KR20110124516A

KR20110124516A - 유산균 배양액 추출물을 포함하는 염증관련질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110124516A
Application number: KR1020100043934A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 신태섭; 고용송
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2011-11-17

Abstract

본 발명은 유산균 배양액에서 추출한 성분을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 염증질환, 혈관 내 혈전 형성 및/또는 항암 치료 효과를 가진다. 상기 유산균 배양액 추출물은 3kDa 미만의 열에 저항하는 성분을 포함할 수 있다.

Description

유산균 배양액 추출물을 포함하는 염증관련질환 치료용 조성물{Composition for treating inflammation-related diseases comprising extracts from culture media of lactic acid bacteria}

본 발명은 염증질환, 혈관 내 혈전 형성 및/또는 암에 대한 치료 효과를 가지는 유산균 배양액 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

만성 염증은 일반적으로 면역기능 이상에 의해 발생한다. 면역기능 이상은 그 종류에 따라 호산구성 염증을 특징으로 하는 Th2-type의 염증, 호중구성 염증을 특징으로 하는 Th17-type 혹은 Th1-type 염증으로 나눌 수 있다 [J Allergy Clin Immunol.2010;125:S33-40].

Naive T cell의 분화과정에서 Th17 면역반응의 발생에는 병원성 세균 혹은 세균에서 유래하는 독소에 의해 생성되는 IL(Interleukin)-6가 중요하다고 알려져 있으며, 상기 IL(Interleukin)-6 는 STAT3 signaling pathway를 통해 Th17 세포로의 분화를 유도한다 [Cytokine.2009;47(3):149-56].

또한 혈관 내 혈전 형성과 관련하여 IL-6 이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 급성관상동맥증후군 (acute coronary syndrome), 뇌졸증 (stroke) 등은 혈관 내 혈전 (thrombosis)이 형성되어 심혈관 및 뇌혈관 등이 막혀서 발생하는 질환이다.

이에 더하여, 암 발생에 있어서 염증반응이 중요하다는 사실은 이전부터 당업계에서 제기되어 왔으며, 염증에 따른 조직 손상과 이의 치유과정의 잘못으로 암이 발생한다는 제안이 있다. 최근 STAT3 signaling pathway가 암발생에 관련이 있고, 대장암인 경우에는 Th17-type 염증이 중요하다고 보고된 바 있다 [Cell. 2010;140(6):883-99].

한편, 유산균은 포도당 혹은 유당과 같은 당류를 분해하여 유산을 만드는 박테리아로, 단백질을 분해하지만 부패시키지 않아 인체에 유익한 작용을 하는 세균으로 알려져 있다.

유산균의 유익한 작용기전으로 당류를 에너지원으로 이용하여 이를 발효시켜 다량의 유산을 생성하고, 이로 인해 장관내 pH를 낮추어 장내 유해 세균의 서식을 억제시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 유산균의 염증반응에 관련된 작용에 대하여 알려진 바는 없다.

본 발명자들은, 유산균이 염증반응의 중요한 매개체인 IL-6의 생성을 억제시키는 활성을 가짐을 발견하고 이에 기초하여 유산균 배양액 추출물을 이용하여 염증질환, 혈관 내 혈전 형성 및 암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고자 한다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 수단으로, 본 발명은 유산균 배양액 추출물을 함유하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 염증질환, 혈관 내 혈전형성, 및 암을 치료 또는 예방하는 용도를 가진다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액은 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leukonostoc), 페디오코커스 (Pdiococcus), 또는 비피도박테리아 (Bifidobacteria)를 배양한 배지에서 추출한 물질 및 이들의 조합에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 (Lactobacillus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 MRS broth 배지를 사용하여 배양한 배양액에서 추출한 물질인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물은 유산균 배양액에서 유산균을 제거한 배양액 상층액을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물은 3kDa 미만의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 염증질환 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양액 추출물 투여는 구강투여, 비강 투여, 기도 투여, 피부투여, 혈관투여복강내 투여 및 이들의 조합에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 혈전형성질환 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 유산균 배양액 추출물은 염증성 반응의 중요한 매개체인 IL-6 분비를 억제하는 작용을 가진다. 상기 IL-6는 STAT3 signaling pathway 뿐만 아니라 Th17-type의 염증반응을 통해 암을 발생시키는 것에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 또한 혈관 내 혈전의 생성에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 유산균 배양액 추출물(특히 3kDa 미만의 열에 저항하는 성분)을 사용하여 염증질환, 혈전형성, 및 암을 치료 및/또는 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 마우스 대장암 세포주인 colon 26을 배양한 후 자발적, 시간 의존적인 염증성 매개체 IL-6의 발현 양상을 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 2는 마우스 대장암 세포주인 colon 26 세포에서 자발적, 시간 의존적으로 발현하는 염증성 매개체 IL-6의 발현이 NF-kB signaling에 의한 것임을 증명하기 위해 NF-kB의 내재적 inhibitor인 IkB의 degradation과 IkB degradation의 전조인 phosphor-IkB를 western blotting방법으로 확인한 결과이다.
도 3은 마우스 대장암 세포주인 colon 26세포에서 자발적, 시간 의존적으로 발현하는 염증성 매개체인 IL-6의 발현이 NF-kB signaling에 의존적임을 확인하기 위하여 NF-kB inhibitor인 BAY 11-7082와 NF-kB의 상위 분자인 PI3K의 inhibitor인 LY 294002을 이용하여 IL-6의 발현 정도를 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 4는 colon 26세포에 농도 의존적으로 Lactobacillus (LR)를 처리한 뒤 IL-6의 발현을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 5는 Lactobacillus 에 의한 염증성 매개체 IL-6의 발현억제가 세포의 괴사에 의한 것이 아님을 확인하기 위해 살아있는 세포를 염색하는 Cell Tracker dye를 이용하여 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 6은 colon 26 세포에서 자발적으로 발현하는 IL-6의 발현 억제에 대한 활성이 Lactobacillus 에 의한 특이적인 활성임을 보여주는 것으로, 같은 수의 Lactobacillus 와 bacillus를 주입하여 배양한 colon 26 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 확인한 결과이다.
도 7은 염증성 대장 질환 동물모델에서 Lactobacillus의 치료효과를 확인하기 위한 실험 protocol이다.
도 8은 염증성 대장 질환의 일반적인 증상인 대장의 길이와 개체의 체중을 측정하여 상기 질환에 대한 Lactobacillus 의 치료효과를 나타낸 결과이다.
도 9는 Lactobacillus 배양액을 분자의 크기에 따라 분리하는 protocol을 나타낸 것이다.
도 10은 도 9의 protocol 에 따라 분리한 수용성 분획들의 IL-6 발현억제 활성을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 11은 분리된 3 kDa 미만의 수용성 성분의 IL-6 발현억제 활성이 농도 의존적으로 발생하는지를 확인한 결과이다.
도 12는 분리된 3 kDa 미만의 수용성 성분을 100 ?에서 20 분간 가열한 뒤 colon 26세포에 처리하여 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 유산균이 염증성 사이토카인인 IL-6 의 분비를 억제시키는 활성을 가짐을 발견하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 유산균 배양액 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 염증질환, 암, 및 혈전형성관련질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

IL-6 는 염증반응 중 호중구성 염증을 특징으로 하는 Th17-type 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로 IL-6 는 STAT3 signaling pathway를 통해 Th17 세포로의 분화를 유도한다. 따라서 IL-6 분비를 억제시키는 활성을 가지는 본 발명의 유산균 배양액 추출물은 염증질환의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다. 상기 염증질환의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들면 염증성 대장 질환의 치료에 사용될 수 있다.

한편, 염증반응과 암과의 관련성에 있어서, 염증에 따른 조직 손상과 이의 치유과정의 잘못으로 암이 발생한다는 제안이 있으며, 또한 STAT3 signaling pathway가 암발생에 관련이 있고, 대장암인 경우에는 Th17-type 염증이 중요하다고 보고되어 있다. 따라서 STAT3 signaling pathway 뿐만 아니라 Th17-type의 염증반응에 관여하는 IL-6 의 분비를 억제하는 본 발명의 유산균 배양액 추출물은 항암치료 및 예방을 위해 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 상기 치료가능한 암의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들면 대장암의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

또한 혈관 내 혈전의 생성에 있어서의 IL-6의 중요성은 이미 알려져 있으므로, IL-6 의 분비를 억제하는 본 발명의 유산균 배양액 추출물은 혈전형성관련 질환의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 상기 혈전형성관련 질환에는 급성관상동맥증후군, 뇌졸증 등이 포함될 수 있다.

이하에서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및/또는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 암세포에서의 IL-6 분비를 평가하는 실험을 실시한 결과, 암 세포에 아무런 처리를 하지 않은 상태에서, 시간의존적으로 IL-6의 분비가 증가하는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 암세포로 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26을 사용하였으나, 사용 가능한 암세포의 종류에는 제한이 없다.

상기 암세포에서의 IL-6의 자발적 분비증가의 기전을 살펴본 결과, IL-6의 발현은 NF-kB pathway(PI3K 및 NF-kB)에 의존적인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, NF-kB signaling inhibitor 인 BAY 11-7082 및 NF-kB 상위 분자인 PI3K 의 inhibitor 인 LY 294002 처리시 대장암 세포에서 IL-6의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

본 발명자들은 암세포의 염증관련 사이트카인 분비에 대한 유산균의 효과를 살펴보았다. 이 때 사용되는 암세포 및 유산균의 종류에는 제한이 없다. 예를 들면 대장암 세포주인 colon 26을 사용할 수 있다. 또한 사용 가능한 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leukonostoc), 페디오코커스 (Pdiococcus), 또는 비피도박테리아 (Bifidobacteria) 에서 선택될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 유산균으로 Lactobacillus rhamnosus GG 를 사용할 수 있다.

본 발명자들은 대장암 세포에 Lactobacillus rhamnosus 를 처리한 그룹에서 자발적인 IL-6의 발현이 농도의존적으로 감소함을 확인하였으며, 이에 더하여 상기 IL-6의 발현 감소가 세포괴사에 의한 것이 아님을 확인하였다.

또한 본 발명자들은 암세포에서의 IL-6의 발현에 대한 유산균의 억제효과가 유산균만의 특이적인 활성에 기인한 것임을 알아보기 위하여, 동일한 조건으로 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26 에 그람양성균인 bacillus subtilis 를 처리하였다. 그 결과, bacillus subtilis 는 암세포의 IL-6의 발현을 전혀 억제하지 아니하는 것으로 확인되었다.

또한 본 발명자들은 유산균 배양액 중 활성성분을 분리 및 동정한 결과, 유산균 배양액 추출물 중 3kDa 미만의 수용성, 열에 저항하는 성분이 현저한 IL-6 분비억제효과를 가짐을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Colon cancer cell 에서의 염증성 사이토카인( IL -6) 분비 분석

암세포에서 염증관련 사이토카인의 분비를 평가하는 실험을 수행하였다. 본 실험에서는 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26에서 염증성 매개체인 IL-6의 발현 정도를 평가하였다.

구체적으로, Colon 26 세포를 2 x 10⁵이 되도록 24 웰 플레이트에 분주하고 12시간 동안 배양하였다. 12시간 후 PBS(phosphate buffer saline)로 세척 후 MEM(Minimum Essential Media) alpha 배지 500 ㎕를 분주한 뒤 시간에 맞춰 세포배양액을 거두었다. 각각의 세포 배양액에서 염증성 매개체인 IL-6의 발현 양을 확인하기 위하여 엘라이자법(ELISA)을 수행하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대장암 세포에 대한 어떠한아무런 자극이 없는 상태에서 IL-6의 발현이 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. Colon cancer cell 에서의 IL -6 발현 기작 평가

본 발명자들은 상기 실시예 1의 결과로부터 아무런 자극이 없는 상태에서 colon 26 세포에서의 시간 의존적으로 증가하는 IL-6의 발현이 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하고 그 발현 기작을 밝히는 실험을 수행하였다.

이와 관련하여, NF-kB 의존적인 IL-6의 발현을 평가하기 위해서 NF-kB의 활성을 억제하는 작용을 하는 IkB에 대하여 그 degradation의 정도 및 IkB의 proteosomal degradation의 전조인 IkB의 인산화 정도를 western blotting으로 확인평가하였다.

구체적으로, 60 mm 배양 접시에 5 x 10⁵개 가 되도록 세포를 분주하고 12시간 후에 시간 의존적으로 세포를 수확하여 세포의 단백질을 분리하였다. 시료당 상기 단백질 30㎍을 로딩하여 IkB, phospo-IkB의 발현 정도를 확인평가하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이 때 β-actin 을 대조군으로 사용하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, IL-6의 발현이 증가하는 12시간부터 NF-kB의 내재적 inhibitor인 IkB가 degradation이 되는 것을 확인하였고, 6시간 및 9시간 때에 IkB proteosomal degradation의 전조인 IkB의 phosphorylation이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

이에 더하여, colon 26 세포에서 자발적으로 발현하는 IL-6의 발현이 실제로 NF-kB pathway에 의존적으로 일어나는지를 확인확인하는 실험을 수행하였다. 이와 관련하여, NF-kB signaling inhibitor인 BAY 11-7082, 및 NF-kB 상위 분자인 PI3K의 inhibitor인 LY 294002를 이용하여 IL-6의 발현 정도를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1의 방법에 따라 세포 분주 12시간 후에 BAY 11-7082 및 LY 294002 를 10nmol의 농도로 처리하고 12시간 후에 세포 배양액에서의 IL-6의 발현 양을 확인하기 위하여 엘라이자법(ELISA)을 수행하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, NF-kB signaling inhibitor인 BAY 11-7082 및 NF-kB 상위 분자인 PI3K의 inhibitor인 LY 294002 처리시 대장암 세포에서 IL-6의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26에서 염증성 매개체인 IL-6의 발현은 NF-kB pathway(PI3K 및 NF-kB)에 의존적임이 명백하다.

실시예 3. Colon cancer cell 의 염증관련 사이토카인 분비에 대한 유산균의 효과

본 발명자들은 염증관련 사이트카인 분비에 대한 유산균의 효과를 평가하기 위해서 하기 실험을 수행하였다. 이와 관련하여 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26의 IL-6 의 발현에 대한 Lactobacillus rhamnosus GG의 효과를 살펴보았다.

구체적으로, 실시예 1의 방법에 따라 Colon 26 세포를 분주한 뒤 12시간 후 Lactobacillus rhamnosus GG를 MEM alpha에 각각 5 x 10⁷, 5 x 10⁸ CFU(colony-forming unit)/ml로 풀어낸 뒤 각각 웰에 500 ㎕를 분주하여 12시간 동안 배양 후 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 ELISA로 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대장암 세포(colon 26)에 5 x 10⁸ CFU/ml Lactobacillus rhamnosus 를 처리한 그룹(LR 5 x 10⁸)에서 자발적인 IL-6의 발현이 현저히 감소(거의 완전히 발현 억제)함을 확인하였다.

이에 더하여, 상기 도4의 결과가 세포괴사에 의한 것이 아니라 유산균에 의한 것임을 확인하는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 방법에 따라 colon26을 Lactobacillus rhamnosus와 같이 12시간 동안 배양 후 세포 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 MEM alpha 500 ㎕를 넣고 셀트랙커 (CellTracker, Invitrogen, NO. C 2925) 용액을 5㎛이 되도록 넣은 후, 30분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, MEM alpha 500 ㎕를 넣고 다시 30분간 배양하였다. 커버 글라스를 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde) 500 ㎕에 넣고 실온에서 10분간 고정한 후, 호스트 염색제 (Hoescht dye, Sigma, No. B2883)를 5㎛이 되도록 넣고 다시 10분간 염색하였다. 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 붙인 후, 공초점 현미경 (confocal microscope) 상에서 관찰하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 유산균(Lactobacillus rhamnosus)에 의해 세포괴사는 일어나지 아니함을 알 수 있다.

상기 결과로부터, 대장암 세포(colon 26)에 5 x 10⁸ CFU/ml Lactobacillus rhamnosus 를 처리한 그룹(LR 5 x 10⁸)에서 자발적인 IL-6의 발현이 현저히 감소(거의 완전히 발현 억제)된 것은 세포괴사에 의한 것이 아닌 유산균의 작용에 의한 것임이 확인되었다.

추가적으로, 본 발명자들은 상기 대장암 세포(colon 26)에서의 IL-6 발현억제가 유산균의 특이적인 활성에 기인한 것임을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이와 관련하여, 그람양성균인 bacillus subtilis를 이용하여 상기 실험을 반복하여 colon 26세포에서의 억제되는 IL-6의 발현을 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 같은 수(5 x 10⁸ CFU)의 Lactobacillus rhamnosus 와 bacillus subtilis를 처리 하였을 때, Lactobacillus rhamnosus GG는 IL-6의 분비를 억제하는 활성을 보였으나, bacillus subtilis는 IL-6의 발현을 억제하지 못하였다.

상기 결과로부터, Lactobacillus rhamnosus 등과 같은 유산균은 대장암 세포에서 염증관련 사이토카인인 IL-6의 발현을 억제시키는 특이적인 활성을 가짐이 명백하다.

실시예 4. 염증성 대장 질환( inflammatory bowel disease , IBD ) 동물모델에서 유산균의 치료효과

본 발명자들은 염증성 대장 질환 동물모델에서 유산균의 치료효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 이와 관련하여 Lactobacillus rhamnosus GG 를 사용하여 그 염증치료효과를 평가하였다.

구체적으로, BALB/c 종의 female 마우스를 이용하여 dextran sodium sulfate (DSS)를 5% 농도로 음용수에 섞어 질병염증성 대장 질환을 유발하는 DSS 모델을 이용하였다.

도 7에 나타낸 프로토콜에 따라 DSS를 이용한 모델을 시작하기 전 실험군은 24시간 간격으로 1 x 10⁹ CFU의 Lactobacillus rhamnosus 를 7일 동안 경구투여 하였다. 그 후에 음성 대조군(negative control, NC)을 제외한 양성 대조군(positive control, PC) 및 실험군의 음용수를 5% DSS가 첨가된 것으로 교체하여 7일간 키웠으며, 그 동안 실험군은 1 x 10⁹CFU의 Lactobacillus rhamnosus를 24시간 간격으로 경구투여 하였다.

7일간의 DSS처리 기간 동안 염증성 대장 질환의 증상인 체중의 감소를 확인하기 위하여 마우스의 몸무게(B.wt)를 매일 오전 10시에 측정하였으며, 마지막 투여 24시간 후에 마우스를 해부하여 염증성 대장 질환의 발생을 표현하는 대장의 길이(colon length)를 측정하여 염증성 대장 질환의 정도를 확인하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, Lactobacillus rhamnosus를 처리한 실험군(Lactobacillus)에서 양성 대조군(PC)에 비해 염증성 대장 질환의 증상인 대장의 길이 (colon length) 감소 및 체중의 감소(B.wt change)가 완화되었음을 확인하였다.

상기 결과로부터, DSS에 의해 유도된 염증성 대장 질환모델에 대하여 유산균(Lactobacillus rhamnosus)이 치료효과가 있음이 명백하다.

실시예 5. 유산균 ( Lactobacillus rhamnosus GG ) 배양액에서 활성성분 분리 및 동정

본 발명자들은 유산균의 항염증효과를 확인한 후 그 활성성분을 분리 및 동정하는 실험을 수행하였다.

(1) Fractionation

도 9에 나타낸 fractionation 방법에 따라, Lactobacillus rhamnosus의 배양액에서 수용성 성분을 분리하기 위해서 MRS broth (GIBCO, Cat.no 288130, 1L당 성분: Proteose Peptone No. 3 10 g, Beef Extract 10 g, Yeast Extract 5 g, Dextrose 20 g, Polysorbate 80 1 g, Ammonium Citrate 2 g, Sodium Acetate 5 g, Magnesium Sulfate 0.1 g, Manganese Sulfate 0.05 g, Dipotassium Phosphate 2 g ) 1L에 Lactobacillus rhamnosus (3.6 x 10¹² CFU/L)를 12시간 동안 배양한 뒤 고속원심분리 (1000 x g, 20min, 4℃) 하여 Lactobacillus rhamnosus를 제외한 상층액을 얻었다. 상기 상층액에 대하여 100kDa 필터 멤브레인을 이용하여 100kDa 이상의 배양액(50 ml) 및 100kDa 미만의 배양액 (950 ml)으로 분리한 다음, 상기 100kDa미만의 배양액 100ml 에 대해 다시 3kDa 필터 멤브레인을 이용해 3kDa이상 100kDa미만의 배양액 (2.5 ml) 및 3kDa미만의 배양액(97.5 ml) 으로 분리하였다.

상기 fractionation 방법에 의해, 결과적으로 100kDa이상, 3kDa이상 100kDa미만, 그리고 3kDa미만의 수용성 성분을 분획하였다.

(2) 유산균 ( Lactobacillus rhamnosus GG ) 배양액 중 수용성 성분의 활성 평가

상기 실시예 5 (1) 의 방법에 따라 분리한 유산균 배양액 중 수용성 성분 분획들의 항염증효과를 평가하는 실험을 수행하였다. 이와 관련하여 마우스 유래 대장암 세포주인 colon 26에 대하여 상기 분획들을 처리시 IL-6 의 발현 정도를 평가하였다.

구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 분자크기에 따라 분리한 각각의 수용성 성분 분획들을 같은 비율로 세포에 처리(50 ㎕/ml)하여 12시간 동안 배양한 후 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 ELISA로 확인하고 그 결과를 도 10에 나타내었다

도 10에 나타난 바와 같이, 3 kDa미만의 수용성 성분분획을 처리한 대장암 세포에서 IL-6의 발현이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다.

이에 더하여, 상기 3 kDa미만의 수용성 성분분획의 IL-6의 발현 억제가 농도 의존적인지를 평가하기 위하여, 실시예 1의 방법에 따라 colon 26에 상기 3 kDa미만의 수용성 성분을 각각 20㎕/ml, 100㎕/ml 씩 처리 하고 12시간 후 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 확인하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 유산균 (Lactobacillus rhamnosus GG) 배양액 중 3 kDa미만의 수용성 성분이 대장암 세포에서의 IL-6의 발현을 농도 의존적으로 억제시킴을 알 수 있다.

(3) 유산균( Lactobacillus rhamnosus GG ) 배양액 중 3 kDa 미만의 수용성 성분 분석

본 발명자들은 상기 3 kDa미만의 수용성 성분이 열에 저항하는 성분인지를 확인하기 위한 실험을 추가적으로 수행하였다.

상기 3 kDa 미만의 수용액 성분을 100℃에서 20분간 가열 한 다음 즉시 4℃에서 5분간 방치한 후, 가열하지 않은 대조군과 함께 실시예 1의 방법에 따라 Colon 26에 처리하여 12시간 동안 배양 한 후 세포 배양액에서 IL-6의 발현을 확인하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포에서의 IL-6의 발현 억제 효과에 있어서, 100℃에서 20분간 가열한 3 kDa 미만의 수용성 성분을 처리한 군과 가열하지 아니한 대조군을 처리한 군이 차이를 나타내지 아니하였다. 상기 결과로부터, IL-6의 발현을 억제하는 활성을 가지는 유산균 배양액 중 3 kDa 미만의 수용성 성분은 열에 저항성이 있는 성분으로 확인되었다.

상기로부터, 본 발명의 유산균 배양액 추출물 (특히 유산균 배양액 추출물 중 3 kDa 미만의 수용성 성분)이 IL-6의 분비를 억제하는 활성을 가짐을 명백히 알 수 있다. 또한 IL-6는 염증반응의 중요한 매개체로서, STAT3 signaling pathway를 통해 Th17 세포로의 분화를 유도함으로써 Th17-type 염증반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명의 유산균 배양액 추출물을 사용하여 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 것이 가능하며, 이에 더하여 STAT3 signaling pathway가 암 발생에 관련이 있고, 대장암인 경우에는 Th17-type 염증이 중요하다고 보고된 바 있으므로, 본 발명의 유산균 배양액 추출물은 항암치료 및/또는 예방에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 혈관 내 혈전 생성에 있어서의 IL-6의 중요성이 이미 알려져 있으므로, 급성동맥증후군, 뇌졸증 등의 혈전형성 관련 질환의 치료 및 예방을 위해 본 발명의 유산균 배양액 추출물을 이용할 수 있을 것이다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면 등은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면 등에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되지 아니한다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims

유산균 배양액 추출물을 함유하는 염증질환 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leukonostoc), 페디오코커스 (Pdiococcus), 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 (Lactobacillus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 MRS broth 배지 성분(Proteose Peptone, Beef Extract, Yeast Extract, Dextrose, Polysorbate 80, Ammonium Citrate, Sodium Acetate, Magnesium Sulfate, Manganese Sulfate, 및 Dipotassium Phosphate)을 함유하는 배지에서 배양한 배양액에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 유산균을 제외한 배양액 상층액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서,
상기 상층액은 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 열에 저항하는 성분은 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
유산균 배양액 추출물을 함유하는 암 치료용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leukonostoc), 페디오코커스 (Pdiococcus), 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 (Lactobacillus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 MRS broth 배지 성분 (Proteose Peptone, Beef Extract, Yeast Extract, Dextrose, Polysorbate 80, Ammonium Citrate, Sodium Acetate, Magnesium Sulfate, Manganese Sulfate, 및 Dipotassium Phosphate)을 함유하는 배지에서 배양한 배양액에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 유산균을 제외한 배양액 상층액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항에 있어서,
상기 상층액은 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제16항에 있어서,
상기 열에 저항하는 성분은 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
유산균 배양액 추출물을 함유하는 혈전형성 질환 치료용 조성물.
제18항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leukonostoc), 페디오코커스 (Pdiococcus), 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 (Lactobacillus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 배양한 배지에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)를 MRS broth 배지 성분 (Proteose Peptone, Beef Extract, Yeast Extract, Dextrose, Polysorbate 80, Ammonium Citrate, Sodium Acetate, Magnesium Sulfate, Manganese Sulfate, 및 Dipotassium Phosphate)을 함유하는 배지에서 배양한 배양액에서 추출한 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 유산균을 제외한 배양액 상층액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제23항에 있어서,
상기 상층액은 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제24항에 있어서,
상기 열에 저항하는 성분은 3kDa 미만 크기의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 염증질환 치료 방법.
제26항에 있어서,
상기 투여는 구강투여, 비강투여, 기도투여, 피부투여 및 혈관투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
염증성 대장 질환 치료방법으로, 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분 함유 유산균 배양액 추출물을 경구 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
제30항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제30항에 있어서,
상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 방법.
유산균 배양액 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 혈전형성 질환 치료 방법.
제33항에 있어서,
상기 유산균 배양액 추출물은 3kDa 미만 크기의 열에 저항하는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.