본 발명은 멜라닌 생성 저해 활성을 갖는 서장채국화 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서장채국화 추출물의 제조 방법을 제공하며,
(1) 서장채국화에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 첨가하여 추출하는 단계,
(2) 상기 단계(1)에서 얻은 추출물을 클로로포름으로 분배 추출하는 단계,
(3) 상기 단계(2)에서 얻은 수용액 층을 에틸아세테이트로 분배 추출하는 단 계, 및
(4) 상기 단계(3)에서 얻은 에틸아세테이트 층을 여과, 분리 및 정제하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 서장채국화 추출물의 제조 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
중국 티벳에서 자생하는 서장채국화를 물로 세척하여 이물질을 제거한 후, 그늘에서 건조하고, 분쇄한다. 분쇄된 서장채국화에 적당한 양의 용매를 첨가하여 완전히 침지되도록 하며, 교반하면서 추출한다. 추출 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매가 바람직하며, 가장 바람직하게는 물이다. 상기 추출 용매의 양은 서장채국화 건중량의 10 내지 30배이며, 보다 바람직하게는 15 내지 25배로 하며, 가장 바람직하게는 20배로 한다.
추출 방법은 실온에서 함침하거나, 가온할 수 있으며, 바람직하게는 70℃에서 3시간 동안 추출한다.
상기에서 얻어진 추출물을 냉각시키고, 여과한다. 여과된 용액은 회전식 감압증발기를 이용하여 감압 농축한다.
상기에서 얻은 농축액과 클로로포름을 분액 깔때기에 넣고 충분히 교반시킨 다음, 수용액 층과 클로로포름 층으로 분액 한다. 이때, 바람직하게는 클로로포름의 양은 농축액과 동량이 되도록 한다. 상기에서 얻은 수용액 층과 에틸아세테이트를 분액 깔때기에 넣고 충분히 교반시킨 다음, 수용액 층과 에틸아세테이트 층으로 분액 한다. 이때, 바람직하게는 에틸아세테이트의 양은 수용액과 동량이 되도 록 한다. 상기에서 얻은 수용액 층, 클로로포름 층, 에틸아세테이트 층을 각각 회전식 감압증발기로 증발시켜 분말화 한 후, 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 저해 실험을 통하여 에틸아세테이트 층에서 멜라닌 생성 저해 활성이 가장 우수함을 확인하였다.
상기에서 얻은 서장채국화 추출물의 에틸아세테이트 층을 여과한 다음, 제조용 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 실시하여 4개의 분획(1~4)으로 분리한다. 이때, 이동상 용매로 아세토니트릴과 물(60 : 40, v/v%)의 혼합 용매를 사용한다. 상기 분획 중 분획 2에서 멜라닌 생성 저해 활성이 가장 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 서장채국화 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서장채국화 추출물의 물, 클로로포름, 에틸아세테이트 층은 B16 멜라노마 세포에 의한 멜라닌 생성을 알부틴 처리군에 비해 각각 최대 약 18%, 약 45% 및 약 11.8%까지 감소시킨다(도 3). 상기의 세 가지 서장채국화 추출물의 용매 층 중 멜라닌 생성 저해 효과가 가장 우수한 에틸아세테이트 층을 크로마토그래피하여 얻은 분획 1, 2, 3 및 4 중 20∼50분 사이에 검출되는 분획 2는 알부틴 처리군에 비해 9.6%까지 멜라닌 생성을 감소시킨다(도 4). 또한, 각 용매 층은 B16 멜라노마 세포를 대상으로 실시한 세포 독성 실험에서 독성을 전혀 나타내지 않는다(도 5).
따라서, 본 발명의 서장채국화 추출물 중 에틸아세테이트 층 및 에틸아세테 이트 추출 분획 2에서 멜라닌 생성 저해 활성이 우수하게 나타나고 세포 독성이 없으므로, 미백용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 서장채국화 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005∼20 중량 % 함유되는 것이 바람직하지만, 멜라닌 생성 억제 효과가 있고 독성이 나타나지 않는 범위에서 사용 용도에 따라서 상기 범위 이상 또는 이하로도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 서장채국화 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 서장채국화 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 서장채국화 추출물을 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 서장채국화 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제 공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 서장채국화 추출물의 제조
1-1: 서장채국화로부터 추출
중국 티벳에서 제공받은 서장채국화 10g을 분쇄한 후 200 ㎖의 물을 첨가하여 70℃에서 3 시간동안 교반, 추출하였다. 추출된 용액을 상온에서 하루 동안 냉각시켰다. 냉각시킨 용액을 32㎛의 체로 여과한 후 다시 여과지로 여과하였다. 여과액은 회전식 감압증발기(Buchi Rotavapor R-200, Buchi Labotechuik AG. Switzerland)를 이용하여 50 ㎖까지 농축시켰다. 상기에서 얻은 농축액 50 ㎖와 50 ㎖의 클로로포름을 분액깔때기에 넣고, 충분히 교반시킨 다음 수용액 층과 클로로포름 층으로 분액 하였다. 그 다음 단계로 상기에서 얻은 수용액 층 50 ㎖에 50 ㎖의 에틸아세테이트를 넣고 충분히 교반시킨 후 수용액 층과 에틸아세테이트 층으로 분액 하였다. 상기에서 얻은 수용액 층, 클로로포름 층, 에틸아세테이트 층의 용액을 각각 회전식 감압증발기로 증발시켜 분말화하여, 수용액 층 850 ㎎, 클로로포름 층 20 ㎎ 및 에틸아세테이트 층 138 ㎎을 얻었다.
1-2: 서장채국화 추출물의 분리 및 정제
상기 1-1에서 얻은 서장채국화 추출물의 에틸아세테이트 층을 0.2㎛ PTFE(polytetrafluoruethylene) 주사기 여과기(syringe filter)를 이용하여 여과한 후 크로마토그래피 시료로 사용하였다. 상기 여과액 중 2 ㎖를 역상 제조용 컬럼(21.5×500 mm, GFC, C18, 13 ㎛, JAI, 일본)에 주입하고, 이동상 용매로 아세토니트릴 : 물 = 60 : 40(v/v%)인 혼합 용매를 이용하여 용리시켰다. 이동상 용매의 용리속도는 3.5 ㎖/min이었으며, 검출 파장은 254 nm로 유지하였다.
에틸아세테이트 층은 용리 시간 100분 이내에 검출되었으며, 4개의 분획(1~4)으로 분리하였다. 각 분획을 감압 회전식농축기로 감압, 농축시켜, 3분 내지 18분 사이의 분획 1은 11.5 ㎎, 20분 내지 50분 사이의 분획 2는 67.4 ㎎, 50분 내지 58분 사이의 분획 3은 13.8㎎ 및 60분 내지 75분 사이의 분획 4는 14.1 ㎎을 얻었다.
본 발명에 따른 서장채국화로부터 추출, 분리 및 정제 과정은 도 1에 나타내었으며, HPLC 분석결과는 도 2 에 나타내었다.
실험예 1: 서장채국화 추출물의 미백 효과 실험
본 발명의 서장채국화 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
멜라닌 세포는 B16 멜라노마 세포(ATCC, CRL-6475)로서 ㈜태평양에서 분양받아 사용하였고, 배양 배지로는 RPMI 1640 배지에 10%(v/v %) FBS (fetal bovine serum), 1%의 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가하여 만들었다.
B16 세포를 1×105 세포/웰을 표준으로 접종한 후 24시간이 지나서, 상기 실시예 1에서 제조한 서장채국화 추출물(물, 클로로포름, 에틸아세테이트)을 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로, 에틸아세테이트 층의 4개의 추출 분획(1~4)을 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 방치하였다. 48시간이 지난 후 세포들을 마이크로 원심분리 튜브에 옮겨 PBS(인산완충용액)로 세척하고, 10% DMSO(Dimethylsulfoxide)를 함유하고 있는 NaOH 250 ㎕에 용해시켰다. 용해시킨 세포들을 85℃ 인큐베이터에서 30분 동안 방치시켜 멜라닌이 용해되도록 하였다. 200 ㎕의 용액을 96 웰 플래이트에 옮겨서 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 검측하였다. 이때 대조군으로서 미백 성분으로 잘 알려져 있는 알부틴을 처리한 군을 사용하였다.
결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서장채국화 추출물 중 에틸아세테이트 층의 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 38.75, 27.18, 11.8%의 멜라닌 함량을 나타내어 대조군에 비해 멜라닌 함량이 현저히 낮게 나타남을 확인하였다. 또한, 본 발명의 서장채국화 추출물의 에틸아세테이트 층이 물 층 및 클로로포름 층 보다 멜라닌 함량이 낮게 나타남을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서장채국화 추출물의 에틸아세테이트 추출 분획 중 분획 2에서 각 농도별(10, 50 100 ㎍/㎖)로 각각 33.3, 26.5, 9.6%로 나타나, 멜라닌 함량이 가장 낮게 나타남을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 서장채국화 추출물은 멜라닌 생성 저해 활성이 우수하므로, 미백용 화장료 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
실험예 2: 서장채국화 추출물의 세포 독성 실험
본 발명의 서장채국화 추출물의 세포 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
세포 독성 검사는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 시그마 화학사, 미국)를 이용하여 진행하였다. B16 멜라노마 세포를 2×104 세포/웰로 96 웰 플래이트에 접종하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2일 동안 방치한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT용액을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 4 시간 동안 더 방치하였다. 그 다음 세포를 100 ㎕의 DMSO에 용해시키고 ELISA 리더(reader)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 활성을 검측하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서장채국화 추출물은 어떤 시료도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 세포 생장률이 높아 독성이 없는 것으로 나타났다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1: 유연 화장수
서장채국화 추출물을 함유한 유연 화장수의 제제예는 다음 표 1의 조성과 같이 제조하였다.
원료 |
함량(중량%) |
본 발명의 서장채국화 추출물 |
10.00 |
1,3-부틸렌글리콜 |
1.00 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
알란토인 |
0.10 |
디포타슘글리시리제이트 |
0.05 |
시트릭애씨드 |
0.01 |
소듐시트레이트 |
0.02 |
글리세레스-26 |
1.00 |
알부틴 |
2.00 |
하이드로제네이티드캐스터오일 |
1.00 |
에탄올 |
30.00 |
보존제 |
미량 |
착색제 |
미량 |
착향제 |
미량 |
정제수 |
잔량 |
제제예 2: 영양 크림
서장채국화 추출물을 함유한 영양크림의 제제예는 다음 표 2의 조성과 같이 제조하였다.
원료 |
함량(중량%) |
본 발명의 서장채국화 추출물 |
10.0 |
1,3-부틸렌 글리콜 |
7.0 |
글리세린 |
1.0 |
D-판테놀 |
0.1 |
식물 추출물 |
3.2 |
마그네슘알루미늄실리케이트 |
0.3 |
PEG-40 스테아레이트 |
1.2 |
스테아릭애씨드 |
2.0 |
폴리소르베이트 60 |
1.5 |
친유형글리세릴스테아레이트 |
2.0 |
소르비탄세스퀴올리에이트 |
1.5 |
세테아릴알코올 |
3.0 |
미네랄오일 |
4.0 |
스쿠알란 |
3.8 |
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
2.8 |
식물성 오일 |
1.8 |
디메치콘 |
0.4 |
디포타슘글리시리제이트 |
미량 |
알란토인 |
미량 |
소듐 히아루로네이트 |
미량 |
토코페릴아세테이트 |
적량 |
트리에탄올아민 |
적량 |
보존제 |
적량 |
착향제 |
적량 |
정제수 |
잔량 |