JP6467583B2 - Ｄｐｐ−４の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または治療用の組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または治療用の医薬組成物に関するものである。また、本発明はＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または改善用の食品組成物に関するものである。

心血管系の石灰化は高血圧、心不全、急性冠状動脈症候群、弁膜疾患及びこれによる様々な合併症を誘発する。また、多数の疫学研究から血管石灰化が独立的に死亡率を増加させると知られている。血管石灰化は正常的な胎生期または骨折後、骨形成プログラムと類似した機転で起こり、老齢、糖尿、慢性腎不全、慢性炎症疾患で活性化される。炎症反応により骨でミネラルの消失が促進されて遊離されたミネラルが非正常的な血管内皮細胞に貪食される。

血管内皮細胞の機能不全は血管石灰化の重要な機転である。ｅＮＯＳは正常的に血管内皮細胞、心内膜心筋細胞、心房細胞、血管平滑筋細胞、氣道内皮細胞などで一定な水準でいつも発現され、酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）を生成して血管緊張度を調節して血管内皮細胞の恒常性を維持する役割をする。ｅＮＯＳの機能不全がある場合に構造と機能が類似したｎＮＯＳ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＮＯＳ）及びｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＮＯＳ）などの同種酵素が補完的に増加し、ｅＮＯＳの役割を対置するが、持続的に正常の血管内皮細胞の機能を維持することには難しいので、粥状硬化を含めた血管の病気的な変化が早期に起きる。ｅＮＯＳ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の心血管系の影響に対する実験動物モデル、すなわち、ｅＮＯＳ遺伝欠乏動物（ｅＮＯＳ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ，ｅＮＯＳ ＫＯ）は高血圧と粥状硬化症が増加し、対照群に比べて、脳卒中及び心筋梗塞症後、損傷範囲が広くて再形成が激しいと知られている。

一方、心血管の石灰化が誘導された動物モデルでＤＰＰ−４の発現が増加されるということが報告されたことがあるが、ＤＰＰ−４の発現と心血管系、特に心臓弁膜の石灰化が関連性があるということ、ＤＰＰ−４の発現及び活性の抑制を通じて心臓弁膜の石灰化を予防または治療することができるということが提示されたことはない。

本発明者は、心血管の石灰化の過程とこの治療薬物を開発するために鋭意努力した結果、ＤＰＰ−４の抑制剤が弁膜、特に心臓弁膜の石灰化を効果的に予防または治療することができることを確認したことによって、本発明を完成するに至った。

本発明はＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または治療用の医薬組成物を提供する。

また、本発明はＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または改善用の食品組成物を提供する。

本発明はＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または治療用の組成物を提供する。

上記の組成物は医薬組成物または食品組成物を含む。

図１はＣＡＶＤ患者で石灰化、繊維化の炎症関連遺伝子の発現プロフィルを示したもので、上流調節は赤、下流調節は緑色で示した。 図２ａはｑＲＴ−ＰＣＲで示したＣＡＶＤ患者と正常人でのｈＤＰＰ−４のｍＲＮＡの発現レベルを示したもので、図２ｂはＤＰＰ−４によって活性化されるケモカインとＤＰＰ−４によって調節される遺伝子の発現プロフィルを示したものであり、図２ｃはマイクロアレイセットでＤＰＰ−４によって調節される遺伝子のｍＲＮＡのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示したものである。 図３はＣＡＶＤ患者及び正常人でＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色、ＤＡＰＩ、ＤＰＰ−４及びＤＡＰＩとＤＰＰ−４のマージによる組織学的の分析結果を示したものである。核はＤＡＰＩ（青色）で染色した。 図４は野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスの大動脈弁膜部位のパラフィン包埋セクションをＡＲとＶＫで染色した結果を示したものである。上記セクションは抗ミュリンＤＰＰ−４でも染色した。 図５は野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣを骨形成培地で培養した後、ＡＬＰ、ＡＲ及びＶＫ染色した結果を示したものである。 図６のａは野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣの培養の培地でｍＤＰＰ−４のレベルをＥＬＩＳＡで確認した結果を示したもので、図６のｂはｍＤＰＰ−４のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示したもので、図６のｃは血漿ｍＤＰＰ−４のレベルをＥＬＩＳＡで測定した結果を示したものである。 図７ａはＤＥＴＡ−ＮＯ２４時間処理後、野生型またはｅＮＯＳマウスのＶＳＭＣのＤＰＰ−４の発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示したもので、図７ｂはＤＥＴＡ−ＮＯ４８時間処理後、野生型またはｅＮＯＳマウスのＶＳＭＣに対してｍＤＰＰ−４の免疫ブロット分析結果を示したものであり、図７ｃは野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣでｍＤＰＰ−４のプロモーター分析を遂行した結果を示したもので、図７ｄは野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣでＮＦ−κＢの活性を確認したもので、図７ｅはＮＦ−κＢの抑制剤が処理された野生型またはｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣの培養の培地でｍＤＰＰ−４の濃度をＥＬＩＳＡで確認した結果を示したものである。 図８はＮＦ−κＢの結合部位の変異を含むｍＤＰＰ−４のプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を含むプロモーターで形質転換されたｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣでＤＥＴＡ−ＮＯ処理後、ｍＤＰＰ−４のプロモーター活性を確認した結果を示したものである。 図９ａ及びｂはｅＮＯＳ−／−マウスでシタグリプチン投与後、骨形成の活性を検出するために、ビスフォスフォネート−コンジュゲートの映像化剤を投与した結果を示したものである。 図１０ａはｅＮＯＳ−／−マウスでシタグリプチン投与後、ｅＮＯＳ−／−マウスの全体（上列）及び大動脈弁膜の部位（下列）をＶＫ染色した結果を示したもので、図１０ｂはＶＫ染色で陽性で示された部位をグラフで示したものである。 図１１はヒト大動脈弁膜細胞（ｈＶＩＣ）で造骨細胞の転移分化がＤＰＰ−４の処理により阻害されることを示したものである。 図１２はＣＡＶＤ患者（ｎ＝４８）と正常人（ｎ＝１１１）の血漿でのｈＤＰＰ−４の濃度を示した結果である。 図１３ａはＣＡＶＤ患者のうち、石灰化が進行された患者（ｎ＝３０）と石灰化のない患者（ｎ＝１８）の血漿ｈＤＰＰ−４の濃度を示したもので、図１３ｂは活性血漿でのｈＤＰＰ−４の濃度を示したものである。 図１４はｅＮＯＳ−／−マウスのＶＳＭＣに様々な種類のＤＰＰ−４の抑制剤を処理した後、ＡＬＰの活性を測定した結果を示したものである。

他の式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、通常的に使用されるものである。

本発明はＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む弁膜石灰化の予防または治療用の組成物及び上記治療用の組成物を利用した弁膜石灰化の治療方法に関するものである。

本発明において、ＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）はＣＤ２６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２６）と命名されたりして、免疫調節、アポプトシス、信号伝達などに関与するタンパク質として知られている。

本発明の組成物でＤＰＰ−４の抑制剤はＤＰＰ−４のヌクレオチドの発現またはＤＰＰ−４のタンパク質の活性を抑制することをすべて含むことができる。ＤＰＰ−４のヌクレオチドの発現を抑制することは、例えば、ＤＰＰ−４のｍＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチド、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などであることができる。

また、ＤＰＰ−４タンパク質の活性を抑制するものは、例えば、ＤＰＰ−４に対する抗体、シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、ビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、デュトグリプチン（ｄｕｔｏｇｌｉｐｔｉｎ）、ジェミグリプチン（ｇｅｍｉｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、アナグリプチン（ａｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、ベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、ディプロチン（Ｄｉｐｒｏｔｉｎ）、またはルペオール（Ｌｕｐｅｏｌ）などであることができる。本発明で上記ＤＰＰ−４に対する抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であることができる。

本発明で弁膜が石灰化された場合、ＤＰＰ−４の発現が増加されて、ＤＰＰ−４の抑制剤を投与の時、その石灰化が顕著に減少するところ、ＤＰＰ−４の抑制剤は弁膜の治療または予防に有用に利用されることができる。

本発明において、弁膜石灰化は弁膜内に細胞外性基質（ｍａｔｒｉｘ）のヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）（リン酸カルシウム）の結晶沈着物（ｃｒｙｓｔａｌ ｄｅｐｏｓｉｔｓ）の形成、成長または沈着を意味する。

石灰化は中膜性石灰化または粥状硬化性石灰化を含む。石灰化された組織を石灰質という。弁膜石灰化は二つの部位から特徴的に起きる。内膜の石灰化は粥状硬化症と連関されて発生する。粥状硬化症は初めには弁膜の内側に脂肪が豊富な大食細胞とＴリンパ球が蓄積されて脂肪層を形成し、つづいて平滑筋細胞が中膜から移動して入ってくる。これらの移動を刺激する化学力動物質は近隣の内皮、活性化された貪食細胞などで生成されるものと考えられている。移動された平滑筋細胞は増殖して、脂肪が蓄積され、細胞外間質を生成する。石灰化は粥状硬化斑の中心部で起きる。中膜性石灰化は粥状硬化症や内幕石灰化とは独立的に発生する。末端動脈で生じた血管中膜石灰化をメンケベルク硬化症（Ｍｕｃｋｅｂｅｒｇ’ｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）と呼ばれたりもして、これは主に老齢の糖尿病患者で多く観察される。発生には平滑筋細胞とエラスチンが連関されていると知られている。

本発明で用語、粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は内膜層に沿って粥腫性プラーク（ａｒｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ ｐｌａｑｕｅｓ）内に発生する血管石灰化を意味する。

本発明で中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、中膜壁石灰化（ｍｅｄｉａｌ ｗａｌｌ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）またはメンケベルク硬化症（Ｍｏｅｎｃｋｅｂｅｒｇ’ｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は中膜壁内にカルシウムの存在により特徴された石灰化を意味する。

また、本発明の石灰化は弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲンの不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、***、糖尿病、炎症疾患または心血管の障害によるものであることができる。上記の腎臓疾患の例としては、糸球体腎臓炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、多発性嚢胞腎、腎盂腎炎、腎結石、腎結核、腎腫瘍などがある。また、炎症疾患の例としては、喘息、アレルギー性及びに非アレルギー性鼻炎、慢性及び急性鼻炎、慢性及び急性胃炎または腸炎、潰瘍性胃炎、急性及び慢性腎臓炎、急性及び慢性肝炎、慢性閉鎖性肺疾患、肺線維症、過敏性大腸症侯群、炎症性痛み、偏頭痛、頭痛、腰痛、繊維筋肉痛、筋膜疾患、ウイルス感染（例えば、Ｃ型感染）、バクテリア感染、カビ感染、やけど、外科的または歯科的手術による傷、プロスタグランジンＥ過多症侯群、アテローム性動脈硬化症、通風、関節炎、リウマチ性関節炎、強直性脊柱炎、ホジキン病、膵臓炎、結膜炎、紅彩炎、鞏膜炎、ブドウ膜炎、皮膚炎、湿疹、または多発性硬化症などがある。また、上記心血管系疾患では心筋障害、原発性心臓停止、虚血性心不全、高血圧、虚血性心臓疾患、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞症、粥状硬化症または不整脈などがある。

本発明では、大動脈弁膜の石灰化（ＣＡＶＤ）で大動脈弁膜の石灰化の進行過程がＤＰＰ−４が連携して関与していることを確認した。ＮＯの供給が欠乏されたマウスでＮＯの欠乏はＤＰＰ−４の発現を増加させる。これは大動脈弁膜で造骨細胞の転移分化を起こして、石灰化を加速化させることである。

ＤＰＰ−４の抑制剤を投与すると、ＶＳＭＣの造骨細胞の転移分化が抑制され、病気の進行を抑制することができ、ＤＰＰ−４がＣＡＶＤの治療において潜在的治療ターゲットになることができるという概念を裏付けている。

本発明の医薬組成物は薬学的に許容される担体を追加で含むことができる。薬学的に許容可能な担体は食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち一つの成分以上を混合して使用することができて、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法でまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を利用して各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができて、これら薬学的に許容される担体、医薬組成物の製剤、これらの製剤を製造する方法の実例は公知された方法に基づく。

また、これらの医薬組成物は、上記記述されたことのように、弁膜の石灰化を治療するために本発明のＤＰＰ−４の抑制剤を有効成分に含む組成物を個体に投与するのに有用である。本発明の組成物が投与される個体から弁膜の石灰化を治療するのに有効な量で提供され、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、***率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様であり、当業者は適切な量を便宜に決定することができる。

上記ＤＰＰ−４の抑制剤の１日投与量は約０．０００１ないし５００ｍｇ／ｋｇ好ましくは０．０１ないし５ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回に分けて投与することが好ましい。

本発明の組成物は目的することによって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内または皮下投与）することができて、好ましくは経口投与である。経口投与のために、カプセル、錠剤、粉末、顆粒または懸濁液で提供されることができる。また、これらの製剤はラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンのような通常的な添加剤を含有することができて、これら製剤に使用される結合剤には結晶性セルロース、セルロース類似体、アカシア、トウモロコシデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムが提供されることもできる。

これらの製剤にはまた第二リン酸カルシウムまたは無水性ナトリウムデンプングリコレートが提供されることもできる。最終的にこれらの製剤には潤滑剤、例えば滑石またはステアリン酸マグネシウムが提供されることができる。

また、本発明の組成物は弁膜石灰化の予防または治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。

本発明の弁膜の石灰化の予防または改善用の食品組成物はその剤型において特別に限定されることではなく、上記組成物の添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含む。

本発明の食品組成物で含まれることができるＤＰＰ−４の抑制剤のほかに追加的に含まれることができる他の成分に特別な制限がなく、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。また、食品補助添加剤を追加に含むことができるが、食品補助添加剤は当業界で通常的に使用される香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定化剤などを含む。上記天然炭水化物の例は、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、スクロースなど；及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。上記の他に様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に天然の果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は独立的にまたは組み合わせて使用することができる。

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることではない。

実施例１：ヒト大動脈弁の石灰化（ＣＡＶＤ）でのＤＰＰ−４の発現確認
ヒト大動脈弁膜の標本は、ソウルアサン病院で大動脈弁膜の置換術を受けた正常患者とひどい石灰化の病変形成の患者から得た。各サンプルの半分は、直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（ライフテクノロジー）に貯蔵して、残り半分のＯＣＴ化合物（さくらＦｉｎｅｔｅｋ社）に固定させた。ヒト由来のサンプルの収集に対する研究プロトコルは、ソウルアサン病院（ソウル、韓国）の臨床試驗審査委員会（ＩＲＢ）の承認を受けて進行した。

ヒトの心臓大動脈弁の石灰化（ＣＡＶＤ）での細胞進行に関与する遺伝子発現のプロファイルをマイクロアレイで確認した。

遺伝子発現のプロファイルは石灰化が起きなかった正常患者と石灰化患者の大動脈弁膜のサンプルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ(R)Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ２．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＳＡ）を使用して遂行した。分位数正規化とデータの分析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＣＯＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用して遂行した。

その結果、図１に示したことのように、石化化、繊維化及び炎症と関連された遺伝子が正常人に比べて、ＣＡＶＤ患者の大動脈弁膜で上流調節されることが確認された。

また、リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を随行して、ＣＡＶＤ患者でのＤＰＰ−４の発現を再確認した。ｑＲＴ−ＰＣＲ方法は、まず、各サンプルの総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して分離して、ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｒ，ＥＵ）を使用してｃＤＮＡを合成した後、光学９６ウェルプレートでＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲグリーン１ｓｔｅｐキットとＡＢＩ ７０００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を遂行して、内部対照群としてＧＡＰＤＨを使用した。

その結果、図２ａに示したことのように、ＤＰＰ−４がＣＡＶＤ患者で高いレベルで発現されることをリアルタイムＰＣＲで確認した。

マイクロアレイ分析を通じて、ＤＰＰ−４の活性が炎症性ケモカインを活性化させて、ＤＰＰ−４によって調節されるダウンストリーム遺伝子とケモカイン遺伝子が大動脈弁膜の石灰化組織で上流調節されることを確認して（図２ｂ）、上記遺伝子の上流調節はリアルタイムＰＣＲを利用したｍＲＮＡ発現を分析して再確認した（図２ｃ）。

ヒト大動脈弁膜のサンプルを４％ホルマリン溶液に２４時間の間固定した後パラフィンで包埋して４μｍ厚さの切片を作製した。パラフィン包埋した大動脈弁及び心臓基底部の切片でカルシウムの沈着を確認するため、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色（ＶＫ）、Ａｌｉｚａｌｉｎ ｒｅｄ染色（ＡＲ）をした。Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色はホルマリンに固定された大動脈弁を蒸留水で洗った後、室温で５％水溶性ＡｇＮＯ_３と強い光に６０分間露出させた。以後、２．５％チオ硫酸ナトリウムに５分間処理して黒褐色が現われれば、陽性反応で判読した。Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色はホルマリンに固定された大動脈弁を蒸留水で洗った後、２％ Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ（ａｑｕｅｏｕｓ，Ｓｉｇｍａ）に５分間処理して赤色またはオレンジ色が現われれば陽性反応で判読した。

石灰化された大動脈弁膜の組織を免疫蛍光染色した結果、図３に示したことのように、ＤＰＰ−４は、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ（ＶＫ）とＡｌｉｚａｌｉｎ ｒｅｄ（ＡＲ）によって染色される石灰化の進行された部分で高く発現され、正常人の大動脈弁膜の組織では発現が確認されなかった。

実施例２：ｅＮＯＳノックアウトマウスモデルでのＤＰＰ−４の発現確認
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ起源のｅＮＯＳ−／−（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）マウス（８週齢，ｎ＝１０，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍｅ，ＵＳＡ）と同種の野生対照群のマウス（８週齢、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＷＴ、ｎ＝１０）を利用した。搬入後３ヵ月齢までには標準のげっ歯類の飼料を与えた。

マウスは深く麻酔させた状態で４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳを投与して、心臓と大動脈を摘出して、一晩固定させた後、パラフィン包埋して、全体の大動脈弁膜の部位に対して、５μｍ厚さの切片を修得した。マウスを安楽死させて血液と大動脈のサンプルは分析のために保管した。

パラフィン包埋した大動脈弁及び心臓基底部の切片では、カルシウムの沈着を確認するため、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄの染色を行った。

その結果、図４に示したことのように、大動脈弁のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色で、対照群とは違って、ｅＮＯＳ ＫＯマウスの大動脈弁に無機質の沈着を意味する黒褐色で染色された部分が観察されて、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色でもカルシウムの沈着を意味する赤く染色された部分が観察された。また、ＡＲ染色とＶＫ染色で、石灰化が確認された部分で高いＤＰＰ−４の発現が確認される細胞が観察された。

実施例３：マウスの血管平滑筋細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ，ＶＳＭＣ）での石灰化の確認
実施例２でｅＮＯＳ−／−マウスと野生型マウスで、心臓とともに摘出した大動脈を無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）Ｍ１９９（Ｃｅｌｌｇｒｏ）につけて洗った後、小片に切った後、Ｍ１９９に２０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、３ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃の水槽で３時間湯煎した。分離された細胞は抗ＳＭ単クローン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して血管平滑筋細胞であることを確認した。分離された血管平滑筋細胞を３０％濃度で分注して２４時間後、骨形成培地（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ，Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）で交替した。培地は３日ごとに交替して２８日間、培養した。

野生型及びｅＮＯＳ ＫＯマウスに対して、石灰化の初期段階の染色法であるＡＬＰ染色、中期段階の染色法であるＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ（ＡＲ）染色法、後期段階の染色法であるＶｏｎ Ｋｏｓｓａ（ＶＫ）染色を利用してＣＤ２６が脈管性平滑筋細胞の骨化促進を誘発するかを確認した。

その結果、図５に示したことのように、対照群のマウスに比べてｅＮＯＳ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ形質転換のマウスで、脈管性平滑筋細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ，ＶＳＭＣ）の骨細胞化（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が促進されたことを観察することができた。

血管平滑筋細胞の培養液の遊離ＣＤ２６／ＤＰＰ−４の濃度を商用のＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して製造社の指針によって測定して、その結果、図６ａに示したことのように、ｅＮＯＳ−／−マウス由来のＶＳＭＣ培養液で増加されたＤＰＰ−４の濃度を確認することができた。

大動脈弁膜組織のＤＰＰ−４のｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲを利用して測定し、その結果、図６ｂに示したことのように、野生型に比べてｅＮＯＳ−／−マウスの大動脈弁膜組織でＤＰＰ−４のｍＲＮＡが増加することを確認した。

また、ｅＮＯＳ−／−マウスと野生型マウスの血漿内のＤＰＰ−４タンパク質のレベルはＥＬＩＳＡを利用して測定し、その結果、図６ｃに示したことのように、ｅＮＯＳ−／−マウス血漿で野生型に比べてＤＰＰ−４タンパク質のレベルが増加することを確認した。

実施例４：血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）でＮＯによるＤＰＰ−４の発現調節確認
ＮＯ生合成の抑制剤であるＬ−ＮＡＭＥ（Ｎω−Ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）を処理すると、大動脈でＤＰＰ−４の発現が顕著に増加することで示され、ＮＯの欠乏がＤＰＰ−４の発現を引き起こすことで知られている。

本実施例では実施例３の方法で獲得した血管平滑筋細胞にＮＯ供与体であるＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ（ＤＥＴＡ−ＮＯ）を処理すると、ＶＳＭＣでＤＰＰ−４ｍＲＮＡの発現が減少されるだけではなく（図７ａ）、ＤＰＰ−４タンパク質の発現も減少することで確認された（図７ｂ）。

ＤＰＰ−４発現の減少でＮＯの調節の役割に対するより直接的な証拠を得るために、ＤＰＰ−４のプロモーター活性がＮＯによって調節されるかを確認した。

その結果、ＤＰＰ−４のプロモーター活性は野生型マウス由来のＶＳＭＣでよりｅＮＯＳ−／−マウス由来のＶＳＭＣでさらに高く、これはＤＥＴＡ−ＮＯ処理により濃度依存的に抑制されることで示された（図７ｃ）。

ＶＳＭＣでのＮＦ−κＢの活性はＮＯによって抑制される。ｅＮＯＳ−／−マウス由来のＶＳＭＣで野生型マウス由来のＶＳＭＣより高いＮＦ−κＢの活性を示して、これはＤＥＴＡ−ＮＯの処理により減少された（図７ｄ）。ＤＰＰ−４のプロモーターにＮＦ−κＢの推定上の結合部位が存在するために、ＮＦ−κＢの活性が直接的にＤＰＰ−４プロモーターの活性を調節することができるかを確認した

まず、ＶＳＭＣを６ウェルプレートで８０％の培養密度になるまでに培養した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を利用して、ＮＦ−κＢの結合部位の変異を含めたり、正常の結合部位を有するＤＰＰ−４のリポーター部分をルシフェラーゼｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした後、形質導入させた。２４時間後、蛍及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。蛍ルシフェラーゼの活性はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性で標準化した。

上記ＮＦ−κＢ結合部位のＳＤＭ（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のために、下記プライマーを使用してＰＣＲを遂行した。
［配列番号１］５’−ＣＡＧＣＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣ−３’
［配列番号２］５’−ＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧ−３’

その結果、図８に示したことのように、ＤＰＰ−４プロモーターのＮＦ−κＢの結合部位を変異させると、ＤＰＰ−４プロモーターの活性が顕著に抑制されて、ＮＦ−κＢの抑制剤を処理すると、ＤＰＰ−４の生産が完全に抑制された（図７ｅ）。このような結果は、血管平滑筋細胞でＮＦ−κＢの活性化を通じたＤＰＰ−４の誘導がＮＯの欠乏によって起こり、ＮＯの供給を調節してＶＳＭＣの造骨細胞の転移分化を調節することができるということを提案している。

実施例５：大動脈弁膜の石灰化でＤＰＰ−４の抑制剤であるシタグリプチンの効果確認
大動脈弁膜の石灰化の過程でＤＰＰ−４が顕著に増加されることは弁膜の石灰化でＤＰＰ−４が潜在的な役割をしたということを意味する。これを証明するため、ｅＮＯＳ−／−マウスの大動脈石灰化に選択的のＤＰＰ−４の抑制剤であるシタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）を処理し、その効果を確認した。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ起源のｅＮＯＳ−／−（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）マウス（８週齢，ｎ＝１０，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍｅ，ＵＳＡ）と同種野生の対照群のマウス（８週齢，ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ，ＷＴ，ｎ＝１０）を利用した。搬入後３ヵ月齢までには標準のげっ歯類飼料を与えて、食塩水、またはシタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ，１５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ）を１２週間投与した。

ｅＮＯＳ−／−マウスで骨形成の活性を検出するために、尾静脈注射を通じて、ビスフォスフォネート−コンジュゲート映像化剤（Ｏｓｔｅｏｓｅｎｓｅ６８０，ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を注射した。Ｏｓｔｅｏｓｅｎｓｅ６８０は生体内で石灰化の部位、特にヒドロキシルアパタイトに結合して、造骨細胞の活動の検出のための映像化剤の役割をする。マウスを安楽死させた後、体全体または分離された大動脈をＯｐｔｉｘＭＸ３（ＡＲＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用してイメージングした。

その結果、ｅＮＯＳ−／−マウスで大動脈の周囲に石灰化が大きく進行されることを確認して（図９）、シタグリプチンを経口投与した場合、マウスの生体内で大動脈部位の石灰化が減少されることを確認した（図９ａ，ｂ）。また、ｅＮＯＳ−／−マウスの大動脈弁膜の部位をＶＫ染色したセクションでもＤＰＰ−４の活性を抑制する場合、大動脈の石灰化の過程を抑制することができるということを確認した（図１０ａ，ｂ）。

実施例６：ヒト大動脈弁膜細胞（ＶＩＣ）でのシタグリプチン処理効果の確認
ヒト大動脈弁膜のＶＩＣ（Ｖａｌｖｅ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ）は繊維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞の異種細胞の集合であり、ＶＳＭＣと類似した特徴を有して、造骨細胞の転移分化をすることができる。

ヒトＶＩＣを利用して造骨細胞の転移分化でＤＰＰ−４の役割を確認した。

ヒトＶＩＣは大動脈弁の前端で通常的な細胞の分離方法で分離して、２〜１０継代したものを使用した。ＤＰＰ−４（Ｒ＆Ｄ）またはシタグリプチン、ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ（エンゾ生命科学）と一緒に培養した。

その結果、図１１に示したことのように、ＤＰＰ−４の処理はＶＩＣの骨形成能力を増加させて、このような現象はシタグリプチンの処理によりなくなった。

疾病活性でＤＰＰ−４の関係を確認するために、ＣＡＶＤ患者の血漿でＤＰＰ−４の濃度を分析したが、リウマチ性大動脈弁膜疾患を有した患者とＤＰＰ−４の阻害剤を投与した患者は分析から除外した。

その結果、ＣＡＶＤ患者のＤＰＰ−４のレベルが正常人より高かった（図１２，表１）。

石灰化が示されたＣＡＶＤ患者は石灰化のない患者と比較して、ＤＰＰ−４のレベルが３４％増加しており（図１３ａ）、活性化されたタンパク質の分解能を有するＤＰＰ−４も増加した（図１３ｂ）。これはＤＰＰ−４の循環レベルがヒトＣＡＶＤ患者の重症度と関連があることを意味する（表２）。

実施例７：様々な種類のＤＰＰ−４の抑制剤の投与によるＶＳＭＣでの造骨細胞の転移分化の抑制効果の確認
シタグリプチン以外のＤＰＰ−４の抑制剤による弁膜石灰化の抑制効果を確認するために、様々な種類のＤＰＰ−４の抑制剤の処理によるｅＮＯＳ−／−マウス由来のＶＳＭＣ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ，ＶＳＭＣ）の骨細胞化（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の抑制効果を確認した。

アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、ビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）をそれぞれ４８ウェルプレートで培養されたｅＮＯＳ−／−マウス由来のＶＳＭＣに１０Ｍの濃度で７日間処理して、ＡＬＰの活性を測定した。その結果、ＤＰＰ−４の抑制剤を処理していなかった陰性対照群に比べて５０％以下のＡＬＰの活性抑制を確認して、これはシタグリプチン以外のＤＰＰ−４の抑制剤も大動脈血管弁膜の石灰化の抑制効果を示すことを意味する。

以上で本発明内容の特定した部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的な技術はただ好ましい実施態様であるに過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることではないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項と等価物によって定義されると言える。

本発明のＤＰＰ−４は弁膜が石灰化された場合、発現が増加し、ＤＰＰ−４の抑制剤を投与の時、その石灰化が顕著に減少するところ、ＤＰＰ−４の抑制剤は弁膜の治療または予防に有用に利用されることができる。

Claims (5)

1. シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、及びビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む大動脈弁膜の石灰化の予防または治療用の医薬組成物。
2. 前記の大動脈弁膜の石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン欠乏症、狭心症、心不全、腎臓疾患、***、糖尿病、炎症疾患及び心血管疾患から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の大動脈弁膜の石灰化の予防または治療用の医薬組成物。
3. シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、及びビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤の、大動脈弁膜の石灰化の予防または改善用の医薬組成物の製造のための使用。
4. シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、及びビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤を含む大動脈弁膜の石灰化の予防または改善用の食品組成物。
5. シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、エボグリプチン（ｅｖｏｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、及びビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのＤＰＰ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）の抑制剤の、大動脈弁膜の石灰化の予防または改善用の食品組成物の製造のための使用。

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