KR20110064292A

KR20110064292A - 루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110064292A
Application number: KR1020090120810A
Authority: KR
Inventors: 홍은숙; 안기웅; 조병기
Original assignee: (주)더페이스샵
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-15

Abstract

본 발명은 루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 강력한 항산화 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 가지므로 멜라닌 생성을 저해하며, 티로시나아제 활성을 억제하며 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 억제함으로서 멜라닌 생성을 저해한다. 특히 루시놀 및 하수오 추출물은 세포독성이 거의 나타나지 않기 때문에 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

루시놀, 하수오 추출물, 미백, 화장료, 조성물

Description

루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Rucinol and Polygonum multiflorum Extracts for skin whitening}

본 발명은 루시놀(Rucinol, 4-n-butyl-resorcinol) 및 하수오(Polygonum multiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 강력한 항산화 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 가지므로 멜라닌 생성을 저해하며, 티로시나아제 활성을 억제하며 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 억제함으로서 멜라닌 생성을 저해한다. 특히 루시놀 및 하수오 추출물은 세포독성이 거의 나타나지 않기 때문에 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적이고 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피(epidermis), 진피(dermis), 그리고, 피하(hypodermis)로 나누어진다. 멜라닌은 피부의 표피층에 존재하는 색소로서, 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)로부터 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이 동한다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고, 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다.

멜라닌 합성 과정을 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜라노좀이라는 소포체에서 합성되며, 멜라노좀에는 멜라닌 합성에 필요한 특이적인 효소를 함유하고 있다. 이 효소들 중 가장 잘 알려진 것으로 티로시나아제(Tyrosinase), TRP-1(Tyrosinase related protein-1)과 TRP-2(DCT, dopachrome tautomerase)라는 효소가 있으며, 이들 효소에 의해 티로신이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPAquinone)으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 케라티노사이트로 옮겨지고 여기에서 약 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부 표면으로 나와 각질과 함께 소실된다.

멜라닌은 햇빛 UV의 빛 에너지를 흡수하여 UV에 의한 손상으로부터 진피 이하의 피부 기관을 보호하는 역할을 하며, 피부 생체 내에 생겨난 유해산소 및 프리라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호해주는 유용한 역할을 수행한다. 또한, 피부 세포 내의 멜라닌 양에 따라 사람의 피부색을 결정한다. 멜라닌 색소가 많은 사람은 갈색 또는 검은 색 피부를 갖는 반면, 멜라닌 색소가 적은 사람은 흰색의 피부를 갖게 된다.

그러나 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 일광, 호르몬변화, 염증, 약제 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되거나 각화작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 피 부에 손상을 줄 뿐 만 아니라 피부의 색소가 침착되어 기미, 주근깨를 형성하며, 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 따라서, 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소 시켜야 한다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 피부색소 이상침착의 치료 및 미용욕구 충족을 위한 미백제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

현재 피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 미미한 것으로 알려져 있다. 따라서 티로시나제의 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제가 주목받고 있다.

종래의 화장품 분야에서는 미백성분으로서, 예를 들면, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다.

그러나, 처방계 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 코지산은 티로시나제의 활성부위에 존재하는 구리이온을 흡착시켜 효소활성을 저해하지만, 화장품에 배합 시 불안정성, 피부 부작용의 문제 및 최근 동물실험 결과 간암유발이 밝혀져 화장품 원료로 사용이 중지되었다. 비타민-C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 미백효과는 탁월하지만 알레르기를 유발하는 성질, 멜라닌 생성 세포에 대한 독성, 피부에의 영구 탈색화 등 피부에 대한 자극성이 높으며, 최근 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되어 각 나라별로 제한적인 농도만 허가하고 있다. 또한, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부질환의 치료제로서 이용가능성이 제시되었으나, 피부효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다.

이들 미백물질들 외에 천연물 특히 식물 중에서 미백활성성분을 찾기 위한 연구도 계속 이루어져왔고, 그 중 상백피(일본공개특허 소 55-44375호, 소 64-26507호, 소 64-83009호, 평 1-25687호, 평 5-139950호 및 대한민국 공개특허 제92-002109호, 제97-021273호), 감초(일본공개특허 소 60-214721호, 소 60-214728호, 소 63-23809호, 소 64-63506호, 평 1-149706호 및 대한민국 공개특허 제92-002109호, 제97-025601호), 작약(일본공개특허 소 61-246109호 및 대한민국 공개특허 제92-002111호), 계피(일본공개특허 소 63-30403호, 평 5-139954호), 고삼(일본공개특허 소 64-26507호 및 대한민국 공개특허 제92-002110호), 갈근(일본공개특허 소 60-214727호, 소 64-16709호), 당귀(일본공개특허 소 56-92211호, 평 4-26610 호), 목단피(일본공개특허 소 60-214721호, 소 61-50915호, 소 61-246109호), 반하(일본공개특허 평 2-207028호, 대한민국 공개특허 제96-033442호), 알로에(일본공개특허 소52-44375호, 평 2-207030호, 평 5-139950호)등 다수의 식물추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나아제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 아직 뛰어난 효과를 나타내지도 못하고 있는 실정이다.

본 발명자는 루시놀 및 하수오 추출물이 강력한 항산화 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 가지므로 멜라닌 생성을 저해하며, 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 억제함으로서 멜라닌 생성을 저해하는 것을 발견하였고, 루시놀 및 하수오 추출물은 세포독성이 거의 나타나지 않기 때문에 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 수단을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 미백용 화장료 조성물을 루시놀 및/또는 하수오 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 화장료 조성물은 tyrosinase 또는 TRP-2 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 하기의 실험예에서 확인할 수 있듯이 루시놀은 강력한 항산화 효과 및 티로시나제 활성 억제 효과를 가지므로 멜라닌 생성을 저해하며, 하수오 추출물은 티로시나아제 활성을 억제하며 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 억 제함으로서 멜라닌 생성을 저해한다. 특히 세포독성이 거의 나타나지 않기 때문에, 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 루시놀 및 하수오 추출물을 함유하는 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 하수오(Polygonum multiflorum)는 중국에서 들어온 것으로 알려져 있으며 오랫동안 재배되고 있는 덩굴성 약용식물이다. 키는 3~4m에 이르며 뿌리는 옆으로 길게 뻗어 종종 덩이뿌리를 형성한다. 심장형의 잎은 길이가 약 3~6㎝, 너비가 2.5~4.5㎝ 정도로 어긋나며, 잎자루와 턱잎[托葉]이 있지만 가장자리에 톱니가 없다. 꽃은 8~9월에 원추(圓錐)꽃차례를 이루며 핀다. 꽃잎은 없고 꽃받침은 5장이다. 열매는 길이가 2.5㎜ 정도로 세모진 난형이고 윤기가 난다.

붉은빛을 띤 갈색 덩이뿌리를 한방에서 하수오라고 하며 하수오는 신장기능을 튼튼하게 하여 정력을 높이고 머리카락을 검게 하며 병 없이 오래 살게 하는 약초로 이름이 높다. 간장의 기능을 좋게 하여 피곤함을 없애고, 살결을 곱게 하며, 뼈와 근육을 튼튼하게 하고, 심장을 튼튼하게 하여 신경쇠약이나 불면증 같은 데에도 효과가 있다. 조혈 작용이 뛰어나 빈혈치료에도 좋고 여성의 생리불순, 자궁염, 만성변비 등에도 두루두루 널리 쓰인다. 또 하수오는 노인들의 기력을 돋구는 데 매우 좋은 약이다. 신장기능을 좋게 하여 머리카락이 희어지지 않게 하고 머리카락이 빠지지 않게 한다. 중국 사람들은 하수오를 인삼, 구기자와 함께 3대 명약으로 여긴다. 하수오에 많이 함유되어있는 물질인 레스베라트롤(resveratrol)은 식물에 서 발견되는 항산화물질인 폴리페놀(polyphenol) 계열에 속하는 물질로 포도, 오디, 땅콩 등에 들어있다고 알려져 있으며, 특히 적포도주에 다량 함유되어 있다. 레스베라트롤은 그동안 항암, 항산화 작용을 하는 것으로 알려졌으며, 또한 심장 동맥 손상을 줄여주고 심장발작과 뇌졸중을 일으키는 위험한 현상인 혈액응고를 방지하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

상기 하수오 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 극성용매를, 가장 바람직하게는, 에탄올을 첨가하여 열수 추출하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 조성물의 미백 효과는 항산화 효과, 멜라닌 생성의 저해, 티로시나아제 활성의 억제, 미백관련 유전자의 발현 억제에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 이용되는 루시놀(4-butyl-resorcinol)은 전나무에 포함되어 있는 물질과 구조적으로 유사한 성분으로, 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 루시놀은 Mizoguchi and Sato 법(1975) 등 공지의 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있을 뿐만 아니라 시중에서 쉽게 구입할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 하수오 추출물의 제조 방법은 하수오를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조한 하수오를 추출용기에 넣고, 적당량의 추출 용매에 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 추출물은 여과되고, 진공회전증발기 등을 이용하여 농축될 수 있다.

상기 추출 용매로는 물(정제수), 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 극성용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사 용한다.

상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 2 ~ 10 배로 한다.

상기 추출 방법은 중탕 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중탕 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다.

상기 침적 온도는 30 ~ 70℃ 이며, 보다 바람직하게는 40 ~ 60℃이며, 가장 바람직하게는 50℃ 정도로 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 가장 효과적이다.

상기 침적 시간은 5 ~ 20 시간이며, 바람직하게는 10 시간이다.

상기 하수오 추출물을 수득한 후, 거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고, 현탁액을 원심분리 시키고, 상층액을 감압여과할 수 있다.

상기 여과된 추출물을 진공회전농축기로 20 ~ 100℃, 바람직하게는 50 ~ 70℃에서 감압농축할 수 있다.

본 발명에 의한 루시놀 및 하수오 추출물은 멜라닌 생성 세포에 의한 멜라닌 생성을 감소시키고, 티로시나아제 활성을 억제하는 미백효과가 있으며 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 억제하는 효과가 있다. 또한, 자유 라디칼을 소거하는 항산화 효과가 있으며, 세포 독성이 적다. 따라서, 본 발명의 루시놀 및 하수오 추출물은 과다한 멜라닌 생성을 억제하는 미백용 조성물로 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 루시놀은 조성물 총 중량에 대하여 0.0005 ~ 5 중량% 함유될 수 있다. 또한 상기 하수오 추출물은 조성물 총 중량에 대하여0.005 ~ 50 중량 % 함유될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 루시놀 및 하수오 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 루시놀 및 하수오 추출물을 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 루시놀 및 하수오 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화 제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 루시놀의 제조

상기 화학식 1로 표시되는 4-n-부틸-레조르시놀(4-n-butyl-resorcinol)로 2,4-디히드로옥시프로피오페논(2,4-dihydroxypropi ophenone) 1.66 ㎎을 20 mL의 에탄올, 80 mL의 conc 염산에 녹이고, 아연 아말감 50 ㎎을 첨가한다. 약 1.5 ㎎의 조추출물을 규산(silicic acid)의 컬럼에 크로마토그라피한 다음 클로로포름으로 용리하고 클로로포름-헥산으로 결정화하여 루시놀을 제조한다(Mizoguchi and Sato, 1975).

[제조예 2] 하수오 추출물의 제조

본 실시예의 하수오는 우리나라에서 채취한 것을 사용하였다.

채취한 식물 50 g을 100% 에탄올 200ml에 침지시켜 50℃ 수욕조에서 10시간 동안 온탕하였다. 얻어진 추출액을 실온으로 냉각시키고 거름종이로 여과하여 여과액을 취하였다. 질소를 사용하여 여과액에서 에탄올을 증발시켜 농축한 다음, 이를 10% 에탄올에 녹여 추출물을 제조하였다.

[시험예 1] 세포내 멜라닌 저해효과

B16F1 멜라노마 세포는 한국 세포주은행에서 제공받아 배양시켰다. B16F1 멜라노마 세포는 멜라닌을 생성하는 세포주로서 일반적으로 미백물질 스크리닝에 사용된다.

상기 세포를 배양하기 위한 배지는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 넣어 무균상태로 만들었다. 세포배양은 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. 멜라노마 세포를 배양하여 100 mm 패트리 디쉬가 90% 정도 찼을 때 계대하였다.

루시놀과 하수오 추출물의 미백효과 측정을 위하여 B16F1 멜라노마 세포에 처리하여 생성된 멜라닌양의 변화를 측정하였다. 6 웰 플래이트에 세포를 접종(seeding)하고 제조예 1, 2에서 제조한 루시놀과 하수오 추출물을 각각 농도별로 처리한 후 이틀간 배양하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 10% DMSO를 포함하는 1N NaOH를 가해 90℃에서 1 시간 반응시켜 멜라닌에 충분히 녹아나오도록 한 후, ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

IC₅₀은 대조군의 멜라닌 생성량을 100으로 보았을때 멜라닌 생성을 50% 억제하는 시료의 농도를 나타낸다.

시료명	알부틴	루시놀	하수오 추출물
IC₅₀	381.6ug/ml	234.7ug/ml	0.47%

시험결과 루시놀은 알부틴보다 더 높은 멜라닌 생합성 억제효과를 나타냈으며, 하수오 추출물은 IC₅₀0.47%로 나타났다. 특히, 하수오 추출물은 세포내 멜라닌 생합성 억제에 가장 뛰어난 우수한 효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.

[시험예 2] 티로시나아제 활성 저해 측정

루시놀과 하수오 추출물이 멜라닌을 생성하는데 중요한 역할을 하는 티로시나아제 효소 활성에 영향을 끼치는지 측정하였다.

96웰 플래이트에 0.1M phosphate buffer(pH6.8)를 210ul 첨가하고 농도별로 루시놀과 하수오 추출물 또는 증류수 30ul를 각각 첨가한후 20ul의 버섯유래 티로시나아제를 첨가한다. 기질로서 5mM의 L-DOPA 40ul를 첨가한후 37℃에서 10분간 반응시킨후, ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 475nm에서 흡광도를 측정하였다.

IC₅₀은 대조군의 티로시나아제 활성을 100으로 보았을때 티로시나아제 활성을 50% 억제하는 시료의 농도를 나타낸다.

시료명	비타민C	루시놀	하수오 추출물
IC₅₀	92.76ug/ml	0.885ug/ml	0.38%

상기 표 2에 나타난 바와같이 루시놀은 비타민C와 비교하였을 때 놀랍게도 약 100배 높은 티로시나아제 활성 저해효과를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통하여 루시놀은 매우 강력한 티로시나아제 활성 저해제로서 사용될 수 있음을 확인 하였고 특히 하수오 추출물은 더욱 강한 티로시나아제 활성 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 독성 실험

루시놀과 하수오 추출물의 미백 화장료로 사용하기 위하여, 세포 독성 여부를 확인하기 위한 실험을 하였다. 96 웰 플래이트에 세포를 접종하고 루시놀과 하수오 추출물을 각각 200ug/ml, 1%로 처리하고 이틀후 배지를 제거하고 MTT solution을 100ul 첨가하여 30‘C에서 4시간 반응후 용액을 제거하고 DMSO 100ul를 첨가하여 염색된 세포를 녹인후 ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였으며, 결과를 표 3에 나타내었다.

세포 생존율(%) = (1-처리구 흡광도/미처리구 흡광도) × 100

시료명	미처리구	루시놀	하수오 추출물
세포 생존율(%)	100	100	98.8

루시놀과 하수오 추출물 모두 시험농도에서 세포독성이 거의 없는 것으로 나타났다.

[시험예 4] 항산화 활성 실험

루시놀과 하수오 추출물의 항산화 활성을 갖는지 확인하기 위하여 일반적으로 항산화 활성을 측정하는 방법인 DPPH 용액을 이용하여 측정하였다.

루시놀과 하수오 추출물을 각각 여러농도로 희석하여 항산화 측정 용액인 DPPH 용액과 일대일로 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨후 ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화제로 알려진 비타민C와 함께 실험하여 추출물이 어느 정도의 자유라디칼 소거효과를 갖는지를 상대적으로 비교해보았다. SC₅₀은 대조구의 자유라디칼 양을 100으로 보았을때 자유라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도를 나타낸다.

시료명	비타민 C	루시놀	하수오 추출물
SC₅₀	100ug/ml	106.61ug/ml	0.94%

항산화 효과를 확인한 결과 루시놀은 비타민C과 거의 동일한 자유라디칼 소거효과를 갖는 것으로 나타났다.

[시험예 5] 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현 억제효과

멜라닌 생성 인자인 tyrosinae, TRP-1(tyrosinae related protein-1) 및 TRP-2(dopachrome tautomerase)의 유전자 발현 억제효과를 알아보고자 mRNA 발현량을 RT-PCR을 통하여 정량하였다. 시험예1의 B16F1 세포를 배양하여 60 mm 패트리 디쉬에 5x10⁶ cells의 농도로 접종하여 24시간 배양하였다. 배양한 디쉬에 루시놀과 하수오 추출물을 각각 200ug/ml과 1%가 되도록 첨가한 후 6시간 더 배양하였다. 배양액을 제거한 다음, 트리졸(Trizol) 용액에 넣고 세포를 라이시스 (lysis) 시켰다. 트리졸을 이용한 RNA 분리법에 의하여 토탈 RNA를 분리하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 10 μg의 RNA를 MMLV-RT 효소와 올리고 디티 프로머(oligo dT promer)를 이용하여 cDNA로 역전사(reverse transcription)시킨 다음, RT 반응산물을 각각 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 프라이머를 사용하여 PCR 반응용액으로 증폭시켰다. 최종 PCR 생성물을 1.0% 아가로스젤 (agarose gel)에서 전기영동 한 뒤 사이버-그린(Cyber Green)으로 염색하여 320 nm UV 하에서 정량하였다. 상기 과정을 실시하여 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현 억제율을 구해 그 결과를 표 5에 나타내었다.

	루시놀	하수오 추출물
tyrosinaes	14.7%	22.2%
TRP-1	-	-
TRP-2	-	34.5%

시험결과 하수오 추출물은 tyrosinase와 TRP-2 유전자의 발현을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났으며 루시놀은 tyrosinase 유전자 발현 억제효과가 있음을 확인하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

[제조예 3] 실시예 및 비교예

제조예 1, 2의 루시놀 및 하수오 추출물을 함유하는 화장료를 제조하고, 이와 비교하기 위하여 루시놀 및 하수오 추출물이 결여된 화장료 조성물을 하기 표 6의 조성비로 제조하였다.

구분	함량(중량%)
성분	실시예	비교예1	비교예2	비교예3
루시놀	0.1	2.1	-	-
하수오 추출물	2.0	-	2.1	-
세테아릴 옥타노에이트	5.0	5.0	5.0	5.0
이소프로필 팔미테이트	5.0	5.0	5.0	5.0
폴리아크릴아마이드/C13-14이소파라핀/라우레스-7	2.0	2.0	2.0	2.0
폴리소르베이트60	1.7	1.7	1.7	1.7
솔비탄 세스퀴올리에이트	1.3	1.3	1.3	1.3
향료, 방부제	정량	정량	정량	정량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100

[시험예 6]

본 발명의 화장료의 임상 미백효능을 시험하기 위하여, 기미, 주근깨 및 색소침착증을 갖고 있는 건강한 성인 남녀 40명을 무작위로 10명씩 4개 그룹(A, B, C 및 D)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예를, B그룹을 대상으로는 비교예1을, C그룹을 대상으로는 비교예2를, D그룹을 대상으로는 비교예4를 각각 1일 2회씩 12주간 도포한 후 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(△ L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 미백효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

*미백효능 평가 기준 :

-3: 매우악화 -2: 악화 -1: 약간악화 0:변화없음

1: 약간개선 2: 개선 3: 매우 개선

피검자	피부색의 밝기변화(△ L)				숙련자의 객관적평가				피검자의 주관적평가
피검자	A그룹	B그룹	C그룹	D그룹	A그룹	B그룹	C그룹	D그룹	A그룹	B그룹	C그룹	D그룹
평균	5.1	4.6	3.8	2.5	2.1	1.8	1.8	0.4	1.8	1.1	1.2	0.5

상기표 7에 나타난 결과를 보면 피부 밝기 변화는 비교예3에 비하여 실시예 적용시 약 2배의 효과를 보였고 비교예1, 2와 비교 하였을 때에도 실시예가 가장 우수한 것으로 나타났다. 숙련자의 객관적 평과와 피검자의 주관적 평가 역시 실시예를 적용한 것이 비교예1, 2, 3을 적용하였을 때와 비교하였을때 보다 개선효과가 높은 것으로 확인되었다.

결과적으로 상기 표7에 나타난 결과를 통해 확인할 수 있는 사실은 본 발명에 따른 루시놀 및 하수오 추출물을 함유하는 화장료는 피부미백효과를 증진시키는 것으로서 우수한 효과를 발휘하고 있음을 알 수 있다.

선 실험예의 결과를 근거로 하여 본 발명의 루시놀 및 하수오 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

[제형예 1] 유연 화장수

루시놀 및 하수오 추출물을 함유한 유연 화장수의 제제예는 다음 표 8의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량%)
루시놀	0.10
하수오 추출물	1.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

[제형예 2] 영양 크림

루시놀 및 하수오 추출물을 함유한 영양크림의 제제예는 다음 표 9의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량%)
루시놀	0.20
하수오 추출물	2.00
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
식물 추출물	3.2
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

Claims

루시놀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
루시놀 및 하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 tyrosinase 또는 TRP-2 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형을 취하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.