KR20100112658A - 트랜스제닉 계통 ｍｏｎ８７７６９에 상응하는 대두 식물 및 종자, 및 그의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트랜스제닉 대두 계통 MON87769, 및 상기 대두 계통에 대한 진단 표지가 되는 DNA를 포함하는 세포, 종자, 및 식물을 제공한다. 본 발명은 또한 샘플 중 상기 대두 계통에 대한 진단 표지가 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물, 샘플 중 상기 대두 계통 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법, 샘플 중 상기 대두 계통 뉴클레오티드 서열의 존재에 대한 진단 표지가 되는 뉴클레오티드 서열을 검출하는 데 사용하기 위한 프로브 및 프라이머, 상기 대두 계통의 종자를 대두 식물로 재배하는 방법, 및 상기 대두 계통에 대한 진단 표지가 되는 DNA를 포함하는 대두 식물을 생산할 수 있도록 육종하는 방법 또한 제공한다.

Description

트랜스제닉 계통 ＭＯＮ８７７６９에 상응하는 대두 식물 및 종자, 및 그의 검출 방법{SOYBEAN PLANT AND SEED CORRESPONDING TO TRANSGENIC EVENT MON87769 AND METHODS FOR DETECTION THEREOF}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2008년 2월 15일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제61/029,197호, 및 2008년 5월 22일 출원된 시리얼 번호 제61/055,401호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 우선권을 주장한다.

컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록에 관한 참고 인용

본 개시 내용의 일부인 서열 목록은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 파일명이 "MONS193WO_ST25.txt"이며, 파일 크기가 37 KB인 컴퓨터 판독 가능한 형태의 파일을 포함한다. 서열 목록 내용 전체가 본원에서 참고로 인용된다.

본 발명의 배경

1. 기술분야

본 발명은 계통 MON87769, 그의 자손 식물, 종자를 포함하는 트랜스제닉 대두 식물에 관한 것이다. 계통은 스테아리돈산을 포함하는 오일 조성물을 나타낸다. 본 발명은 또한 생물학적 샘플 중 상기 대두 계통의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이고, 상기 계통의 독특한 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

2. 관련 분야 설명

대두는 세계의 수많은 지역에서 중요한 작물이자 주된 식량원이다. 생명공학 방법들이 생성물의 작물상의 특성과 품질을 개선시키기 위하여 대두에 적용되어 왔다. 그러한 품질 특성은 스테아리돈산 (SDA)을 포함하는 대두유이다.

유성 교배의 자손이 관심의 대상이 되는 트랜스진/게놈 DNA를 포함하는지 여부를 측정하기 위하여 특정 식물의 트랜스진/게놈 DNA의 존재를 검출할 수 있다면, 이는 유리할 수 있다. 추가로, 특정 식물을 검출하는 방법은, 예를 들면, 판매전 승인을 필요로 하고, 재조합 작물 식물들로부터 유래된 식품을 표지하는 규정들을 따르는 데에 도움이 될 수 있다.

다가불포화 지방산 (PUFA)을 섭취하는 것이 건강에 좋다고 알려져 있다. SDA인, PUFA를 함유하는 오일이 인간 및 기타 다른 동물에서 건강한 식단의 일부로서 이로울 수 있다. SDA는 식물 및 동물 공급원으로부터 기원할 수 있다. SDA의 상업적 공급원으로는 트리코데스마(Trichodesma), 보라고(Borago) (보리지) 및 에키움(Echium ) 속의 식물 뿐만 아니라, 어류를 포함한다. 그러나, 천연 공급원으로부터 상업적으로 PUFA를 생산하는 것과 관련해서는 여러 가지 단점이 있다. PUFA의 천연 공급원, 예로서, 동물 및 식물은 고도로 이질성인 오일 조성물을 갖는 경향이 있다. 그러므로, 이러한 공급원으로부터 수득한 오일의 경우, 하나 이상의 원하는 PUFA를 분리해 내거나, 하나 이상의 PUFA 중에 강화되어 있는 오일을 생산하기 위해서는 철저히 정제시켜야 할 수도 있다. PUFA의 천연 공급원은 또한 이용가능성 면에 있어서 제어할 수 없이 달라질 수 있다. 수산 자원은 천연적으로 변형될 수 있거나, 과도한 어업 활동으로 고갈될 수 있다. 또한 어유는 그 맛과 향이 불쾌한데, 이는 원하는 생성물로부터부터 경제적으로 분리해 내는 것도 불가능할 수 있고, 이 때문에 상기 생성물은 식품 보충제로서 용인되지 못할 수 있다. 동물성 오일, 및 특히 어유는 환경 오염 물질을 축적시킬 수 있다. 음식물은 어유로 강화될 수 있지만, 다시 그러한 강화는 비용과 전세계의 수산 자원의 감소로 문제가 된다. 그럼에도 불구하고, 어류 섭취를 증가시키는 건강 메세지가 사회에서 용인된다면, 어류 수요량을 충족시키는 데 있어서 문제가 일어날 가능성이 있다. 추가로, 수산 양식을 위한 먹이 사료를 야생 수산 자원에 크게 의존하고 있는 상기 산업의 지속가능성에 있어서도 문제가 존재한다 (문헌 [Naylor et al, Nature 405:1017-1024, 2000]).

따라서, 상업적인 양으로 SDA를 생산할 수 있도록 조작될 수 있는 육지에 사는 육상 작물 식물계에서 SDA와 같은 PUFA를 생산하는 것이 이로울 수 있다. 시판 종유 작물, 예로서, 카놀라, 대두, 옥수수, 해바라기, 홍화, 또는 아마에서, 그의 종자유의 특징을 나타내는 단가불포화 및 다가불포화 지방산 분획 일부를 SDA로 전환시키려면, 효소 델타 6-데세츄라제 및 델타 15-데세츄라제가 종자-특이적으로 발현하여야 한다. 상승된 수준으로 Δ6- 및 Δ15-데세츄라제를 발현하는 식물로부터 유래된 오일은 SDA가 풍부하다. 또한, 인간 및 동물에서 오메가-3 지방산 섭취를 증가시킬 것이 요구됨에 따라, 피험체는 그들의 일반적인 식습관에 맞는 먹이 사료, 먹이 사료, 먹이 사료 성분, 음식물 및 음식물 성분을 선택할 수 있도록 하는 매우 광범위한, 오메가-3이 강화된 음식물 및 음식물 보충제의 제공이 요구되고 있다. 콩 식물에서 SDA를 상업적인 양으로 제공하는 것 또한 유리할 수 있다.

식물에서 외래 유전자를 발현하는 것은 가능하게는, 염색질 구조 (예로서, 이질 염색질), 또는 통합 부위에 인접한 전사 조절 요소 (예로서, 인핸서)의 근접성에 기인하는 그의 염색체 위치에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Weising et al.(Ann . Rev . Genet 22:421-477, 1988)]). 상기 이유 때문에, 관심의 대상이 되는 도입된 유전자의 최적의 발현을 특징으로 하는 계통을 확인하기 위하여 다수의 계통들을 스크리닝할 필요가 종종 있다. 예를 들면, 계통들 중에서 도입된 유전자의 발현 수준 내에서 광범위한 변화가 있을 수도 있다는 것이 식물 및 기타 다른 유기체에서도 관찰되었다. 또한, 예를 들면, 도입된 유전자 작제물에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예측되는 패턴에 상응할 수 없는 각종 식물 조직 내 트랜스진의 상대적 발현에서 나는 차이와 같이, 발현의 공간적 패턴 또는 시간적 패턴에서 차이가 날 수 있다. 상기와 같은 이유 때문에, 수백개 내지 수천개의 상이한 계통들을 생성하고, 상업적인 목적에 맞은 원하는 트랜스진 발현 수준과 패턴을 갖는 단일 계통을 위하여 이들 계통들을 스크리닝하는 것이 통상적이다. 원하는 수준 또는 패턴의 트랜스진 발현을 갖는 계통은 통상의 육종법을 사용하는 유성 이계교배에 의해 다른 유전학적 배경들로 트랜스진을 유전자이입시키는 데 유용하다. 이러한 교배로 이루어진 자손은 원 형질전환체의 트랜스진 발현 특징을 유지한다. 이러한 전략법은 특정의 국부적인 재배 환경에 잘 적응하는 다수의 품종에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확인하기 위해 사용된다.

예로서, 핵산 프로브들을 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 DNA 혼성화와 임의의 주지된 핵산 검출 방법에 의해 트랜스진들의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 검출 방법은 일반적으로는, 예로서, 프로모터, 종결 인자, 마커 유전자 등과 같이, 빈번하게 사용되는 유전적 요소들에 초점을 맞춘다. 그 결과, 삽입된 DNA에 인접한 염색체 DNA ("인접" DNA)의 서열이 공지되지 않은 경우에는, 상기 방법은 (예를 들면, 상이한 계통들 사이에서의 구별에 유용한) 특히 동일한 DNA 작제물을 사용하여 생산된 것에 대해 계통-특이적이지 못할 수 있다. 트랜스제닉 옥수수 계통 Bt11, Bt176, 및 GA21, 및 카놀라 계통 GT73에 대한 계통-특이 추적 시스템을 입증하는 계통-특이 PCR 분석법이 예를 들면, 문헌 [Taverniers et al. (J. Agric . Food Chem ., 53: 3041-3052, 2005)]에서 논의된 바 있다. 본 연구에서, 계통-특이 프라이머 및 프로브는 각 계통에 대한 게놈/트랜스진 연접부의 서열에 기초하여 디자인되었다. 계통-특이 검출 방법은 또한 주어진 형질전환 계통을 포함하는 트랜스제닉 식물의 사용을 승인하는 업무를 맡고 있는 관리 기관에 의해 요구될 수도 있다. 트랜스제닉 식물 계통-특이 DNA 검출 방법은 또한 미국 특허 번호 제6,893,826호; 제6,825,400호; 제6,740,488호; 제6,733,974호; 제6,689,880호; 제6,900,014호 및 제6,818,807호에서 설명된 바 있다.

발명의 요약

본 발명은 MON87769로 지칭되는 트랜스제닉 대두 계통을 포함하는 대두 식물, 및 (그의 자손은 또한 삽입된 트랜스제닉 DNA에 상응하는 적어도 하나의 대립유전자를 포함한다는 점에서) 대두 계통 MON87769와 구별이 불가능한, 그의 자손에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면(들)은 대두 계통 MON87769를 포함하는, 자손 식물, 또는 종자, 또는 대두 식물 및 종자의 재생가능 부분이다. 본 발명은 또한, 화분, 배주, 꽃, 발아, 뿌리, 줄기, 잎, 깍지, 종자 및 분열 조직을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물 부분을 포함한다. MON87769를 포함하는 식물, 및 MON87769를 포함하는 식물로부터 생산된 생성물, 예로서, 오일, 굵은 가루, 고운 가루, 식품, 단백질 보충제 및 MON87769에 상응하는 대두 식물이 수확된 경작지에 남아있는 바이오매스의 게놈 내에 포함되어 있는 신규한 유전적 조성물이 본 발명의 측면이 된다.

본 발명은 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물의 생리학적 및 형태학적 특징 모두를 갖는, SDA를 포함하는 오일 조성물을 갖는 대두 식물을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따라, 서열 1 및/또는 서열 2를 포함하는 신규한 대두 식물, 또는 MON87769로 지칭되는 계통으로부터 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 대두 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있다. 서열 1 (도 2에 제시되어 있는 바와 같이, "[F] 서열 6"의 979번 위치에서부터 998번 위치까지에 상응하는 "[A] 서열 1") 및 서열 2 (도 2에 제시되어 있는 바와 같이, "[F] 서열 6"의 8345번 위치에서부터 8365번 위치까지에 상응하는 "[B] 서열 2") 및 그의 상보체로 구성되는 군으로부터 선택되는 계통 MON87769의 적어도 하나의 연접부 서열을 포함하는 DNA 서열을 제공하며; 여기서 상기 연접부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA가 대두 세포 게놈 DNA에 연결되는 연결 지점에 걸쳐져 있는 뉴클레오티드 서열이고, 대두 DNA를 포함하는 생물학적 샘플 중 상기 서열을 검출하는 것이 상기 샘플 중 콩 계통 MON87769 DNA의 존재에 대한 진단 표지가 된다. 그러한 연접부 서열은 적어도 서열 1 및/또는 서열 2 및/또는 그의 상보체를 포함한다. 이러한 DNA 분자를 포함하는 대두 계통 MON87769 및 대두 종자가 본 발명의 한 측면이다.

대두 계통 MON87769로부터 신규한 트랜스진/게놈 삽입 영역, 서열 3[C], 서열 4[D] 및 서열 5[E] 또는 서열 1[A], 서열 2[B] 및 서열 5[E] (또한 도 2 참조)를 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 한 측면이다. 이러한 분자를 포함하는 대두 식물 및 종자 또한 본 발명의 측면이다.

본 발명이 또다른 측면에 따라, DNA 검출 방법에 사용하기 위한 2개의 DNA 분자를 제공하는데, 여기서, 제1 DNA 분자는 서열 3 또는 서열 5의 DNA 분자의 트랜스진 영역의 임의 부위의 적어도 11개 이상의 인접한 폴리뉴클레오티드 및 서열 3의 5' 인접 대두 게놈 DNA 영역의 임의 부위의 길이가 유사한 DNA 분자를 포함하는데, 상기 DNA 분자들은 함께 사용될 때, 앰플리콘을 생산하는 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. DNA 증폭 방법에서 이들 DNA 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은, 앰플리콘이 서열 1을 포함할 경우에는 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 된다. 서열 3 및 서열 5의 어느 부위, 및 서열 1을 포함하는 임의 앰플리콘에 상동성이거나 상보적인, DNA 프라이머에 의해 생산된 임의 앰플리콘이 본 발명의 한 측면이다.

본 발명이 또다른 측면에 따라, DNA 검출 방법에 사용하기 위한 2개의 DNA 분자를 제공하는데, 여기서, 제1 DNA 분자는 서열 4 또는 서열 5의 DNA 분자의 트랜스진 영역의 임의 부위의 적어도 11개 이상의 인접한 폴리뉴클레오티드 및 서열 4의 3' 인접 대두 게놈 DNA의 임의 부위의 길이가 유사한 DNA 분자를 포함하는데, 상기 DNA 분자들은 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. DNA 증폭 방법에서 이들 DNA 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은, 앰플리콘이 서열 2를 포함할 경우에는 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 된다. 서열 4 및 서열 5의 어느 부위, 및 서열 2를 포함하는 임의 앰플리콘에 상동성이거나 상보적인, DNA 프라이머에 의해 생산된 임의 앰플리콘이 본 발명의 한 측면이다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 샘플 중 대두 계통 MON87769에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 대두 계통 MON87769로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 서열 1 및/또는 서열 2를 포함하는 상기 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 측면은 게놈 DNA가 약 1번 위치에서부터 998번 위치까지의 서열 3의 뉴클레오티드 서열, 약 1번 위치에서부터 7367번 위치까지의 서열 5의 뉴클레오티드 서열, 및 약 1번 위치에서부터 939번 위치까지의 서열 4의 뉴클레오티드 서열 (그의 콘틱은 서열 6으로서 제시되어 있다) 및 그의 상보체로 본질적으로 구성된 DNA 분자를 포함하는 것인, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물이다. 대두 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있다. 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물로부터 단리된 게놈 DNA가 서열 1 및/또는 서열 2 및 그의 상보체를 혼입하고 있는 DNA 분자를 포함하는, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물 또한 본 발명의 한 측면이다.

본 발명의 추가의 측면은 게놈 DNA가 약 1번 위치에서부터 9294번 위치까지의 서열 6의 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 구성된 DNA 분자 및 그의 상보체를 포함하는 것인, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물이다. 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물로부터 단리된 게놈 DNA가 서열 1 및/또는 서열 2 및 그의 상보체를 혼입하고 있는 DNA 분자를 포함하는, 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물 또한 본 발명의 한 측면이다.

본 발명이 또다른 측면은 MON87769의 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물로부터 단리된 게놈 DNA가 DNA 증폭 방법에서 앰플리콘을 생산하고, 여기서, 상기 앰플리콘은 서열 1 및/또는 서열 2를 포함하는 것인, MON87769의 대두 식물, 또는 종자, 또는 상기 식물 또는 종자로부터 유래된 생성물이다.

본 발명의 또다른 측면은, (a) DNA를 포함하는 샘플을, 엄격한 혼성화 조건 하에서 대두 계통 MON87769로부터의 게놈 DNA와는 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에서 대조군 대두 식물과는 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 상기 샘플 및 상기 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계; 및 (c) 서열 1 및/또는 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 프로브와 대두 계통 MON87769 DNA와의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 MON87769 계통에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법이다.

본 발명이 또다른 측면은 (a) 대두 DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 형광 신호를 방출하면서, 프라이머 SQ5923 및 SQ5924 및 6FAM™-표지된 프라이머/프로브, PB2511의 조합물로부터 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 제1 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트 SQ5923 (서열 8), SQ5924 (서열 9), SQ5925 (서열 11), 및 프로브 세트 6FAM™-표지된 PB2511 (서열 10) 및 VIC™-표지된 PB2512 (서열 12)와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 (d) 대두 DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 형광 신호를 방출하면서, 대두 계통 MON87769로서 확인되는 트랜스진 삽입의 대두 게놈 영역에 상동성인 야생형 대두 게놈 DNA에 대한 진단 표지가 되는 제2 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트, SQ59224 및 SQ5925, 및 VIC™-표지된 프로브, PB2512와 접촉시키는 단계; (e) 핵산 증폭 반응을 수행하여 제2 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (f) 제2 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 (g) 샘플 중 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘을 비교하여, 두 앰플리콘 모두가 존재한다면 이는 상기 샘플이 트랜스진 삽입에 대하여 이형접합성이라는 것을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 대두 계통 MON87769의 자손의 접합성을 측정하는 방법이다.

본 발명이 또다른 측면은 (a) 대두 DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 대두 계통 MON87769로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 프라이머 SQ5923 및 SQ5924의 조합물로부터 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 제1 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트 SQ5923 (서열 8), SQ5924 (서열 9), 및 SQ5925 (서열 11)와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 (d) 대두 DNA를 포함하는 샘플을, 핵산 증폭 반응에서 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 사용될 때, 프라이머 SQ5924 및 SQ5925의 조합물로부터 대두 계통 MON87769로서 확인되는 트랜스진 삽입의 대두 게놈 영역에 상동성인 야생형 대두 게놈 DNA에 대한 진단 표지가 되는 제2 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트, SQ59224 및 SQ5925와 접촉시키는 단계; (e) 핵산 증폭 반응을 수행하여 제2 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (f) 제2 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 (g) 샘플 중 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘을 비교하여, 두 앰플리콘 모두가 존재한다면 이는 상기 샘플이 트랜스진 삽입에 대하여 이형접합성이라는 것을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물의 자손의 접합성을 측정하는 방법이다.

서열 3, 서열 4 및 서열 5로부터 디자인된 프라이머를 사용하는, 대두 계통 MON87769 검출용 키트를 제공한다. 앰플리콘이 (1) 서열 1 또는 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하거나, (2) 서열 1 및 서열 2, 둘 모두를 포함할 때, 상기 키트를 사용하여 생산된 앰플리콘은 MON87769에 대한 진단 표지가 된다.

본 발명이 또다른 측면은 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물, 또는 종자, 또는 종자 자손, 또는 상기 식물 또는 식물의 종자로부터 유래된 생성물이다. 특정 실시태양에서, 대두 계통 MON87769를 대두 식물 게놈 내로 유전자이입시키는 단계를 포함하는, PUFA 함량이 변경된 것을 포함하는 대두 식물 제조 방법 (여기서, 형질전환 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있다) 또한 제공한다.

상품을 식재 또는 제조하기 위한 시판용 종자가 본 발명의 한 측면이다. 그러한 상품으로는 전체 또는 공정처리된 콩 종자, 동물 먹이 사료, 식물성 오일, 굵은 가루, 고운 가루, 비독성 플라스틱, 인쇄 잉크, 활택제, 왁스, 유압유, 변압기 유동체, 용제, 화장품, 모발 관리 제품, 두유, 콩 너트 버터, 나토, 템페, 콩 단백질 농축액, 콩 단백질 단리물, 조직콩 단백질 농축액, 가수분해된 콩 단백질, 휘핑 토핑, 조리용 오일, 샐러드 오일, 쇼트닝, 레시틴, 식용 통대두(생것, 구운 것, 또는 에다마메), 두유, 콩 요거트, 콩 치즈, 두부, 유바 및 바이오디젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 전술한 내용들과 다른 측면들은 하기의 상세한 설명과 첨부되는 도면으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1. 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물을 생성하는 데 사용된 이진 형질전환 벡터 pMON77245 지도.
도 2. 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물의 게놈 중 트랜스제닉 삽입체의 조직 구도; [A]는 서열 3과 서열 5 사이의 연접부를 형성하는 서열 1의 상대적인 위치에 상응하고; [B]는 서열 4와 서열 5 사이의 연접부를 형성하는 서열 2의 상대적인 위치에 상응하고; [C]는 계통 MON87769의 게놈 내로 통합된 발현 카세트의 임의로 지정된/지칭된 5' 말단 측면에 위치하는 대두 게놈 서열인, 서열 3의 상대적인 위치에 상응하고; [D]는 계통 MON87769의 게놈 내로 통합된 발현 카세트의 임의로 지정된/지칭된 3' 말단 측면에 위치하는 대두 게놈 서열인, 서열 4의 상대적인 위치에 상응하고; [E]는 계통 MON87769를 포함하는 식물의 게놈 내로 삽입된 발현 카세트의 서열인, 서열 5를 포함하는 다양한 요소들을 나타하고; [F]는 도면에 나타낸 바와 같이, 좌측에서 우측으로 서열 3, 서열 5 및 서열 4를 포함하며, 여기서 서열 1 및 서열 2는 상기 설명된 바와 같이 혼입되어 있는 것인 (이들 서열들은 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물의 게놈에 제시되어 있는 바와 같다) 인접한 서열을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열 1 - 대두 게놈 DNA와 통합된 발현 카세트 사이의 우측 경계 연접부를 나타내는 20개의 뉴클레오티드 서열. 상기 서열은 서열 6의 979번 위치에서부터 998번 위치까지에 상응한다. 추가로, 서열 1 (도 2의 [A])은 서열 3 ([C], 도 2 참조)의 979번 위치에서부터 988번 위치까지에 상응하고, 서열 5 ([E], 도 2 참조)의 1번 위치에서부터 10번 위치까지에 상응하는 데세츄라제 발현 카세트의 통합된 우측 경계에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2 - 통합된 발현 카세트와 대두 게놈 DNA 사이의 좌측 경계 연접부를 나타내는 20개의 뉴클레오티드 서열. 상기 서열은 서열 6의 8346번 위치에서부터 8365번 위치까지에 상응한다. 추가로, 서열 2 ([B], 도 2 참조)는 서열 5 ([E], 도 2 참조)의 7358번 위치에서부터 7367번 위치까지에 상응하고, 서열 4 ([D], 도 2 참조)의 1번 위치에서부터 10번 위치까지에 상응하는 3' 인접 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 3 - T-DNA 삽입 영역까지 (상기 영역 포함)의 MON87769의 삽입된 DNA 측면에 위치하는 5' 서열.
서열 4 - T-DNA 삽입 영역까지 (상기 영역 포함)의 MON87769의 삽입된 DNA 측면에 위치하는 3' 서열.
서열 5 - 통합 이후의 통합된 데세츄라제 발현 카세트 서열 (우측 및 좌측 경계 서열 포함).
서열 6 - MON87769의 삽입된 DNA 측면에 위치하는 5' 서열 (서열 3), 통합된 발현 카세트 서열 (서열 5), 및 MON87769의 삽입된 DNA 측면에 위치하는 3' 서열 (서열 4)의 콘틱을 나타내는, 9294 bp 뉴클레오티드 서열.
서열 7 - pMON77245의 데세츄라제 발현 카세트.
서열 8 - MON87769 계통 뿐만 아니라, MON87769 계통의 접합성을 확인하는 데 사용된 프라이머 SQ5923. 프라이머 SQ5923은 서열 6의 944번 위치에서부터 968번 위치까지에 상응하는 우측 T-DNA 삽입 경계에 근접해 있는 삽입된 데세츄라제 카세트의 5' 측면에 위치하는 영역에 상응한다. 프라이머 SQ5923 및 SQ5924의 조합물을 사용한 PCR 앰플리콘은 계통 MON87769의 존재에 대하여 양성을 띤다.
서열 9 - MON87769 계통 뿐만 아니라, MON87769 계통의 접합성을 확인하는 데 사용된 프라이머 SQ5924. 프라이머 SQ5924는 서열 6의 1007번 위치에서부터 1025번 위치까지에 상응하는 우측 T-DNA 삽입 경계에 근접해 있는 삽입된 데세츄라제 카세트의 5' 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ5923 및 SQ5924의 조합물을 사용한 PCR 앰플리콘은 계통 MON87769의 존재에 대하여 양성을 띤다.
서열 10 - MON87769 계통을 확인하는 데 사용된 프로브 PB2511. 상기 프로브는 그의 서열이 서열 6의 986번 위치에서부터 1005번 위치까지에 상응하는 것인, 6FAM™-표지된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 6FAM™-표지된 프로브 PB2511과 함께 프라이머 SQ5923 및 SQ5924를 사용한 증폭 반응에서 형광 신호의 방출이 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 된다.
서열 11 - MON87769 계통의 접합성을 확인하는 데 사용된 프라이머 SQ5925. 프라이머 SQ5925는 서열 6의 8372번 위치에서부터 8395번 위치까지에 상응하는 좌측 T-DNA에 근접해 있는 삽입된 발현 카세트 측면에 위치하는 3' 영역에 상보적이다. 6FAM™-표지된 프로브 PB2512 및 프라이머 SQ5923 및 SQ5925를 사용한 PCR 앰플리콘의 검출은 접합성 분석에서 야생형의 존재에 대해 양성을 띤다.
서열 12 - MON87769 계통의 접합성을 확인하는 데 사용된 프로브 PB2512. 상기 프로브는 그의 서열이, 계통 MON87769에 대한 발현 카세트의 삽입 지점의 프라이머 SQ5925에 상동성인 영역 바로 다음에 오는 야생형 게놈 DNA의 영역에 상응하는 것인, VIC™-표지된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머 SQ5924 및 SQ5925를 사용하여 생산된 PCR 앰플리콘은 프로브 PB1112를 사용하여 형광 신호를 방출시키고, 이는 계통 MON87769에 대한 접합성 분석에서 야생형 대립유전자의 존재에 대해 양성을 띤다.

바람직한 실시태양에 대한 상세한 설명

본 발명은 스테아리돈산 (SDA)을 포함하는 오일 조성물과 함께, 계통 MON87769를 포함하는 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스(Glycine max)) 식물, 및 그의 종자 및 자손에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 대두 계통 MON87769에 삽입된 DNA 작제물, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물 또는 종자에서 발견되는 트랜스진/게놈 삽입 영역, 및 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물 또는 종자, 및 그의 자손에서 트랜스진/게놈 삽입 영역의 검출 방법에 관한 것이다.

하기의 정의와 방법은 본 발명을 더욱 명확하게 정의하고, 본 발명의 실시에서 당업계의 숙련인을 이해시키기 위하여 제공된다. 달리 언급하지 않는 한, 용어는 관련 분야에서 당업계의 숙련인에 의한 일반적인 용법에 따라 이해될 것이다. 또한, 분자생물학의 일반적 용어의 정의는 또한 문헌 ([Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991]; 및 [Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994])에서도 살펴볼 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "대두"라는 용어는 글리신 맥스를 의미하며, 대두 야생종 뿐만 아니라, 종간 교배를 허용하는 글리신 소야(Glycine soja)에 속하는 식물을 비롯한, 대두와 교배될 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "~을 포함하는"이라는 용어는 "~을 포함하나, 이에 한정하지 않는"이라는 의미를 갖는다.

"글리포세이트"는 N-포스포노메틸글리신 및 그의 염을 지칭한다. N-포스포노메틸글리신은 광범위한 스펙트럼의 식물 종에 대해 활성을 갖는 주지된 제초제이다.

"데세츄라제"는 하나 이상의 지방산의 연속되는 탄소 사이에 이중 결합을 불포화시키거나, 그러한 이중 결합 형성을 촉매화시켜 단가불포화 및 다가불포화 지방산을 생산하는 폴리펩티드 또는 그의 전구체를 지칭한다. OA→LA, LA→ALA, 또는 ALA→SDA의 전환을 촉매화시킬 수 있는 폴리펩티드로서, 12번, 15번, 또는 6번 위치에서 불포화시키는 것인 효소를 포함하는 폴리펩티드가 특히 관심의 대상이 된다. 데세츄라제 활성을 갖는 특이적인 폴리펩티드를 선택함에 있어 고려해야 할 사항으로는 폴리펩티드의 최적의 pH, 폴리펩티드가 속도 제한형 효소 또는 그의 성분인지 여부, 사용되는 데세츄라제가 원하는 PUFA의 합성에 필수적인 것인지 여부, 및/또는 공-인자가 폴리펩티드가 필요로 하는 것인지 여부를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 발현된 폴리펩티드는 바람직하게 숙주 세포에서 그가 위치하는 곳의 생화학적 환경과 화합성인 특징을 갖는다. 예를 들면, 폴리펩티드는 기질(들)에 대해 경쟁해야 할 수 있다.

"상품"은 대두 또는 대두유로부터 유래된 물질로 구성되고, 소비자에게 판매되는 임의의 생성물을 지칭한다. 공정처리된 대두는 전 세계에서 단백질 먹이 사료 및 식물성 오일의 가장 큰 공급원이다. 대두 식물 MON87769를 사용하여 전형적으로는 콩으로부터 획득할 수 있는 상품을 제조할 수 있다. 하기 언급하는 바와 같이, 대두 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있다. MON87769의 대두는 굵은 가루, 고운 가루, 또는 오일로 공정처리될 수 있을 뿐만 아니라, 육상 및 수상 동물, 둘 모두에 대한 동물 먹이 사료에서 단백질 또는 오일 공급원으로서 사용될 수 있다. 계통 MON87769을 포함하는 식물, 식물 부분, 또는 종자로부터의 대두 및 대두유를, 제한하는 것은 아니지만, 비독성 플라스틱, 인쇄 잉크, 활택제, 왁스, 유압유, 변압기 유동체, 용제, 화장품, 및 모발 관리 제품과 같은 다수의 상이한 제품 제조에 사용할 수 있다. 계통 pMON87769을 포함하는 식물, 식물 부분, 또는 종자로부터의 대두 및 오일은 통대두로부터 제조된 각종 콩식품, 예로서, 두유, 콩 너트 버터, 나토, 및 템페, 및 대두 굵은 가루, 콩 고운 가루, 콩 단백질 농축액, 콩 단백질 단리물, 조직콩 단백질 농축액, 가수분해된 콩 단백질, 휘핑 토핑, 조리용 오일, 샐러드 오일, 쇼트닝, 및 레시틴을 비롯한, 공정처리된 대두 및 대두유로부터 제조된 콩식품에 사용하기에 적합할 수 있다. 통대두 또한 식용될 수 있고, 이는 전형적으로는 날것, 구운 것 또는 에다마메로서 소비자에게 판매된다. 전형적으로는 통대두를 침지시키고 분쇄시킴으로써 생산이 되는 두유는 기타 다른 공정처리없이 소비되거나, 분무 건조되거나, 공정처리됨으로써 콩 요거트, 콩 치즈, 두부, 또는 유바를 형성할 수 있다.

MON87769의 오일은 바이오디젤을 제조하는 데 사용될 수 있다. 통상의 디젤 엔진에 바이오디젤을 사용하게 되면 석유 디젤 연료와 비교하였을 때, 오염 물질, 예로서, 황산염, 일산화탄소, 및 미립자가 상당 수준 감소하게 되고, 스쿨 버스에 사용하게 되면 독성 디젤 배기 가스에의 노출은 현저히 감소할 수 있다. 바이오디젤은 전형적으로는 대두유를 추출, 여과, 및 정련하여 유리 지방 및 인지질을 제거한 후, 메틸과의 에스테르 교환 반응을 거쳐 지방산 메일 에스테르를 형성함으로써 수득된다 (예를 들면, 미국 특허 번호 제5,891,203호 참조). 생성된 콩 메틸 에스테르를 통상 "바이오디젤"이라 칭한다. 계통 MON87769를 포함하는 식물, 식물 부분, 또는 종자로부터 유래된 오일 또한 예를 들면, 아세탈을 상기 오일과 함께 혼합함으로써 메틸 에스테르를 형성할 필요없이 디젤 연료로서 사용할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 번호 제6,013,114호). 상기 오일을 제조하는 데 사용된 계통 MON87769를 포함하는 식물, 식물 부분, 또는 종자의 종자는 본 발명의 방법에 의해 확인할 수 있다. MON87769 계통 종자, 또는 그 전부가 또는 그 일부가 MON87769인 종자의 혼합물로부터 정제된 오일은 시험에 이용할 수 있는 DNA를 상대적으로 거의 갖고 있지 않거나, 전혀 갖지 않을 것이라고 예측된다. 그러나, 오일이 추출된 종자는 상기 오일 제조에 사용된 종자 군집 내 MON87769 계통의 존재를 확인하는 본 발명의 방법을 통해 특징이 규명될 수 있다. 또한, 상기 오일을 제조하는 데 사용된 공정처리로부터 나온 식물 폐기물도 상기 오일 제조에 사용된, 공정처리된 식물 또는 종자 혼합물 내 MON87769 계통을 포함하는 식물, 식물 부분, 또는 종자의 존재를 확인하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 유사하게, 상품 제조 후에 남거나, 또는 대두 종자 수확 이후에 남은 식물 잔재물은 상기 상품 제조에 사용된 원료 내에 MON87769 계통을 확인하는 본 발명의 방법을 통해 특징이 규명될 수 있다.

트랜스제닉 "계통"은 식물 세포를 이종성 DNA, 즉, 관심의 대상이 되는 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물로 형질전환시키고, 식물의 게놈 내로 트랜스진을 삽입함으로써 얻어지는 식물 군집의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선별에 의해 생산된다. "계통"이라는 용어는 이종성 DNA를 포함하는 원 형질전환체 및 상기 형질전환체의 자손을 지칭한다. 또한, "계통"이라는 용어는 이종성 DNA를 포함하는 형질전환체와 또다른 변종 사이의 유성 이계교배에 의해 생산되는 자손을 지칭한다. 반복친에 대한 반복된 역-교배 후에도, 형질전환된 모체로부터의 삽입된 DNA 및 인접 DNA는 교배 자손에서도 동일한 염색체 위치에 존재한다. "계통"이라는 용어는 또한 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 모계 (예로서, 원 형질전환체 및 자가수분에 의한 자손)와 삽입된 DNA를 포함하지 않는 하나의 모계 사이의 교배 결과로서 관심의 대상이 되는 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손에게 전달될 것으로 기대되는 상기 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA 바로 옆, 인접 게놈 서열을 포함하는 원 형질전환체로부터의 DNA를 지칭한다. 본 발명은 계통 MON87769, 및 계통 MON87769를 포함하는 식물 세포, 조직, 종자 및 식물 조직으로부터 유래된 공정처리된 생성물에 대해 독특하거나, 그에 대한 진단 표지가 되는 DNA 서열에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "단리된 DNA 분자"라고 지칭될 때의 DNA 분자는 단독으로 또는 기타 다른 조성물과 함께 조합하여 그의 천연 환경 내 위치가 아닌 위치에 존재하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 대두 게놈의 DNA 내에서 천연적으로 발견되는 코딩 서열, 인트론 서열, 비번역 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등은 그들이 대두 게놈 내에 존재하는 한, 상기 게놈으로부터 단리된 것으로 간주되지 않는다. 그러나, 구조 및 성분들이 대두 게놈 내에 존재하지 않는 한, 이들 성분들, 및 이들 성분들의 하위부분들 각각은 본 개신 내용 범주 내에 포함되는 "단리된" 것이 될 것이다. 유사하게, 프리물라 줄리아에(Primula juliae) 델타 6 데세츄라제 단백질 또는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 델타 15 데세츄라제 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 그 구조가 최초로 관찰되었던 유기체 (P. 줄리아에 또는 N. 크라사)의 DNA 내에 그 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는 한, 단리된 뉴클레오티드 서열이 될 것이다. 천연 N. 크라사 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열과 동일 아미노산 서열 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 인공 뉴클레오티드 서열이 본 개시의 목적을 위해 단리된 것으로 간주될 것이다. 본 개시의 목적을 위해, 임의의 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열, 즉, 대두 식물 계통 MON87769의 세포의 게놈 내로 삽입된 DNA의 뉴클레오티드 서열은 MON87769 계통의 발생 기원이 되는 대두 세포를 형질전환시키는 데 사용된 플라스미드 내에 존재하든, 계통 MON87769의 게놈 내에 존재하든, 계통 MON87769로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 상품으로 검출가능한 양으로 존재한다면 단리된 뉴클레오티드 서열로 간주될 것이다. 따라서, DNA 분자가 식물 또는 종자 또는 식물 기관으로부터의 세포, 조직, 또는 균질액으로부터 추출될 수 있거나; 또는 식물 또는 종자 또는 식물 기관으로부터의 세포, 조직, 또는 균질액으로부터 추출된 DNA 또는 RNA로부터 앰플리콘으로서 생산될 수 있다면 (여기서, 상기 식물 또는 종자 또는 식물 기관 중 어느 것이든 계통 MON87769로부터 유래된 물질로부터 유래된 것이다), 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 임의의 단편은 단리된 것이거나, 단리될 수 있는 것으로 간주될 것이다. 이와 관련해서, 서열 1 및 서열 2에 기재된 연접부 서열, 및 이들 연접부 서열 또한 포함하는, 계통 MON87769로부터 유래된 뉴클레오티드 서열은, 상기 서열이 계통 MON87769의 세포의 게놈 내 존재하든, 또는 계통 MON87769로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 상품 중에 검출가능한 양으로 존재하든 간에, 단리된 것이거나, 단리될 수 있는 것으로 간주된다.

또한, 독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 포함하는 자손을 얻기 위하여 2개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배시킬 수 있다고 이해되어야 한다. 적절한 자손의 자가수분은 첨가된 두 외인성 유전자가 동형접합성인 식물을 생산할 수 있다. 또한, 영양 번식과 같이, 모체 식물과의 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배가 고려된다. 다른 특질 및 작물들에 일반적으로 사용되는 다른 육종 방법의 설명은 여러 참고문헌 중 하나인, 문헌 [Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)]에서 살펴볼 수 있다.

"프로브"는 통상의 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예를 들어, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소가 부착된 분리된 핵산이다. 이러한 프로브는 표적 핵산의 하나의 스트랜드에, 본 발명의 경우에는, 대두 식물이든, 계통 MON87769로부터의 DNA를 포함하는 샘플이든지 간에, 대두 계통 MON87769로부터의 게놈 DNA의 하나의 스트랜드에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하여, 그러한 결합이 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 다른 프로브 물질을 포함한다.

"프라이머"는 핵산 혼성화에 의하여 상보적인 표적 DNA 스트랜드에 어닐링되어 프라이머와 표적 DNA 스트랜드 간에 하이브리드를 형성한 후, 중합효소, 예를 들어, DNA 중합효소에 의하여 표적 DNA 스트랜드를 따라 연장되는 단리된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 종래의 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 이들의 사용을 나타낸다.

프로브 및 프라이머는 일반적으로 11개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는, 18개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는, 24개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 고도로 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 표적 서열과는 다르지만, 표적 서열에 혼성화할 수 있는 능력을 보유하는 프로브가 종래의 방법으로 디자인될 수 있지만, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 유사성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 임의의 하나 이상의 서열 1-6 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 프라이머, 프라이머 쌍, 또는 프로브는 뉴클레오티드 합성, 클로닝, 증폭, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자를 생산하는 기타 다른 표준 방법에 의해 서열 1-6으로부터 "유래"될 수 있다. 유사하게, 서열 1-6 중 어느 것으로부터 유래되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 그에 대해 상보적인 서열은 주지되어 있는 바와 같이 (예로서, 문헌 [Wojciech and Rhoads, NAR 17:8543-8551, 1989]), 인실리코 분석을 통해 선택될 수 있다.

프로브 및 프라이머의 제조 방법 및 사용 방법은 예를 들면, 문헌 ([Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (이하, "Sambrook et al., 1989")]; [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (주기적으로 업데이트됨) (이하, ["Ausubel et al., 1992")]; 및 [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990])에 기재되어 있다. PCR-프라이머 쌍은 예를 들면, 이러한 목적을 위하여 개발된 프라이머(Primer) (Version 0.5, (c) 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.

본원에 개시된 인접 DNA와 삽입된 서열을 기초로 한 프라이머 및 프로브는 종래의 방법들, 예를 들어, 재-클로닝 및 상기 서열들의 서열 분석에 의하여 개시된 서열을 확인 (및, 만약 필요하다면, 수정)하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에서 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 종래 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 중 트랜스제닉 계통의 DNA의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 환경하에서 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 만약 두 핵산 분자가 역-평행의 더블-스트랜드 핵산 구조를 형성할 수 있다면, 두 핵산 분자는 서로 특이적으로 혼성화할 수 있다는 것을 나타낸다. 만약, 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내면, 핵산 분자는 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 분자의 각 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드와 상보성일 때, 분자는 "완전한 상보성"을 나타낸다고 말할 수 있다. 만약, 두 분자가 적어도 통상의 "낮은-엄격성" 조건 하에서 서로가 어닐링된 상태로 유지될 수 있도록 허용하는 충분히 안정성을 가지고 서로 혼성화할 수 있다면, 두 분자는 "최소 상보성"을 나타낸다고 말할 수 있다. 유사하게, 만약 두 분자가 통상의 "높은-엄격성" 조건 하에서 서로가 어닐링된 상태로 유지될 수 있도록 허용하는 충분히 안정성을 가지고 서로 혼성화할 수 있다면, 두 분자는 상보성"을 나타낸다고 말할 수 있다. 통상의 엄격성 조건은 문헌 ([Sambrook et al., 1989], 및 [Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)])에 기재되어 있다. 따라서, 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것도 더블-스트랜드 구조를 형성할 수 있는 분자의 능력을 완전히 방해하지 않는 한, 허용될 수 있다. 핵산 분자를 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여, 사용되는 특정 용매 및 염 농도하에서 안정한 더블-스트랜드 구조를 형성할 수 있게 하기 위한 서열의 충분한 상보성만이 필요하다.

본원에서 사용되는 바, 실질적으로 상동성인 서열은 고도로 엄격한 조건 하에서 핵산 서열과 비교되는 상보체에 특이적으로 혼성화할 핵산 서열이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)으로 처리 후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는, DNA 혼성화를 촉진시키는 데 적합한 엄격성 조건은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 고도로 엄격한 정도까지로 선택될 수 있다. 추가적으로, 상기 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 고도로 엄격한 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염, 두가지 모두가 달라질 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도 중 하나를 일정하게 유지하면서, 다른 하나를 변화시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 중간 정도의 엄격한 조건, 예를 들어, 약 2.0 x SSC 및 약 65℃에서, 서열 1 및 2에 기재된 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 상보체 또는 그 중 어느 것의 단편에 특이적으로 혼성화할 것이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 고도로 엄격한 조건 하에서 서열 1 및 서열 2에 기재된 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 상보체 또는 단편에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열 1 및 서열 2에 기재된 핵산 서열 또는 그의 상보체 또는 그 중 어느 것의 단편을 갖는다. 본 발명의 또다른 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열 1 및 서열 2에 기재된 핵산 서열 또는 그의 상보체 또는 그 중 어느 것의 단편과 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 912％, 92％, 93％, 94$, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 및 100％의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가의 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 마커 핵산 분자는 서열 1 및 서열 2에 기재된 핵산 서열 또는 그의 상보체 또는 그 중 어느 것의 단편과 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 및 100％의 서열 동일성을 공유한다. 서열 1 및 서열 2는 문헌 (["DNA markers: Protocols, applications, and overviews", pp. 173-185], [Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY, 1997] (이들 모두 본원에서 참고로 인용된다)에서 단순 반복 서열 DNA 마커 분석법에 대해 기술된 방법과 유사한, 유전적 교배의 자손을 확인하기 위한 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자와 프로브의 혼성화는 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그, 및 화학발광 태그를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 방법들에 의해 검출될 수 있다.

(예를 들면, PCR에 의한) 특정 증폭 프라이머 쌍을 사용한 표적 핵산 서열의 증폭과 관련하여, "엄격한 조건"이란 DNA 열 증폭 반응에서, 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 상보체)을 갖는 프라이머가 표적 핵산 서열에 결합하여, 바람직하게는, 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생산하도록, 프라이머 쌍이 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 허용하는 조건이다.

용어 "(표적 서열)에 특이적"이라는 것은 엄격한 혼성화 조건 하에서 프로브 또는 프라이머가 표적 서열을 포함하는 샘플 중 표적 서열에만 혼성화하는 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 부분인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들면, 유성 교배로부터 얻은 대두 식물이 본 발명의 대두 식물로부터의 트랜스제닉 계통 게놈 DNA를 포함하는지 여부를 측정하기 위하여, 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA는 계통 DNA의 존재에 대하여 진단성인 앰플리콘을 생산하기 위해, 삽입된 이종성 DNA의 삽입 위치에 인접한 식물의 게놈 내의 인접 서열로부터 유래된 하나의 프라이머, 및 상기 삽입된 이종성 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용시킴으로써 계통 DNA의 존재에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산할 수 있다. 앰플리콘은 계통에 대하여 에 대한 진단 표지가 되는 임의의 길이이고, 그러한 서열을 갖는다. 앰플리콘의 길이는 프라이머 쌍과 하나의 뉴클레오티드 염기 쌍, 바람직하게는, 약 50개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 보다 바람직하게는, 약 250개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 및 가장 바람직하게는, 약 450개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합된 길이 범위일 수 있다. 별법으로, 전장 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘을 생산하기 위하여, 프라이머 쌍은 삽입된 DNA의 양 측면의 인접 서열로부터 유래될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 멤버는 삽입된 DNA 분자로부터 떨어져 위치할 수 있는데, 이러한 거리는 하나의 뉴클레오티드 염기 쌍으로부터 최대 약 2만 뉴클레오티드 염기 쌍까지의 범위일 수 있다. "앰플리콘"이라는 용어를 사용하는 것은 특히 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이합체를 배제한다.

핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 비롯한, 당업계에서 공지된 다양한 핵산 증폭 방법 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업자에 공지되어 있으며, 특히, 미국 특허 번호 제4,683,195호 및 제4,683,202호, 및 문헌 [PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al, Academic Press, San Diego, 1990]에 기재되어 있다. PCR 증폭 방법은 최대 22kb의 게놈 DNA 및 최대 42kb의 박테리오파아지 DNA를 증폭시킬 정도로 발전되어 있다 (문헌 [Cheng et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:5695-5699, 1994]). DNA 증폭 분야에 공지된 상기 방법 뿐만 아니라, 기타 다른 방법들도 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물 또는 종자 조직으로부터의 이종성 DNA 삽입체의 서열 또는 인접 서열은 본원에서 제공된 서열들로부터 유래된 프라이머를 사용하여 상기 계통으로부터 이들 서열을 증폭시킨 후, PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 서열 분석에 의하여 확인 (및 만약 필요하다면 수정)될 수 있다.

이러한 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 여러 기법에 의하여 검출될 수 있다. 이러한 하나의 방법은, DNA 올리고뉴클레오티드가 옆에 있는 인접 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 모두에 중첩되도록 디자인된, 제네틱 비트(Genetic Bit) 분석법이다 (문헌 ([Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994]). 상기 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰 중에 고정화된다. (삽입된 서열에서 하나의 프라이머와 옆에 있는 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머를 사용하여) 관심의 대상이 되는 영역의 PCR을 수행한 후에는, 싱글-스트랜드 PCR 생성물은 고정화된 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있으며, DNA 중합효소와 기대되는 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 사용한 단일 염기 확장 반응을 위한 기질로서의 역할을 한다. 판독은 형광 또는 ELISA에 기초하여 수행될 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 의한 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.

또다른 방법은 문헌 [Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)]에 기재된 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기법이다. 이러한 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 게놈 DNA 및 삽입체 DNA 연접부에 중첩되도록 디자인한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 영역으로부터의 싱글-스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 설푸릴라제, 루시페라아제, 아피라아제, 아데노신 5' 포스페이트 및 루시페린의 존재하에서 인큐베이션시킨다. dNTP들을 개별적으로 첨가하고, 광신호로 혼입 결과를 측정한다. 광신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 확장에 의한 트랜스진 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.

문헌 [Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999)]에 기재된 형광 편광법은 본 발명의 앰플리콘을 검출하는 데 사용될 수 있는 방법이다. 이 방법을 사용하여, 게놈 인접 및 삽입된 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 영역으로부터의 싱글-스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 DNA 서열에서 하나의 프라이머)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지된 ddNTP의 존재하에서 인큐베이션시킨다. 단일 염기 확장에 의해 ddNTP가 혼입된다. 혼입은 형광계를 사용하여 편광의 변화로 측정된다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 의한 트랜스진 삽입/인접 서열의 존재를 나타낸다.

택맨(TaqMan)® (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems))는 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법으로서 설명되며, 제조사가 제공하는 설명서를 통하여 완전히 이해될 수 있다. 간략하면, 게놈 인접 및 삽입체 DNA 연접부에 중첩되도록 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재하에서 사이클링한다. FRET 프로브의 혼성화 결과로 FRET 프로브 상의 소광 부분으로부터 형광 부분이 절단되고 방출된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 인접/트랜스진 삽입 서열의 존재를 나타낸다.

분자 비콘(Molecular Beacons)은 문헌 [Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303-308, 1996)]에 기재된 바와 같이, 서열 검출 용도를 위하여 설명되어 있다. 간략하면, 인접 게놈 및 삽입체 DNA 연접부에 중첩되도록 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인한다. FRET 프로브의 독특한 구조로 인해, 상기 FRET 프로브는 형광 및 소광 부분이 매우 근접하게 유지되는 2차 구조를 갖게 된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 인접 게놈 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재하에서 사이클링한다. 성공적인 PCR 증폭 후, FRET 프로브가 표적 서열에 혼성화함으로써 프로브 2차 구조가 제거되고, 형광 및 소광 부분의 공간적인 분리가 일어나고, 그 결과 형광 신호가 발생된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 인접/트랜스진 삽입체 서열의 존재를 나타낸다.

미세 유체 공학적 기법(Microfluidics)(미국 특허 공개 2006068398, 미국 특허 번호 제6,544,734호)과 같은, 기타 다른 공지된 방법들은 DNA 샘플을 분리 및 증폭하는 방법 및 장치을 제공한다. 특정 DNA 분자를 검출 및 정량하기 위하여 광학적 염료가 사용된다 (WO/05017181). 나노튜브 장치 (WO/06024023)는 DNA 분자, 또는 특정 DNA 분자에 결합되어 검출될 수 있는 나노비드의 검출을 위한 전자 센서를 포함한다.

본원에 개시된 조성물과, DNA 검출 분야에 주지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트를 개발할 수 있다. 상기 키트는 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA를 확인하는 데 유용하고, 적절한 계통의 DNA를 포함하는 대두 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 상기 키트는 서열 1 내지 서열 5에 대해 상동성이거나 또는 상보성인 DNA 프라이머 및/또는 프로브, 또는 DNA의 트랜스진 유전 요소에 포함된 DNA에 대해 상동성이거나 상보성인 DNA 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서, 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 게놈 DNA 및 계통 MON87769를 포함하는 대두 게놈내 포함되어 있는 트랜스진 유전 요소의 서열은 하기와 같이 조직화된 2개의 유전자 카세트로 구성된다: 노팔린 우측 경계 서열 다음으로는, 베타-콘글리시닌 저장 단백질 유전자의 글리신 맥스 7S 알파' (알파'-bcsp) 서브유니트로부터의 프로모터와 리더 서열을 포함하는 제1 유전자 카세트 (이는 프리물라 줄리아에 델타 6 데세츄라제의 상류에 위치하고 (WO2005021761 (참고로 인용)), 이는 아그로박테리움(Agrobacterium) 옥토핀-유형 Ti 플라스미드로부터의 tml (종양 형태 대형) 유전자의 3' UTR 상류에 위치한다) 다음으로는, 베타-콘글리시닌 유전자의 글리신 맥스 7S 알파 서브유니트로부터의 프로모터와 리더 서열로 구성된 제2 유전자 카세트 (이는 코돈이 최적화된 네우로스포라 크라사 델타 15 데세츄라제의 상류에 위치하고 (US20060156435, (참고로 인용)), 이는 완두콩 RbcS2 유전자의 3' UTR 상류에 위치한다), 다음으로는 옥토핀 좌측 경계 서열 (예로서, 도 1). DNA 증폭 방법에서 프라이머로서 유용한 DNA 분자는 MON87769 계통에 포함되어 있는 트랜스진 삽입체의 유전 요소의 서열로부터 유래될 수 있다. 이러한 프라이머 분자는 염기 1부터 988까지의 서열 3과, 염기 1부터 939까지의 서열 4에 제시된 바와 같은, 계통 MON87769의 트랜스진 삽입체 측면에 위치하는 게놈으로부터 유래된 DNA 프라이머 분자 또한 포함하는 프라이머 세트의 일부로서 사용될 수 있다.

대두 식물 MON87769는 플라스미드 작제물 pMON77245 (도 1에 제시)를 사용하여 실시되는 대두 순계의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법에 의해 생산되었다. 사용된 형질전환 방법은 미국 특허 5,914,451에 기재된 방법과 유사하다. 플라스미드 작제물 pMON77245는 연결된 식물 발현 카세트와, 대두 식물 세포에서 데세츄라제 단백질의 발현에 필요한 조절 유전 요소를 포함한다. 대두 세포는 온전한 대두 식물로 재생되었고, 식물 발현 카세트의 통합 및 SDA를 포함하는 오일 조성물 뿐만 아니라, 연결되지 않은 글리포세이트 내성 선별 카세트의 손실을 나타내는 각각의 식물을 식물 군집으로부터 선별하였다. pMON77245의 연결된 식물 발현 카세트를 그의 게놈내 포함하는 대두 식물이 본 발명의 한 측면이다.

MON87769로 지칭되는 계통을 포함하는 대두 식물의 게놈 내로 삽입된 플라스미드 DNA의 특징은 자세한 분자 분석에 의해 규명되었다. 이러한 분석으로는 삽입체 수 (대두 게놈내 포함되어 있는 통합 부위 수), 카피수 (하나의 유전자좌내 포함되어 있는 T-DNA의 카피수), 및 삽입된 유전자 카세트의 통합성을 포함한다. 온전한 데세츄라제 코딩 영역 및 그의 각 조절 요소, 프로모터, 인트론, 및 식물 발현 카세트의 폴리아데닐화 서열, 및 플라스미드 pMON77245 골격 DNA 영역을 포함하여, DNA 분자 프로그가 사용되었다. 계통 MON87769를 포함하는 대두 게놈은 단일의 T-DNA 삽입부와 1 카피의 데세츄라제 카세트를 포함한다는 데이타 결과가 나왔다. 형질전환 벡터 pMON77245, 연결 또는 연결되지 않은 온전한 유전자 카세트로부터의 어떤 추가의 요소도 MON87769의 게놈에서는 검출되지 않았다. 최종적으로, 역 PCR 및 DNA 서열 분석을 수행하여 5' 및 3' 삽입체-대-식물 게놈 연접부를 측정하고, 삽입체 내에 포함되어 있는 요소들의 조직 구도를 확인하고 (도 2), 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물 중 삽입체의 완전한 DNA 서열 (서열 5)을 측정하였다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시태양을 입증하기 위하여 포함된 것이다. 하기 실시예에 개시된 기법들은 본 발명자들이 본 발명의 실시에 있어서 가장 잘 기능을 수행하는 것으로 발견한 접근법들인 바, 따라서, 본 발명의 실시를 위한 바람직한 모드의 실시예를 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러나, 본 개시내용에 비추어 볼 때 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이, 개시된 구체적인 실시태양에 대해 다수의 변형이 이루어질 수 있고, 이를 통해서도 동등하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다.

기탁 정보

MON87769로 지칭되는 트랜스제닉 대두 계통을 포함하는 종자 계통 MON87769의 적어도 2500개의 종자를 기탁하였다. 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection)에 기탁하였다. 기탁물의 수탁번호는 ATCC 수탁 번호 PTA-8911이다. 기탁일은 2008년 2월 5일이다. 출원 계류 중 요청시에는 그러한 자격이 있는 당사자에게 기탁물이 열람될 수 있을 것이다. 기탁물은 30년의 기간, 또는 최종 요청일로부터 5년, 또는 더 장기간이더라도 특허존속기간 동안 ATCC 기탁 기관에 보관될 것이며, 상기 기간 동안 필요한 경우 대체될 것이다. 출원인은 본 특허 또는 식물 품종 보호법(Plant Variety Protection Act)(7 U.S.C. 2321 이하 참조)을 비롯한 기타 다른 형태의 품종 보호법 하에 승인받은 그의 권리에 대한 어떤 침해에 대한 어떤 주장도 포기하지 않는다.

실시예

실시예 1

pMON77245 를 사용한 대두 A3525의 형질전환 및 계통 선별

MON87769로 지칭되는 계통을 포함하는 최초의 트랜스제닉 대두 식물은, pMON77245로부터 유래된 DNA 단편을 사용하여 이루어진 대두 세포의 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 생성하였다 (도 1; 미국 특허 출원 공개 번호 제20080063691호 (참고로 인용) 참조). 이진 식물 형질전환 벡터 pMON77245는 2개의 식물 형질전환 카세트 또는 T-DNA를 포함한다. 각 카세트는 각각 형질전환 카세트의 5' 및 3' 말단에서 우측 경계 및 좌측 경계 서열 측면에 위치한다. 발현 카세트 (서열 7)는 2개의 데세츄라제 유전자 발현을 위해 사용된다. 2개의 유전자 카세트는 하기와 같이 조직화되어 있다: 노팔린 우측 경계 서열 다음으로는, 베타-콘글리시닌 저장 단백질 유전자의 글리신 맥스 7S 알파' (알파'-bcsp) 서브유니트로부터의 프로모터와 리더 서열을 포함하는 제1 유전자 카세트 (이는 프리물라 줄리아에 델타 6 데세츄라제의 상류에 위치하고 (WO2005021761 (참고로 인용)), 이는 아그로박테리움 옥토핀-유형 Ti 플라스미드로부터의 tml (종양 형태 대형) 유전자의 3' UTR 상류에 위치한다) 다음으로는, 베타-콘글리시닌 유전자의 글리신 맥스 7S 알파 서브유니트로부터의 프로모터와 리더 서열로 구성된 제2 유전자 카세트 (이는 코돈이 최적화된 네우로스포라 크라사 델타 15 데세츄라제의 상류에 위치하고 (US20060156435, (참고로 인용)), 이는 완두콩 RbcS2 유전자의 3' UTR 상류에 위치한다), 다음으로는 옥토핀 좌측 경계 서열 (예로서, 도 1). 제2 형질전환 카세트는 형질전환 선별가능 마커로서 사용되는 글리포세이트 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.

pMON77245로 형질전환된 외식편은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개 형질전환을 통해서 수득하였다. 형질전환된 조직으로부터 식물이 재생되었다. 발생 중인 뿌리를 샘플링하고, 데세츄라제 카세트 서열 (서열 7)에 기초한 프라이머를 사용하여 데세츄라제 카세트의 존재에 대하여 PCR을 통해 분석하였다. 대략 38개의 R0 형질전환 계통이 생산되었고, 인베이더(Invader)^R (위스콘신주 매디슨 소재의 써드 웨이브 테크놀러지스 인크.(Third Wave Technologies))에 의해 단일 카피의 데세츄라제 카세트 존재에 관하여 시험하였다. 추가로, 연관 써던 블롯 분석법을 사용하여 각 계통 중에 있는 트랜스제닉 유전자좌의 수를 측정하였다. 제한 효소 SwaI를 유전자좌 써던 방법을 위해 선택하였는데, 그 이유는 상기 제한 효소가 데세츄라제 카세트 내에 포함되어 있지 않기 때문이다. 보통은 밀접하게 결합된 트랜스진 카피를 다중 카피수의 계통으로 해리시킬 수 있도록 상기 효소는 충분한 빈도로 대두 게놈에서 절단을 한다. 단일 카피의 데세츄라제 카세트가 삽입되었음을 입증하는 R0 계통을 자가 수분시켜 R1 종자를 생성하였다. FAME-GC 분석법에 의해 R1 종자의 지방산 조성물을 측정하였다. 성숙한 종자에서의 값의 범위는 8-12％ SDA였다. 다음 단계를 수행하기 위해 이러한 분석법에 기초하여 10개의 계통을 선별하였다.

선별된 10개의 R2 식물에 대해 써던 분석법을 수행하여 형질전환 벡터로부터 원치않는 뉴클레오티드 서열의 부재 및 발현 카세트의 존재를 확인하였다. 추가로, 각 계통에 대해 데세츄라제 카세트 삽입부 측면에 위치하는 서열을 측정하였다. 그의 성능상의 특징 및 분자상의 특징 규명에 기초하여 MON87769로 지칭되는 계통을 포함하는 하나의 자손 계통을 선택하였다.

실시예 2

역 PCR 을 사용한 인접 서열의 단리

문헌 [Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.)]에 기재된 역 PCR을 사용하고, TAIL PCR(열적 비대칭으로 짜여진 PCR(Thermal Asymmetric InterLaced PCR))에 의해 MON87769 중의 T-DNA 삽입부 측면에 있는 서열을 측정하였다. 야생형 A3525와, 온실 조건 하에서 성장시킨 조직으로부터의 트랜스제닉 계통, 둘 모두로부터 식물 게놈 DNA를 단리시켰다. 냉동된 잎 조직을 액체 질소하에 유발과 유봉을 사용하여 분쇄하거나, 기계를 이용하여 분쇄하였다. 22 mL 부피의 추출 완충액을 약 1 g의 분쇄된 잎 조직에 첨가하고, 1시간 동안 65℃에서 인큐베이션시켰다. CTAB 추출 완충액은 1.4 M NaCl, 2％ CTAB, 20 mM EDTA, 및 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 구성되었다. 사용 직전에, 0.02％ 베타-머캅토에탄올 및 0.5 mg RNase A를 추출 완충액에 첨가하였다. 샘플을 12 mL의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1) 용액에 첨가하고, 10분 동안 4℃에서 4000 x G로 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브로 옮기고, 15 mL의 이소프로판올로 DNA를 침전시켰다. 10분 동안 4000 x G로 원심분리한 후, 펠릿을 5 mL 70％ 에탄올로 세척하였다. 5분 동안 4000 x G로 최종 원심분리를 수행하였다; 펠릿을 대기 건조시키고, 300 ㎕ 물에 재현탁시켰다.

분취량의 DNA를 TAIL PCR시키고, 삽입부에 인접한 서열 영역을 단리시키고, 서열을 분석하였다. 추가로, T-DNA의 제한 분석에 기초하여 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 분취량의 DNA를 분해시켰다. 제한 단편을 자가 결찰시킨 후, T-DNA 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 T-DNA의 5' 말단으로부터 3' 말단으로 확장시키면서 서열을 증폭시켰다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 퀴아젠(QIAGEN) 겔 정제 키트 (캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 정제하였다. 후속 생성물은 표준 서열분석 프로토콜을 사용하여 직접적으로 서열 분석하였다. 이러한 두 방법을 사용하여, 데세츄라제 카세트 T-DNA의 우측 경계 서열로 확장되는 5' 인접 서열은 서열 3 ([C], 도 2 참조)에 제시되어 있다. 데세츄라제 카세트 T-DNA의 좌측 경계 서열로 확장되는 3' 인접 서열은 서열 4 ([D], 도 2 참조)에 제시되어 있다. A3525 게놈 DNA 내로 전체적으로 통합된 pMON77245로부터의 데세츄라제 카세트 DNA (서열 7)의 일부분은 서열 5 ([E], 도 2 참조)에 제시되어 있다.

단리된 서열을 T-DNA 서열과 비교하여 인접 서열 및 함께 단리된 T-DNA 단편을 확인하였다. 연역적 방법으로 도출된 인접 서열 데이타 및 공지의 T-DNA 서열에 기초하여 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 발현 카세트가 존재한다는 것을 확인하게 되었다. 형질전환된 계통 중 T-DNA가 통합되는 영역과 동일한 영역에 상응하는 A3525 야생형 서열은, MON87769의 인접 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 단리시켰다. MON87769의 인접 서열 및 A3525 야생형 서열을 다중 뉴클레오티드 및 단백질 데이타베이스에 대해 분석하였다. 이러한 정보를 사용하여 트랜스진과 식물 게놈의 관계를 조사하고, 삽입부 통합성을 관찰하였다. 인접 서열 및 야생형 서열을 사용하여 실시예 3에 기술되는 바와 같은, 계통을 확인하고 접합성을 측정하는 데 사용되는 택맨(TaqMan) 엔드포인트 분석을 위한 프라이머를 디자인하였다.

실시예 3

계통-특이 엔드포인트 택맨 및 접합성 분석.

샘플 중 계통 MON87769의 존재를 확인하는 데 사용된 방법은 계통-특이 엔드포인트 택맨 PCR 분석법에 기술되어 있고, 그를 위한 조건의 일례는 표 1 및 2에 기재되어 있다. 엔드포인트 분석에 사용된 DNA 프라이머는 프라이머 SQ5923 (서열 8), SQ5924 (서열 9) 및 6FAM™ 표지된 프라이머 PB2511 (서열 10)이다. 6FAM™은 DNA 프라이머에 부착된 형광 염료 생성물 (어플라이드 바이오시스템즈 (캘리포니아주 포스터 시티 소재))이다. 택맨 MGB (마이너 그루브 결합: Minor Groove Binding) 프로브를 위해, Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성은 형광단과 소광제 사이의 5'-말단으로부터 프로브를 절단한다. 표적 DNA 스트랜드에 혼성화하게 되면, 소광제 및 형광단은 충분히 분리됨으로써 형광 신호가 발생하게 된다.

기술된 바와 같이, PB2511 (서열 10)과 함께 사용될 때, SQ5923 (서열 8) 및 SQ5924 (서열 9)는 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 DNA 앰플리콘을 생산한다. 이러한 분석에 대한 대조군으로는 계통 MON87769 DNA를 포함하는 것으로 알려져 있는 대두로부터의 양성 대조군, 비-트랜스제닉 대두로부터의 음성 대조군, 및 어떤 주형 DNA도 포함하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다.

어플라이드 바이오시스템즈 진앰프(Applied Biosystems GeneAmp)® PCR 시스템 9700, 스트라테이진 로보사이클러(Stratagene Robocycler)®, MJ 엔진, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 9700 또는 에펜도르프 마스터사이클러(Eppendorf Mastercycler)® 구배 써모사이클러와 함께 사용하기 위하여 상기 분석법을 최적화시켰다. 계통 MON87769 DNA를 확인시켜 주는 앰플리콘을 생산하는 기타 다른 방법 및 장치가 당업자에게 공지되어 있을 수 있다.

하기와 같은 사이클링 파라미터를 사용하여 스트라테이진 로보사이클러, MJ 엔진, 퍼킨-엘머 9700, 에펜도르프 마스터사이클러 구배 써모사이클러, 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 PCR 시스템 9700 또는 MJ 리서치 DNA 엔진 PTC-225 써모사이클러에서 DNA 증폭을 수행하였다. 에펜도르프 마스터사이클러 구배 또는 MJ 엔진에서 PCR을 진행할 때, 써모사이클러는 계산된 방식으로 작동시켜야 한다. 퍼킨-엘머 9700에서 PCR을 진행할 때, 써모사이클러는 램프 속도를 최대로 설정해 놓은 상태에서 작동시켰다.

계통-특이 접합성 엔드포인트 택맨 PCR을 사용하여 샘플 중 계통 MON87769를 포함하는 조직에 대한 접합성에 대해 측정하였는데, 상기 PCR을 위한 조건의 일례는 표 3 및 4에 기재되어 있다. 접합성 분석에 사용된 DNA 프라이머는 프라이머 SQ5923 (서열 8), SQ5924 (서열 9), SQ5925 (서열 11), 6FAM™ 표지된 프라이머 PB2511 (서열 10) 및 VIC™ 표지된 프라이머 PB2512 (서열 12)이다. 6FAM™ 및 VIC™은 DNA 프라이머에 부착된 형광 염료 생성물 (어플라이드 바이오시스템즈 (캘리포니아주 포스터 시티 소재))이다.

이러한 반응 방법에서 PB2511 (서열 10)과 함께 사용될 때, SQ5923 (서열 8) 및 SQ5924 (서열 9)는 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 DNA 앰플리콘을 생산한다. 이러한 분석에 대한 대조군으로는 계통 MON87769 DNA를 포함하는 대두로부터의 양성 대조군, 비-트랜스제닉 대두로부터의 음성 대조군, 및 어떤 주형 DNA도 포함하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다.

이러한 반응 방법에서 PB2512 (서열 12)와 함께 사용될 때, SQ5923 (서열 8) 및 SQ5925 (서열 11)는 야생형 대립유전자에 대한 진단 표지가 되는 DNA 앰플리콘을 생산한다.

프로브 PB2511 및 PB2512, 둘 모두로부터 형광 신호가 유리는 것으로 입증되는 양 앰플리콘 모두의 존재에 의해 이형접합성을 측정하였다.

어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 PCR 시스템 9700, 스트라테이진 로보사이클러, MJ 엔진, 퍼킨-엘머 9700 또는 에펜도르프 마스터사이클러 구배 써모사이클러와 함께 사용하기 위하여 상기 분석법을 최적화시켰다. 당업자에게 공지되어 있는, 계통 MON87769 DNA를 확인시켜 주는 앰플리콘을 생산하는 기타 다른 방법 및 장치는 당업계의 기술 내에 포함되어 있다.

하기와 같은 사이클링 파라미터를 사용하여 스트라테이진 로보사이클러, MJ 엔진, 퍼킨-엘머 9700, 에펜도르프 마스터사이클러 구배 써모사이클러, 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 PCR 시스템 9700 또는 MJ 리서치 DNA 엔진 PTC-225 써모사이클러에서 DNA 증폭을 수행하였다. 에펜도르프 마스터사이클러 구배 또는 MJ 엔진에서 PCR을 진행할 때, 써모사이클러는 계산된 방식으로 작동시켜야 한다. 퍼킨-엘머 9700에서 PCR을 진행할 때, 써모사이클러는 램프 속도를 최대로 설정해 놓은 상태에서 작동시켰다.

실시예 4

임의의 MON87769 육종 계통에서 계통 MON87769 확인

하기 실시예는 계통 MON87769를 포함하는 임의의 대두 육종 계통의 자손 내에서 MON87769 계통을 확인할 수 있는 방법을 설명한다.

DNA 계통 프라이머 쌍을 사용하여 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 앰플리콘을 생산하였다. MON87769에 대한 진단 표지가 앰플리콘은 적어도 하나의 연접부 서열인 서열 1 또는 서열 2 (도 2에 도시된 바와 같이, 각각 "[A]" 및 "[B]")를 포함하였다. 서열 1 (도 2의 [A])은 5' 인접 서열의 연접부 (서열 3 [C]의 979번 위치에서부터 988번 위치까지, 도 2 참조) 및 데세츄라제 카세트의 통합된 우측 경계 (서열 5 [E]의 1번 위치에서부터 10번 위치까지, 도 2 참조)에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열 2 ([B], 도 2 참조)는 데세츄라제 카세트의 통합된 좌측 경계의 연접부 (서열 5 [E]의 7358번 위치에서부터 7367번 위치까지, 도 2 참조) 및 3' 인접 서열 (서열 4 [D]의 1번 위치에서부터 10번 위치까지, 도 2 참조)에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.

MON87769에 대한 진단 표지 앰플리콘을 생산하는 계통 프라이머 쌍은 인접 서열 및 삽입된 데세츄라제 카세트에 기초한 프라이머 쌍을 포함한다. 서열 1 중 적어도 11개의 뉴클레오티드가 발견이 되는 진단 표지 앰플리콘을 획득하기 위하여 염기 1부터 978까지의 서열 3에 기초하여 전방향 프라이머와 삽입된 발현 데세츄라제 카세트인, 염기 10부터 7367까지의 서열 5에 기초하여 역방향 프라이머를 디자인하였다. 서열 2 중 적어도 11개의 뉴클레오티드가 발견이 되는 진단 표지 앰플리콘을 획득하기 위하여 삽입된 발현 데세츄라제 카세트인, 염기 10부터 7357까지의 서열 5에 기초하여 전방향 프라이머와 3' 인접 서열인, 염기 10부터 939까지의 서열 4에 기초하여 역방향 프라이머를 디자인하였다. 실제로 실행하기 위한 목적으로 크기 범위가 제한된, 바람직하게는, 200 내지 1000 염기인 앰플리콘을 생산하는 프라이머를 디자인하여야 한다. 일반적으로 앰플리콘의 크기가 작으면 작을수록, 앰플리콘은 PCR 반응에서 더욱 높은 신뢰도로 생산이 되고, 사이클 시간은 단축될 수 있고, 아가로스 겔 상에서 쉽게 분리되고 시각화될 수 있거나, 엔드포인트 택맨™-유사 분석법에서의 사용을 위해 쉽게 적합화될 수 있다. 추가로, 상기 프라이머 쌍을 사용하여 생산되는 앰플리콘은 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 증식될 수 있고, 단리될 수 있고, 서열 분석될 수 있거나, 당업계에 잘 확립되어 있는 방법을 사용함으로써 직접적으로 서열 분석될 수 있다. 서열 3 및 서열 5의 조합물, 또는 그의 하나 이상의 하위서열(들), 또는 서열 4 및 서열 5의 조합물, 또는 그의 하나 이상의 하위서열(들)로부터 유래된 프라이머 쌍으로서, DNA 증폭 방법에서 MON87769 또는 그의 자손에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는 데 유용한 임의의 프라이머 쌍이 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법에서 MON87769 또는 그의 자손에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는 데 유용한, 서열 3 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 단일의 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자가 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법에서 MON87769 또는 그의 자손에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는 데 유용한, 서열 4 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 단일의 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자가 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법에서 MON87769 또는 그의 자손에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는 데 유용한, 서열 5 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 단일의 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자가 본 발명의 한 측면이다.

상기 분석법을 위한 증폭 조건의 일례는 표 5 및 6에 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법, 또는 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산하는, 서열 3 또는 서열 4, 또는 MON87769의 트랜스진 삽입체 (서열 5)에 포함되어 있는 유전 요소의 DNA 서열에 대해 상동성이거나 또는 상보성인 DNA 프라이머의 사용에 대한 임의의 변형도 당업계에 포함되어 있다. 진단 표지 앰플리콘은 적어도 하나의 트랜스진/게놈 연접부 DNA (서열 1 또는 서열 2)에 대해 상동성이거나 또는 상보성인 DNA 분자, 또는 그의 상당부를 포함한다.

샘플 중 계통 MON87769 식물 조직에 대한 분석법은 계통 MON87769를 포함하는 식물 조직으로부터의 양성 조직 대조군, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, A3525와 같이, 계통 MON87769를 포함하지 않는 대두 식물로부터의 음성 대조군, 및 어떤 대두 게놈 DNA도 포함하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다. 내인성 대두 DNA 분자를 증폭시키는 프라이머 쌍은 DNA 증폭 조건을 위한 내부 대조군으로서의 역할을 할 것이다. 추가의 프라이머 서열은 DNA 증폭 방법 분야의 당업자에 의해 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5로부터 선택될 수 있고, 표 5 및 6에 제시한 방법에 의해 앰플리콘을 생산하기 위한 목적으로 선택된 조건은 달라질 수는 있지만, 상기 조건을 통해 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘이 생산된다. 표 5 및 6의 방법을 수정하여 상기 DNA 프라이머 서열을 사용하는 것도 본 발명의 범주에 포함된다. 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5로부터 유래된 적어도 하나의 DNA 프라이머 서열에 의해 생산된 것으로서, MON87769에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘이 본 발명의 한 측면이다.

DNA 증폭 방법에서 사용될 때, MON87769 또는 그의 자손에 대한 진단 표지 앰플리콘을 생산하는 프라이머로서, 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5로부터 유래되는 적어도 하나의 DNA 프라이머를 포함하는 DNA 검출 키트가 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법에서 시험하였을 때, 그의 게놈이 MON87769에 대한 진단 표지 앰플리콘을 생산하는 대두 식물 또는 종자가 본 발명의 한 측면이다. MON87769 앰플리콘에 대한 분석은 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 PCR 시스템 9700, 스트라테이진 로보사이클러, MJ 엔진, 퍼킨-엘머 9700 또는 에펜도르프 마스터사이클러 구배 써모사이클러, 또는 표 6에 제시된 바와 같은, 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 앰플리콘을 생산할 수 있는 임의의 기타 다른 증폭 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 원리들을 예시하였고 설명하였는 바, 본 발명은 상기 원리로부터 벗어나지 않고 배치와 상세내용에 있어서 변경될 수 있다는 것이 당업자에게는 자명하여야 한다. 본 발명자들은 첨부된 특허청구범위의 정신과 범주 내에 속하는 모든 변형들을 특허청구한다.

ATCC PTA-8911 20080205

SEQUENCE LISTING <110> Froman, Byron Duong, Can Listello, Jennifer <120> SOYBEAN PLANT AND SEED CORRESPONDING TO TRANSGENIC EVENT MON87769 AND METHODS FOR DETECTION THEREOF <130> MONS:193WO <150> US 61/029,197 <151> 2008-02-15 <150> US 61/055,401 <151> 2008-05-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5' Junction Sequence between Glycine max genomic DNA and sequence from plasmid pMON77245 <400> 1 tgtagattga tcaaacactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 3' Junction Sequence between sequence from plasmid pMON77245 and Glycine max genomic DNA <400> 2 ttacaattga ccatcatact 20 <210> 3 <211> 988 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 agataaagtt gactagactc aaactaaagt agttaaaacc aaagggactg agaaagatca 60 atcctgagat agagaaagag aaaggaattt gtaaaacaaa aatcccataa acaactgtca 120 atgttgaaga gcccactctt gatgtgactt agccacataa cgttaatgag ccaattacta 180 ttcctgatgt gcttgctcag aatatggtaa agctgactac taccactatt 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ctggagtacg accctgacct ccagtacatt cccttgttgg ttgtgtcccc gaagttcttt 1620 aactccctca cttctcgttt ctacgacaag aagctgaact tcgacggtgt gtcgaggttt 1680 ttggttcaat accagcactg gtcgttttat ccggtcatgt gtgttgctag gctgaacatg 1740 cttgcgcagt cgtttatact gcttttttcg aggagggagg tggcgaacag ggtgcaggag 1800 attcttggac tagcggtttt ttggctttgg tttccgctcc tgctttcttg ccttcctaat 1860 tggggtgaga gaataatgtt tttgctcgcg agctactccg ttacggggat acaacacgtg 1920 cagttcagct tgaaccattt ctcatctgac gtttacgtgg gcccacccgt aggtaacgat 1980 tggtttaaga aacagactgc agggacactc aacatatcgt gcccggcgtg gatggattgg 2040 ttccatggcg ggttgcagtt tcaggtcgag caccacttgt tcccgcggat gcctaggggt 2100 cagtttcgga agatttctcc ttttgtgagg gatttgtgta agaaacacaa tttgacttac 2160 aatattgcgt cttttactaa agcaaatgtg ttgacgcttg agaccctgag aaacacagcc 2220 attgaggctc gggacctctc taatccgatc ccaaagaata tggtgtggga ggctgttaaa 2280 aatgtcgggt gaccaattcc cgggggagga aattacactg aggaaggaga agatgacgac 2340 gatgagatgg acgatgaagg ggaggctggt ggagcggaac caagagagtg tcagatcgga 2400 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ataatcaatc attattctta catattgttc gaactacgag ttatgaagtg tcaattgcac 4140 cttagtgttt tgataggcct ccatttgccg ctcattaatt aatttgataa cagccgtacc 4200 gatcaattac ttatgcttct tccatcgtaa ttatatgcat gtcggttctt ttaatcttgg 4260 tactctcgaa tgccaccaca acactgacta gtctcttgga tcatgagaaa aagccaaaga 4320 acaaaaaaga caacataaag agtatccttt gcaaaaaaat gtctaagttc ataaaataca 4380 aacaaaaacg caatcacaca cagtggaccc aaaagccatg cacaacaaca cgtactcacc 4440 aaggtgcaat cgtgctgccc aaaaacattc accaactcaa tccatgatga gcccacacat 4500 ttgttgtttg taaccaaatc tcaaacgcgg tgttctcttt ggaaagcaac catatcagca 4560 tatcacacta tctagtctct tggatcatgc atgcgcaacc aaaagacaac acataaagta 4620 tcctttcgaa agcaatgtcc aagtccatca aataaaattg agacaaaatg caacctcacc 4680 ccacttcact atccatggct gatcaagatc gccgcgtcca tgtaggtcta aatgccatgc 4740 acatcaacac gtactcaaca tgcagcccaa attgctcacc atcgctcaac acatttcttg 4800 ttaatttcta agtacactgc ctatgcgact ctaactcgat cacaaccatc ttccgtcaca 4860 tcaattttgt tcaattcaac acccgtcaac ttgcatgcca ccccatgcat gcaagttaac 4920 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ctccaaacag tgggaaaccg gcaaaggtgg aatgggatgg ctccgcgtga gccatttcga 5820 accaagttca gccgttttca gaaacagcga agcaatttac atagctctaa gcgatctcgg 5880 acttatgatt atgggataca ttctctacca ggcagcccaa gttgttggat ggcaaatggt 5940 tggtctcttg tattttcaac agtacttctg ggttcaccat tggctcgttg ccatcactta 6000 ccttcatcac acacacgaag aagttcacca ctttgatgca gattcttgga catttgttaa 6060 gggtgccctc gctaccgtgg acagagactt cggtttcatc ggcaagcacc tcttccataa 6120 catcattgac catcatgttg ttcatcacct cttcccaaga atccctttct actacgctga 6180 agaagctacc aattcaataa gacctatgct cggacctctt taccacagag atgaccgttc 6240 tttcatgggg caactctggt acaacttcac acactgcaaa tgggttgtcc ctgatcctca 6300 agtgccaggt gctctaatct gggctcacac cgttcagagt actcagtaac tgcagtattg 6360 tgtcttcact gactggaaag gagataggat cctctagcta gagctttcgt tcgtatcatc 6420 ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca ttgcgcacac accagaatcc 6480 tactgagttt gagtattatg gcattgggaa aactgttttt cttgtaccat ttgttgtgct 6540 tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa ctgtgaaatg gaaatggatg 6600 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insertion site in event MON87769: G. max 5' and 3' flanking regions and inserted DNA from plasmid pMON77245 <400> 6 agataaagtt gactagactc aaactaaagt agttaaaacc aaagggactg agaaagatca 60 atcctgagat agagaaagag aaaggaattt gtaaaacaaa aatcccataa acaactgtca 120 atgttgaaga gcccactctt gatgtgactt agccacataa cgttaatgag ccaattacta 180 ttcctgatgt gcttgctcag aatatggtaa agctgactac taccactatt tctccaactc 240 cttcaagtca atttcaaatt atttaaactt taactcttat gtctaaggtt aaaatttctt 300 caatgtacaa caaattattc tatattttct taggaaagaa aattcctcca aagaacacct 360 catatgatag gcgaggtagg ggtttggttc tttgacacca tcaaggtcct ttacgaaggt 420 ttgatcatat gactgtatct catgatctcc cttcattatg gaatattgac ctcaagggat 480 ttgagttcat cacaactaac aaattgctta caaaagttga tgttgagatg atggattatg 540 ttggagtcga taactatttg gattttattg aggtattcct tctctgatct gctgcttcaa 600 ttctctattg gagaaataga tatgctaaat atgaggcaaa aacaaagatg ataatgaatt 660 aaaggaagaa cctaattgtg gccatcaatg aaaagaatat tttggtaact aagaagattg 720 aaatcattaa tagttttcgg caaaaagttg ctaatcatga 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atccactagc 1620 tgatcaggat cgccgcgtca agaaaaaaaa actggacccc aaaagccatg cacaacaaca 1680 cgtactcaca aaggtgtcaa tcgagcagcc caaaacattc accaactcaa cccatcatga 1740 gcccacacat ttgttgtttc taacccaacc tcaaactcgt attctcttcc gccacctcat 1800 ttttgtttat ttcaacaccc gtcaaactgc atgccacccc gtggccaaat gtccatgcat 1860 gttaacaaga cctatgacta taaatatctg caatctcggc ccaggttttc atcatcaaga 1920 accgggtacc gagctcgaca tgactaagac catttacata accagctcag aacttgaaaa 1980 acataacaag ccaggtgacc tatggatatc aattcacggt caagtttacg acgtttcttc 2040 ctgggctgcg cttcacccgg ggggcatcgc tcccctcctc gcccttgcag gacatgatgt 2100 gaccgacgct ttcctcgctt accatccccc ttccacctcc cgcctcctcc ctcccttctc 2160 caccaaccta cttctagaaa aacattccgt gtccgagacc tcttccgact atcgcaaact 2220 tctagacagc tttcataaga tgggcatgtt tcgtgccagg ggccacactg cctacgcgac 2280 ctttgtcatt atgatactta tgttggtttc ctctgtgact ggggtgcttt gcagtgagaa 2340 tccgtgggtg catttggttt gtggagcggc aatggggttt gcctggatcc agtgcggatg 2400 gataggtcat gattccggac attaccggat aatgactgac aggaaatgga 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ggggaggaaa 3300 ttacactgag gaaggagaag atgacgacga tgagatggac gatgaagggg aggctggtgg 3360 agcggaacca agagagtgtc agatcggaaa ccttatcaat tatccgatca ttgctttagg 3420 gtcatgcgat ctttccgcat aattcccgtc gccgacacct aataaagtcg gctaatctat 3480 gtgattgagt gtgtcttgac tttgttattt tgcatgtttc caatgtcatt tagtaacgaa 3540 ataaacgtta tcctcttcta aaagcaggct gtgttttcgg caaacatcgc cacccatcgc 3600 tagtttttct aaaagtgttc taagctagcc tggtaataat ctatacgagc ttatatttct 3660 aatcattgcc gaaaaatcct gtttcgaaat aattttgtaa ctctctttaa tatcaccacg 3720 atcacacaag aagaagaatt aaatataaca tttatcagcc cacgatgaac atggcgaaaa 3780 ttacaagcga acacaattgt cttattcatt aataattaat tcaacaaagt tctcagacac 3840 tccttgattt aacagaagat tttataagca cctctatgat gcaacaacca aaacgacata 3900 gacttcgaaa tcccgcccca taaaaactag atagcaccat ctaactccac gtcttcaaga 3960 gcagcctccg ggaggaaagc tgaacagccc acagcgatca aaagataatc caatggttgg 4020 ccggcgcttg gcattttcct tttccaaacg tccttgcttt gaccaaaagt gttccggacg 4080 actcctatgc gttcgaactc gttgctggcc tgaattgcta gaaagtacga 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catgttttct 9180 gacttgtgta agcataaata ataaaaataa gtattaacaa caataaatgg aaaatgagat 9240 gaacagtaaa aggatttcat taaaagatta taatgatagg aatttccttt taca 9294 <210> 7 <211> 7849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette with Primula juliae and Neurospora crassa desaturase genes of pMON77245 <400> 7 aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60 cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120 gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180 actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240 ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 300 gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat 360 ccccatcaag cttgatggcc gcggtacggt cgactctaga ggatccccgg caaaaacatt 420 taatacgtat tatttaagaa aaaaatatgt aataatatat ttatatttta atatctattc 480 ttatgtattt tttaaaaatc tattatatat tgatcaacta aaatattttt atatctacac 540 ttattttgca tttttatcaa ttttcttgcg ttttttggca tatttaataa tgactattct 600 ttaataatca atcattattc ttacatggta catattgttg gaaccatatg aagtgtccat 660 tgcatttgac tatgtggata gtgttttgat ccaggcctcc atttgccgct tattaattaa 720 tttggtaaca gtccgtacta atcagttact tatccttcct ccatcataat taatcttggt 780 agtctcgaat gccacaacac tgactagtct cttggatcat aagaaaaagc caaggaacaa 840 aagaagacaa aacacaatga gagtatcctt tgcatagcaa tgtctaagtt cataaaattc 900 aaacaaaaac gcaatcacac acagtggaca tcacttatcc actagctgat caggatcgcc 960 gcgtcaagaa aaaaaaactg gaccccaaaa gccatgcaca acaacacgta ctcacaaagg 1020 tgtcaatcga gcagcccaaa acattcacca actcaaccca tcatgagccc acacatttgt 1080 tgtttctaac ccaacctcaa actcgtattc tcttccgcca cctcattttt gtttatttca 1140 acacccgtca aactgcatgc caccccgtgg ccaaatgtcc atgcatgtta acaagaccta 1200 tgactataaa tatctgcaat ctcggcccag gttttcatca tcaagaaccg ggtaccgagc 1260 tcgacatgac taagaccatt tacataacca gctcagaact tgaaaaacat aacaagccag 1320 gtgacctatg gatatcaatt cacggtcaag tttacgacgt ttcttcctgg gctgcgcttc 1380 acccgggggg catcgctccc ctcctcgccc ttgcaggaca tgatgtgacc 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gtgggcccac 2280 ccgtaggtaa cgattggttt aagaaacaga ctgcagggac actcaacata tcgtgcccgg 2340 cgtggatgga ttggttccat ggcgggttgc agtttcaggt cgagcaccac ttgttcccgc 2400 ggatgcctag gggtcagttt cggaagattt ctccttttgt gagggatttg tgtaagaaac 2460 acaatttgac ttacaatatt gcgtctttta ctaaagcaaa tgtgttgacg cttgagaccc 2520 tgagaaacac agccattgag gctcgggacc tctctaatcc gatcccaaag aatatggtgt 2580 gggaggctgt taaaaatgtc gggtgaccaa ttcccggggg aggaaattac actgaggaag 2640 gagaagatga cgacgatgag atggacgatg aaggggaggc tggtggagcg gaaccaagag 2700 agtgtcagat cggaaacctt atcaattatc cgatcattgc tttagggtca tgcgatcttt 2760 ccgcataatt cccgtcgccg acacctaata aagtcggcta atctatgtga ttgagtgtgt 2820 cttgactttg ttattttgca tgtttccaat gtcatttagt aacgaaataa acgttatcct 2880 cttctaaaag caggctgtgt tttcggcaaa catcgccacc catcgctagt ttttctaaaa 2940 gtgttctaag ctagcctggt aataatctat acgagcttat atttctaatc attgccgaaa 3000 aatcctgttt cgaaataatt ttgtaactct ctttaatatc accacgatca cacaagaaga 3060 agaattaaat ataacattta tcagcccacg atgaacatgg cgaaaattac aagcgaacac 3120 aattgtctta ttcattaata attaattcaa caaagttctc agacactcct tgatttaaca 3180 gaagatttta taagcacctc tatgatgcaa caaccaaaac gacatagact tcgaaatccc 3240 gccccataaa aactagatag caccatctaa ctccacgtct tcaagagcag cctccgggag 3300 gaaagctgaa cagcccacag cgatcaaaag ataatccaat ggttggccgg cgcttggcat 3360 tttccttttc caaacgtcct tgctttgacc aaaagtgttc cggacgactc ctatgcgttc 3420 gaactcgttg ctggcctgaa ttgctagaaa gtacgaggat gaatattcat ttttgctgta 3480 gttgatccga ccaccgtctc cgcttaaggc ttgcagttgc gccctcacct gccggaatgt 3540 ataaccatca gaatagggtt ccaggcggcc atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact 3600 agttctagag cggccgcgaa ttcactagtg attaagctta tgcagggtcg acggcccggg 3660 ctggtctgtc ttttcaattt ttttggccac atattattcg ggttctgtga ccttttcaaa 3720 atgactgcta ttacctcctg accttgctat tacatcttga ccatcactag gcatttaaaa 3780 gtattagtca tagtcacata ttactacaaa gcgagattga tctctctaat ctaatgggtg 3840 ggaaaacact tataatatat gattcaagaa aagaaagtaa ataaaacaat tttattatat 3900 aaagactatt aggataaaaa aaaccttaaa agtgcttgga tttggaccag acttgaattt 3960 taatttaatg atattataat atgtgaatat atttttgaga caattgtaaa tttcagataa 4020 aaaaataatg taattaaaat tgtaataact atatcgtata cttaattaat tattaaatgt 4080 gacaaaaaag atatacatca aaacttaatg tttcatgact ttttttttta atgtgtgtcc 4140 taaatagaaa ttaaaaataa aaattattat atccaaatga aaaaaacatt taatacgtat 4200 tatttaagaa ataacaatat atttatattt taatatgtat tcacatgtaa atttaaaaac 4260 aaaaacaaaa tttctctttt attgattaat taaaataatt ttataactac atttattttc 4320 tattattatc aattttcttc tgttttttta tttggcatat atacctagac aagtcaaaaa 4380 atgactattc tttaataatc aatcattatt cttacatatt gttcgaacta cgagttatga 4440 agtgtcaatt gcaccttagt gttttgatag gcctccattt gccgctcatt aattaatttg 4500 ataacagccg taccgatcaa ttacttatgc ttcttccatc gtaattatat gcatgtcggt 4560 tcttttaatc ttggtactct cgaatgccac cacaacactg actagtctct tggatcatga 4620 gaaaaagcca aagaacaaaa aagacaacat aaagagtatc ctttgcaaaa aaatgtctaa 4680 gttcataaaa tacaaacaaa aacgcaatca cacacagtgg acccaaaagc catgcacaac 4740 aacacgtact caccaaggtg caatcgtgct gcccaaaaac attcaccaac tcaatccatg 4800 atgagcccac acatttgttg tttgtaacca aatctcaaac gcggtgttct ctttggaaag 4860 caaccatatc agcatatcac actatctagt ctcttggatc atgcatgcgc aaccaaaaga 4920 caacacataa agtatccttt cgaaagcaat gtccaagtcc atcaaataaa attgagacaa 4980 aatgcaacct caccccactt cactatccat ggctgatcaa gatcgccgcg tccatgtagg 5040 tctaaatgcc atgcacatca acacgtactc aacatgcagc ccaaattgct caccatcgct 5100 caacacattt cttgttaatt tctaagtaca ctgcctatgc gactctaact cgatcacaac 5160 catcttccgt cacatcaatt ttgttcaatt caacacccgt caacttgcat gccaccccat 5220 gcatgcaagt taacaagagc tatatctctt ctatgactat aaatacccgc aatctcggtc 5280 caggttttca tcatcgagaa ctagttcaat atcctagtat accttaataa ataatttaag 5340 atactagatc gatctatcga ttctaggaca aaaatggctg tcactactag gtcacacaaa 5400 gccgccgctg ccaccgaacc tgaagttgtg tctacaggag tggatgcagt cagcgctgcc 5460 gcaccaagca gtagtagctc ctcatcctcc caaaagtcag ctgagcctat cgaatatcca 5520 gacatcaaga caattcgtga cgctatacca gaccactgct ttagacctcg cgtttggata 5580 tccatggcgt actttattcg cgattttgca atggctttcg gcctcggata cttggcatgg 5640 caatacatcc ctttgattgc aagtacccca ttgagatacg gagcttgggc tttgtacggt 5700 tacctccagg gactcgtctg tactggaatt tggatcttgg ctcacgaatg cggtcacgga 5760 gccttttcta gacacacctg gttcaacaac gttatgggtt ggattggtca ctctttccta 5820 ctagtcccat attttagctg gaaattttcc catcaccgtc atcataggtt caccggacat 5880 atggaaaaag atatggcgtt cgttccagcc acggaggcgg acagaaatca gagaaaacta 5940 gctaatctct atatggacaa agagactgcg gagatgttcg aggatgttcc tattgtgcag 6000 ttggttaaac taattgctca ccaactcgcc ggttggcaga tgtatctctt gttcaacgtt 6060 agtgccggaa aaggctccaa acagtgggaa accggcaaag gtggaatggg atggctccgc 6120 gtgagccatt tcgaaccaag ttcagccgtt ttcagaaaca gcgaagcaat ttacatagct 6180 ctaagcgatc tcggacttat gattatggga tacattctct accaggcagc ccaagttgtt 6240 ggatggcaaa tggttggtct cttgtatttt caacagtact tctgggttca ccattggctc 6300 gttgccatca cttaccttca tcacacacac gaagaagttc accactttga tgcagattct 6360 tggacatttg ttaagggtgc cctcgctacc gtggacagag acttcggttt catcggcaag 6420 cacctcttcc ataacatcat tgaccatcat gttgttcatc acctcttccc aagaatccct 6480 ttctactacg ctgaagaagc taccaattca ataagaccta tgctcggacc tctttaccac 6540 agagatgacc gttctttcat ggggcaactc tggtacaact tcacacactg caaatgggtt 6600 gtccctgatc ctcaagtgcc aggtgctcta atctgggctc acaccgttca gagtactcag 6660 taactgcagt attgtgtctt cactgactgg aaaggagata ggatcctcta gctagagctt 6720 tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt ttcattgcgc 6780 acacaccaga atcctactga gtttgagtat tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta 6840 ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga 6900 aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt 6960 aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat aagagatatg 7020 caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac cgaagttaat 7080 atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca acaaatatat 7140 tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct tgtgttttag 7200 acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct tgtcagattc taatcattgc 7260 tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta tgaaaatatt 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11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 11 caaaattagc aagttgctcg tgaa 24 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Probe <400> 12 agaaggcaac ctcaaaa 17

Claims (34)

1. 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열 또는 그에 상보성인 서열을 포함하는 DNA 분자.
2. 서열 1 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하며, 대두 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 DNA 프로브로서 사용하기 위한 단리된 DNA 분자.
3. 서열 2 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하며, 대두 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 DNA 프로브로서 사용하기 위한 단리된 DNA 분자.
4. i. 생물학적 샘플을 DNA 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
   ii. 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하는 단계; 및
   iii. 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법.
5. 제4항의 방법에 적용시켰을 때, 그의 DNA가 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 DNA 앰플리콘을 생산하는, 안정적으로 형질전환된 대두 식물.
6. 제4항에 있어서, DNA 프라이머 쌍이 서열 3 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 5 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 것인 방법.
7. 제4항에 있어서, DNA 프라이머 쌍이 서열 4 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 5 또는 그의 상보체 중 적어도 11개의 연속되는 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 것인 방법.
8. i. 생물학적 샘플을, 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1, 서열 2 및 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과는 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1, 서열 2 또는 그의 상보체를 포함하지 않는 대두 식물 게놈 DNA와는 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계;
   ii. 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용시키는 단계; 및
   iii. 프로브와 샘플의 결합을 검출하며, 여기서 결합하였다는 것은 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA의 존재에 대한 진단 표지가 되는 것인 단계
   를 포함하는, 생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA의 존재를 검출하는 방법.
9. i. 샘플을,
   (a) 핵산 증폭 반응에서 함께 사용될 때에 대두 계통 MON87769 DNA를 포함하는 경우에는, 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA에 대한 진단 표지가 되는 제1 앰플리콘을 생산하고;
   (b) 핵산 증폭 반응에서 함께 사용될 때에 MON87769 DNA 이외의 대두 게놈 DNA을 포함하는 경우에는, 샘플 중 계통 MON87769 DNA 이외의 대두 게놈 DNA에 대한 진단 표지가 되는 제2 앰플리콘을 생산하는
   서열 8, 서열 9 및 서열 11을 포함하는 3개의 상이한 프라이머와 접촉시키는 단계;
   ii. 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
   iii. 생산된 앰플리콘 또는 앰플리콘들을 관찰하며, 여기서 제2 앰플리콘의 존재는 상기 샘플 중 이형접합성 게놈에 대한 진단 표지가 되는 것인 단계
   를 포함하는, 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA를 포함하는 대두 식물 게놈의 DNA의 접합성을 측정하는 방법.
10. 서열 1 및 서열 2를 포함하는 대두 식물.
11. 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 대두 종자.
12. 형질전환 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있는, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물 또는 종자.
13. 제12항의 식물 또는 종자의 부분.
14. 제12항의 대두 식물 또는 종자의 화분, 배주, 깍지, 꽃, 뿌리 또는 잎.
15. 서열 1 및 서열 2를 포함하는, 제12항의 대두 식물의 자손.
16. 서열 1, 서열 2, 서열 1에 상보성인 서열 및 서열 2에 상보성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 적어도 약 11개 내지 약 20개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 세그먼트.
17. 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 그에 상보성인 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
18. i. 생물학적 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에서 프로브와 접촉시키며, 여기서 상기 프로브는 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 서열 또는 그에 상보성인 서열을 포함하는 것인 단계;
    ii. 프로브와 샘플의 결합을 검출하며; 여기서 결합하였다는 것은 샘플 중 대두 계통 MON87769 폴리뉴클레오티드의 존재에 대한 진단 표지가 되는 것인 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법.
19. 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 대두 굵은 가루, 콩 고운 가루, 콩 단백질 농축액, 콩 단백질 단리물, 조직콩 단백질 농축액, 가수분해된 콩 단백질 및 휘핑 토핑으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물.
20. 생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 DNA의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한, 서열 1, 서열 2 또는 그의 상보체 중 약 11개 내지 약 20개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 프로브.
21. 제20항에 있어서, 데옥시리보핵산, 리보핵산 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 프로브.
22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 형광단으로 표지된 프로브.
23. 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 대두 계통 MON87769 뉴클레오티드 서열을 검출가능한 양으로 포함하는 상품 또는 식품.
24. 제23항에 있어서, 대두 굵은 가루, 콩 고운 가루, 콩 단백질 농축액, 콩 단백질 단리물, 조직콩 단백질 농축액, 가수분해된 콩 단백질 및 휘핑 토핑으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품 또는 식품.
25. 서열 1 및/또는 서열 2의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 대두 굵은 가루, 콩 고운 가루, 콩 단백질 농축액, 콩 단백질 단리물, 조직콩 단백질 농축액, 가수분해된 콩 단백질 및 휘핑 토핑으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 샘플 중에서 대두 계통 MON87769의 존재에 대한 진단 표지가 되는 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법.
26. 대두 계통 MON87769에 대한 진단 표지가 되는 뉴클레오티드 서열을 검출가능한 양으로 포함하며, 여기서 상기 서열은 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 계통 MON87769의 대두 종자 또는 그의 자손으로부터 유래된 오일.
27. 조리용 오일, 샐러드 오일, 쇼트닝, 레시틴, 비독성 플라스틱, 인쇄 잉크, 활택제, 왁스, 유압유, 변압기 유동체, 용제, 화장품, 모발 관리 제품 및 바이오디젤로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제26항의 오일로부터 유래된 상품.
28. 생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 뉴클레오티드 서열을 검출하는 데 사용하기 위한 키트.
29. 제28항에 있어서,
    i. 생물학적 샘플을 DNA 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
    ii. 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하는 단계; 및
    iii. 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 사용하며,
    생물학적 샘플 중 대두 계통 MON87769 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 데 사용되는 키트.
30. 제29항에 있어서, DNA 프라이머 쌍이 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하며, 여기서 제1 프라이머는 서열 3 또는 그의 상보체로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 프라이머 쌍은 서열 5 또는 그의 상보체로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
31. 제29항에 있어서, DNA 프라이머 쌍이 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하며, 여기서 제1 프라이머는 서열 5 또는 그의 상보체로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 프라이머 쌍은 서열 4 또는 그의 상보체로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
32. 대두 계통 MON87769를 포함하는 식물을 대두 계통 MON87769를 포함하지 않는 식물과 교배시켜, 대두 계통 MON87769를 포함하며 PUFA 함량이 변경된 식물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 형질전환 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있는 것인, PUFA 함량이 변경된 대두 식물을 생산하는 방법.
33. 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시키는 단계를 포함하며, 여기서 형질전환 계통 MON87769를 포함하는 종자의 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-8911 하에 기탁되어 있는 것인, 대두 계통 MON87769를 포함하는 대두 품종을 생산하는 방법.
34. 제12항의 종자를 재배하는 단계를 포함하는, 계통 MON87769를 포함하는 대두 식물 또는 그의 부분을 생산하는 방법.
    
    
    
    
    

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