- 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P)인 식물 생육 증진 및 식물 병원균의 생육 억제 기능을 갖는 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 식물 병원균은,
검은무늬병(KACC 40019), 잿빛곰팡이병(KACC 40574), 고추탄저병(KACC 40003, KACC 40489), 도열병(KACC 40439), 인삼뿌리썩음병(KACC 41077), 시들음병(KACC 44452), 역병(KACC 40483), 모잘록병(KACC 40125), 인삼균핵병(KACC 45152), 상추균핵병(KACC 40457), 감귤점무늬병(KACC 45782) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물.
- 작물 생육 증진 및 작물 병원균의 생육 억제 기능을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SCAT002(수탁번호: KACC 92387P)를 포함하는 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지.
- 제3항에 있어서,
상기 미생물 배양배지는,
포도당, 효모추출물, 글루타민산, 요소, 인산칼륨 및 황산칼륨 중 하나 이상을 더 포함하는 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지.
- 삭제
- 제3항에 있어서,
상기 미생물 배양배지는,
작물의 생육 시기에 따라 구분되어 생장기용 배양배지로 마련되며,
상기 생장기용 배양배지는,
포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 20 내지 40중량부, 인산칼륨 5 내지 12중량부 및 황산칼륨 0.5 내지 5중량부를 더 포함하는 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지.
- 제3항에 있어서,
상기 미생물 배양배지는,
작물의 생육 시기에 따라 구분되어 결실기용 배양배지로 마련되며,
상기 결실기용 배양배지는,
포도당 6 내지 12중량부, 효모추출물 4 내지 10중량부, 글루타민산 0.2 내지 2중량부, 요소 4 내지 15중량부, 인산칼륨 8 내지 20중량부 및 황산칼륨 1 내지 10중량부를 더 포함하는 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지.
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|---|---|---|---|
| KR1020210174990A KR102508900B1 (ko) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지 |
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| KR1020210174990A KR102508900B1 (ko) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지 |
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| KR1020210174990A KR102508900B1 (ko) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117165498A (zh) * | 2023-11-03 | 2023-12-05 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一株贝莱斯芽胞杆菌及其用途 |
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| KR102201835B1 (ko) * | 2019-12-06 | 2021-01-12 | 전라북도 순창군(농업기술센터장) | 식물 병원균에 대한 방제 효과를 가지는 버크홀데리아 테리토리 scat001 및 이를 포함하는 식물병 방제제 |
-
2021
- 2021-12-08 KR KR1020210174990A patent/KR102508900B1/ko active IP Right Grant
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